Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конъюгационный перенос R-плазмид Р-1 группы несовместимости у PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конъюгационный перенос R-плазмид Р-1 группы несовместимости у PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI"

На правах рукошю«

С е и и п п. а ч ^ " " • '.'. 2 * о п т п н п в п *

КОННГАЦИОННЬЙ ПЕРЕНОС И - 1ШЗМИД Р-1 ГРУППЫ НЕСОВМЕСТИМОСТИ У РЗЕШОМОМАЗ Р5Н1ГО0МАи£1

03. СЮ. 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Саратов 1005 р.

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители .-доктор медицинских наук, профессор в. И. Илюхин кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Л.К. Меринова

Официальные оппоненты:доктор биологических наук,профессор ю. А.Попое кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М.Сергеева

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 1995 г, а_часов

на заседании диссертационного совета Л 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" ( 410071 г.Саратов, Университетская, 46 ). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

//

Автореферат разослан " /<у / 1995 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор корнеев Г.А.

Актуальность проблемы Pseudomonas pseudcmal lei высоко патогенный вид псейдомояад Zo настоящего времени остается сравнительно (.¡ало изученным возбудителем тяжелого инфекционного заболевания - иелиокдоза, лечение и профилактика котпплт "^•—rr^;.;-,. 01.a4nw»""»

гонот;::-л я^«гсп идхим кз наименее разработанных разделов Экологии этого вида. Не расшифрованы механизмы изменчивости P.pseudomallel, определяювдо возможности адаптации микроорганизма во внеашей среде, по-существу нет каких-либо сведений о генетических детерминантах факторов его патогенности.

К началу наших экспериментов было описало получение маркирован!!:« штатов возбудителя мелиоидоза (Ряпис Л. А. ,1371, Тарасова Т.Д.,1984, Мериноза Л.К. с соавт. ,1990), установлена способность P.pseudomallei передавать участки хромосомы в процессе спонтанной трансформации (Булакцев А.Л.,1985). При помост генетической трансформации осуществлено картирование сцепленшк лскусов аук-зотрофности P.pseudcxnallei (Тарасова Т.Д. 1983 к iSS-i, Кшис И. А., 1888). Однако, поступление в бактериальны« кхечкз: ца-5слгппгх фрагментов ДНК при трансформации, ограничивает нспольго-ванне данного метода при анализе генома.

До настоящего времени у возбудителя мелиоидоза не была разра-5отана конъюгация. Ее проведение требует наличия в клетке конъ-огативной плазмидн. Однако, собственные факторы фертизьносга у возбудителя мелиоидоза не обнаружены (Петере М. К. ,1932), а его Фкптические плазмиды не обладают трансмнссивноотьп (Замараев 3.С. ,1990)..

Изложенное определило необходимость введения в клетки возбудителя мелиоидоза конъюгативньве плазмид других бактерий, которые

могли бы зкспрессироватъся и наследоваться в P.pseudomallei с сохранением структурной стабильности.

Ведущее положение плазмид Inc Р-1 группы, в развитии систем генетического анализа псевдомонад ( Chacrabarty А. ,1978, Haas D., 1881, Holloway В.,1986) делает целесообразным их применение для разработки конъюгации у P.pseudomallei. Наиболее перспективными показали себя плаамиды, несущие в своем составе мигриругаде генетические, элементы. Гомология между хромосомой плазмидой, создаваемая транспозонами, повышает вероятность образования Hfr -штаммов и R'-плаамид (Данилевич В.Н.,1984, Заренков М.И.,1984).Помимо втого, мигрирующие элементы имеют самостоятельное значение при исследовании генома, поскольку их внедрение в пределы структурных генов приводит к образованию инсерционных мутаций, что позволяет картировать биологически значимые области бактериальной хромосомы (Johnson S.,1979 Смирнова Н,И.. 1984).

Кониэгативные плаамиды нашли применение и для мобилизации нетрансмиссивных, в том числе рекомбинантных плазмид, сконструированных In. Vitro (Аниценко М.А..1982, Абаев Й.В. И др., 1995)

Указанные аспекты применения конгюгативных R-плазмад и транс-позонов для изучения геномов различных бактерий, у P.pseudomallei практически не разработаны. Вместе с тем, развитие их позволит приступить к изучению генетических основ вирулентности и иммуно-генности микроорганизма и целенаправленному созданию средств специфической профилактики ыелиоидоза. Таким образом, актуальность разработки метода конъюгации у возбудителя мелиоидоза, нуждающегося в развитии эффективных систем генетического анализа, не вызывает сомнений.

Цедь работы заключалась в разработке метода коныога-

- б -

ции у возбудителя мелиоидоза на основе плазнвд Inc Р-1 группы, применении R-плазмид для включения транспозонов в хромосому P.pseudomallei и изучении мобилизующей активности R-плазмид в отношении хромосомных и плазмидных генов.

Основные задачи исследования;

1. Подбор условий селекции ТОаНСКШГЫПРэи-пло „ —¿^UH-rniSKTiiirt июсоонл!ти ятялк>!5 f.pccudai.ulrti а отнсгекяи R-плаэмид Inc Р-1 группы.

2. Изучение особенностей наследования R-плазмид клетками воз-Зудителя мелиоидоза при межвидовой и внутривидовой передаче.

3. Разработка способа транспозиции Тп 10 в хромосому возбудителя мелиоидоза, получение набора инсерционных мутантов и юс характеристика.

4. Оценка мобилизующей способности некоторых R-плазмид в отношении хромосомных и плазмидкых генов.

Научная новизна. Впервые изучен процесс конъюгации у P.pseud:"*nallel - микроорганизма, способного к обмену генетическим материалом в ходе естественной трансформации. Определены условия внутри- it межвидовой передачи R-плазмид. Установлены особенности вырастая плазмддных генов в клетках P.pseudomallei. Отмечена высокая стабильность наследования плазмид Ino Р-1 группы штаммами возбудителя мелиоидоза.

Показана возможность эффективного применения RPt Rep Ts в качестве вектора Tn-злемента. Научена закономерность поведения плазмиды RPl::TnlO Rep Is в различных штаммах P.pseudomallei. Установлены сайты внедрения транспозона ТпЮ в хромосому возбудителя мелиоидоза. Создана коллекция маркированных втаммоа P.pseudo-nallei на основе инсерций ТпЮ.

- б -

Впервые показана эффективность использования й-пла^мид 1пс Р-1 группы для мобилизации в клетки P.pseudomallel неконъюгатив-ных реояиконов. Охарактеризованы общие закономерности наследования мобилизующей и неконъюгативной плазмид.

Практическая ценность. По итогам выполненного исследования составлены "Методические рекомендации по использованию транспозона ТпЮ для получения инсерционшс. мутантов возбудителя мелиоидоза" и "Методические рекомендации по применения канъюгативных R-плазмид для мобилизации в штаммы Pseudomonas pseudomallel неконъюгативных плазмид",которые рассмотрены и одобрены Ученым советом и утверждены директором ВолгНИПЧИ 12.03.92. Указанные рекомендации используются в практике работы Волгоградского НИПЧИ.

Создана коллекция ауксотрофных инсерционных мутантов P.pseudomallel, которые используются в генетических, молекулярно-биаяо-гических и иммунологических исследованиях.

Положения, выносимые на защиту.

1.P.pseudomallel обладает способностью к восприятию в конъюгации различных R-плазмид Inc Р-1 группы. В ходе конъюгации на плотной среде с применением мембранных фильтров при температуре 32°С и соотношении клеток донора и реципиента в экспоненциальной фазе роста 1:10 достигаются оптимальные условия для передачи в P.pseudomallel плазмид от гетерологичных доноров и проведения внутривидовых скрещиваний.

2. В клетках возбудителя мелиоидоза осуществляется эффективная экспрессия плаззддньк детерминантов резистентности. Переданные плазмиды стабильно поддерживаются в новом хозяине, обнаруживая в

- ? -

new тенденцию к снихекип мэггьогзтизноста.

З.й-плазкяды Inc Р-1 группы являются оффектизкыи инструментом для мобилизации нетрансмиссизных совместна плагмидных реошео-нов в клетки P.pseudomallei. Как способ перекоса йеконыэгатнвных плазмид мобилизация значительно превьсзет возможности генетической трансформации.

„. .""•^"р-—-- плааьэда КР1::Тп10

катет использоваться для включения а хромосому P.pseudcmallel тракспозона ТпЮ и получения rapo кого спектра инсерционных мутантов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на институтских научных конференциях 1986 - 1980гг.. а тагае на Российской научней конференции "Генетика и биохкмгя вирулентности возбудителей 00И" (Волгоград.1992).

По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей. Структура диссертации. Диссертация излеакка на 123 листах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, одной главы обзора литературы, четырех глаз собственных исследований с 23 таблицами и 2 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 180 источников, в тем числе 97 отечественных и 83 иностранных алторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы. В данном разделе диссертации содержится описание использованных в работе штаммов P.pseudcrallei, P.putl-da, P.aeruginosa, E.coli, а также плазмид и бактериофага. Приведены питательные среды и препарата , условия и способы их применения. Описаны методики получения мутантов о помощью нитроэогуа-яидина я исцеления итаммов P.pseudociallel от плазмид (Миллер

Дх..1976).метод определения минимальной подавляющей концентрации антибиотиков Шавашш С. U. .1902). Дали . способы коиызгациошшх скрещиваний в различных собственных модификациях. Трансформацию хромосомной и пдазмидной ДНК проводили по метолу Тарасовой Т.Д. (1884). Мобилизацию кеконъюгативной плаамнды KSF1010 и её производных, в клетки P.pseudanallel осуществляли в системе трехроди-гехьских скрещиваний (David M..1881). При скрининге uei. идозных птаммов на наличие плазмид. ДНК выделяли по методу КаЗо С. .Liu S.(19S1).с последующим исследованием ее в электрофорезе. Для трансформации P.pseudomallel плазмидой RSF1010, ДНК выделяли по методу, изложенному в руководстве Маниатиса Т. (1084). Идентификацию питательных потребностей ауксотрофных мутантов проводили по схеме Holllday R.(1B56).

Результаты исследования и их обсуждение

Выбор R-плазмид Inc Р-1 группы для введения их в клетки возбудителя мелиоидоза, обусловлен тем, что эти репликоны обладают широким кругом бактериальных хозяев и способностью эффективно мобилизовать хромосому псевдомонад.

На первом этапе исследований подбирали условия передачи плазмид RS8.45, рТНЮ, pRP19.6, RP4, RP1 от гетерологичных доноров в клетки возбудителя мелиоидоза. Для этого варьировали различные параметры : температуру инкубирования, продолжительность скрещивания, возраст культуры , соотношение клеток донора и реципиента, а такжа применяли интенсивное аэрирование культур и прогревание рещшиенгных клеток при 52°С для инактивации зндонуклеаз рестрикции.

Установлено, что максимальную рещшиентну» активность P.pseu-dotaallel проявляла, если культуры находящиеся в экспоненциальной

- з -

фазе роста, э ггрсгтсрцкн 1 клетка донора на 10 клеток реципиента, нанести на мембранный фильтр, псчеценкый ка поверхность I.-агара к инкубировать в течение 4 -18 ч. Причем, наиболее эффективно (с частотой Ю-5) перенос плазмид происходил при температуре 32°С. В отличие от других грамотрицательных микроорганизмов, конъюгация в жидкой питательной среде у возбудителя мелиоидоза проходила с низкой частотой . ,

Боосудите/.я мелиоидоза является его природная устойчивость к целому ряду антибактериальных препаратов, что определило необходимость тцательного подбора условий селекции. Сравнение уровней устойчивости к антибиотикам у Р.рэеис1ота11е1 и доноров плазмид показало, что различия в МПК канамицина я ампициллина у них незначительны ( в 2 и 4 раза, соответственно). Креме того, на средах о ампициллином и канамшшом возникали спонтанные аитибиотнкореэистенткые мутанты Р. рзеис!стга11е1 с частотой п- 10~б-Ю"7. Установлено.что тетрациклин является предпочтительным селективным агентом , обеспечквапвди достоверный отбор трансконъ-сгантов возбудителя мелиоидоза.

Таким образом, оптимальные условия передачи возбудителю мелиоидоза Р- плазмид 1пс Р-1 группы от гетерологичнкх декоров заключались в проведении конгюгационных скреяиваний на мембранных. Фильтрах, г.смег£ккых на поверхность плотной питательной среды при температуре 32°С 4-18 ч при соотношении клеток донора и реципиента 1:10. Лучшим селективным фактором был тетрациклин (50 икг/мл).

Отработанные методические приемы позволили изучить и в целой охарактеризовать рецнпненткые свойства ряда штаммов Р. рзеибслзД-1е1 в отнозении конъюгативных плазмид 1пс Р-1 группы.' В кроссах Р.рзеис)отаПе1 с донорами различных !?-плазмид, установлено, что

. - 10 -

наиболее эффективно передавались плазмиды К68.45. рТНЮ и р{?Р19.6. Частота их переноса в мелиоидозные бактерии при хетеро-логичньи скрещиваниях достигала 10~5 и зависела от воспринимаоде-го штамма. Наиболее активными реципиентами были штаммы 56770, 67676, 66830, С 141. 60806 и 56739. При этом саму плазмиду ЙЧ восприняла только половина из 35 изученных штаммов с частотой не правыиаодей 10~6 на клетку донора. Плазмиды 1?1я1::Тп9 и 1&з1::Тп10 передавались в ограниченной число штаммов возбудителя мелиоидоза с частотой 10~7-10"8.

Таким образом, показано,что возбудитель ыелиоидоза способен воспринимать плазмиды ИРА, Я 68.45, рТНЮ и pRP 19.6 от гетероло-гичных доноров в процессе конъюгации с частотой п*10"7 -10"5, зависящей от штамма и вида плазмиды.

При изучении закономерностей наследования клетками возбудителя мелиоидоза нонызгативных Я-плазмид. установлено, что плазмида ЙР4 е& производные м аналоги наследовались Р,рзеис1оп1а11е1 с выражением всех детерминант антибиотикоревистентности и сохранением коггыогативных функций. Отмечалась различная степень экспрессии генов тетрациклин-, ампициллин- и канамицинрезистентвости в сравнении с донорами. Наиболее эффективно выражались в Р.рБеисктПе! плазмидные гены 1е1 и кап. обеспечивая устойчивость к 300 мкг/мл тетрациклина и 10 ООО мкг/мл канамицина, -что превышало значения устойчивости доноров в 6 и 20 раз соответственно. Наличие Арк-ыаркера регистрировалось во всех культурах транскокъпгантов, однако ШК ампициллина - 200 мкг/мл - была на два порядка ниже, чем у донора Е.со11.

Установлено, что плазмиды {£з1::Тп9 ^51:: ТпЮ не пригодны для генетических исследований на модели Р.рэеийапаПе!, поскольку они с трудом передавались и быстро элиминировались из клеток возбуди-

е£Я иелиоидоза.

Сохранение кониогативностк плазмнд F354. R68.4S, pRP19.6 и ГН10 в клетках возбудителя мелиоидоза подтверждалась их трано-иссией как внутри вида, так и в скрещиваниях с E.coli. Косвенным оказателеи наличия конъюгативкьгх функций этих плаемид служила увствктельность tcP кп^ adr- е-глиипв i» "--г-г^^ои^чю.-»«»« «г» гиil ooprvr,^! kû йниялккз пысокая стабиль-ость наследования плазмидных маркеров Km" Ар11 клетками .pseudomallel (10 лет хранения в неселективных условиях), кото-ая предполагала хорошую корреляцию процессов сегрегации плаами-ы и хромосомы.

Следовательно, R-шшмнды Inc Р-1 группы наследовались новый озяинсм P.pseudcraallel в виде единых генетических структур, о ем свидетельствовали сохранение ими коныогативности а полная кспрессия генов tet.kan.anp э плазмидосодержащих птамиах.

Способность возбудителя мелиоидоза воспринимать и стабильно заведовать плазмиды Inc Р-1 группы послужила основанием для при-енекия дачных плазмид в качестве векторов транспсзоноз. Выбор ранспозсна Tnlû обусловлен данными о низкой специфичности его коочеиия. а тс;—s наличием удобного для P.pseudomallel селектив-ого маркера - устойчивости к тетрацш—ину. Вектором транспозона служила плааиида RP1 TcsRep Ts с делецией в гене tet и мутацией, ;елающей температурочувствительным процесс ее репликация.

Конструирование гибридного репликона RP1: :TnlO RepTs проводи->и в клетках E.colí, Затем штамм E.coll W3110 rscA::TnlO (RP1) !epTs использовали в качестве докорного в конъпгационных скрещиваниях с мелиоидозными бактериями. Штаммовые различия в частоте ¡осприятия векторной плазмиды не являлись препятствием для полу-[ения трансконъюгантов P.pseudomallel с Тс^-маркером транспозона

и Кв^-ыаркероы плазмвды. Отсутствие роста культур на среде с ка-наыицином при 42°С свидетельствовало о сохранении плазмидой тем-пературочувствителького фенотипа в новой хозяине.

Встраивание тралспозона ТпЮ в хромосому P.pseudomallel проведено на трех штаммах - 66770,57576 и 57562, стабильно наследуо-вих плаамиду RPl::Tnl0 Rep Is. Образование температур еаистент-вых вариантов у этих культур происходило с частотой tvl0~e-10~7. Тривиальная методика включения травспозона и элиминации плазмиды, состоящая в однократной выращивании культур в бульоне при непер-ыиссивной температуре (42°С), у P. pseudcciallel не приводила к образован® инсерционных мутантов. Лишь применение адаптированного метода Harayama S.(1981), состоящего в многократном поочередна« культивировании клеток возбудителя мелиоидоза с плазмидой RP1::ТШО Rep Ts при 42 - 32°С на L-arape с тетрациклином, позволило встроить транспозон ТпЮ в хромосому P.pseudanallel. При этом отмечено, что потери Кк^-маркера у инсерционных мутантов не происходило ни в одном случае, что свидетельствовало об отсутствии элиминации векторной плазмиды из клеток P.pseudomallel.

При инсерцгш транспозона ТпЮ в хромосому возбудителя мелиоидоза, ауксотрофные мутации возникали в 0,7 - 2.6Z случаев в зависимости от птамыа. Различался и спектр ауксотрофных мутаций. Наи-больпэе число поврежденных сайтов выявлено в штамые 55770 - это мутации по гкствдину, ыетиокину, изолейцину, валнну, аспарагину, глутамиау, лизину и тиосульфату. Наименьшее и совершенно отличное - в оташе Б7576. Это повреждения локусов, ответственных за синтез триптофана к пантотеновой кислоты. Мутации по триптофану, возникавшие как-более часто, отличались нестабильностью и быстро утрачивались. Все триптофановые, равно как и пантотековые мутации б или результатом иясерцка в один и тот ге локус, что подтвервда-

лось траясформадаоянкын схрегааанняки между ыу?антамя о однначо-еыу фенотнпои, на коыплементнрутаки недостаток питательных потребностей друг друга. У втаыыа 57562 возникав зуксотро5кна цу~ "Ш!тн, яуддазазиеся в метиояияе, треонине и гистздикз.

Наиболее стабильными были мутанты, дефектные по гвстияену.

катет» » й* »»иог»Г?« " ^ТрСТСГ^-

кости составляла Г10*в. Все мутанты, полученные з результате встраивания траяспозона ТпЮ в хромоссму Р.р5еисЗ«гдШ1, з тем числе реверткровавЕше к прототрофностл, сохраняли маркеры трало-позона и плаэмиды (Тс^Кп^). Первоначальный Тк-фенотип плазмады не оставался постоянным. В процессе хранения культур наблюдалось вы-пегиенне вариантов Тс^К.тг4!3 с темперзтурочувствительной плазия-дсй. В ауксотрофкьк ТскК.-лкТя-клонах плазмвда ке выявлялась при электро$ореткческси исследовании - ДНК и не проявляла кенгвгатав-ности, в то зремя как из Тс^Кя^-итамнов олазлглда передавалась з гетерологичные и гомологичные реципиенты я ее антснсмное ссстсг-лне подтверждалось эдектрсфзретичесюы анализе:« образцов ДНК.

Предпркнкуялйсь пепытка еыдбйть возможное пере«е™еш:9 тразс-позона Тлю п пределах уагтаа екгшсшм. При анализе »•эясклонэз . различных аумсотрс.}:пос иисерциояюх чутактов ? род&гзШ! аа одной вторичной мутации выявить не удалось. Эти результаты сопоставимы с данкыгл литература по кзучежзо мутаций, кндупигаван-ных трзнспозоначи Тпо и Тп9 у Р.р&эисЗотаИэ! и Р.га11е1 (Агеева Н.П..1932. Нержоза Л.К.,1992). где формирование мутаэтев. гнду--шгрсванных Тп-элементами происходило с частотой 0,5 - 1,6%, но выявить перемещение транспозоноа в пределах участков включения не удалось. •

Обобщая данные этого раздела,. подчеркнем особенности поведения внехромосомных элементов в клетках возбудителя ыелиоидоза.

Пааамида RP1: :TntO RepT3 слугзиа эффективна вектором транспозо-ва. Образование ауксотрофных мутантов происходило только после 4-к кратного поочередного культивирования P.pseudomallel RP1: : TnlO RepTs при 42 - 32°С ва плотной питательной среде. При этом векторная плазмида не элиминировалась, а включалась в геном возбудителя мелиоидоза, что подтверждалось стойким наследованием Кгг^-маркера всеми инсерционными мутантами, наряду с отсутствием плазмиды в автономном состоянии при электрофоретическом анализе ДНК, выделенной из инсерционных мутантов.

Транспозиция ТпЮ в хромосому различных штаммов происходила с частотой 0.7 - 2.6Х, в каждом отдельном штамме имелись свои определенные сайты интеграции Тп-элемента. Выявленный спектр ауксот-рофности включал девять лок/сов. Перемещение транспозона в пределах участка включения не происходило. Плазмида, стабильно наследуемая инсерционными мутантами, имела вариабельный TR - Xs -фенотип.

Четкая экспрессия всех плазмидных генов в клетках P.pseudo-aallel и высокий уровень их стабильности стали предпосылкой для изучения мобклизуюпей активности этих репликонов в отношении хромосомных и плазмидных генов. При использовании P.pseudomallel в качестве донора R-плаамвд. обнаружили,что эффективность переноса плазмад RP4.R 68.45 и рТНЮ внутри вида оставалась такой же, как при передаче от гетерологичных доноров. Штаммы P.pseudctnallel (R68.45), скрещенные с ауксотрофными реципиентами, передавали мар керы pur, his, met, trp, phe с одинаковой частой rrlO-5. однако добавление к кроссовой смеси ДНКазы полностью подавляло образование рекоыбикантов. Чувствительность наблюдаемого процесса к ДНКа-ве позволяла расценивать его как спонтанную трансформацию. Сравнительное изучение условий, в которых протекали конъюгация и

спонтанная трансформация, показало,что при соксстси культивировании донорных и реципиентных клеток на агаровых средах происходит перенос как плазмидннх (TcR), так и хромосомных маркеров (pur, met, his, trp, phe). Введение в кроссовую смесь ДНКазы не влияло на эффективность передачи плазмиды, ко пазипет*

Г^пОй. ыгятаа ii G004X

ниях - от донора к реципиенту и наоборот, что служило дополнительным подтверждением трансформационной природы наблюдаемого переноса. Установлено, что плазмиды эффективнее передавались на полноценной питательной среде конъюгационным путем, а хромосомные гены - в ходе спонтанной трансформации на минимальной среде.

замечено, как по мере хранения плазмидосодержацих штаммов, кон?югативностъ плазмид в ких постепенно снижалась. Поэтому для повышения доноряой активности плазмиды рШО был испробован метод адаптации плазмиды к новому хозяину, состоящий з последовательной передаче рТНЮ ые.гду различными рециаиентюла птакнами P.pseudanallel. Однако, адаптировать плазииду с псмоаью повторсэ-дайся системы "донор - реципиент" у возбудителя мелиоидоза не улаяоо.. Напротив, nocie 4-5 передачи внутри вида частота переноса рТНЮ снизилась на два порядка, з отлично от P.mallel, где применение данного метода повысило эффективность передачи плазмиды (Агеева Н.П.,1989). Для оптимизации условий внутркзздсвсго переноса R-плазмид. пробовали уменьшать количество тетрациклина в селективной среде а 10 раз. В качестве рецкпнентоз при зтса использовали Тс3-мутанты P.pseudanallel, полученные с покощьв шгг-розогуанилина. Однако, заметкой разницы в количестве трансконъ-югантов, возникающих на среде с тетрациклином 5 и 50 мкг/ал за-, фиксировано не было., В то время как у P.mallel, снижение концентрации селективного агента в среде явилось основным фактором, узе-

дичхваим частоту переноса плаамиды рТНЮ на два порядка (Агеева Н.П.,1992).

На основании этих опытов был сделан вывод о той, что обмену R-плазмидами внутри вида препятствовали особенности, присущие возбудителю ыелиоидоза: при стабильном наследовании плазмид, трансыкссивность юс угнеталась. Помимо этого, естественная трансформация успешно конкурировала с коныогационным переносом хромосомных генов.

Попытки конструирования донорных втаммов предпринимались на основе температурочувствительной по репликации плаамиды pRP19.6 с аипициллнновым транспозоном. Поиск клонов с интегрированной в хромосому плазмидой осуществляли среди вариантов, у которых элиминация плаамиды достигалась при многократном культивировании при непермиссивной температуре 42°С. При этом удалось выделить штамм 67576 (pRP19.6)TInd, проявляющий антибиотикорезистентный фенотип плаамиды и не имаваий плазмидной ДНК в свободном состоянии. При скрещивании субклонов штамма 57576 (pRF19.6) îIn<1 с ауксотрофными мутантами P.pssudcmallel был выявлен перенос хромосомных маркеров (Pur,His, Met, llv) с частотой гг 10~7-10~е. который расценили как перенос, опосредованный плазмидой. поскольку он не снимался ДНКа-еой. Направленного переноса хромосомы в данном случае не наблюдалось.

Изучение способности R-плазмид мобилизовать на перенос другие репликоны, помимо хромосомных, проводилось в отношении RSF1010 и созданных на ее основе рекомбинантных плазмид pVAl, pVA4, не обладающих собственной трансмиссивностьв. Мобилизацию этих плазмид осуществляли с использованием RP1 или рТНЮ в два этапа. На первом - совмещали некотягативную и мобилизующую плаамиды в клетках E.coll, а на втором проводили мобилизацию RSF1010 или ее произ-

водных в бактерии возбудителя маиюидоза. Для пыпогвешш последнего этапа была разработана методика селекции по Тс"-маркеру ио-бнлкзующей олазмиды, поскольку высокая природная устойчивость P.pseuckxnallel к стрептомицину (маркеру iSFlOlO), исключала возможность отбора »а средах с этим препаратом. В последующем

Тс^-клоны "1 CiüeiiTiwnnrar»! (f?*?? "T/lii.) .

ÜCHSieüiie у Тсг-клсксз сслее высокого уровня стрептомицкнрезт-тентности, по сравнению с исходным (500-1000 мкг/ыл), служило показателем наличия плазциды RSF1010, которое затем подтверждалось электрофоретическим исследованием образцов ДНК . выделенных из этих клонов.

Плазмнды рТНЮ и RP1, передававЕиеся в иглкоидозные бактерия с частотой ггЮ~7-10"5, обеспечивали перенос RSF1010 и ее производных в различные шташы в 76 - 89Х случаев, при этом сама пжаз-мида также ст&5ильно сохранялась з клетках P.pseuöcsnallel ссэ-ыестно с RSF1010 в виде изолированного региккона. Это свидетельствовало о своеобразии наследования R-плязмэд возбудителем ¿гзлхг-оидоза, поскольку, например, в клетках P.rallel юбзггугго» плазмиды рТНЮ и RP1 не сохранялись (Аиишрщу Ы.А. .1С02). а в E.coll формировались стабильные гаинтегратн та пеюнктгтщпсй и мобилизующей плазмвд (Муронец E.U. ,1837, Ронсон К. .1638).

Следовательно, установлена возможность передавать некогшгг-тизиые реплкконы, способные реплицироваться в P.pseudcmallel. с помощью плазиид inc Р-1 группы рТНЮ и 13*1. Следует отметить, что у возбудителя медкондоза метод кобнлкзедай иожно считать предпочтительным перед генетической трансформацией, изгорая мало эффективна при передаче плазмидиых ДНК (Кучераева 8Л.,1892).

Тааы образом, впервые проведенное изучение процесса конгпгат ции у природнотраксформирущегося высокопатегенного микроорганка-

на Р.рзеи<3ала11е1 показало,что возбудитель келкокдоза является хорошим реципиентом й-плазмид 1пс Р-1 группы и наследует их с высокой степенью стабильности.

Установлена эффективность применения 1?-плазмнд в качестве векторов транспозонов. Созданная нами коллекция инсерционкых мутантов, открывает перспективы для дальнейшего изучения генома Р. р5еийапа11е1 методами трансформации или молекулярного клонирования. .

Показана эффективность использования 1?-плаамид 1пс Р-1 для мобилизации неконъогативкых репликонов в клетки Р.р5еискгоа11е1. Метод мобилизации не имеет альтернативы при введении в клетки возбудителя мелко ид оза молекул ДНК не имеющих удобных для работы селективных маркеров.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны оптимальные условия передачи (?-плазмид 1пс Р-1 группы в клетки Р.рэеисЗотаПе!, заключающиеся в проведении конъюгации на плотной среде с использованием мембранных фильтров при температуре 32°С и соотношении клеток донора и реципиента в экспоненциальной фазе роста 1:10. Установлено, что тетрациклин является предпочтительным фактором селекции трансконъюгантов возбудителя мелиоидоаа.

2, Показано, что большинство штаммов возбудителя мелиоидоза способно участвовать в процессе бактериальной конъюгации и воспринимать плазыкды ЙРА. 1®8.45. рТНЮ и рИПЭ.б с частотой ггЮ"7 - 10~5 на 1 донорную клетку. Плазмиды передаются внутри вида с частотой, не превышавшей эффективность межвидового переноса, постепенно утрачивая коныогативность в процессе хранения.

3. Плазмиды Р-1 группы несовместимости CTaOiLSi.no наследуются клетками P. pseudomallel, опосредуя высокую резистентность к тетрациклину и канамицину и более низкую - к ампициллину, уступающую по уровню устойчивости гетерологичным донорам.

4. Показано, что плазмида RPl::TnlO Rep Ts может служить век-

"Т4' _____________________ия мп»»™

«озн. Идентифицирован ряд ТпЮ-индуцированных мутантов. нуддго-щихся в изолейцине, валине, гисгидиие, иетшШе, триптофане,-панготеновой кислоте, лизине, тиосульфате, аспарагине, глутгмине и треонине, с преобладанием зависимых по триптофану. Перемещение транспозона ТпЮ в пределах участка включения не выявлено. Отмечено, что векторная плазмида не элиминируется :гз ¡теток инсерцксшкос мутантов, обнаруживая в них вариабельный TR - Ts фенотип.

5. На основе температурочувствительной по репликации плазмиды PRP19.6 получен атамм P.pseudanallei 57576 (pRPl9.6)TInd, в котором осуществлена интеграция плазмиды с хромосомой, показана способность плазмиды к мобилизации на перенос отдельных маркеров ауксотрофности с частотой гг Ю~7-10~в на 1 доноряу» клетку.

6. С помощью плазмиды рТНЮ проведена эсМкктияяяа нс-конгюгатяьных р^пликоиоэ RSF1010, pVAl и pV.M в атат» r.pjeu-donallel. установлено совместное наследование клетками иелкоидоэ-ного микроба нетрансмиссивкых и мобилизующих плазиид в виде изолированных репликпноз. Продемонстрировано преимущество метода мобилизации некотягатнвиых планид в клетки P. pseudciialls 1 серсд их трансформационной передачей.

Список работ, опубликованных .по теме диссертации:

1. Сеимова И.К.. Меринова Л.К.. Петере М.К. Особенности конъ-сгациониой передачи некоторых плазмид Р-1 группы несовместимости в штаммы Pseudomonas pseudomall el // Микробися.журн. -1988. - N3. -С.68 - 71.

2. Сеимова И.К.. Меринова Л.К., Варыханова Т.Г. Конгвгациокный перенос плазмиды R 68.45 между штаммами Pseudomonas pseudomallei // Особо опасн. инфекц. заболевания: иммунол., генет.и биал. свойства возбудителей. - Волгоград.1989. - вып.5. - С.192 - 196.

3.Меринова Л.К.. Сеимова И.К., Анищенко М.А. Применение конъ-югативных R-плазмид для мобилизации в штаммы Pseudomonas pseudo-mallei плазмиды RSF 1010 // Особо опасн. инфекц.заболевания: иммунол.. генет. и биол. свойства возбудителей. - Волгоград,1989. -вып.5. - С.150 - 153.

4. Меринова Л.К., Сеимова И.К. Кониогационная передача плазмид Inc Р-1 группы между штаммами Pseudomonas pseudomallei // Лабораторная диагностика и генетика вирулентности возбудителей особо опасн.инф.- Саратов,1990. - вып.2. - С.130 - 135.

5. Меринова Л.К., Сеимова И.К. Мобилизующая способность плаз-иид Р-1 группы несовместимости в отношении хромосомных генов Pseudomonas pseudomallei // Генет.и биохимия вирулентности возбудителей особо опасн.инф.: Матер.Росс.науч.конф.-Волгоград,1992.- С.44.

6. Сеимова И.К., Меринова Л.К., Тимофеева Е.В. Применение транспозона Тп 9 для получения инсерционных мутантов возбудителя мелиоидоза // Генет.и биохимия вирулентности возбудителен особо опасн.инф.: Матер.Росс.науч.конф. - Волгоград,1992. - С.52.

7. Меринова Л.К., Сеимова И.К. Транспозиция Тп 5 на хромосому Pseudomonas pseudomallei // Генет.и биохимия вирулентности возбудителей особо опасн.инф.: Матер.науч.конф. - Волгоград,1992. -

С.43,