Влияние структуры липополисахарида на устойчивость Yersinia pestis к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов и комплемента сыворотки

Титарева, Галина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние структуры липополисахарида на устойчивость Yersinia pestis к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов и комплемента сыворотки
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние структуры липополисахарида на устойчивость Yersinia pestis к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов и комплемента сыворотки"

На правах рукописи

□ОЗ165596

ТИТАРЕВА ----------

Галина Михайловна

ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА НА УСТОЙЧИВОСТЬ YERSINIA PESTIS К БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ КАТИОННЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И КОМПЛЕМЕНТА СЫВОРОТКИ Л

03.00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 3 МДР Т-т

Москва-2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель

доктор медицинских наук Анисимов Андрей Павлович Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Козлов Леонид Васильевич Доктор медицинских наук, профессор Сидоренко Сергей Владимирович Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « » года в /Р часов на за-

седании диссертационного совета Д 208 046 01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу 125212, г Москва, ул Адмирала Макарова, Д ю

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского»

Автореферат разослан « ^ » ¿'СО^/П&д.ров г Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук С Ю Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Чума до настоящего времени остается серьезной проблемой для эндемичных регионов, а также для мирового здравоохранения в целом Ежегодно регистрируется около 2000 случаев заражения людей Острое природно-очаговое особо опасное инфекционное заболевание, несколько пандемий которого унесли жизни миллионов людей, признано "возрождающейся инфекцией". Возбудитель инфекции является одним из потенциальных агентов биотерроризма [Gage et al, 2005, Inglesby et al, 2000] Для совершенствования специфической профилактики, лечения и диагностики этого заболевания необходимо изучение ключевых механизмов иммунопатогенеза

Возбудитель чумы - Yersinia pestis является одним из представителей рода Yersinia, включающий 11 видов [Achtmanet al, 1999, 2004], которые относятся к грамотрицательным бактериям, имеющим в составе клеточной оболочки липополисахарид (ЛПС) Располагаясь в наружном слое внешней мембраны, ЛПС играет важную роль в процессах взаимодействия микроорганизма с организмом теплокровного хозяина и переносчика [Butler et al, 19ВЗ, Дмитровский, 1994, Rebeil et al, 2004] Молекулы ЛПС с поверхности бактерий, попадая во внутреннюю среду макроорганизма при слущивании с клеточной мембраны или в результате лизиса бактериальных клеток, могут взаимодействовать со специфическими рецепторами, вызывая ответную реакцию системы врожденного иммунитета [Medzhitov, Janeway, 2000 ]

Иммунная система человека и млекопитающих работает как интегрированная защитная система, стремящаяся обеспечить элиминацию патогенов из организма Механизмы иммунной защиты представлены, с одной стороны, системой врожденного иммунитета - наиболее ранним ответом на инфекцию, действующим немедленно после внедрения патогена, а с другой стороны - системой приобретенного иммунитета, который включается в более поздней стадии и является антиген-специфическим Система врожденного иммунитета, эволю-ционно наиболее древняя, действует путем воспалительных реакций и фагоци-

тоза Огромная роль в реализации воспалительных реакций принадлежит комплементу, цитокинам, лизоциму, пропердину, ß-лизину, а также другим антимикробным агентам, к которым относятся и катионные пептиды Патогенные бактерии, попадая в организм млекопитающего, либо быстро уничтожаются, либо, преодолев барьер неспецифической иммунной защиты, размножаются, что и приводит к развитию заболевания [Medzhitov, 2001] В процессе эволюции у бактериальных патогенов, в частности, у патогенных иерсиний, сформировались механизмы устойчивости к факторам врожденного иммунитета, что позволяет им выживать и размножаться в организме хозяина [Анисимов, 2002, Portnoy, 2005]

Бактерицидные свойства сыворотки определяются, в основном, системой комплемента Существуют различные механизмы устойчивости к бактерицидному действию сыворотки [Rautemaa, Men, 1999] При сравнении филогенетически близкого к Y pestis вида Y enterocohtica [Achtman et al, 1999,2004], было показано, что его устойчивость к сыворотке определяется такими факторами, как YadA, Ail, О-антигеном [Balligand et al, 1985, Pierson, Fakow, 1993] и гекса-сахаридами внешнего кора [Skurnik et al, 1999] Для возбудителя чумы, передающегося при укусах кровососущих насекомых, устойчивость к бактерицидному действию сыворотки крови хозяина [Porat et al, 1995] - одно из важнейших условий, которое создает возможность передачи бактерий блохами от одного грызуна к другому [Анисимов, 2002, Hinnebusch, 2004] Действительно, большая часть штаммов чумного микроба обладает резистентностью к бактерицидному действию сыворотки R Porat et al [1995] показали, что устойчивость к комплемент-опосредованному лизису обеспечивается именно липопо-лисахаридом Y pestis, но до настоящего времени не установлены ее механизмы Наряду с устойчивыми к действию сыворотки штаммами Y pestis существуют и чувствительные к действию этого фактора представители подвида caucasica [Гвозденко с соавт 1992, Anisimov et al, 2004, 2005]

Другим фактором неспецифической иммунной защиты являются катионные антимикробные пептиды (КАМП), обнаруженные во многих тканях и клет-

ках млекопитающих [Boman, 2002, Yoshio etal, 2003] и насекомых [Dimopoulos, 2003] В основе антимикробного действия КАМП лежит электростатическое взаимодействие с анионными участками липида А Известно, что КАМП1 могут значительно снижать эндотоксический эффект ЛПС [Gough et al, 1996] Изучение механизма антиэндотоксического действия КАМП показывает, что они имеют более высокое сродство к ЛПС по сравнению с сывороточным белком LBP [Scott, 2000], и, таким образом, препятствуют связыванию ЛПС с TLR [Scott, 1999, 1996] Некоторые виды иерсиний У pestis,

Y pseudotuberculosis и патогенные Г enterocohtica, обладают способностью противостоять действию КАМП, причем на уровень устойчивости к ним влияет температура культивирования [Bengoechea et al, 1996, 1998, David etal, 1992] Один из механизмов этой устойчивости - модификация липида А за счет при-соединёния 4-амино-4-дезокси-Ь-арабинозы (Ara4N) к четвертому и/или первому фосфату [Gunn, Miller, 1996, Groisman et al, 1997, Preston et al, 2001, Rebeil et al, 2004] Возможно, различная способность к модификации ЛПС объясняет факт, что, наряду с резистентными к действию полимиксина В штаммами

Y pestis, существуют и чувствительные к этому КАМП представители подвидов caucasica и hissarica [Мартиневский и соавт, 1981, Фурсова и соавт, 2002] В модельных экспериментах для изучения механизма взаимодействия КАМП с внешней мембраной бактерий часто используют полимиксины, действие которых аналогично действию КАМП млекопитающих [Zhang et al, 2001]

В последние годы были опубликованы результаты всестороннего анализа структуры ЛПС, синтезируемых разными штаммами Y pestis, отличающимися по географическому происхождению и эпидемической значимости [Knirel et al, 2005а, 2005b] Тем не менее, определение роли отдельных структурных компонентов ЛПС в устойчивое ги Y pestis к антимикробным пептидам и сыворотке сохраняет свою актуальность, так как позволит установить молекулярные основы патогенетического действия ЛПС

1 Список сокращений и условных обозначений представлен в конце автореферата

Цель работы

Получение новых данных о функциональной значимости отдельных структурных компонентов ЛПС 7 реяйя в устойчивости к бактерицидному действию антимикробных пептидов и комплемента сыворотки

Задачи исследования

1 Изучить уровни чувствительности к бактерицидному действию полимик-синаВ и сыворотки крови у представителей разных внутривидовых групп У ре.чШ, выращенных в температурном диапазоне от 5 °С до 40 °С, и сопоставить их с данными о химической структуре ЛПС

2 Оценить степень связывания полимиксина В живыми клетками У реяШ и препаратами ЛПС в зависимости от его структуры

3 Определить степень участия альтернативного и классического путей активации комплемента в реализации бактерицидного действия сыворотки на разные штаммы У резШ, изучить связывание СЗ компонента комплемента с клетками У реъШ и с препаратами ЛПС

4 Создать на основе штамма основного подвида У реяШ КМ260(11) коллекцию изогенных нокаутных мутантов, отличающихся по степени редуцированности молекулы ЛПС

5 Охарактеризовать функциональное значение некоторых генов, участвующих в процессе биосинтеза ЛПС

Научная новизна

Установлено, что культивирование У ре^ая при 6 °С, соответствующей температуре зимней спячки грызунов, сопровождается изменением структуры ЛПС, что приводит к увеличению чувствительности микробных клеток к бактерицидному действию КАМП и сыворотки Определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) КАМП - полимиксина В (РМВ) для штаммов У реяШ, выращенных при температурах от 5 °С до 40 °С Показано, что максимальная устойчивость к РМВ для разных штаммов находится в различных температурных диапазонах

Показано впервые, что гены Y pestis rfaE, waaF, waaQ, waaL и prmF кодируют LD-гептозилсинтазу, LD-гептозилтрансферазу II, LD-гептозил-трансферазу III, О-антиген лигазу и Ага4Ы-т:рансферазу, соответственно, и отвечают за их синтез Доказано, что мутации по rfaE, waaF, waaQ и waaL генам приводят к снижению устойчивости Y pestis к бактерицидному действию КАМП и сыворотки Причем, чем значительнее укорочение корового олигоса-харида, тем выше чувствительность к этим факторам Мутация по гену prmF снижает устойчивость только к РМВ

Показано, что ЛПС внешней мембраны участвует в связывании СЗ компонента системы комплемента с поверхностью бактериальных клеток Y pestis Несмотря на то, что почти все изученные штаммы (за исключением штамма KIMD1, содержащего плазмиду pPst) способны в равной степени фиксировать этот компонент комплемента, тем не менее, лизис микробных клеток под действием сыворотки наблюдается только для глубокого R-мутанта EV11M (ssp pestis) и штаммов 1146 и 1680р~ (ssp caucasicä) Лизис бактерий обеспечивается активацией комплемента по альтернативному пути

Практическая значимость работы

Полученные в ходе выполнения работ данные о разной чувствительности штаммов Y pestis к полимиксину В и бактерицидному действию сыворотки могут являться важной внутривидовой характеристикой и служить дополнительным дифференциально-таксономическим признаком Обнаружение зависимости между химической структурой ЛПС и чувствительностью к полимиксину В позволяет прогнозировать структуру ЛПС у неизученных штаммов Y pestis

В Коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ депонированы 5 авторских штаммов Y pestis с мутациями по генам YP00057(w<mF)> YP00416(wcrag), YP00417(waaL), YP00654(r/a£), нарушающими соответственно синтез LD-гептозшпрансферазы II, LD-гегггозилтрансферазы III, О-антиген лигазы, LD-гептозилсинтазы, участвующих в процессе биосинтеза ЛПС

Предложены новые молекулярные мишени для создания высокоаффинных олигонуклеотидных лигандов (антисенс-РНК или iRNA), позволяющих це-

ленаправленно нарушать определенные этапы биосинтеза ЛПС в клетках Y pestis - гены rfaE, waaF, waaQ и prmF Внедрение результатов работы

Результаты проведенных исследований послужили основой для составления методических рекомендаций "Оценка устойчивости патогенных иерсиний к бактерицидному действию полимиксина В" (Оболенск, Иркутск, 2003), и методических рекомендаций "Оценка устойчивости патогенных иерсиний к бактерицидному действию сыворотки" (Оболенск, Иркутск, 2003), которые используются в лабораторных исследованиях Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии и Иркутского научно-исследовательского противочумного института

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Зависимая от температуры внешней среды адаптационная изменчивость структуры ЛПС Y pestis - один из основных факторов патогенности чумного микроба, определяющих исход взаимодействия с бактерицидными системами врожденного иммунитета теплокровного хозяина и переносчика

2 Культивирование Y pestis при температуре, соответствующей условиям торпора зимоспящих грызунов (6 °С), приводит к специфическим изменениям в структуре ЛПС Эти изменения сопровождаются повышением чувствительности бактериальных клеток к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки и к действию катионных антимикробных пептидов, в частности, к полимиксину В

3 Гены биосинтеза ЛПС Y pestis YP00057, YP00416, YP00417, YP00654 и YP02421 являются функциональными аналогами энтеробактериальных генов waaF, waaQ, waaL, rfaE и pmrF, соответственно кодирующими LD-гептозилтрансферазу II, LD-гептозилтрансферазу III, О-антиген лигазу, LD-гептозилсинтазу и Ага4Ы-трансферазу

4 Гены pmrF, waaF, rfaE и waaQ могут рассматриваться, как перспективные молекулярные мишени для разработки нового поколения высокоспецифичных и эффективных препаратов для терапии чумы на основе высокоаффинных олигонуклеотидных лигандов Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ 24 июля 2007 года Материалы диссертации доложены и представлены на 14 научных конференциях, из них 12 - международных, наиболее значимые из которых XIIth European Carbohydrate Symposium (July 6-11, 2003, Grenoble, France), INTAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (October 6-9, 2004, Wroctaw, Poland), 105th ASM General Meetmg (June 5-9, 2005, Atlanta, GA, USA), международная конференция "Предотвращение распространения биологического оружия The cooperative biological research Annual review" (10-13 октября 2005 г, Санкт-Петербург), 106th ASM General Meetmg (May 21-25, 2006, Orlando, FL, USA), 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA)

Публикации

Основное содержание работы отражено в 24 научных публикациях, в том числе в 5 статьях в реферируемых журналах Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 21 работу отечественных и 300 работ зарубежных авторов Работа иллюстрирована 22 рисунками и 10 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Бактериальные штаммы и генно-инженерные конструкции. Исследования были проведены на 13 лабораторных штаммах из них штаммы КМ 218,

231, KM 260(11), 1146, 1680p", 2377 получены из Российской коллекции патогенных бактерий "Микроб" при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (РКПБ РНИПЧИ "Микроб"); штаммы И-1996, А-1249, А-1725, И-2359 И-2422 - из Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (ИНИПЧИ СДВ), штамм EV11M - из музея живых культур Государственного научного центра прикладной микробиологии (МЖК ГНЦ ПМ), штамм KIMD1 - от профессора М Скурник университет Турку, Финляндия, на 3-х свежевыделенных природных изолятах (322, 1191 и 1121), любезно предоставленных ИНИПЧИ СДВ и 5-и изогенных мутантах, полученных на основе штамма КМ260(11) Y pestis (КМ260( 11 )Д YP00417, KM260(11)AYP00416, КМ260(11)ДУР00057, КМ260(11)AYP00654 и КМ260(11)AYP02421, депонированных и хранящихся в МЖК ГНЦ ПМ Микроорганизмы выращивали на жидких или плотных питательных средах Хоггингера (разные серии лабораторного приготовления ГНЦ ПМБ), LB (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л) или BHI (среда на основе сердечно-мозговой вытяжки, Himedxa) Селекцию клеток, содержащих хелперную плазмиду pKD46, проводили на средах с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл Биомассу штаммов Y pestis для выделения ЛПС нарабатывали в аэрируемых условиях в лабораторном ферментере New Brunsuik Scientific (США) с рабочим объемом 2 л на сложных питательных средах солянокислый гидролиза! казеина (20-30 г/л), дрожжевой автолизат (10 г/л), глюкоза (3-9 г/л), К2НР04 (6 г/л), КН2Р04 (3 г/л) и MgS04 (0,5 г/л), pH6,9-7,1 (совместно с Щайхутдиновой РЗ) При необходимости в среду культивирования добавляли полимиксин В (20 Ед/мл)

Для получения нокаутных мутантов Y pestis использовали метод RedGam-мутагенеза [Datsenko, Wanner, 2000] Дизайн праймеров для амплификации канамицинового ген-блока плазмиды pUTKm, фланкированного короткими участками гомологии (55 п н ) к ДНК генов rfiiE, waaF, waaQ, waaL и pmrF, осуществляли с помощью программы DNAStar (совместно с Дентовской С В и Платоновым М Е )

