Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние состава липополисахаридов на характеристики клеточной стенки бактерий
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Влияние состава липополисахаридов на характеристики клеточной стенки бактерий"
На правах рукописи
ЗУБОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ НА ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ БАКТЕРИЙ
03.00.04 -биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино - 2006
Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии РАН.
Научный руководитель: доктор биологических наук
Прохоренко Изабелла Рувимовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Любимов Валерий Юрьевич
кандидат биологических наук, доцент Поцсдуева Маргарита Михайловна
Ведущая организация: Биологический факультет
Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева
Защита диссертации состоится « 21 » декабря 2006 г. в 11 00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН
по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская 2, ИФПБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН г. Пущино
Автореферат разослан «Ц.о _2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
Г.Н. Назарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Актуальной современной проблемой остается ухудшение эпидемиологической обстановки, в частности, увеличение количества больных с грамотрицательной бактериемией. При заражении грамотрндательными бактериями возрастает опасность осложнений, которые могут привести к эгадотоксиновому шоку, причиной развития которого являются липополисахариды- (ЛПС). ЛПС - основная структурная единица внешней мембраны грамотрицательных бактерий (Mikaida & Vaara, 1987). Токсической составляющей ЛПС является лнпвд A (Westphal & Luderitz, 1954). Дли на и состав кора и полисахаршшого фрагмента ЛПС определяют хемотип бактерий.
Сравнительные определения последовательностей нуклеотндов 16S рРНК (Woese, 1987) обнаружили неизвестную ранее филогенетическую связь между фототрофнымн (Pseudomonas. Khodobacter) и другими трамотрицательными бактериями, такими как Neisseria, Eicherictita, Salmonella и др., что позволило расширить границы исследований и возможности модифицировать факторы, влияющие на рост грамотрнцательных бактерий. Представители класса Proteobacteria имеют принципиальные различия по морфологии, физиологии, экологии и взаимоотношениям с другими формами жизни. Однако все они характеризуются общей организацией клеточной оболочки, макромолекулярнымн компонентами которой являются пептидогликан, лттопротеины, порины, фосфолнпиды, а также ЛПС, занимающие две трети клеточной поверхности (Weckesseret al., 1979). Физико-химический состав и структура клеточной стенки бактерий являются определяющими во взаимодействии с разнообразными факторами внешней среды. Поверхностный заряд, создаваемый структурными компонентами клеточной стенки, влияет на взаимодействие бактериальных клеток с антибиотиками, детергентами и биологически активными молекулами (Bayer & S loyer, 1990). ЛПС проявляют различные виды биологической активности только в свободном состоянии (Мауепх, 1997). На высвобождение ЛПС из бактерий могут влиять как свойства самой клетки - ее жизнеспособность, структура и заряд клеточной стенки, так и внешние факторы, такие хак условия роста бактерий и различные внешние агенты. Исследования по этим вопросам носят скорее отрывочный, чем систематический характер. Имеющиеся в литературе данные получены для различных бактерий и штаммов без прослеживания логической связи объектов исследования. Остается не до конца изученной зависимость алекгроповерююстных свойств бактериальных клеток от таких важных характеристик клеточной стенки, как хемотип, поверхностный заряд, плотность упаковки ЛПС s клеточной стенке. Это важно знать для понимания процессов, происходящих при взаимодействии бактерий с катионнымн белками и антибиотиками, а также при оценке возможной адгезивной и антигенной активностей бактерий.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей - работы явилось изучение влияния состава ЛПС на электроповерхностные характеристики некоторых представителей грамотрицательных бактерий в различных условиях окружающей среды и их способности взаимодействовать с катионными белками шгаэмы крови в зависимости от хемопша. .
Были поставлены следующие задачи:
- определить хемотип бактерий штаммов Rb. capsulatum BIO и Rb. capsulatus PG, а также состав ЛПС, формирующих их клеточную стенку,
• изучить влияние факторов роста (состава срсаы и условий освещенности) на состав ЛПС клеточной стенки и хемопга клеток Rb, capsulata*',
• провести сравнительное исследование электроповерхностных свойств клеток Rb. capsulatum и Е. coli различных хемотгаюв;
- изучить роль некоторых белков плазмы крови в высвобождении эндотоксинов из клеточной стенки в зависимости от хемотипа бактерий на примере Е. coli к Rb. capxulatus.
Научи ая новизна. Впервые определены неописанные ранее хемотипы фототрофных бактерий Rb. capsulatum BI0 н Rb. capsulatus PG.
Впервые показано влияние состава ЛПС на электропоаерхиоепше свойства фототрофных бактерий ЛЬ. capsulatus В10 и ЛЬ. capsulatus PG.
Установлена зависимость взаимодействия белков крови с бактериями не только от их хемотнпа, но в плотности упаковки ЛПС в клеточной стенке, которая определяется коровой частью ЛПС.
Научно-практическая значимость, Полученные в настоящей работе данные по взаимодействию белков плазмы крови с грэмотрицательными бактериями различных хемотипов представляют не только теоретический, но в практический интерес, поскольку имитируют процесс, который может реализоваться у больных с неотрицательной бактериемией. Полученные результаты могут иметь решающее значение при антибактериальной терапии.
Впервые показана возможность практического применения колориметрического метода с карбоцваншовым красителем для определения ЛПС различной структуры и установления хемотипа бактерий.
Аппабаиня работы. Материалы диссертации были представлены на международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001 г.), на VII Всероссийском научном Форуме имени академика B.U. Иоффе с международным участием (Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003 г.), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М.Сеченова «Инфекционные и паразитарные
болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение ннфектологив» (Москва, 2003 г.), на Ш Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки н прогресс клинической медицины» (Москва, 2004 г,), на I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004 г.), на Щ Российском конгрессе но патофизиология «Дизрегулядаюкная патология органов и систем» (Москва, 2004 г.), на Конференции «Фундаментальные науки - медицине» Программа фундаментальных исследований Президиума РАН (Москва, 2004 г.), на II международной научно-практической конференция Медбиотех-2 «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущиво, 2005 г.), на ХШ Российском, национальном конгрессе «Человек в лекарство» (Москва, 2006 г.).
Публикация. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых Российских журналах и одна статья принята в печать.
Структура н объем диссертация. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 206 источников. Содержит 29 рисунков и 8 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Настоящая работа выполнена на клетках пурпурной несерной фототрофной бактерии Rb. capsulatus BIO из коллекции кафедры микробиологии МГУ им, М.В. Ломоносова и Rb. capsulatus PG (ВКМ В-2381Д) из Российской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН, а также на двух штаммах Е. coli К-12: диком шт. D21 из Российской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН и тт. JM 103 из немецкой коллекции микроорганизмов (DSMZ GmbH; Braunschweig, Germany). По классификации Бомана и Моннера, основанной на анализе состава углеводов и жирных кислот ЛПС мутантов Е. coli К-12, шт. JM 103 (Re-хемотип) носит название шт. D2ID (Boman & Моппет, 1975). Выбор объектов исследования обусловлен принадлежностью бактерий Rb. capsulatus и Е, coli, как отмечалось выше, к одному классу Proteobacteria, а именно к грамотрицательным бактериям, имеющим общий принцип организации клеточной стешда. Клетка Rb. capsulatus BIO и Äi>. capsulatus PG выращивали на среде Хатнера (Cohen-Bazire et al., 1957) в анаэробных условиях при ЗО'С, освещении 1000-2000 лк в жидкой культуре н на твердой среде с добавлением 1.5% агара в течение 4-5 суток. Клетки Е. coli К-12 шт. D21 выращивали на агаризованиой среде М9; Е. coli К-12 пгг. JM 103 - на среде 382 (DSMZ GmbH, Braunschweig, Germany) при 37*С в течение 24 часов.
Выделение ЛПС из клеток Rb. capsulatus проводили методом Вестфаля (Westphal et al., 1952) в модификации Кулышгаа я др. (1987). ЛПС из Е coli К-12 выделяли методом.
предложенным Галаносом (Galanos et at., 1968). Препараты ЛПС проверяли на содержание белков и нуклеиновых кислот спектрофотометрически (Thome, 1978).
Для определения хемотипа бактерий скорость оседания клеток определяли по агглютинации в 4% растворе NaCl (Lindberg, 1980). Состав ЛПС определяли: спектроскопическими методами с карбоцианииовым красителем (Janda & Work, 1971) и по содержанию КДО (кетодезоксиоктолузоновая кислота) (Karkhanis et al., 1978), а также методом электрофореза в 14% ПААГ (Krauss et al., 1988), методом ИФА и методом иммунной электронной микроскопии. Электрокинетические свойства бактерий определяли методом клеточного электрофореза в фосфагно-голратноы буфере с ионной силой 0,02 (уделышя электропроводность 1.4 мСм/см) (Шеппе я др., 1978).
Клетки после инкубации при мягком перемешивании с лизоцимом и лактоферрином при 37*С в течение 1 часа центрифугировали. В супернатанте определяли содержание высвободившихся ЛПС с помощью карбоцианина. Осадок клеток суспендировали в PBS-буфере и определяли количество колониеобразуклцих единиц (CFU) контрольных клеток и клеток, инкубированных с белками, посевом на соответствующую агаризованную среду и подсчетом образовавшихся колоний.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Многочисленные штаммы бактерий способны образовывать колонии различной формы. Форма колоний определяете* составом ЛПС, входящих в клеточную стенку. Бактерии, образующие колонии гладкой формы (S-хемотип), содержат в составе своей клеточной стенки полные молекулы ЛПС, состоящие из гидрофобного липнда А, олигосахаридного кора и полисахаридной О-цепн. Микроорганизмы, формирующие колонии шероховатой формы, синтезируют ЛПС, для которых типичным являете« отсутствие полисахаридной цепи (Я-хемогад). В пределах R-хемотипа возможны структуры кора, отличающиеся количеством и составом Сахаров - от максимально усеченной Re-структуры до полного кора Ra. Исследованные вами штаммы Е. coli относятся к R-хемотнпу (т.е. в состав их ЛПС не входит О-антиген) я различаются по структуре кора. ЛПС из К coli D21 характеризуется полной Ra-структурой кора, а ЛПС из Е. coli JM 103 содержит минимальный по структуре Re-кор (рас. 1).
Cfell^Gdlf
R»
►dt: •
a Gill! t— Bi ■ Rkj Hb,
r
Hcptn
I—Hl
PPEA ,1
►,HiptT
EKDOlj-^^Ä]
KDöm
-tu
Pac. 1. Структуры коров ЛПС из Еь coli К-12 (от Нд до Re) (адmri ировдно по Rccves, 1994). Glc, Gal* Hep - остатки Сахаров; KDO - кетодезоксиоктолузоновая кислота.
Для фототрофных бактерий подобная классификация по хемотипу отсутствует. Поэтому нами был определен хемогип используемых в работе штаммов Rb. capsulatus.
1. Определение хемотипа бактерий Rb. capsulatus BIO и Rb. capsulatus PG Исследование культур адьяых признаков изучаемых штаммов Rb. capsulatus показало, что бактерии Rb. capsulatus BIO на атаризованной среде образуют колонии R-тята кирпичного цвета, плотно сидящие на поверхности агара, характеризующиеся морщинистой, полусухой поверхностью с неравномерными извилистыми краями (рис. 2). Бактерии Rb. capsulatus PG образуют блестящие, гладкие колонии S-типа кирпичного цвета с ровным контуром, равномерно возвышающейся центральной частью и более светлой уплощенной периферической вуалью. Колонии легко снимаются с поверхности агара.
Рис. 2. Колонии бактерий ЛЬ. capsulatus BIO (А) и Rb. capsulatus PG(E). Очень простым и быстрым методом определения хемотипа является агглютинация клеток в растворе NaCl (Lindberg, 1980). Дня клеток Rb. capsulatus BIO скорость оседания составляла 0.05 мм/мш, а язя Rb. capsulatus PG - 0.01 мм/мин, что свидетельствует о принадлежности клеток данных штаммов к разным хемотипам. Дальнейшее уточнение хемотипа изучаемых штаммов Rb. capsulatus требовало дополнительного анализа ЛПС их клеточной стенки.
