Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация базовых репликонов плазмид группы несовместимости P-7

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация базовых репликонов плазмид группы несовместимости P-7"

На правах рукописи

ВОЛКОВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ОРГАНИЗАЦИЯ БАЗОВЫХ РЕПЛИКОНОВ ПЛАЗМИД ГРУППЫ НЕСОВМЕСТИМОСТИ Р-7

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 СЕН 2013

Москва - 2013

005533334

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино) и Пущинском государственном университете.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,

ФГБУН ИБФМ РАН Кошелева Ирина Адольфовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

ФГУП «ГосНИИгенетика» Цыганков Юрий Дмитриевич

кандидат биологических наук,

ФГБУН ИБФМ РАН Грановский Игорь Эдуардович

Ведущая организация: Филиал Федерального государственного

Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г.Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».

бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится

2013 г. в 14.00 часов на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат химических наук, доцент

Воюшина Т. Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактерии рода Pseudomonas повсеместно распространены в природе и известны как деструкторы широкого спектра органических веществ, в том числе токсичных и канцерогенных поллютантов. С другой стороны, серьезной проблемой становится приобретение некоторыми условно патогенными представителями рода множественной устойчивости к антибиотикам (Strateva and Yordanov, 2009). Очень часто приведенные выше фенотипические признаки кодируются внехромосомными генетическими элементами - плазмидами биодеградации (D-плазмиды) и антибиотикорезистентности (R-плазмиды) (Тор et al., 2000; Boronin, 1992), которые являются ключевыми «игроками» в процессе горизонтального переноса генетической информации в бактериальных популяциях.

Плазмиды классифицируют по «даруемым» хозяину фенотипическим признакам, по размеру, способности к конъюгационному переносу и т.п. Но наибольший интерес с молекулярно-генетической точки зрения представляет классификация плазмид по признаку несовместимости, поскольку она отражает эволюционный путь генетических элементов и основана на различиях структуры и функционирования их базовых репликонов, включающих области, ответственные за репликацию (минимальные репликоны) и стабильное поддержание плазмид в ряду бактериальных поколений. Плазмиды с близкородственными базовыми репликонами не могут длительное время сосуществовать в одном бактериальном хозяине, т.е. несовместимы друг с другом и поэтому относятся к одной группе несовместимости (Inc — incompatibility) (Novick, 1987; Austin and Nordstrom, 1990). Принадлежность плазмиды к той или иной группе несовместимости определяет круг бактериальных хозяев, способность к длительному сосуществованию с другими плазмидами в одном хозяине, а следовательно, судьбу генов биодеградации/резистентности в конкретных микробных сообществах.

В системе классификации плазмид псевдомонад (IncP) насчитывается 14 групп несовместимости (помимо целого блока неклассифицированных внехромосомных элементов) (Boronin, 1992). Особый интерес для биотехнологии представляют группы Р-1, Р-7 и Р-9, включающие плазмиды биодеградации ксенобиотиков и компонентов нефти (галогенированных соединений, капролактама, ароматических углеводородов и др.). В отличие от групп Р-1 и Р-9 (Adamczyk and Jagura-Burdzy, 2003; Sevastsyanovich et al., 2008), до настоящего времени не были детально изучены механизмы

поддержания и структурное разнообразие плазмид IncP-7-группы, не разработана их внутригрупповая классификация. D-плазмиды этой группы несовместимости вносят существенный вклад в биодеградативный потенциал окружающей среды и часто обнаруживаются в загрязненных образцах почвы и воды. Кроме, того, некоторые из них кодируют гистоноподобные глобальные регуляторы транскрипции H-NS-семейства и могут модулировать экспрессию хромосомных генов, в том числе повышая устойчивость бактериального хозяина к действию антибиотиков (Yun et al., 2010). Известны и IncP-7-плазмиды антибиотикорезистентности (архетип группы -плазмида резистентности к стрептомицину Rmsl48 из клинических изолятов P.aeruginosa), исследование механизмов поддержания которых представляет несомненный интерес для клинической микробиологии.

Цели и задачи работы. Цель работы - исследование организации базовых репликонов плазмид группы несовместимости Р-7.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать минимальные/базовые репликоны D- и R-плазмид группы Р-7.

2. Изучить организацию и особенности поддержания полученных репликонов.

3. Определить нуклеотидную последовательность полученных репликонов и провести филогенетический анализ областей, входящих в их состав.

4. Исследовать структурное разнообразие базовых репликонов и прилегающих к ним участков ДНК большой группы IncP-7-плазмид из лабораторной коллекции.

5. На основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей области инициации репликации и раг-локуса разработать внутригрупповую классификацию P-7-плазмид.

Научная новизна. В данной работе впервые получены минимальные репликоны плазмид биодеградации нафталина pFME5 и pYl-З и плазмиды устойчивости к стрептомицину Rmsl48 (архетип 1псР-7), а также базовый репликон pFME5. Определены нуклеотидные последовательности полученных репликонов, оценен круг их хозяев и стабильность поддержания. Проведен мутационный анализ базового репликона плазмиды pFME5, выявивший области плазмидной ДНК, необходимые для ее стабильного поддержания.

Подобрана большая группа праймеров для детекции и характеристики различных областей и генов в составе базовых репликонов плазмид группы 1псР-7.

С помощью ПЦР, рестрикционного анализа и избирательного секвенирования

впервые оценено структурное разнообразие базовых репликонов и гена герВ большой выборки IncP-7-плазмид.

На основе выявленного нуклеотидного полиморфизма участка repA-oriV-parWABC впервые разработана внутригрупповая система классификации P-7-плазмид.

В составе IncP-7-плазмиды биодеградации капролактама/салицилата pBS270 обнаружен функционирующий 1псР-1-подобный репликон, содержащий новый ген белка-инициатора репликации TrfA-семейства.

Научно-практическая значимость работы. Исследование организации и особенностей поддержания базовых репликонов плазмид группы 1псР-7 расширяет представления о системах репликации и сегрегации мобильных генетических элементов (МГЭ) и их эволюции, а оценка разнообразия P-7-плазмид - о распространении в популяциях микроорганизмов биотехнологически и клинически значимых фенотипических признаков, кодируемых плазмидами этой группы.

Подобранные в работе праймеры, специфичные к различным участкам областей инициации репликации (repA-oril') и активной сегрегации (parWABC) P-7-плазмид, можно использовать для обнаружения и классификации новых плазмид группы 1псР-7. Праймеры, специфичные к консервативному гену хеликазы UvrD-типа (repК), позволяют обнаружить инсерционные последовательности, внедренные в область, прилегающую к базовому репликону P-7-плазмид, а при небольшом размере инсерций - установить их нуклеотидную последовательность.

В дальнейшем возможно применение специфичных к некоторым областям Р-7-базовых репликонов праймеров для диагностики и мониторинга эффективности терапии бактериальных инфекций, вызванных псевдомонадами, несущими R-плазмиды группы 1псР-7. Более того, в связи с возросшими темпами распространения опосредованной плазмидами мультирезистентности обсуждается возможность «антиплазмидной терапии» с целью формирования чувствительности клинических штаммов бактерий к антибиотическим препаратам (DeNap and Hergenrother, 2005). «Мишенями» подобной терапии должны стать области, связанные с витальными для плазмидной ДНК процессами, а структура этих областей отличается у представителей разных групп несовместимости. Поэтому изучение организации базовых репликонов плазмид группы 1псР-7 может лечь в основу разработки соответствующей «антиплазмидной» терапии, дополняющей лечение антибактериальными препаратами,

при обнаружении циркуляции клинически значимых R-плазмид этой группы в больничных популяциях псевдомонад.

На основе базовых/минимальных репликонов IncP-7-плазмид могут быть созданы векторные конструкции. Учитывая круг потенциальных хозяев плазмид этой группы, вероятно использование P-7-репликонов в качестве векторов для клонирования в штаммах рода Pseudomonas и интегративных - в других систематических группах бактерий. В частности, минимальный репликон плазмиды pFME5 мы успешно использовали для изоляции генов биодеградации капролактама плазмиды pBS270.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на 13-й и 15-й Международных пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология -наука 21-го века» (Пугцино, 2009 г. и 2011 г.), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010 г.).

Диссертация была апробирована на совместном семинаре лабораторий биологии плазмид и молекулярной микробиологии ФГБУН ИБФМ РАН 14 декабря 2012 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 22 мая 2013 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 4 статьи и 3 публикации в сборниках трудов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: «Введение», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Список литературы». Работа содержит 28 рисунков и 4 таблицы, список литературы включает 170 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Структура области инициации репликации плазмиды резистентности к стрептомицину Rmsl48

Структура минимального репликоиа Rmsl48

Конъюгативная плазмида Rmsl48 (182 т.п.н.), кодирующая стрептомицин-фосфотрансферазу, была выделена из клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa (г. Франкфурт) и уже более 30 лет служит архетипом IncP-7-группы в классических тестах на несовместимость плазмид в лабораториях разных стран. Однако до сих пор отсутствует общедоступная информация о структуре ее репликона. Кроме того, Rmsl48 - единственная доступная IncP-7-плазмида антибиотикорезистентности, что

также послужило поводом для определения нуклеотидной последовательности ее области инициации репликации.