Выделение, очистка липополисахаридов и электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле. Бактериальные клетки для выделения ЛПС из атте-нуированных штаммов Y pestis выращивали в течение суток при температурах 25 °С или 37 °С, культивирование при 6 °С вели в течение двух суток Мутант-ные штаммы для выделения ЛПС выращивали только при 25 °С Выделение ЛПС проводили методом экстракции по С Galanos [1969] Чистоту препаратов ЛПС контролировали электрофоретически Электрофорез проводили в ДСН-ПААГ, для визуализации ЛПС гели окрашивали аммиачным раствором оксида серебра после окисления йодной кислотой по С Tsai, С Frash [1982] Для проведения скрининговых исследований ЛПС выделяли по Р J Hitchcock, Т M Brown [1983] Для препаратов ЛГ1С-37-РМВ (культивирование бактериальной массы проводили в присутствие полимиксина В) использовали дополнительную очистку от фосфолипидов методом Е G Bligh, WJ Dyer [1959]

Изучение взаимодействий с катионными пептидами. В качестве модели для изучения оценки активности КАМП использовали полимик-син В Определение МПК полимиксина В проводили, как описано Р G Hitchen et al [2002] Для определения связывания РМВ жизнеспособными клетками и препаратами ЛПС использовали метод M Skurnik et al [2000] Количество не связавшегося РМВ оценивали путем титрования полученного суперна-танта с использованием штамма Y pestis EVI IM, чувствительного к этому антибиотику

Изучение взаимодействия живых бактериальных клеток Y.pestis с нормальной мышиной, нормальной и иммунной человеческой сыворотками Бактерицидные свойства сывороток определяли по методу M G Barnes et al [2001] Клетки бактериальных штаммов выращивали на чашках с агаром Хоггингера при разных температурах 20 мкл бактериальной суспензии (108 КОЕ/мл) исследуемых штаммов инкубировали с 80 мкл сыворотки в течение 1 ч при температуре 37 °С Для сравнения использовали соответствующую термоинактивированную сыворотку КОЕ определяли высевом на плотную питательную среду

Изучение влияния структуры ЛПС на механизмы устойчивости к бактерицидному действию сыворотки штаммов Y. pestis. Исследуемые препараты ЛПС (25-500 мкг/мл) инкубировали 30 мин при 37 °С с сывороткой и по снижению гемолитической активности сыворотки оценивали степень связывания ЛПС с компонентами комплемента Гемолитическую активность комплемента определяли по общепринятой методике, используя сенсибилизированные эритроциты барана Для оценки связывания компонента СЗ с бактериальными клетками и препаратами ЛПС использовали иммуноферментный метод и дот-блот анализ

Результаты исследования Изучение влияния липополисахарида на устойчивость Y. pestis к бактерицидному действию катионного антимикробного пептида - полимиксина В

Циркулируя в природных очагах чумы, Y pestis передается по цепочке грызун-блоха-грызун Одним из компонентов врожденного иммунитета как насекомых, так и млекопитающих, являются обладающие бактерицидной активностью катионные пептиды [Dimopoulos, 2003]. Механизм действия КАМП обусловлен электростатическим взаимодействием с анионными группами внешней мембраны, в качестве источника которых и выступают молекулы ЛПС [Hancock et al, 1998, Sawyer et al, 1988] К таким КАМП относится полимик-синВ

Сравнительный анализ полученных ранее с нашим участием данных о химической структуре ЛПС штаммов Y pestis разных подвидов, выращенных при 6 °С, 25 °С или 37 °С [Knirel et al, 2005] и данных об изменении чувствительности бактерий к РМВ в диапазоне температур культивирования от 5 °С до 40 °С (табл 1) позволил выявить определенную зависимость между структурой ЛПС и устойчивостью к бактерицидному действию РМВ

Таблица 1. Минимальные ингибирующие концентрации полимиксина В для штаммов У. ревйв, выращенных в диапазоне температур от 5 °С до 40 "С._

Температура культивирования, "С МИ К полимиксина В(Ед/мл) для штаммов У. ревШ

КМ218 К1М01 КМ260(11) 1146 ЕУ11М

5 31,3 15,6 31,3 62,5 31,3

10 31,3 31,3 31,3 62,5 31,3

15 31,3 31,3 31,3 62,5 31,3

20 31,3 31,3 250 250 31,3

23 250 31,3 250 500 31,3

25 2000 1000 1000 250 31,3

28 2000 1000 1000 125 31,3

30 62,5 15,6 1000 125 62,5

35 31,3 15,6 1000 31,3 62,5

37 31,3 15,6 31,3 31,3 250

40 Н/д 1,9 15,6 Н/д 7,8

Липид А в препаратах ЛПС-37 более гетерогенен в отношении замещения фосфатных групп глюкозамина 4-амино-4-дезокси-Ь-араби'нозой (Ага4К) Примерно равные количества липида А содержат производные с двумя, одним или нулевым содержанием Ага4КГ, то есть замещение носит нестехиометрический характер В препаратах ЛПС-25 характер замещения Ага4И близок к стехио-метрическому большая часть препаратов содержит варианты липида А с двумя остатками Ага4К и лишь следовые количества вариантов - с однозамещенными остатками Ага4К Изучение препарата ЛПС, выделенного из штамма КМ218 7 резШ, культивированного при 6 °С, показали, что низкие температуры приводят к значительным изменениям в его структуре При 6 °С в штамме КМ218, наряду с липидомА, насыщенным Ага4Ы, присутствуют формы, полностью лишенные этого углевода Это находится в полном соответствии с данными по чувствительности к РМВ Открытые фосфатные группы глюкозамина являются анионными участками липида А, которые активно связываются с молекулами КАМП Эти особенности химической структуры коррелируют со способностью сорбировать РМВ препаратами ЛПС Чем ниже степень гликозилирования фосфатных групп липида А Ага4М (ЛПС-37), тем выше их сорбционная способность (табл 2)

Таблица 2. Зависимость сорбции полимиксина В от концентрации препаратов ЛПС штаммов У. выращенных при температурах 25 "С и 37 "С.

ЛПС, мкг/мл Сорбция полимиксина В штаммами У. реэиз (Ед/мл)

КМ218 КШЮ1 КМ260(11) 1146 ЕУ11М

25 "С 17 °С 25 °С 37 °С 25 "С 37 °С 25 "С 37 °С 25 °С 37 °С

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 35 35 35 70 35 35 17,5 0

2 17,5 0 70 140 70 280 70 140 35 0

4 35 35 140 280 140 560 280 280 70 17,5

8 70 140 280 560 280 560 280 560 140 35

16 140 280 560 1120 560 1120 560 1120_| 280 70

При сравнении сорбционной способности живых бактериальных культур только клетки штамма КМ260(11), выращенного при 37 °С, сорбировали достоверно большие количества РМВ (Р<0,05) по сравнению с бактериями, культи-

структуры ЛПС-37-РМВ (культивирование У. реБиэ проводили в присутствие РМВ) и ЛПС-37 свидетельствует, что присутствие в среде культивирования антибиотика приводит к тому, что начинается синтез молекул, липид А которых похож на липид А ЛПС-25 и представлен в основном, вариантами с одним и двумя остатками Ага4Ы, а варианты без Ага4Ы присутствуют в незначительных количествах. Вероятно, происходит селекция бактерий, имеющих строение ЛПС, обеспечивающее устойчивость к РМВ.

вированными при 25 °С (рис. 1). Сравнительный анализ

КМ218 К1М01 КМ260(11) 1146 штаммы У. рехИз В25 П37

Рис. 1. Сорбция полимиксина В жизнеспособными клетками штаммов У. реввв, выращенными при температурах 25 °С и

Относящийся к подвиду caucasica штамм 1146, несмотря на то, что его ЛПС-25 содержал значительное количество Ara4N, был в четыре раза более чувствителен к полимиксину В, чем штаммы подвида pestis Несмотря на близкое к стехиометрическому содержание этого аминосахара в препаратах ЛПС-37, штамм 1146 оставался высокочувствительным к РМВ и при температуре культивирования 37 °С При анализе химической структуры кора штамма 1146 было выявлено полное отсутствие в нем DD-Hep, присоединенной к LD-HepIII, хотя содержание этого сахара с повышением температуры культивирования увеличивалось в штаммах подвида pestis КМ218, KIMD1 и КМ260(11) Кроме того, в коре штамма Y pestis 1146 в препаратах ЛПС-25 была обнаружена аминокислота глицин, присоединенная в неустановленном положении, которая дополнительно увеличивает его гетерогенность Этот компонент полностью отсутствует в препаратах ЛПС-37 Следует отметить, что глицин в коре был обнаружен и в препаратах штамма КМ218, выращенного в присутствии РМВ Подтверждение влияния строения кора на чувствительность к РМВ было получено при изучении глубокого R-мутанта EVI IM Этот штамм, обладая высокой чувствительностью к РМВ, при температуре 25 °С (МПК = 31,2 Ед/мл ), становился более резистентным к дейсгвию этого антибиотика при повышении температуры выращивания до 37 °С (МПК = 250 Ед/мл ) (табл 2) ЛПС Y pestis EVI IM имеет усеченный до дисахарида кор, состоящий из Kdo и Ко Такой кор характерен как для ЛПС-25, так и для ЛПС-37 В то же время замещение фосфатных групп Ara4N в липиде А было нестехиометрично при обеих температурах, однако, количество двухзамещенных остатков увеличивалось в препаратах ЛПС-37 на 20 %, что, видимо, и приводило и повышению устойчивости этого штамма к РМВ при 37 °С

Структурные особенности молекул ЛПС и их корреляция с температуро-зависимыми и внутривидовыми вариациями чувствительности к РМВ позволяют высказать предположение об их биологическом значении Необходимым условием сохранения жизнеспособности и возможности передавать инфекцию новому теплокровному хозяину явилось приобретение насекомыми устойчиво-

сти к бактериальным патогенам Для того, чтобы обеспечить передачу чумы блохами [Кокушкин, 1995], уровень бактериемии инфицированных грызунов должен составлять не менее 108 КОЕ/мл клеток, что гарантирует последующую колонизацию желудочно-кишечного тракта блохи [Hmnebusch, 2003, Perry, 2003] Минимальная инфицирующая доза для блохи составляет 104 микробов [Hxnnebush, 2004] Такое количество бактерий недостаточно для предотвращения индуцированнния липополисахаридом синтеза ЬСАМП эпителием средней кишки насекомого [Lmdmark et al, 2001] Поэтому единственным средством для обеспечения выживания Y pestis в блохе является устойчивость к действию КАМП, которая согласуется с нашими данными о значительной резистентности к РМВ Y pestis подвида pestis "дикого типа" при температуре 25 °С Более высокая чувствительность к этому антибиотику штамма Y pestis 1146 подвида caucasica возможно связана с более низким уровнем продукции КАМП в организмах специфических для них видов блох-переносчиков Callopsylla с aspia и Nosopsyllus consimilis [Amsimov et al, 2004]

Изучение влияния липополисахарида на устойчивость К pestis к бактерицидному действию сыворотки крови Механизмы устойчивости возбудителя чумы к другому фактору неспецифической защиты - системе комплемента - до сих пор изучены не полностью Мы исследовали чувствительность штаммов Y pestis разных подвидов к бактерицидному действию сыворотки Клетки штаммов подвидов pestis, his-sarica, altaica, ulegeica обладали устойчивостью к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки (НЧС) при температуре 25 °С и 37 °С (рис 2) Штаммы 1146 и 1680р~ подвида caucasica и глубокий И-мутантЕУПМ оказались высокочувствительными к действию НЧС Чувствительность к НЧС для большинства штаммов была практически одинаковой при температурах 25 °С и 37 °С (рис 2 А, В) Только культивирование при 6 °С резистентных штаммов резко снижало уровень их устойчивости на 4-5 порядков (рис 2 В)

штаммы, Y.Destis

0НЧС □ т НЧС

штаммы Y. pestis

В НЧС Di НЧС

Рис. 2. Уровень чувствительности к бактерицидному действию НЧС штаммов У. pestis, выращенных при разных температурах. А - штаммы неосновных подвидов: hissarica: А-1249, А-1725; caucasica: 1146, 1680p"; altaica: И-2377, И-2359; ulegeica: И-2422; В - штаммы основного подвида pestis: КМ218, KIMD1, КМ260(11), EV11M. Данные приведены по результатам трех независимых экспериментов. Доверительный интервал вычисляли для вероятности 95 %. Цифры в скобках - температура выращивания штамма.

Структурный анализ ЛПС штаммов 1146, КМ218: KIMD1 и КМ260(11)

показал, что основным различием между штаммами основного подвида и

штаммом 1146, принадлежащим к подвиду caucasica, является структура кора У штамма 1146 отсутствуют формы ЛПС, содержащие в коре DD-Hep, а содержание молекул ЛПС с GlcNAc невелико Еще большая степень редуцированности кора присуща глубокому R-мутанту штамму EV1 IMF pestis

По данным ЯМР-спектроскоггаи он содержит только укороченные варианты, состоящие го Kdo-Kdo или Ko-Kdo дисахаридов, представленные примерно в равных количествах вне зависимости от температуры культивирования - 25 °С или 37 ° [Knirel et al, 2005]

Структурным отличием препарата ЛПС-6 является фосфорилирование концевого остатка Ко или Kdo фосфоэтаноламином (EtnP), что ранее в олиго-сахаридах кора ЛПС Y pestis не встречалось Присутствие EtnP может являться одной из причин высокой чувствительности бактерий к НЧС У Neisseria meningitidis EtnP является акцептором компонента С4Ь комплемента, запускающим механизм бактерицидного действия сыворотки [Ram et al, 2003] Возможно, при низких температурах запускается иной механизм контроля синтеза ЛПС, что позволяет бактериям поддерживать бессимптомное существование во время зимней спячки организма-хозяина, иммунная система которого в этот период не активна [Novoselova et al, 2000]

Лабораторные мыши, так же, как и дикие, имеют очень низкий уровень комплемента по сравнению с людьми, крысами и морскими свинками [Ong et al, 1992], что объясняет высокую устойчивость к мышиной сыворотке всех изученных штаммов Y pestis (рис 3) Низкий уровень комплемента у мышей может служить объяснением чувствительности к сыворотке штамма 1146, который является типичным представителем подвида caucasica, циркулирующего в популяциях полевок [Кокушкин, 1995] Он вирулентен для полевок и мышей, но авирулентен для морских свинок и людей Вероятно, разные концентрации комплемента в крови хозяев могут являться одной из основных причин избирательной вирулентности штаммов этого подвида Можно предположить, что в процессе эволюции низкий уровень комплемента в крови естественного хозяина - полевок - вызвал целый ряд адаптационных изменений

в структуре ЛПС. Возможно, что адаптационные изменения затронули не только ЛПС, но и другие факторы, участвующие в реализации взаимодействия бактериальной клетки с системой комплемента.

штаммы Y.¡>('stis

■ НМС ПтНМС

Рис 3. Чувствительность штаммов У. ревНв к бактерицидному действию нормальной мышиной сыворотки. Данные приведены по результатам трех независимых экспериментов. Доверительный интервал вычисляли для вероятности 95 %. Цифры в скобках - температура выращивания штамма

Препараты ЛПС могут снижать гемолитическую активность сыворотки

[Касаега/., 2000]. При изучении влияния ЛПС на гемолитическую активность НЧС (рис. 4) мы обнаружили, что наибольшее снижение активности комплемента (40-54,5 %) вызывало инкубирование сыворотки с препаратами ЛПС-25 и ЛПС-37 штаммов 1146 и ЕУ11М, бактериальные культуры которых, как было показано выше, чувствительны к ее бактерицидному действию.

Аналогичные результаты были получены и для препарата ЛПС-6 штамма КМ218. ЛПС других штаммов ингибировали гемолиз бараньих эритроцитов не более, чем на 30 %. Эти данные указывают на то, что структура липополисаха-рида определяет исход взаимодействия микробной клетки с системой комплемента хозяина.

