Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Электрофизический анализ и физиолого-биохимические особенности клеточных повреждений ионами тяжелых металлов

ВАК РФ 06.01.14, Агрофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрофизический анализ и физиолого-биохимические особенности клеточных повреждений ионами тяжелых металлов"

ПЬ од

АГРОФИЗИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕ^оШЙ иЬ^НТУТ

На правах рукописи

ХАСАНОВА ЛИЛИЯ АНАСОВНА

Электрофизический анализ и физиолого-биохимические особенности клеточных повреждений ионами тяжелых металлов

Специальность - 06.01.14 - агрофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ -1996

Работа выполнена в Институте биофизики клетки Российской Академии наук, Отделе биохимии и цитохимии Уфимского научного центра Российской Академии наук, Башкирском государственном университете.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.С.Медведев; доктор биологических наук А.И.Мирошников; доктор

\iiiHprvuv Iт-х- О Г" Уп чппп

^.«„.Медведев; доктор оиологических н химических наук, профессор О.Г.Усьнров

Ведущее учреждение - Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится " ^/Г-Р1996 г,

в часов на заседании Диссертационного сове^ Д 020.21.01 в

Агрофизическом научно-исследовательском институте по адресу: 195220, Санкт-Петербург, Гражданский проспект, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агрофизического научно-исследовательского института.

Автореферат разослан "/X" 996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

М.В.Архипов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди антропогенных воздействий, оказывающих давление на экологическую структуру Земли особое место занимают тяжелые металлы, техногенное накопление которых в окружающей среде идет высокими темпами. В следовых количествах тяжелые металлы - микроэлементы необходимы для всех форм жизни. Их большая физиологическая значимость не только научно доказана, но и повсеместно используется в практике сельского хозяйства. С увеличением концентрации тяжелые металлы становятся высокотоксичными, поскольку обладая большим сродством к физиологически важным органическим соединениям, нарушают процессы метаболизма, нормального роста и развития живых организмов (Альберт, 1989; Ершов, Плетнева, 1989; Литвин, Чубуков, 1989; Ильин, 1991; Littlfield, Poirier, 1994; Corbella et al, 1996).

На появление избыточного количества тяжелых металлов наиболее чутко реагирует почвенная биота и прежде всего микроорганизмы. Микробные сообщества в ряду быстро сменяющихся поколений реактивно отвечают на повышенные концентрации тяжелых металлов количественными и качественными перестройками в своей структурно-функциональной организации (от деструкции отдельных элементов до элиминации сообщества в целом) (Щеповских и др., 1995). Высокая чувствительность почвенных микроорганизмов к тяжелым металлам, особенности клеточной организации, разнообразие биосинтетических и катаболических реакций, а также широкое участие этой группы педобионтов в поддержании естественного статуса и плодородия почвы посредством осуществления процессов, связанных с накоплением органического вещества и его трансформации, делает микробные клетки незаменимыми для изучения механизмов повреждающего действия тяжелых металлов, использования их в качестве индикаторных систем в нормировании техногенного поступления соединений тяжелых металлов, а также для разработки надежных методов детоксикации этого класса веществ.

К настоящему времени накоплен обширный фактический материал, посвященный изучению реакций микроорганизмов на действие тяжелых металлов, который касается как отдельных показателей, определяющих их токсические эффекты, так и процессов жизнедеятельности микробных клеток (различных сторон метаболизма, структурной организации и адаптивных ответов) в присутствии этого класса токсикантов. Однако не нашли своего отражения вопросы кратковременных сублетальных повреждений (токсический шок) ионами тяжелых металлов и, в этой связи, соотношения специфичности и неспецифичности реакций микробных клеток на данный экстремальный фактор, механизмов изменения первичной устойчивости клеточных функций и репарации

сублетальных повреждений, как часть общей проблемы возникновения клеточных повреждений в результате различных экстремальных воздействий.

Необходимо отметить, что современные концепции механизмов клеточных повреждений недооценивают эффекты, связанные с изменениями электрических свойств клеток, хотя эти изменения, выходящие за пределы эволюционно сложившихся физиологических норм, могут приводить к существенному снижению функциональной активности и нарушению структурной организации микроорганизмов, в частности, к изменению клеточной поверхности, целостности мембран, отдельных белковых комплексов, при этом часто игнорируется интегральный многофакторный анализ, привлекающий приемы и методы смежных научных дисциплин. На сегодня при решении теоретических вопросов наметилась тенденция к переходу от биохимических подходов (изучение строения и состава клеток на молекулярном уровне) к биофизическому - построению моделей клеток с учетом параметров среды (Мирошников и др., 1986). В настоящей работе впервые предпринята попытка объединения этих подходов и проведения исследований клеточных повреждений ионами тяжелых металлов посредством совместного изучения электрофизических характеристик и физиолого-биохимических процессов у различных в систематическом отношении групп микроорганизмов: цианобактерий, пурпурных бактерий, псевдомонад и микобактерий, принимающих активное участие в почвообразовании, минерализации органических соединений и утилизации антропогенных загрязнений. Сопоставление реакций этих микроорганизмов с общим индикатором загрязнения -гетеротрофной грамотрицательной бактерией Escherichia coli на действие тяжелых металлов, как весьма опасных, наряду с пестицидами и радионуклидами, экотоксикантов, имеет принципиальное значение в экологическом прогнозировании поведения данной группы поллютантов в системе почва- агро- и биоценоз.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выяснение механизмов повреждающего действия Ag+, Cd+2, Со+2, Cu+2, Fe+2, Mg+2, Ni+2, Pb+2, Zn+2, А1+3, Cr+3, Fe+3, Ga+3, Gd+3, La+3 на клетки цианобактерий Anacystis nidulans, Synechocystis aquatilis, несерных пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, грамотрицательных гетеротрофных бактерий Escherichia coli, Pseudomonas fluorantice, грамположительных гетеротрофных бактерий Bacillus subtilis, Mycobacterium phlei в связи с исследованиями специфики структурной и физиолого-биохимической интеграции микробной клетки в экстремальных условиях окружающей среды.

Для этого были сформулированы следующие задачи:

1. Проведение системного анализа и обобщение фактического материала по изучаемому вопросу;

2. Определение параметров и критериев оценки повреждения микробных клеток ионами тяжелых металлов в повышенных концентрациях при их кратковременном сублетальном воздействии (токсический шок); изучение условий репарации возникших повреждений, установление специфичности токсического шока ионами тяжелых металлов; выявление устойчивости клегок к последующим экстремальным воздействиям.

3. Исследование электроповерхностных характеристик и свойств цитоплазматической мембраны микробных клеток при обработке ионами тяжелых металлов в зависимости от физико-химических показателей (рН, осмотическая реакция, наличие конкурирующих катионов, вид аниона, зарядность), а также систематического положения микроорганизмов.

4. Изучение физиолого-биохимических характеристик (фотосинтетическая активность, дыхание, скорость роста, синтез стрессовых белков), морфологии и ультраструктуры, поврежденных ионами тяжелых металлов клеток.

Проведение сопоставительного электрофизического и биохимического анализа повреждений микробных клеток одно-, двух-, трехзарядными катионами тяжелых металлов.

5. Поиск и разработка методов экспресс-анализа и биологической индикации загрязнения окружающей среды соединениями тяжелых металлов.

Научная новизна. Впервые применен комплексный электрофизический анализ (изучение электрофоретической подвижности, электроориентационных и электрооптических эффектов клеток) и физиолого-биохимическое исследование кратковременного

сублетального повреждающего действия широкого спектра ионов тяжелых металлов для представителей различных систематических групп микроорганизмов (цианобактерии, кесерные пурпурные бактерии, гетеротрофные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы) при вариации фнзнко-химИческих параметров среды и учета изменяющихся при этом свойств тяжелых металлов.

Впервые показана корреляция между экстремальными изменениями электроповерхностных свойств клеток и повреждениями цитоплазматической мембраны, зависящая от значения рН, присутствия гидролизованных форм металлоионов и исходных электрических свойств бактерий. В случае рН образования однозарядных гидролизованных форм металлоионов обнаружена их поверхностная адсорбция и проникновение к цитоплазматической мембране клеток. Впервые проведен анализ электрических свойств фототрофных бактерий (цианобактерии и пурпурные бактерии) и установлена зависимость ответных реакций микробных клеток на повреждающее действие ионов тяжелых металлов от систематического положения микроорганизмов.

Показано изменение в составе растворимой фракции полипептидов микроорганизмов в процессе повреждения металлоионами, при этом обнаружен синтез новых полипептидов (стрессовых белков) - белков токсического шока. На основе полученных экспериментальных данных и обобщения теоретического материала предложен один из возможных механизмов повреждающего действия ионов тяжелых металлов на микроорганизмы, обусловленный как физико-химической природой ионов тяжелых металлов и параметрами среды, в которых они находятся, так и особенностями биологической организации изученных микробных клеток.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований дополняют сведения о физиологии почвенных микроорганизмов. Полученные данные могут быть использованы в системе долгосрочного контроля (мониторинга) за процессами, происходящими в почвенных биоценозах, подверженных токсическому влиянию тяжелых металлов, при экологическом нормировании, индикации и прогнозировании поведения этой группы токсикантов, биологической деструкции соединений тяжелых металлов, а также биологической рекультивации загрязненных ими почв.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на V Межвузовской конференции молодых ученых "Современные проблемы молекулярной и клеточной биологии" (Ленинград, 1987), Всесоюзной конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1987), рабочем совещании по систематике и биологии цианобактерий (Ленинград, 1988), заседании кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ЛГУ (Ленинград, 1988), научно-практической Региональной конференции "Электрофорез клетки" (Уфа, 1989), заседании кафедры ФЧЖ Башкирского государственного университета (Уфа, 1991), на Межвузовском научном семинаре "Принципы адаптации живых систем" (Уфа, 1992), VI координационном семинаре-совещании преподавателей физиологии растений (Смоленск, 1993), семинаре научного факультета Реймского университета (Reims, France, 1993), III Международном симпозиуме "Металлоионы в биологии и медицине (Montreal, Canada, 1994), V Международном Comtox-симпозиуме по токсикологии и клинической химии металлов (Vancouver, Canada, 1995), IX Международном NC1-EORTC симпозиуме (Amsterdam,\ The Netherlands, 1996), IV Международном симпозиуме "Металлоионы в биологии и медицине" (Barcelona, Spain, 1996).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 34-х печатных работах, из них 4 монографии.

введения, обзора литературы по современному состоянию проблемы (глава I), описания методики исследования (глава II), результатов и

обсуждения (главы III, IV, V, VI, VII), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (1159 источников). Работа изложена на 369 страницах машинописного текста.

МЛ ТЕ РИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были одноклеточные цианобактерии с оксигенным типом фотосинтеза Anacystis nidulans (CALU-2i7), Synechocystis aquatilis (CALU-428) (коллекция лаборатории

микробиологии БиНИИ Санкт-Петербургского государственного университета), пурпурные бактерии с аноксигенным типом фотосинтеза Rhodobacter capsulatus В 10, Rhodobacter sphaeroides 2 R (коллекция кафедрьт микробиологии Московского государственного университета), грамотрицательные бактерии Escherichia coli С 600, Escherichia colt К-12. Escherichia coli M-17, Pseudomonas fluoraniice 71, грамположительные бактерии Bacillis subtilis, Mycobacterium phlei (коллекции ВНИИ прикладной микробиологии и ВНИИ особо чистых биопрепаратов).

Культивирование клеток Anacystis nidulans, Synechocystis aquatilis, Rhodobacter capsulatus В 10, Rhodobacter sphaeroides 2 R осуществляли стерильно в накопительном режиме на среде BG-11 (Stanier et al, 1971), среде № 6 (Громов, 1965), среде Ормеруда (Ormerod et al., 1961) соответственно. Грамотрицательные бактерии Escherichia coli К-12, Pseudomonas fluorantice 71 и грамположительные бактерии Bacillus subtilis, Mycobacterium phlei культивировали на обогащенной глюкозопептонной срсде М9 (Иванов. Фомченков, 1989). Клетки Escherichia coli M-17 выращивали на обогащенной аминопептидной среде, Escherichia coli С 600 - среде LB (Sambrook et al. 1989).

В экспериментах использовались соли следующих металлов: AgN03; А1С13: FeCl3; FeS04<7H,0; GaCl3: GdCl3-6H20: Cd(CH3C00)7-2H,0; CdS04.8H,0; CoClX^O; GrCl3.6H,0; CuClr2H?0; CuSO^SH^O; Си^03)2;~Си(СН3С00)2; KC1; LaCl3f MnCl2; NiCly6H20; Pb(NOt)2; РЫСНзСОСУЬ-ЗН^О; ZnS04«7H20. Применяли реактивы марки х.ч.'Теахим'' (Россия).

Для обработки бактериальных клеток готовили водные растворы солей тяжелых металлов в концентрации 1цМ - 100 мМ, при этом использовали дистиллированную воду с электропроводностью не выше 1,3'10"4 См«м-1. Регулирование рН в диапазоне значений 5,0-9,5 осуществляли дробными добавками растворов 0,01 М NaOH, трис-(гидрооксиметил) аминометана и 0,01 н НС1. Растворы выравнивали по электропроводности до 0,0035 См*м-1 0,01 М NaCl. Бактериальные клетки (10? кл,мл-1) инкубировали в растворах солей металлов 15 мин при 20° С.

В опытах по изучению токсического шока ионами Си+2 суспензию клеток обрабатывали 40 цМ раствором CuS04-5H20 в течение 15 мин. В

случае исследования теплового шока суспензию клеток инкубировали в 10 мМ K-Na фосфатном буфере 5 мин при 51° С. В опытах по изучению кислотного шока клетки выдерживали в 50 мМ цитрат-фосфатнсм буфере (pH 2,2) 25 мин при комнатной температуре.

Жизнеспособность клеток и степень их повреждения после сублетальных воздействий оценивали методом двойного высева (Jandolo, Ordal, 1966) по способности образовывать колонии на 20% агаризованной среде № 6 с 0,5% тиосульфата (неселективная среда) и той же среде с добавлением 0,6% NaCl (селективная среда) (Шарипова, Громов, 1983).

Динамику репарации сублетальных повреждений после токсического шока изучали, инкубируя клетки в минеральной среде или 10 мМ K-Na фосфатном буфере в темноте или на свету (Шарипова, Громов, 1984).

Содержание меди определяли на спектрофотометре Perkin-Elmer (США) атомно-абсорбционным методом (Брицке, 1982).

Спектры флуоресценции регистрировали in vivo при комнатной температуре на спектрофлуориметре Hitachi - 850. Выделение и поглощение кислорода клетками измеряли амперомегрическим методом на полярографе ОН-105 (Pradelkt, Венгрия) (Seilner et al., 1982).

Электроориентационные спектры (ЭОС) бактериальных клеток регистрировали путем измерения относительного изменения оптической плотности клеточной суспензии, наблюдаемого при ориентации клеток в однородном переменном электрическом поле фиксированной частоты в диапазоне от 20 Гц до 30 МГц при двух напряженностях поля 30 В<см~' и 60 В<см-1 (Фомченков и др., 1984).

Повреждение цитоплазматической мембраны (ЦПМ) клеток определяли, анализируя ход высокочастотного участка их электроориентационного спектра, изменение которого оценивали отношением величины электроориентационного эффекта (ЭОЭ) клеток при частоте переменного электрического поля 5 МГц к таковой при частоте 0,5 МГц (Фомченков и др., 1984; Мирошников и др., 1986)).

Электрофоретическую подвижность (ЭФП), электрокинетический потенциал (ЭКП) клеток определяли на приборах "Пармоквант-2" (Carl Zeiss Jena, Германия) и "Zetasizer-2c" (Malvern, Англия). Измерения на приборе "Parmoquant-2 " проводили в ручном режиме регистрации клеток, движущихся в прямоугольном капилляре. В приборе "Zetasizer-2c" используется лазерная допплер-спектроскопия и цилиндрический капилляр.

Турбидиметрические измерения оптической плотности клеточной суспензии проводили на экспериментальной установке для электроориентационных измерений на базе ФЭК 56 М (Россия) (Ivanov et al., 1985).

Контроль за концентрацией ионов К+ осуществляли с помощью калий-селективного электрода (Orion, США), подключенного к

электронному блоку рН-метра "рН-340", выход которого регистрировали на самописце BD-12 (LKB, Швеция).

Для электронно-микроскопических исследований клетки центрифугировали при 3000 об»мин"' и фиксировали 2,5% глютаровым альдегидом в какодилатном буфере рН 7,2 и в последующем 1% тетроксидом осмия в течение 24 час (Spurr, 1969). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-8800 и контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца (Reynolds, 1963). Материал просматривали в электронном микроскопе JEM-100C при 80 кВ. Исследование поверхностной морфологии колоний осуществляли посредством сканирующего электронного микроскопа JEM-35C при 15 кВ.

Разделение полипептидов проводили методом .S¿^-электрофореза {Lammli, 1970) в электрофоретическом приборе ЛБГЭ-1 фирмы "Хийу-Калур " (Эстония).

В опытах по авторадиографии в качестве предшественников использовали меченные С14 аминокислоты 40 цСЬмл"1 (С14 - Protein hydrolyzate, UVVVR, Чехия). Денситограммы записывали на денситометре Chromoscan 3 {Joyce-Loeble, Англия).

Статистическую обработку результатов проводили путем вычисления стандартного отклонения от среднего арифметического, значимость различия определяли по критерию Стьюдента, расчет калибровочных графиков осуществляли по методу наименьших квадратов (Зайцев, 1984).

ЯВЛЕНИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ШОКА ИОНАМИ Си+2 У ЦИАНОБАКТЕРИИ Synechocystis aquatilis

Постоянной и важной составляющей почвенной бпоты являются цианобактерии, принимающие активное участие в накоплении органического вещества, регулировании физико-химических свойств почвы, стимуляции ее микробиологической активности. Будучи автотрофами, они сходным с растениями образом реагируют на экстремальные изменения окружающей среды и могут быть успешно использованы при изучении механизмов фитотоксического действия тяжелых металлов (Масюк, Виноградова, 1989). В то же время, являясь продуцентами, усваивающими молекулярный азот атмосферы и не требующими при этом готового органического вещества цианобактерии способны существовать в экстремальных условиях, где высшие растения либо вообще не развиваются, либо ценозообразующая роль их значительно снижена, формируя примитивные почвы на безжизненных субстратах антропогенного происхождения и участвуя в процессах почвенной рекультивации. В условиях постоянной антропогенной эмиссии соединений тяжелых металлов в окружающую среду изучение взаимодействия цианобактерии с этой группой соединений становится весьма актуально, при этом особый интерес представляет исследование

токсического шока ионами меди, поскольку, медь, супертоксикант (техногенная доля меди в атмосфере составляет, примерно, 75%) (Майстренко и др., 1996), в следовых количествах играет существенную роль в жизнедеятельности микроорганизмов, входит в состав ферментов, катализирующих важнейшие реакции обмена веществ. Ее высокая биологическая активность определяется способностью служить как акцептором, так и донором электронов, образовывать хелатные комплексы с белками и аминокислотами.

Для изучения токсического шока цианобактерии ЗупесИосуяИз адиаШЬ ионами Си+2 были подобраны параметры сублетального воздействия, при которых значительная часть клеток не погибала, но оказывалась поврежденной. Культуру инкубировали в 4-400 цМ растворе СиБ04 15 мин. Инкубация клеток в присутствии 4 цМ Си+2 оказывала определенный стимулирующий эффект. Повышение концентрации ионов Си+2 приводило к снижению числа бактериальных колоний, а после инкубации в присутствии 400 рМ Си+2 образовывались лишь единичные бактериальные колонии. Во всех случаях на селективной среде вырастало, примерно, на 20% меньше колоний, чем на неселективной, то есть у цианобактерий после воздействия ионами Си+2 повышалась чувствительность к хлористому натрию. Такое снижение солеустойчивости клеток свидетельствует о нарушении барьера проницаемости, что, вероятно, является следствием изменений в строении ЦПМ. После 15 мин инкубации клеток в присутствии 40 цМ Си+2 на неселективной среде вырастало около 90% клеток от контроля, тогда как на селективной - около 50%, то есть значительная часть бактерий была травмирована, но жизнеспособна. Увеличение длительности инкубации приводило к снижению числа жизнеспособных клеток. Таким образом, кратковременная инкубация клеток

БупесНосуяги ациаИШ в присутствии ионов Си+2 оказывала шоковое действие, в результате которого часть клеток сохраняя жизнеспособность получала повреждения (теряла солетолерантносгь и не образовывала колоний на селективной среде).

В дальнейших опытах клетки цианобактерии БупесНосухйч ациаШи подвергали 15 мин инкубации в присутствии 40 цМ Си+2. Такое воздействие мы определяем как токсический шок.

Накопление меди клетками после токсического шока ионами Си+2 со временем увеличивалось незначительно. В этих условиях бактерии, в основном, сохранили жизнеспособность. Повышение концентрации ионов Си+2 в инкубационной среде вело к увеличению ее содержания в клетках цианобактерии.

Известно, что медь является одним из наиболее фитотоксичных агентов, ингибирующих фотосинтез (Патин, 1979; Дмитриева, 1985). В хлоропластах она блокирует транспорт электронов на разных участках электронтранспортной цепи. Обнаружены сайты действия меди на

акцепторной стороне ФСI на уровне цитохрома с (Bohner et al., 1980), на донорной стороне ФС II (Samson et al., 1988) на уровне вторичного хинонного акцептора Qb (Mohanty et al., 1989). Повреждения, вызванные медью ведут к инактивации реакционных центров ФС TI и усилению тепловой диссипации поглощенной световой энергии (Hsu, Lee, 1988). Кроме того медь может ингибировать реакции фиксации С02, 02 и другие биохимические процессы, происходящие в клетке (McBrien, Hassall. 1967; Полынов и др., 1993).

Эксперименты по изучению последствий токсического шока цианобактерии Synechocystis aquatilis ионами Cu+2 показали снижение ее фотосинтетической активности. Известно, что при возбуждении света в области поглощения хлорофилла a (Goedheer, 1976) спектр флуоресценции клеток Synechocystis aquatilis имеет два пика - 682 им и 725 нм. Эти пики соответствуют максимумам флуоресценции хлорофилла а ФС II и хлорофилла а ФС I (Mohanty et al., 1972). При возбуждении света в области поглощения фикоцианинов в спектре флуоресценции различают уже три пика: 656 нм, 682 нм и 725 нм, которые соответствуют максимумам флуоресценции фикоцианина, хлорофилла а ФС II и хлорофилла а ФС I. Токсический шок наряду со снижением интенсивности флуоресценции хлорофилла а ФС II (682 нм), приводил к повышению интенсивности флуоресценции фикоцианина (656 нм). Фикобнлипротеины, являясь основными свстособирающими пигментами ФС II у цианобактерии, сконцетрированы в фикобилисомах, которые расположены на внешней поверхности тилакоидных мембран. Энергия, поглощенная фикобилипротеинами, передается хлорофиллу а, находящемуся внутри мембран в виде хлорофилл-белковых комплексов. Эффективность передачи энергии зависит от степени связи и взаимоориентации пигментных систем. В случае токсического воздействия ионами Си+2, вероятно, нарушается связь .между пигментными системами, что и проявляется в увеличении относительной интенсивности флуоресценции фикоцианина и падении флуоресценции хлорофилла а. _

Таким образом, у поврежденных клеток возрастает относительная интенсивность флуоресценции фикоцианина по сравнению с хлорофиллом, что, вероятно, свидетельствует о частичном разобщении энергетического сопряжения основного светособирающего комплекса (фикобилисомы) с антенным комплексом ФС II. При токсическом шоке Си+2 также было отмечено изменение соотношения максимумов флуоресценции хлорофилла а ФС I и хлорофилла а ФС II. а также максимумов флуоресценции хлорофилла а ФС 11 и фикоцианина, причем, в первом случае, различия были менее выражены, чем во втором. Кроме того, наблюдалось подавление фотовыделения От поврежденными клетками. При повышении интенсивности света фотосинтетическая активность в контроле возрастала, тогда как в опыте сначала

увеличивалась, а при интенсивности свыше 40 тыс. лк снижалась. Различия в фотосинтетической активности контрольных и поврежденных клеток наиболее ярко проявлялись при высокой интенсивности света, что, по-видимому, соответствует известному эффекту фотоингибирования (Whitelam, Godd, 1983; Tytler et al., 1984; Samuelsson et al., 1985; Oquist et al., 1987; Samuelsson et al., 1987), который связан с комплексными изменениями на уровне электронтранспортной цепи. При экстремальных условиях фотоингибирование может приводить к фотоокислительному разрушению клеточных компонентов (Abelovich, Shilo, 1972). Энергетической основой этого эффекта является, по-видимому, возрастание потока фотохимической энергии, поглощенной, но не использованной клеткой. Нереализуемая в фотосинтезе световая энергия может расходоваться в процессах фотосенсибилизированного окисления восстановленных метаболитов, направляться на жизненно важные структуры клетки и усиливать их повреждения (Петров и др., 1983). Таким образом, причиной снижения фотосинтетической активности цианобактерии явилось комплексное воздействие ионов Си+2 на фотосинтетические мембраны, что нашло подтверждение в опытах разобщением энергетического сопряжения основного светособирающего комплекса с антенным комплексом ФС II (табл. I) и фотоингибированием выделения 02, свидетельствующем о нарушении функционирования электронтранспортной цепи.

Таблица 1

Изменение соотношения максимумов флуоресценции клеток Synechocystis aquatilis после токсического шока ионами Cu+2 (X±S„; п = 6)

Варианты опыта 682/ F 656 725/ F 682

Контроль 1,42 ±0,01 0,45+0,02

Сублетальное

воздействие

ионами Си+2 0,88 ± 0,03 ~~ 0,57 ± 0,02

Цианобактерии, наряду с фотосинтезом, осуществляют и темновое поглощение 02. Исходя из этого изучалось влияние токсического шока ионами Си+2 на интенсивность темнового дыхания Synechocystis aquatilis. Темновое поглощение 02 в опыте снижалось и составляло 58% от контроля. Видимо, такая реакция клеток цианобактерии является следствием нарушения дыхательной электронтранспортной цепи. Несмотря на то, что конкретный механизм данного явления остается невыясненным, наблюдаемая картина соответствует современным представлениям о структурном взаимодействии фотосинтетической и дыхательной электронтранспортных цепей (Binder, 1982).

Сублетальные повреждения ионами Си+2 могут быть обратимыми, о чем свидетельствуют опыты по изучению репарации клеток Synechocystis aquatilis после токсического шока. Солетолерантность клеток восстанавливалась в течение 6 час, минеральная среда была более благоприятна для процессов репарации цианобактерии.

Наряду с репарацией солетолерантности полиостью восстанавливается сопряжение основного светособиратощего комплекса с антенным комплексом ФС II, о чем свидетельствуют спектры флуоресценции поврежденных клеток Synechocystis aquatilis после 6 час репарации в минеральной среде на свету. Параллелльно восстанавливается сопряжение основного светособирающего комплекса с антенным комплексом ФС II.

Обширные литературные данные свидетельствуют о возникновении устойчивости микроорганизмов к действию тяжелых металлов (Steeman-Nielsen, Kamp-Nielsen, 1970; Hurst, 1977; Shehata, Whitton, 1981; Singh, Pandey, 1982; Babich, Stotzky, 1983; Gilbert, 1984).

Для выяснения возможности приобрегения устойчивости к повторному шоку поврежденные клетки Synechocystis aquatilis после 6 час репарации в минеральной среде на свету подвергались повторному действию ионов Си+2 в концентрации 40 цМ в течение 15 мин. Клетки после токсического шока приобретали повышенную устойчивость к последующему сублетальному воздействию ионами Си+2. причем устойчивость проявлялась независимо от характера первичного шока, что было показано в опытах по изучению последовательного сочетания теплового и токсического шока ионами Си+2. Эксперименты выявили, что после сублегального теплового воздействия клетки приобретали устойчивость к последующему токсическому шоку ионами Cu+i (рис.1, 2).

Таким образом, реакцию цианобактерии - Synechocystis aquatilis на сублетальное воздействие ионами Си+2 можно разделить на три этапа: повреждение репарация -> приобретение устойчивости. Сравнение

полученных данных с имеющимися в литературе свидетельствует о

сходстве картины сублетального воздействия ионов меди на клетки Synechocystis aquatilis с другими типами шоковых воздействий как в отношении цианобактерий, так и представителей иных групп микроорганизмов, при этом специфика наблюдаемых эффектов связана как с фототрофной природой изучаемого объекта, так и с комплексным воздействием ионов Си+2 на клеточные мембраны, что подтверждает представление о мембранах как первичных мишенях действия тяжелых металлов.

Таким образом, повреждающее действие ионов Си+2 проявляется в нарушении барьерных свойств ЦПМ, как фотосинтетической, так и внешней, вследствие чего наблюдаются изменения отдельных физиологических функций цианобактерии. Подобные изменения

напрямую связаны с электрофизическими характеристиками клеток, и прежде всего, с их электроповерхностными свойствами.

Контроль ПеряиЧниИ шеи

Репарацн*

ВТГ>РИЧ11Ы1( шок

Рис.1. Выживаемость клеток (% от контроля) ЗупескосуьНз ациапИь в опытах с первичным и вторичным токсическим шоком. 1 - неселективная среда 2 - селективная среда

Рис.2. Солетолерантность (%) клеток Вупескосуьг^з адисиШх после шоковых воздействий: 1 - контроль, 2 - первичный тепловой шок, 3 - вторичный тепловой шок, 4 - токсический шок ионами Си+2 после теплового шока.

ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ИОНАМИ МЕДИ

Повреждающее действие ионов тяжелых металлов в значительной степени определяется их способностью взаимодействовать с отрицательно заряженной клеточной поверхностью микроорганизмов и

изменять барьерные свойства ЦПМ. Большую роль при этом взаимодействии играют электрофизические и, в особенности, электроповерхностные свойства микробных клеток. Наряду с этим нельзя не учитывать и физико-химические условия среды (концентрация, вид катиона и аниона, наличие конкурирующих ионов, рН, ионная сила и т.д.), при которых происходят повреждения клеток ионами тяжелых металлов. Особенно важен учет этих параметров в случае изучения миграции тяжелых металлов в окружающей среде, так как с ними связана аккумуляция этой группы веществ в почвах и, как следствие, непосредственное влияние их на физико-химические свойства почв. Кроме того параметрами среды определяется биодоступность тяжелых металлов и их токсичность для представителей почвенного ценоза. В этой связи представляло интерес сравнительное изучение электроповерхностных свойств и свойств ЦПМ клеток цианобактерии с представителями других групп микроорганизмов при кратковременном сублетальном воздействии ионами Си+2 в зависимости от физико-химических условий среды. В качестве объектов исследований были выбраны палочковидные формы микроорганизмов, что связано с методическими особенностями проведения электрофизических измерений.

На первом этапе работы были получены электроориентационные спектры (ЭОС) цианобактерии Апасугли тбиЫт в зависимости от концентрации ионов меди в среде инкубации (!: 10; ¡00 цМ. время воздействия 15 мин, рН 5,5-4,9) (рис.3). С увеличением концентрации Си+- наблюдалось изменение ЭОС клеток в диапазоне низких частот, при этом токсический эффект оказывала концентрация Си+2 100 цМ. Как-известно, низкочастотный участок ЭОС клеток определяется их электроповерхностнымн свойствами: электроориентационным эффектом (ЭОЭ) при низких частотах и электрофоретической подвижностью (ЭФП). Анализ концентрационных зависимостей относительных

изменений ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток ЛпасузШ тскйшь; показал снижение этих величин с ростом концентрации Си+2 (рис.4). Разным характер изменения ЭОЭ и ЭФП клеток ЛпасуяНз пкЫат, по-видимому. связан с тем, что величина ЭОЭ определяется анизотропией электрической поляризуемости исследуемых клеток, а величина ЭФП -величиной поверхностного электрического заряда клеток.

Известно, что при нарушении проницаемости ЦПМ во внеклеточную, частично деионизированную среду выходит значительная часть несвязанных ионов, в основном ионов калия и ряда низкомолекулярных веществ цитоплазмы, что в итоге приводит к уменьшению эффективной электропроводности клеток, и, согласно теории (РотсЬепкоу & Са\тПуик, 1978; Фомченковб 1981; Мирошников и др., 1986; Фомченков и др., 1986; Фомченков и др., 1989; РотсИепкоу й а1., 1990), вызывает соответствующий сдвиг высокочастотного спада ЭОЭ в область более

низких частот. Для характеристики изменений этого участка ЭОС клеток в результате их повреждения использовалось отношение Др/ро - величина ЭОЭ на частоте 5,0 МГц к таковой на частоте 0,5 МГц при напряженности электрического поля 60 В-см"1 с целью исключения влияния адсорбции катионов меди на клеточной поверхности.

Повреждающего действия ионов Си+2 в концентрации 1-100 цМ при рН 5,5-4,9 и времени воздействия 15 мин на цитоплазматическую мембрану клеток АпасузИя пЫи1ат обнаружено не было (рис.5). Однако увеличение концентрации ионов Си+2 до 1 мМ в аналогичных условиях вызывало повреждение ЦПМ клеток Лпасуз1Ь тйи1ат.

К<%)

ро- I -•- II -и- 111 -х- IV [

Рис.3. ЭО-спектры интактных (I) и обработанных ионами меди (Н-1У) клеток Апасузт тЛиШт. Концентрация ионов меди (цМ):И-1; III-10; IV-100; рН - 5,5-4,9.

Рис.4. Зависимость относительной величины ЭОЭ (К(— кривая I) и ЭФП (ц - кривая II) клеток АпасуяШ т(1и!ат от концентрации ионов меди. 8 = 0,0028 См»м"1; рН 5,5-4,9.

la

Рис.5. Зависимость относительных ш.мепешш Aß'P0 клеток Anacystis niäulans от концентрации Си-+ и Ag4" . 8 = 0,002 См'м"'; pH 5,5-4,9.

Показано, что по составу и организации поверхностные сдои цианобактерий проявляют большое сходство с таковыми грамотрицательных микроорганизмов (Баулина, 1970; Кондратьева и др., 1989). Представляло интерес сопоставление эффектов

повреждающего действия ионов Си+- для клеток цианобактерий и грамотрицательных бактерий. В качестве исследуемых объектов были взяты грамотринательные гетеротрофные бактерии Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorantice 71. На рис.6 показаны ЭОС Escherichia coli К-12 в зависимости от концентрации ионов Си+- в среде инкубации (1; 10; 100 цМ в течение 15 мин pH 5,5-4,9). Видно, что с увеличением концентрации ионов Си+- наблюдается изменение ЭОС клеток во всем диапазоне исследованных частот.

Концентрационные зависимости относительных изменений ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток Escherichia coli К-12 после обработки ионами Си+2 представлены на рис.7. ЭОЭ и ЭФП клеток Escherichia coli К-12 с ростом концентрации ионов меди уменьшались. Подобная картина, как было показано выше, имела место и у клеток Anacystis nudilans. Однако в отличие от клеток цианобактерии у клеток Escherichia coli К-12 при обработке ионами Си+2 в аналогичных условиях наблюдалось изменение ЭОЭ в области высоких частот .

На рис.8 приведены величины Aß/ß0 для клеток Escherichia coli К-12 при их обработке ионами Си+~ в различной концентрации. Видно, что максимальный токсический эффект медь оказывала на клетки Escherichia coli К-12 в концентрации 100 цМ. Сопоставление ЭОЭ и ЭФП. а также Aß/ßa клеток Escherichia coli К-12 с другим видом грамотрицательных гетеротрофных бактерий Pseudomonas fluorantice 71 выявило сходный

ответ клеток обоих видов на действие ионов Си+2. Однако клетки Pseudomonas fluorantice 71 оказались более чувствительными к ионам Си+2.

1-0- I -tP in -м- IV |

Рис.6. ЭО-спектры интактных (Г) и обработанных ионами меди (II-IV) клеток Escherichia coli К-12. Концентрация ионов меди (цМ): II-1; III - 10; IV-100. рН - 5,5-4,9.

Рис.7. Зависимость относительной величины ЭОЭ (Kf - кривая I) и ЭФП (ц - кривая II) клеток Escherichia coli К-12 от концентрации ионов меди. 8 = 0,0028 См«м"'; рН 5,5-4,9.

Рис.8. Зависимость относительных изменений Aß/p0 клеток Escherichia coli К-12 от концентрации Ag+ и Си+-. S = 0,002 См-м"1; pH 5,5-4.9.

Токсические эффекты ионов тяжелых металлов, как отмечалось ранее, прежде всего сказываются на проницаемости ЦПМ. Подобные нарушения можно наблюдать по изменению осмотической реакции клеток, утечке внутриклеточных ионов К+, Na+. Повреждающее действие ионов Си+2 для ЦПМ двух видов грамотрицательных микроорганизмов Escherichia coli К-12, Pseudomonas ßuorantice 71 оказалось выше, в случае нахождения клеток в изотонической среде, то есть у клеток с высоким содержанием внутриклеточного калия. Однако степень токсичности меди для данных микроорганизмов была ярче выражена в гнпотанической среде, где отчетливо проявляется высокая чувствительность клеток Pseudomonas ßuoranticc 71 к повреждающему действию Си+2 по сравнению с клетками Escherichia coli К-12.

На токсическое действие тяжелых металлов оказывает влияние и вид аниона, входящего в состав соединения с тяжелым металлом, поэтому было проведено сопоставление повреждающего действия различных солей меди на барьерные свойства ЦПМ клеток Escherichia coli К-12, результаты которого обобщены и представлены на рис.9. Ацетат меди оказался более токсичным для ЦПМ клеток, чем соли меди с другими видами анионов.

Наряду с этим проводилось исследование влияния трехзарядных катионов тяжелых металлов на токсичность ионов Си4"2 для ЦПМ микробных клеток. Предварительное введение трехзарядных катионов

в клеточную суспензию Escherichia coli К-12 защищало цитоплазматическую мембрану бактерии от токсического действия ионов Си+2 (рис.10).

Подвижность тяжелых металлов и их токсические эффекты для микробных клеток во многом определяются значениями pH. Представляло интерес проведение комплексного электрофизического

исследования действия ионов Си+2 на клетки

Рис.9. Зависимость относительных изменений Aß/ßo клеток Escherichia coli К-12 от вида аниона в солях меди. 5 =0,0028 См'м_1;рн 5,5-4,9.

Рис.10. Зависимость относительных изменений Л|Уро при обработке клеток Escherichia coli К-12 ацетатом меди (100 цМ) от влияния ионов калия, галлия, лантана и гадолиния (до введения ионов меди клеточные суспензии инкубировали с Ga+J, La+3, Gd+3 5 мин при 20°С . 5 = 0,0028 См>м"'; рН 5,5.

микроорганизмов при вариации значений рН. Исходя из вышеописанных концентрационных зависимостей токсического действия Си+2 для микробных клеток в последующих экспериментах использовалась концентрация металла 100 рМ (время

инкубации в присутствии Си+2 15 мин). На рис.11 показаны ЭОС клеток фототрофных бактерий Anacystis nidulans, Rhodobacier capsulatus BIO, Rhodobacier sphaeroides 2R, после воздействия ионами Cu+2 при разных значениях рН инкубационной среды. Как видно смещение высокочастотного спада ЭОЭ микробных

клеток в область низких частот зависит от рН-среды. рН-

зависимости ЭФП интактных и обработанных ионами

меди клеток, представленные на рис. 12, показали, что в случае использования КаОН-НС1 буфера обнаруживается

экстремальное уменьшение ЭФП обработанных клеток. При рН 7,0-6,5 она меняет знак на положительный, при дальнейшем же увеличении рН вновь реверсирует к отрицательному значению (кривая III). При этом агрегативная устойчивость клеточной суспензии снижается и происходит сильное слипание клеток, что и приводит к отмеченному выше резкому снижению ЭОЭ обработанных Си+2 клеток.

Сравнительный анализ результатов, отраженный на рис.12 показывает, что степень токсического действия ионоз меди коррелирует с изменениями ЭФП обработанных клеток в определенной области значений рН. При рН близком к 7,0, когда происходит смена знака ЭФП клеток, обнаруживается максимальное нарушение ЦПМ клеток АпасуяШ тйи1ат, КИойоЬасгег сарБиЬш В10, КИос1оЬас1ег ¡ркаего1с1е.^ 2Я. Следует отметить, что в присутствии трис (кривая II) изменений ЭФП обработанных ионами Си+2 клеток не выявлено. Отсутствовало и агрегирование клеток. Вероятно, малоподвижные ионы триса оказывают существенное влияние на структуру, образующейся противоионной атмосферы двойного электрического слоя у заряженной поверхности в водной среде, что и отражается на характере поведения электроповерхностных свойств клеток при взаимодействии с ионами Си+- . Однако рН-зависимость А(5/(50 после воздействия ионами Си+-клсток носила регулярный характер.

рН-зависимость относительных изменений величины А(3/ро, характеризующей степень повреждения ЦПМ клеток ЛпасуЩя пкЫстн. Яко^Ьас!ег сар$и]а1ш В10, ЯУюАоЬаЫег $рЪаего1с1е5 2К ионами Си+2, расчитанная по сдвигу высокочастотного участка ЭО-спектров в водных растворах показана в таблице 2.

Таблица 2

Относительные изменения величины Лр/[}0 фототрофных микроорганизмов после обработки 100 р.М Си+2 при разных значениях рН

рН 5,4 7,0 8,3

***********************************************

Апасу$№ т<Ли1ат 0,07+0,002 0.4+0.08 0,35±0.04

Шюс1оЬааег 0,05±0,002 0,55+0,09 0,1 ±0,03 са/то/я/ш' В10

К1хос1оЬас1ег 0,2±0,04 0,75±0,10 0,53±0,05 вр}шего1йе^ 2Я

а

К(%)

о—~i - п -и- ilT^t- iv | б

К(%)

Но- 1 • II --Н- III -Х- IV I

в

ко%)

FÖ- 1 Ji- tl -К- »1 -х- ТУ ]

Рис.11. ЭО-спектры интактных (I) и обработанных ионами меди (100 цМ) клеток Anacystis nidulans (а), Rhodobacter capsulatus BIO (6), Rhodobacter sphaeroides 2R (в) при разном pH (II-1V): II - 5,0; III - 7,0; IV - 8,3 в mpuc-HCl.

б

в

\ ^ / I

интактных меди (100 цМ)

(I)

Рис.12. рН-зшисимопь ЭФП

обработанных нонами меди (100 рМ) клеток АпасуыЬ! лк/и/а/ы (а), ЮюйоЪааег сар$и1а1и$ В10 (б), ЮюЛоЬаает $р}гаегоИев2Щъ)ъ средах: трис-ИСЛ

(И) и иаон-на (Ш).

Наряду с этим представлял интерес сопоставительный анализ повреждающего действия ионов Си+2 для фототрофных бактерий с представителями других систематических групп.

Сопоставление относительных изменений величин др/А(Зо, ЭФП и ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) грамотрицательных и грамположигельных бактерий, подверженных воздействию Си+- при разных значениях рН-среды инкубации показано на рис.13. Видно, что повреждающее действие ионы Си+- оказывают на все виды микроорганизмов в диапазоне рН 8,5-5,5, однако максимальный токсический эффект для ЦПМ и электроповерхностных свойств клеток обнаруживается при значении рН

Си

+2

клеток, также

7.0. Изменения ЭФП. обработанных ионами максимальны при pH 7,0.

Изменение относительных величин Äß/ß0 ЭФП и ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) для Pseudomonas fluorantice 71, Escherichia coli K-12 и Mycobacterium phlei в зависимости от концентрации ионов Си+2 при pH максимального токсического действия этого металла показано на рис.14.

Наиболее чувствительными к повреждающему действию ионов оказались клетки грамположительной Mycobacterium phlei. Среди двух видов грамотрицательных бактерий клетки Pseudomonas fluorantice 71 проявляли повышенную чувствительность к токсическому действию Си+-по сравнению с клетками Escherichia coli К-12. Среди изученных микроорганизмов клетки цианобактерий были наиболее устойчивы к повреждающему действию ионов Си4"2.

Различные виды экстремальных воздействий приводят к проявлению в бактериальных клетках ряда специфических и неспецифических для данного фактора внутриклеточных реакций, которые проявляются в

изменении морфологических свойств исследуемых микроорганизмов. Не составляет в этом смысле исключение и воздействие ионами тяжелых металлов.

а б в

1 -0-8 -tt III I

Рис.13. pH-зависимость относительных изменений Aß/ß0 (а), ЭФП (б) и ЭОЭ (20 Гц) (в) клеток Pseudomonas ßuorantice 71 (кривая I), Escherichia coli К-12 (кривая И) и Mycobacterium phlei (кривая III), обработанных ионами меди (100 цМ для грамотрицательных и 50 (J.M для грамположительных бактерий) при pH 7,0.

а б в

Рис.14. Зависимость относительных изменений Aß/ß0 (а), ЭФП (б) и ЭОЭ (20 Гц) (в) клеток Pseudomonas ßuorantice 71 (I), Escherichia coli K-12 (II) и Mycobacterium phlei (III) от концентрации ионов меди при pH 7,0.

Для цианобактерий, культивируемых в присутствии ионов Си+2, показано появление упакованных внутрицитоплазматических мембран,

уменьшение площади тилакоидов и их аглютинация, фомирование

филаментов, уменьшение размеров и числа полиэдральных тел, полифосфатных и цианофильных гранул, увеличение числа жировых включений и ограниченных мембраной кристаллических включений, обнаружен хлороз и разрушение нитей, изменениее числа гетероцист (Gypta, Arora, 1978; Laube et al, 1979; 1980; Whitton, Shehata, 1982; Rachlin et al, 1984; Prior, Dalton, 1985; Petterson et a!, 1985; Durnel, 1986). Исходя из этого нами были проведены электронно-микроскопические исследования влияния ионов Си+2 на ультратонкую организацию клеток Escherichia coli М-17, а также ее микробной популяции методами позитивного окрашивания, ультратонких срезов, сканирующей электронной микроскопии, поскольку использование этих методов позволяет сопоставить ультраструктурные изменения в клетках и

выявить их специфичность для данного воздействующего фактора.

Выращивание Escherichia coli М-17 проводили на минимальной глюкозо-минеральной и богатой аминопептидной питательных средах. Жизнеспособность после токсического шока ионами меди сохраняли на минимальной среде - 0,8%, а на обогащенной - 100% клеток. Сравнительный морфологический анализ контрольных и опытных образцов показал повышенную склонность последних к образованию агрегатов, при этом степень агрегации зависела от условий выращивания бактерий. Клетки, выращенные на минимальной среде, образовывали большее число агрегатов с большим количеством клеток в них.

В опытных препаратах клеток, выращенных на минимальной среде, также отмечено появление на поверхности клеточной стенки мембранных везикул, наличие которых может свидетельствовать о выбросе внутриклеточного содержимого в окружающую среду и об изменении проницаемости поверхностных структур.

У клеток, после токсического шока ионами меди, выращенных на богатой питательной среде, после воздействия ионами меди отмечено усиление гетерогенности цитоплазмы, что свидетельствует о достаточно глубоких ультраструктурных перестройках. На микрофотографиях клеток, полученных методом ультратонких срезов, в опытном варианте видно отслоение на отдельных участках наружной мембраны от цитоплазматической, приводящее к расширению периплазматического пространства, что может служить причиной нарушения проницаемости клеточной стенки. За счет этого происходит также увеличение размеров клеток. Обнаружено также локальное отделение цитоплазматической мембраны от цитоплазмы, в результате которого происходит появление характерных пустот - гетерогенность цитоплазмы. Этот факт выявляется также методом позитивного окрашивания. На ультратонких срезах клеток, выращенных на богатой питательной среде после воздействия ионами меди происходят аналогичные изменения, однако, ярче выраженные. Так, например, видны фестончатые образования наружной

мембраны микробных клеток, отделившейся от цитоплазматической. Морфологические изменения, наблюдаемые при воздействии ионами Си+2, схожи с таковыми при действии гипертонического шока на бактериальные клетки.

Таким образом, опыты по изучению ультраструктуры клеток, подверженных действию ионов Си+2, также свидетельствуют о повреждении ЦПМ.

ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ К А ТИОНАМИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Известна зависимость биологической активности вещества от его зарядности (Агеева, 1986), данные же, касающиеся зависимости токсических эффектов тяжелых металлов от зарядности их катионов немногочисленны и весьма противоречивы, поэтому представляло интерес сопоставление реакций бактериальных клеток на повреждающее действие одно-, двух- и трехзарядных катионов тяжелых металлов для бактериальных клеток. В качестве модели однозарядных катионов в экспериментальных исследованиях были взяты катионы Ag+.

На рис.15 показаны ЭОС клеток А пасу sits nidulans, обработанных катионами серебра в различных концентрациях. ЭОС цианобактерии изменялись во всем диапазоне исследованных частот электрического поля, при этом наблюдалось повреждение ЦПМ, более ярко выраженное, чем в случае двухзарядных катионов Си+2 (рис.6).

На рис.16 изображены ЭОС клеток Escherichia coli К-12 после обработки их катионами Ag+ в различных концентрациях. ЭОС бактерии изменялись во всем диапазоне исследованных частот электрического поля, также имело место повреждение ЦПМ при этом повреждающий эффект катионов Ag+ был сильнее, чем катионов Си+2 (рис.9).

Проведенный сопоставительный анализ временных изменений относительной величины ЭОЭ (5»106 Гц) в области высокочастотного спада ЭО-спектра, оптической плотности клеточной суспензии и выхода внутриклеточного К+ клеток Escherichia coli К-12 после обработки катионами Ag+ (50 цМ) отчетливо показал корреляцию между увеличением оптической плотности клеточной суспензии, утечкой внутриклеточного К+ из цитоплазмы клеток, и изменением относительной величины ЭОЭ (5«106 Гц) обработанных клеток. Можно утверждать, что описанные эффекты выявляют нарушение барьерных свойств ЦПМ клеток и отражают развитие процесса повреждения.

К(%)

R>- i ii -a- in -к- iv |

Рис.15. ЭО-спектры ингактных (I) и обработанных катионами cepe6pa(II-IV) клеток Anacystis nidulans. Концентрация катионов серебра (цМ): II-1; 111-10; IV-100. рН - 5,5-4,9.

_ о и hi —х- iv

Рис. 16. ЭО-спектры интактных (I) и обработанных ионами серебра (II-IV) клеток Escherichia coli К-12. Концентрация ионов (цМ): II-1; III-10; IV-100. 5 = 0,0028 См'м"1; рН 5,5-4,9.

Изучение кратковременного действия двухзарядпых катионов на бактериальные клетки обнаружило изменения ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток сходные с таковыми при воздействии катионов Си+~.

В случае двухзарядных катионов Pb+2, Cd+2, Zn+2, Mn+2 цианобактерии Anacystis nudilans наблюдалось изменение ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток с повышением их концентрации. Токсическое действие на ЦПМ Anacystis nidulans исследуемых катионов в концентрации 100 цМ при рН от 5,0 до 8,5 не выявлено, поэтому в экспериментах по изучению Др/(30 была взята концентрация 1 мМ. На рис.17 приведены значения Др/ро для клеток Anacystis nidulans после их инкубации в присутствии Pb2+, Cd+2, Zn+2, Mn+2 (1 мМ, 15 мин, рН 5,55,2). При этом токсичными для ЦПМ клеток Anacystis nidulans оказались

лишь катионы Cd+2, ионы же РЬ+2, Ъх\+2 и Мп+2 в данных условиях не проявили повреждающего действия. Наряду с этим изучалась рН-зависимость ЭФП и Ар/р клеток Апасуз/и тс1и1ат, ' обработанных катионами Сс1+2, №+2, РЬ*2 в концентрации 1 мМ как в трис-НС\, так и в ЫаОН-НС1 буфере. Для каждого катиона выявлялось определенное значение рН, при котором наблюдалось экстремальное изменение ЭФП клеток. Только ионы СМ+2 оказывали повреждающий эффект на ЦПМ клеток АпасузШ тйиЫпз, что нашло свое подтверждение и в экспериментах по изучению рН-зависимости токсического действия катионов Cd+2, №+2 и РЬ+2. С ростом рН величина Лр/ро, характеризующая степень повреждения ЦПМ катионами Сс1+2 возрастала и при значении рН 8,5-8,3 достигала максимальной величины, что соответствует области рН экстремального изменения ЭФП клеток АпасузИя тс1и1ап5 под действием Сс1 .

Рис.17. Зависимость относительных изменений Ар/(50 клеток Anacystis nidulans от вида катиона металла в концентрации 1 мМ; 6 = 0,00086 См>м"' и рН 5,5-5,2.

Параллельно с изучением влияния двухзарядных катионов металлов на клетки Anacystis nidulans исследовались и электрофизические характеристики грамотрицательной бактерии Escherichia coli К-12 под действием ионов Cd+2, РЪ+2, Zn+2, Mn+2, Со+2, Ni+2.

Токсическое действие исследованных катионов на ЦПМ Eschercihia coli К-12 в концентрации 100 цМ при рН 5,5 не было обнаружено. В экспериментах по изучению Ар/ро концентрацию катионов увеличивали до 1 мМ. При этом токсичными для Escherichia coli К-12 оказались катионы Cd+2 и РЬ+2, тогда как повреждающие эффекты Zn+2 и Мп+2 для ЦПМ бактерии не были выявлены (рис. 18).

Наряду с этим изучались рН-зависимости токсического действия катионов двухзарядных металлов для клеток грамотрицательных микроорганизмов. Как и в случае обработки клеток Escherichia coli К-12 и Pseudomonas jluorantice 71 ионами Cu+2 при воздействии ионами Cd+2

на грамотрицательные бактерии наблюдалось смещение высокочастотного спада ЭОС в область низких частот, что свидетельствует о повреждении глубоких структур клеточной оболочки, в частности, ЦПМ.

Снижение ЭФП клеток Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorantice 71 в присутствии Cd+- при изменяющихся значениях pH происходило незначительно. Однако следует отметить, что хотя обработка клеток двух видов грамотрицательных микроорганизмов катионами Cd+- не вызывала экстремальных изменений ЭФП, в клеточных суспензиях развивался процесс агрегирования клеток, характерный для суспензий, у которых происходило резкое снижение ЭФП клеток (например, в присутствии Си+2). Влияние Cd+2 на проницаемость ЦПМ Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorantice 71 начинало проявляться при значениях pH 7,0-6,5 и увеличивалось с возрастанием pH до 9,2-8,5. Величина Aß/ß0, свидетельствующая о повреждении ЦПМ клеток Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorantice 71, достигала своего максимального значения также при pH 9,2-8,5.

Рис.18. Зависимость относительных изменений ДР/(30 клеток Escherichia coli К-12 от вида катиона металла в концентрации 1 мМ; 8 = 0,00086 См«м"' и рН 5,5-5,2.

При обработке клеток Escherichia coli К-12 катионами Со+2 и Ni+2 максимальные изменения высокочастотных спектров наблюдались при действии их в концентрации 200 цМ, причем катионы Ni+2 были более токсичны.

На рис.19 показана динамика изменений ЭФП клеток Escherichia coli

К-12 на примере ионов Ni+2 в концентрации 200 |дМ, при двух значениях рН: рН 6,0 (кривая 1), когда в среде инкубации присутствуют двухвалентные катионы металла и рН 8,5 (кривая 2), когда в среде инкубации преобладают гидролизованные формы металлоионов. Только в случае присутствия в среде однозарядных катионов NiOH+ (гидролизованные формы) удается проследить изменение ЭФП клеток по времени близкой к изотерме процесса адсорбции (кривая И). В

п.

отсутствии подобных форм металлоионов и при наличии двухзарядных негидролизованных форм (кривая I) такой динамики не прослеживается, что свидетельствует о процессе сжатия двойного электрического слоя и, вероятно, об отсутствии процесса адсорбции металла на клеточной поверхности.

ЭФП ■

I _* II

Рис.19. Динамика изменений ЭФП клеток Escherichia coli К-12 в присутствии ионов никеля при разных значениях рН: рН 6,0 (I) и рН 8,5 (II).

Необходимо отметить, что в литературных источниках токсическое действие тяжелых металлов связывают со взаимодействием последних с SH-группами белковых молекул ЦПМ, вследствии чего происходит нарушение ее барьерных свойств и выход внутриклеточных

катионов. В этой связи нельзя исключить того факта, что с увеличением рН, приводящему к образованию высокотоксичных однозарядных гидролизованных форм металлоионов, растет и степень ионизации SH-групп, которая создает благоприятные условия для их взаимодействия с гидролизованными формами тяжелых металлов и, соответственно, инактивации локальных белков и изменению проницаемости ЦПМ.

Незначительный токсический эффект Со+2 и Ni+2 для ЦПМ клеток различного происхождения, продемонстрированный ранее рядом авторов, свидетельствует, вероятно, о несущественном содержании гидролизованных форм металлоионов в условиях проведения эксперимента. Обнаруженное небольшое различие в токсическом действии Со+2 и Ni+2, по-видимому, связано с особенностями физико-химических характеристик катионов этих металлов (например, ионный радиус, окислительно-восстановительный потенциал и др.).

Обработка катионами Ni+2 (100 рМ) вызывала рН-зависимое понижение ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток Pseudomonas fluorantice 71, которое достигало максимума при рН 9,2. Высокочастотные ЭОС Pseudomonas fluorantice 71 после обработки

катионами Ni+2 в данной концентрации с увеличением значений рН смещались в область более низких частот.

Сравнительное изучение токсического действия двухзарядных катионов было продолжено на клетках грамположительных микроорганизмов и фототрофных бактерий с аноксигснным типом фотосинтеза (Mycobacterium phlei, Rhodobacter capsulatus В- JO и Rhodobacter sphaer aides 2R).

Анализ изменений ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) в диапазонах значений рН сред, при которых проявлялись изменения ЭФП клеток Mycobacterium phlei после обработки двухзарядными катионами металлов показал, что величина ЭОЭ существеннее отражает изменения электроповерхностных свойств бактерии по сравнению с элсктрофореТическими изменениями. Изменения ЭОЭ и ЭФП обработанных клеток коррелировали с повреждением ЦПМ Mycobacterium phlei в определенной области значений рН. Значения рН, при которых уровень ЭОЭ был минимальным, соответствовали максимальному повреждающему действию двухзарядных катионов на ЦПМ клеток Mycobacterium phlei. Повреждающее действие Cd+2 и для ЦПМ клеток Mycobacterium phlei начинало проявляться, как и в случае грамотрицательных микроорганизмов при рН 7,0-6,5 и увеличивалось с возрастанием рН до 9,2-8,5, при этом происходило снижение ЭФП по сравнению с интактными клетками. Хотя обработка клеток не вызывала экстремальных изменений ЭФП. в клеточных суспензиях развивался процесс агрегирования клеток, характерный для суспензий, у которых происходило снижение ЭФП клеток. Действие ионов РЬ+2 на барьерные свойства ЦПМ клеток Mycobacterium pltlei наблюдалось в диапазоне значений рН от 5,5 до 7,5 с максимальной токсичностью при рН 7,0-6,8. Экстремальных изменений ЭФП при этом не было обнаружено.

Отсутствие резких изменений ЭФП клеток Mycobacterium phlei после обработки двухзарядными катионами металлов в исследуемых концентрациях при рН, когда для грамотрицательных микроорганизмов наблюдалось экстремальное изменение электроповерхностных свойств, вероятно, связано с более высоким отрицательным зарядом их клеточной поверхности (или ЭФП) (Iske el al., 1990).

Повреждающее действие Cd+2, Ni+2 и Pb+2 на клетки пурпурных бактерий удалось надежно зарегистрировать при концентрации катионов металлов 200 цМ. В таблице приведены значения А(?/ро для двух видов Rhodobacter capsulatus В-10 и Rhodobacter sphaeroides 2R после их обработки Cd+-, Ni+2, Pb+2 при значении рН 5,6-5,0 и при рН 8,5-8,3 для Cd+2 и Ni+2, рН 6.5-7,0 - РЬ+2, т.е. при значениях рН, при которых наблюдалось максимальное уменьшение ЭФП обработанных этими катионами клеток.

Таблица 3

Изменение Др/р„ в зависимости от вида катиона металла в концентрации 200 цМ для клеток ШюйоЬааег сартШт В-10 и Rh.odoba.cter ярНаегоШея 27? при разных значениях рН-среды обработки

Катионы

Cd+2 Ni+2 Pb+2

рН

Вид микроорганизма R.capsulatus R.sphaeroides

5,6 0

8,3 0,35+0,10; 0,10+0,05

5,6 0

8,4 0,33+0,05; 0,05+0,0025

5,3 0

7,0 0,40+0,05; 0

0,16+0,10; 0,05+0,0025 0,60+0,15;0,26+0,10 0 ;0,05

0,55+0,10; 0,25 0,17+0,10; 0 0,53+0,10; 0

Примечание: Первая цифра - величина Др/ро клеток, обработанных в растворе 0,25 М сахарозы, вторая - в дистиллированной воде.

На основе результатов, приведенных в таблице 1, исследованные катионы тяжелых металлов можно расположить по их повреждающему действию на ЦПМ пурпурных бактерий в следующем порядке: Си4"2 > Cd+2 > Ni+2 > Pb+2. В целом клетки Rhodobacter sphaeroides 2R были чувствительнее к токсическому действию металлов, чем клетки Rhodobacter capsulalus В-10.

Ранее отмечалось, что взаимодействие ряда катионов металлов с сульфгидрильными группами белков ЦПМ приводит к повреждению барьерных свойств клеток и выходу внутриклеточных ионов К+ из цитоплазмы. Сопоставление рядов токсичности металлов для микроорганизмов и сродства металлов к лигандам: (-ОН); (-СООН); (-РО3Н2); (-NHj); (C3H4N2); (-SH) показало, что в случае

цианобактерий, пурпурных и хемотрофных бактерии) ряд токсичности металлов практически совпадал с рядом сродства металлов к SH-группам, что подтверждает наше предположение об изменении барьерных свойств клеток, обусловленных связыванием металлоионами SH-групп ЦПМ.

Рядом авторов показано, что величина отрицательного поверхностного заряда бактериальных клеток оказывает существенное влияние на аккумуляцию (Isre et al., 1990, Вагабов и др., 1990) и поступление тяжелых металлов в клетки (Cheng, Ting, 1995), а также на проникновение катионных детергентов к ЦПМ бактериальных клеток (Иванов, Фомченков, 1989). Так как участки ЭОС, особенно в области высокочастотного спада ЭОЭ, для клеток двух видов интактных

пурпурных бактерий совпадают, то согласно теории при близких размерах клеток можно говорить о равных значениях электропроводности их цитоплазмы, которая определяется, главным образом, содержанием простых одновалентных катионов К+ и Na+. Количественное содержание последних в цитоплазме клеток будет также определять внутриклеточное осмотическое давление. Влияние содержания внутриклеточного К+ и, соответственно, осмотического давления со стороны цитоплазмы па степень повреждения ЦПМ под действием катионов тяжелых металлов, определяемую по сдвигу высокочастотного спада ЭОЭ, показано выше, результаты, представленные в таблице, подтверждают эго. Действительно относительные изменения величины Др/ро существенно выше у клеток, отмывка и обработка которых проводилась в изотоническом растворе 0,25 М сахарозы, в сравнении с клетками, находящимися в гипотоничных условиях, то есть в дистиллированной воде.

Далее проводили исследования по изучению токсического действия трехзарядных катионов на электрофизические характеристики бактериальных клеток.

На рис.20 представлены ЭО-спектры Anacystis nidulans, обработанных трехзарядными катионами гадолиния в различных концентрациях. Воздействие гадолиния приводило к значительному уменьшению ЭОЭ клеток во всем диапазоне исследованных частот электрического поля. С ростом концентрации Gel4"-' происходило одновременное уменьшение ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток (рис.21).

На рис.22, 23 представлены концентрационные зависимости действия катионов гадолиния на относительные изменения величины ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток Escherichia coli К-12. Характер изменения относительных величин ЭОЭ и ЭФП клеток был близок к характеру изменения этих величин под влиянием двухзарядных катионов, а абсолютная величина изменений была несколько выше. Воздействие катионами Gd+3 не вызывало перезарядки клеток Escherichia coli К-12.

Также изучалось влияние трехзарядных .катионов А1+3, Сг+3, Fe+3, Ga+J на электроповерхностиые свойства Escherichia coli К-12. Pseudomonas fluorantice 71. Для Escherichia coli К-12 при обработке катионами Ai+J и Сг+3 имели место экстремальные скачки ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц), в то время как для Fe+3 и Ga+3 лишь монотонное изменение ЭОЭ. В случае Pseudomonas fluorantice 71 обработка А1+3 и Fe+3 приводила к монотонному падению ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц), а для ионов Сг+3 - к небольшому экстремальному подъему (50 рМ), в экспериментах с Ga+J после снижения ЭОЭ при концентрации 10 рМ, на блюдался резкий экстремальный подъем при 50 цМ с последующим

К<%)

ho- i -»- н -tt- ш -x- iv |

Рис.20. ЭО-спектры интактных (I) и обработанных Gd+3 (II-IV) клеток Anacystis nidulans. Концентрация ионов (ИМ): II-1; III-10; IV-100. рН 5,5-4,9.

Рис.21. Зависимость относительной величины ЭОЭ (Kf-кривая I) и ЭФП (ц - кривая II) клеток Anacystis nidulans от концентрации ионов 6 = 0,0028 — См«м"';

рН 5,5 - 4,9.

его уменьшением. Катионы А1+3 и Сг+3 приводили к снижению ЭФП клеток Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorantice 71, в то время как катионы Ga+3 резко снижали и меняли знак заряда клеток обоих видов на положительный при концентрации 20-30 jiM. Аналогичная картина, но при более высоких концентрациях катионов наблюдалась у клеток Pseudomonas fluorantice 71 при воздействии Fe+3. Для Escherichia coli К-12 в случае Fe+3 подобной картины изменения знака заряда не обнаруживалось, хотя происходило резкое снижение его при концентрации 50 цМ. Разнонаправленный характер изменений ЭОЭ и ЭФП в случае обработки катионами А1+3 и Сг+3 для Escherichia coli К-12

Ga+3 и катионами Сг+3 для Pseudomonasßuorantice 71, вероятно, связан.с изменением анизотропии электрической поляризуемости клеток.

К (%)

1_____и III " - Х-" ГУ I

Рис.22. ЭО-спектры интактных (I) и обработанных Gd+-' клеток Escherichia coli К-12. Концентрация (цМ): II-1; III - 10; IV - 10. pH 5,5 - 4,9.

•6 -5 -i li'C(Ml

-О- I____Э II

Рис.23. Зависимость относительной величины ЭОЭ (Kj--кривая 1) и ЭФП (ц - кривая II) Escherichia coli К-12 от концентрации Gd+3. 8 = 0,0028 См-м"1: рН 5.5-4.9.

Обнаруженные изменения эдсктроповерхностных свойств ЭОЭ (при частоте поля 20 Гц) и ЭФП клеток с ростом концентрации катионов металлов могут быть связаны со сжатием двойного электрического слоя и (или) адсорбцией ионов на отрицательно заряженной клеточной

поверхности, что может, в свою очередь, определяться физико-химическими характеристиками (зарядностыо, степенью гидратации, способностью образовывать гидролизованные формы,

поляризуемостью), присутствующих в среде катионов, а также исходными электроповерхностньши свойствами клеток.

Известно, что трехзарядные катионы металлов в водных растворах при определенных значениях рН могут гидролизоваться и переходить в следующие формы:

ОН- ОН-

Ме3+ МеОН2+ Ме(ОН)2+

Ранее показано, что однозарядные гидролизованные формы Ме(ОН)+ двухзарядных и трехзарядных катионов металлов обладают повышенными, по сравнению с двухзарядными и трехзарядными формами катионов сорбционными свойствами и при взаимодействии с отрицательно заряженными поверхностями минеральных частиц, бактериальных клеток и дрожжей резко уменьшают их заряд, вплоть до смены знака на положительный (ВаЫсЬ, Бгоику, 1992).

Рис.25. Влияние соединений тяжелых металлов на изменение значений рН суспензий клеток Pseudomonas fluorantice 71 и Escherichia coli К-12 в дистиллированной воде. Трехзарядные катионы добавляли в виде хлорида соответствующих металлов.

Сравнение полученных значений рН клеточных суспензий после введения солей тяжелых металлов с областями —распределения однозарядных гидрокомплексов показало, что только в случае катионов Fe+3 и Ga+3 при повышенных концентрациях создаются условия для присутствия в среде таких гидролизованных форм (рис.25). Поэтому обработка Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorantice 71 Fe+3 и Ga+3 приводило к резкому снижению ЭФП клеток. При концентрации 20-30 цМ Ga+3 в случае клеток обоих видов ЭФП меняла знак с отрицательного на положительный. Подобная картина наблюдалась при обработке катионами Fe+3 в концентрации выше 70 цМ для Pseudomonas fluorantice 71. Различия же в концентрациях катионов, при которых происходила смена знака ЭФП, очевидно, обусловлены большим количеством однозарядных гидролизованных катионов Ga+3, по сравнению с таковыми у Fe+3, при одинаковой молярности в среде. Отсутствие же смены знака ЭФП у клеток Escherichia coli К-12 и ее

снижение при росте концентрации катионов по сравнению с Pseudomonas fluorantice 71, вероятно, связано с высокой исходной величиной ЭФП клеток. Таким образом, выявлено, что изменение ЭФП со сменой знака при воздействии катионами Fe+3 и Ga+3 обусловлено присутствием однозарядных гидролизованных форм этих металлов и их адсорбцией на отрицательно заряженной поверхности бактериальных клеток. Характер относительных изменений ЭФП Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorantice 71 с ростом концентрации А1+3 и Сг+3, вероятно, в большей степени связан со сжатием двойного электрического слоя у клеточной поверхности. Необходимо отметить, что относительные изменения ЭФП в результате адсорбции катионов на клеточной поверхности зависят ог исходного значения ЭФП, что не существенно в случае сжатия двойного электрическою слоя.

При адсорбции катионов на клеточной поверхности происходил однонаправленный характер относительных изменений ЭФП и ЭОЭ, за исключением клеток Pseudomonas fluorantice 71, обработанных катионами Ga+3. Сразу же, с увеличением концентрации Fe+3 и Ga+3 наблюдалось снижение ЭФП и ЭОЭ. Уменьшение толщины двойного электрического слоя с ростом концентрации А1+3 и Gr+3 по-разному отражалось на изменении ЭФП и ЭОЭ. Величина ЭФП понижалась, при этом ЭОЭ сначала увеличивался (особенно сильно в случае Escherichia coli К-12), достигая максимального значения при определенной концентрации катионов металлов, и только после этого начинал уменьшаться. Экстремальное увеличение ЭОЭ, по-видимому, связано со снижением анизотропии электрической поляризуемости клеток. Относительные изменения величины ЭОЭ с ростом концентрации А!4"-' и Cr+J занисилн от исходного значения ЭФП клеток и вида катиона, тогда как из электрофоретических измерений такое различие не выявлялось. Как и в случае двухзарядных катионов наблюдалась корреляция между изменениями электроповерхностных свойств бактериальных клеток и повреждениями их ЦПМ при определенных значениях рН.

АНАЛИЗ ПОЛИПЕПТИДОВ РАСТВОРИМОЙ ФРАКЦИИ

Общеизвестно, что благодаря гибкости метаболического аппарата и его регуляторных механизмов микроорганизмы могут приспосабливаться к самым различным экстремальным воздействиям. Одним из ответов микробных клеток на неблагоприятные факторы окружающей среды является изменение в синтезе белка, при котором часто образуются стрессовые или шоковые белки. Эти изменения определяются как природой неблагоприятного фактора, так и степенью, интенсивностью или длительностью его действия, при этом может наблюдаться: усиление синтеза одних, в то время как синтез других белков, присущих клетке в оптимальных условиях, остается неизменным;

появление стрессовых белков в дополнение к обычным; образование стрессовых белков при частичном подавлении синтеза обычных белков; появление стрессовых белков при усилении синтеза одних и подавлении синтеза других обычных белков (Блехман, 1987).

Действие тяжелых металлов индуцирует синтез низкомолекулярных, богатых цистеином белков в клетках микроорганизмов, причем эти белки часто связывают ионы тяжелых металлов, участвуя в их детокскикации, что приводит к репарации поврежденных тяжелыми металлами клеток.

В этой связи исследовался полипептидный состав растворимой фракции Synechocystis aquatilis, Escherichia coli C600 и Bacillis subtilis после воздействия двух и трехзарядными катионами тяжелых металлов.

На первом этапе был изучен полипептидный состав растворимой фракции Synechocystis aquatilis после сублетального и летального действия ионами Си+2, а также после кислотного и теплового шока для выяснения последствий повреждающих факторов различной природы. Сравнение сублетального и летального воздействия Си+2 на клетки Synechocystis aquatilis обнаружило как сходные полипептиды с молекулярной массой 12,7; 18,7; 32,1 и 39,6 кДа, так и присущие только данному воздействию полипептиды - 11,9 (сублетальное) и 14,8; 22,8 кДа (летальное). При кислотном шоке (рН 2,2; 25 мин) обнаруживались новые полосы с молекулярной массой 14,8; 18,7; 32,1; 55,9; 64,9; 66,9: кДа, а при тепловом (52° С, 5 мин) -11,9; 39,6 кДа.

Таким образом, в случае токсического, кислотного и теплового шока выявляется ряд новых полипептидов. При летальном токсическом и сублетальном кислотном воздействии их количество и состав наиболее схожи (общие полипептиды 14,8; 18,7; 22,8; 32,1 кДа), сходные полипептиды обнаруживаются и в случае токсического и теплового шоков (11,9 и 39,6 кДа). Такая ответная реакция цианобактерии объясняется, по-видимому, неспецифической природой изменений в ответ на различные повреждающие факторы. Однако наряду с общими полипептидами обнаруживаются индивидуальные. В „случае кислотного шока это полипептиды с молекулярной массой 55,9; 64,9; 66,9 кДа, в случае летального и сублетального токсического воздействия -12,7 кДа.

Кроме того представлял интерес сопоставительный анализ белков токсического шока цианобактерий с таковыми грамотрицательных и грамположительных бактерий. Для этого были взяты клетки грамотрицательной бактерии Escherichia coli С 600 и грамположительной бактерии Bacillus subtilis, которые обрабатывали двух- и трехзарядными катионами металлов: Zn+2, А1+3, Сг+3, Ga+3, Fe+3. В логарифмической фазе роста в следующих концентрациях: 1 мМ, 10 мМ, 100 мМ в течение 15 мин. При этом, синтез части полипептидов уменьшался, части усиливался, синтез же некоторых при изученной концентрации солей тяжелых металлов полностью прекращался. Среди вновь образованных

следует отметить полипептид с молекулярной массой 70 Кд, который

является неспецифическим ответом клеток Escherichia coli С 600 на токсический шок ионами меди. Вновь синтезированные полипептиды Escherichia coli С-600 для всех изученных катионов металлов неодинаковы, хотя есть и общие белки, например, с молекулярной массой

14 кД. Для Zn4-, Сг+3, Fe+3 показаны дополнительные белки с молекулярной массой 85 кД. Кроме того, в случае воздействия катионами Fe+J появляются полипептиды с молекулярной массой 63 кД, в случае Zn+2 - полипептиды с молекулярной массой 78 кД, в случае А1+3 -полипептиды с молекулярной массой 42 Кд.

Параллельно исследовалось и влияние Ga+3 на Escherichia coli С 600. В повышающемся градиенте концентрации Ga+3 происходило значительное уменьшение синтеза белков с .молекулярной массой 28 кД и

15 кД. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии ионов Ga+3 на общий синтез полипептидов и появлении Ga+3 индуцируемых стрессовых белков с молекулярной массой 30 кД.

При воздействии катионами Zn+2, Сг+3 и Ga+3 на клетки грамположительной бактерии Bacillus subtilis происходили заметные изменения в синтезе полипептидов водорастворимой фракции.

При воздействии Сг+3 в концентрации 100 цМ появляются полипептиды с молекулярной массой 21 кД и 39 кД, при меньшей концентрации катионов (10 ¡дМ) синтеза этих полипептидов не наблюдался. В случае Zn2+ (10 и 100 цМ) появлялся полипептид с молекулярной массой 121 кД. При воздействии Ga+3 наблгодаегся синтез полипептидов с молекулярными массами 121 кД, 82 кД. 43 кД.

Сопоставление полученных данных обнаруживает сходную реакцию Synechoeystis aquatilis, Escherichia coli С 600 и Bacillis cybiilis на токсическое действие тяжелых металлов, а также кислотный и тепловой шок, что позволяет говорить о возможном существовании универсального а дап ¡анионного механизма, обеспечивающего выживание организмов при сублетальных воздействиях различной природы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изложенные выше экспериментальные результаты и данные литературы позволяют утверждать, что механизмы повреждающего действия тяжелых металлов обусловлены как физико-химической природой ионов тяжелых металлов, так и особенностями биологической организации микробных клеток.

К физико-химическим свойствам, определяющим повреждающее действие тяжелых металлов относятся показатели, характеризующие свойства их атомов и ионов и соответственно отражающие положение

тяжелых металлов в Периодическоей системе элементов: заряд, электронная структура, электроотрицательность, стандартный потенциал, степень окисления металла в соединении, прочность связи металла с неметаллической частью молекулы, растворимость соединения металла и устойчивость его в жидких биологических средах, степень гидратации, образующихся ионов, гидролиз и реакционная способность продуктов гидролиза, возможность образования хелатных комплексных соединений.

Микробную клетку можно характеризовать как динамическую систему, состоящую из постоянно взаимодействующих органических и минеральных компонентов (молекулы белков, нуклеиновых кислот, воды и т.д.), то есть основной молекулярный массив клетки - это связанные между собой электрические заряды. Поэтому очевидна роль электрических явлений в изучении повреждающего действия ионов тяжелых металлов, при этом особое значение имеет отрицательно заряженная клеточная поверхность и внешнаяя цитоплазматическая мембрана - место первичного контакта тяжелых металлов с клетками микроорганизмамов. В процессе этого происходит классическая сорбция на отрицательно заряженные поверхности с уменьшением общего заряда клетки, а также биохимическая сорбция, сопровождающаяся связыванием ионов и возрастанием электрокинетического потенциала. При этом существенно присутствует ли металл в виде свободного иона или находится в составе недиссоциированной соли либо является составной частью органического или неорганического комплексного соединения, т.е. решающим при повреждающем действии тяжелых металлов является не столько их общее содержание, сколько концентрация в доступном для микроорганизма состоянии и потенциальной способностью взаимодействовать с отрицательно заряженной клеточной поверхностью. В случае присутствия металлов в виде гидратированных катионов и, в частности, в виде гидролизованных однозарядных металлоионов происходит их сорбция на отрицательно заряженной клеточной поверхности микроорганизмов, что в последующем может привести к взаимодействию катионов металлов с доступными ионизированными карбоксильными, фосфатными, амино- и сульфгидрильными группами наружных мембран микробных клеток, при этом возможно протекание окислительно-восстановительных реакций и реакций комплексообразования. Способность осуществления окислительно-восстановительных реакций для конкретного тяжелого металла определяется величиной его нормального окислительного потенциала, но в каждом конкретном случае необходио учитывать лигандное окружение металла, наличие конкурирующих катионов, что, как известно, может существенно влиять на окислительно-восстановительные свойства тяжелых металлов, вплоть до их перевода из восстановителей в окислители. Взаимодействуя с функциональными

группами и аминокислотными остатками белков наружных оболочек микроорганизмов ионы тяжелых металлов могут изменять проницаемость мембран, блокировать активные центры-насосы, увеличивать жесткость мембраны и снижать ее устойчивость к осмотическому шоку. Кроме того, благодаря наличию в наружной мембране особых гидрофильных пор гидратированные катионы, не связанные в комплексы, могут беспрепятственно проникать в периплазматическое пространство микробных клеток. Однако, на поступление тяжелых металлов в область расположения жизненно важных структур микроорганизмов (рибосомы, ДНК, тилакоиды) влияет трансмембранный потенциал, при этом тяжелые металлы могут вступать в конкурентное взаимодействие с биоэлементами, в частности, кальцием, магнием, железом. Прохождение катионов тяжелых металлов через цитоплазматнческую мембрану может быть осуществлено посредством активного транспорта с помощью специальных транспортных белков-переносчиков, в частности, систем унипорта катионов калия. В этом случае транспортируемый катион должен быть максимально похожим на гидратированный катион калия. И, следовательно, иметь близкий по величине заряд и размеры. Очевидно, лишь однозарядные катионы тяжелых металлов по величине заряда могут быть сходны с катионами калия. Наиболее близки в этом плане гидратированному катиону калия маловодные катионы тяжелых металлов, например. Ag+ и Си+2, обычно комплексующиеся с одной или двумя молекулами воды либо однозарядные гидролизованные формы металлоионов, отсюда их повышенная токсичность для клеток микроорганизмов. В последующем взаимодействуя с фосфатными и азотистыми основаниями нуклеиновых кислот, образуя с молекулами ДНК и РНК стабильные комплексы тяжелые металлы приводят к конформационным изменениям, дестабилизации и денатурации макромолекул. Таким образом, изменение электрических характеристик микробной клетки является интегральным показателем сложных структурно-функциональных перестроек при повреждении микроорганизмов нонами тяжелых металлов.

Тяжелые металлы, вступающие в интимные связи со структурными элементами микробных клеток, оказывают повреждающее действие, замедляют и извращают ход обменных процессов клетки, что не может не вызвать ответных реакций микроорганизмов, одной из которых является индукция синтеза стрессовых белков, пусковой механизм которого -конформационные изменения белков, вызванные действием ионов тяжелых металлов. Эти реакции, возникшие и закрепленные в процессе эволюции, носят приспособительный характер и направлены прежде всего на нормализацию нарушенных процессов обмена веществ и восстановление поврежденных структур и функций.

выводы

В работе изложены результаты физиологического, электрофизического и биохимического анализа кратковременного токсического действия тяжелых металлов на клетки цианобактерий Anacystis nidulans, Synechocystis aquatilis, несерных пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, грамотрицательных гетеротрофных бактерий Escherichia coli, Pseudomonas fluoranlice, грамположительных гетеротрофных бактерий Bacillus subtilis, Mycobacterium phlei с целью выяснения механизмов клеточных повреждений ионами Ag+, Cd+2, Со+2, Cu+2, Fe+2, Mg+2, Ni+2, Pb+2, Zn+2, А1+3, Cr+3, Fe+3, Ga+3, Gd+3, La+3.

1. Токсический шок ионами тяжелых металлов приводит к структурным и функциональным повреждениям микробных клеток, при этом обнаруживаются как неспецифические эффекты, характеризующие различные шоковые воздействия, так и специфические изменения, определяемые природой воздействующего начала и организацией самих исследуемых объектов.

2. Физиолого-биохимическими исследованиями установлено, что токсический шок ионами Си+2 у цианобактерии Synechocystis aquatilis вызывает снижение солеустойчивости, свидетельствующее о нарушении барьера проницаемости, следствием которого является повышенное поступление ионов Си+2 в поврежденные клетки, замедление скорости роста, уменьшение фотосинтетической активности, подавление фотовыделения кислорода, разобщение энергетического сопряжения основного светособирающего комплекса с антенным комплексом ФС II, характеризующее повреждение фотосинтетических мембран, а также ингибирование темнового дыхания, связанное с нарушениями дыхательной электронтранспортной цепи.

3. Репарация поврежденных клеток, выявляемая по восстановлению солетолерантности и сопряжения основного светособирающего комплекса с антенным комплексом ФС II происходит на свету и в темноте. Буферный раствор менее благоприятен для сохранения жизнеспособности поврежденных клеток и их последующей репарации в отличие от минеральной ростовой среды. Репарировавшие клетки приобретают устойчивость к повторному токсическому шоку ионами Си+2. Клетки, восстановившие повреждения после теплового шока, также приобретают устойчивость к последующему токсическому шоку ионами Си+2. Реакция цианобактерии Synechocystis aquatilis на сублетальное воздействие ионами Си+2 характеризуется тремя этапами: повреждение - репарация - приобретение устойчивости.

4.Электрофизический анализ поверхностных свойств и цитоплазматической мембраны клеток Anacystis nidulans, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Escherichia coli, Pseudomonas fluorantice,

Mycobacterium phlei при кратковременном воздействии ионами Cu+2

показал, что токсические эффекты тяжелых металлов проявляются в изменении барьерных свойств и повреждении цитоплазматической мембраны микроорганизмов, что подтверждается и изменениями в их ультраструктурной организации, при этом повреждающее действие солей меди зависит от физико-химических параметров: среды инкубации, концентрации катиона, вида аниона, входящего в состав исследуемой соли, прединкубации в присутствии трехзарядных катионов, рН.

5. Повреждающее действие ионов Си+2 выше в изотонической среде, то есть в случае клеток с высоким содержанием внутриклеточного калия, однако степень токсичности ярче проявляется в гипотонической среде. Ацетат меди более токсичен для цитоплазматической мембраны клеток, чем соли меди с другими анионами. Анионный ряд токсичности имеет следующий вид: CH3CGO' > СГ > S04"2 > N03". Предварительная инкубация в присутствии трехзарядных катионов (Ga+3, Gd+J, La+J) защищает клетки от повреждающего действия ионов Си+2. Максимальное повреждение цитоплазматической мембраны ионами Си+2 наблюдается при значении рН 7,0.

6. По резистентности к повреждающему действию ионов меди исследованные микроорганизмы выстравиваются в следующий ряд: Anacystis nidulatis > Rhodobacter capsulatus > Rhodobacter sphaeraides > Escherichia coli > Pseudomonas fluorantice > Mycobacterium phlei.

7. Сопоставление действия одно-, двух-, и трехзарядных катионов тяжелых металлов обнаруживает корреляцию между экстремальным изменением электроповерхностных свойств клеток и повреждением цитоплазматической мембраны в определенных областях значений рН. при которых имеет место образование однозарядных гидролизованных форм металлоионов (МеОН+) с повышенными сорбционными свойствами и высокой токсичностью для цитоплазматической мембраны бактериальных клеток.

8. Показана рН-зависимость кинетики взаимодействия исследованных катионов тяжелых металлов с клеточной поверхностью и изменений анизотропии электрической поляризуемости микробных клеток. В случае рН образования однозарядных гидролизованных форм металлоионов наблюдается их поверхностная адсорбция, устанавливаемая по перезарядке клеточной поверхности, экстремальному уменьшению величины электроориентационного эффекта поврежденных клеток в области низких частот электрического поля (процесс во времени продолжительный, протекает в минутах). В случае рН присутствия цегидролизованных форм металлоионов (Ме+2, Ме+3) имеет место сжатие двойного электрического слоя, наблюдаемое по экстремальному увеличению электроориентационного эффекта клеток в области низких частот электрического поля, при этом не происходит перезарядки

клеточной поверхности (процесс во времени быстротечный, протекает в секундах). ;

9. В ответ на повреждающее действие ионов тяжелых металлов происходит изменение в синтезе полипептидов растворимой фракции Synechocystis aquatilis, Escherichia coli и Bacillus subtilis, при этом появляются шоковые (стрессовые) белки в дополнение к обычным. Наряду с этим синтез полипептидов, присущих исследованным клеткам в оптимальных условиях, как усиливается, так и подавляется.

10. По степени повреждающего действия изученные одно- и двухзарядные катионы располагаются в ряду Ag+ > Cu+2 > Cd+2 > Pb+2 > Ni+2 > Co+2 > Zn+2 > Mn+2, что соответствует рядам сродства металлов к сульфгидрильным и фосфатным группам.

11. Установленные различия в чувствительности микробных клеток к токсическому действию катионов тяжелых металлов обусловлена несходством структурных, электрических и катионообменных свойств их поверхностных оболочек, оказывающих определенное влияние на процессы обменной адсорбции и проникновения катионов к цитоплазматической мембране клеток.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Явление токсического шока синезеленой водоросли Synechocystis aquatilis.//Актуальные проблемы современной альгологии. I Всесоюзная конференция. - Черкассы, 1987. С.247.

2. Физиологические последствия токсического шока меди цианобактерии Synechocystis aquatilis.//I/by4eHHe, охрана и рациональное использование природных ресурсов. Всесоюзная конференция молодых ученых.-Уфа, 1987. С. 135.

3. Влияние сублетальной обработки ионами меди на клетки цианобактерии Synechocystis aquatilis.//BecrHmc Лениградского университета.- Ленинград, 1988. Сер.биология. Вып.1., № 3. С.83-88 (в соавт.: И.Вагнер)

4. Реакция цианобактерии Synechocystis aquatilis на действия стрессовых факторов./Юрганизмы в условиях стрессовых воздействий. Региональная конференция молодых ученых. - Уфа, 1988. С.121-122 (в соавт.: А.Н.Чемирис).

5. Электрофорез полипептидов Synechocystis aquatilis после токсического шока ионами меди. //Электрофорез клетки. Научно-практическая региональная конференция. - Уфа, 1989. С.63-66.

6. Электрофорез полипептидов Synechocystis aquatilis при действии стрессоров различной природы.//Электрофорез клетки. Научно-практическая региональная конференция. - Уфа, 1989. С.66-69.

7. К вопросу о механизмах адаптации клеток в экстремальных условиях.//Физиологические .механизмы адаптации человека и животных. II съезд физиологов Уральского региона. - Свердловск, 1990. С.123-124.

8. Notes on Mechanisms of Cell Adaptation to Extreme Conditions. //Regional Meeting of IUPS.- Praha, 1991. 2 p.

9. Некоторые аспекты роста микроорганизмов,- Уфа, 1991, 128 с. (в соавт.: С.М.Ждан-Пушкина).

10. Пероксидаза в ответных реакциях на экстремальное воздействие электрическим полем коронного разряда.//Принципы адаптации живых систем.- Уфа, 1992 (в соавт.: З.М.Хасанова, Л.Г.Наумов. Ф. К. Иштиряко ва).

И. Влияние ионов тяжелых металлов на электрофизические свойства бактериальных клеток Anacystis nidulans и Escherichia соН.//Микробиология. Москва, 1992. Т.61. Вып.З. С.455-463 (в соавт: А.Ю.Иванов, В.М.Фомченков, З.М.Курмашина, М.М.Садиков).

12. Влияние металлов на рост цианобактерии Synechocystis aquatilis. //VI координационный семинар-совещание преподавателей физиологии растений.- Смоленск, 1993. С. 119 (в соавт.: Л.Н.Волошко, 3. М. Курамшина, 3. М. Хасанова).

13. Содержание меди в клетках цианобактерии Synechocystis aquatilis после сублетального и летального воздействия./ЛТ координационный семинар-совещание преподавателей физиологии растений.- Смоленск, 1993. с. 121 (в соавт.: С.Н.Шахов).

14. Copper Uptake in Cyanobacterium Synechocystis aquatilis after CuS04 Treatment.//II Biochemistry Congress.- Teheran, 1993. P. 130 (в соавт.: P.Collery, Z.Khassanova. S.Shakhov, Z. Yangourazova, J.C.Etienne).

15. The Influence of Copper Ions on the Photosynthetic Activity of the Cyanobacterium Synechocystis aquatilis. //Metal Ions in Biology and Medicine.- Paris, 1994. Vol.3. P. 181-185 (в соавт.: P.Collery, J.C.Etienne, Z.Khassanova, Z. Yangurazova).

16. Response of Escherichia coli to Gallium Treatment.//Metal Ions in Biology and Medicine.- Paris, 1994. Vol.3. P.327-330 (в соавт.: P.Collery. V.Vakhitov, E.Guimalov, A.Chemeris, A.Ivanov. J.C.Etienne, Z.Khassanova).

17. Продуктивность и обменные процессы озимой ржи при предпосевной обработке семян электрическим полем коронного разряда. -Уфа, 1995. 104 с. (в соавт.:Л.Г. Наумов, З.М.Хасанова).

18. О механизме биологического действия электрического поля на растения,- Уфа, 1995. 81 с. (в соавт.: Хасанова З.М., Наумов Л.Г., Н. Ф.Батыгин).

19. Changes in Electrophysical Properties of Bacterial Cells by Metal Tons. //V Comtox Symposium on Toxicology and Clinical Chemistry of Metals.- Canada, 1995. P.56. (в соавт.: A.Ivanov, Z.Khassanova, Z.Kuramshina, P.Collery, C.Choisy, J.C.Etienne).

20. Changes in Eleetrophysical Properties of Bacterial Cells by Copper Ions. //V Comtox Symposium on Toxicology and Clinical Chemistry of Metals.- Canada, 1995. P.56. (в соавт.: Z.Khassanova, A.lvanov, Z. Kuramshina, J. C. Etienne, P. Collery, C. Choisy).

21. Influence of Trivalent Metal Ions on the Electrophysical Properties of Microorganisms.//V Comtox Symposium on Toxicology and Clinical Chemistry of Metals.-Canada, 1995. P.56. (в соавт.: J.C.Etienne. P.Collery, C.Choisy, A.lvanov, Z.Khassanova, Z.Kuramchina).

22. Influence of Metal Ions on the Polypeptide Synthesis of Escherichia сой. //V Comtox Symposium on Toxicology and Clinical Chemistry of Metals.- Canada, 1995. P.57. (в соавт.: J.C.Etienne, F.Guimalov, C.Allagulova, A.Chemeris, V.Vahkiiov, L.Khassanova, P.Collery, C.Choisy).

23. Токсический шок ионами меди у цианобактерии Synechocystis aquatilis. - Уфа, 1995. 84 с.

24. Анализ клеточных повреждений ионами тяжелых металлов. - Уфа, 1996. 39 с.

25. Физиолого-биохимические аспекты и экология фотосинтеза.- Уфа, 1996. 69 с. (в сосшт.: З.М.Хасанова).

26. Физиолого-биохимические аспекты и экология дыхания.- Уфа, 1996, 37 с. (в соавт.: З.М.Хасанова).

27. Физиология и экологические аспекты водного режима.- Уфа, 1996, 51 с. (в соавт.: З.М.Хасанова).

28. Физиология и экологические аспекты минерального питания,- Уфа, 1996, 29 с. (в соавт.: З.М.Хасанова).

29. Microorganisms as a tool of studyng metal ions - induced changes in electrophysical cell membrane properties.//Molecular Cell Biology.- Paris -London, 1996. № 6. 9 p. (в соавт.: A.lvanov, P.Collery, Z.Khassanova, C.Choisy, J.C.Etienne).

30. Colloidal antiseptics on base of aluminium hydroxyde.- Metal ions in biology and medicine. Paris, 1996. Vol.4. P.672. (в соавт.: M.Khavkin, M.J.Roitman, Y.Khavkin, Z.Khassanova, P.Collery).

31. Control by electrical parameters of Escherichia coli K-12 membrane damages resulting from metal ions.//Metal ions in biology and medicine. -Paris, 1996. Vol.4. P.234-237. (в соавт.: A.lvanov, Z.Khassanova, P.Collery. C. Choisy, J. C. Etienne).

32. Electrophysical analysis of metal ions - induced toxic shock in phototrophic microorganisms.- Metal ions in biology and medicine. Paris, 1996. Vol.4. P.229-233. (в соавт.: A.lvanov, Z.Khassanova, E.Pavlova, P. Collery. C. Choisy, J. C. Etienne). !

33. The cell membrane target of antitimour gallium compounds.-Amsterdam, 1996. P.327. (всоавт.: P.Collery, A.lvanov, Z.Kuramshina).

34. The effect of gallium on the calcium retention capasity of rate liver mitochondria. Metal ions in biology and medicine. - Paris, 1996. Vol.4. P.249-252. (в соавт.: V.Gogvadze, A.Zhukova, A.lvanov, Z.Khassanova, P.Collery).