Для выделения и дальнейшего изучения участков, ответственных за репликацию плазмид, целесообразно конструирование их минимальных репликонов, содержащих ген белка-инициатора репликации (герА) и сайт начала репликации (огП% Был выбран самый радикальный способ ограничения репликона - амплификация участка герА-опУ плазмиды Ктя148 без прилегающих к нему генов. Под опУ подразумевалась область между геном герА и предыдущей открытой рамкой считывания (ОРС) секвенированных Р-7-плазмид. ПЦР-фрагмент (~2 т.п.н.), полученный с подобранными праймерами и лигированный с кассетой устойчивости к тетрациклину (Тс) для селекции плазмидосодержащих бактериальных клонов, мог автономно реплицироваться в клетках Р. аигео/аЫет В81393 и получил название Кгт148гшш.

Определение нуклеотидной последовательности мини-репликона Яте 148 (депонирована в ОепВапк под номером .(N698877) выявило следующие компоненты области инициации репликации (рис. 1):

1) тринадцать 18-членных тандемных повторов (потенциальных итеронов) с уникальным консенсусом 5'-СОАСТАСЛ(С/Л)АТТ(С/А)ССССТ-3', а также дополнительные редуцированные прямой и инвертированный повторы, перекрывающиеся.с предполагаемыми -35 и -10 боксами промотора гена герА;

2) два предполагаемых бокса взаимодействия с хозяйским инициирующим белком ОпаА: ТТАТССАСА (идентичен боксам в опС Е. соИ и опУ секвенированных 1псР-7-плазмид) и ТССТТСССТ (варьирует даже в пределах Р-7-группы, но в случае Игш148 наблюдается максимальное (4 нуклеотида) отклонение от консенсуса ТТ(А/Т)'ШСАСА, что вызывает вопрос о функциональности данного бокса);

3) две АТ-богатых области, разделенные ЭпаА-боксами и содержащие 12-нуклеотидные прямые повторы с консенсусом ТТТТЫТвТТТТТ, 3 из которых находятся в первой, дистальной по отношению к гену герА, области и 5 — во второй;

4) ген герА (867 п.п.), продукт которого, согласно выведенной аминокислотной последовательности, - белок размером 288 а.о., принадлежащий к Яер-З-суперсемейству а-белков.

Вполне вероятно, что не все описанные компоненты опУ обязательны для инициации репликации, поэтому данный участок следует считать расширенным ог1 V.

В единственной работе по изучению функционирования базового репликона Р-7-плазмиды (Shintani et al., 2006) показано, что в клетках Р. pulida DS1 при действии белка RepA in trans минимальный oriV плазмиды биодеградации карбазола pCARl укладывался в отрезок размером 345 п.н., включающий первую АТ-богатую область, итероны 1-6, оба DnaA-бокса и два 12-членных повтора из второй АТ-богатой области. Однако этот факт нельзя экстраполировать на остальные P-7-плазмиды в связи с определенной филогенетической удаленностью pCARl от них, как нельзя исключить и изменение потребности в компонентах oriV при репликации в различных хозяевах даже одного рода (Adamczyk and Jagura-Burdzy, 2003).

¡мг-локус ABC DnaA-боксы DE F GH rip A

область I облэс ib II

Рис. 1. Структура oriV плазмиды Rmsl48. А-Н - прямые 12-членные повторы в левой (1) и правой (И) АТ-богатых областях; 1-15 - итероны и итерон-подобные последовательности.

Rmsl48 содержит на 1 итерон больше, чем другие известные P-7-плазмиды (итерон 9 на рис. 1), что может влиять как минимум на степень проявления плазмидной несовместимости (Kim, 1996).

Филогенетический анализ области repA-oriVплазмиды Rmsl48

Для филогенетического -анализа области repA-oriV Rmsl48 использовали Р-7-плазмиды с известными нуклеотидными последовательностями pCARl, pND6-l, pWW53, pL6.5 и pDKl. Выявлен достаточно консервативный характер этой области в пределах группы, в отличие, например, от 1псР-9 (Sevastsyanovich et al., 2008). Тем не менее, Rmsl48 и pCARl формируют отдельные ветви на филогенетическом дереве (рис. 2). Из-за минимальных отличий repA-oriV плазмид pND6-l, pWW53, pL6.5 и pDKl можно предварительно объединить их в кластер (подгруппу) pND6-I. Нуклеотидная последовательность анализируемой области Rmsl48 идентична герА-oriVплазмид pND6-l-подгруппы на 83%, a pCARl - на 81%.

Следует отметить, что в группе Р-7, в отличие от Р-9, более консервативной выглядит последовательность гена герА, чем oriV. Если идентичность repA Rmsl48 аналогичным генам плазмид кластера pND6-l составляет 93%, a pCARl - 92%, то oriV - лишь 75-76 и 73% соответственно. Причем отличается даже размер расширенного

опУ плазмид, принадлежащих к разным ветвям филогенетического дерева. Фрагмент огИ' Ягп8148 размером 95 п.п., включающий итероны 2-5 и первый ОпаА-бокс, на 75% идентичен итерон-содержащей части опУ рЕСВ2 (малая криптическая плазмида Р.а1са1'щепе$). Этот факт в совокупности с гомологией белков ЯерА Ягш148 и рЕСВ2 может свидетельствовать в пользу возможного родства этих плазмид.

0.1

100

100

97

100

PL6.5 pDKl

L pNDn I

pCARl — R111S148

Рис. 2. Дендрограмма, иллюстрирующая эволюционные взаимоотношения между нуклеотиднымн последовательностями области repA-oriV плазмид группы 1псР-7.

Последовательность рЕСВ2 использована для укоренения. Дерево построено в программе TREECON с помощью метода ближайших соседей (Neighbour-Joining) и бутстрэп-анализа.

Предсказание структуры белка RepA Rmsl48

Выведенная аминокислотная последовательность белка RepA Rmsl48 на 99% идентична RepA подгруппы pND6-l и на 98% - pCARl. Белок гомологичен инициаторам репликации многих итерон-содержащих плазмид, включая F-фактор Е. coli, pSClOl, R6K, но максимальное сходство за пределами 1псР-7 наблюдается с рЕСВ2 (46% идентичности) и pPSlO (41% идентичности) при перекрывании аминокислотных последовательностей на 77%.

Предсказанные с помощью компьютерных программ вторичная и третичная структуры RepA Rmsl48 (как и P-7-плазмид из GenBank) имеют характерную для белков данной группы доменную организацию: по одной "крылатой спирали" (WH1-2-домены) на N- и С-концах (аминокислотные остатки 8-142 и 145-229), первая из которых обычно отвечает за межбелковые взаимодействия, а вторая содержит мотив типа спираль-поворот-спираль (НТН), взаимодействующий со специфическими участками ДНК (оператором, консервативными З'-коицевыми участками итеронов) (del Solar et al, 1998). В узнавании более вариабельных 5'-концов итеронов участвует первый WH-домен. На примере криптической плазмиды pPSlO показано, что главную роль в димеризации RepA и во взаимодействии его с хозяйскими факторами играет гидрофобный N-концевой мотив, так называемая лейциновая застежка (LZ, 26 а.о.). Предполагаемый LZ-мотив RepA Rmsl48 на 58% идентичен соответствующим

мотивам pPSlO и рЕСВ2, в то время как основной НТН-домен (в WH2) Rmsl48 на 52% идентичен рЕСВ2 и лишь на 39% - pPSlO, что не удивительно, если принять во внимание разницу в нуклеотидных последовательностях oriV этих плазмид. По сравнению с хорошо изученными Rep-белками pPSlO и F-фактора IncP-7-RepA имеет удлиненную на 20-40 а.о. С-концевую часть. Анализ вторичной структуры RepA Rmsl48 выявил, что эта область формирует дополнительную а-спираль.

Учитывая структурное сходство Rep-белков, кодируемых P-7-плазмидами, с RepA pPSlO, можно предположить сходный механизм их функционирования: мономер, связываясь с итеронами, инициирует репликацию, димер же взаимодействует с промоторно-операторной областью собственного гена, осуществляя авторепрессию.

Rep-белок pPSlO успешно используется в качестве модели для изучения процессов Р-агрегации (амилоидогенеза). Склонность к формированию амилоидных наноструктур повышается у A31 V-мутантов RepA (расширяющих круг хозяев pPSlO) до уровня, который демонстрирует р-амилоид, вовлеченный в развитие болезни Альцгеймера. Предполагается, что именно амилоидные агрегаты, возникающие при взаимодействии WHl-доменов мономеров RepA, «сидящих» на итеронах разных плазмидных копий, участвуют в регуляции репликации по типу «наручников» (handcuffing) (Giraldo, 2007). Структурное сходство RepA Rmsl48 с гомологом, кодируемым pPSlO, и результаты анализа аминокислотной последовательности RepA Rmsl48 в программе TANGO позволяют предположить возможность моделирования процессов амилоидогенеза с использованием Rep-белков IncP-7-плазмид.