ЛПС могут активировать систему комплемента как по классическому, так и по альтернативному пути. В активации классического пути участвует в основном липид А. Для активации альтернативного пути необходима полисахаридная составляющая ЛПС [Vukajlovich, 1987]. Проведенные нами исследования свидетельствуют, что СЗ - один из ключевых компонентов системы комплемента — одинаково фиксируется на бактериальной поверхности всех изученных

Рис. 4. Ингибирование гемолитической ак- штаммов, за исключением тивности комплемента препаратами ЛПС

Y. pestis разных штаммов. KIMD1 (рис.5).

Возможно, что низкий уровень фиксации СЗ клетками этого штамма является следствием наличия плазмиды pPst, кодирующей активатор плазминоге-на (Pia) - протеазу, способную расщеплять этот компонент комплемента [Sodeinde et al., 1992]. Выявленный высокий уровень связывания СЗ со штаммом 1146 (рис. 5) является, вероятно, одной из главных причин, обуславливающих высокую чувствительность этого штамма к бактерицидному действию сыворотки. Вероятно, структура кора, в которой отсутствует DD-Hep, в сочетании с низким содержанием GlcNAc, позволяет формировать мембран-атакующий комплекс комплемента, эффективно лизируюший бактериальные клетки. Хотя редуцированный кор штамма EVI IM с очень небольшой полиса-харидной составляющей, и, как следствие, имеющий более доступный для взаимодействия липид А, позволяет предположить, что комплемент мог бы активироваться и по классическому пути, полученные данные свидетельствуют,

0 20 40 60

% ингиоирования гемолитическои

активности комплемента

Дозы ЛПС м кг/мл

О 25 □ 50 В 100 ■ 500

что фиксация СЗ на клеточной мембране штамма EVI IM происходит, в основном, за счет альтернативного пути активации комплемента (рис. 5).

штаммы, Y. pestis ННЧС □ АП ШКП ЯтНЧС

Рис. 5. Связывание компонента комплемента СЗ НЧС альтернативным или классическим путем активации комплемента и термоинактивированной человеческой сыворотки (тИЧС) цельными клетками разных штаммов ¥. реэНэ, выращенных при температуре 25 °С и 37 °С. Данные ИФА представлены как единицы ОД при Х=492 нм, по результатам трех независимых экспериментов. Доверительный интервал вычисляли для вероятности 95 %.

Влияние мутаций в области генов, участвующих в биосинтезе ЛПС, на устойчивость к полимиксину В и бактерицидному действию сыворотки

Для изучения роли отдельных генов в биосинтезе такой сложной макромолекулы, как ЛПС, необходимо наличие генетически определенных изоген-ных вариантов. На основе последовательности генома V. рс^И.ч С092 [РагкЫ\\etal., 2001] были отобраны гены, предположительно принимающие участие в биосинтезе ЛПС - УР00057, \T00416, УР00417, УР00654 и УР02421, и с помощью сайт-направленного мутагенеза получены соответствующие мутанты на основе штамма КМ260(11).

ЛПС выделяли из мутантных штаммов и изучали методом электрофореза в ДСН-ПААГ (рис. 6). Изменения электрофоретической подвижности препаратов ЛПС по сравнению с родительским штаммом позволили предположить, что му-

тации в выбранных генах действительно привели к изменениям строения ЛГТС. Молекулы ЛПС по возрастанию степени редуцированности можно расположить в следующем порядке: АУР00417, АУР00416, ДУР00057 и АУР00654 (А - деления соответствующего гена). Мутация по гену УР02421 в меньшей степени оказала влияние на электрофоретическую подвижность препарата Ш~1С.

Для определения химической структуры препараты ЛПС были проанализированы методом МС ИЭР, а также одно- и двухмерной ЯМР-спектроскопией. Структурные исследования ЛПС нокаутных мутантов У. рау/й позволили нам определить функции пяти изученных генов, участвующих в биосинтезе ЛПС (рис. 6 и табл. 3).

Ген г/аЕ (УР00654) кодирует ЬВ-гептозилсинтазу. При отсутствии его экспрессии в клетках У реяШ не синтезируются гептозы, что и приводит к образованию молекул, биосинтез кора в которых завершается после присоединения к липиду А остатков Кс1о-Кс1о или Кс1о-Ко. Гены \vaaQ (УР00416), \vaaF (УР00057) и ртгр (УР02421) отвечают за синтез трансфераз, принимающих участие в сборке кора и липида А. О-антиген лигаза - \vaaL (ген УР00417) -обеспечивает процессинг олигосахарида - перенос остатка ОкИАс.

Рис. 6. Окраска серебром образцов ЛПС из штамма У. рехвя КМ260(11), его производных и штамма У. рез/н- ЕУ11М после электрофореза в ДСН-ПААГ.

(по 2,5 мкг каждого образца ЛПС У. рея^). Линия 1-КМ260(11)-25; линия 2 - КМ260(11)ДУР00417::кап-25; линия 3 -КМ260(11)ДУР00416::кап-25; линия 4 - КМ260(11)ДУР00057::кап-25; линия 5 - КМ260(11)ДУР00654::кап-25; линия 6 - КМ260( 11 )АУР02421: :кап-25; линия 7 - КМ260(11)-37; линия 8-ЕУ11М-25;

Изучение влияния мутации пяти перечисленных выше генов, участвующих в биосинтезе молекулы ЛПС, позволило определить степень участия структурных компонентов этой макромолекулы в чувствительности к бактерицидной активности полимиксина В и НЧС. Мутация по гену ртгр приводила к

нарушению функции Ага4М-орансферазы и, как следствие, к полному отсутствию Ага4К в липиде А, поэтому клеточная стенка ртгр-мутанта становилась уязвимой для действия полимиксина В Мутация по гену г[аЕ приводила к нарушению синтеза чумным микробом гептоз, а нарушение структуры лмааР и жаа() генов сопровождалось прекращением синтеза гликозилтрансфераз, ответственных за перенос второго и третьего остатков ББ-Нер Мутация по гену м/ааЬ вела к нарушению функции лигазы, ответственной за присоединение остатка ИсЫАс к гептозе Перечисленные мутации были причиной нарушения разных этапов биосинтеза коровой области ЛПС, что сопровождалось изменением чувствительности к РМВ Штаммы с мутациями по генам г/аЕ, ччааР, м>ааО. стали примерно в 100 раз чувствительнее к этому антибиотику, а чувствительность мутанта по \vaaL гену изменилась незначительно (всего в 2-4 раза) Аналогичным образом мутанты по м/ааР, г/аЕ и м>аа() генам были чувствительны к бактерицидному действию НЧС, а чувствительность м>а&£-мутанта не изменилась Это позволяет сделать вывод, что для устойчивости к НЧС необходимо, чтобы к третьей гептозе был присоединен еще один моносахарид Изменение липида А по гену ртгР не влияло на чувствительность к сыворотке Таблица 3. Характеристика изогенных мутантов штамма КМ260(11)

У. ревНэ и функции затронутых генов, участвующих в биосинтезе ЛПС

Штаммы У ревйэ Функция гена, определенная на основании структуры ЛПС мутанта Химическая структура кора

КМ260(11) вй/ОО-Нер-Нер С1с Ко 1 1 1 ЭоМАс Нер~Нер-К<)о-1.А

КМ260(11)ДУР00417 (ДwaaL) лигаза переносит 01сЫАс Оа1Лю-Нер-Нер 61с Ко 1 1 1 Нер-Нер-Кс1а-1~А

КМ260(11)ДУР00416 (Дшаа(2) ЬБ-гептозилтрансфераза III Ис Ко 1 1 в1оЫАс Нер-Нер-Кс1о-1-А

КМ260(11)ДУР00057 (Д\уааР) 1ЛЭ-гептозилтрансфераза II (глюкоза не переносится в отсутствие ЫЭ-Нер II) Ко 1 Нер-Кйо-1А

КМ260(11)ДУР00654 (ДйаЕ) ЬБ-гептозилсинтаза Ко ! Кйо-ЬА

КМ260(11)ДУР02421 (ДршгР) Ага4М-трансфераза ва1/00-Нер-Нер С1с Ко 1 1 ! С1сЫАо Нер-Нер-К(Зо~1-А

Мутагенез выбранных пяти генов, ответственных за биосинтез ЛПС чумного микроба, позволил нам получить изогенный набор штаммов, отличающихся по степени редуцированности кора или липида А, и оценить степень влияния этих мутаций на устойчивость к бактерицидному действию полимиксина В и сыворотки Эти гены можно рассматривать как потенциальные мишени для создания высокоаффинных олигонуклеотидных лигандов (антисенс-РНК) и использования их для регуляции экспрессии генов Y pestis [Wagner, Simons, 1994] Возможно, такое направление будет новым этапом в создании эффективных препаратов для лечения чумы - одного из самых опасных заболеваний человека

Выводы

1 Выживание и циркуляция внутривидовых групп У реШя в популяциях определенных резервуарных хозяев и переносчиков может приводить к изменениям структуры ЛПС, обеспечивающим адаптационные изменения вирулентности

2 Устойчивость к полимиксину В определяется как замещением фосфатных групп в липидеА остатками Ага41Ч, так и наличием полноценной структуры корового олигосахарида Устойчивость к комплементу сыворотки определяется, главным образом, структурой кора ЛПС Структура ЛПС и коррелирующая с ней устойчивость к бактерицидным факторам врожденного иммунитета зависят от температуры выращивания У реяш

3 ЛПС У реяШ участвует в связывании СЗ компонента комплемента с поверхностью бактериальной клетки Лизис бактерий в случае чувствительных к сыворотке штаммов У ре$Ш обеспечивается активацией альтернативного пути

4 Функциональные характеристики пяти изученных генов биосинтеза ЛПС УР00057, УР00416, УР00417, УР00654 и УР02421 позволили идентифицировать их как гены, отвечающие за синтез ЬВ-гептозилтрансферазы II, 1Л)-гептозилтрансферазы III, О-антиген лигазы, Ы>-гептозилсинтазы и Ага41Ч-трансферазы

5 С помощью комплекса генетических, химических, биофизических и микробиологических методов получены экспериментальные доказательства влияния строения ЛПС на чувствительность У рент к бактерицидному действию полимиксина В и сыворотки

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Бахтеева И В , Титарева Г.М., Шайхутдинова Р 3 и др Способность липополисахарида Yersinia pestis вызывать эндотоксический шок //Успехи современного естествознания -2003 -№10 - С 54

2 Дентовская С.В , Титарева Г.М , Шайхутдинова Р 3 и др Штаммовые отличия Yersinia pestis по чувствительности к бактерицидному действию сыворотки //Там же - С 63

3 Титарева Г.М, Фурсова Н К, Балахонов С В и др Штаммовые отличия Yersinia pestis по чувствительности к бактерицидному действию полимиксина В//Там же - С 100

4 Анисимов А П , Книрель Ю А, Виноградов Е В , Линднер Б , Кочарова Н А, Анисимов А П, Фурсова Н К, Бахтеева И В , Титарева Г.М и др. Липоолигосахарид (ЛОС) Yersinia pestis - один из основных факторов патогенности и возможная мишень для химиотерапии// Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы 2-го Московского международного Конгресса (10-14 ноября 2003 г, Москва) М ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им ДИ Менделеева С 15

5 Бахтеева И В , Титарева Г.М., Шайхутдинова Р 3 и др Изучение экспрессии TNF-a в сыворотке мышей при введении липоолигосахаридов (ЛОС) Yersinia pestis //Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 2003 -С 65-66

6 Титарева Г.М , Дентовская С В , Шайхутдинова Р 3 и др Штаммовые и подвидовые отличия в устойчивости Yersinia pestis к бактерицидному действию сыворотки //Там же - С. 121-122

7 Титарева Г.М, Дентовская С В, Шайхутдинова Р 3 и др Анализ депозиции и деградации СЗ компонента комплемента на поверхности клеток Yersinia pestis //Там же -С 122-123

8 Титарева Г.М., Фурсова Н К, Балахонов С В и др Изучение чувствительности штаммов чумного микроба к полимиксину //Там же -С 123-124

9 Knirel Y А, Vinogradov Е, Lindner В , Shaikhutdmova R Z , Kocharova N А, Senchenkova S.N , Dentovskaya S V , Fursova N К, Bakhteeva IV, Titareva G.M et al. Diversity and Variations of the Lipopolysaccharide (LPS) Structure in Yersinia pestis //Abstracts of 104th ASM General Meeting (May 23-27, 2004, New Orleans, Louisiana), J-012

10 Bakhteeva I, Titareva G, Senchenkova SN et al Temperature-dependent variations of the structure of lipid A and biological properties of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis KM218 //Abstracts of the INTAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates m prevention and diagnostics of emerging pathogens 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (October 6-9,2004, Wroclaw, Poland), PI 1 Wroclaw, Poland, p 71

11 Shaikhutdmova R, Senchenkova S N, Dentovskaya S , Lindner В , Moknevich A, Titareva G. et al Mutation in the msbB (IpxM) gene of Yersinia pestis KM218 caused modifications in lipid A structure and influences biological properties of the bacterial cell // Ibid, PI 2, p 72-73

12 Анисимов А П, Виноградов Е В , Lindner В , Шайхутдинова Р 3 , Дентовская СВ, Фурсова НК, Бахтеева ИВ, Титарева Г.М и др Изменения структуры и биологических свойств липополисахарида Yersinia pestisH Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research Annual review (12-15 июля 2004 г, Санкт-Петербург) С -П • Институт особо чистых биопрепаратов С 14-15

13 Анисимов А П, Книрель Ю А, Виноградов Е, Линднер Б , Шайхутдинова Р 3 , Кочарова Н А, Сенченкова С Н, Дентовская С В , Н К.Фурсова, Бахтеева И В , Титарева Г.М и др Структура липополисахарида Yersinia pestis //Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний Тезисы докладов международной конференции (8-10 сентября 2004 г, "Сосновка", Новосибирская область, Россия) ЦЭРИС, Новосибирск, 2004, р 43-44

14 Knirel Y А , Lindner В , Vinogradov Е V, Kocharova N А, Senchenkova S N , Shaikhutdmova R Z , Dentovskaya S V, Fursova N К, Bakhteeva IV, Titareva G.M. et al Temperature-dependent variations and mtraspecies diversity of the structure of the lipopolysaechande of Yersinia pestis //Biochemistry 2005,44(5) 1731-1743

15 Amsimov A P, Dentovskaya S V, Titareva G.M. et al Intraspectes and temperature-dependent variations m susceptibility of Yersinia pestis to the bactericidal action of serum and to polymyxin В // Infect Immun 2005, 73(11) 7324-7331

16 Knirel Y A, Vinogradov E, Lindner В , Shaikhutdmova R Z, Kocharova N A, Senchenkova S N, Dentovskaya S V, Bakhteeva IV, Titareva G.M et al Cold temperature-induced modifications to the chemical composition and biologic activity of the lipopolysacchande of Yersinia pestis //Abstracts of 105th ASM General Meeting (June 5-9, 2005, Atlanta, GA), J-002

17 Анисимов А П, Виноградов E В , Lindner В , Шайхутдинова P 3 , Дентовская С В, Бахтеева И В, Титарева Г.М и др Изучение структуры и биологических свойств липополисахарида Yersinia pestis //Предотвращение распространения биологического оружия The cooperative biological research Annual review (10-13 октября 2005 г, Санкт-Петербург) С-П Институт особо чистых биопрепаратов С. 24-28

18 Knirel Y А, Kocharova N А, Senchenkova S N., Bystrova O.V , Dentovskaya S V, Shaikhutdmova R Z, Titareva G.M. et al A role of the lipopolysacchande structure in the resistance of Yersinia pestis to the bactericidal action of polymyxin b and serum// Abstracts of the 2006 MAID Research Conference (June 24-30,2006, Opatija, Croatia), p 27

19 Шайхутдинова P 3 , Титарева Г.М., Баннов В А и др Получение штаммов Yersinia pestis, чувствительных к полимиксину В, методом инсерционного мутагенеза //Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников

СНГ (3-5 октября 2006 г, Оболенск, Московская обл ) / Под ред Г Г Они-щенко, В В Кутырева, И А. Дятлова Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006 - С 130-131

20 Knirel Y А, Dentovskaya S V, Bystrova О V, Kocharova N А, Senchenkova SN, Shaikhutdmova RZ, Titareva G.M. et al Relationship of structural variation m the lipopolysaccharide of Yersinia pestis to resistance to antimicrobial peptides and complement-mediated killing //Abstracts of the 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14,2006, Lexington, Kentucky, USA), S7 3 - American Society for Microbiology, Washington, D С, 2006 P 23-24

21 Amsimov A P , Shaikhutdmova R Z, Pan'kma L N, Feodorova V A , Savostma E P , Bystrova О V , Lindner В , Moknevich A N, Bakhteeva IV, Titareva G.M. et al Influence of a IpxM mutation on Yersinia pestis virulence and immunogenicity // Ibid, В138 P 84.

22 Amsimov A P , Shaikhutdmova R Z, Pan'kma L N , Feodorova V A, Savostma E P , Bystrova О V, Lindner В , Moknevich A N, Bakhteeva IV, Titareva G.M. et al Effect of deletion of the IpxM gene on virulence and vaccine potential of Yersinia pestis m mice // J Med Microbiol 2007,56(4) 443-453

23 Knirel Y A, Dentovskaya S V, Bystrova О V, Kocharova N A., Senchenkova SN, Shaikhutdmova RZ, Titareva G.M et al Relationship of the lipopolysaccharide structure of Yersinia pestis to resistance to antimicrobial factors //Adv Exp. Med Biol 2007, 603 88-96

24 Дентовская С В, Бахтеева И В, Титарева Г.М. и др Структурное разнообразие и эндотоксическая активность липополисахарида Yersinia pestis II Биохимия 2008,73(2) 237-247

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АП - альтернативный путь активации комплемента, ДСН - додецилсульфат натрия, КАМП - катионный антимикробный пептид, КП - классический путь активации комплемента, ЛПС - липополисахарид,

МПК - минимальная подавляющая концентрация, НМС - нормальная мышиная сыворотка; НЧС - нормальная (неимунная) человеческая сыворотка, ПААГ - полиакриламидный гель

тНЧС - термоинактивированная человеческая сыворотка, Ara4N - 4-амино-4-дезоксиарабиноза,

BHI - питательная среда, на основе сердечно-мозговой вытяжки,

EtnP - фосфоэтаноламин,

GlcNAc- N-ацетил-глюкозамин,

GalNA - 2-амино-2-дезоксигалактуроновая кислота;

DD-Hep - 0-глицеро-0-манно-гептоза;

Kdo - 2-кето-З-дезоксиоктоновая кислота,

Ко - 0-глицеро-0-тало-2-окгулопиразоновая кислота,

LBP - белок, связывающий липиды (lipid binding protein),

РМВ - полимиксин IL

Подписано в печать 26.02 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 0 п л Тираж 100 экз Заказ № 699 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Титарева, Галина Михайловна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, 6 СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Глава . 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ВОЗБУДИТЕЛЕ ЧУМЫ

1.2. ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ - ОСНОВНОЙ КОМПОНЕНТ 20 ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

1.3. ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ

1.3.1. КАТИОННЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ

1.3.2. СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА

1.4. ЛПС И УСТОЙЧИВОСТЬ К БАКТЕРИЦИДНОМУ 42 ДЕЙСТВИЮ КАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ

1.5. ЛПС И УСТОЙЧИВОСТЬ К БАКТЕРИЦИДНОМУ 45 ДЕЙСТВИЮ СЫВОРОТКИ КРОВИ

1.6. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОСИНТЕЗА ЛПС И 52 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУР, ОТВЕЧАЮЩИХ ЗА УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЙСТВИЮ КАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ И СЫВОРОТКИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние структуры липополисахарида на устойчивость Yersinia pestis к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов и комплемента сыворотки"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Чума до настоящего времени остается серьезной проблемой для эндемичных районов, а так же для мирового здравоохранения в целом. Ежегодно регистрируется около 2000 случаев заражения людей. Острое природно-очаговое особо опасное инфекционное заболевание, несколько пандемий, которого унесли жизни миллионов людей, признано "возрождающейся инфекцией" и является одним из потенциальных агентов биотерроризма [Gage et al., 2005, Inglesby et al, 2000.]. Изучение ключевых механизмов иммунопатогенеза необходимо для совершенствования специфической профилактики, лечения и диагностики этого заболевания.

Возбудитель чумы - Yersinia pestis относится к роду Yersinia, который включает 13 видов бактерий. Наиболее филогенетически близкими к Y. pestis являются два вида энтеропатогенных иерсиний: Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica [Achtman et al, 1999; 2004.]. Все они - грамотрицательные бактерии, имеющие в составе клеточной оболочки липополисахарид (ЛПС). Располагаясь в наружном слое внешней мембраны, то есть непосредственно на поверхности клетки, ЛПС играет важную роль в процессах взаимодействия микроорганизма с организмом теплокровного хозяина и переносчика - блохи [Albizo et al., 1970; Butler et al, 1983; Дмитровский, 1994; Rebeil et al, 2004].

Иммунная система человека и млекопитающих работает как интегрированная защитная система, стремящаяся обеспечить элиминацию патогенов из организма. Механизмы иммунной защиты представлены - с одной стороны -системой врожденного иммунитета - наиболее ранним ответом на инфекцию, действующим немедленно после внедрения патогена, а с другой стороны - системой приобретенного иммунитета, который включается в более поздней стадии и является антиген-специфическим. Система врожденного иммунитета, являясь эволюционно наиболее древней, действует путем воспалительных реакций и фагоцитоза. Огромная роль в реализации воспалительных реакций принадлежит системе комплемента, цитокинам, лизоциму, пропердину, лейкину и /?-лизину, а также другим антимикробным агентам, к которым относятся и ка-тионные пептиды. Патогенные бактерии, попадая в организм млекопитающего, могут быть либо быстро уничтожены, либо, преодолев барьер неспецифической иммунной защиты, привести к развитию заболевания [Medzhitov, 2001]. В процессе эволюции отношений микро- и макроорганизма у бактериальных патогенов, в частности у патогенных иерсиний, появились механизмы устойчивости к факторам врожденного иммунитета, что позволяет им выживать и размножаться в организме хозяина [Анисимов, 2002а, 2002b; Portnoy, 2005].

Существуют различные механизмы устойчивости к бактерицидному действию сыворотки [Rautemaa, Meri S.,1999]. Бактерицидные свойства сыворотки определяются, в основном, системой комплемента. Устойчивость к бактерицидной активности сыворотки Y. enterocolitica определяется такими факторами, как YadA, Ail, О-антигеном [Balligand et al., 1985; Pierson, Fakow, 1993] и гек-сасахаридами внешнего кора [Skurnike^ al., 1999]. Для Y.pestis, возбудителя инфекции, передающегося при укусах кровососущих насекомых, устойчивость к бактерицидному действию сыворотки крови хозяина [Porat et al., 1995] - одно из важнейших условий, которое создает возможность передачи бактерий блохами от одного грызуна к другому [Анисимов, 2002а, 2002b, Hinnebusch BJ., 2004]. Действительно, большая часть штаммов чумного микроба обладает резистентностью к бактерицидному действию сыворотки. R. Porat et al. [1995] показали, что устойчивость к комплемент-опосредованному лизису обеспечивается именно липополисахаридом Y. pestis, но до сих пор не установлены её механизмы. Наряду с устойчивыми к действию сыворотки штаммами Y.pestis существуют и чувствительные к этому действию представители подвида cancasica [Гвозденко с соавт., 1992; Anisimov et al., 2004, 2005Другим фактором неспецифической иммунной защиты являются антимикробные катионные пептиды, обнаруженные во многих тканях и клетках млекопитающих [Boman,2002; Yoshio et al.,2003] и насекомых [Dimopoulos, 2003.]. Полимиксины относятся к антибиотикам катионно-пептидной природы, механизм взаимодействия которых с внешней мембраной бактерий аналогичен действию катионных пептидов млекопитающих [Zhang et al., 2001], в связи с этим их часто используют в модельных экспериментах. В основе антимикробного действия катионных пептидов лежат электростатические взаимодействия с анионными участками липида А. Кроме того показано, что катионные пептиды могут значительно снижать эндотоксический эффект ЛПС [Gough et al., 1996]. Изучение механизма антиэндотоксического действия катионных пептидов свидетельствует, что они имеют более высокое сродство к ЛПС по сравнению с сывороточным белком LBP [Scott, 2000], и, таким образом, препятствуют связыванию ЛПС с TLR [Scott, 1999, Gough, 1996]. Некоторые виды иерсиний, такие как: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и патогенные Y. enterocolitica, обладают способностью противостоять действию катионных пептидов, причем уровень устойчивости у энтеропатогенных иерсиний зависит от температуры культивирования [Bengoechea et aL, 1996, 1998; David et aL, 1992]. Одним из механизмов такой устойчивости может являться модификация липида А за счет присоединения 4-амино-4-дезокси-Ь-арабинозы (L-Ara4N) к четвертому и/или первому фосфату [Gunn and Miller, 1996; Groisman et al., 1997; Preston et al, 2001; Rebeil et al., 2004]. Наряду с резистентными к действию полимиксина В штаммами Y. pestis, существуют и чувствительные к этому катионному пептиду представители подвидов caucasica, hissarica [Мартиневский с соавт1981].

Недавно были опубликованы результаты всестороннего анализа структуры ЛПС синтезируемых разными штаммами Y. pestis, отличающимися по географическому происхождению и эпидемической значимости [Knirel et al., 2005а, 2005Ь]. Тем не менее, установление роли отдельных структурных компонентов ЛПС в устойчивости Y. pestis к антимикробным пептидам и сыворотке является предметом дальнейшего изучения. Выявление молекулярных механизмов резистентности к факторам врожденного иммунитета может объяснить причины избирательной вирулентности неосновных подвидов Y. pestis и предложить новые молекулярные мишени для диагностики, специфической профилактики и терапии чумы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - получение новых данных о функциональной значимости отдельных структурных компонентов ЛПС Y. pestis в устойчивости к бактерицидному действию антимикробных пептидов и комплемента сыворотки.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить уровни чувствительности к бактерицидному действию полимик-синаВ и сыворотки крови у представителей разных внутривидовых групп Y. pestis, выращенных в температурном диапазоне от 5 °С до 40 °С, и сопоставить их с данными о химической структуре ЛПС.

2. Оценить степень связывания полимиксина В живыми клетками Y. pestis и препаратами ЛПС в зависимости от его структуры.

3. Определить степень участия альтернативного и классического путей активации комплемента в реализации бактерицидного действия сыворотки на разные штаммы Y. pestis; изучить связывание СЗ компонента комплемента с клетками Y. pestis и с препаратами ЛПС.

4. Создать на основе штамма основного подвида Y. pestis КМ260(11) коллекцию изогенных нокаутных мутантов, отличающихся по степени редуцированности молекулы ЛПС.

5. Охарактеризовать функциональное значение некоторых генов участвующих в процессе биосинтеза ЛПС.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Установлено, что культивирование Y. pestis при 6 °С, соответствующей температуре зимней спячки грызунов, сопровождается изменением структуры ЛПС, что приводит к увеличению чувствительности микробных клеток к бактерицидному действию КАМП и сыворотки. Определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) КАМП - полимиксина В (РМВ) для штаммов Y. pestis, выращенных при температурах от 5 °С до 40 °С. Показано, что максимальная устойчивость к РМВ для разных штаммов находится в различных температурных диапазонах.

Показано впервые, что гены Y. pestis rfaE, waaF, waaO, waaL и prmF кодируют LD-гептозилсинтазу, LD-гептозилтрансферазу II, LD-гептозил-трансферазу III, О-антиген лигазу и Ага41Ч-трансферазу, соответственно, и отвечают за их синтез. Доказано, что мутации по rfaE, waaF, waaO и waaL генам приводят к снижению устойчивости Y. pestis к бактерицидному действию КАМП и сыворотки. Причем, чем значительнее укорочение корового олигоса-харида, тем выше чувствительность к этим факторам. Мутация по гену prmF снижает устойчивость только к РМВ.

Показано, что ЛПС внешней мембраны участвует в связывании СЗ компонента системы комплемента с поверхностью бактериальных клеток Y. pestis. Несмотря на то, что почти все изученные штаммы (за исключением штамма KIMD1, содержащего плазмиду pPst) способны в равной степени фиксировать этот компонент комплемента, тем не менее, лизис микробных клеток под действием сыворотки наблюдается только для глубокого R-мутанта EV11М (ssp. pestis) и штаммов 1146 и 1680р~ (ssp. caucasica). Лизис бактерий обеспечивается активацией комплемента по альтернативному пути

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ДИССЕРТАЦИИ.

Полученные в ходе выполнения работ данные о разной чувствительности штаммов Y. pestis к полимиксину В и бактерицидному действию сыворотки могут являться важной внутривидовой характеристикой и служить дополнительным дифференциально-таксономическим признаком. Обнаружение зависимости между химической структурой ЛПС и чувствительностью к полимиксину В позволяет прогнозировать структуру ЛПС у неизученных штаммов Y. pestis.

В Коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ депонированы 5 авторских штаммов Y. pestis с мутациями по генам YP00057(waaF), YPOO416(wtftf0, YP00417(waaL)) YP00654(rfaE), нарушающими соответственно синтез LD-гептозилтрансферазы II, LD-гептозилтрансферазы III, О-антиген лигазы, LD-гептозилсинтазы, участвующих в процессе биосинтеза ЛПС.

Предложены новые молекулярные мишени для создания высокоаффинных олигонуклеотидных лигандов (антисенс-РНК или iRNA), позволяющих целенаправленно нарушать определенные этапы биосинтеза ЛПС в клетках Y. pestis - гены rfaE, waaF, waaO и prmF.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результаты проведенных исследований послужили основой для составления методических рекомендаций "Оценка устойчивости патогенных иерси-ний к бактерицидному действию полимиксина В" (Оболенск, Иркутск, 2003), и методических рекомендаций "Оценка устойчивости патогенных иерсиний к бактерицидному действию сыворотки" (Оболенск, Иркутск, 2003), которые используются в лабораторных исследованиях Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии и Иркутского научно-исследовательского противочумного института.

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Зависимая от температуры внешней среды адаптационная изменчивость структуры ЛПС Y. pestis — один из основных факторов патогенности чумного микроба, определяющих исход взаимодействия с бактерицидными системами врожденного иммунитета теплокровного хозяина и переносчика.

2. Культивирование Y. pestis при температуре, соответствующей условиям торпора зимоспящих грызунов (6 °С), приводит к специфическим изменениям в структуре ЛПС. Эти изменения сопровождаются повышением чувствительности бактериальных клеток к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки и к действию катионных антимикробных пептидов, в частности, к полимиксину В.

3. Гены биосинтеза ЛПС Y. pestis: YP00057, YP00416, YP00417, YP00654 и YP02421 являются функциональными аналогами энтеробактериальных генов: waaF, waaQ, waaL, rfaE и pmrF, соответственно кодирующими LD-гептозилтрансферазу II, LD-гептозилтрансферазу III, О-антиген лигазу, LD-гептозилсинтазу и Ага4>1-трансферазу.

4. Гены pmrF, waaF, rfaE и waaQ — могут рассматриваться, как перспективные молекулярные мишени для разработки нового поколения высокоспецифичных и эффективных препаратов для терапии чумы на основе высокоаффинных олигонуклеотидных лигандов.

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦПМБ по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Изучение молекулярных механизмов патогенеза и иммуногенеза чумы, псевдотуберкулеза, сибирской язвы и туляремии" научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов, № гос. регистрации 01.200.2 13001; "Структурная организация и биологические свойства липополисахарида Yersinia pestis" отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации» (договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 74-Д от 31 декабря 2005 г.), научные руководители темы: к.м.н. С.В. Дентовская и д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов. Данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-04-49280 "Структурно-функциональный и генетический анализ липополисахарида возбудителя чумы, Yersinia pestis, с помощью сайт-направленного мутагенеза", научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов) и Международного научно-технического центра (проект МНТЦ № 1197 "Изучение роли структурной организации липополисахаридов Yersinia pestis в создании иммунных препаратов", научный руководитель темы д.м.н., с.н.с. А.П. Анисимов).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и представлены на: Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (3-5 июня 2002 г., Серпухов); XIIth European Carbohydrate Symposium (July 6-11, 2003, Grenoble, France); 2-ом Московском международном конгрессе: Биотехнология: состояние и перспективы развития (10-14 ноября 2003 г., Москва); 104th ASM General Meeting (May 23-27, 2004, New Orleans, Louisiana, USA); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (12-15 июля 2004 г., Санкт-Петербург); Международной конференции "Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний" (8-10 сентября 2004 г., "Сосновка", Новосибирская область, Россия); INTAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens: 3rd German-Polish-Russian meetth ing о n b acterial с arbohydrates ( October 6 -9, 2 004, W roctaw, P oland); 105 A SM General Meeting (June 5-9, 2005, Atlanta, GA, USA); VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (13-14 сентября, Волгоград); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (10-13 октября 2005 г.; Санкт-Петербург); 106th ASM General Meeting (May 21-25, 2006, Orlando, FL, USA) VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г, Обо-ленск, Московская обл.); the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30, 2006,

Opatija, Croatia); 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМ 18 декабря 2003 г. протокол № 10. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ 24 июля 2007 года.