7.1. Хщ>актеристика ЛПС «и разных штаммов Rb, capsulatus 1.1.1. Изучение возможностей применения калориметрического метода для определения ЛПСразличной структур**
Количественное определение ЛПС в лекарственных препаратах и биологических жидкостях остается актуальной задачей. Мы использовали метод колориметрического определения ЛПС с карбоцианнном, суть которого состоит во взаимодействии карбодианикового красителя с молекулой ЛПС, не содержащей хромофорных групп {Janda & Work, 1971). Это вело к появлению в спектре комплекса ЛПС-карбо цианин характерного пика с максимумом поглощения в диапазоне 450-478 нм, тогда как его взаимодействие с белками, полисахаридами и нуклеиновыми кислотами вызывало другие изменения спектра карбоцианива. Из литературы известно, что комплекс липида А с краской смещает
4ВЗ
максимум поглощения в коротковолновую, а комплекс карбоцианин-полисахарид (ПС) - в длинноволновую область по сравнению с максимумом поглощения свободного красителя (Егорова и др., 1988). Вклад кора в изменения спектров и положений максимумов поглощения в литературе не был отмечен.
Поскольку одной из наших задач было установление хемотипа разных штаммов бактерий Rb. capsulatum на основании анализа структуры ЛПС, было изучено влияние ЛПС бактерий известных хемотипов на спектральные характеристики комплекса ЛПС-карбоциании. Были использованы коммерческие препараты ЛПС: Е. coli 055:В5 (S-хемотип), Е, coli ЕЮОО (Ra-мутант), Е. colt J5 (Rc-мутаят), S. ihyphimurium SL11S1 (Re-мутант) ("Sigma").
Растворы карбоциашша с препаратами ЛПС, лишенными полисах аридного фрагмента (Ra-, Re-, Re-структуры), приобретали желтую окраску различных оттенков, а растворы ЛПС S-хемотипа всегда были окрашены в синий цвет. Спектры, представленные на рис. 3, показывают, что только ЛПС S-хемотвпа дополнительно поглощал свет в диапазоне 500600 им. Таким образом, можно заключить, что синее окрашивание растворов карбоциашша с ЛПС свидетельствует о присутствии О-полисахарида в препаратах ЛПС. Из спектров поглощения комплексов ЛПС-карбоцианин ян видно, что спектры ЛПС различных хемотипов различаются ие только по форме, но и по величине и положению максимумов поглощения (рис. 3). Наиболее длинноволновый максимум поглощения наблюдался для ЛПС S-хемотипа при 465 им, С укорочением длины кора происходило смещение максимумов в коротковолновую область: для Ra-icopa он соответствовал 462 им, Rc-кора - 461.5 ям, Re-кора - 458 нм (рис. 3). Видно также, что чем более усеченной является структура ЛПС, тем меньше величина абсорбции комплекса с ¡фаской. Как отмечено выше, принципиальным отличием между S* и R-ЛПС является наличие О-антигена. Молекулы, усеченные по этому фрагменту, более гидрофобны и склонны к агрегации. Г идрофобносгь ЛПС возрастает и с усечением кора,
А
3.4-I
3.0-
1.6-
1.S-
0,4 -
0,0
400
«О
500
550
BOG
Гис. 3. Спектры поглощения комплексов ЛПС-карбоцианин для ЛПС различной структуры (концентрация: ЛПС—100 мкг/мл; карбоциашша - 0,003%). 1 - S-ЛПС; 2 - Ra-ЛПС; 3 - Rc-ЛПС; 4 - Re-ЛПС. А - величина абсорбции.
о
OlG ■
что приводит к образованию мицелл в растворах, в свази о чем меняется возможность контакта краски с отдельными молекулами. С увеличением гндрофобности ЛПС от S- к Re-хеыотипу снижается интенсивность поглощения, спектры расширяются и максимумы смещаются в коротковолновую область. Таким образом, спектры поглощения комплексов ЛПС с карбоцианйном позволяют судить о составе исследуемых ЛПС, в частности, как о наличии полисахаридного фрагмента, так и о составе кора.
На основании полученных результатов, подтверждающих возможность использования колориметрического метода с карбоцианином для оценки состава ЛПС, мы исследовали ЛПС из Rb. capsúlalas различных штаммов. Нами была установлена идентичность спектров
ЛПС-карбоцианин между ЛПС, высвобождаемыми в среду роста и ЛПС, выделенными из бактерий по методу Кулыпина (1987).
Видно, что максимум поглощения комплекса ЛПС-карбоцианин дав ЛПС кз Rb. capsulatus В10 соответствовал 458 им, а из Rb. capsulatus PG - 468 нм (рис. 4). Сдвиг максимума в спектре поглощения комплекса ЛПС-карбоцианин в коротковолновую область может свидетельствовать □ различии в структурах ЛПС
Ряс. 4. Спектры поглощения комплексов карбоцианина с ЛПС из: I -Rb. capsulatus ВЮ; 2-Rb. capsulatus PG.
изучаемых штаммов клеток, а именно о более усеченной структуре ЛПС из НЬ. сартШиз В10.
1.1.2. Сравнительный анализ содержания КДО в препаратах ЛПС из разных штамма» КЬ. сарииЫит
Остатки КДО являются неотъемлемой частью любой молекулы ЛПС. Из всех описанных на сегодня эндотоксинов не известно ни одного, в состав которого входило бы более трёх молекул КДО (Квирель и Кочетков, 1993). Из формулы ЛПС следует, что относительная молярная доля КДО в молекуле ЛПС уменьшается с удлинением внешнего кора и полисахаридного фрагмента.
В связи с этим, для более детального уточнения состава ЛПС вз разных штаммов Rb. сарзиШих нами был проведен анализ КДО, входящих в исследуемые ЛПС по реакции с тиобарбитуровой кислотой (КагкЬашз е1 а1., 1978).
с
ни
Результат определения молярной доли
КДО в составе молекул ЛПС изучаемых
штаммов наглядно иллюстрируются
спектрами поглощения продуктов реакции
КДО с твобарбвггуровой кислотой (рис. 5).
Из представленных результатов видно, что
доля КДО в препарате ЛПС из Rb. capsulatum
PG в несколько раз меньше, чем в ЛПС из
Rb. capsulatusBIO.
~вош Это также свидетельствует о
Рис. 5. Спектры поглощения продуктов присутствии шлисахаридного фрагмента в реакции 2-пюбарбнтуровой кислоты с ЛПС ^^^ лпс го Rb PG ,ю
из: 1 -Rb. capsulatus BIO, 2-Rb. capsulata "Рукгуре Jilll- из Hb. capsulatus Ft. но
PG. Навеска ЛПС-2мг. сразвению с Rb. capsulatus BIO и,
соответственно, о принадлежности исследуемых штаммов бактерий к различным хемотшмм.
1.1.3. Сравнительный анализ состава ЛПС различных штаммов Rb, capsulatus методам электрофореза « полиакрипамидном геле
Из результатов по скорости агглютинации, по карбоця&нину и содержанию КДО следовало, что клетки исследуемых штаммов относятся к разным хемотипам. Анализировать более детально ЛПС из фототрофных бактерий различных хемотнпов аналогично тому, как это делается для энтеробактерий, в настоящее время затруднительно. Связано это с тем, что в отличие от энтеробахтерий, для большинства пурпурных бактерий не доказано существование различных R-коровых структур. Таким образом, обозначения Ra-, Rc-, Rdi-, Rc-подобные используются для ЛПС из фототрофных бактерий исключительно как оперативная терминология. Дня целого ряда фототрофных бактерий был проведен сравнительный анализ структуры кора с охарактеризованными по хеыопшу представителями Enterobacteriaceae и обнаружена хорошая корреляция между хемотипом, серотипом и электропсдвижностью ЛПС в геле (Krauss et al., 1983).
Анализ ЛПС изучаемых штаммов Rb. capsulatus проводили методом Электрофореза в 14% ПААГ. Электрофореграыма ЛПС представлена на рис. б. Для ЛПС из Rb. capsulatus BIO наблюдаются лишь зоны в области низких молекулярных масс (12.5 кДа), соответствующие липиду А. Такие же зоны обнаружены на электрофореграмме ЛПС из Rb. capsulatus PG. Наличие дополнительных полос в области 21 кДа указывает на присутствие небольшого полнсахарндного фрагмента в ЛПС из Rb. capsulatus PG.
Таким образом, спектральными и биохимическими методами показано, что исследуемые штаммы Rb. capsulatum различаются по структуре клеточной стенки и входящих в ее состав ЛПС. Полученные результаты позволяют нам отнести штамм Rb. capsulatus PG к SR-, a Rb. capsulatus BIO к R-хемотипу.
2. Исследование электрофоретцческих свойств клеток ЯЬ. capsulatus м £ coli различных хемотимв
Для изучения влияния структуры ЛПС на характеристики клеточной поверхности изучаемых штаммов бактерий была изучена электрофоретическая подвижность клеток (ЭФП) методом клеточного электрофореза. ЛПС, располагаясь во внешнем лепестке внешней мембраны, обеспечивают целостность и стабильность мембраны, и участвуют во взаимоотношениях бактериальной клетки с внешней средой. Отрицательные заряды фосфатых групп литщда А, карбоксильных трупп КДО и фосфатных групп фосфоршшрованных Сахаров могут вносить вклад в общий отрицательный заряд клетки. Исследование заряженных групп на клеточной поверхности различных штаммов Rb. capsulatus и Е. coli было проведено в зависимости от pH суспензии. На поверхности бактериальных клеток находятся группы с положительным и отрицательным зарядом.
Из рис. ? видно, .что клетки обоих штаммов Е. coli К-12 имеют близкие значения отрицательного ЭФП в диапазоне pH 7.0-7.8. Достоверное различие в величинах ЭФП клеток между штаммами начинало проявляться только при более кислом значении pH (5.44.6) суспензии. В этом случае клетки Е. coli JM 103 имели больший отрицательный заряд поверхности клеток, чем Е. coll D21.
Величины ЭФП клеток Rb. capsulatus BIO и PG также были близки при нейтральных значениях pH. Значительные различия в средних величинах ЭФП популяций клеток двух штаммов начинали проявляться при pH менее 4.6 (P^O.OOl). Клетки Rh. capsulatus BIO в этих условиях имели. больший отрицательный заряд. При дальнейшем снижении pH клеточных суспензий клетки Rb. capsulatus PG, переходя изоэлектрическое состояние, аналогично клеткам обоих штаммов Е. coli, приобретали положительное значение ЭФП, что могло указывать на наличие на поверхности основных групп, например, аминогрупп поринов.
pHC.fi.
Электрофореграмма ЛПС, выделенных из: 1 - Rb. capsulatus BIO; 2-Rb. capsulatus PG, 3 - белки-маркеры. Справа указаны молекулярные массы белковых метчиков в
кДа-
—ft, tape. PG -»-M. caps. BiO
a. 6.
Рас. 7. рН-завясимости ЭФП клеток Е. coli К-12 (а) и Rb. capsulatus (б).
В отлично от этого у клеток культуры Rb. capsulatus BIO снижение pH вызывало лишь уменьшение отрицательной. величины ЭФП. № кривой ЭФП клеток Rb. capsulatus BIO следует, что на их поверхности присутствует больше отрицательно заряженных групп (карбоксильные, фосфатные), чем у клеток Ab. capsulatus PG.
При измерении ЭФП клеток обнаруживалась дисперсия значений для всех штаммов. Известно, что в буферных системах с высокой ионной силой (выше 0,01) форма и размер клеток не влияют на этот параметр. По-видимому, дисперсия значений ЭФП клеток связана с присутствием популяций клеток, находящихся в различных фазах роста. Из литературы известно, что ЭФП клеток по мере роста культуры Е. coli увеличивается, что обусловлено изменением количества ЛПС в наружном слое внешней мембраны (Иванов, Фомченков, 1989). Наиболее выраженные различия между штаммами наблюдались при значении pH 4.6.
Из рисунка распределения ЭФП клеток, видно, что клетки Е. coli D21 содержали две субпопуляции (рис. 8). Клетки Е. coli JM 103 при значении pH 4.6 имели узкий диапазон значений ЭФП. Следует отметить, что двухмодальный
рн 4.3
ll.ll,
-H,t Jlß -1Д -J Jt -21 -ЭД
-Ü« -о» -U ■<* 4
ЭФП, ыкн/свкДОсм
Рис. 8. Типичные гистограммы распределения ЭФП клеток Е. coli D21 и Е. coli JM 103.
характер распределения клеток во ЭФП для Е. coli D21 сохранялся с изменением значений pH суспензии, но был менее выражен. Наличие двух популяций клеток (рис. 8), по-видимому, может отражать гетерогенность состава ЛПС, связанную с различными этапами биосинтеза (Klena et al., 1992), и обусловленную присутствием на клеточной поверхности молекул ЛПС с различной по степени завершенности биосинтеза структурой.
Структура кора определяет размер и влияет иа величину заряда молекулы ЛПС, что может иметь решающее значение при взаимодействии клеток с окружающей средой. В состав ЛПС из Е. coli D21 за счет внутреннего кора входят две дополнительные фосфатные труппы фосфорилированных Сахаров в сравнении с Е. coli JM 103, которые вместе с карбоксильными труппами КДО и фосфатными группами липнда Л вносят вклад в общий отрицательный заряд на клеточной поверхности (Reeves, 1994). Исходя из структуры кора ЛПС клеток К coli D21 можно было ожидать, что их клеточная поверхность будет белее электроотрицательной. Выполненные нами электрокинетические измерения клеток двух штаммов при значении pH 4,6, Dpa котором различия по ЭФП клеток двух штаммов наиболее выражены, показали, что абсолютные величины значений ЭФП клеток Е, coli JM 103 были достоверно больше, чем у клеток Е coli D21 (рис. 7). Эти результаты позволяют
яквдяивю ¡ил.е
предположить, что больший отрицательный заряд на поверхности клеток иггамма Е. coli JM 103 может быть обусловлен большим в сравнении с Е. coli D21 количеством ЛПС в клеточной стенке и, соответственно, большей плотностью их упаковки во внешней мембране.
.ljl 41 .и .'I j .at
Рнс. 9, Типичные гистограммы распределения ЭФП клеток культур Rb. capsulatum PG и Rb. capsulatus BIO.
is 14
a в
А 2
0
J
т_■
•It At
ЯищхшшГа |М4в
.17 -л ед
Из типичных гистограмм распределения значений ЭФП клеток двух штаммов Rb. capsulatum (рнс. 9), видно, что популяции клеток исследуемых культур имели нормальное одномодульное распределение по этой характеристике. Дисперсия значений ЭФП клеток для обоих штаммов связана с присутствием в популяция клеток, находящихся на различных фазах роста, аналогично клеткам Е. coli. Сдвиг гистограммы распределения ЭФП клеток Rb. capsulatum BIO в область больших абсолютных величин ЭФП по сравнению с клетками Rb.
capsulatus PG обусловлен присутствием в составе их клеточной стенки ЛПС с укороченной структурой (Гремякова, 1996).
Таким образом, установлено, что электроповерхностные свойства клеток определяются структурой ЛПС, формирующих хемотип бактерий Äb. capsulatus и Е. coli. 3. Исследование влияния факторов роста на состав ЛПС клеток Rb. capsulatus PC Остается открытым вопрос о влиянии внешних факторов -на биосинтез полной структуры молекулы ЛПС фототрофшах бактерий. В качестве модифицирующих факторов использовали условия освещенности и состав среды. Спектры поглощения суспензии клеток использовались нами для оценки количественной (оптическая плотность суспензии) и качественной (положение максимумов поглощения) характеристики клеток (Dieistein & Drews, 1974). Характеристикой роста клеток является скорость их деления, которая зависит
от условий культивирования. Известно, что деление клеток сопровождается высвобождением ЛПС в среду роста. Нами было показано, что в оптимальных условиях роста высвобождение ЛПС в среду пропорционально скорости роста клеток Rb. capsulatus PG, и что максимальная скорость высвобождения ЛПС наблюдалась в экспоненциальной фазе роста культуры (рис. 10).
Известно, что максимальная скорость роста Rb. capsulatus. наблюдается в фотогетеротрофных анаэробных условиях (Цыганков и Гоготов, 1990), Клетки Rb. capsulatus способны расти также т^теротрофно (в темноте) ван аэробных условиях в присутствии глюкозы или других органических соединений, переключаясь с фотосинтеза на получение энергии в результате брожения или анаэробного дыхания (Madigan & Gest, 1978). f
Контролем роста клеток служила оптическая плотность исходных клеток при 650 им, помещенных в темноту на среду роста, не содержащую органических соединений. Эти условия обеспечивали выживание клеток без их деления или гибели в течение эксперимента (5 сут). Содержание ЛПС в среде роста определяли с помощью колориметрического метода с карбоциаянновым красителем (Janda&Work, 1971).
Обогащение среды органическими веществами, а затем малатом в темяовых условиях приводило к незначительному увеличению концентрации ЛПС в культуряльной жидкости.
Рнс. 10. Зависши ость количества высвободившихся ЛПС (мкг/мл) (кривая 2) от фазы роста бактерий Rb. capsulatus PG (кривая 1) в фотогетеротрофных условиях.
Таблица 1. Влияние условий культивирования ЛЬ. сарш!агш Рй на оптическую плотность
Состав среды по Хатверу Свет Темнота
Содержание ЛПС, мкг/мл Омо Содержание ЛПС, мкг/мл О«»
Полная 98 ±15 0.77 50 ±8 039
Без малата 66 ± 13 0.61 26 ± б 0.37
Без органических добавок 39 ±5 0.45 23 ±6 0.35
Рис. 11. Спектры поглощения комплексов карбоцианина с ЛПС из клеток КЬ. сарЫашз Рб, культивированных на полной среде Хатнера на свету (7) и в темноте (2).
Аналогичное обогащение среды на свету увеличивало высвобождение ЛПС из клеточной стенки бактерий в 1.7 и в 2.5 раза, соответственно (табл. 1).
Из данных таблицы видно, что максимальное содержание высвободившихся ЛПС наблюдалось у бактерий, растущих на свету на полной среде. Влияние условий роста отражалось не только на количестве, но и на составе ЛПС, что проявлялось в положении максимумов поглощения комплекса ЛПС-карбоцнанин.
Спектры поглощения комплексов карбоцианина с ЛПС из клеток, выращенных в фотогетеротрофных условиях, имели не только максимальное поглощение, ко в наиболее длинноволновое положение (465 нм) по сравнению с ЛПС из клеток, культивируемых на обедненной среде или без света (455 км) (рис. П). Таким образом, нами показано, что ухудшение условий культивирования может влиять не только на скорость роста н высвобождение ЛПС, но и на их состав. Для подтверждения этого предположения нами были получены
антитела (АТ) против полной структуры ЛПС и АТ против его поли сахар идного фрагмента. Таблица 2. Влияние состава среды на содержание ПС в составе ЛПС
Состав среды по Хатнеру Содержание ПС в ЛПС, %
Полная 75
Без малага 50
Без органических добавок 37
Количественный вклад ПС в состав высвободившихся ЛПС в зависимости от заданных условий культивирования клеток был оценен с помощью метода иммунно-ферментного анализа (ИФА) на, нитроцеллюлозе с использованием АТ к ЛПС и его ПС-фрагменту. Из полученных нами/с помощью ИФА данных следует, что ухудшение условий роста на свету по составу среды приводит к уменьшению доли ПС-фрагмента в ЛПС (табл. 2).
Изменения состава и распределения ЛПС в клеточной стенке бактерий, культивированных в разных условиях роста, подтверждено также методам иммунной электронной микроскопии. Применение метода одновременного двойного маркирования антителами против ЛПС и ПС с использованием частиц золота разного размера (5 и 15 нм) подтвердило влияние условий культивирования клеток на состав ЛПС (рис. 12). На электронных микрофотографиях видно, что максимальное соотношение между количеством частиц золота, связанных с АТ прошв ПС-фрагмента и с АТ против полной молекулы ЛПС, наблюдалось в клеточной стенке бактерий, выращенных на свету на полной среде Хатнера. У темновых клеток количество АТ к ПС значительно уменьшалось, что свидетельствовало об уменьшении доли ПС в составе ЛПС.
Рис. 12. Распределение ЛПС и ПС в клеточной стенке бактерии Rb. capsulatus, культивированной на свету (А) и в темноте (Б), определенное методом двойного иммуномаркирования, ЛПС —РгА-Аи (5 нм); ПС - Рг А-Аи (15 нм). .
Результаты исследований электрофоретических свойств клеток Rb. capsulatus PG, выращенных в разных условиях представлены на рис. 13 в виде гистограмм распределения ЭФП клеток. Анализ представленных результатов показал, что ухудшение условий роста бактерий приводило как к увеличению отрицательного значения ЭФП клеток, так и к изменению в характере гистограмм распределения ЭФП в сравнении с клетками, выращенными в фотогегерсярофных условиях, что также может свидетельствовать о синтезе ЛПС укороченной структуры в обедненных условиях культивирования.
Свет» полны среди
- i 11 ■
Jf -al 4*
ЭФП, мкм/cfк/В/см
TlMMOTt, пешни Epes«
Полученные результаты показывают, что на свету в оптимальных фотогетеротрофных условиях роста высвобождение эндотоксинов в среду происходит за счет активного деления клеток.
Ухудшение условий роста сопровождается не только понижением выхода ЛПС в среду, но и подавлением синтеза полной структуры ЛПС, иначе говоря, меняя условия роста фототрофных бактерий можно влиять на изменение состава ЛПС их клеточной стенки.
4. Влияние хемотипа бактерий на высвобождение ЛПС из клеточной стенки Rb. capsulatum PG и Е. coli под действием различных белков плазмы крови
ä-i Свободные эндотоксины играют важную
] роль в патогенезе эндотоксинового шока. Нами
были проведены исследования влияния белков острой фазы воспаления - лизоцима и лактоферрина, на высвобождение ЛПС из клеточной стенки Rb. capsulatum PG и двух штаммов Е coli. Выбор белков обусловлен их антибактериальными свойствами, а также тем, что лизоцим и лактоферрин, являясь катонными белками, прочно связываются со свободными эндотоксинами, нейтрализуя их биологическую
активность.
Для изучения влияния хемотипа бактерий на высвобождение ЛПС необходимо были бактерии,
Л SÍ -tt
ЭФП, мкы№екШ/см
Cae?; среда без оргвнига
.Iii
« в.1 ií -w -м в* ЭФП, wguifcaWBJfcH
Рис, 13. Гистограммы распределения ЭФП клеток Rb. capsulatum PG в изменяющихся условиях культивирования, pH 7.0.
ЛПС которых различались бы не только наличием полисахаридного фрагмента, во и структурой кора. Классическим объектом в таких исследованиях является бактерия Е. coli. В нашем распоряжении имелось два штамма Е. coli, не имеющих О-актнгсна и различающихся по структуре кора: гаг, JM103, относящийся к Re-хвмотшзу и шт. D21 - Ra-хемотнп. В качестве бактерии, ЛПС которой имеет в своей структуре полисахарвдный фрагмент, мы использовали фототрофную бактерию Üb. capsutatus PG. Такой выбор был правомерен, поскольку, как отмечалось выше, бактерии Rb. capsulatum и Е. coli имеют общую организацию клеточной стенки. Результаты по высвобождению ЛПС из бактерий
различных хемотипов под действием лизоцима я лактоферрина представлены в таблице 3. Из данных таблицы видно, что количество высвободившихся ЛПС в контрольных клетках зависит от хемотипа бактерий и увеличивается с удлинением структуры ЛПС. Можно предположить, что усеченная структура молекул ЛПС обеспечивает более плотную упаковку в клеточной мембране, что согласуется с данными по ЭФП клеток (гл. 2). Наличие полного сахаридного кора (Яа-хемоткп) и О-аншгена (Э-хемотап) делает упаховку ЛПС более рыхлой, что способствует более легкому высвобождению ЛПС то клеточной стенки.
Таблица 3. Влияние белков плазмы крови на высвобождение ЛПС из клеточкой стенки Rb. capsulatus PG и Е. coli.
Белок Концентрация белка, мкг/мл Количество ЛПС, высвободившихся из клеток, мкг/мл
Re-хвмотил £ coli IM 103 Ra-хемотип £ coli D21 SR-хемотид Rb. capsulatum PG
Контроль - 3,5 63 15,2
Лизощим 150 3,85 8,82 20,7
Лактоферрии 100 11,9 18,9 18,6
Количество высвободившихся ЛПС при инкубации с лизоцимом возрастало от Re- к SR-хемотипу, Высвобождение ЛПС при инкубации с лактоферрииом имело близкие значения для Ra- и SR-хемотипоа и более низкие значения для Re-хемотипа. Поскольку в контроле у различных хемотипов бактерий высвобождалось различное
количество ЛПС, для удобства сравнения эффектов белков на клетки разных хемотипов К сой результаты экспериментов представлены в виде гистограмм, на которых концентрации ЛПС в контроле приняты за единицу. Из результатов, представленных на рис. 14 видно, что количество ЛПС, высвободившееся под влиянием лизоцима, было сравнимо с контролем в случае клеток £ coli JM 103 и в Г.4 раза превышало контрольные значения у клеток К coli D21. Лактоферрия увеличивал высвобождение ЛПС по сравнению с контролем в 3 раза для Е, coli D21 и в З.б раза дня Е. coli JM 103.
fieeiBIl Е «UM 103 DK
Рис. 14. Влияние белков крови на количество ЛПС, высвободившихся из клеток Е. coli D21 и £ co/i JM 103.1 —контрольные клетки, 2 - 4-лизоцнм, 3 - +лактоферрин, .
Известно, что белки сыворотки крови высвобождают до 30% ЛПС клеточной стенки (ТезсЬ е! а!. 1988). Представляло интерес выяснить - как повлияет высвобождение ЛПС под действием различных белков на жизнеспособность клеток. Это возможно оценить по количеству колоннеобразующих единиц (СШ) после инкубации клеток с белками плазмы крови по сравнению с контрольными клетками.
Е.№ЙЬ21
Пробн
Подсчет количества CFU показал, что под действием исследованных белков
величина CFU значительно снижалась по сравнению с контрольными клетками (рис. 15). Наиболее заметный эффект по подавлению роста колоний на Е, coli D21 (Ra-хемотип) оказывал белок лшоцим (в б.б раза по сравнению с контролем). Для
Рнс. 15. Влияние белков крови на формирование колоннеобразующих единиц клетками Е. coli D21 и Е. coli IM 103.1 - контрольные клетки, 2-+ЛИ30ЦИМ, 3 - +лактоферрян.
Е. coli JM 103 это значение снижалось в 3 раза. Катионный белок лактоферрин снижал значение CFU на клетках Ке-хемотипа в 4 раза и в 3.3 раза по сравнению с контролем на клетках с Ra-структурой кора ЛПС.
Меньшее высвобождение ЛПС из клеток Re-хемотипа, чем из клеток с Ra-структурой кора при действии лизоцима мы можем объяснить различной плотностью упаковки ЛПС а клеточной стенке бактерий двух хемогипов. Лизоцам для разрушения пептидогликанового слоя должен проникнуть через внешний лепесток внешней мембраны, который труднее преодолеть в клетках с более плотной упаковкой ЛПС, предполагаемой нами для Re-хемотипа бактерий (гд. 2). Действительно, из этих клеток высвобождалось наименьшее количество ЛПС (рис, 14, табл. 3).
Известно, что лактоферрин взаимодействует с грамотрицательными бактериями по иному, чем лизоцим механизму. Он связывается с белками-поринами, входящими в состав клеточной стенки грамотрицатеяьных бактерий. При связывании поринов с лактоферрином ослабляется связь между этими белками и молекулами эндотоксинов, результатом чего является высвобождение ЛПС в среду (Erdei et ah, 1994). Показано, что степень взаимодействия лактоферрина с клеточной поверхностью увеличивается при переходе от S-к R-структуре ЛПС у Е. coli Н10407 (Gado et al„ 1991). Предполагается, что О-цепи ЛПС экранируют поривы, защищая их от взаимодействия с лактоферрином (Erdei et al,, 1994).
Полученные нами результаты показали, что сахара кора клеток Ка-хемотипа затрудняют доступ лактоферрина к поринам, по сравнению с коротким кором клеток Re-хемотипа. Кроме того, поверхность клеток Е. coli JM 103 более электроотрицательна, чем у клеток Е coli Ш1, О чем свидетельствовали алектрофоретическне измерения (рис, 8). Этот фактор также способствует лучшему взаимодействию этих бактерий с катонным белком, каковым является лактоферрин. В результате под действием лакгоферрииа из клеток Re-хемотипа высвобождалось больше ЛПС, я сильнее подавлялся рост колоний (рис. 14,15).
Проанализировав результаты экспериментов по высвобождению ЛПС из клеточной стенки бактерий и образованию CFU, можно предположить, что взаимодействие лакгоферрииа с клетками Е. coli осуществляется по механизму, при котором высвобождение ЛПС пропорционально снижает жизнеспособность клеток. При действии физиологических концентраций лизоцима на клетки Е coli подавление роста колоний не связано с повреждением внешнего лепестка мембраны и высвобождением ЛПС из клеточной стенки бактерий. Совокупность полученных вами результатов свидетельствует о том, что в механизмах взаимодействия исследованных белков с клеточной стенкой хемотип бактерий играет существенную роль.
ВЫВОДЫ
1. Установлена принадлежность бактерий Rb. capsulatum BIO к R-, a Rh. capsulams PG к SR-хемотипу,
2. Показано, что условия культивирования фототрофной бактерии Rb. capsulatus PG влияют на формирование состава ЛПС клеточной стенки.
3. "Установлено, что электршговерхноетные свойства клеток определяются структурой ЛПС, формирующих хемотип неотрицательных бактерий.
4. На основании полученных величин ЭФП клеток и степени высвобождения из них ЛПС под воздействием лизоцима установлено, что разные хемотипы Е. coli различаются плотностью упаковки молекул ЛПС в клеточной стенке.
5. Показано, что коровая часть молекулы ЛПС влияет на взаимодействие лизоцима и лакгоферрииа с клеточной стенкой грамотрицатеяьиых бактерий,
6. Установлено, что жизнеспособность клеток после контакта с катяонными белками определяется не количеством высвободившихся ЛПС, а механизмом повреждения клеточной стенки.
7. Впервые показана возможность применения карбоцианинового красителя для определения ЛПС различной структуры колориметрическим методом.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:
1. Зубова C.B., Кабанов Д.С., Дряглева ИД., Прохоренко И.Р., Грачев С. В. Липополисахариды из фототрофньи бактерий - потенциальные антагонисты эндотоксинов. Материалы международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». Саранск, изд. Мордовского университета. Сборник тезисов, 181-182 (2001).
2. Grachev S.V., Prokhorenko LR., Gragdankin ЕВ., Muraschcv AJÍ., Vinokürov M.G., Jurinskaja MAL, Zubova S.V., Dryagleva ID., Kustanova G.A., Kosjaiova N.I. Structure of endotoxin influences the vascular system of rats. Acta Phisiologaca Hungarica, 1(1-3), 293 (2002).
3. Прохоренко ИР., Белков ДА., Зубова C.B., Дряглева ИД., Грачев C.B., Косякова RH. Роль различных белков крсши в высвобождении эндотоксинов из клеточной стенки бактерий. VII Всероссийский научный Форум с международным участием имени академика В.НИоффе «Дай иммунологии в Санкт-Петербурге». Медицинская иммунология, 5(3-4), 213-214 (2003).
4. Прохоренко И.Р., Зубова СВ., Белков Д.А., Прохоренко C.B., Грачев C.B. Исследование различных факторов, влияющих на высвобождение эндотоксинов из клеток Rhodobaeter capsúlalas so внешнюю среду. Материалы юбилейной научно-практической конференция, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА нм. И.М.Сеченова «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико — лабораторное обеспечение инфехтолопш». Москва. Тезисы научных докладов, 148-150(2003).
5. Белков Д.А-, Зубова C.B. Роль отдельных белков крови в высвобождении эндотоксинов яз клеточной стенки Rhodobaeter capsula tus. Ш Конференция молодых ученых Россия с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 20-24 января. Сборник тезисов, 248 (2004)..
6. Прохоренко И.Р., Винокуров MP., Юринская М.М., Кабанов Д.С., Гражданкин Е.Б., Кустакова Г.А., Зубова C.B., Прохоренко C.B., Волошина Е.В., Грачев C.B. Изучение запретного действия нетоксичных ЛПС от эффектов эндотоксинов в экспериментах in vivo я in vitro. I Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Москва, 26-28 октября. Сборник тезисов, 159 (2004).
7. Трофимов В.А., Прохоренко И.Р, Аксенова О.Н., Зубова C.B., Грачев СВ. Изменение состава липидов мембран макрофагов белых мышей, индуцированного разными липополисахарвдами. Третий Российский конгресс по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем». Москва, 9-12 ноября. Материалы конгресса, 144-145 (2004).
8. Грачев C.B., Прохоренко И.Р., Винокуров М.Г., Гражданкин Е.Б., Зубова CS., Кабаноа Д.Б., Кустакова Г.А., Прохоренко C.B. Исследование антагонистических активностей липополисахарида из Rhodobaeter в целях создания препаратов для лечения эндотоксинового шока. Конференция «Фундаментальные науки -медицине». Программа фундаментальных исследований Президиума РАН. Москва, 2-3 декабря. Тезисы докладов, 172-173 (2004).
9. Зубова C.B., Прохоренко И.Р. Влияние хемотша бактерий на высвобождение ЛПС из клеточной стенки Escherichia coli под действием различных белков плазмы крови. Вторая международная научно-практическая конференция Медбиотек-2 «Перспективы развития биотехнологии в России». Пущино, 1-2 декабря. Материалы конференции, 25-26 (2005).
10. Зубова C.B., Мелцер М., Прохоренко И .Р. Влияние внешних факторов иа состав высвобождающихся лкпополисахаридов из клеточной стенки Rhodobaeter capsulatum. Известия Академии наук. Серия биологическая, (2), 168-173 (2005). (Biology Bulletin. 32(2), 133-137(2005)).
11. Прохоренко ИЛ*., Зубова СВ., Прохоренко C.B., Андреева. JLA., Косякова Н.И. Влияние хемотипа Escherichia coli на взаимодействие с острофазными бедками крови. ХШ Российский национальный конгрессе «Человек и лекарство». Москва, 3-7 апреля. Материалы конгресса, 679 (2006).
12. Зубова C.B., Прохоренко И.Р. Применение колориметрического метода для определения лишмюлнсахарвдов различной структуры. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 141(6), 718-721 (2006).
Принято к исполнению 14/11/2006 Исполнено 14/11/2006
Заказ № 920 Тираж: 100 экз.
Типография «11-й ФОРМАТ» ШШ 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш,, 36 (495) 975-78-56 т^лпл'.зШдге ferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зубова, Светлана Владимировна
Список условных сокращений.
Введение.
I. Обзор литературы.
1. Генетическая связь между фототрофными и другими грамотрицательными бактериями.
2. Биосинтез липополисахаридов.
2.1. Структура и биосинтез липида А.
2.1.1. Регуляторные пути для модификации липида А.
2.2. Структура и биосинтез олигосахаридов кора.
2.2.1. Хемотипы бактерий.
2.2.2. Роль кора в стабильности внешней мембраны: глубокий
R-хемотип.
2.3. Структура и биосинтез О-антигена.
2.3.1. Транспорт ЛПС из внутренней во внешнюю мембрану.
2.3.2. Серотипы бактерий.
3. Электроповерхностные свойства грамотрицательных бактерий.
4. Высвобождение липополисахаридов из клеточной стенки бактерий.
4.1. Участие белков плазмы крови в высвобождении ЛПС из клеточной стенки бактерий.
II. Материалы и методы исследования.
Материалы.
Объекты исследований.
1. Культивирование клеток.
1.1. Культура клеток Rb. capsulatus.
1.2. Культура клеток Е. coli.
2. Метод агглютинации клеток по Линдбергу.
3. Регистрация спектров поглощения клеток Rb. capsulatus.
4. Иммунная электронная микроскопия клеток Rb. capsulatus PG.
5. Определение электрофоретической подвижности клеток (ЭФП).
6. Выделение липополисахаридов из биомассы бактерий и определение их качественного состава.
6.1. Получение ЛПС из клеток Rb. capsulatus.
6.2. Получение полисахаридного фрагмента из ЛПС Rb. capsulatus методом гидролиза.
6.3. Получение ЛПС из клеток Е. coli.
6.4. Определение чистоты препаратов ЛПС.
6.5. Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза.
7. Получение антител против ЛПС и ПС из Rb. capsulatus PG.
8. Иммунно-ферментный анализ определения ЛПС.
9. Колориметрический метод определения ЛПС с карбоцианиновым красителем.
10. Определение содержания КДО в препаратах ЛПС по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой.
11. Инкубация клеток Rb. capsulatus PG и Е. coli различных хемотипов с белками плазмы крови.
12. Определение количества колониеобразующих единиц у клеток Е. coli после инкубации с белками плазмы крови.
III. Результаты и их обсуждение.
1. Определение хемотипа бактерий Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG.
1.1. Характеристика ЛПС из разных штаммов Rb. capsulatus.
1.1.1. Изучение возможностей применения колориметрического метода для определения ЛПС различной структуры.
1.1.2. Сравнительный анализ содержания КДО в препаратах ЛПС из разных штаммов Rb. capsulatus.
1.1.3. Сравнительный анализ состава ЛПС различных штаммов Rb. capsulatus методом электрофореза в полиакриламидном геле.
2. Исследование электроповерхностных свойств клеток Rb. capsulatus и Е. coli различных хемотипов.
3. Исследование влияния факторов роста на состав ЛПС клеток
Rb. capsulatus PG.
4. Влияние хемотипа бактерий на высвобождение ЛПС из клеточной стенки Rb. capsulatus PG и Е. coli под действием различных белков плазмы крови.
Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние состава липополисахаридов на характеристики клеточной стенки бактерий"
Многие тысячелетия человек сосуществует на Земле с патогенными микробами, и лишь на рубеже XIX-XX веков был достигнут решающий перелом в борьбе с болезнями, вызываемыми микроорганизмами.
Актуальной современной проблемой остается ухудшение эпидемиологической обстановки, в частности, увеличение количества больных с грамотрицательной бактериемией. При заражении грамотрицательными бактериями возрастает опасность осложнений, которые могут привести к эндотоксиновому шоку, причиной развития которого являются липополисахариды (ЛПС). ЛПС - основная структурная единица внешней мембраны грамотрицательных бактерий (Nikaido & Vaara, 1987).
Токсической составляющей ЛПС является липид A (Westphal & Luderitz, 1954). Длина и состав кора и полисахаридного фрагмента ЛПС определяют хемотип бактерий.
Сравнительные определения последовательностей нуклеотидов 16S рРНК (Woese, 1987) обнаружили неизвестную ранее филогенетическую связь между фототрофными (Pseudomonas, Rhodobacter) и другими грамотрицательными бактериями, такими как Neisseria, Escherichia, Salmonella и др., что позволило расширить границы исследований и возможности модифицировать факторы, влияющие на рост грамотрицательных бактерий. Представители класса Proteobacteria имеют принципиальные различия по морфологии, физиологии, экологии и взаимоотношениям с другими формами жизни. Однако все они характеризуются общей организацией клеточной оболочки, макромолекулярными компонентами которой являются пептидогликан, липопротеины, порины, фосфолипиды, а также ЛПС, занимающие две трети клеточной поверхности (Weckesser et al., 1979). Физико-химический состав и структура клеточной стенки бактерий являются определяющими во взаимодействии с разнообразными факторами внешней среды. Поверхностный заряд, создаваемый структурными компонентами клеточной стенки, влияет на взаимодействие бактериальных клеток с антибиотиками, детергентами и биологически активными молекулами (Bayer & Sloyer, 1990). ЛПС проявляют различные виды биологической активности только в свободном состоянии (Mayeux, 1997). На высвобождение ЛПС из бактерий могут влиять как свойства самой клетки - ее жизнеспособность, структура и заряд клеточной стенки, так и внешние факторы, такие как условия роста бактерий и различные внешние агенты. Исследования по этим вопросам носят скорее отрывочный, чем систематический характер. Имеющиеся в литературе данные получены для различных бактерий и штаммов без прослеживания логической связи объектов исследования.
Актуальность проблемы
Весьма актуальным является изучение зависимости электроповерхностных свойств бактериальных клеток от таких важных характеристик клеточной стенки, как хемотип, поверхностный заряд, плотность упаковки ЛПС в клеточной стенке. Это важно знать для понимания процессов, происходящих при взаимодействии бактерий с катионными белками и антибиотиками, а также при оценке возможной адгезивной и антигенной активности бактерий. Полученные данные могут иметь решающее значение при антибактериальной терапии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение влияния состава ЛПС на электроповерхностные характеристики некоторых представителей грамотрицательных бактерий в различных условиях окружающей среды и их способности взаимодействовать с катионными белками плазмы крови в зависимости от хемотипа.
Были поставлены следующие задачи:
- определить хемотип бактерий штаммов Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG, a также состав ЛПС, формирующих их клеточную стенку;
- изучить влияние факторов роста (состав среды и условия освещенности) на состав ЛПС клеточной стенки и хемотип клеток Rb. capsulatus;
- провести сравнительное исследование электроповерхностных свойств клеток Rb. capsulatus и Е. coli различных хемотипов;
- изучить роль некоторых белков плазмы крови в высвобождении эндотоксинов из клеточной стенки в зависимости от хемотипа бактерий на примере Е. coli и Rb. capsulatus.
Научная новизна
Впервые определены неописанные ранее хемотипы фототрофных бактерий Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG.
Впервые показано влияние состава ЛПС на электроповерхностные свойства фототрофных бактерий Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG.
Установлена зависимость взаимодействия белков крови с бактериями не только от их хемотипа, но и плотности упаковки ЛПС в клеточной стенке, которая определяется коровой частью ЛПС.
Научно-практическая значимость
Полученные в настоящей работе результаты по взаимодействию белков плазмы крови с грамотрицательными бактериями различных хемотипов представляют не только теоретический, но и практический интерес, поскольку имитируют процесс, который может реализоваться у больных с грамотрицательной бактериемией. Полученные результаты могут иметь решающее значение при антибактериальной терапии.
Впервые показана возможность практического применения колориметрического метода с карбоцианиновым красителем для определения ЛПС различной структуры и установления хемотипа бактерий.
Основные положения, выносимые на защиту
Методические подходы определения структуры ЛПС и хемотипа грамотрицательных бактерий.
- Факторы внешней среды влияют на состав и высвобождение ЛПС из клеточной стенки клеток Rb. capsulatus PG.
- Хемотип бактерий Rb. capsulatus и Е. coli влияет на электроповерхностные свойства клеток.
- Хемотип бактерий играет ведущую роль в высвобождении эндотоксинов из клеточной стенки Rb. capsulatus PG и Е. coli под действием белков плазмы крови.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001 г.), на VII Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003 г.), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М.Сеченова «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (Москва, 2003 г.), на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004 г.), на I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004 г.), на III Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004 г.), на Конференции «Фундаментальные науки - медицине» Программа фундаментальных исследований Президиума РАН (Москва, 2004 г.), на II международной научно-практической конференция Медбиотек-2 «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005 г.), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых Российских журналах и одна статья принята в печать.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 206 источников. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками и 8 таблицами.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зубова, Светлана Владимировна
ВЫВОДЫ
1. Установлена принадлежность бактерий Rb. capsulatus В10 к R-, a Rb. capsulatus PG к SR-хемотипу.
2. Показано, что условия культивирования фототрофной бактерии Rb. capsulatus PG влияют на формирование состава ЛПС клеточной стенки.
3. Установлено, что электроповерхностные свойства клеток определяются структурой ЛПС, формирующих хемотип грамотрицательных бактерий.
4. На основании полученных величин ЭФП клеток и степени высвобождения из них ЛПС под воздействием лизоцима установлено, что разные хемотипы Е. coli различаются плотностью упаковки молекул ЛПС в клеточной стенке.
5. Показано, что коровая часть молекулы ЛПС влияет на взаимодействие лизоцима и лактоферрина с клеточной стенкой грамотрицательных бактерий.
6. Установлено, что жизнеспособность клеток после контакта с катионными белками определяется не количеством высвободившихся ЛПС, а механизмом повреждения клеточной стенки.
7. Впервые показана возможность применения карбоцианинового красителя для определения ЛПС различной структуры колориметрическим методом.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зубова, Светлана Владимировна, Пущино
1. Воскун С.Е., Новикова Л.Ф., Голубев О.А. Адгезивные свойства S- и R-мутантов Salmonella minnesota в процессе периодического культивирования. ЖМЭИ, 1992,1,5-7.
2. Гауроветц Л.А. Иммунохимия и синтез антител. М.: Мир, 1969. -257 с.
3. Гремякова Т.А., Фомченков В.М., Фурсова Н.К., Волковой К.И. Сравнительная характеристика физико-химических свойств липополисахаридов Yersinia pestis и R-мутантов энтеробактерий. Микробиология, 1996, 65(6), 763-767.
4. Гузев B.C., Голубев В.И., Звягинцев Д.Г. Обнаружение микрокапсул у микроорганизмов и контролирование полноты их декапсулирования методом микроэлектрофореза. Микробиология, 1972,41(1), 115-120.
5. Гузев B.C. и Звягинцев Д.Г. Микроэлектрофорез в микробиологии. Микробные метаболиты. М.: Изд-во МГУ, 1979,150-164.
6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. -544 с.
7. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М.: Изд-во МГУ, 1976, 61-70.
8. Егорова Т.П., Глебовская Е.П., Левенсон В.И. Применение колориметрического метода определения липополисахарида в иммунологических исследованиях. Иммунология, 1988, 4, 79-82.
9. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенных бактерий. М., Наука. 1977, 181205.
10. Иванов А.Ю. и Фомченков В.М. Зависимость повреждающего действия поверхностно-активных веществ на клетки Escherichia coli от фазы роста культуры. Микробиология. 1989, 58,969-975.
11. Книрель Ю.А. и Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А. Биохимия. 1993, 58(2), 166-168.
12. Книрель Ю.А. и Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора. Биохимия. 1993, 58(2). 182-201.
13. Кульшин В.А., Яковлев А.П., Аваева С.Н., Дмитриев Б.А. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий. Мол. генетика. 1987, (5), 44-46.
14. Махнева З.К., Вишневецкая Т.А., Прохоренко И.Р. Влияние метода выделения на выход и состав липополисахаридов из фотосинтезирующих бактерий. Прикл. биохимия и микробиология. 1996, 32(4), 444-447.
15. Мирошников А.И., Фомченков В.М., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ и разделение клеток. М.: Наука, 1986. - 184 с.
16. Прохоренко И.Р. Особенности биологической активности липополисахарида из фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus В10. Дис. . докт. биол. наук. М.: ММА им. И.М. Сеченова, 1999. - 175 с.
17. Цыганков А.А. и Гоготов И.Н. Получение биомассы пурпурных бактерий. Прикл. биохимия и микробиология. 1990, 26(6), 819-824.
18. Шеппе Г., Шютт В., Унгер Р. Результаты использования автоматизированного микроскопа для электрофореза частиц «Пармоквант». Йенское обозрение. 1978, (5/6), 232235.
19. Adler К. Simple tools and approved techniques in cryopreparation of biological samples in SEM and TEM-investigations. In: Electron Microscopy. (L. Megias-Megias, M.I. Rodriguez-Garcia, A. Rios, J.M. Arias Eds.). Granada, Spain, 1992, 3, 51-52.
20. Allen A.G., Isobe Т., Maskell D.J. Identification and cloning of waaF (rfaF) from Bordetella pertussis and use to generate mutants of Bordetella spp. with deep rough lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 1998,180(1), 35-40.
21. Amber R.P., Daniel M., Hermoso I., Meyer Т., Bartch R.G., Kamen M.D. Cytochrome C2 seguence variation among the recognized species of purple non-sulfur photosynthetic. Nature. 1979,278, 659-660.
22. Amor K., Heinrichs D.E., Frirdich E., Ziebell K., Joohnson R.P., Whitfield C. Distribution of core oligosaccharide types in lipopolysaccharides from Escherichia coli. Infection and Immunity. 2000, 68(3), 1116-1124.
23. Anderson M.S. & Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A precursors in Escherichia coli: a cytoplasmic acyltransferase that converts UDP-N-acetylglucosamine to UDP-3-0-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine. J. Biol. Chem. 1987, 262, 5159-5169.
24. Andra J., Lohner K., Blondelle S.E., Jerala R., Moriyon I., Koch M.H.J., Garidel P., Brandenburg K. Enhancement of endotoxin neutralization by coupling of a C12-alkyl chain to a lactoferricin-derived peptide. Biochem. J. 2005, 385,135-143.
25. Antonini G., Rossi P., Pitari G., Marchetti M., Superti F., Valenti P. Role of glycan chains in bovine lactoferrin. In: Lactoferrin: structure, function and applications. (K. Shimakaki, H.
26. Tsuda, M. Tomita, Т. Kuwata, J.P. Perraudin Eds.). Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands. 2000, p. 3-16.
27. Appelmelk B.J., An Y.Q., Geerts M., Thijs B.G., de Boer H.A., MacLaren D.M., de Graaf J., Nuijens J.H. Lactoferrin is a lipid A-binding protein. Infect. Immun. 1994, 62,2628-2632.
28. Babinski K.J. & Raetz C.R.H. Identification of a gene incoding a novel Escherichia coli UDP-2,3-diacylglucosamine hydrolase. FASEB J. 1998,12, L 63.
29. Baker E.D. & Lindley P.F. New perspectives on the structure and function of transferrins. J. Inorg. Biochem. 1993, 47,147-160.
30. Baveye S., Elass E., Mazurier J., Spik G., Legrand D. Lactoferrin: a multifunctional glycoprotein involved in the modulation of the inflammatory process. Clin. Chem. Lab. Med. 1999,37, 281-286.
31. Bayer M.E. & Sloyer J.L. The electrophoretic mobility of gram-negative and gram-positive bacteria: an electrokinetic analysis. J. Gen. Microbiol. 1990,136, 867-874.
32. Bayston K.F. & Cohen J. Bacterial endotoxin and current concepts in the diagnosis and treatment of endotoxemia. J. Med. Microbiol. 1990, 31, 73-83.
33. Beamer L.J., Carroll S.F., Eisenberg D. Crystal structure of human BPI and two bound phospholipids at 2.4 angstrom resolution. Science (Reports). 1997, 276, 1861-1864.
34. Bennet R.M. & Mohla C. A solid phase radioimmunoassay for the measurement of lactoferrin in human plasma: variation with age, sex, and disease. J. Lab. Clin. Med. 1976, 88, 156-166.
35. Beveridge T.J. & Graham L.L. Surface layers of bacteria. Microbiol. Rev. 1991, 55, 684-705.
36. Bishop R.E., Gibbons H.S., Guina Т., Trent M.S., Miller S.I., Raetz C.R.H. Transfer of palmitate from phospholipids to lipid A in outer membranes of gram-negative bacteria. EMBO J. 2000,19, 5071-5080.
37. Boman H.G., Monner D.A. Characterization of lipopolysaccharides from Escherichia coli K-12 mutants. J. Bacteriol. 1975,121(2), 455-464.
38. Brade H., Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. Endotoxin in Health and Disease. New York: Marcel Dekker, Inc. 1999. 950 pp.
39. Brandenburg K., Koch M.H.J., Seydel U. Biophysical characterization of lysozyme binding to LPS Re and lipid A. Eur. J. Biochem. 1998, 258, 686-695.
40. Brozek K.A. & Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A in Escherichia coli. Acyl carrier protein-dependent incorporation of laurate and myristate. J. Biol. Chem. 1990, 265(26), 1541015417.
41. Brozek К. A, Bulawa C.E, Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A precursors in Escherichia coli. A membrane-bound enzyme that transfers a palmitoyl residue from a glycerophospholipid to lipid X. J. Biol. Chem. 1987, 262, 5170-5179.
42. Bulawa C.E. & Raetz C.R.H. The biosynthesis of gram-negative endotoxin: identification and function of UDP-2,3-diacylglucosamine in Esccherichia coli. J. Biol. Chem. 1984, 259, 4846-4851.
43. Carty S.M, Sreekumar K.R, Raetz C.R.H. Effect of cold shock on lipid A biosynthesis in Escherichia coli. Induction At 12 degrees С of an acyltransferase specific for palmitoleoyl-acyl carrier protein. J. Biol. Chem. 1999, 274, 9677-9685.
44. ChenT.-J, LeiM.-G, Suzuki T, MorrisonD.C. Lipopolysaccharidereceptors and signal transduction pathways in mononuclear phagocytes. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992, 181, 169-188.
45. Clementz T. & Raetz C.R.H. A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing. J. Biol. Chem. 1991,266(15), 9687-9696.
46. Clementz T, Zhou Z, Raetz C. R.H. Function of the Escherichia coli msbB Gene, a multicopy suppressor of htrBk knockouts, in the acylation of Lipid A acylation by MsbB follows laurate incorporation by HtrB. J. Biol. Chem. 1997,272, 10353-10360.
47. Cohen-Bazire G, Sistrom W.R, Stanier R.Y. Kinetic studies of pigment synthesis by non-sulfur purple bacteria. J. Cellular Сотр. Physiol. 1957, 9(1), 25.
48. Curvall M, Lindberg B, Lonngren Y, Ruden U, Nimmich W. Structural studies of the Klebsiella О group 8 lipopolysaccharide. Acta. Chim. Scand. 1973, 27, 4019-4021.
49. Dame J. & Shapiro B.M. Lipid and lipopolysaccharide composition of Escherichia coli surface-altered mutants selected for resistance to levallorphen, tetracaine and polymixin. J. Bacteriol. 1979,137(2), 1043-1047.
50. Darveau R.P. & Hancock R.E.V. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharide from both smooth and rough Pseudomonas aureginosa and Salmonella typhimurium strains. J. Bacteriol. 1983,155, 831-838.
51. David S.A, Balaram P, Mathan V.I.J. Characterization of the interaction of lipid A and lipopolysaccharide with human serum albumin: implications for an endotoxin carrier function for albumin. Endotoxin Res. 1995, 2,99-106.
52. Day J.R, Albers J.J, Lofton-Day C.E, Gilbert T.L., Ching A.F, Grant F.J, O'Hara P.J, Marcovina S.M, Adolphson J.L. Complete cDNA encoding human phospholipid transfer protein from human endothelial cells. J. Biol. Chem. 1994, 269(12), 9388-9391.
53. Dierstein R. & Drews G. Nitrogen-limited continuous culture of Rhodopseudomonas capsulata growing photosynthetically or heterotrophically under low oxygen tensions. Arch. Microbiol 1974, 99(2), 117-128.
54. Din Z.Z, Mukeijee P, Kastowsky M, Takayama K. Effect of pH on solubility and ionic state of lipolysaccharide obtained from the deep rough mutant of Escherichia coli. Biochemistry. 1993, 32,4579-4586.
55. Drews G, Weckesser J, Mayer H. Cell envelopes. In: The Photosynthetic Bacteria (R.K. Clayton & W.R. Sistrom Eds.). Plenum Publishing Corporation, New York, 1978, p. 61-77.
56. Elass-Rochard E, Legrand D, Salmon V, Roseanu A, Trif M, Tobias P.S, et al. Lactoferrin inhibits the endotoxin interaction with CD 14 by competition with the lipopolysaccharide-binding protein. Infect. Immun. 1998, 66, 486-491.
57. Elin R J, Wolff S.M. Non-specificity of the Limulus amebocyte lysate test: positive reactions with polynucleotides and proteins. J. Infect. Dis. 1973,128, 349-352.
58. Ellison R.T. Ill, Giehl T.J, LaForce F.M. Damage of the outer membrane of enteric Gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin. Infect. Immun. 1988, 56,2774-2781.
59. Ellison R.T. & Giehl T.J. Killing of Gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme. J. Clin. Invest. 1991, 88, 1080-1091.
60. Ellison R.T, LaForce F.M, Giehl T.J, Boose D.S, Dunn B.E. Lactoferrin and transferrin damage of the gram-negative outer membrane is modulated by Ca2+ and Mg2+. J. Gen. Microbiol. 1990,136, 1437-1446.
61. Elsbach P. & Weiss J. Prospects for use of recombinant BPI in treatment of gram-negative bacterial infection. Infect. Agents Dis. 1995, 4,104-109.
62. Engvall E. & Pesce A.J. Quantitative enzyme immunoassay. Scand J. Immunol. 1978, 8(7), 23-28.
63. Erdei J, Forsgren A, Naidu A.S. Lactoferrin binds to porins OmpF and OmpC in Escherichia coli. Infect. Immun. 1994, 62,1236-1240.
64. Finkelstein R.A, Scortino C.V, Mcintosh M.A. Role of iron in microbe-host interactions. Rev. Infect. Dis. 1983, 5, S759-S777.
65. Forsberg L.S. & Carlson R.W. The Structures of the lipopolysaccharides from Rhizobium etli strains CE358 and CE359. The complete structure of the core region of R. etli lipopolysaccharides. J. Biol. Chem. 1998, 273, 21Al-2151.
66. Framberg К., Mayer H., Weckesser J., Drews G. Serologische Untersuchungen an isolierten Lipopolysacchariden aus Rhodopseudomonas palustris. Stammen. Arch. Microbiol. 1974, 98, 239-250.
67. Gado I., Erdei J., Laszlo V.G., Paszt J., Czirak E., Kontrohr Т., Toth I., Forsgren A., Naidu A.S. Correlation between human lactoferrin binding and colicin susceptibility in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 1991, 35, 2538-2543.
68. Galanos C., Luderitz 0., Westphal O. A new method for the extraction of R-lipopolysaccharides. Eur. J. Biochem. 1969, 9, 245-249.
69. Gazzano-Santoro H., Parent J.B., Conlon P,J. Characterization of the structural elements in lipid A required for binding of a recombinant fragment of bactericidal/permeability-increasing protein. Infect. Immun. 1995, 63, 2201-2205.
70. Gibbons H.S., Lin S., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Oxygen requirement for the biosynthesis of the S-2-hydroxymyristate moiety in Salmonella typhimurium lipid A. J. Biol. Chem. 2000, 275, 32940-32949.
71. Goto H. & Nakamura S. Liberation of endotoxin from E. coli by addition of antibiotics. Jpn. Exp. Med. 1980, 50, 35-43.
72. Gunn J.S., Lim K.B., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S.I. PmrA-PmrB-regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymyxin resistance. Mol. Microbiol. 1998, 27,1171-1182.
73. Guo L., Lim K.B., Poduje C.M., Daniel M., Gunn J.S., Hackett M., Miller S.I. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptide. Cell. 1998, 95, 189198.
74. Gutteberg T.J., Haneberg В., Jorgensen T. The latency of serum acute phase proteins in meningococcal septicemia with special emphasis on lactoferrin. Clin. Chim. Acta. 1984, 136, 173-178.
75. Hailman E., Lichenstein H.S., Wurfel M.M., Miller D.S., Johnson D.A., Kelley M., Busse L.A., Zukowski M.M., Wright S.D. Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein accelerates the binding of LPS to CD14. J. Exp. Med. 1994,179, 269-277.
76. Hailman E., Albers J., Wolfbauer G., Tu A.Y., Wright S.D. Neutralization and transfer of lipopolysaccharide by phospholipid transfer protein. J. Biol. Chem. 1996, 271,12172-12178.
77. Han J., Mathison J., Ulevitch R., Tobias P. LPS binding protein, truncated at Ile-197, binds LPS but does not transfer LPS to CD14. J. Biol. Chem. 1994, 269, 8172-8175.
78. Hasin M. & Kennedy E.P. Role of phosphatidylethanolamine in the biosynthesis of pyrophosphoethanolamine residues in the lipopolysaccharide of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1982, 257, 12475-12477
79. Hitchcock P.Y. & Brawn T.M Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamid gels. J. Bacteriol. 1983, 154, 269-277.
80. Hoess A., Watson S., Siber G.R., Liddington R. Crystal structure of an endotoxin-neutrolizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A resolution. EMBO J. 1993,12, 3551-3556.
81. Hoist O., Zahringer U., Brade H., Zamojski A. Structural analysis of the heptose/hexose region of the lipopolysaccharide from Escherichia coli K-12 strain W3100. Carbohydr. Res. 1991,215, 323-335.
82. Huijbregts R.P.H., de Kroon A.I.P.M., de Kruijff B. Topology and transport of membrane lipids in bacteria. BBA. 2000,1469,43-61.
83. Imhoff J.F., Kusbner D.J., Kushwaha S.C., Kates M. Polar lipids in phototrophic bacteria of the Rhodospirilliaceae and Chromatiacea families. J. Bacteriol. 1982,150,1192-1201.
84. Ito H.-O., Hirata M., Koga T. Hen egg white lysozime inhibits biological activities of lipopolysaccharides from periodontopathic bacteria. J. Periodont. Res. 1997, 32, 295-299.
85. Janda J. & Work E. A colorimetric estimation of lipopolysaccharides. FEBS Lett. 1971, 16(4), 343-345.
86. Kaca W., Roth R.I., Levin J. Hemoglobin, a newly recognized lipopolysaccharide (LPS)-binding protein that enhances LPS biological activity. J. Biologic. Chem. 1994, 269(40), 2507825084.
87. Kadrmas J.L., Brozek K.A., Raetz C.R.H. Lipopolysaccharide core glycosylation in Rhizobium leguminosarum. An unusual mannosyl transferase resembling the heptosyl transferase I of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1996, 271, 32119-32125
88. Kanipes M.I., Lin S., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Ca2+-induced phosphoethanolamine transfer to the outer 3-deoxy-D-ma/wo-octulosonic acid moiety of Escherichia coli lipopolysaccharide:
89. A novel membrane enzyme dependent upon phosphatidylethanolamine. J. Biolog. Chem. 2001, 276(2), 1156-1163.
90. Katsu Т., Yoshimura S., Fujita Y. Increases in permeability of Escherichia coli outer membrane induced by polycations. FEBSLetts. 1984,166(1), 175-178.
91. Karkhanis Y.D., Zeltner J.Y., Jackson J.J., Carlo D.J. A new and improved microassay to determine 2-Keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 1978, 85, 595-601.
92. Kato S.T., Urakami Т., Komagato K. Quinone systems and cellular fatty acid composition in species of Rhodospirillaceae genera. J. Gen. Appl. Micribiol. 1985, 31, 381-398.
93. Kelly T.M., Stachula S.A., Raetz C.R.H., Anderson M.S. The firA gene of Escherichia coli encodes UDP-3-0-(R-3-hydroxymyristoyl)-glucosamine N-acyltransferase. The third step of endotoxin biosynthesis. J. Biol. Chem. 1993, 268(26), 19866-19874.
94. Klena J.D., Ashford R.S., Schnaitman C.A. Role of Escherichia coli K-12 rfa genes and rfp gene of Shigella dysenteria in generation of LPS core heterogenety and attachment of O-antigen. J. Bacteriol. 1992,174(22), 7297-7307.
95. Krauss J.H., Weckesser J., Mayer H. Electrophoretic analysis of lipopolysaccharides of purple nonsulfur bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 1988, 38, 157-163.
96. LaForce F.M. & Boose D.S. Release of lactoferrin by polymorphonuclear leukocytes after aerosol challenge with Escherichia coli. Infect. Immun. 1987, 55, 2293-2295.
97. Lengacher S., Jongeneel C.V., Le Roy D., Lee J.D., Kravchenko V., Ulevitch R.J., Glauser M.P., Heumann D. Reactivity of murin and human recombinant LPS-binding protein (LBP) with LPS and gram negative bacteria. J. Inflamm. 1997,47,165-172.
98. Levin J. & Bang F.B. The role of endotoxin in the extracellular coagulation of Limulus blood. Bull. Johns Hopkins Hosp. 1964,115, 265-274.
99. Lindberg A.A. & Hellerquist C.G. Rough mutants of Salmonella typhimurium immunochemical and structural analysis of lipopolysaccharides from rfa H mutants. J. Gen. Microbiol. 1980,116, 25-32.
100. Luderitz O., Freudenberg M.A., Galanos C., Lehmarm E.T., Rietschel E.T., Shaw D.H. Lipopolysaccharides of gram-negative bacteria. Curr. Top. Membr. Transp. 1982,17, 79-151.
101. Madigan M.T. & Gest H. Grouth of the photosynthetic bacterium anaerobically in darkness supported by "oxidant-dependent" sugar fermentation. Arch. Microbiol. 1978,117(1), 119-122.
102. Maidak B.L., Larsen N., McCaughey M.J., Overbeek R„ Olsen G.J., Fogel K., Blandy J., Woese C.R. The ribosomal database project. Nucleic. Acids Res. 1994, 22(17), 3485-3487.
103. Makela P.H. & Stacker B.A.D. In: Handbook of endotoxin (E.Th. Rietschel Eds.). Elsevier Science, Amsterdam, 1984,1, p. 59-137.
104. Marino P.A., Phan K.A., Osborn M.J. Energy dependence of lipopolysaccharide translocation m Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 1985, 260,14965-14970.
105. Masoud H., Lindner В., Weckesser J., Mayer H. The structure of the lipid A component of Rhodocyclus gelatinosus Dr2 lipopolysaccharide. Syst. Appl. Microbiol. 1990,13,227-233.
106. Masson P.L., Heremans J.F., Schonne E. Lactoferrin, an iron-binding protein in neutrophilic leucocytes. J. Exp. Med. 1969,130, 643-648.
107. Mayer H. Signification of lipopolysaccharide structure for question of taxonomy and phylogenetical r eletedness о f g ram-negative b acteria. In: The с ell m embrane (E. H aber E ds.). Plenum Press, New York, 1984, p. 71-83.
108. Mayer H., Masoud H., Urbanik-Sypniwska N., Weckesser Y. Lipid A composition and phytogeny of gram-negative bacteria. Bull. Jpn. Fed. Cult. Collect. 1989, 5, 19-25.
109. Mayeux P.R. Pathobiology of lipopolysaccharide. J. Toxicol. Environ. Health. 1997, 51, 415436.
110. McGrath B.C. & Osborn M.J. Localization of the terminal steps of O-antigen synthesis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 1991,173, 649-654.
111. Messner P. & Sleytr U.B. Crystalline bacterial cell surface layers. Adv. Microbiol. Physiol. 1992, 33,213-275.
112. Metz-Boutigue M.H, Jolles J, Mazurier J, Schoentgen F, Legrand D, Spik G. et al. Human lactotrasferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. Eur. J. Biochem. 1984,145, 659-676.
113. Mohan S. & Raetz C.R.H. Endotoxin biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa: enzymatic incorporation of laurate before 3-deoxy-D-manno-octulosonate. J. Bacteriol. 1994, 176(22), 6944-6951.
114. Morrison D.C. & Jacobs D.M. Binding of polymyxin В to the lipid A portion of bacterial lipopolysaccharides. Immunochemistry. 1976,13, 813-818.
115. Naidu A.S. & Arnold R.R. Influence of lactoferrin on host-microbe interactions. In: Lactoferrin: interactions and biological functions (T.W. Hutchens, B. Lonnerdal, N.J. Ottawa Eds.). Humana Press, 1997, p. 259-275.
116. Naidu S.S, Svensson U, Kishore A.R, Naidu A.S. Relationship between antibacterial activity and porin binding of lactoferrin in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Antimicrob. Agents. Chemother. 1993, 37, 240-245.
117. Nelson N. Evolution of organallar proton-ATP-ses. Biophys. Biochem. Acta. 1992, 1100, 109-124.
118. Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium: transmembrane diffusion of some hydrophobic substances. Biochem. Biophys. Acta. 1976, 433, 118-132.
119. Nikaido H. & Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol. Rev. 1985, 49, 1-32.
120. Nikaido H. & Vaara M. The gram-negative bacterial outer membrane. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium (F. Neidhardt Eds.). Waschington, DC: ASM Publications, 1987, p. 7-44.
121. Ohno N. LPS binding proteins in granulocyte lysosomes. In: Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides (D.C Morrison, J.L. Ryan Eds.). 1st edn. Boca Raton: CRC Press, 1992, p. 387-404.
122. Ohno N. & Morrison D.C. Lipopolysaccharide interactions with lysozyme. Binding of lipopolysaccharide to lysozyme and inhibition of lysozyme enzymatic activity. J. Biol. Chem. 1989, 264(8), 4434-4441.
123. Omar A.S, Flamman H.T, Borowiak D, Weckesser J. Lipopolysaccharide of two stains of the phototrophic bacterium Rhodopseudomonas capsulata. Arch. Microbiol. 1983a, 134, 212216.
124. Omar A.S, Flamman H.T, Borowiak D, Weckesser J. Detection of capsule and slime polysaccharide layers in two strains of Rhodopseudomonas capsulata. Arch. Microbiol. 1983b, 134,217-221.
125. Omar A.S, Weckesser J, Mayer H. Different polysaccharides in the external layers (capsule and slime) of the cell envelope of Rhodopseudomonas capsulate Spll. Arch. Microbiol. 1983c, 136(4), 291-296.
126. Osborn M.J. Structure and biosynthesis of the bacterial cell wall. Annu. Rev. Biochem. 1969, 38,501-538.
127. Osborn M.J, Gander J.E, Parisi E. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Site of synthesis of lipopolysaccharide. J. Biol. Chem. 1972, 247, 3973-3986.
128. Osborn M.J. & Tze-Yuen R.Y. Biosynthesis of bacterial lipopolysaccharide. VII. Enzymatic formation of the first intermediate in biosynthesis of the O-antigen of Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 1968, 243, 5145-5152.
129. Osborn M.J, Rick P.D, Rasmussen N.S. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Translocation and integration of an incomplete mutant lipid A into the outer membrane. J. Biol. Chem. 1980, 255(9), 4246-4251
130. Park C.T. & Wright S.D. Plasma lipopolysaccharide-binding protein is found associated with a particle containing apolipoprotein A-I, phospholipid and factor H-related proteins. J. Biol. Chem. 1996, 271, 18054-18060.
131. ParkerT.S, LevineD.M, Chang J. C.C, Laxer J., Coffin C.C, Rubin A.L. Reconstituted high-density lipoprotein neutralizes gram-negative bacterial lipopolysaccharides in human whole blood. Infect. Immun. 1995, 63, 253-258.
132. Pool E.J, Johaar G, James S, Petersen I, Bouic P. Differentiation between endotoxin and non-endotoxin pyrogens in human albumin solutions using an ex vivo whole blood culture assay. J. Immunoassay. 1999,20, 79-89.
133. Prehm P, Jann B, Jann K. The 09 antigen of Esccherichia coli structure of polysaccharide chain. Eur. J. Biochem. 1976, 67, 53-56.
134. Querishi N.,Honovich J.P., Нага H., Cotter R.J., TakayamaK. Location of fatty acids in lipid A obtained from lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023. J. Biol. Cell. 1988, 263, 5502-5507.
135. Raetz C.R.H. Bacterial endotoxins: extraordinary lipids that activate eukaryotic signal transduction. J. Bacteriol. 1993,175, 5745-5753.
136. Raetz C.R.H. Outer membrane. In: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology (F.C. Neidhardt Eds.). 2nd edn. American Society for Microbiology, Washington, DC, 1996,1, p. 1035-1063.
137. Raetz C.R.H. Biochemistry of endotoxins. Ann. Rev. Biochem. 1990, 59,129-170.
138. Raetz C.R.H., Purcell S., Meyer M.V., Qureshi N., Takayama K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 1985, 260, 16080-16088.
139. Raetz C.R.H. & Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. Ann. Rev. Biochem. 2002, 71, 635-700.
140. Ramadori G., Meyer zum Buschenfelde K.H., Tobias P.S., Mathison J.C., Ulevitch R.J. Biosynthesis of of lipopolysaccharide-binding protein in rabbit hepatocytes. Pathobiology. 1990, 58, 89-94.
141. Rassell R.R.B. Free endotoxin: a review. Microbios. Lett. 1976, 2,125-135.
142. Ray B.L., Painter G., Raetz C.R.H. The biosynthesis of gram-negative endotoxin: formation of lipid A disaccharides frommonosaccharide precursors in extracts of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1984, 259, 4852-4859.
143. Ray B.L. & Raetz C.R.H. The biosynthesis of gram-negative endotoxin. A novel kinase in Escherichia coli membranes that incorporates the 4'-phosphate of lipid A. J. Biol. Chem. 1987, 262,1122-1128.
144. Reeves P. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharide. In: Bacterial Cell Wall (J.-M. Ghuysen, R. Hakenbeck Eds.). Amsterdam-London-New York-Tokyo, 1994, p. 281-317.
145. Reeves P.R., Hobbs M., Valvano M.A., Skurnik M., Whitfield C., Coplin D., Kido N., Klena J., Maskell D., Raetz C.R., Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature. Trends Microbiol. 1996, 4,495-503.
146. RibiE., AnackerR.L., BrownR., Haskins W.T.,MalngrenB.,Milner K.C.,Rudbuch J.A. Reaction of endotoxin and surfactants. I. Physical and biological properties of endotoxins treated with sodium deoxycholate. J. Bacteriol. 1966, 92,1493-1509.
147. Rietschel E.T., Kirikae Т., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G., Loppnow H., Ulmer A.J., Zahringer U., Seydel U., Padova F.D. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J. 1994, 8, 217-225.
148. Rivera M., Bryan L.E., Hancock R.E., McGroarty E.J. Heterogeneity of lipopolysaccharides from Pseudomonas aeruginosa: analysis of lipopolysaccharide chain length. J. Bacteriol. 1988, 170(2), 512-521.
149. Robbins P.W. & Uchida T. Studies on the chemical basis of the phage conversion of O-antigens in the E-group Salmonellae. Biochemistry. 1962,1, 323-335.
150. Rossi P., Giansanti F., Boffi A., Ajello M., Valenti P., Chiancone E., Antonini G. Ca2+ binding to bovin lactoferrin enhances protein stability and influences the release of bacterial lipopolysaccharide. Biochem. Cell Biol. 2002, 80, 41-48.
151. Roth R.I. Hemoglobin enhances the binding of bacterial endotoxin to human endothelial cells. Thrombosis and Haemostasis. 1996, 76(2), 258-262.
152. Roth R.I. & Kaca W. Toxicity of hemoglobin solutions: hemoglobin is a lipopolysaccharide (LPS) binding protein which enhances LPS biological activity. Art. Cells, Blood Subs, and Immob. Biotech. 1994, 22(3), 387-398.
153. Roth R.I., Kaca W., Levin J. Hemoglobin: a newly recognized binding protein for bacterial endotoxins (LPS). Prog. Clin. Biol. Res. 1994, 388, 161-172.
154. Sanchez Carballo P.M., Rietschel E.T., Kosma P., Zahringer U. Elucidation of the structure of an alanine-lacking core tetrasaccharide trisphosphate from the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa mutant H4. Eur. J. Biochem. 1999, 261, 500-508.
155. Schnitzer L.E., Carley W.W., Palade G.E. Albumin interacts specifically with a 60-kDa microvascular endothelial glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988, 85, 6773-6777.
156. Schramm A.B., Brandenburg K. The charge of endotoxin molecules influences their conformation and IL-6-inducing capacity. J. Immunol. 1998,161, 5464-5471.
157. Schumann R.R., Leong S.R., Flaggs G.W., Gray P.W., Wright S.D., Mathison J.C., Tobias P.S., Ulevitch R.J. Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. Science. 1990, 249,1429-1431.
158. Shenep J.L., Barton R.P., Morgan K.A. Role of antibiotic class in the rate of liberation of endotoxin during therapy for experimental gram-negative bacterial sepsis. J. Infect. Dis. 1985, 151,1012-1018.
159. Spik G, Strecker G, Fournet B, Bouquelet S, Montreuil J, Dorland L, van Halbeek H, Vliegenthart J.F. Primary structure of the glycans from human lactotransferrin. Eur. J. Biochim. 1982,121,413-419.
160. Stackebrandt E, Rainey F.A, Ward-Rainey N. Anoxygenic phototrophy across the phylogenetic spectrim: current understanding and future perspectives. Arch. Microbiol. 1996, 166,211-223.
161. Stevenson G, Neal B, Liu D, Hobbs M, Parker N.H, Batley M, Redmond J.W, Lindquist L, Reeves P. Structure of the О antigen of Escherichia coli K-12 and the sequence of its rfb gene cluster. J. Bacteriol. 1994,176, 4144-4156.
162. Su D.H, Roth R.I., Yoshida M, Levin J. Hemoglobin increases mortality from bacterial endotoxin. Infect. Immun. 1997, 65, 1258-1266.
163. Suss K-H, Arkova С , Manteuffel R, Adler K. Calvin cycle multienzyme complexes are bound to chloroplast thylacoid membranes of higher plants in situ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993,90,5514-5518.
164. Takada K, Ohno N, Yadomae T. Detoxification of lipopolysaccharide (LPS) by egg white lysozyme. FEMSImmunol. Med. Microbiol 1994, 9(4), 255-264.
165. Taylor A.H, Heavner G, Nedelman M, Sherris D, Brunt E, Knight D, Ghrayeb J. Lipopolysaccharide (LPS) neutralizing peptides reveal a lipid A binding site of LPS binding protein. J. Biol. Chem. 1995, 270, 17934-17938.
166. Teraguchi S, Shin K, Fukuwatari Y, Shimamura S. Glycans of bovine lactoferrin function as receptors for the type 1 fimbrial lectin of Escherichia coli. Infect. Immun. 1996, 64, 10751077.
167. Tesh V.L, Vukajlovich S.W, Morrison D.C. Endotoxin interactions with serum proteins: relationship to biological activity. Prog. Clin. Biol. Res. 1988, 272, 47-62.
168. Thome C.J.R. Techniques in protein and enzyme biochemistry (H.L. Kornberg et al. Eds.). Elsevier, North Holland, Amsterdam, 1978,1(B104), p. 1-18.
169. Tobias P.S, Soldau K, Ulevitch RJ. Identification of a lipid A binding site in acute phase reactant lipopolysaccharide binding protein. J. Biol Chem. 1989, 264,10867-10871.
170. Tobias P.S., Soldau К., Ulevitch R.J. Isolation of a lipopolysaccharide-binding acute phase reactant from rabbit serum. J. Exp. Med. 1986,164, 777-793.
171. Tomita M., Bellamy W., Takase M., Yamauchi K., Wakabayashi H., Kawase K. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin. J. Dairy. Sci. 1991, 74, 4137-4142.
172. Trent M.S., Pabich W., Raetz C.R.H., Miller S.I. A PhoP/PhoQinduced lipase (PagL) that catalyzes 3-O-deacylation of lipid A precursors in membranes of Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 2001, 276(12), 9083-9092.
173. Tsai C.-M. & Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 1982,119,115-119.
174. Vesy C.J., Kitchens R.L., Wolfbauer G., Albers J.J., Munford R.S. Lipopolysaccharide-binding protein and phospholipid transfer protein release lipopolysaccharides from gram-negative bacterial membranes. Infection and Immunity. 2000, 68(5), 2410-2417.
175. Vinogradov E. & Perry M.B. Structural analysis of the core region of the lipopolysaccharides from eight serotypes of Klebsiella pneumoniae. Carbohydr. Res. 2001, 335, 291-296.
176. Vreugdenhil A.C.E., Snoek A.M., van't Veer C., Greve J.W., Buurman W.A. LPS-binding protein circulates in association with apoB-containing lipoproteins and enhances endotoxin-LDL/VLDL interaction. J. Clin. Investig. 2001,107, 225-234.
177. Wada Т., Aiba Y., Shimizu K., Takagi A., Miwa Т., Koga Y. The therapeutic effect of bovine lactoferrin in the host infected with Helicobacter pylori. Scand. J. Gastroenterol. 1999, 34, 238-243.
178. Watt S.R. & Clarke A.J. Initial characterization of two extracellular autolysins from Pseudomonas aeruginosa PAOl. J. Bacteriol. 1994,176, 4784-4789.
179. Weckesser J., Drews G., Mayer H. Lipopolysaccharides of photosynthetic prokaryotes. Annu. Rev. Microbiol. 1979, 33, 215-239.
180. Westphal O. & Luderitz 0. Chemische erforschung von lipopolysacchariden gram-negativer bakterien. Angew. Chem. 1954, Bd 66, 407-417.
181. Westphal 0., Luderitz 0., Bister F. Uber die extraktion von bakterien mit phenol/wasser. Z. Naturforsch. 1952, 7B, 148-155.
182. Whitfield C., Amor P.A., Koplin R. Modulation of the surface architecture of gram-negative bacteria by the action of surface polymer: lipid A-core ligase and by determinants of polymer chain length. Molecular. Microbiol. 1997, 23, 629-638.
183. Woese C.R. Bacterial evolution. Microbial. Rev. 1987, 51, 221-271.
184. Wurfel M.M., Kunitake S.T., Lichenstein H., Kane J.P., Wright S.D. Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein is carried on lipoproteins and acts as a cofactor in the neutralization of LPS. J. Exp. Med. 1994,180,1025-1035.
185. Wyckoff T.J.O., Raetz C.R.H., Jackman J.E. Antibacterial and anti-inflammatory agents that target endotoxin. Trends in Microbiology. 1998, 6(4). 154-159.
186. Yoshida M., Roth R.I., Levin J. The effect of cell-free hemoglobin on intravascular clearance and cellular, plasma, and organ distribution of bacterial endotoxin in rabbits. J. Lab. Clin. Med. 1995,126,151-160.
187. Yu В., Hailman E., Wright S.D. Lipopolysaccharide binding protein and soluble CD14 catalyze exchange of phospholipids. J. Clin. Investig. 1997, 99, 315-324.
188. Yurgens G., Muller M, Garidel P., Koch M.H.J., Nakakubo H., Blume A, Branderburg K. Investigation into the interaction of recombinant human serum albumin with Re-lipopolysaccharide and lipid A. J. Endotox. Res. 2002, 8(2), 115-126.
189. Zey P. & Jackson S. Conditions that affect the colorimetric analysis of lipopolysaccharide from Escherichia coli and Treponema pallidum. Appl. Microbiol. 1973, 26(2), 129-133
190. Zhou Z.M, White K.A, Polissi A, Georgopoulos C, Raetz C.R.H. Function of Escherichia coli MsbA, an essential ABC family transporter, in Lipid A and phospholipid biosynthesis. J. Biol Chem. 1998, 273, 12466-12475.
191. Zhou Z, Ribeiro A.A, Lin S, Cotter R.J, Miller S.I, Raetz C.R.H. Lipid A modifications in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 2001, 276, 43111-43121.1. Благодарности
192. В заключение мне очень приятно поблагодарить всех тех, кто верил в меня, оказывал помощь и поддержку и просто был рядом в этот важный для меня период.
193. Искренне благодарю коллектив лаборатории молекулярной биомедицины за помощь и содействие в работе.
194. Отдельные слова благодарности хочу выразить Александру Юсуповичу Иванову за выполнение совместной части работы по электрофоретическим свойствам клеток, а также за постоянную помощь и поддержку.
195. Большое спасибо Татьяне Викторовне Русановой за помощь в редактировании диссертации, в оформлении результатов и подготовке презентации.
196. Я искренне признательна моим рецензентам Алле Карловне Романовой и Анатолию Анатольевичу Цыганкову за пристальное внимание к моей работе, за очень важные и ценные замечания.
197. От всей души благодарю моих родителей, детей и всех родных и близких за терпение, понимание и поддержку на всем протяжении работы.
-
Зубова, Светлана Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2006
-
ВАК 03.00.04
- Этиопатогенетические особенности бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста
- Морфофункциональные изменения иммуной системы мышей Balb/c и C57Bl/6 при введении липополисахарида
- Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75
- НОЦИЦЕПТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА
- Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum
