Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физическая и функциональная характеристика криптической плазмиды pPМ1 возбудителя мелиоидоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарова, Ирина Борисовна, Волгоград

61: 99 ~ '6/Ь^ч " с

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ ВОЛГОГРАДСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ

(ВолгНИПЧИ)

На правах рукописи

Захарова Ирина Борисовна

ФИЗИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРИПТИЧЕСКОЙ ПЛАЗМИДЫ рРМ1 ВОЗБУДИТЕЛЯ

МЕЛИОИДОЗА

03.00.07 - микробиология

Диссертация

г

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, ст. н.с. Замараев В.С.

Волгоград - 1998

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................4

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................10

1.1 Плазмиды резистентности..................................................................10

1.2 Роль плазм ид в биологии патогенных микроорганизмов..................14

1.3 Некоторые аспекты изучения генетики и естественной изменчивости возбудителя мелиоидоза..............................................21

1.4 Собственные плазмиды возбудителя мелиоидоза.............................29

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................33

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................33

2.1 Бактериальные штаммы....................................................................33

2.2 Питательные среды и условия культивирования.............................34

2.3 Выделение ДНК.................................................................................35

2.4 Ферментативные реакции..................................................................38

2.5 Трансформация клеток Е.соН............................................................38

2.6 Методы электрофореза......................................................................39

2.7 Иммунохимические методы..............................................................41

2.8 ДНК-ДНК гибридизация...................................................................42

2.9 Получение препаратов клеточных мембран......................................45

2.10 Определение размеров рестрикционных фрагментов.....................46

3. ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ КРИПТИЧЕСКОЙ ПЛАЗМИДЫ рРМ1 ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА.........................47

3.1 Рестрикционный анализ нативной рРМ1...........................................47

3.2 Рестрикционный анализ фрагментов рРМ1, клонированных на мультикопийных векторах рВИ322 и рЦС19..................................... 51

3.3 Построение рестрикционной карты рРМ1 .........................................57

4.ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ рРМ1................................................59

4.1.Изучение гомологии ДНК рРМ1 с геномными ДНК

В.р8еиёота11е1, близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов................................................................................59

4.2.Изучение гомологии ДНК критической плазмиды рРМ 1 и фагов

возбудителя мелиоидоза.....................................................................61

5. КЛОНИРОВАНИЕ рРМ1 В ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМАХ.........64

5.1 Конструирование интегративного вектора на основе Со1Е1 репликона для клонирования в В.р8еис1ота11е1.................................64

5.2 Локализация области начала репликации рРМ1..............................67

5.3 Получение библиотеки рРМ1............................................................69

5.4 Клонирование Крп 1-фрагментов рРМ1 ............................................72

5.5 Анализ продуктов экспрессии рекомбинантных плазмид...............79

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................87

ВЫВОДЫ.....................................................................................................98

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.....................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДСН (БОБ) - додецилсульфат натрия

ИПТГ - изопропилтио- р -В-галактозид

ИФА - иммуноферментный анализ

м.к. - микробные клетки

МТТК - минимальная подавляющая концентрация

НМ - наружные мембраны

ПААГ - полиакриламидный гель

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

т.п.н - тысяча пар нуклеотидов

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

Ша - килодальтон

МОа - мегадальтон

Мг - относительная молекулярная масса

ХОа1 - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-(3 -Б-галактозид

ВВЕДЕНИЕ

Мелиоидоз - инфекционное заболевание, вызываемое Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei. Само заболевание и свойства его возбудителя были впервые описаны английским патологоанатомом Уитмором в 1912 году. Длительное время мелиоидоз считался довольно ограниченно распространенной инфекцией. Однако, по оценкам специалистов, проблема ме-лиоидоза сейчас значима не только для традиционно эндемичных регионов, но и для ряда областей, где заболевание ранее не регистрировалось (16, 35, 90,113,161).