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание работы отражено в 24 научных публикациях, в том числе в 5 статьях в реферируемых журналах (3 статьи в рекомендованных ВАК изданиях).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 21 работу отечественных и 300 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 10 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Титарева, Галина Михайловна

Выводы

1. Выживание и циркуляция внутривидовых групп Y. pestis в популяциях определенных резервуарных хозяев и переносчиков может приводить к изменениям структуры ЛПС, обеспечивающим адаптационные изменения вирулентности

2. Устойчивость к полимиксину В определяется как замещением фосфатных групп в липиде А остатками Ara4N, так и наличием полноценной структуры корового олигосахарида. Устойчивость к комплементу сыворотки определяется, главным образом, структурой кора ЛПС. Структура ЛПС и коррелирующая с ней устойчивость к бактерицидным факторам врожденного иммунитета зависят от температуры выращивания Y. pestis.

3. ЛПС Y. pestis участвует в связывании СЗ компонента комплемента с поверхностью бактериальной клетки. Лизис бактерий в случае чувствительных к сыворотке штаммов Y. pestis обеспечивается активацией альтернативного пути.

4. Функциональные характеристики пяти изученных генов биосинтеза ЛПС YP00057, YP00416, YP00417, YP00654 и YP02421 позволили идентифицировать их как гены, отвечающие за синтез LD-гептозилтрансферазы II, LD-гептозилтрансферазы III, О-антиген лигазы, LD-гептозилсинтазы и Ага4ТЧ-трансферазы.

5. С помощью комплекса генетических, химических, биофизических и микробиологических методов получены экспериментальные доказательства влияния строения ЛПС на чувствительность Y. pestis к бактерицидному действию полимиксина В и сыворотки.

12 О

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наличие у Y.pestis большого количества "детерминант вирулентности" (капсульный антиген, мышиный токсин, белки Yops, рНб антиген, активатор плазминогена и др.), список которых постоянно расширяется, обеспечивает микробу способность эффективно противостоять защитным механизмам хозяина и переносчика [Мишанькин, 1996; Sodeinde et al., 1992; Perry, Fetherston, 1997; Cornells, 1998; Cornelis et al., 1998; Анисимов, 1999, 2002a, 2002b; Hinnebusch 2003; Brubaker, 2007]. До настоящего времени основное внимание исследователей уделялось изучению факторов патогенности возбудителя чумы, направленных на преодоление клеточного звена иммунитета организма млекопитающего [Perry, Fetherston, 1997, Анисимов, 2002а]. Однако на первом этапе инфицирования микроорганизму приходится преодолевать и филогенетически самый древний механизм защиты, к которому относятся система комплемента и антимикробные пептиды [Medzhitov, Janeway, 2000].

Для чумного микроба характерен особый жизненный цикл, в котором происходит обязательная смена хозяев и переносчиков по схеме грызун —> блоха —> грызун, обеспечивающая непрерывную циркуляцию возбудителя и поддержание природного очага инфекции. Такой жизненный цикл, предполагает способность бактерии существовать и размножаться в широком диапазоне температур (0 °С-42 °С) в желудочно-кишечном тракте насекомого или, вызывая генерализованный инфекционный процесс, в организме млекопитающего. В природных очагах штаммы. Y. pestis циркулируют в популяциях разных видов грызунов и блох, что привело к образованию'внутривидовых групп, именуемых биоварами, подвидами, экотипами, популяциями и/или генотипами. Адаптация к циркуляции в составе отличающихся паразитоценозов проявляется в различиях этих внутривидовых групп по ферментативной активности, способности вы зывать бактериемию и гибель разных видов теплокровных животных [Anisi-mov et al., 2004]. Штаммы Y. pestis основного подвида, неспособные ферментировать рамнозу и обладающие универсальной вирулентностью, в ходе трех пандемий распространились по всему миру [Anisimov et al., 2004]. В то же время, в наиболее древних очагах Азии циркулируют рамнозо-позитивные штаммы Y. pestis (неосновные подвиды, "pestoides" или биовар "microtus"), включающие пять неосновных подвидов, на территории СНГ и Монголии и пять из 18 экотипов, циркулирующих на территории Китая. Эти рамнозо-позитивные штаммы характеризуются низкой вирулентностью для морских свинок, и описано всего три случая заболевания людей при инфицировании штаммами кавказского подвида [Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004]. Сравнительное изучение рамнозо-негативных и рамнозо-позитивных штаммов чение рамнозо-негативных и рамнозо-позитивных штаммов предоставляет возможность для более полного понимания механизмов пато- и иммуногенеза чумы.

В нашей работе мы подтвердили данные о чувствительности штаммов кавказского и гиссарского подвидов к бактерицидному действию антимикробного пептида — полимиксина В [Мартиневский с с о авт., 1981] и впервые выявили аналогичное свойство у свежевыделенных штаммов алтайского подвида. На модели штамма Y. pestis ssp. caucasica были выявлены структурные изменения ЛПС (отсутствие в молекуле остатка DD-Hep), коррелирующие с чувствительностью к полимиксину В. На наш взгляд, дальнейшее изучение выявленного феномена для определения его значимости для патогенеза и природной очаговости чумы должно быть сконцентрировано на четырех направлениях: 1) изучение структурных особенностей ЛПС представителей других неосновных подвидов Y. pestis; 2) выявление генетических механизмов, ведущих к отсутствию в составе ЛПС штаммов кавказского подвида терминального остатка DD-Hep; 3) изучение чувствительности представителей разных внутривидовых групп Y pestis к КАМПам, отличным от полимиксина В; 4) выявление различий спектра и/или уровня продукции КАМПов в организмах основных хозяев и переносчиков штаммов Y. pestis, принадлежащих к разным внутривидовым группам возбудителя.

Оценка строения ЛПС и чувствительности изученных штаммов к бактерицидному действию сыворотки человека показали, что устойчивость к комплементу определяется строением корового олигосахарида. Впервые было установлено, что чувствительные к действию сыворотки человека штаммы кавказского подвида не подвергаются лизису сывороткой мышей, для которой характерно более низкое по сравнению с большинством других теплокровных животных содержание комплемента. На наш взгляд, именно концентрация комплемента в крови животного определяет его чувствительность к заражению штаммами этого подвида. Для проверки нашей гипотезы было бы интересно определить концентрацию комплемента в крови Microtus a rvalis — основного хозяина штаммов Y. pestis кавказского подвида.

Y. pestis редко изучают при температурах выращивания ниже 20 °С [Han, 2005, Knirel, 2005b, Naylor, 1961]. Однако, учитывая зимнюю спячку грызунов, когда температура их тела близка к 5 °С, следует заметить, что продолжительность низкотемпературного периода составляет примерно половину годового цикла существования Y. pestis. Кроме того, смерть зимующего в норе грызуна может стать причиной завершения передачи чумного микроба другому хозяину и вести к прерыванию эпизоотии. Ранее существовало мнение, что грызуны, заражаясь чумой в конце осени, обладают высокой устойчивостью к инфекции в период зимней спячки [Domaradskii, 1993, Kalabukhov, 1969]. Позднее было показано, что функциональная активность иммунной системы зимоспящих грызунов находится на низком уровне [Maniero, 2002, Prendergast, 2002] и, соответственно, в этих условиях у чумного микроба нет необходимости противостоять действию бактерицидных факторов системы иммунитета, затрачивая энергию на синтез факторов патогенности. Наше предположение согласуется с. низкой вирулентностью возбудителя чумы, культивированного при температуре 5 С, в отличие от микробов, выращенных в температурном интервале от 20 С до 37° С [Naylor, 1961]. Известно, что в условиях роста при низких температурах основные бактериальные факторы, ответственные за патогенность Y. pestis, -Cafl, PsaA, Yops, Yscs, Pla и т.д. - также имеют более низкий уровень экспрессии [Han, 2005]. Полученные нами данные о высокой чувствительности штаммов Y. pestis, выращенных при 6° С, к действию факторов врожденного иммунитета свидетельствуют о развитии симбиотического взаимодействия между микробом и млекопитающим или блохой в течение периода зимней спячки. В это время бактерии способны персистировать в организме млекопитающего, не вызывая заболевания. Пробуждение грызуна сопровождается обострением инфекции, развитием бактериемии и дальнейшей передачей блохами возбудителя чумы новым хозяевам. Соответственно при повышении температуры культивирования образуются структурные варианты ЛПС обеспечивающие устойчивость микроба к бактерицидному действию факторов врожденного иммунитета, а в условиях зимней спячки — молекулы, повышающие механическую устойчивость клеточной стенки бактерии при низких температурах.

Генетический контроль синтеза ЛПС достаточно сложен. Он определяется несколькими десятками генов, кодирующими три класса ферментов, отвечающих за синтез отдельных Сахаров, наращивание макромолекулы за счет их последовательного переноса и последующий процессинг молекулы ЛПС. В рамках нашего исследования мы сконструировали пять одинарных мутантов и провели функциональную характеристику мутированных генов с помощью структурного анализа ЛПС. Полученный набор мутантов позволил доказать, что устойчивость к полимиксину обеспечивается не только замещением фосфатных групп в липиде А остатками Ara4N, но и полноценной структурой ко-рового олигосахарида. Однако для точного определения роли отдельных остатков в биологических свойствах ЛПС требуется получение полного спектра одинарных, двойных и даже тройных мутантов по генам биосинтеза ЛПС, а также их последующая комплементация. Для оценки влияния структуры ЛПС на вирулентность Y. pestis подобные мутанты нужно будет получать на основе высоко вирулентных штаммов.

В ходе выполнения данной работы нами были получены новые сведения о взаимосвязи структуры липополисахарида Y.pestis с устойчивостью клеток возбудителя чумы к действию факторов врожденного иммунитета. Было показано, что устойчивость клеток Y. pestis к бактерицидному действию катионных пептидов, обеспечивается степенью замещения Ara4N фосфатных групп в липиде А. Если замещение носит стехиометрический характер, что имеет место при 25 градусном культивировании, все анионные участки липида А оказываются закрытыми Ara4N, устойчивость к РМВ возрастает. Чем больше молекул ЛПС, входящих в состав внешней мембраны имеет нестехиометрический характер замещения фосфатных групп (ЛПС-37) или фосфатные группы остаются полностью не замещенными (один из вариантов ЛПС-6, мутанты по гену pmrF) тем выше чувствительность к этому катионному антибиотику.

Доказана роль коровой части молекулы ЛПС в устойчивости к КАМПам. Уменьшение кора на один из остатков Сахаров DDHep в сочетании со снижением содержания молекул ЛПС с GlcNAc, что является характерной чертой представителей Y. pestis, принадлежащих к подвиду caucasica, коррелирует с увеличением его чувствительность к РМВ. Структура кора высокочувствительного штамма EV11M представляет собой дисахарид, состоящим из Kdo и Ко. Еще более очевидное значение структуры кора в чувствительности к РМВ было показано на нокаутных,мутантах по генам, участвующим в его биосинтезе. Любые нарушения в синтезе пентасахаридного фрагмента, который характерен для представителей всего семейства Enterobacteriaceae, приводят'к значительному снижению устойчивости к полимиксину В.

Экспертный комитет ВОЗ по чуме предложил в качестве "золотого стандарта" для лечения этой инфекции тетрациклин и стрептомицин. Однако появление в природных очагах штаммов Y. pestis с множественной лекарственной устойчивостью делает актуальным поиск альтернативы антибиотикам. Целый ряд ученых исследует возможность использования для лечения чумы специфических антител, иммуномодуляторов, бактериофагов, бактериолизинов, и, наконец, ингибиторов факторов патогенности [Anisimov, Amoako, 2006]. К факторам патогенности принято относить специализированные биомолекулы, механизмы и системы микроорганизма, обеспечивающие патогенез инфекции, действие которых, в конечном счете, и определяет клиническую картину заболевания. Инфекционный процесс состоит из многих этапов, включая проникновение в организм хозяина, преодоление врожденного иммунитета и т.д. [Finlay, Falkow, 1997]. Принято считать, что ингибирование отдельных факторов патогенности будет оказывать не бактерицидное действие на патоген, а снижать его способность вызывать инфекционный процесс. Есть основания предполагать, что такие ингибиторы не будут повреждать клетки хозяина, индуцировать устойчивость к лечению ими или быть неэффективными вследствие перекрестной устойчивости к другим антимикробным препаратам [Alksne, 2002]. В ходе выполнения настоящих исследований мы установили, что одиночные мутации по генам rfaE, waaF, waaQ и prmF ведут к 100-кратному повышению чувствительности мутантных штаммов к бактерицидному действию полимиксина В, мутации по генам rfaE, waaF и waaQ - к более чем 1000-кратному повышению чувствительности к бактерицидному действию комплемента сыворотки. Это позволяет предположить, что нарушение экспрессии указанных генов in vivo приведет к повышению чувствительности штаммов с дефектным ЛПС к факторам врожденного иммунитета хозяина. В» качестве ингибиторов экспрессии генов биосинтеза ЛПС можно использовать антисенс-РНК - высокоаффинные олигонуклеотидные лиганды, действие которых основано на подавлении продукции ферментов, участвующих в этом биосинтезе. В настоящее время подобные антисенс-олигонуклеотиды успешно используются для регуляции экспрессии генов в бактериях [Wagner, Simons, 1994].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Титарева, Галина Михайловна, Москва

1. Адо А.Д. Патофизиология фагоцитов М., 1961

2. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Дисс. докт. мед. наук. — Саратов, Оболенск, 1999. 326 с.

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы В экосистемах природных очагов. // Молекулярная генетика. 2002а. - № 3. - С. 3-23.

4. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы В экосистемах природных очагов. // Молекулярная генетика. 2002b. - № 4. - С. 3-11.

5. Ашмарин И.П., Ждан-Пушкина С.М., Кокряков В.Н. и др Антибактериальные и антивирусные функции основных белков клетки и перспективы практического их использования //Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1972 № 4 С 502-508

6. Апарин Т.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Руководство. -Иркутск, Иркутский государственный университет, 1989. 92 с

7. Боровикова Т.А. Характеристика специфических полисахаридсодержа-щих комплексов субкультур штамма ЕВ чумного микроба: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов, 1972. - 13 с

8. Гвозденко Н.А., Валенцев В.Е., Рублев Б.Д. и др. // Журн. микробиол. -1992.-№ 11-12.-С. 8-10.

9. Гремякова Т.А., Анисимов А.П., Захарова Н.М. Взаимосвязь способности к экспрессии различных серовариантов капсульного антигена Yersinia pestis со степенью редуцированности липополисахарида бактериальных клеток // Журн. микробиол. 1995. - № 1. - С. 3-6.

10. Жуков-Вережников Н.Н. Иммунология чумы (Основы специфической терапии и профилактики бубонной и легочной чумы). M.-JL: Медгиз, 1940.-С. 109-113.

11. Зильбер А.А. Основы иммунологии. М., 1958. 599с

12. Кац JI.H. О субмикроскопической структуре Pasteurella pestis II Журн. микробиол. 1966. - № 7. - С. 84-86.

13. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрица-тельных бактерий. // Биохимия. 1993. - Т. 58., вып. 2. - С. 166-181.

14. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. // Биохимия. 1994. - Т. 59, вып. 12. -С. 1784-1851.

15. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения Санкт-Петербург "Наука" 1999. 162с

16. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Дисс. докт. мед. наук. Саратов, 1995. - 392 с Мартиневский И.Л., Аракеляна И.Л.,. // Антибиотики. - 1981- Т. 2618.1. С. 687-689.

17. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. Саратов, 1992. -172 с.

18. Определитель бактерий Берджи. Пер с анг. Г.А. Заварзина. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С Уилльямса. В 2т. Москва: Мир; 1997

19. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Наука, 1981.-288 с.

20. Achtman, M., Zurth, K., Morelli, C., Torrea, G., Guiyoule, A. & Carniel, E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. - V. 96 -P. 14043-14048.

21. Akashi S, Nagai Y, Ogata H, Oikawa M, Fukase K, Kusumoto S, et al. (2001). Human MD-2 confers on mouse Toll-like receptor 4 species-specific lipopolysaccharide recognition. // Int Immunol 2001 - V 13 - P 1595-1599

22. Albizo, J. M., and M. J. Surgalla. Isolation and biological characterization of Pasteurella pestis endotoxin. 11 Infect. Immun 1970 - V 2 - P 229-236

23. Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. // Nature. 2001-V 413-P 732-8

24. Aliprantis AO, Yang RB, Weiss DS, Godowski P, Zychlinsky A. The apop-totic signaling pathway activated by Toll-like receptor-2. // EMBO J. 2000 -V 19-P 3325-36.

25. Alitalo A, Men T, Ramo L, Jokiranta TS, Heikkila T, Seppala IJ, Oksi J, Vil-janen M, Men S. Complement evasion by Borrelia burgdorferi: serum-resistant strains promote C3b inactivation. // Infect Immun. 2001 - V 69 -P 3685-91

26. Alksne, L.E. Virulence as a target for antimicrobial chemotherapy. // Expert. Opin. Investig. Drugs 2002 - V 11 - P 1149-1159.

27. Andersen, J.; Osbakk, S.; Vorland, L.; Traavik, T. and Gutteberg, T. Lactoferrin and cyclic lactoferricin inhibit the entry of human cytomegalovirus into human fibroblasts. // Antiviral Research 2001 - V51-P141-149

28. Anderson KV. Toll signaling pathways in the innate immune response. // Сип-Орт Immunol. 2000 - V 12 - P 13-9. Review

29. Anisimov A.P., Amoako K.K. Treatment of plague: promising alternatives to antibiotics. // J. Med. Microbiol. 2006 - V 55 - P 1461-1475.

30. Anisimov AP, Lindler LE, Pier GB. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. II Clin Microbiol Rev 2004 - V 17 - P 434-464.

31. Aussel, L., H. Therisod, D. Karibian, M. B. Perry, M. Bruneteau, and M. Caroff. Novel variation of lipid A structures in strains of different Yersinia species. // FEBS Lett. 2000 - V 465 - P 87-92

32. Balligand G, Laroche Y, Cornelis G. Genetic analysis of virulence plasmid from a serogroup 9 Yersinia enterocolitica strain: role of outer membrane protein PI in resistance to human serum and autoagglutination. // Infect Immun. -1985 -V 48 -P 782-6

33. Bartholomew RM, Esser AF Differences in. activation of human and guinea pig complement by retroviruses. // J Immunol. 1978 - V 121 - P 1748-51.

34. Beg AA, Baldwin AS Jr. The I kappa В proteins: multifunctional regulators of Rel/NF-kappa В transcription factors. // Genes Dev. 1993 - V 7 - P 2064-Review.

35. Ben-Efraim S, Aronson M, Bichowsky-Slomnicki L. New antigenic component of Pasteurella pestis formed under specific conditions of pH and temperature. // J Bacterid 1961 - V 81 - P 704-14

36. Bengoechea, J. A., K. Brandenburg, U. Seydel, R. Diaz, and I. Moriyon.

37. Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis show increased outer membrane permeability to hydrophobic agents which correlates with lipopolysac-charide acyl-chain fluidity. // Microbiology 1998 - V 144 - P 1517-1526

38. Bengoechea, J. A., Lindner, В., Seydel, U., Diaz, R. & Moriyon, I. Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis are more resistant to bactericidal cati-onic peptides than Yersinia enterocolitica. II Microbiology 1998 - V 144 -P1509-1515

39. Bengoechea, J. A., R. Diaz, and I. Moriyon. Outer membrane differences between pathogenic and environmental Yersinia enterocolitica biogroups probed with hydrophobic permeants and polycationic peptides. // Infect. Immun. -1996 -V 64-P 4891.

40. Betz SJ, Isliker H. Antibody-independent interactions between Escherichia coli J5 and human complement components. // J Immunol. -1981-V127-P 1748-54.

41. Betz SJ, Page N, Estrade C, Isliker H. The effect of specific antibody on antibody-independent interactions between E. coli J5 and human complement. // J Immunol.-1982-V 128-P 707-11.

42. Beutler B, Du X, Poltorak A. Identification of Toll-like receptor 4 (Tlr4) as the sole conduit for LPS signal transduction: genetic and evolutionary studies. // J Endotoxin Res. 2001 - V 7 - P 277-80. Review.

43. Bevins, С. L. & Zasloff, M. Peptides from frog skin. // Annual Review of Biochemistry 1990-V 59-P 395-414

44. Bhat, U.R., Mayer, H., Yokota, A., Hollingsworth, RI. and Carlson, R.W. 0 Occurrence of lipid A variants with 27-hydroxyoctacosanoic acid in lipopoly-saccharides from members of the family Rhizobiaceae. //J. Bacterial. 1991 -V 173-P 2155-2159

45. Biedzka-Sarek, M., Venho, R., Skurnik, M. Role of YadA, Ail, and Lipopoly-saccharide in Serum Resistance of Yersinia enterocolitica Serotype 0:3. // Infect. Immun. 2005 - V 73 - P 2232-2244

46. Bierhaus A, Chen J, Liliensiek B, Nawroth PP. LPS and cytokine-activated endothelium. // Semin Thromb Hemost. 2000 - V 26 - P 571-87. Review

47. Bishop RE, Gibbons HS, Guina T, Trent MS, Miller SI, Raetz CR. Transfer of palmitate from phospholipids to lipid A in outer membranes of Gram-negative bacteria. // EMBO J- 2000 V 19 - P 5071-5080

48. Bjornson AB, Bjornson HS. Activation of complement by opportunist pathogens and chemotypes of Salmonella minnesota. // Infect Immun 1977 -V 16 -P 748-53.

49. Bligh E., Dyer W. A rapid method of total lipid extraction and purification. -Can. // J. Biochem. 1959. - V. 37. - № 8. - P. 911-23.

50. Boman H.,G. Our endogenous peptide antibiotics keep us healthy // Lakar-tidningen. 2002 - V 99 - P 3424-8

51. Boman H G Antibacterial peptides: key components needed in immunity. // Cell. 1991 - V 65 - P 205-7 Review

52. Boman H G Peptide antibiotics and their role in innate immunity. // Annu Rev Immunol. 1995 - V 13 - P 61-92 Review.

53. Bordet C, Bruneteau M, Michel G. Lipopolysaccharides from a slightly virulent strain of Yersinia pestis (author's transl). // Eur J Biochem 1977 - V 79 -P 443-449

54. Bouchon A, Cella M, Grierson HL, Cohen JI, Colonna M. Activation of NK cell-mediated cytotoxicity by a SAP-independent receptor of the CD2 family. // J Immunol. 2001 - V 167 - P 5517-21

55. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantification of micro-gramm quantities of protein. Utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

56. Brandenburg K, David A, HoweJ.,. KochM. H. J, Andra J., Garidel P.Temperature Dependence of the Binding of Endotoxins to the Polycationic Peptides Polymyxin В and Its Nonapeptide. // Biophysical Journal 2005 -V88-P 1845-1858

57. Bredt W, Wellek B, Brunner H, Loos M. Interactions between mycoplasma pneumoniae and the first components of complement. // Infect Immun. 1977 -V 15 — P 7-12

58. Brubaker R.R. The V antigen of yersiniae: an overview // Con-trib.Microbiol.Immunol. 1991. -V. 12.-P. 127-133.

59. Bulet P, Dimarcq JL, Hetru C, Lagueux M, Charlet M, Hegy G, Van Dorsse-laer A, Hoffmann JA. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution. // J Biol Chem. 1993 - V268 -P 14893-7

60. Bulet, P.; Hetru, C.; Dimarcq, J. and Hoffmann, D. Antimicrobial peptides in insects; structure and function. // Developmental Comparative Immunology. -1999-V 23-P 329-344

61. Burtnick MN, Woods DE Isolation of p olymyxin В -susceptible m utants о f Burkholderia pseudomallei and molecular characterization of genetic loci involved in polymyxin В resistance. // Antimicrob Agents Chemother. 1999 -V 43-P 2648-56

62. Carlson RW, Garci F, Noel D, Hollingsworth R. The structures of the lipopolysaccharide core components from Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli CE3 and two of its symbiotic mutants, CE109 and CE309. // Carbo-hydr Res — 1989 V 195-P 101-10.

63. Casteels P, Ampe C, Jacobs F, Vaeck M, Tempst P. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees. // EMBO J. 1989 - V 8 - P 2387-91

64. Charlet M, Chernysh S, Philippe H, Hetru C, Hoffmann JA, Bulet P. Innate immunity. Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusc, Mytilus edulis. // J Biol Chem. 1996 - V 271 - P 2180813.

65. Chart, H., T. Cheasty, and B. Rowe. Differentiation of Yersinia pestis and Y. pseudotuberculosis by SDS-PAGE analysis of lipopolysaccharide. // Lett. Appl. Microbiol. 1995 - V 20 - P 369-370

66. Chernysh, S.; Kim, S.I.; Beckeer, G.; Pleskach, V.A.; Filatova, N.A.; Anikin, V.B.; Platonov, V.G. and Bulet, P. Antiviral and antitumor peptides from insects. // Proceedings of the National Academy of Science USA. 2002 -V20-P 12628-12632

67. China, В., M. P. Sory, В. T. N'Guyen, M. De Bruyere, and G. R. Cornelis. Role of the YadA protein in prevention of opsonization of Yersinia enterocolitica by C3b molecules. // Infect. Immun 1993 - V 61 - P 31293136

68. Chinchar,V.G.; Wang, J.; Murti, G.; Carey, C. and Rollins-Smith, L. Inactiva-tion of frog virus 3 and channel catfish virus by esculentin-2P and ranatuerin-2P, two antimicrobial peptides isolated from frog skin. // Virology. 2001 -V 288-P 351-357

69. Christian A. Zahringer U. // Trends Glycosci. Glycotechnol. 2002. - V. 14. -P. 69-86

70. Clas F., Loos M. Killing of the S and Re forms of Salmonella minnesota via the classical pathway of complement activation in guinea-pig and human sera. // Immunology.- 1980 V 40 - P 547-56

71. Cox AD, Li J, Richards JC. Identification and localization of glycine in the inner core lipopolysaccharide of Neisseria meningitidis. // Eur J Biochem. -2002-V 269-P 4169-75.

72. Dalla Venezia N, Minka S, Bruneteau M, Mayer H, Michel G 0- Lipopoly-saccharides from Yersinia pestis. Studies on lipid A of lipopolysaccharides L and II. // Eur J Biochem. 1985 - V 151 - P 399-404

73. Datsenko K.A., Wanner B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. // PNAS. 2000 - V 97 -P 6640-6645.

74. David SA, Balasubramanian KA, Mathan VT, Balaram P. Analysis of the binding of polymyxin В to endotoxic lipid A and core glycolipid using a fluorescent displacement probe. // Biochim Biophys Acta. 1992 - V 11651. Р 147-52.

75. Domaradskii, I. V. 1993. Plague: contemporary state, assumptions, problems. Saratov Medical Institute Press, Saratov, Russia

76. Dower W.J., Miller J.F, Ragsdale C.W., High efficiency transformation of

77. De Lucca, A.J. Antifungal peptides: potential candidates for the treatment of fungal infections. // Expert Opinion on Investigational Drugs. 2000 — V 9 — P 273-299

78. Dell A, Azadi P, Tiller P, Thomas-Oates J, Jennings HJ, Beurret M, Michon,

79. F. Analysis of oligosaccharide epitopes of meningococcal lipopolysaccharides by fast-atom-bombardment mass spectrometry.//Сarbohydr Res. 1990-V 200-P 59-76

80. Diamond G, Russell JP, Bevins CL. Inducible expression of an antibiotic peptide gene in lipopolysaccharide-challenged tracheal epithelial cells. // Proc Natl Acad Sci USA 1996 - V 93 - P 5156-5160

81. Dierich MP, Bitter-Suermann D, Konig W, Hadding U, Galanos C, Rietschel ET Analysis of bypass activation of C3 by endotoxic LPS and loss of this potency. // Immunology.- 1973 V 24 - P 721-33.

82. Dimopoulos, G. Insect immunity and its implication in mosquito-malaria interactions. // Cell. Microbiol. 2003 - V 5 - P 3-1

83. Dixon D.R and. Darveau R.P Lipopolysaccharide Heterogeneity: Innate Host Responses to Bacterial Modification of Lipid A Structure // Dent Res 2005 - V 84 - P 584-595 Review

84. Dorrer E and Teuber M Induction of polymyxin resistance in Pseudomonas fluorescens by phosphate limitation. // Arch Microbiol. 1977 - V 114 -P 87-89.

85. Edebrink, P., P.-E. Jansson, M. M. Rahman, G. Widmalm, T. Holme, and M. Rahmam. Structural studies of the O-antigen oligosaccharides from two strains of Moraxella catarrhalis serotype C. // Carbohydr. Res. 1995 -V 266-P 237-261

86. Eisenhauer PB, Harwig SS, Lehrer RL Cryptdins: antimicrobial defensins of the murine small intestine. // Infect Immun. 1992 - V 60 - P 3556-65

87. Ernst RK, Guina T, and Miller SI How intracellular bacteria survive: surface modifications that promote resistance to host innate immune responses. // J Infect Dis 1999 - V 179 - P 326-330.

88. Esser AF: The membrane attack complex of complement. Assembly, structure and cytotoxic activity. // Toxicology:, 1994 - V 87 - P 229-234

89. Estabrook MM, Griffiss JM, Jarvis GA. Sialylation of Neisseria meningitidis lipooligosaccharide inhibits serum bactericidal activity by masking lacto-N-neotetraose. // Infect Immun. 1997 - V 65 - P 4436-44

90. Fearon DT. Regulation by membrane sialic acid of betalH-dependent decay-dissociation of amplification C3 convertase of the alternative complement pathway. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1978 - V 75 - P 1971-5.

91. Fekety, R. Polymyxins, In G. L. Mandell, R. G. Douglast, Jr., and J. E. Bennett (ed.), Principles and practice of infectious diseases. // 3rd ed. Churchill Livingstone, Inc., New York, N.Y- 1990 P 323-325.

92. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity // Microbiol. Rev.- 1989 V. 53. - P. 210-230.

93. Fujita T, Hufner Quark fragmentation function in the Schwinger model. // Phys Rev D Part Fields. 1989 - V 40 - P 604-606.

94. Gage, K. L., Kosoy, M: Y. Natural history of plague: perspectives from more than a century of research. // Annu. Rev. Entomol. 2005 - V 50 - P 505-528

95. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // European J. Biochem. 1969. - V. 9. - P. 245-249.

96. Galdiero F, Tufano MA, Sommese L, Folgore A, Tedesco F. Activation of complement system by porins extracted from Salmonella typhimurium. II Infect Iiramm. 1984 - V 46 - P 559-63.

97. Gamian A, Mieszala M, Katzenellenbogen E, Czarny A, Zal T, Romanowska E. The occurrence of glycine in bacterial lipopolysaccharides. // FEMS Immunol Med Microbiol. 1996 - V 13 - P 261-8

98. Ganz T, Selsted ME, Szklarek D, Harwig SS, Daher K, Bainton DF, Lehrer RI. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils. // J Clin Invest. 1985-V 76 - P 1427-35.

99. Ganz T. Extracellular release of antimicrobial defensins by human polymorphonuclear leukocytes. // Infect Immun. 1987 - V 55 - P 568-71.

100. Garcia-Vescovi, E., F. C. Soncini, and A. A. Groisman. Mg 2+ as an extracellular signal: environmental regulation of Salmonella virulence. // Cell. 1996 -V84-P 165-174

101. Gewurz H, Shin HS, Mergenhagen SE Interactions of the complement system with endotoxic lipopolysaccharide: consumption of each of the six terminal complement components. // J Exp Med. 1968 - V 128 - P 1049-57

102. Gough M, Hancock RE, Kelly NM. Antiendotoxin activity of cationic peptide antimicrobial agents. // Infect Immun. 1996 - V 64 - P 4922-7.

103. Griffiss JM, Schneider H, Mandrell RE, Yamasaki R, Jarvis GA, Kim JJ, Gibson BW, Hamadeh R, Apicella MA. Lipooligosaccharides: the principal gly-colipids of the neisserial outer membrane. // Rev Infect Dis. 1988 — V 2 — P 287-95. Review.