Анализ структуры белка RepA и последствий мутирования его гена может пролить свет на причины ограничения круга хозяев плазмид P-7-группы. Потенциальный промотор герА далек от канонического для, например, энтеробактерий, что может быть причиной дефицита инициатора репликации в указанных хозяевах. Однако, в отличие от плазмид P-9-группы, при избытке RepA, вносимого in trans, mini-pCARl не реплицируется в клетках Е. coli (Shintani et al., 2006). Можно предположить, что факторами, ограничивающими круг хозяев плазмид IncP-7-группы, являются не только особенности промотора, но и неэффективное взаимодействие RepA с инициирующими хозяйскими факторами (DnaA, шаперонами). Стоит учесть,' что существует определенная гомология между LZ-мотивами Rep-белков Rmsl48 и pPSlO, а всего

лишь одна транзиция С—>Т, приводящая к замене A3 IV в данной области RepA pPSIO, разрешает эффективную репликацию плазмиды в Е. coli (Maestro et al., 2003).

К сожалению, попытки мутирования Rmsl48mini гидроксиламином с последующей трансформацией Е. coli DH5a не привели к формированию плазмидосодержащих колоний. С другой стороны, для репликации в энтеробактериях может требоваться присутствие не вошедших в состав Rmsl48mini элементов репликона.

2. Организация и особенности поддержания базового репликона плазмиды биодеградации нафталина pFME5

Структура базового репликона pFME5

Стабильное поддержание плазмид в бактериальных популяциях обычно обеспечивается системами активной сегрегации плазмидных копий перед клеточным делением (par), разрешения мультимеров (mrs) и/или постсегрегационной гибели бесплазмидных клеток (PSK). У секвенированных P-7-плазмид в непосредственной близости от области repA-oriV обнаружены гены par-системы. Участие конкретных областей и генов в поддержании P-7-репликонов изучалось только на примере плазмиды биодеградации карбазола pCARl. Этой информации недостаточно для установления общих механизмов репликации и сегрегации P-7-плазмид.

Для изучения структуры и функционирования rep/par-областей целесообразно конструирование базовых репликонов крупных плазмид, в состав которых входили бы только участки ДНК, обеспечивающие автономную репликацию (минимальный репликон) и стабильное поддержание. Следует отметить, что потребность в элементах минимального и базового репликонов для обеспечения соответствующих функций может несколько меняться в зависимости от бактерии-хозяина плазмиды.

Для конструирования базового репликона нами была выбрана конъюгативная IncP-7-плазмида биодеградации нафталина и салицилата pFME5 (80 т.п.н.). Хозяин плазмиды (P.ßuorescens FME5) был выделен из шламонакопителя ОАО «Нижнекамскнефтехим». Известна нуклеотидная последовательность только одной плазмиды биодеградации нафталина группы IncP-7 - pND6-l из Pseudomonas sp. ND6 (Китай, промышленные сточные воды), причем эта плазмида не способна к конъюгационному переносу.

Путем лигирования HindIII-фрагментов pFME5 с селективным маркером был получен укороченный вариант плазмиды - pFME5mini (около 7 т.п.н.), способный к

репликации в клетках P. putida BS394. ПЦР с парой праймеров, специфичной к гену герА, подтвердила, что полученный базовый репликон содержит генетические детерминанты P-7-группы несовместимости. Требовалось также установить, несет ли pFME5mini полный набор генов /w-локуса. Для этого на основе известных нуклеотидных последовательностей P-7-плазмид были подобраны 3 пары праймеров, специфичных к генам рагС (последний ген локуса) и рагА (кодирует сегрегационную АТФазу) pNDó-1-типа и pCARl-типа. ПЦР-анализ показал, что pFME5mini помимо гена герА содержит и par-локус (рис. 3, а), причем в составе pFME5mini обнаружен ген рагА pNDó-1-типа, как у плазмид pND6-l, pWW53, pL6.5 и pDKl.

Особенности поддержания pFME5mini в гомо- и гетерологичных хозяевах

Базовый репликон pFME5 был способен реплицироваться во всех пяти использованных представителях рода Pseudomonas (гомологичных хозяевах). Трансформация потенциальных гетерологичных хозяев (E.coli DH5a и Comamonas acidovorans В-1251) не привела к формированию плазмидосодержащих колоний, что соотносится с результатами других исследований (Shintani M. et al., 2006; Yano H. et al., 2010), определяющих круг хозяев IncP-7-плазмид как узкий, ограниченный только родом Pseudomonas или близкородственными ему таксонами. Обработка pFME5min¡ гидроксиламином не привела к образованию мутантов, способных реплицироваться в E.coli ни при 37°С, ни при 28°С.

В четырех из пяти неродственных штаммов псевдомонад репликон pFME5min¡ поддерживался стабильно (82-93% популяции сохраняли плазмиду после 10 сут культивирования в неселективных условиях), поэтому можно считать, что он содержит полный набор генов и участков ДНК, обеспечивающих автономную репликацию и сегрегацию плазмидных копий в бактериях рода Pseudomonas. Варьирование показателей стабильности репликона отражает влияние бактериального генетического окружения на поддержание внехромосомных элементов. Подобные результаты получены и при оценке стабильности базового репликона pCARl, который на 5-е сутки сохранялся в 96% популяции Р.putida DS1, но быстро элиминировался из штамма КТ2440, принадлежащего к тому же виду (Shintani et al., 2011).

Анализ нуклеотидной последовательности pFME5mini

Нуклеотидная последовательность была определена для HindIII-фрагмента (6952 п.н.), заключающего в себе базовый репликон, и депонирована в GenBank под номером

.1(3929663. Последовательность рРМЕ5гшт в среднем (исключая инсерционные элементы некоторых плазмид и вариации в числе палиндромов в межгенной области рагА-рагВ) на 99-100% идентична аналогичным последовательностям плазмид рКЭб-1-кластера и на 84% - рСАШ. содержит интактные гены герА, рагЦ>', рагА, рагВ, рагС и 5'-конец герВ (рис.3, б). Последний ген присутствует у всех известных Р-7-плазмид, но, видимо, не является обязательным компонентом их базового репликона в клетках псевдомонад. Судя по количеству нуклеотидных замен рРМЕЗгшгп филогенетически ближе базовым репликонам плазмид биодеградации толуола (р'\\'\\'53, рЬ6.5). чем нафталина ^N06-1). В отличие от р\\/\\'53 и pND6-l. исследуемая область рРМЕ5гшш интактна, т.е. не содержит вставок транспозонов или 18-элементов (рис. 3. б).

Структура огИ'' рРМЕ5гшш соответствует таковой ЯтвМЗ (у последней на 1 итерон больше). Ген герА рРМЕ5гтпш (867 п.н.) на 100% идентичен герА всех представителей рШ6-1 -кластера, на 96% - рСАЯ! и на 93% - Итэ148.

Рис. 3. Организация pFME5niini. а - Электрофореграмма продуктов амплификации генов в составе pFME5mini. 1 - герА (412 п.н.), 2 - рагС (267 п.н.), 3 - par A pND6-l-Tnna (355 п.н.), 4 -par А pCARl-типа (518 п.н.), M - 50 bp DNA ladder, б - Генетическая карта pFME5mir» (6952 п.н.). Гены, необходимые для репликации и стабильного поддержания базового репликона pFME5, тонированы. Прямоугольниками под схемой обозначены инсерционные элементы в соответствующих местах других плазмид 1псР-7 группы: ISPpu20 внедрен в pWW53 с удвоением последовательности АТТАА, IS222 внедрен в pND6-l с удвоением триплета GGT. Число над местом инсерции - позиция нуклеотида pFME5mini, после которого произошло внедрение IS-элемента в гомологичные плазмиды.

В составе par-локуса pFME5mini присутствуют гены рагА и рагВ, кодирующие классическую пару транс-действующих сегрегационных белков, обеспечивающих стабильное поддержание многих плазмид (Ebersbach and Gerdes, 2005). Наиболее вероятным претендентом на роль г/г^одействующего элемента parS для P-7-плазмид предложено считать уникальный 17-нуклеотидный палиндром (рис. 3, б),

обнаруженный между генами par А и рагВ всех плазмид группы и способный связывать

белок ParB (Yano et al., 2010). Плазмида pFME5mini, как и базовые репликоны pWW53, pL6.5 и pND6-l, содержит 4 повтора этого палиндрома, pCARl - 3 повтора, pDKI -всего 2. Положение сайта parS, характерное для репликонов P-7-группы, уникально, поскольку обычно он располагается либо перед, либо после par-оперона.

Выведенная аминокислотная последовательность белка ParA pFME5mini (377/394 а.о.) на 100% идентична гомологам, кодируемым плазмидами pND6-l-подгруппы, на 83% - pCARl, на 63-65% - РагА-белкам различных патоваров P. syringae, а также Pseudomonas sp. TJI-51 и P.putida DOT-TIE (pGRTl). Компьютерные программы определяли различные старты трансляции par А для членов pND6-l-кластера и плазмиды pCARl, т.е. N-концы ParA-белков всех плазмид, кроме pCARl, могут быть на 5% длиннее, а целый продукт состоять из 394 а.о. (у pCARl - 377 а.о.). Это исключает использование промотора, обнаруженного программой BPROM в непосредственной близости от инициирующего кодона укороченной (как у pCARl) ОРС, а именно на этом промоторе инициируется синтез транскрипта, содержащего ОРС генов рагА, рагВ, рагС у pCARl (Shintani et al., 2011). Однако в той же работе показано, что синтезируется (чуть менее эффективно) и более длинный транскрипт, с которого тоже транслируются перечисленные выше ОРС, но вместе с геном parW. Поэтому у представителей pND6-l-подгруппы возможен синтез удлиненных вариантов РагА с транскриптов, начинающихся перед parW.

Определение нуклеотидной последовательности области parlV-parA плазмиды Rmsl48 позволило выяснить, что точечная мутация перед геном par А (замена инициирующего триплета ATG на ААТ) исключает формирование удлиненного варианта белка, как и в случае pCARl. Но некоторая филогенетическая удаленность плазмиды pFME5 от Rmsl48 и pCARl допускает возможность модификаций в функционировании их базовых репликонов.

Обнаруженный на границе N-концевой и центральной частей белка РагА pFME5mini девиантный бокс Уолкера, а также размер белка (около 400 а.о.) позволяют отнести систему сегрегации IncP-7-плазмид к типу 1а общепринятой классификации.

Продукт гена рагВ pFME5min¡ состоит из 338 а.о., что также соответствует типу 1а сегрегационных систем, и идентичен соответствующим продуктам плазмид pND6-l-подгруппы на 99-100%, pCARl (342 а.о.) — на 71%, Pseudomonas sp. TJI-51 и патоваров Р. syringae - на 42%. Белок РагВ обычно взаимодействует с ДНК плазмиды в районе

«центромеры» parS. Комплекс РатВ-parS в присутствии АТФ распознается АТФазой РагА, молекулы которой полимеризуются в филаментарные структуры, «расталкивающие» плазмидные копии по клеточным четвертям, обеспечивая активную сегрегацию кластеров плазмид с одинаковым origin репликации. Считается, что АТФаза может самостоятельно «измерять» клеточное пространство, т.е. для позиционирования плазмидных копий перед клеточным делением не нужны специфические мембранные рецепторы, кодируемые геномом хозяина. Поэтому особый интерес вызывает обнаружение в составе par-локуса всех плазмид 1псР-7-группы гена предполагаемого мембранного белка - par IV.

Предсказанная аминокислотная последовательность продукта гена parW (159 а.о.) pFME5mini на 99-100% идентична гомологам,'кодируемым pND6-l-кластером, на 95% - pCARl, на 85% - Rmsl48, на 22% (перекрытие 82%) - гипотетическому белку Psychromonas sp. CNPT3, ОРС которого находится между генами транспозаз рядом с рагА. Кроме того, наблюдается некоторое (32% идентичности) сходство центральной части ParW pFME5mini с трихоплеин-подобным доменом гипотетического белка аскомицета Ajellomyces capsulatus Н88. Трихоплеин/митостатин, связанный с цитоскелетом, обеспечивает правильную локализацию центросомных белков в клетках эукариот, регуляцию клеточного цикла у позвоночных (Cerqua et al., 2010). Web-программы PredictProtein и SOSUI определяют трансмембранный домен у ParW pFME5mini в районе 12-29 N-концевых а.о., а 1-20 а.о. - как а-спиральный сигнальный пептид. Подобные структуры предсказаны для ParW всех представителей P-7-группы. Возможно, мембранные белки, кодируемые IncP-7-репликонами, взаимодействуя с комплексом ParA-ParB-/wS, обеспечивают «адресную» доставку сегрегируемых плазмид в зоны под клеточной мембраной и/или участвуют в компактизации разделяемых копий.

Функция продукта гена рагС не известна из-за отсутствия охарактеризованных гомологов. Аминокислотная последовательность РагС pFME5mini (106 а.о.) на 100% идентична соответствующим белкам рМ06-1-кластера и на 94% - pCARl.

С помощью дефектных по par-генам вариантов pFME5mini показано, что для стабильного наследования базового репликона плазмиды pFME5, как и филогенетически удаленной pCARl, необходимо наличие всех генов par-локуса, за исключением рагС (рис. 4), хоть он и обнаружен у всех известных 1псР-7-плазмид. Для

автономной репликации в псевдомонадах было достаточно области г ер А-ог IV (минимальный репликон. рРМЕ5гшшДраг1УАВС). Все дефектные по раг-локусу варианты рРМЕ5гшЫ утрачивались из клеток Р.аигео/аает В81393 медленнее, чем соответствующие варианты базового репликона рСАЯ1.

Рис. 4. Стабильность поддержания мутантных по ряг-локусу вариантов рГМЕ5гг)1П1 в Р. аигео/аЫепя В8Т393. Диаграммы для вариантов рРМЕЗгштДрагИ7 и рРМЕ5т1тД/югЛ не приведены, т.к. подобны диаграммам рРМЕ5гшп\kparWABC и рРМЕ5тшДрагАВС.

3. Классификация lncP-7-плазмид, основанная на структурном разнообразии их базовых репликонов

Полиморфизм области repAB-oriV

В отличие от представителей 1псР-1 и 1псР-9 -групп, до настоящего времени не было оценено структурное разнообразие IncP-7-плазмид, как не разработана и их внутригрупповая классификация. Рестрикционный анализ нескольких плазмид биодеградации P-7-группы не позволил разделить их на отдельные подгруппы (Измалкова и др., 2005). что может быть связано с большим количеством и разнообразием МГЭ. внедренных в плазмидный «остов» или же полиморфизмом самого «остова». Из коллекции лаборатории для оценки полиморфизма P-7-базовых репликонов были выбраны 11 плазмид. выделенные в разное время из географически удаленных мест, кодирующие разные фенотипы и отнесенные на основании микробиологического теста на несовместимость или ПЦР к группе IncP-7: Rmsl48 (SmR). pFME4 (NAH), pAK5 (NAH). pFME5 (NAH), pBS270 (CAP. SAL), pS6f (CAP, SAL), pOS18(NAH). pEx4 (CAP. SAL); линия pY (pYl-3 (NAH). pYl-7 и pY5-6 (SAL)).

Определение нуклеотидной последовательности гена Rep-белка позволяет установить принадлежность плазмиды к той или иной группе несовместимости, полиморфизм же этого гена может лечь в основу построения внутригрупповой системы классификации. С праймерами, специфичными к внутренней области гена

Стабильность поддержания дефектных по par -генам вариантов pFMESmini в P.aureofaciens BS1393

99 99

----pFME5mini

pFME5miniAparBC pFME5miniAparABC pFME5m¡niAparWABC pFME5miniAparC 2

герА на всех матрицах получены ПЦР-фрагменты ожидаемого размера - 412 п.н. Полиморфизм гена герА оценили с помощью рестрикции амплифицированных фрагментов эндонуклеазой НаеШ. Оказалось, что отличную от всех рестрикционную картину внутренней области гена герА имеет единственная R-плазмида - Rmsl48 (рис. 5). Причем все рестрикционные профили, кроме Rmsl48, соответствовали виртуальным рестрикционным картинам гена герА всех P-7-плазмид из GenBank. Таким образом, в отличие от секвенирования, рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов гена герА не позволяет различить pCARl- и pND6-l-подобные репликоны.

М 1 2 3 * 5 6

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов рестрикции 1ЩР-фрагментов гена ггрЛ (412 п.н.) некоторых плазмид Р-7-группы эндонуклеазой HaelII. М - 50 bp DNA ladder. 1 -Rms 148 (SmR), 2 - pFME4 (NAH), 3 - pAK5 (NAH). 4 - pFME5 (NAH), 5 - pBS270 (CAP, SAL), 6 -pS6f (CAP, SAL).

«Ниже» герА по ходу цепи ДНК у полностью секвенированных P-7-плазмид (их всего 4) локализован ген герВ, предположительно кодирующий ДНК-хеликазу суперсемейства i. Выведенные аминокислотные последовательности RepB этих четырех плазмид (693 а.о.) идентичны на 99-100%, С-концевая область (44% от общего размера RepB IncP-7) абсолютно идентична хеликазе, кодируемой плазмидой pGRTl, однако значимой гомологии с охарактеризованными функционально белками не обнаружено. Вторичная структура белка RepB демонстрирует доменную организацию 3'-5' UvrD-хеликаз, функционирование которых скорее связано с процессами репарации, чем нормальной репликации (Kumari et al.. 2010).

Несмотря на консервативный характер гена герВ и его присутствие в составе 4-х Р-7-плазмид, в случае pDKl ОРС rep В нарушена внедрением крупной инсерционной последовательности, а в случае pWW53 IS-элемент внедрен между потенциальным промотором гена герВ и стартом его трансляции (рис.6, а, в). Возник вопрос, является ли этот ген составной частью консервативного «остова» P-7-плазмид. и как часто он встречается в интактном виде. ПЦР с праймерами. специфичными к последовательностям ДНК в районе 100-160 п.н. «выше» и «ниже» ОРС герВ, выявила, что все 11 плазмид из лабораторной коллекции несут ген герВ (рис. 6, б). Размер большинства ампликонов соответствовал ожидаемому (2344 п.н.), а картины их гидролиза эндонуклеазами НаеШ и Rsal не отличались от виртуальных картин

рестрикции соответствующей области плазмид pCARl и pND6-l. ПЦР-фрагменты.

полученные на матрицах Rmsl48, рАК5, pYl-3, Y1-7 и Y5-6 были длиннее на 100-400

п.н.. что исключает внедрение в ген герВ и прилегающие к нему участки полноценных

IS-элементов/транспозонов. С помощью секвенирования у pYl-З и рАК5 обнаружены

уникальные инсерционные последовательности (рис. 6. а, в), внедренные в

плазмидный «остов» без удвоения нуклеотидов матрицы. 3'- конец «вставки» рАК5 на

87% идентичен 5'-инвертированному повтору Тп4654. Обе инсерции, видимо.

представляют собой остатки МГЭ, ранее некорректно «покинувших» место внедрения.

Рис. 6. Полиморфизм гена герВ и примыкающей к нему области у плазмид группы IncP-7. а - Схема базового P-7-репликона с обозначенными местами инсерций в районе герВ у представителей группы. Элементы, необходимые для репликации и стабильного поддержания репликона, тонированы, б - Электрофореграмма ампликонов гена герВ (праймеры RepBF-RepBR, размер без инсерций - 2344 п.н.): /

- pY 1-3*, 2 - рАК5, 3 - pFME4, 4 - pFME5, 5 - Rms 148, б - pOS 18, 7 - pS6f, 8 - PEx4, 9

- pBS270, M -1 kb DNA ladder, в - Размер инсерционных последовательностей в районе гена герВ. * ПЦР-фрагменты герВ плазмид pYl-7 и pY5-6 идентичны pYl-3.

Таким образом, большинство 1псР-7-плазмид несет интактные консервативные гены герВ, у рАК5 и pDKl инсерции нарушают ОРС этого гена, у pWW53 и pYl-3 (вероятно, и у родственных ей pYl-7 и pY5-6) инсерции локализованы в непосредственной близости от герВ, то есть исследуемая область является «горячей точкой» для внедрения чужеродной ДНК. Нельзя исключить, что адаптация Р-7-плазмид к узкому кругу хозяев (род Pseudomonas) могла привести к утрате потребности в хеликазе RepB. а в случае необходимости ее функции выполняют клеточные гомологи. Присутствие и характер инсерций не коррелируют с принадлежностью плазмиды к той или иной предварительной подгруппе, а, скорее, отражают индивидуальную историю репликона.

Область начала репликации (oriV) представителей P-7-группы менее консервативна, чем последовательность гена герА, что предполагает возможность разделения плазмид на подгруппы на основе анализа этой области. С помощью программы pDRAW32 была

il 1 i И peri Уg i^s) Г)

repB (rc^J1 parS pa*

ISpYl-З-400П.И

„ _ -- ¡ад ISрАК5-300пн.

нНМнк.Мн ,

* 2 ln a- IS pDKl (КЛЙ) ■ 2634 ив.

IS pWW53 (IS^puiö) - 1598 пл. IS RmsHS -100 м. (cm ?)

1 2 3 4 5 6 7 8 S M

разработана максимально дифференцирующая тактика рестрикции ПЦР-фрагментов oriV P-7-плазмид мелкощепящими эндонуклеазами. Обработка ампликонов размером ~ 1000 и.н. ферментом НаеШ привела к формированию рестрикционных профилей трех типов. По типу I (Rmsl48) гидролизовался ампликон только Rmsl48; по типу II (pND6-1) - ампликоны pFME4, pFME5, рАК5, pOS18, рЕх4, pS6f; по типу III (pCARl) - pYl-3, pYl-7, pY5-6. Определение нуклеотидных последовательностей участка oriV(l()() п.н.), прилегающего к раг-локусу плазмид линии pY (п-ов Ямал), не выявило у них ни одной замены по сравнению с аналогичным фрагментом pCARl (Япония).

Амплифицировать с подобранными праймерами oriV плазмиды pBS270 не удалось. На матрице этой плазмиды амплифицируется меньший фрагмент (-1400 п.н.), включающий ген герА и прилегающую к нему часть oriV (примерно до места предполагаемого промотора раг-локуса), в которую, видимо, не входят все необходимые для инициации репликации элементы, но присутствует 7 итеронов -детерминант плазмидной несовместимости. В нуклеотидной последовательности фрагмента обнаружено несколько точечных замен по сравнению с аналогичной областью репликонов pND6-l-™na.

Таким образом, рестрикционный анализ oriV позволяет четко разделить 1псР-7-плазмиды на кластеры, совпадающие (за исключением pBS270) с предварительными подгруппами, выделенными на основании филогенетического анализа области герА-oriV малого числа плазмид.

Полиморфизм генов par-покуса

Поскольку элементы раг-локуса вносят вклад в проявление несовместимости, а гены сегрегационного аппарата parWABC обнаружены у всех известных представителей Р-7-группы, была оценена возможность уточнения внутригрупповой классификации на основе полиморфизма этих генов. В дополнение к праймерам, специфичным к генам рагА и рагС, были подобраны праймеры, специфичные к внутренним областям генов parW и рагВ, в последнем случае - дифференцирующие pND6-l- и pCARl-типы. ПЦР-фрагменты генов parW и рагС формировались на всех плазмидных матрицах, кроме pBS270. У последней не был выявлен ни один элемент раг-локуса. Как раг Л, так и рагВ плазмид линии Y амплифицировались только с праймерами, специфичными к соответствующим участкам pCARl. Интересно, что с помощью праймеров,

специфичных к рагА и рагВ рМЭ6-1-типа, удалось получить ампликоны не только на матрицах рРМЕ4. рРМЕ5. рАК5. р0818. рЕх4. р86£ но и Яшз148.

По аналогии с опУ, для ПЦР-фрагментов генов рагН'АВ была разработана максимально дифференцирующая тактика рестрикции. На рис. 7, б приведены примеры рестрикции />аг№'-ампликонов (299 п.н.). Типу рК06-1 соответствовали рестрикционные профили плазмид рРМЕ4. рРМЕ5, рАК5. р0818. рЕх4. р86Г и Яш8148. а типу рСАЯ1 - рУ1-3, рУ1-7, рУ5-6. Однако секвенирование гена рагЦг Яшз148 выявило, что рестрикционный анализ не позволяет дифференцировать Ктз148 и pND6-l-подобные репликоны, хотя нуклеотидные последовательности их раг!¥ различаются больше, чем раг1¥ рСАЯ1 и pND6-I.

а б в г <)

Mi: 3 К 1 : 3 4 М Ml 2 34 1234М5678 IM

Рис. 7. Электрофореграммы продуктов рестрикции амплнфицированных фрагментов области oriV(a) и генов par-локуса (б-д) некоторых плазмид 1псР-7- группы.

а - ПЦР-фрагменты (4292F-5292R) oriV 3-х типов P-7-репликонов. обработанные эндонуклеазой НаеШ: 1 - Rmsl48 (тип I), 2 - рРМЕ5(тип II), 3 - рУ1-3(тип Ш). б - ПЦР-фрагменты гена parW, обработанные эндонуклеазой Rsal (К- интактный фрагмент рЕх4): I - рЕх4, 2 - pSöi 3 - Rmsl48, 4- pYl-3.

в - ПЦР-фрагменты гена par A pND6-l-THna. обработанные эндонуклеазой Rsal (дорожки 1-3), и pCARl-типа, обработанные Hpall (дорожка 4): 1 - Rmsl48, 2 - рЕх4, 3 - pS6f, 4 - pY 1-3. г - ПЦР-фрагменты гена рагВ pND6-l-Tima, обработанные эндонуклеазой НаеШ (дорожки 14) и Hpall (дорожки 5-8): 1 и 5 - pFME5, 2 и 6 - Rmsl48, 3 и 7 - pS6f, 4 и 5 - рАК5. д - ПЦР-фрагмент гена par В pCARI-типа. обработанный эндонуклеазой Hpall: 1 - pYl-З. На всех электрофореграммах: М - 50 bp DNA ladder.

Рестрикционные профили ампликонов рагА и рагВ (рис. 7, в, г, д) более четко отражали разделение плазмид на 3 типа, причем был обнаружен полиморфизм рагВ (наименее консервативного гена локуса) даже в пределах pND6-l-кластера. Профили гидролиза ампликонов /?а/--генов плазмид линии pY соответствовали виртуальным рестрикционным картинам соответствующих участков pCARI.

Результаты ПЦР-анализа par-локуса. дополненного рестрикцией и избирательным секвенированием, подтверждают основанное на полиморфизме минимального

репликона разделение плазмид группы 1псР-7 на 4 подгруппы (рВ8270 выделена в условную подгруппу из-за отрицательных результатов ПЦР с праймерами, специфичными к рог-генам и прилегающей к ним части ог/Г), а также позволяют сделать предположение о независимом приобретении минимальными Р-7-репликонами модулей раг\У и рагАВ или о различной степени «нуклеотидной адаптации» (амелиорации) этих модулей к генетическому окружению бактерий-хозяев.

1псР-7-репликоны образуют 4 подгруппы, не отражающие принцип «одна подгруппа - один кодируемый фенотип»

В системе классификации 1псР подгруппы принято обозначать буквами греческого алфавита, поэтому выделенные выше 4 кластера следует обозначить как подгруппы а, Р, у, § (табл. 1). Подгруппа а представлена Р-7-архетипом, единственной в группе плазмидой антибиотикорезистентности 11гш148. В подгруппу (3 включено большинство Р-7-плазмид биодеградации. Это самая крупная подгруппа, однако нуклеотидные последовательности базовых репликонов ее представителей высококонсервативны, за исключением разницы в числе палиндромов сайта рагБ и некоторого полиморфизма гена рагВ. Минимальные репликоны представителей подгруппы у быстрее элиминируются из популяции псевдомонад в неселективных условиях, чем герА-ог1У-фрагменты других типов. Возможно, структура области инициации репликации плазмид рСАШ-типа не в состоянии обеспечить взаимодействие с какими-то «хозяйскими» факторами, способными хотя бы частично компенсировать отсутствие собственного раг-локуса. Интересно, что у. плазмид у-подгруппы в участке опУ, прилегающем к гену рагIV и включающем АТ-богатую область I, обнаружена делеция 18-нуклеотидного фрагмента (по сравнению с репликонами других типов). В условную подгруппу 5 выделена плазмида рВ8270, содержащая редуцированный Р-7-репликон. Таблица 1. Подгруппы плазмид в составе группы несовместимости Р-7.

Подгруппа Представители

а Rmsl48 (SmR)

Р pND6-l, pOS18, pAK5, pFME4, pFME5 (NAH); pWW53, pL6.5, pDKl (TOL); pEx4, pS6f (CAP, SAL).

У pCARl (CAR); pYl-3 (NAH); pYl-7, pY5-6 (SAL).

8 (условная) pBS270 (CAP, SAL)

В целом, базовые репликоны известных P-7-плазмид, несмотря на обширную географию мест выделения, консервативны. Дивергенция нуклеотидных последовательностей гена герА между подгруппами составляет всего 7-8% (у Р-9-группы - 8-26%), области oriV- 24-27% (у P-9-группы - 7-36%). Это не удивительно, если принять во внимание узкий круг хозяев IncP-7-плазмид.

Для группы 1псР-7 характерно отсутствие корреляции между структурой базовых репликонов плазмид, входящих в одну подгруппу, и фенотипическими признаками, кодируемыми этими плазмидами (табл. 1). Трудно судить об исключительности подгруппы а в этом отношении, т.к. не обнаружены аналоги базового репликона Rmsl48 и не доступны для исследования другие R-плазмиды группы 1псР-7.

4. Мини-репликон плазмиды биодеградации капролактама/салицилата pBS270 содержит новый ген инициатора репликации TrfA-типа

CAP/SAL плазмида pBS270 проявляла слабовыраженную несовместимость с репликонами групп 1псР-7 и 1псР-9 (Есикова и др., 1990). С помощью ПЦР детерминанты несовместимости P-9-репликона в составе pBS270 выявлены не были. IncP-7-репликон данной плазмиды помимо консервативного для P-7-плазмид гена герВ содержал ген герА и часть oriV., но не удалось амплифицировать прилегающий к раг-локусу участок oriV и элементы самого 1псР-7-/?аг-локуса, хотя плазмида pBS270 наследуется в псевдомонадах стабильно. Поэтому вопрос о функциональной активности P-7-репликона остался открытым. Попытки ограничения мини-репликона pBS270 с использованием различных эндонуклеаз приводили к получению конструкций, не содержащих элементов IncP-7-репликона. Для изучения был отобран наименьший фрагмент (pBS270mini, 4,3 т.п.н.), способный к автономной репликации во всех использованных штаммах Pseudomonas.

Анализ нуклеотидной последовательности pBS270mini (депонирована в GenBank под номером JX840344) выявил 3 ОРС, 2 из которых были неполными. Вычисленная аминокислотная последовательность ОРС1 (138 С-концевых а.о.) оказалась на 93% идентичной продукту гена PACL 0400 геномного острова (ГО) Р.aeruginosa PACS171b и аналогичным белкам, кодируемым ГО других патогенных изолятов P.aeruginosa (CIG1, С79, 37308). «Ниже» по ходу транскрипции PACL 0400 у ГО находится ген, кодирующий TerD-подобный белок. В составе pBS270mini обнаружен только короткий 5'-концевой фрагмент этого гена, после чего нуклеотидная последовательность мини-

репликона резко утрачивает гомологию с ГО (рис. 8). В этой области обнаружены совершенный палиндром и прямые повторы, которые могут быть связаны с рекомбинационными событиями или служить регуляторными элементами.

ОРС2, вероятно, имеет химерную природу (рис. 8) и кодирует белок TrfA-типа (363 а.о.), родственный инициаторам репликации плазмид группы 1псР-1. Участие продукта именно этого гена в инициации репликации pBS270mini подтвердили с помощью Mfel-опосредованной делеции 161 п.н. в центральной части ОРС2. TrfA-белок pBS270min¡ при 28-80%-ном перекрывании последовательностей всего на 24-33% идентичен известным белкам TrfA-семейства. Ближайшие «соседи» TrfA pBS270mini на филогенетическом древе - белки плазмид (а также продукты генов, «заякоренных» в некоторых протеобактериальных хромосомах), отнесенных авторами работы (Stenger and Lee, 2011) к расширенной у-подгруппе IncP-1-группы (рис. 9). В неселективных условиях pBS270mini поддерживался нестабильно, а также, в отличие от большинства IncP-1-плазмид, не реплицировался ни в E.coli, ни в C.acidovorans, что указывает на узкий круг хозяев репликона или же на отсутствие в его составе областей, необходимых для репликации в бактериях других таксонов. Вычисленная аминокислотная последовательность ОРСЗ (209 С-концевых а.о.) на 58-62% идентична сайт-специфическим рекомбиназам XerD-типа (семейство фаговых интеграз) псевдомонад. Не исключено, что присутствие целой ОРСЗ в составе pBS270min¡ могло повлиять на круг хозяев или на показатели стабильности репликона.

Им 2)и : пи.

CGnGCT^GrGrCCCCCATGAGGCÖXiGTCACCOTOT

i PACLJW) irß i I

Рис. 8. Химерная область в составе репликона pBS270mini. Слева от пунктирной линии -последовательность, гомологичная ГО P.aeruginosa, справа - уникальная последовательность pBS270. Выделены жирным и подчеркнуты: ТАА - стоп-кодон ОРС1, гомологичной PACL0400 геномных островов; ATG - инициирующий кодон PACL 0399 (terD) геномных островов (у pBS270m¡ni ОРС неполноценна); ТСА - триплет, комплементарный стоп-кодону гена tr/A (ОРС2). Выделены курсивом и отмечены верхней стрелкой прямые повторы, на 100% идентичные в 2-ух локусах различной природы; встречными тонированными стрелками обозначен совершенный палиндром, отличающийся 1-2 нуклеотидами от палиндромов ГО.

Поскольку представители расширенной подгруппы у филогенетически удалены от «классических» IncP-1 -плазмид, a TrfA pBS270min¡ проявляет низкую гомологию с

инициаторами репликации даже этой полиморфной подгруппы, а также принимая во внимание отсутствие гомологии oriV и совместимость плазмид pBS270 и RP4 (1псР-1, a), trfA -содержащий репликон pBS270 был классифицирован как 1псР-1-подобный.

Анализ областей инициации репликации в составе pBS270 позволил обнаружить не только новый ген инициатора репликации TrfA-семейства, но и выявить сложный эволюционный путь плазмиды, насыщенный событиями горизонтального генетического переноса между различными генетическими элементами (плазмидой IncP-7-группы, носителем 1псР-1-подобного репликона и ГО P.aeruginosa).

0.1

I—I

Нтпоахеш кат АТСС 19707 (АВА56Ш) j

платила Desulfotalea pqxhrvphOa LSv34 (CAG37865) j

pNU'ATO! Ximiococais waaon/l C-113 (ADJ29S71) [ ^p j

- pPNAPOS РоЬттош nophthalennvram СЛ (ABM40183) | у (расширгаваа)

Geobcner nlfrrmhtctm PCA (AAR35551) Pelobacterprvpimnis DSM 2379 (АВК979ОД

G«obact«r itn-lfiT SZ (ACD94061) _

-[pDS270 (JX840.344)]

- шгаосш I Polanmcnca sp. JS666 (ABE4i917) |

I I I

■ pPNAP02 P naphthaittiiwrmu CI (ABM3974i)

-Pieudomonoi sp. GMB4 (ЕЖ39127)

-?р»»йСВ-1<АВУ9б594) ■ pXF-RIVtl XyUiaJiaUiosa Rhll CADF29413)

IncP-1,

7 (расширяла*)

Verminephmbacter eistniae EF01-2 (ABM60724) i -pQKH54 (CAJ43307) IncP-1, у

Ь

I— 9

- pMCBFl (AAY97979) IncP-1,?

- рВГГЗ (CAC9491!) IncP-1,£ _ pASI (CAI47811) IncP-1,0

. pLAFR®K2-d«ivam'i)(.AAS78884) hcP-1, a

■ pAKD4(ADD6327!) IncP-1,5

pDTG (IncP-9) (AA064263)

Рис. 9. Дендрограмма, иллюстрирующая эволюционные взаимоотношения между аминокислотными последовательностями белков TrfA-семейства, кодируемых «классическими» плазмидамн группы 1псР-1 (подгруппы a, (i, у, 8, г, Q, представителями расширенной подгруппы у и CAP/SAL-плазмндой pBS270. Указано только название штамма, если TrfA-белок кодируется хромосомой (или не установлена плазмидная локализация гена). Последовательность Rep-белка pDTGl (IncP-9) использована для укоренения. В скобках указаны номера, под которыми последовательности депонированы в GenBank. Дерево построено в программе TREECON с помощью метода ближайших соседей (Neighbour-Joining) и бутстрэп-анализа.

выводы

1. Сконструированы минимальные репликоны IncP-7-плазмид биодеградации нафталина pFME5 и pYl-З, плазмиды устойчивости к стрептомицину Rmsl48, а также базовый репликон pFME5.

2. Полученные минимальные репликоны, состоящие из гена герА и области oriV могут поддерживаться только в бактериях рода Pseudomonas в селективных условиях. Присутствие кластераparWABC, кодирующего систему активной сегрегации, в составе базового репликона плазмиды pFME5 стабилизирует его наследование, но не расширяет круг хозяев. Ген рагС, кодирующий гипотетический белок, на стабильность не влияет.

3. У плазмид IncP-7-группы наиболее консервативен ген инициатора репликации герА, максимальная дивергенция его нуклеотидных последовательностей в пределах группы составляет 8%, в то время как области oriV - 27%. Плазмида Rmsl48 отличается от остальных членов группы числом итеронов, локализованных в oriV.

4. Раг-система плазмид группы 1псР-7 относится к типу 1а сегрегационных систем, состоящих из АТФазы Уолкера (РагА), ДНК-связывающего белка (РагВ) и центромероподобной последовательности parS, однако у представителей группы IncP-7 локализация потенциального сайта parS - между генами рагА и рагВ - уникальна. Необходимым компонентом Р-7-Раг-системы является мембранный белок с неизвестными функциями (ParW).

5. У 15-ти исследованных плазмид IncP-7-группы «ниже» гена герА по ходу цепи ДНК обнаружен высококонсервативный ген герВ, кодирующий ДНК-хеликазу, однако его ОРС и область, к ней прилегающая, является «горячей точкой» для внедрения чужеродной ДНК.

6. В составе плазмиды биодеградации капролактама/салицилата pBS270, несущей детерминанты несовместимости группы Р-7 и ген герВ, отсутствует кластер parWABC и необходимая для инициации репликации часть oriV. Получен мини-репликон pBS270 и определена его нуклеотидная последовательность. Выявлена химерная природа pBS270mini. В составе репликона обнаружен новый ген инициатора репликации TrfA-типа, позволяющий классифицировать репликон как 1псР-1-подобный.

7. Организация базовых репликонов исследованных P-7-плазмид консервативна, однако различия в нуклеотидных последовательностях области инициации репликации

и par-локуса позволяют предложить первую систему классификации плазмид группы IncP-7, в которой репликоны образуют 4 подгруппы (а, ß, у, 8), не отражающие принцип «одна подгруппа - один кодируемый фенотип».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волкова О.В.. Кошелева И.А., Воронин A.M. Организация и особенности поддержания базового репликона IncP-7-плазмиды биодеградации нафталина pFME5 // Генетика. 2013. Т. 49. № 5. С. 558-568.

2. Волкова О.В.. Панов A.B., Кощелева И.А., Есикова Т.З., Воронин A.M. Новый ген инициатора репликации TrfA-типа обнаружен в составе плазмиды биодеградации капролактама/салицилата pBS270 // Молекулярная биология. 2013. Т. 47. № 2. С. 356360.

3. Волкова О.В.. Панов A.B., Кошелева И.А., Воронин A.M. Классификация 1псР-7-плазмид, основанная на структурном разнообразии их базовых репликонов // Молекулярная биология. 2013. Т. 47. № 2. С. 232-242.

4. Волкова О.В.. Кошелева И.А., Воронин A.M. Структура области инициации репликации плазмиды Rmsl48 (IncP-7), детерминирующей резистентность бактерий рода Pseudomonas к стрептомицину // Молекулярная биология. 2012. Т. 46. № 4. С. 605-611.

5. Волкова О.В.. Кошелева И.А. Структурно-функциональный анализ базового репликона плазмиды биодеградации нафталина pFME5 (IncP-7). Труды 15-й Международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, Россия). 2011. С. 33.

6. Волкова О.В. Анализ структурной организации базовых репликонов плазмид биодеградации, принадлежащих Р-7 группе несовместимости. Труды Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» (г. Тула, Россия). 2010. С. 43.

7. Волкова О.В.. Кошелева И.А. Анализ структуры базового репликона плазмиды биодеградации нафталина pFME5 (IncP-7). Труды 13-ой Международной пущинской. школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, Россия). 2009. С. 9.

Отпечатано в ООО «Тайм принт», ИНН 3666175538, г.Воронеж, ул.Карла Маркса, д.67,оф.24 Тираж 80 экз. 10.07.2013г. Заказ 082013

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волкова, Ольга Викторовна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИМЕНИ Г. К. СКРЯБИНА ПУ1ЦИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЕСТЕСТВЕННО-НАУЧНЫЙ ИНСТИТУТ

ОРГАНИЗАЦИЯ БАЗОВЫХ РЕПЛИКОНОВ ПЛАЗМИД ГРУППЫ

НЕСОВМЕСТИМОСТИ Р-7

На правах рукописи

04201 361 905

ВОЛКОВА

ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

кандидат оиологических наук И. А. КОШЕЛЕВА

МОСКВА - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..........................................................5

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................................12

1. Мобильные генетические элементы - неисчерпаемый источник генотипической изменчивости..................................................................................................................................................................12

1Л. Вирусы: суперпаразиты и соучастники................................................................................................................12

1.2. Плазмиды - ключевые «игроки» в процессе горизонтального переноса генетической информации................................................................................................................................................................................14

1.3. Транспозоны - универсальные генетические челноки..............................................................15

1.4. Интегроны - природные системы клонирования и экспрессии..................................17

1.5. Геномные ос трова - «пластилин» для эволюционного процесса............................19

2. Системы репликации бактериальных плазмид......................................................................................................26

2Л. Репликация по типу «катящегося кольца»......................................................................................................27

2.2. Репликация с вытеснением цепи (по типу D-петли)......................................................................29

2.3. Репликация по тета-типу................................................................................................................................................................30

3. Системы сегрегации низкокопийных плазмид......................................................................................................36

3.1. Системы сегрегации типа 1........................................................................................................................................................37

3.2. Системы сегрегации типа II......................................................................................................................................................40

4. Поддержание плазмид за счет постсегрегациопной гибели бесплазмидиых клеток....................................................................................................................................................................................................................................................41

5. Несовместимость плазмид........................................................................................................................................................................42

5.1. Свойство плазмидной несовместимости............................................................................................................42

5.2. Классификация плазмид по группам несовместимости..........................................................44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................................................................52

1. Бактериальные штаммы и плазмиды......................................................................................................................................52

2. Среды, источники углерода и антибиотики................................................................................................................54

3. Конъюгация........................................................................................................................................................................................................................55

4. Выделение плазмидной ДНК................................................................................................................................................................55

5. Приготовление компетентных клеток E.coli..............................................................................................................56

6. Полимеразная цепная реакция (ГИДР)....................................................................................................................................56

7. Визуализация ДНК и выделение ДНК из геля........................................................................................................58

8. Рестрикция ДНК и обработка концов фрагментом Клёнова..........................................................58

9. Лигирование ДНК....................................................................................................................................................................................................59

10. Мутагенез плазмиднои ДНК гидроксиламином..............................................................................................59

11. Трансформация штаммов E.coli, Pseudomonas, Comamonas плазмиднои ДНК..........................................................................................................................................................................................................................................................59

12. Секвепирование ДНК....................................................................................................................................................................................60

13. Конструирование минимальных репликонов плазмид Rmsl48, pFME5, pYl-3......................................................................................................................................................................................................................................................60

14. Конструирование базового репликона плазмиды pFME5..............................................................61

15. Конструирование мини-репликона плазмиды pBS270........................................................................61

16. Конструирование дефектных по par-vtнам вариантов pFME5mini................................61

17. Стабильность поддержания плазмиднои ДНК..................................................................................................62

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................................................64

1. Структура области инициации репликации плазмиды резистентности к стрептомицину Rmsl48..........................................................................................................................................................................................64

1.1. Структура минимального репликона Rmsl48............................................................................................64

1.2. Филогенетический анализ области repA-oriVплазмиды Rmsl48............................66

1.3. Предсказание структуры белка RepA Rmsl48..........................................................................................68

2. Организация и особенности поддержания базового репликона плазмиды биодеградации нафчалина pFME5........................................................................................................................................................71

2.1. Структура базового репликона pFME5..................................................................................................................71

2.2. Особенности поддержания pFME5mini в гомо- и гетерологичных хозяевах..............................................................................................................................................................................................................................................73

2.3. Анализ пуклеотидной последовательности pFME5mini..........................................................75

2.4. Мутационный анализ pFME5mini..................................................................................................................................79

3. Классификация 1псР-7-плазмид, основанная на структурном разнообразии

их базовых репликонов..........................................................................................................................................................................................82

3.1. Полиморфизм области repAB-oriV...............................................................................................................................82

3.2. Полиморфизм генов/?аг-локуса........................................................................................................................................89

3.3. Минимальные репликоны рСАРИ-типа быстрее элиминируются из популяции псевдомонад, чем минимальные репликоны других типов............... 93

3.4. 1псР-7-репликоны образуют 4 подгруппы, не отражающие принцип

«одна подгруппа - один кодируемый фенотип».................................................... 94

4. Мини-репликон плазмиды биодеградации капролактама/салицилата

рВ8270 содержит новый ген инициатора репликации Тг£А-типа........................ 96

ВЫВОДЫ................................................................................................................... 103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................... 105

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей белков ЯерА

плазмид ИлшМВ, рЕСВ2 и рРБЮ............................................................................. 121

ПРИЛОЖЕ11ИЕ 2

Сравнение иуклеотидных последовательностей области рагЖ-рагА представителей трех кластеров (подгрупп) 1псР-7-плазмид................................. 122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

а.о. аминокислотные остатки

АТФ аденозинтрифосфат

АТФаза адснозинтрифосфатаза

ГГП горизонтальный генетический перенос

ГО геномный остров

ДМСО диметилсульфоксид

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

МГЭ мобильные генетические элеменчы

ОРС открытая рамка считывания

ПАУ полицикличсские ароматические углеводороды

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

РНКаза рибонуклеаза

Трис трис[гидроксиметил]аминометан

т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

УФ ультрафиолет

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

Минимальный репликон область, необходимая для инициации

репликации плазмидной ДНК (гер-опУ).

Базовый репликон область, необходимая для инициации

репликации и стабильного поддержания плазмидной ДНК (минимальный репликон + раг-локус).

Ар ампициллин

Cap капролактам

Car карбазол

dNTP дезоксирибонуклеозидтри фосфаты

Е среда Эванса

Gfp green fluorescent protein (зелёный флюоресцирующий белок)

IS инсерциониый элемент

Km канамицин

LB среда Лурия-Бертани

Nah _ нафталин

Phn фенантреп

Rif рифампицин

Sal салициловая кислота

SDS додецилсульфат натрия

Sm стрептомицин

Тс тетрациклин

Тп транспозон

А аденин

Т тимин

G гуанин

С цитозин

IncP система классификации плазмид бактерий рода Pseudomonas, основанная на явлении плазмидной несовместимости.

D-плазмида плазмида биодеградации R-плазмида плазмида резистентности

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Бактерии рода Pseudomonas повсеместно распространены в природе и известны как деструкторы широкого спектра органических веществ, в том числе токсичных и канцерогенных поллютантов. С другой стороны, серьезной проблемой становится приобретение некоторыми условно патогенными представителями рода множественной устойчивости к антибиотикам [144]. Очень часто приведенные выше фенотипические признаки кодируются внехромосомиыми генетическими элементами - плазмидами биодеградации (D-плазмиды) и антибиотикорезистентности (R-плазмиды) [17, 151]. которые являются ключевыми «игроками» в процессе горизонтального переноса генетической информации в бактериальных популяциях.

Плазмиды классифицируюi по «даруемым» хозяину фенотипическим признакам, по размеру, способности к коныогационному переносу и т.н. Но наибольший интерес с молекулярно-генегической точки зрения предеiавляе! классификация плазмид по признаку несовместимости, поскольку она отражает эволюционный путь генетических элементов и основана на различиях структуры и функционирования их базовых репликонов, включающих области, ответственные за репликацию (минимальные репликоны) и стабильное поддержание плазмид в ряд}' бактериальных поколений. Плазмиды с близкородственными базовыми рспликонами не могут длительное время сосуществовав в одном бак1ериальном хозяине, т.е. несовместимы друг с другом и поэтому оiносяiся к одной группе несовмесшмосп! [12, 113J. Принадлежность плазмиды к той или иной группе несовместимости определяет круг бактериальных хозяев, способность к длительному сосуществованию с другими плазмидами в одном хозяине, а следовательно, судьбу генов биодеградации/резисгентности в конкретных микробных сообществах.

В сис1еме классификации плазмид нсевдомонад (IncP) насчитывается 14 групп несовмес1 имоеги (помимо целого блока неклассифицированных внехромосомных элементов) [17]. Особый ишерес для биотехнологии представляют группы Р-1. Р-7 и Р-9, включающие плазмиды биодеградации ксенобиотиков и компонентов нефти (галогепированных соединений, капролактама, ароматических углеводородов и др.). В

отличие от Р-1 и Р-9 групп [10. 135]. до настоящего времени не были детально изучены механизмы поддержания и структурное разнообразие плазмид IncP-7-группы, не разработана их внутригрупповая классификация. D-плазмиды этой группы несовместимости вносят существенный вклад в биодеградативный потенциал окружающей среды и часто обнаруживаются в загрязненных образцах почвы и воды. Кроме того, некоторые из них кодируют гистоноподобные глобальные регуляторы транскрипции H-NS-семейства и могут модулировать экспрессию хромосомных генов, в том числе, усиливать транскрипцию mexEF-oprN-onepona, кодирующего эффлюкс-систему, повышая устойчивость бактериального хозяина к антибиотикам [169]. Известны и IncP-7-плазмиды антибиотикорезистентности (архетип группы - плазмида резистентности к стрептомицину Rmsl48 из клинических изолятов P.aeruginosa), исследование механизмов поддержания которых представляет несомненный интерес для клинической микробиологии.

Цели и задачи работы

Цель работы - исследование организации базовых репликоиов плазмид группы несовместимости Р-7.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать минимальные/базовые репликоны D- и R-плазмид группы Р-7.

2. Изучить организацию и особенности поддержания полученных репликонов.

3. Определить нуклеотидную последовательность полученных репликонов и провести филогенетический анализ областей, входящих в их состав.

4. Исследовать структурное разнообразие базовых репликонов и прилегающих к ним участков ДНК большой группы IncP-7-плазмид из лабораторной коллекции.

5. На основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей области инициации репликации и /х/г-локуса разработать впутригрупповую классификацию Р-7-плазмид.

Научная новизна

В данной работе впервые получены минимальные репликоны плазмид биодеградации нафталина pFME5 и pYl-З и плазмиды устойчивости к стрептомицину Rmsl48 (архетип

1псР-7), а также базовый репликон рГМЕ5. Определены нуклеотидпые последовательности полученных репликонов, оценен круг их хозяев и стабильность поддержания. Проведен мутационный анализ базового репликона плазмиды рРМЕ5, выявивший области плазмидной ДНК, необходимые для ее стабильного поддержания.

Подобрана большая группа праймеров для детекции и характеристики различных областей и генов в составе базовых репликонов плазмид группы 1псР-7.

С помощью ПЦР, рестрикционного анализа и избирательного секвенирования впервые оценено структурное разнообразие базовых репликонов и гена герВ большой выборки 1псР-7-плазмид.

Па основе выявленного нуклеотидного полиморфизма участка герА-ог1У-раг\¥АВС впервые разработана внутригрупиовая система классификации Р-7-плазмид.

В составе 1псР-7-плазмиды биодеградации капролактама/салицилата рВ8270 обнаружен функционирующий 1псР-1 -подобный репликон, содержащий новый ген белка-инициатора репликации 'ПТА-семейства.

Научно-пракгическая значимость работы

Исследование организации и особенностей поддержания базовых репликонов плазмид группы 1псР-7 расширяе1 представления о системах репликации и сегрегации внехромосомных генетических -элементов и их эволюции, а оценка разнообразия Р-7-плазмид - о распространении в популяциях микроорганизмов биотехнологичеекп и клинически значимых фенотипических признаков, кодируемых плазмидами -этой группы.

Подобранные в работе праймеры, специфичные к различным участкам областей инициации репликации (герА-огИи активной сегрегации (раг1¥АВС) Р-7-плазмид, можно использовать для обнаружения и классификации новых плазмид группы 1псР-7, а также (в совокупности с праймерами, специфичными к ключевым генам биодеградации) для оценки биодеградативпого потенциала загрязненных территорий. Праймеры, специфичные к консервативному гену хеликазы иугО-типа (герВ), позволяют обнаружить инсерционные последовательности, внедренные в область, прилегающую к базовому репликону Р-7-плазмид. а при небольшом размере инсерций - установить их нуклео гидную последовательность.

В дальнейшем возможно применение специфичных к некоторым областям Р-7-базовых репликонов праймеров для диагностики и мониторинга эффективности терапии бактериальных инфекций, вызванных псевдомонадами, несущими R-плазмиды группы IncP-7. Более того, в связи с возросшими темпами распросфанения опосредованной плазмидами мультирезисгентности обсуждается возможность «ангиплазмидной iерапии» с целью формирования чувствительности клинических штаммов бактерий к антибиотическим препаратам [35]. «Мишенями» подобной терапии должны стать области, связанные с витальными для плазмидной ДНК процессами, а структура этих областей отличается у представителей разных групп несовместимости. Поэтому изучение организации базовых репликонов плазмид группы IncP-7 может лечь в основу разработки cooi встствующей «ангиплазмидной» герании. дополняющей лечение ан1ибак1ериальными препаратами, при обнаружении циркуляции клинически значимых R-плазмид эгой группы в больничных популяциях псевдомонад.

На основе базовых (или минимальных) репликонов IncP-7-плазмид могут быть созданы векторные конструкции. Учитывая круг потенциальных хозяев плазмид этой группы, вероятно использование P-7-репликонов в качестве векторов для клонирования в штаммах рода Pseudomonas и ингегративных - в других систематических группах бактерий. В часжосш. минимальный репликон плазмиды pFME5 мы успешно использовали для изоляции генов биодеградации капролакгама плазмиды pBS270.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 13-й и 15-й Международных путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2009 г. и 2011 г.). Всероссийско