Возбудитель мелиоидоза обладает чрезвычайно пластичными адаптационными механизмами, обеспечивающими существование как в постоянно меняющихся условиях природных биоценозов, так и в условиях пресса иммунной системы макроорганизма при развитии инфекционного процесса. Природная хромосомная трансформабелыюсть В.pseudomallei, наличие криптических плазмид, полилизогения - все эти факторы создают большие резервы для регулярных и нерегулярных перестроек генома, и, по-видимому, лежат в основе диссоциативного и адаптационного процессов (16).

Накопление знаний о структуре и функции геномов, анализ закономерностей и механизмов, лежащих в основе выражения важнейших биологических признаков многих микроорганизмов, включая известные высокопатогенные виды (Y.pestis, V.cholerae, B.anthracis), позволили раскрыть природу патогенности перечисленных бактерий и создать реальные предпосылки к совершенствованию средств профилактики и лечения вызываемых ими заболеваний (23, 28, 38, 43, 103, 126, 157, 165). На сегодняшний день достаточно много известно об основных биологических свойствах возбудителя мелиоидоза - составе и биохим ической активности клеток (21,112, 125, 170), наличии и функции отдельных ферментов и токсинов

(22, 61, 132,152, 169), продукции и структуре антигенов (5, 58, 59, 84, 114, 186), резистентности бактерий к разного рода ингибиторам и антибиотикам (12, 13, 14, 92, 115,198). Можно ожидать, что выявление генетических детерминант указанных факторов послужит основанием для дальнейшего целенаправленного генетического и молекулярно-биологического изучения патогенных свойств B.pseudomallei.

Одна из наименее исследованных областей генетики возбудителя ме-лиоидоза - внехромосом ные элементы наследственности. Имеющиеся публикации лишь констатируют факты наличия в штаммах Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei различного географического происхождения криптических плазм ид, стабильность их наследования, наличие специфических гомологичных последовательностей с хромосомными ДНК собственного и близкородственных видов (11, 41, 69, 75, 77), а также передаче в Salmonella typhi плазмиды от возбудителя мелиоидоза (187). Однако, в работах вышеназванных авторов не приводится каких-либо сведений о физической организации и функциональной роли обнаруженных плазмид. Изучение их физической структуры и выявление фенотипа су щественно дополнят знания о генетических детерминантах, лежащих в основе выражения важнейших биологических признаков Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei.

Цель работы

Изучение физической структуры и определение фенотипа криптиче-ской плазмиды pPMl Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei.

Задачи исследования

1. Физическое картирование pPMl.

2. Гибридизационный анализ pPMl.

3. Клонирование и изучение возможности репликации рРМ1 в гетеро-логичных видах микроорганизмов.

4. Характеристика продуктов экспрессии плазмиды рРМ1 в кишечной палочке.

Научная новизна

Впервые на критической плазмиде рРМ1 обнаружены и локализованы сайты узнавания для рестриктаз В gl И, Kpn I, а также пятый сайт для SalG I. Уточнены размеры фрагментов и взаиморасположение сайтов рестрикции в секторе карты с координатами: 5,4 -12,0. В целом, для рРМ1 построена физическая карта сайтов узнавания для специфических эндонукле-аз BarnH I, Bgl II, EcoR I, EcoR V, Hind III, Kpn I, Pst I, SalG I.

Локализована область начала репликации критической плазмиды рРМ1.

Показана экспрессия генов B.pseudomallei в клетках кишечной палочки.

На рРМ1 обнаружена детерминанта, ответственная за синтез белков наружной клеточной мембраны и определяющая множественную лекарственную резистентность рекомбинантных клонов E.coli.

Практическая ценность

Сконструирована библиотека щэиптической плазмиды рРМ1 в составе мультикопийных векторов pUC19 и pBR322.

Получены рекомбинантные штаммы кишечной палочки, продуцирующие поверхностный антигенный комплекс, специфически взаимодействующий с иммуноглобулинами поликлональной мелиоидозной сыворотки.

Разработан ускоренный метод плазмидного скрининга при исследовании большого количества рекомбинантных клонов кишечной палочки и утверждены методические рекомендации "Ускоренный метод обнаружения

плазм ид в штаммах Escherichia coli", утвержденные 10 марта 1998г. директором ВолгНИПЧИ Заслуженным деятелем науки РФ, профессором Тихоновым Н.Г.

Апробация работы

Материалы диссертации были обсуждены на институтских и межлабораторных конференциях ВолгНИПЧИ (1991-1996), на юбилейной конференции ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995), на международной научной конференции "Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания" (Харьков, 1995) и научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, отражающих основное ее содержание.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уточнена и дополнена рестрикционная карта рРМ1, локализована и клонирована область начала репликации, установлена возможность функционирования origin криптической плазмиды Burkholderia pseudomallei в кишечной палочке.

2. рРМ1 является резидентной плазмидой Burkholderia pseudomallei, обладающей гомологией с геномными ДНК различных штаммов возбудителя мелиоидоза и не содержащей последовательностей, гомологичных ДНК мелиоидозных бактериофагов.

3. Проклонирован фрагмент рРМ1, несущий детерминанту, экспрессия которой приводит к изменению белкового состава наружной мембраны и развитию множественной антибиотикорезистентности у рекомбинантных клонов кишечной палочки.

4. рРМ1 детерминирует синтез белков 23 и 27 kDa, входящих в состав наружной мембраны рекомбинантных штаммов кишечной палочки. Эти

белки специфически взаимодействуют с иммуноглобулинами поликло-нальной мелиоидозной сыворотки и способны к ассоциации в более высокомолекулярные формы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 115 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, иллюстрированных 6 таблицами и 28 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя по 198 литературным источникам (87 отечественных и 111 иностранных авторов).

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Наличие плазмид у самых различных прокариотов, видимо, надо считать скорее правилом, чем исключением (30). Плазмиды обнаружены даже у 3 из 4 представителей надцарства архебактерий ( 163, 190).

Широкое распространение внехромосомных генетических элементов показывает, что их присутствие не может быть безразличным для клеток-хозяев. Они сообщают микроорганизмам резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, придают способность подавлять рост других бактерий и утилизировать агрессивные химические соединения, служат для обмена генетической информацией, детерминируют факторы вирулентности патогенных бактерий (16, 17, 37, 44, 56, 65). И, тем не менее, функции плазмид этим не ограничиваются. Подтверждением этого является наличие криптических плазмид, которые сохраняются в клетках бактерий без видимого селективного давления ( 30).

1.1 Плазмиды резистентности

В широком плане к плазмидам резистентности относят плазмиды, детерминирующие резистентность бактерий к бактериальным вирусам, бак-териоцинам, сыворотке, ионизирующим излучениям, тяжелым металлам и другим факторам воздействия. Плазмиды лекарственной резистентности (П-плазмиды) кодируют устойчивость бактерий к лекарственным веществам, главным образом к антибиотикам и сульфаниламидам (56). Коньюга-тивные Я-плазмиды с широким кругом хозяев 1псЫ группы несовместимости детерминируют, помимо этого, такие важные функции, как рестрикция-модификация, устойчивость к ультрафиолету, синтез специфических ДНК-полимераз (74).

Впервые систематическое слежение за лекарственной резистентностью бактерий разных видов, выделенных от больных, было предпринято

еще в 60-е годы в Японии. Уже тогда изучение выделенных в этой стране штаммов Е.соН, устойчивых к тетрациклину, канамицину, стрептомицину, сульфаниламидам и сочетаниям антибиотиков с сульфаниламидами, показало, что клетки около 58% этих штаммов содержали плазмиды (56).

Ареал распространения коньюгативных и неконьюгативных Я-плазмид очень широк и охватывает даже такие экосистемы, где антибиотики никогда не применялись: Я-плазмиды выделены у бактерий из морской воды Антарктики (30).

Псевдомонады, в том числе возбудитель синегнойной инфекции, устойчивы к целому ряду обычно применяемых антимикробных агентов (72,73). Большинство публикаций, посвященных распространению II-плазмид у синегнойной палочки, посвящено коньюгативным репликонам. Частота их встречаемости у клинических штаммов значительно варьирует и составляет от 0,7 до 20%. При использовании антибиотиков или учете не-трансмиссибельных репликонов процент плазмидсодержащих культур значительно выше и может доходить до 87%. К-плазмиды чаще выявляют в клетках с высокой резистентностью к антибиотикам среди изолятов, выделенных от пациентов урологических и ожоговых клиник (18, 19).

В настоящее время описаны 13 групп несовместимости плазмид, выделенных у синегнойной палочки. Плазмиды, принадлежащие к одной группе несовместимости обладают значительной ДНК-гомологией (17,19, 107, 142).

Большинство Я-плазмид псевдомонад различных групп несовместимости имеют широкий круг хозяев и могут быть переданы во многие бактериальные виды путем коньюгационного переноса, мобилизации или трансформации. Считается, что плазмиды-"космополиты" могут играть роль челночных векторов, осуществляя обмен генетической информацией (142).

Плазмиды PI группы могут осуществлять собственный перенос и стабильно поддерживаться в бактериях, относящихся к самым различным родам, охватывающим едва ли не большинство таксономических групп микроорганизмов. К примеру, RP1 способна передаваться практически в любой грамотрицательный микроорганизм, а с низкой частотой - даже в B.cereus.(57, 134). Низкая специфичность представителей PI группы в отношении бактерий-хозяев находит объяснение в способности детерминируемых ими пилей узнавать компоненты или структуры клеточной оболочки, общие для ряда бактерий разных родов, что определяется наличием у плазмид этой группы сложной системы репликации и её контроля ( 42, 129, 164, 189).

Показано, что репликация RP4 начинается в уникальном локусе ori V (129, 158, 183), молекулярная организация которого существенно отличается от ori репликации многих плазмид E.coli с ограниченным кругом хозяев (122, 175, 189). Для инициации репликации необходима также позитивная функция гена trf А (188).

Важнейшим свойством плазмид PI группы является конъюгатив-ность и связанная с нею способность осуществлять перенос неконъюгатив-ных репликонов и фрагментов хромосомной ДНК (130, 133, 135).Установлено, что процесс конъюгации RP4 принципиально сходен с механизмом конъюгации плазмид других групп несовместимости (196).

Отдельные R-плазмиды кишечной палочки, по меньшей мере IncC, IncN, IncP и IncW групп несовместимости, передаются и стабильно наследуются P.aeruginosa. Следует отметить, что плазмиды IncN и IncW групп отличаются нестабильностью в синегнойной палочке и не встречаются в природных изолятах этого микроорганизма. Штаммы P.aeruginosa, получившие плазмиды IncN и IncW групп , приобретают маркеры резистентности, но внехромосомная ДНК у таких транско ньюгантов не выявляется. От-

дельные трансконьюганты синегнойной палочки, несущие в своей хромосоме плазмиду группы IncN, в последующих кроссах способны с повышенной частотой воспринимать плазмиды кишечной палочки групп IncC, IncS, IncN и затем передавать их E.coli. В то же время плазмиды IncFl, IncFl 1, Inda, IncM, IncT, IncX групп несовместимости способны передаваться при конъюгации Р. aeruginosa, но не существовать в этом микроорганизме в автономном состоянии (142). По мнению GJacoby (142), биологическое значение таких плазмид, способных передаваться в широкий круг микроорганизмов, но наследуемых только в результате интеграции в хромосому хозяина, заключается в том, что они способствуют стабильному наследованию генов резистентности гомо- и гетерологичными видами микроорганизмов. Такая изменчивость генома , возможно, распространенное явление, поскольку нередко выделяются полирезистентные клинические изоляты возбудителя синегнойной инфекции, у которых спектр антибиотикорези-стентности характерен для плазмидного контроля, но коньюгационный перенос маркеров устойчивости и внехромосомная ДНК не выявляются (142).

К настоящему времени описано множество фактов влияния R-плазмид на свойства бактерий, помимо приобретения последними устойчивости к антимикробным препаратам. По данным С.Ferreiras, M.Criado (121), наличие некоторых R-плазмид способствует повышению гидрофобности клеточной стенки кишечной палочки. Со спектром устойчивости, которую они сообщают, этот эффект не связан. R-плазмиды повышают ч