104. Groisman EA, Kayser J, Soncini FC. Regulation of polymyxin resistance and adaptation to low-Mg2+ environments. // J Bacterid. 1997 - V 179 -P 7040-5

105. Gronow, S., C. Noah, A. Blumentha, B. Lindner, and H.Brade. Construction of a deep-rough mutant of Burkholderia cepacia ATCC 25416 and characterization of its chemical and biological properties. // J. Biol. Chem. 2003 -V 278 - P 1647-1655

106. Guina T, Yi EC, Wang H, Hackett M, and Miller SI () A PhoP-regulated outer membrane protease of Salmonella enterica serovar typhimurium promotes re-sis-tance to alpha-helical antimicrobial peptides. // J Bacterid. 2000 - V 182- P 4077-4086.

107. Gunn JS, Miller SI. PhoP-PhoQ activates transcription of pmrAB, encoding atwo-component regulatory system involved in Salmonella typhimurium antimicrobial peptide resistance. // J Bacterid. 1996 - V 178 - P 6857-64

108. Gunn, J. S., К. B. Lim, J. Krueger, K. Kim, L. Guo, M. Hackett, and S. I. Miller. PmrA-PmrB-regulated genes necessary for 4-aminoarabinoselipid A modification and polymyxin resistance. // Mol. Microbiol. 1998 - V27 -P1171-1182

109. Gunn, J. S., R. K. Ernst, A. J. McCoy, and S. I. Miller. Constitutive mutations of the Salmonella enterica serovar Typhimurium transcriptional virulence regulator phoP. II Infect. Immun. 2000 - V 68 - P 3758-3762.

110. Gunne H, Steiner H. Efficient secretion of attacin from insect fat-body cells requires proper processing of the prosequence. // Eur J Biochem. 1993 -V 214-P 287-93

111. Guo, L., К. B. Lim, С. M. Poduje, M. Daniel, J. S. Gunn, M. Hackett, and S. I. Miller. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. // Cell. 1998 - V 95 - P 189-198

112. Guo, L., К. B. Lim, J. S. Gunn, B. Bainbridge, R. P. Darveau, M. Hackett, and S. I. Miller. Regulation of lipid A modifications by Salmonella typhimurium virulence genes phoP-phoQ. // Science. 1997 - V 276 - P 250-253.

113. Hajjar AM, Ernst RK, Tsai JH, Wilson CB, Miller SI (). Human Toll-like receptor 4 recognizes host-specific LPS modifications. // Nat Immunol. 2002 -V3-P 354-359

114. Hancock, R. E. Alterations in outer membrane permeability. // Annu. Rev. Microbiol. 1984 - V 38 - P 237-264

115. Hancock, R. E. W. Therapeutic potential of cationic peptides. // Expert. Opin. Investig. 1998 - V 7 - P 167-174

116. Hancock, R. E. W., and G. Diamond. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. // Trends Microbiol. 2000 - V 8 - P 402-410

117. Hancock, R. E. W., and M. G. Scott. The role of antimicrobial peptides in animal defenses. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 - V 97 - P 856-861

118. Hancock, R. E. W., and D. S. Chappie. Peptide antibiotics. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999 - V 43 - P 1317-1323

119. Hancock, R.E.W. Cationic antimicrobial peptides: towards clinical applications. // Expert Opinion on Investigational Drugs. 2000 - V9-P 17231729

120. Harder J, Bartels J, Christophers E, Schroder JM. A peptide antibiotic from human skin. // Nature. 1997 - V 387 - P 861

121. Helander IM, Kilpelainen I, Vaara M, Moran AP, Lindner B, Seydel U. Chemical structure of the lipid A component of lipopolysaccharides of the genus Pectinatus. // Eur J Biochem. 1994 - V 224 - P 63-70.

122. Hetru C, Bulet P. Strategies for the isolation and characterization of antimicrobial peptides of invertebrates. // Methods Mol Biol 1997 -V 78 - P 3549.

123. Hinnebusch В .J. Transmission factors: Yersinia pestis genes required to infect the flea vector of plague. // Adv. Exp. Med. Biol. 2003 -V 529 - P 55-62

124. Hinnebusch В J. The evolution of flea-borne transmission in Yersinia pestis. // In: Carniel E, Hinnebusch BJ. (eds) Yersinia Molecular and Cellular Biology.

125. Wymondham, Norfolk: Horizon Bioscience. 2004 -P 49-73

126. Hirsch, J.G. Phagocytin: a bactericidal substance from polymorphonuclear leukocytes. // J. Exp. Med. 1956 - V 103 - P 589-621

127. Hitchcock P.J., Brown T.M. Preparation of proteinase K-treated cell lysates for SDS-PAGE // J. Bacterid. 1983. - V. 154. - P. 269-277

128. Hoffmann JA, Hetru C. Insect defensins: inducible antibacterial peptides. // Immunol Today. -1992-V13-P411-15. Review.

129. Hoffmann JA, Kafatos FC, Janeway CA, Ezekowitz RA. Phylogenetic perspectives in innate immunity. // Science. 1999 - V 284- P 1313-8. Review.

130. Hoffmann JA. Innate immunity of insects. // Curr Opin Immunol. 1995- V 7 - P 4-10 Review

131. Hoffmann, J.A. and Reichhart, J.M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. // Nature Immunology. 2002 - V3-P 121-126

132. Hoist O. Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides. // In: Brade H, Opal SM, Vogel SN, Morrison DC. (eds) Endotoxin in Health and Disease. New York: Marcel Dekker. 1999 - P 115-154

133. Hoist O., Ulmer,A.J., Brade,H., Flad,H.D., Rietschel,E.T. Biochemistry and cell b iology of bacterial endotoxins. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1996-V 16-P 83-104

134. Hu VW, Esser AF, Podack ER, Wisnieski BJ: The membrane attack mechanism of complement: Photolabeling reveals insertion of terminal proteins intotarget membrane. // J Immunol. 1981 - V 127 - P 380

135. Imler JL, Hoffmann JA. Toll receptors in innate immunity. // Trends Cell Biol. 2001 - V 11 - P 304-11. Review.

136. Ingalls RR, Heine H, Lien E, Yoshimura A, Golenbock D. Lipopolysaccharide recognition, CD 14, and lipopolysaccharide receptors. // Infect Dis Clin North Am. 1999 - V 13 - P 341-53 Review

137. Islam, D. et al. Down-regulation of bactericidal peptides in enteric infections: A novel immune escapemechanism with bacterial DNA as a potential regulator. // Nature Med. 2001 - V 7 - P 180-185

138. Jack, R. W., Tagg, J. R. & Ray, B. (). Bacteriocins of gram-positive bacteria. // Microbiological. 1995- V 59 - P 171-200 Review

139. Jacks-Weis J, Kim Y, Cleary PP. Restricted deposition of C3 on M+ group A streptococci: correlation with resistance to phagocytosis. // Immunol. 1982-V 128-P 897-902

140. Jarvis, G. A., and N. S. Vedros. Sialic acid of group В Neisseria meningitidis regulates alternative complement pathway activation. // Infect. Immun. — 1987-V 55 -P 174-180

141. Jennings HJ. Chemically modified capsular polysaccharides as vaccines. // Adv Exp Med Biol. 1988- V 228 - P 495-550 Review

142. Jones DE, Bevins CL. Paneth cells of the human small intestine express an antimicrobial peptide gene. // J Biol Chem. 1992- V 267 - P 23216-25.

143. Kaca W, Literacka E, Sjoholm AG, Weintraub A. Complement activation by Proteus mirabilis negatively charged lipopolysaccharides // J Endotoxin Res. -2000-V 6 -P 223-34.

144. Kalabukhov, N. I. 1969. Periodical (seasonal and years') changes in rodents' organisms, their reasons and after-effects. Nauka Press, Leningrad, Russia

145. Kasai, K., J. Galton, P. I. Terasaki, A. Wakisaka, M. Kawahara, T. Root, and . S. I. Hakomori. Tissue distribution of the Pk antigen as determined by a monoclonal antibody. // J. Immunogenet. 1985- V 12- P 213-220

146. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H., Lindner В., Matsuura M. Modification of the structure and activity of lipid a in Yersinia pestis lipopolysaccha-ride by growth temperature. // Infect. Immun. 2002- V 70 - P 4092-4098

147. Kellenberger E, Ryter A. Cell wall and cytoplasmic membrane of Escherichia coli. // J Biophys Biochem Cytol. 1958- V 4 - P 323-6.

148. Kirschning CJ, Wesche H, Merrill Ayres T, Rothe M. Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide. // J Exp Med. -1998-V 188-P 2091-7.

149. Knirel Y.A., Dentovskaya S.V., Senchenkova S.N., Shaikhutdiniva R.Z., Kocharova N.A., Anisimov AP. Structural features and' structural variability of the lipopolysaccharide -of Yersinia pestis, the cause of plague: //J. Endotoxin Res. 2006-V 12-P 3-9.

150. Kragol G, Lovas S, Varadi G, Condie BA, Hoffmann R, and Otvos L Jr The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding. // Biochem. 2001- V40 -P 3016-3026.

151. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. - V. 227. - P. 680-685.

152. Levy O. Antibiotic proteins of polymorphonuclear leukocytes. // Eur J Haematol; 1996- V 56-P 263-77

153. Li, Jt,, Bauer, SJLJ., Mansson, M., Moxon, E.R., Richards, J.C. & Schweda, E.K.H. Glycine is a common constituent of the inner-core in Haemophilus influenzae lipopolysaccharide. // Glycobiology. 2001- V 11 - P 1009-1015

154. Lien E, Means TK, Heine H, Yoshimura A, Kusumoto S, Fukase K, et al (). Toll-like receptor 4 imparts ligand-specific recognition of bacterial lipopoly-saccharide. // J Clin Invest. 2000- V 105 - P 497-504

155. Lipuma, J. J. Burkholderia cepacia. Management issues and new insights. // Clin. Chest Med. 1998- V 19 - P 473^186

156. Loos M, Wellek B, Thesen R, Opferkuch W. Antibody-independent interaction of the first component of complement with Gram-negative bacteria. // Infect Immun. 1978- V 22 - P 5-9.

157. Loos, M., D. Bitter-Suermann, and M. Dierich. Interaction of the first (CI), the second (C2) and the fourth (C4) component of complement with different preparations of bacterial polysaccharides and with lipid A. // J. Immunol. -1974-V 112 -P 935-940.

158. Lopez-Solanilla E, Garcia-Olmedo F, Rodriguez-Palenzuela P.Inactivation of the sapA to sapF locus of Erwinia chrysanthemi reveals common features in plant and animal bacterial pathogenesis. // Plant Cell. 1998- V 10 - P 873-6.

159. Lowry O.H., Rosenbrough N.R., Farr A.L. et al. Protein measurement with the folin phenol // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 115-119.

160. Luderitz O. Freudenberg M. A., G alanos С., Z ehmann К., Rietschel E. T., Shaw D. H. Lipopolysaccharide of gram-negative bacteria // Curr. Top. Membr. Transport. —1982. —V. 17. —P. 79-134

161. Lysenko ES, Gould J, Bals R, Wilson JM, and Weiser JN () Bacterial phos-pho-rylcholine decreases susceptibility to the antimicrobial peptide LL-37/hCAP18expressed in the upper respiratory tract. // Infect Immun. 2000-V68-P 1664-1671

162. Mandrell, R. E. 1992. Further antigenic similarities of Neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharides and human glycosphingolipids. // Infect. Immun. 60:3017-3020

163. Mandrell, R. E., and M. A. Apicella. Lipo-oligosaccharides (LOS) of mucosal pathogens: molecular mimicry and host-modification of LOS. // Immunobiology.-1993-V 187-Р 382-402.

164. Maniero GD. Classical pathway serum complement activity throughout various stages of the annual cycle of a mammalian hibernator, the golden-mantled ground squirrel, Spermophilus lateralis. // Dev Comp Immunol. 2002- V 26 -P 563-74

165. Marcus RL, Shin HS, Mayer MM. An alternate complement pathway: C-3 cleaving activity, not due to C4, 2a, on endotoxic lipopolysaccharide after treatment with guinea pig serum; relation to properdin. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1971-V 68-P 1351-4.

166. Marshall S. H., Arenas G., Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology // Journal of Biotechnology. 2003- V 6- P 271-283

167. Masoud H, Perry MB, Richards JC. Characterization of the lipopolysaccharide of Moraxella catarrhalis. Structural analysis of the lipid A from M. catar-rhalis serotype A lipopolysaccharide. // Eur J Biochem. 1994- V220 -P 209-16

168. MatsuzakI, K. Why and how peptide-lipid interaction utilized for self defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. // Biochimica et Biophysca Acta. 1999-V 1462-P 1-10

169. Mayer MM, Michaels DW, Ramm LE, Whitlow MB, Willoughby JB, Shin ML: Membrane damage by complement. // Crit Rev Immunol. 1981- V 2-P 133-165

170. McCoy A J, Liu H, Falla TJ, and Gunn JS Identification of Proteus mirabilis-mutants with increased sensitivity to antimicrobial peptides. // Antimicrob

171. Agents Chemother. 2001- V 45 - P 2030-2037

172. McGee D. J. Rest R. F. Regulation of Gonococcal Sialyltransferase, Lipooli-gosaccharide, and Serum Resistance by Glucose, Pyruvate, and Lactate. // Infect Immun. 1996- V 11 - P 4630-4637

173. Means TK, Pavlovich RP, Roca D, Vermeulen MW, Fenton MJ. Activation of TNF-alpha transcription utilizes distinct MAP kinase pathways in different macrophage populations. // J Leukoc Biol. 2000- V 67 - P . 885-93

174. Medicus RG, Chapuis RM. The first component of complement. I. Purification and properties of native CI. // J Immunol. 1980- V 125- P 390-5.

175. Medzhitov R, Janeway С Jr (). Innate immune recognition: mechanisms and pathways. // Immunol Rev. 2000- V 173 - P 89-97

176. Medzhitov R, Janeway CA Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. // Science. 2002- V 296 - P 298-300

177. Medzhitov R, Janeway CA Jr. Innate immunity: impact on the adaptive immune response. // Curr Opin Immunol. 1997- V 9 - P 4-9. Review.

178. Medzhitov R. Toll-like receptors and innate immunity // Nature . -12001. -V 1. P - 135-145 Reviews Immunology

179. Mekalanos JJ. Environmental signals controlling expression of virulence determinants in bacteria. // J Bacterid. 1992- V 174- P 1-7.

180. Minka, S., and M. Bruneteau. Isolement et caracterisation chemique des lipopolysaccharides de type R dans une souche hypovirulente de Yersinia pestis. Can. // J. Microbiol. 1998- V 44- P 477-481

181. Miyake K, Ogata H, Nagai Y, Akashi S, Kimoto M. Innate recognition о f lipopolysaccharide by Toll-like receptor 4/MD-2 and RP105/MD-1. // J Endotoxin Res. 2000- V 6- P 389-91

182. Modlin RL, Brightbill HD, Godowski PJ. The toll of innate immunity on microbial pathogens. // N Engl J Med. 1999- V 340 - P 1834-5.

183. Moore AJ, Beazley WD, Bibby MC, Devine DA. Antimicrobial activity of cecropins. // J Antimicrob Chemother. 1996- V 37 - P 1077-89

184. Muhlradt PF, Wray V, Lehmann V. A 31P-nuclear-magnetic-resonance study of the phosphate groups in lipopolysaccharide and lipid A from Salmonella: // Eur J Biochem. 1977- V 81 - P 193-203

185. Mtiller-Eberhard, H: J. Complement. // Annu. Rev. Biochem. 1975- V 44v.1. P 697-724

186. Muller-Eberhard H.J. Molecular organization and function of the complement system. // Annu. Rev. Biochem. 1988- V 57 - P 321-347

187. Murphy T F В ranhamella catarrhalis: epidemiology, surface antigenic structure, and immune response. // Microbiol Rev. 1996- V 60- P 267-79. Review

188. Naylor HB, Fukui GM, Mcduff CR Effect of temperature on growth and virulence of Pasteurella pestis. Physical and nutritional requirements for restoration of virulence. // J Bacterid. 1961- V 81 - P 649-55

189. Ong G. L, Baker A. E, Mattes M. J. Analysis of high complement levels in Mus hortulanus and BUB mice // J. Immunol Methods. 1992. - V. 154. -P. 37-45.

190. Ong G.L, Mattes MJ. Mouse strains with typical mammalian levels of complement activity I IJ Immunol Methods 1989. - V. 125. - P. 147-158.

191. Pangburn, M. K., D. C. Morrison, R. D. Schreiber, H. J. Muller-Eberhard. Activation of the alternative complement pathway: recognition of surface structures on activators by bound C3b. // J. Immunol. 1980- V 124 - P 977982

192. Parra-Lopez С, Baer MT, Groisman EA Molecular genetic analysis of a locus required for resistance to antimicrobial peptides in Salmonella typhimurium.7/ EMBO J. 1993- V 12 - P 4053-62.

193. Parra-Lopez C, Lin R, Aspedon A, Groisman EA.A Salmonella protein that is required for resistance to antimicrobial peptides and transport of potassium. // EMBO J. 1994- V 13 - P 3964-72

194. Perry RD, Brubaker RR Vwa+ phenotype of Yersinia enterocolitica. // Infect Immun. 1983- V 40- P 166-71

195. Perry R., Fetherston J.D. Yersinia pestis—etiologic agent of plague. // Clin. Microbiol. Rev.:- 1997- V 10 P 35-66

196. Pierson DE, Falkow S. The ail gene of Yersinia enterocolitica has a role in the ability of the organism to survive serum killing. // Infect Immun. 19931. V 16-P 1846-52

197. Pilione M. R., Pishko E J., Preston A., Maskell D. J., and Harvill E.T pagP Is Required for Resistance to Antibody-Mediated Complement Lysis during Bordetella bronchiseptica Respiratory Infection // Infect Immun. 20041. V 72- P 2837-2842

198. Pillemer L, Blum L, Lepow IH, Ross OA, Todd EW, Wardlaw AC The properdin system and immunity. I. Demonstration and isolation of a new serum protein, properdin, and its role in immune phenomena. // Science. 19541. V 120-P 279-85

199. Podack ER, Stoffel W, Esser AF, Muller-Eberhard HJ: Membrane attack complex о f complement: Distribution of subunits between the hydrocarbon phase of target membranes and water. // Proc Natl Acad Sci USA.;- 1981— 78V -P 4544-4548

200. Podack, E. R., and J. Tscopp. Membrane attack by complement. // Mol. Immunol.- 1984- V 21 P 589-603

201. Porat R., W.R. McCabe, R.R. Brubaker, Lipopolysaccharide associated resistance to killing of Yersiniae by complement // J. Endotoxin Res. -1995- V 2 -P 91-97.

202. Portnoy D.A. Manipulation of innate immunity by bacterial pathogens // Current Opinion in Immunology. 2005- V 17 - P 25-28

203. Prendergast В J, M osinger В J г, К olattukudy PE, Nelson RJ. Hypothalamic gene expression in reproductively photoresponsive and photorefractory Siberian hamsters. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2002- V 99 - P 16291 -6

204. Radziejewska-Lebrecht J, Feige U, Mayer H, Weckesser J. Structure of the heptose region of lipopolysaccharies from Rhodospirillum tenue. // J Bacte-riol. 1981-V 145-P 138-44

205. Raetz CR, Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. // Annu Rev Biochem. 2002- V 71- P 635-700.

206. Raetz C.R.H. Biochemistry of endotoxins. // Ann. Rev. Biochem.- 19901. V 59-P 129-170

207. Rautemaa R., Meri S. Complement-resistance mechanisms of bacteria // Microbes and Infection. 1999 - V 1. - P 785-794

208. Ray MK, Kumar GS, Shivaji S. Phosphorylation of lipopolysaccharides in the Antarctic psychrotroph Pseudomonas syringae: a possible role in temperature adaptation. // J Bacterid. 1994- V 176- P 4243-9.

209. Rebeil R, Ernst RK, Gowen BB, Miller SI, Hinnebusch BJ. Variation in lipid A structure in the pathogenic yersiniae. // Mol Microbio. 2004- V 521. Р 1363-1373.

210. Rest, R. F., and R. E. Mandrell. Neisseria sialyl transferases and their role in pathogenesis. // Microb. Pathog.:- 1995- V 19 P 379-390

211. Rietschel E. Т., Krikae Т., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. // FASEB J 1994 - V 8 - P 217-225

212. Roantree, R. J. and L. A. Rantz. A study of the relation-ship of the normal bactericidal activity of human serum to bacterial infection. // J. Clin. Invest-1960-V39-P 72-81.

213. Roantree, R. J., and N. C. Pappas. The survival of strainsof enteric bacilli in the blood stream as related to their sensitivity to the bactericidal effect of serum. // J. Clin. Invest. 1960- V 39- P 82-88.

214. Rock FL, Hardiman G, Timans JC, Kastelein RA, Bazan JF A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998-V 95 -P 588-93.

215. Roggenkamp A., Ackermann N., Jacobi C. A., Truelzsch K., Hoffmann H., and Heesemann J. Molecular Analysis of Transport and Oligomerization of the Yersinia enterocolitica Adhesin YadA I I J. Bacteriology. 2003- V 185-P 3735-3744

216. Ross, G. D., J. D. Lambris, J. A. Cain, and S. L. Newman. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. I. Requirements for factor H vs CR1 cofactor activity. // J. Immunol. 1982-V 129-P 2051-2060

217. Sahl, H. G., Jack, R. W. & Bierbaum, G. Biosynthesis and biological activities of lantibiotics with unique post-translational modifications. // European Journal of Biochemistry. 1995- V 230 - P 827 -53

218. Schoolnik, G. К., Т. M. Buchanan, and К. K. Holmes. Gonococci causing disseminated gonococcal infection are resistant to the bactericidal action of normal human serum. // J. Clin. Invest. 1976- V 58- P 1163-1173.

219. Schromm AB, Brandenburg K, Loppnow H, Zahringer U, Rietschel ET, Carroll SF, Koch MH, Kusumoto S, Seydel U. The charge of endotoxin molecules influences their conformation and IL-6-inducing capacity. // J Immunol. 1998. —V 161. —P 5464—5471

220. Schumann, R. R., S. R. Leong, G. W. Flaggs, P. W. Gray, S. D. Wright,J. C. Mathison, P. S. Tobias, and R. J. Ulevitch. Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. // Science. 1990- V 249 - P 1429-1431

221. Scott MG, Gold MR, Hancock RE Interaction of cationic peptides with lipo-teichoic acid and gram-positive bacteria. // Infect Immun. 1999- V>67 -P 6445-53.

222. Scott, M. G., А. С. E. Vreugdenhil, W. A. Buurman, R. E. W. Hancock, M. R. Gold:. Cationic antimicrobial peptides block the binding of lipopolysaccharide (LPS) to LPS binding protein. // J. Immunol 2000- V 164 - P 549-553

223. Selitrennikoff, C.P. Antifungal proteins. // Applied and Environmental Microbiology. 2001- V 67- P 2883-2894

224. Selsted ME, Brown DM, DeLange RJ, Lehrer RI. Primary structures of MCP-1 and MCP-2, natural peptide antibiotics of rabbit lung macrophages. // J Biol Chem. 1983-V 258-P 14485-9.

225. Seltmann G, Beer W, Claus H, Seifert H. Comparative classification of Acinetobacter baumannii strains using seven different typing methods. // Zen-tralbl Bakteriol. 1995- V 282 - P 372-83

226. Severina, E., Severin, A. & Tomasz, A. (). Antibacterial efficacy of nisin against multidrug-resistant Gram-positive pathogens. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1998- V 41 - P 341-7

227. Shafer, W. M., L. E. Martin, and J. K. Spitznagel. Cationic antimi-crobial proteins isolated from human neutrophil granulocytes in the pres-ence of diiso-propyl fluorophosphate. // Infect. Immun. 1984- V 45 - P 29-35.

228. Sharp P., Sugden В., Sambrook J. Detection of two estriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose. // Biochemistry. 1973. -V. 12. P. 3051-5

229. Shimomura H, Matsuura M, Saito S, Hirai Y, Isshiki Y, Kawahara К Unusual interaction of a lipopolysaccharide isolated from Burkholderia cepacia with polymyxin B. // Infect Immun. 2003- V 71 - P 5225-30

230. Skurnik M, Venho R, Bengoechea JA, Moriyon I. The lipopolysaccharide outer core of Yersinia enterocolitica serotype 0:3 is required for virulence and plays a role in outer membrane integrity. // Mol Microbiol. 1999- V 31-P 1443-62.

231. Skurnik M., J.A. Bengoechea, The biosynthesis and biological role of lipopolysaccharide O-antigens of pathogenic Yersiniae. II Carbohydr. Res. -2003-V 338-P 2521-252.

232. Smith, H., J. A. Cole, and N. J. Parsons. The sialylation of gonococcal lipopolysaccharide by host factors: a major impact on pathogenicity. // FEMS Microbiol. Lett. 1992- V 100 - P 287-292.

233. Smith, H., N. J. Parsons, and J. A. Cole. Sialylation of neisserial lipopolysac-charides: a major influence on pathogenicity. // Microb. Pathog. 1995- V 19 -P 365-377.

234. Sodeinde O.A., Subrahmanyam Y.V., Stark K. et al. A surface protease and the invasive character of plague // Science. 1992. - V. 258. - P. 1004-1007

235. Soravia, E., Martini, G., and Zasloff, M. Antimicrobial properties of peptides from Xenopus granular gland secretions. // FEBS Lett. 1988- V228 -P 337-340

236. Steiner H, Hultmark D, Engstrom A, Bennich H, Boman HG. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. // Nature. 1981-V 292-P 246-8.

237. Sterzl J; Pesak, V; Kostka, J; Jilek, M. The relation between the bactericidal activity of complement and the character of the bacterial surfaces // Folia Microbiol. (Pratia). 1964- V 9 - P 284-298

238. Stumpe S, Schmid R, Stephens DL, Georgiou G, Bakker EP Identification of OmpT as the protease that hydrolyzes the antimicrobial peptide protamine before it enters growing cells of Escherichia coli. // J Bacteriol. 1998-V 180-P 4002-6

239. Takeda, K., Kaisho, Т., and Akira, S. Toll-like receptors. // Annu Rev Immunol. 2003- V 21 - P 335-376.

240. Tamayo R, Ryan SS, McCoy AJ, Gunn JS. Identification and genetic characterization of PmrA-regulated genes and genes involved in polymyxin В resistance in Salmonella enterica serovar typhimurium.// Infect Immun. 20021. V 70-P 6770-8.

241. Tanaka, К. P-I3 kinase p85 is a target molecule of proline-rich antimicrobial peptide to suppress proliferation of ras - transformed cells. // Japanese Journal of Cancer Research. - 2001- V 92 - P 959-967

242. Taylor, P. W., and H.-P. Kroll. Killing of an encapsulated strain of Escherichia coli by human serum. // Infect. Immun. 1983-V 39 - P 122-131

243. Thevissen, K.; Terras, F.R.G. and Broekaert, W.F. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal. // Applied and Environmental Microbiology. 1999 - V 65 - P 5451-5458

244. Towbin H., Staenelin, Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from poly-acrilamide gels to< nitrocellulose sheets: procedure and some applications.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979 - V 76- P 4350-4354

245. Tsai C.M., Frash C.E. A sensitive silverstain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. // Anal. Biochem. 1982. - V. 119: - P. 115-119

246. Ulevitch RJ. New therapeutic targets revealed through investigations of innate immunity. // Crit Care Med. 2001- V 29 - P 8-12

247. Vaara, M., T. Vaara, M. Jensen, I. Helander, M. Nurminen, E. T. Rietschel, and P. H. Makela. Characterization of the lipopolysaccharide from the po-lymyxin-resistant pmrA mutants of Salmonella typhimurium. II FEBS Lett. -1981-V 129-P 145-149

248. Vizioli, J. and Salzet, M. Antimicrobial peptides: new weapons to control parasitic infections? // Trends in Parasitology 2003- V 19- P 502-508

249. Vogel, U., A. Weinberger, R. Frank, A. Mueller, J. Koehl, J. P. Atkinson, and

250. M. Frosch. Complement factor СЗ deposition and serum resistance in isogenic capsule and lipooligosaccharide sialic acid mutants of serogroup В Neisseria meningitidis. // Infect. Immun. 1997-V 65 - P 4022-4029

251. Wagner E.G., Simons R.W. . Antisense RNA control in bacteria, phages, and plasmids. // Annu. Rev. Microbiol. 1994- V 48 - P 713-742

252. Westphal O., Luderitz O. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bacterien // Angew.Chem. —1954. —V. 66. —P. 407-417

253. Wetmur J. G., Davidson N. J. Kinetics of renaturation of DNA. // Mol. Biol. -1968. -V. 31. P. 349-370

254. Williams R.C., Gewurz H., Quie P.G. Effects of fraction 1 from Yersinia pestis on phagocytosis in vitro II J. Infec. Dis. 1972. - V. 126. - P. 235-241

255. Wollenweber, H.-W. and Rietschel, E.Th. Analysis of lipopolysaccharide (lipid A) fatty acids. // J. Microbial. Methods. 1990- V 11 - P 195-211

256. Wright, S. D., and R. P. Levine. How complement kills E. coli. II. The apparent two-hit nature of the lethal event. // J. Immunol. 1981- V 127 - P I 1521156

257. Wright, S. D., R. A. Ramos, P. S. Tobias, R. J. Ulevitch, and J. C. Mathison. CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. // Science. 1990- V 249 - P 1431-1433

258. Wu, M., and R. E. W. Hancock. Interaction of the cyclic antimicrobial cationic peptide bactenecin with the outer and cytoplasmic membrane. // J. Biol. Chem. 1999- V 274 - P 29-35.

259. Yang RB, Mark MR, Gray A, Huang A, Xie MH, Zhang M, Goddard A, Wood WI, Gurney AL, Godowski PJ. Toll-like receptor-2 mediates lipopoly-saccharide-induced cellular signalling. // Nature. 1998- V 395 - P 284-8

260. Yang RB, Mark MR, Gurney AL, Godowski PJ. Signaling events induced by lipopolysaccharide-activated toll-like receptor 2. // J Immunol. 1999- V 163 - P 639-43

261. Yeaman, M. R., Yount, N. Y. 0- Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. // Pharmacol. Rev. 2003- V 55 - P 27-55

262. Yersin A. Bacille de la peste // Ann. Inst. Pasteur. 1894. - V. 8. - P. 666

263. Yoshio H, Tollin M, Gudmundsson GH, Lagercrantz H, Jornvall H, Marchini G, Agerberth B. Antimicrobial polypeptides of human vernix caseosa and amniotic fluid: implications for newborn innate defense. // Pediatr Res.2003-V 53- Р 211-6

264. Zahringer, U., Lindner, В. and Rietschel, E.Th. Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides. // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994- V 50 - P 211-276

265. Zasloff, M. Antibiotic peptides as mediators of innate immunity. // Curr. Opin. Immunol.- 1992- V 4 P 3-7

266. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. // Nature. -2002-V 415-P 389-395

267. Zeya H.I., Spitznagel J.K. Antibacterial and enzymic basic proteins from leukocyte lysosomes: separation and identification. // Science. 1963- V 142 1. P 1085-7.

268. Zeya HI, Spitznagel JK. Arginine-rich proteins of polymorphonuclear leukocyte lysosomes. Antimicrobial specificity and biochemical heterogeneity. // J Exp Med. 1968- V 127 - P 927-41

269. Zeya HI, Spitznagel JK. С ationic p roteins о f p olymorphonuclear 1 eukocyteлlysosomes. I. Resolution of antibacterial and enzymatic activities. // J Bacte-riol. 1966-V 91-P 750-4

270. Zhang L, Rozek A and Hancock RE Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes. // J Biol Chem 2001- V 276 - P 35714-35722

271. Zhang, L., R. Benz, and R. E. W. Hancock. Influence of praline residues on the antimicrobial and synergistic activities of a-helical peptides. //Biochemistry. 1999- V 38- P 8102-8111

272. Zhao C, Wang I, Lehrer RI. Widespread expression of beta-defensin hBD-1 in human secretory glands and epithelial cells. // FEBS Lett. 1996- V396 -P 319-22

273. Zhou Z, Lin S, Cotter RJ, and Raetz CRH () Lipid A modifications characteristic of salmonella typhimurium are induced by NH4V03 in Escherichia coli K12.1 IJ Biol Chem.- 1999-V 274-P 18503-18514

274. Zhou D., Han Y., Song Y., Huang P., Yang R. Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis. 11 Microbes Infect. 2004- V 6 - P 1226-1234

Информация о работе

Титарева, Галина Михайловна
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Влияние структуры липополисахарида на устойчивость Yersinia pestis к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов и комплемента сыворотки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы