Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НОЦИЦЕПТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "НОЦИЦЕПТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА"

На правах рукописи УДК 591.1

АБРАМОВА АНАСТАСИЯ ЮРЬЕВНА

НОЦИЦЕПТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

16 МАИ 2013

005058954

Москва, 2013

005058954

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П К. Анохина» РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Перцов Сергей Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор.

Заслуженный деятель науки РФ Котов Александр Владимирович ФГБУ «НИИ нормальной физиологии имени П.К.Анохина» РАМН, Зав. отделом системных механизмов поведения

доктор медицинских наук, профессор Будылина Софья Михайловна Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, профессор кафедры нормальной физиологии

Ведущая организация: Биологический факультет Федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Защита диссертации состоится « 29 » мая 2013 года в 13— часов на заседании Диссертационного совета Д 001.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П К. Анохина» РАМН по адресу: 125009, г. Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П К. Анохина» РАМН.

Автореферат разослан апреля 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ч' Кубряк О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования ,. .

Ноцицепция - нейрофизиологическое понятие, обозначающее восприятие, проведение и центральную обработку сигналов о вредоносных процессах и воздействиях. Термин «ноцицепция», введенный в 1900 году Ч.С. Шеррингтоном, применяют в экспериментальных исследованиях на животных с целью четкой дифференцировки между физиологическими процессами, связанными с воздействием болевого раздражителя, и психологической реакцией на боль.

Выделяют следующие пять основных компонентов ноцицептивной реакции млекопитающих: перцептуальный, эмоционально-аффективный, вегетативный, двигательный и когнитивный [Яхно Н.Н., Кукушкин M.JL, 2011]. Недавно описан иммунный компонент ноцицептивного ответа [Никенина Е.В., 2010], исследование которого - относительно новый подход к изучению боли.

В настоящее время накоплены данные, свидетельствующие о роли иммунологических механизмов в развитии болевых синдромов [Wiertelak Е. et al., 1994; Yezierski R., 2001; Widerstrom-Noga E.G. et al., 2009; Rekand T. et al., 2012; Kukkar A. et al., 2013]. Однако имеются лишь отдельные сведения, указывающие на взаимосвязь между иммунным статусом и ноцицепцией у млекопитающих [Василенко A.M., 1995; Абрамов Ю.Б. и др., 2005].

Особое внимание в изучении роли нейроиммунных взаимодействий в механизмах формирования боли уделяется корковым и лимбическим структурам ЦНС, в частности - дорсальному гиппокампу и поясной области мозга. Дорсальный гиппокамп вовлечен преимущественно в реализацию эмоционально-аффективного компонента боли [Liu M.G., Chen J., 2009]. Факт участия поясной коры и поясного пучка головного мозга в формировании ноцицептивного ответа у млекопитающих получил подтверждение в работах российских и зарубежных исследователей [Никенина Е.В. и др., 2006, 2010; Абрамов Ю.Б. и др., 2009; Johansen J.P. et al., 2001]. При этом существенно, что как гиппокамп [Магаева С.В., Морозов С.Г., 2005; Геворкян М.М. и др., 2010; Devi R.S. et al., 2004], так и поясная область мозга [Абрамов Ю.Б. и др., 2009; Abramov Y.B. et al., 2003] занимают важное место в модуляции иммунных реакций. Однако в целом роль функционального сопряжения нервных и иммунных процессов в системных ноцицептивных реакциях у млекопитающих остается неясной.

В плане изучения участия иммунных факторов в регуляции болевой чувствительности отдельного внимания заслуживают цитокины - медиаторы межклеточного взаимодействия, участвующие в формировании защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в

координации ряда нормальных физиологических функций [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008]. Одной из широко распространенных является классификация цитокинов, предполагающая их рассмотрение в зависимости от доминирующего биологического действия [Фрейдлин И.С., 1998]. В соответствии с данной классификацией, цитокины подразделяются на провоспалительные (интерлейкин-1 [ИЛ-1], ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, фактор некроза опухолей-альфа [ФНО-а], интерферон-альфа [ИФН-а], ИФН-у и др.) и противовоспалительные (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, трансформирующий фактор роста-бета). Определение соотношения указанных цитокинов - так называемого, цитокинового баланса, позволяет объективно оценить степень отклонений функциональной активности иммунной системы при различных воздействиях на иммунный статус у млекопитающих [Еричев В.П. и др., 2009].

Цитокины рассматриваются в качестве сигнальных молекул, информирующих мозг о состоянии - активации или подавлении - иммунных процессов на периферии. Продукция цитокинов является частью клеточного ответа, связанного с распознаванием иммунокомпетентными клетками сходных структурных компонентов различных патогенов - патоген-ассоциированных молекулярных паттернов [Medzhitov R., Janeway С., 1997]. Такими структурами являются, например, липополисахариды грамотрицательных бактерий. Существуют немногочисленные данные, иллюстрирующие взаимосвязь между болевой чувствительностью и уровнем цитокинов в биологических тканях млекопитающих. По мнению Ю.Б. Абрамова (2009), цитокины вовлекаются в регуляцию ноцицептивных реакций, обеспечивая взаимодействие глиальных клеток и нейронов. Однако в целом роль цитокинов в супраспинальных механизмах реализации ноцицегггивного ответа изучена недостаточно.

В экспериментальных исследованиях для изучения механизмов формирования и регуляции иммунных реакций широко применяются липополисахариды (ЛПС) -естественные стимуляторы иммунных процессов. ЛПС относятся к классу бактериальных антигенов, запускающих каскад иммунных реакций в ЦНС и периферических тканях, в том числе, высвобождение цитокинов [Basta-Kaim A. et al., 2012]. В современной научной литературе имеются указания о характере и механизмах влияния ЛПС на болевую чувствительность млекопитающих [Wadachi R., Hargreaves К., 2006; Cao L. et ai, 2009; Seo J.W. et al., 2012]. Модулирующее воздействие ЛПС на ноцицептивные реакции позволяет использовать введение этого антигена как оптимальную модель для экспериментального изучения механизмов ноцицепции [Watkins L. et al., 1994; Colheo A. et al., 2000].

Несмотря на большое число исследований, посвященных анализу физиологических и патофизиологических механизмов боли, многие вопросы в этой области остаются нерешенными. Сведения о роли иммуноактивных веществ, в том числе цитокинов, в формировании и реализации различных компонентов ноцицептивных реакций у млекопитающих немногочисленны и противоречивы. Требуют дальнейшего изучения центрально-периферические механизмы вовлечения иммунных факторов в системную организацию физиологических функций на разных стадиях болевого ответа. В литературе практически отсутствуют данные о роли различных структур головного мозга в реализации взаимодействия между нервными и иммунными процессами, лежащими в основе формирования и регуляции ноцицептивных реакций. Данная работа направлена на решение этих вопросов.

Цель и задачи исследования Целью исследования явилось изучение участия иммунных процессов в формировании различных компонентов ноцицептивных реакций у крыс при периферическом и центральном введении липополисахарида.

В соответствии с поставленной целью, конкретными задачами работы были:

1. изучить изменения эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

2. определить содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в периферической крови крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

3. измерить концентрацию цитокинов в тканях дорсального гиппокампа и поясной области мозга у крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

4. выявить взаимосвязь между ноцицептивными показателями и уровнем цитокинов в периферической крови и тканях структур головного мозга крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

5. установить возможные особенности участия дорсального гиппокампа и поясной области головного мозга крыс в реализации эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций при внутримозговом введении липополисахарида.

Научная новизна работы В работе впервые показано, что внутрибрюшинное введение крысам липополисахарида приводит к специфическим изменениям ноцицептивной чувствительности животных в разные временные периоды исследования.

Обнаружено, что в 1-е сутки после антигенной стимуляции происходит усиление только перцептуального, а на 7-е сутки - как перцептуального, так и эмоционального компонентов ноцицепции животных.

Установлено, что повышение ноцицептивной чувствительности крыс при воздействии липополисахарида сопровождается разнонаправленными изменениями уровня цитокинов в крови и тканях головного мозга. В отличие от наблюдающегося в этих условиях уменьшения концентрации провоспалительных (ИЛ-1а, ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у и ФНО-а) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) в периферической крови животных, антигенная стимуляция приводит к увеличению содержания ИЛ-4 и ИЛ-10 в тканях дорсального гиппокампа и поясной области мозга. Показано, что формирование у крыс отрицательных корреляционных связей между ноцицептивными и иммунными показателями соответствует позднему периоду после введения липополисахарида.

Выявлено, что внутримозговое введение крысам липополисахарида не оказывает значимого влияния на перцептуальный компонент ноцицептивных реакций, но сопровождается выраженными изменениями эмоционального компонента ноцицепции животных на 7-е сутки исследования. Обнаружено, что микроинъекция указанного антигена в дорсальный гиппокамп приводит к подавлению, а в поясную область мозга — усилению эмоционального компонента ноцицепции у крыс.

Научно-практическая значимость работы Полученные в ходе исследования результаты могут быть использованы как в научно-исследовательской работе, так и в клинической практике. Теоретическое значение работы определяется расширением знаний о роли иммунных факторов в центральных и периферических механизмах формирования и реализации ноцицептивных реакций у млекопитающих. Представлены новые доказательства того, что изменения ноцицептивной чувствительности животных при введении липополисахарида опосредованы специфическими механизмами, зависящими в частности от характера системного иммунного ответа при антигенном воздействии.

Результаты комплексного анализа ноцицептивных и биохимических показателей у экспериментальных животных при антигенной стимуляции могут быть использованы в клинической практике при разработке новых схем терапии болевого синдрома у больных с нарушениями иммунного статуса. Полученные данные перспективны для разработки лекарственных средств на основе иммуномодуляторов, направленных на устранение болей неясной этиологии при ряде хронических заболеваний. Материалы исследования целесообразно использовать в курсе преподавания нормальной и патологической физиологии, неврологии и иммунологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Воздействие на иммунный статус крыс при введении липополисахарида приводит к изменению ноцицептивной чувствительности животных в разные временные периоды исследования.

2. Направленность изменений эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс различается в условиях периферического и центрального введения липополисахарида.

3. Изменения ноцицептивной чувствительности крыс в условиях введения липополисахарида опосредованы специфическими механизмами, зависящими, в частности, от характера иммунных процессов в тканях головного мозга и периферической крови при антигенном воздействии.

Апробаиия работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на научных мероприятиях: II International Symposium "Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease" (Saint Petersburg, Russia, 2009); XII Школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2009); I Конференция молодых ученых «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2009); XXI Съезд физиологического общества им. Павлова (Калуга, 2010); VI Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010); Первая Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Сафага, Египет, 2010); VII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2011); III Съезд физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011); Вторая Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Бодрум, Турция, 2012); Международный симпозиум по проблемам боли «Подходы к пониманию механизмов и лечению симптомов боли» (Санкт-Петербург, 2012); III Конференция молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2012); конференциях Отдела социальной физиологии НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2009-2013). Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 7 статьях и 17 тезисах.

Структура и объем диссертаиии Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 15 таблиц.

Библиографический указатель содержит 188 источников, из них 46 на русском и 142 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 97 крысах-самцах Вистар массой 230,0+5,1 г в светлое время суток в осенне-зимний период. Перед началом опыта крыс содержали на карантине в клетках (по 9-10 особей в каждой) в условиях свободного доступа к воде и пище в течение 10 дней. В постановке эксперимента руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Этическая комиссия НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН, протокол №1 от 03.09.2005) и требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

В соответствии с целью исследования, выполнено две серки экспериментов.

Целью первой серии экспериментов явилось выявление взаимосвязи между изменениями ноцицептивных реакций и уровнем цитокинов в сыворотке периферической крови и структурах головного мозга у крыс при внутрибрюшинном введении ЛПС. Опыты проведены на 54 животных. В начале исследований у крыс всех экспериментальных групп определяли исходные показатели эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций. Периептуальный компонент ноцицепции у крыс оценивали по латентному периоду реакции отведения хвоста (ЛП РОХ) в ответ на свето-термальное раздражение методом «tail-flick» [D'Amour F.E., Smith D.L., 1941; Daniel le Bars et al., 2001]. Измерения проводили на приборе Tail-Flick Analgesia Meter 0104-301M (Columbus Instruments, USA). Осуществляли 5 предъявлений свето-термального раздражителя с последующим расчетом среднего значение ЛГТ РОХ в секундах у каждого животного. Эмоциональный компонент ноцицептивной реакции у крыс определяли по порогу вокализации животных (ПВ, мА) в ответ на электрокожное раздражение хвоста по оригинальной методике, разработанной в НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН (Абрамов Ю.Б., Козлов А.Ю., 2005). Для исследования применяли электростимулятор SEN-3201 (Nihon Kohden, Япония). Использовали следующие параметры электростимуляции: частота - 10 Гц, длительность импульса - 0,5 мс. Силу тока постепенно увеличивали от 0,25 до 1 мА до появления реакции вокализации (писка) у крыс.

Интактные животные группы I (я= 10) в последующий период не подвергались каким-либо воздействиям. Крысы группы II («=24) получали однократную внутрибрюшинную инъекцию ЛПС в дозе 30 мкг/кг (до 1 мл физиологического раствора). Выбор этой дозы ЛПС в наших исследованиях определялся, в первую очередь, характером пирогенного действия данного соединений при используемом способе введения. В наших предыдущих опытах было установлено, что

внутрибрюшинная инъекция крысам ЛПС в дозе 30 мкг/кг сопровождается развитием гипертермии у животных по сравнению с особями контрольной группы, получавшими физиологический раствор [Абрамова А.Ю., Абрамов Ю.Б., 2011]. В то же время, ЛПС в указанной дозе не обладает той степенью токсичности, которая может привести к сепсису и последующему летальному исходу у экспериментальных животных [Recknagel Р. et al., 2013]. Ноцицептивные пороги у крыс группы II измеряли в 1-е (подгруппа II-1, п= 12) и 7-е сутки (подгруппа И-2, п=12) после введения ЛПС. Выбор указанных периодов исследования после инъекции крысам ЛПС обусловлен имеющимися литературными данными о временной динамике эффектов этого антигена у млекопитающих. В частности, выделяют острую (в течение 1-х суток) и хроническую (7-е - 21-е сутки) фазы действия ЛПС при его внутрибрюшинном введении [Bekker Z. et al., 2012].

Крысам группы III (л=20) вместо ЛПС внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объеме 1 мл; ноцицептивные пороги определяли в 1-е (подгруппа III-1, л=10) и 7-е сутки (подгруппа III-2, «=10) после инъекции. Таким образом, при анализе ноцицептивной чувствительности животные группы III служили контролем для крыс группы II. ЛПС или физиологический раствор вводили животным с помощью одноразовых пластиковых шприцов.

Крыс всех экспериментальных групп декапитировали по окончании опытов; быстро извлекали головной мозг, выделяли дорсальный гиппокамп и переднюю поясную кору. Пробы сыворотки периферической крови, полученной при декапитации животных, и ткани структур головного мозга замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°С. В дальнейшем после соответствующей обработки данные пробы использовали для измерения концентрации цитокинов.

Содержание провоспалительных (ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у и ФНО-а) и противовоспалительных иитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) в сыворотке периферической крови и ткани структур головного мозга крыс определяли [Hülse R.E. et al., 2004] на установке Bio-PIex (Bio-Rad Laboratories, USA, CA). В исследовании применяли наборы реагентов для анализа цитокинов (Bio-PIex Pro™ Rat Cytokine Thl/Th2 Assay).

Целью второй серии экспериментов явилось изучение характера изменений эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс при введении ЛПС в различные структуры головного мозга. Опыты проведены на 43 животных. В начале опытов у крыс всех групп определяли исходные показатели эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций. Методика измерения показателей перцептуального и эмоционального компонентов ноцицепции аналогична таковой в первой серии экспериментов.

ЛПС или физиологический раствор в объеме 5 мкл вводили животным с

использованием шприца Гамильтона. Применяемое в наших опытах количество вводимых веществ не превышает объемов, используемых в исследованиях на животных с внутримозговым введением ЛПС [Terrazzino S. et al., 1997; Lee J.C. et al., 2005]. Используемая в нашей работе методика микроинъекций ЛПС описана ранее [Pang Y. et al., 2012]. Для микроинъекций в структуры головного мозга крыс применяли стереотаксический прибор для мелких лабораторных животных (TSE Systems, Германия). Трепанацию черепа животных выполняли под нембуталовым наркозом (30 мг/кг). Исследуемый препарат вводили по координатам стереотаксического атласа для крыс [Paxinos G., Watson С., 1996]: в дорсальный гиппокамп (АР = -5 мм, L = +2,5 мм, Н = 2,5-3 мм) и задний отдел поясного пучка (АР = -4,5 мм, L = +1 мм, Н = 1,5 мм).

Крысам группы I (л=22) вводили ЛПС в структуры головного мозга: дорсальный гиппокамп (подгруппа 1-1, «=12) и задний отдел поясного пучка (подгруппа 1-2, л=10). Контролем служили животные группы II («=21), получавшие соответствующие инъекции физиологического раствора в дорсальный гиппокамп (подгруппа II-1, /7=10) и задний отдел поясного пучка (подгруппа II-2, л=11). Показатели эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс измеряли на 7-е сутки после введения ЛПС или физиологического раствора.

Статистическая обработка данных. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью соответствующих статистических и аналитических методов с использованием пакетов программ STATISTICA 6.1.478, пакета программы Microsoft Office Excel 2007 и программного обеспечения Bio-Plex Manager (версия 4.1). Достоверность различий между разными группами крыс выявляли с помощью непараметрического [/-критерия Манна-Уитни. Принятый уровень значимости межгрупповых отличий составлял 5%. Корреляционный анализ внутригрупповых связей между исследуемыми показателями проводили с помощью непараметрического коэффициента корреляции Спирмена (уровень значимости р<0,05). Выявляли положительные и отрицательные корреляции, свидетельствующие о наличии прямой или обратной связи соответственно. Числовые данные приведены как среднее значение ± ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

НОЦИЦЕПТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ ВВЕДЕНИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

В данном разделе представлены результаты изучения характера изменений перцептуального и эмоционального компонентов ноцицептивных реакций у крыс при антигенном воздействии в условиях внутрибрюшинного введения ЛПС.

Внутрибрюшинное введение крысам физиологического раствора

сопровождалось достоверным увеличением ЛПРОХ на 1-е сутки исследования по сравнению с исходным показателем (2.74+0,15 и 2,23+0,12 сек соответственно, в 1,2 раза, р<0,05; табл. 1). Указанные изменения отражают подавление перцептуального компонента ноцицепции у крыс в ранние сроки после инъекции физиологического раствора. Полученные данные дополняют имеющиеся сведения о физиологическом значении перцептуального компонента ноцицепции у животных. Согласно теории «воротного контроля», сформулированной R.Melzak и P. Wall в 1965 году, формирование ноцицепции на уровне сегментов спинного мозга находится под контролем вышележащих структур, где происходит оценка значимости повреждающего фактора. Выявленное нами снижение ноцицептивной чувствительности животных через 1 сутки после введения физиологического раствора свидетельствует о раннем подавлении распространения ноцицептивного возбуждения на уровне периферического звена системы оценки ноцицептивного потока. В указанных экспериментальных условиях ПВ животных при электрокожном раздражении хвоста практически не отличался от фонового уровня (0,64+0,04 и 0,70+0,07 мА соответственно). На 7-е сутки после инъекции физиологического раствора статистически значимых отличий ноцицептивных порогов крыс от исходных значений не обнаружено.

Таблица 1. Средние значения показателей ноцицептивных порогов у крыс после внутрибрюшинного введения физиологического раствора (М±т)

Подгруппа, число крыс Экспериментальные условия ЛПРОХ, сек ПВ, мА

III-1, и—10 Исходно 2,23+0,12 0,70+0,07

Физ. раствор - 1 -е сутки 2,74+0,15 * 0,64+0,04

III-2, п=10 Исходно 2,40+0.20 0,70+0,08

Физ. раствор - 7-е сутки 2,44+0,20 0,70+0,07

Примечание. ЛПРОХ - латентный период реакции отведения хвоста (сек); ПВ - порог вокализации (мА). ^<0.05 по сравнению с исходным показателем.

При внутрибрюшинном введении крысам ЛПС на 1-е сутки выявлено достоверное снижение ЛПРОХ в ответ на свето-термальное раздражение по сравнению с исходным показателем (в 1,6 раза, р<0,001; табл. 2). Указанные изменения были значительно более выражены по сравнению с таковыми, наблюдающимися у животных в аналогичный период после введения физиологического раствора. ПВ крыс при электрокожном раздражении хвоста на 1-е сутки после инъекции ЛПС практически не отличался от исходного. Полученные

результаты иллюстрируют усиление перцептуального компонента ноцицептивных реакций у крыс в относительно ранние сроки после воздействия ЛПС. Это согласуется с опубликованными ранее данными о гипералгетическом эффекте ЛПС, выявленном при оценке ноцицептивных порогов животных в тесте «горячей пластины» [АЬи-ОЬей-еЬ А.А., МаБосЬа 2010; МеЬгой-а А. с/ а/., 2011].

На 7-е сутки после внутрибрюшинного введения ЛПС у крыс выявлено значимое усиление как перцептуального, так и эмоционального компонентов ноцицептивной чувствительности. По сравнению с исходными показателями в этот период исследования у животных наблюдалось снижение ЛПРОХ (в 1,1 раза, р<0,05) и ПВ (в 1,3 раза, р<0,01).

Таблица 2. Средние значения показателей ноцицептивных порогов у крыс после внутрибрюшинного введения ЛПС (М±т)

Подгруппа, число крыс Экспериментальные условия ЛПРОХ, сек ПВ, мА

П-1,и=12 Исходно 2,85+0,10 0,86+0,07

ЛПС - 1-е сутки 1,82+0,06 *** 0,76+0,04

Н-2, л=12 Исходно 3,04+0,09 0,94+0,03

ЛПС - 7-е сутки 2,76+0,08 * 0,75+0,03 **

Примечание. ЛПРОХ - латентный период реакции отведения хвоста (сек); ПВ - порог вокализации (мА). *р<0,05, **/?<0,01 и ***р<0,001 по сравнению с исходным показателем.

Полученные данные дополняют имеющиеся научные сведения о пролонгированном действии ЛПС при периферическом введении, которое проявляется, в частности, в изменении перцептуального компонента ноцицепции у крыс [Ма1ег 8.И. е? а/., 1993]. Усиление эмоционального компонента ноцицепции у животных, выявленное в поздние сроки после введения ЛПС является новым фактом. Эмоционально-аффективный компонент ноцицепции у млекопитающих отражает эмоциональную реакцию на повреждение [Кукушкин М.Л. и др., 1994]. Формирование этого компонента происходит преимущественно в лимбических структурах головного мозга [Дегтярев В.П., 1998]. Усиление эмоционального компонента ноцицепции у крыс, наблюдающееся на 7-е сутки после внутрибрюшинного введения ЛПС, косвенно свидетельствует о развитии у животных вторичной гипералгезии под воздействием этого иммуноактивного соединения. Состояние вторичной гипералгезии у млекопитающих является результатом повышения возбудимости ноцицептивных нейронов в структурах головного мозга, может сохраняться длительное время [Кукушкин М.Л., 2007] и является одним из клинических симптомов центральной сенситизации [Данилов А.Б, Данилов Ал.Б., 2012].

ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

У КРЫС ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ ВВЕДЕНИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

В данном разделе представлены результаты анализа уровня цитокинов в периферической крови и тканях головного мозга у крыс в условиях внутрибрюшинного введения ЛПС. Определяли содержание провоспалительных (ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у и ФНО-а) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10). При выборе группы контроля мы опирались на опубликованные ранее данные о двухфазных колебаниях концентрации цитокинов у млекопитающих в различных состояниях, связанных с изменением иммунного статуса. Установлено, что продукция ряда цитокинов альвеолярными макрофагами крыс выражено возрастает в первые часы после введения ЛПС, но уменьшается в последующий период в динамике первых суток после антигенной стимуляции [Ren W. et al., 2011]. Обнаружено, что первоначальное увеличение концентрации цитокинов в крови больных сепсисом сменяется тенденцией к снижению или нормализации содержания указанных соединений [Мухоедова Т.В., Жидкова О.В., 2011]. Мы предположили, что в наших опытах время проведения исследований цитокинового профиля биологических тканей у крыс после воздействия ЛПС соответствуют периоду снижения или возврата содержания цитокинов к исходному уровню, характерному для интактных животных. Помимо этого, в наших экспериментах было выявлено, что концентрация цитокинов в сыворотке периферической крови и тканях структур мозга животных в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения физиологического раствора практически не отличается от таковой у интактных особей, не получавших инъекций. В связи с этим, изменения уровня цитокинов у крыс, наблюдающиеся на 1-е и 7-е сутки после введения ЛПС, анализировали по отношению к содержанию данных соединений у интактных особей (контроль).

Концентрация цитокинов в сыворотке крови у крыс после внутрнбрюшинного введения липополисахарида

Внутрибрюшинное введение крысам ЛПС сопровождалось изменениями содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке периферической крови (табл. 3). При сравнении с соответствующими показателями у интактных особей обнаружена тенденция к снижению концентрации ИЛ-lß в крови крыс через 1 сутки после инъекции ЛПС. На 7-е сутки после антигенного воздействия уровень данного цитокина в крови животных возрастал и практически не отличался от такового у интактных крыс. Содержание ИЛ-2 в сыворотке крови крыс на 1-е и 7-е сутки после введения ЛПС было меньше, чем у интактных особей. Однако эти различия не были статистически достоверны.

Внутрибрюшинное введение крысам ЛПС приводило к выраженному снижению концентрации ИЛ-1а в периферической крови животных в 1-е сутки исследования (в 3,5 раза, р<0,05 по сравнению с контролем). Содержание этого цитокина в сыворотке крови крыс возрастало на 7-е сутки после инъекции ЛПС и практически не отличалось от такового у интактных особей. Концентрация ИФН-у в сыворотке периферической крови животных выражено уменьшалась в 1-е сутки после введения ЛПС (в 4,1 раза, р<0,01). Уровень этого цитокина в крови крыс несколько возрастал на 7-е сутки после инъекции ЛПС, но оставался ниже контрольного значения. Содержание ФНО-а в сыворотке крови крыс, получавших инъекции ЛПС, уменьшалось в 3,9 раза в 1-й день после антигенного воздействия (р<0,05). На 7-е сутки исследования уровень данного цитокина в периферической крови животных увеличивался, но не достигал контрольного показателя. Концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови крыс уменьшалась в 3,8 раза в 1-е сутки после внутрибрюшинного введения ЛПС (р<0,05 по сравнению с интактными особями). Содержание данного цитокина в крови животных незначительно увеличивалось на 7-е сутки, но оставалось в 2,1 раза меньше контрольного показателя (статистически недостоверно).

Таблица 3. Концентрация цитокинов в сыворотке периферической крови крыс разных экспериментальных групп (пг/мл, М±т)

Цитокины Группа, число животных

I (интакгные), л=10 ІІ-1 (ЛПС - 1-е сутки), /1=12 ІІ-2 (ЛПС - 7-е сутки), и=12

ил-ір 2162,17+727,83 800,81+374,11 2013,03±1001,29

ИЛ-1а 1958,31±465,33 554,48±208,36* 1745,91±556,83

ИЛ-2 15200,09±4842,02 3657,38±1805,52 4074,92±2259,99

ФНО-а 5917,83+1740,63 1514,12±587,19* 2712,32± 1226,64

ИФН-у 1216,761292,29 293,31±125,24** 576,89±266,49

ИЛ-6 20255,74±5308,96 5380,82±2298г35* 9584,07±4053,35

ИЛ-4 6394,51+2130,92 1544,05±719,93* 3401,18+1597,33

ИЛ-10 5160,28+1290,22 1281,17±563,36* 2205,65±972,60

Примечание. */т<0,05 и **р<0,01 по сравнению с интактными крысами.

Внутрибрюшинное введение крысам ЛПС приводило к уменьшению концентрации противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови. В 1-е сутки после инъекции уровень ИЛ-4 и ИЛ-10 в периферической крови животных снижался соответственно в 4,1 и 4,0 раз по сравнению с таковым у интактных особей (р<0,05). Содержание этих цитокинов у крыс, получавших ЛПС, несколько возрастало на 7-е сутки после воздействия, но не достигало контрольных значений.

Таким образом, внутрибрюшинное введение крысам ЛПС сопровождается снижением уровня как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов в периферической крови, особенно в 1-е сутки исследования. Содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ИЛ-1Р в сыворотке крови животных возрастает на 7-е сутки после антигенного воздействия и практически не отличается от такового у интактных особей. Концентрация других изученных цитокинов в крови крыс несколько увеличивается на 7-е сутки после инъекции ЛПС, но остается меньше соответствующих контрольных показателей. Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о временной динамике изменений уровня цитокинов в сыворотке крови млекопитающих под влиянием ЛПС. Ранее установлено, что продукция ИЛ-фи ФНО-а в культуре альвеолярных макрофагов крыс наиболее выражено возрастает через 6 ч после введения ЛПС, но несколько снижается на 8-й час после воздействия [Яеп XV. е( а1., 2011]. В то же время, содержание ИЛ-6 достигало максимального значения только через 8 ч после стимуляции макрофагов ЛПС. Выявленное нами снижение концентрации цитокинов в периферической крови крыс на 1-е сутки после введения ЛПС, по-видимому, является, отсроченным эффектом, развивающимся в относительно поздний период после антигенного воздействия. Указанные изменения согласуются с недавно опубликованными данными о двухфазности колебаний содержания цитокинов в крови млекопитающих при системном воспалении. В работе Т.В. Мухоедовой и О.В. Жидковой (2011) показано, что первоначальное повышение уровня цитокинов у больных сепсисом сменяется снижением цитокиновых показателей на 3-е сутки исследования. В более поздний период обследования этих пациентов наблюдалась тенденция к увеличению концентрации провоспалительных цитокинов или возврат их содержания к исходному уровню (двухфазная кривая).

Цитокнновый профиль ткани структур головного мозга у крыс после внутрибрюшинного введения липополисахарнда

Числовые данные, отражающие концентрацию изученных цитокинов в дорсальном гиппокампе и передней поясной коре мозга крыс, представлены в табл. 45. При оценке содержания ИЛ-1Р в тканях головного мозга животных разных экспериментальных групп обнаружены лишь следовые количества указанного соединения. В связи с этим данные по концентрации ИЛ-1Р были исключены из дальнейшего анализа характера изменений уровня цитокинов в структурах мозга крыс после внутрибрюшинного введения ЛПС.

Содержание иитокинов в дорсальном гиппокампе крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида. Статистически значимых изменений уровня ИЛ-1а, ИЛ-2 и ФНО-а в дорсальном гиппокампе крыс, получавших внутрибрюшинные инъекции

ЛПС, не обнаружено (табл. 4). В отличие от содержания указанных цитокинов, концентрация ИФН-у в этой структуре головного мозга животных уменьшалась на 1 -е и особенно на 7-е сутки после антигенного воздействия (в 1,7 и 3,5 раз соответственно по сравнению с интактными особями). Однако указанные изменения не были статистически достоверны.

Концентрация ИЛ-4 в дорсальном гиппокампе крыс значительно возрастала на 1-е сутки после внутрибрюшинной инъекции ЛПС (в 1,5 раза, р<0,05 по сравнению с контролем). Уровень ИЛ-4 в тканях дорсального гиппокампа животных несколько снижался на 7-е сутки после введения ЛПС, но оставался выше соответствующего показателя у интактных особей. Концентрация ИЛ-10 в дорсальном гиппокампе крыс на 1-е и 7-е сутки после внутрибрюшинного введения ЛПС увеличивалась соответственно в 1,7 и 1,5 раз по сравнению с таковой у интактных животных. Выявленные после инъекции ЛПС изменения содержания данного цитокина в тканях дорсального гиппокампа крыс не были достоверны.

Таблица 4. Концентрация цитокинов в дорсальном гиппокампе крыс разных экспериментальных групп (пг/мл, М±т)

Цитокины Группа, число животных

I (интактные), л=10 ІІ-1 (ЛПС - 1-е сутки), и=12 Н-2 (ЛПС - 7-е сутки), п=12

ИЛ-13 _ - -

ИЛ-1а 13,71+1,81 16,12+1,83 14,08+1,58

ИЛ-2 24,53±11,16 29,79±8,82 28,38±13,65

ФНО-а 10,47±0,97 10,30+0,69 10,42+0,77

ИФН-у 21,90±7,34 12,91±2,84 6,26+2,92

ИЛ-6 _ 36,66+7,65 23,27± 10,78

ИЛ-4 4,71±0,82 6,96±1,35 * 5,49+0,68

ИЛ-10 43,33±9,67 72,89±10,95 64,75±8,62

Примечание. «-», следовые количества. */?<).05 по сравнению с интактными крысами.

Содержание иитокинов в передней поясной коре головного мозга крыс при внутоибрюшинном введении липополисахарида. Концентрация ИЛ- 1а, ИЛ-2 и ФНО-а в ткани передней поясной коры у животных, получавших ЛПС, была незначительно больше по сравнению с соответствующими показателями у интактных особей (табл. 5). Однако указанные различия не были статистически достоверны.

В отличие от выявленного в дорсальном гиппокампе крыс уменьшения содержания ИФН-у после внутрибрюшинного введения ЛПС, антигенная стимуляция сопровождалась тенденцией к повышению уровня этого цитокина в передней поясной коре мозга животных. Указанные изменения в тканях коры головного мозга крыс наблюдались на 1-е сутки и в меньшей степени на 7-е сутки после инъекции ЛПС (в 1,6 и 1,2 раз соответственно по сравнению с интактными особями).

Если в дорсальном гиппокампе крыс уровень ИЛ-4 возрастал на фоне антигенного воздействия, то в тканях передней поясной коры головного мозга животных содержание этого цитокина на 1-е и 7-сутки после введения ЛПС практически не отличалось от такового у интактных особей. Напротив, концентрация ИЛ-10 в тканях коры головного мозга животных значительно возрастала на 1-е сутки после внутрибрюшинной инъекции ЛПС (в 1,8 раза, р<0,05 по сравнению с контролем). Уровень ИЛ-10 в передней поясной коре мозга крыс на 7-е сутки после введения ЛПС оставался выше соответствующего показателя у интактных особей.

Таблица 5. Концентрация цитокинов в передней поясной коре мозга крыс разных экспериментальных групп (пг/мл, М±т)

Цитокины Группа, число животных

I (ннтактныс), л=10 П-1 (ЛПС - 1-е сутки), л=12 11-2 (ЛПС - 7-е сутки), л=12

ИЛ-13 _ _ -

ИЛ-1а 9,16±0,64 12,48±1,51 13,7±2,39

ИЛ-2 41,06±8,86 50,28+16,45 43,96±10,93

ФНО-а 11,22+1,92 13,28+1,25 11,27±0,97

ИФН-у 16,67+5,09 25,99±5,77 20,58±5,38

ИЛ-6 _ 22,32±3,36 16,81+5,51

ИЛ-4 7,41 ±1,96 8,54+1,87 6,97±1,18

ИЛ-10 43,05±10,89 77,04±13,93 * 75,72±11,58

Примечание. «-», следовые количества. *р<0,05 по сравнению с интактными крысами.

Таким образом, внутрибрюшинное введение крысам ЛПС сопровождается специфическими изменениями содержания цитокинов в дорсальном гиппокампе и передней поясной коре головного мозга. Результаты наших экспериментов дополняют имеющие научные данные о селективной чувствительности гиппокампа и новой коры головного мозга к интероцептивному стрессу, вызванному системным введением прелетальной дозы ЛПС [Пискунов А.К., 2011]. Показано, что внутрибрюшинное введение этого антигена в дозе 5 мг/кг приводит к увеличению содержания провоспалительных цитокинов в корковых областях мозга и дорсальном гиппокампе животных к 7-му часу исследования. Обнаружено, что на 1-е сутки после воздействия уровень этих цитокинов снижается в коре головного мозга, но продолжает расти в дорсальном гиппокампе.

Представленные результаты иллюстрируют формирование специфического цитокинового профиля дорсального гиппокампа и поясной области головного мозга крыс при внутрибрюшинном введении ЛПС. В отличие от наблюдающегося в этих условиях уменьшения концентрации как про-, так и противовоспалительных цитокинов в периферической крови животных, антигенная стимуляция приводила

преимущественно к повышению уровня противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 в изученных структурах мозга. Следовательно, периферическое введение животным ЛПС сопровождается смещением баланса между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами в структурах ЦНС в сторону преобладания последних. Результаты наших исследований косвенно подтверждают сведения об ингибиторном воздействии противовоспалительных цитокинов на синтез и выделение провоспалительных медиаторов [БЫтаисЫ Н. е! а!., 1999]. Полученные нами данные о характере изменений цитокинового профиля крови и структур головного мозга крыс при антигенной стимуляции дополняют современные представления о сложных реципрокных отношениях между иммунными процессами в периферических тканях и ЦНС у млекопитающих.

КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И НОЦИЦЕПТИВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У КРЫС ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ ВВЕДЕНИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

В данном разделе представлены результаты анализа корреляционных связей между концентрацией цитокинов в периферической крови, ткани головного мозга и ноцицептивными порогами у крыс при внутрибрюшинном введении ЛПС. В ходе выполненного анализа нами были обнаружены определенные корреляционные зависимости между содержанием провоспалительных (ИЛ-1а, ИЛ-ф, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у и ФНО-а) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) в сыворотке периферической крови и структурах мозга крыс разных экспериментальных групп. Но, исходя из основной цели наших исследований, особое внимание было уделено выявлению и описанию взаимосвязей между ноцицептивными показателями и уровнем цитокинов в биологических тканях у животных.

Статистически значимых корреляционных взаимосвязей между показателями ноцицептивной чувствительности и содержанием цитокинов в сыворотке периферической крови и структурах головного мозга у интактных крыс не было выявлено. Корреляционные связи между порогами болевой чувствительности животных и уровнем цитокинов в тканях головного мозга - дорсальном гиппокампе и передней поясной коре - в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения ЛПС не обнаружены.

Достоверные корреляционные взаимосвязи между ноцицептивными порогами и концентрацией цитокинов в сыворотке периферической крови животных выявлены лишь на 7-е сутки после инъекции ЛПС (табл. 6). В указанный период после антигенной стимуляции наблюдались обратные корреляционные связи латентного периода реакции отведения хвоста крыс при свето-термальном раздражении -

показателя перцептуального компонента ноцицепции - с содержанием противовоспалительного цитокина ИЛ-10 (г=-0,62, /КО,05) и провоспалительного ФНО-а в периферической крови (г=-0,66, р<0,05). У этих животных обнаружены отрицательные корреляции между уровнем противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и фоновыми показателями ноцицепции: ИЛ-4 и латентным периодом реакции отведения хвоста (г=-0,79, /т<0,05), ИЛ-10 и порогом вокализации (г=-0,61,р<0,05).

Таким образом, стадия появления статистически значимых корреляционных связей между иммунными и ноцицептивными показателями у крыс - 7-е сутки после внутрибрюшинного введения ЛПС — совпадает с временным периодом развития выраженных, сочетанных изменений как перцептуального, так и эмоционального компонентов ноцицепции животных при антигенной стимуляции. По-видимому, формирование в этот период наиболее тесных взаимосвязей между ноцицептивной чувствительностью и иммунными процессами вносит вклад в реализацию системной реакции организма на антигенное воздействие. Полученные данные способствуют пониманию механизмов регуляции ноцицепции с вовлечением иммунных факторов, в том числе, на основе функционального взаимодействия между глиальными клетками и нейронами головного мозга. Известно, например, что иммунные клетки, глия и секретируемые ими цитокины играют важную роль в процессах центральной сенситизации - повышении возбудимости ноцицептивных нейронов в структурах ЦНС [McMahon S.B., Koltzenburg М., 2005]. Обращает внимание тот факт, что уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в сыворотке периферической крови крыс отрицательно коррелировал с показателями как эмоционального, так и перцептуального компонентов ноцицепции. Результаты наших исследований косвенно подтверждают полученные ранее данные об антиноцицептивной активности ИЛ-10 у млекопитающих, что, по-видимому, связано с его способностью подавлять выработку провоспалительных цитокинов [Lee B.S. el al., 2013]. Полученные в первой серии экспериментов данные указывают на то, что изменения цитокинового профиля периферической крови и тканей мозга у крыс при внутрибрюшинном введении ЛПС сопровождаются повышением ноцицептивной чувствительности животных.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что усиление эмоционального и перцептуального компонентов ноцицепции, а также появление значимых корреляционных связей между ноцицептивными и иммунными показателями у крыс наблюдаются на 7-е сутки после антигенного воздействия.

Таблица 6. Корреляционная матрица исходных показателей ноцицепции у крыс, а также ноцицептивных порогов и концентрации цитокинов в сыворотке периферической крови животных на 7-е сутки после введения ЛПС

Показатель

ПВ - фон

ПВ-ЛПС, 7 сут

ЛПРОХ -

ЛПРОХ -ЛПС, 7 сут

ИЛ-1а

ИЛ-13

ИЛ-2

ИЛ-4

ИЛ-6

ИЛ-10

ИФН-у

ФНО-а

ПВ - фон

0,324779

0,057149

0,643577

-0,820783

-0,637748

-0,465919

-0,159584

-0,422434

-0.609779*

-0,507859

-0,601910

ПВ-ЛПС, 7 сут

0,324779

0,298342

0,196124

-0,205196

-0,091077

0,090787

0,279040

0,168604

-0,123950

0,109906

-0,071673

ЛПРОХ-фон

0,057149

0,298342

0,448155

-0,300000

-0,771429

-0,133739

-0,785714*

-0,109423

-0,350798

-0,090909

-0,337900

ЛПРОХ -ЛПС, 7 сут

0,643577

0,196124

0,448155

-0,800000

-0,771429

-0,553194

-0,642857

-0,516720

-0.618182* -0,575758 -0.660594*

ИЛ-1а -0,820783 -0,205196 -0,300000 -0,800000 0,700000 0,700000 0,900000 0,700000

ИЛ-1Р -0,637748 -0,091077 -0,771429 -0,771429 0,700000 1,000000 0,942857 1,000000

ИЛ-2 -0,465919 0,090787 -0,133739 -0,553194 0,700000 ' 1,000000 Сч^ФЙФ^ 0.952381 0,987805

ИЛ-4 -0,159584 0,279040 -0.785714* -0,642857 0,900000 0,942857 0,952381 «^ЭДв^Зрф^ 0,976190

ИЛ-6 -0,422434 0,168604 -0,109423 -0,516720 0,700000 1,000000 0,987805 0,976190

ИЛ-10 -0.609779' -0,123950 -0,350798 -0.618182* 0,700000 1,000000 0,996965 0,952381 0,984807

ИФН-у -0,507859 0,109906 -0,090909 -0,575758 0,900000 0,942857 0,984807 0,976190 0,972649

ФНО-а -0,601910 -0,071673 -0,337900 -0.660594* 0,900000 0,885714 0,975610 0,952381 0,963415

0,700000 1,000000 0,996965 0,952381 0,984807

0,900000 0,942857 0,984807 0,976190 0,972649

0,975758

0,975758

0,979501 ' 0,984807 ^

0,900000 0,885714 0,975610 0,952381 0,963415 0,979501 0,984807

Примечание. «ПВ-фон» и «ПВ-ЛПС, 7 сут» - порог вокализации крыс в исходном состоянии и на 7-е сутки после введения ЛПС соответственно; «ЛПРОХ-фон» и «ЛПРОХ-ЛПС, 7 сут» - латентный период реакции отведения хвоста крыс в исходном состоянии и на 7-е сутки после введения ЛПС соответственно. Жирным шрифтом с подчеркиванием выделены достоверные корреляции при £><0,05.

НОЦИЦЕПТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС

ПРИ ВВЕДЕНИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА В СТРУКТУРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА

В данном разделе представлены результаты заключительного этапа наших исследований - изучения характера изменений ноцицептивной чувствительности крыс при воздействии на иммунные процессы в тканях головного мозга. Перцептуальный и эмоциональный компоненты ноцицепции у животных изучали на 7-е сутки после микроинъекции ЛПС или физиологического раствора (в качестве контроля) в дорсальный гиппокамп или задний отдел поясного пучка мозга. Выбор данного периода наблюдений обусловлен тем, что выявленные ранее изменения болевой чувствительности крыс, а также взаимосвязи между иммунологическими и ноцицептивными показателями были более значимы в поздний период после внутрибрюшинного введения ЛПС (7-е сутки) по сравнению с таковыми, наблюдающимися в 1 -е сутки исследования.

Наши опыты продемонстрировали, что введение физиологического раствора в дорсальный гиппокамп крыс не приводит к статистически достоверным изменениям порогов ноцицептивных реакций по сравнению с исходными показателями (табл. 7). В указанных экспериментальных условиях выявлена лишь тенденция к увеличению ЛПРОХ и ПВ животных - в 1,02 и 1,07 раз соответственно. Показатели различных компонентов ноцицептивных реакций крыс при микроинъекции физиологического раствора в задний отдел поясного пучка изменялись разнонаправленно по сравнению с исходными значениями. На 7-е сутки после введения физиологического раствора выявлено незначительное увеличение ЛПРОХ (в 1,04 раза), но снижение ПВ животных (в 1,12 раза). Однако эти изменения были статистически недостоверны.

Таблица 7. Средние значения показателей ноцицептивных порогов у крыс после введения физиологического раствора в структуры головного мозга (М±т)

Подгруппа, число крыс; структура Экспериментальные условия ЛПРОХ, сек ПВ, мА

И-1, л=7 Дорсальный гиппокамп Исходно 2,34±0,13 0,70±0,07

Физ. раствор - 7-е сутки 2,39±0,15 0,75±0,06

Н-2, и=11 Задний отдел поясного пучка Исходно 2,88±0,11 0,84±0,05

Физ. раствор - 7-е сутки 3,00±0,07 0,75±0,09

Примечание. ЛПРОХ - латентный период реакции отведения хвоста (сек); ПВ - порог вокализации (мА).

Изучение характера влияния ЛПС при микроинъекции в различные структуры головного мозга крыс на ноцицептивную чувствительность животных показало следующее (табл. 8). На 7-е сутки после введения ЛПС в дорсальный гиппокамп

животных выявлено незначительное снижение ЛГГРОХ по сравнению с исходными показателями (в 1,08 раза). ПВ крыс в этих условиях возрастал в 1,57 раза (р<0,05). Введение ЛПС в задний отдел поясного пучка мозга животных сопровождалось статистически недостоверным — по сравнению с исходными значениями -увеличением ЛПРОХ, но выраженным снижением ПВ (в 1,43 раза, р<0,05).

Таблица 8. Средние значения показателей ноцицептивных порогов у крыс после введения ЛПС в структуры головного мозга (М±т)

Подгруппа, число крыс; структура Экспериментальные условия ЛПРОХ, сек ПВ, мА

1-1, «=12 Дорсальный гиппокамп Исходно 3,01 ±0,1 0,53±0,06

ЛПС - 7-е сутки 2,79±0,19 0,83±0,07 *

1-2, л=10 Задний отдел поясного пучка Исходно 2,63±0,14 0,60±0,08

ЛПС - 7-е сутки 2,91±0,20 0,42±0,06 *

Примечание. ЛПРОХ - латентный период реакции отведения хвоста (сек); ПВ - порог вокализации (мА). *р<0,05 по сравнению с исходным показателем.

Таким образом, ЛПРОХ у крыс, как показатель перцептуального компонента ноцицепции, практически не изменяется на 7-е сутки после микроинъекции ЛПС в изученные структуры головного мозга. Полученные результаты согласуются с опубликованными ранее данными о том, что экспериментальные воздействия на различные отделы поясной области у животных практически не оказывают влияния на перцептуальный компонент болевой чувствительности [Никенина Е.В., 2010]. Приведенные данные иллюстрируют относительную стабильность перцептуального компонента ноцицептивных реакций у крыс в условиях центрального введения ЛПС.

Проведенные опыты показали, что микроинъекция ЛПС в ткани мозга крыс приводит к разнонаправленным изменениям эмоционального компонента ноцицептивной чувствительности у животных. Установлено, что введение антигена в дорсальный гиппокамп сопровождается выраженным увеличением, а в задний отдел поясного пучка - снижением ПВ крыс при ноцицептивном раздражении хвоста на 7-е сутки исследования. Полученные результаты свидетельствуют о том, что центральное введение ЛПС крысам приводит к специфическим, зависящим от структуры мозга, изменениям эмоционального компонента ноцицепции: подавлению - при воздействии на дорсальный гиппокамп, но усилению - на задний отдел поясного пучка.

Выявленная нами специфика изменений эмоционального компонента ноцицептивных реакций у крыс при локальном введении ЛПС в дорсальный гиппокамп и поясную область головного мозга, по-видимому, связана с анатомо-физиологическими особенностями этих структур ЦНС. Известно, что гиппокамп у

млекопитающих содержит большое количество макрофагов - микроглию, активация которой при различных видах нейровоспаления приводит к увеличению секреции провоспалительных цитокинов [Raivich G. et al., 1999]. В дополнение к этому, усиление выраженности или хронизация воспалительного процесса в указанной структуре головного мозга повышает активность астроцитов, или макроглии, в дорсальном гиппокампе. Данные клетки способны не только продуцировать про- и противовоспалительные цитокины, но и играют важную роль в нейродегенеративных процессах, приводящих к гибели нейронов ЦНС [Gahtan Е., Overmier J.B., 1999]. Обнаруженное нами подавление эмоционального компонента ноцицепции у животных в ноздние сроки после инъекции ЛПС в дорсальный гиппокамп иллюстрирует гипоальгетический эффект этого антигена при указанном способе введения. Возможно, быстрая инактивация ЛПС за счет связывания со специфическими рецепторами в данной структуре мозга приводит к повышению выработки противовоспалительных цитокинов, которые могут предупреждать повышение болевой чувствительности [Wang Z. et al., 2012]. В отличие от гиппокампа, поясной пучок представлен исключительно аксонами; это - проводящие пути между различными структурами головного мозга. В поясном пучке мозга, в частности, выделяют основные группы восходящих волокон от таламуса, поясной извилины и близлежащего серого вещества [Mufson E.J., Pandya D.N., 1984]. Можно предположить, что направленные воздействия на поясной пучок мозга способствуют активации глиальных клеток в анатомически связанных с этой областью структурах, играющих роль в формировании эмоциональных реакций у млекопитающих. Применительно к полученным нами данным, эти особенности могут вносить вклад в усиление эмоционального компонента ноцицепции у животных при локальном введении ЛПС в поясную область головного мозга.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что антигенное воздействие на крыс посредством введения ЛПС приводит к изменению ноцицептивной чувствительности животных. Изменения эмоционального и перцептуального компонентов ноцицепции у крыс под влиянием ЛПС опосредованы специфическими механизмами, зависящими в частности от временного периода исследования и характера иммунных реакций при антигенной стимуляции. Представленные данные иллюстрируют тесное функциональное взаимодействие иммунных и нервных процессов, лежащее в основе регуляции болевой чувствительности V млекопитающих.

выводы

1. Антигенное воздействие на крыс посредством введения липополисахарида приводит к изменению ноцицептивной чувствительности животных, что находит отражение в особенностях цитокинового профиля крови и тканей головного мозга.

2. Содержание провоспалительных (интерлейкина-1а, интерлейкина-1р, интерлейкина-2, интерлейкина-6, интерферона-у и фактора некроза опухоли-а) и противовоспалительных цитокинов (интерлейкина-4 и интерлейкина-10) в периферической крови крыс уменьшается на 1-е и в меньшей степени на 7-е сутки после внутрибрюшинного введения липополисахарида.

3. Внутрибрюшинное введение крысам липополисахарида сопровождается специфическими изменениями уровня цитокинов в тканях головного мозга животных в разные временные периоды исследования. Антигенное воздействие у крыс приводит к повышению концентрации противовоспалительных цитокинов интерлейкина-4 и интерлейкина-10, но не влияет на содержание провоспалительных цитокинов в дорсальном гиппокампе и поясной области мозга.

4. Ноцицептивная чувствительность крыс повышается после внутрибрюшинного введения липополисахарида. В 1-е сутки после антигенного воздействия у животных наблюдается усиление только перцептуального, а на 7-е сутки - как перцептуального, так и эмоционального компонентов ноцицепции.

5. Взаимосвязь между ноцицептивными и иммунными показателями у крыс наиболее значима на 7-е сутки после внутрибрюшинного введения липополисахарида. В условиях антигенного воздействия у животных наблюдаются обратные корреляции между перцептуальным компонентом ноцицепции и уровнем провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли-а и противовоспалительного цитокина интерлейкина-10 в крови.

6. Введение липополисахарида в дорсальный гиппокамп сопровождается подавлением, а в поясную область мозга - усилением эмоционального компонента ноцицепции у животных на 7-е сутки исследования. Перцептуальный компонент ноцицептивных реакций у крыс не изменяется после внутримозгового введения липополисахарида.

7. Изменения эмоционального и перцептуального компонентов ноцицепции у крыс в разные временные периоды после введения липополисахарида опосредованы специфическими механизмами, зависящими, в частности, от характера воздействия на иммунный статус животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Abramov Yu.B., Abramova A.Yu.. Kozlov A.Yu., Ionkina E.G., Nikenina E.V. The immune component as a factor of nociceptive régulation // II International symposium "Interaction of the nervous and immune systems in health and disease". Saint Petersburg, 2009. Abstracts of Papers, p. 5.

2. Абрамова А.Ю. Влияние Имунофана на поведенческие реакции у крыс при периферической ноцицептивной стимуляции и раздражении неспецифических ядер таламуса // XII Школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии. Москва, 2009 г. Тезисы докладов, с. 36.

3. Абрамова А.Ю. Способность к обучению крыс с различной поведенческой активностью в тесте «тейл-флик» при наличии и отсутствии светового раздражителя // Первая Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций». Сафага, Египет, 2010 г. Тезисы докладов, с. 3-5.

4. Абрамова А.Ю. Активация иммунитета липополисахаридом и ноцицепция // VI Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» II Судак, Крым, Украина, 2010 г. Тезисы докладов, с. 34-35.

5. Абрамова А.Ю. Влияние иммуноактивных препаратов Пирогенал, Имунофан и пептида Семакс на ноцицептивные реакции у крыс // Шестая Российская конференция «Нейроиммунопатология». Тезисы докладов, Патогенез. - 2010. - Т. 8. -№ 1.-С. 27.

6. Абрамова А.Ю. Иммобилизационный стресс, гипертермия и ноцицептивные реакции у крыс // XXI Съезд физиологического общества им. Павлова. Калуга, 2010 г. Тезисы докладов, с. 5.

7. Абрамова А.Ю.. Абрамов Ю.Б. Ноцицептивные пороги и показатели гипертермии у крыс при действии липополисахарида (пирогенала) // Бюлл. экспер. биол. мед. — 2011.-T. 1S2. — № 8. - С. 124-127. (*)

8. Турин А.В., Абрамова А.Ю.. Перцов С.С., Судаков К.В. Содержание АТФ в поясном пучке головного мозга крыс при стимуляции вентромедиального гипоталамуса // Билл, экспер. биол. мед.-2011.-Т. 152.-№ 10. - С. 364-367. (*)

9. Никенина Е.В., Абрамова А.Ю.. Умрюхин А.Е. Влияние иммунизации крыс бычьим сывороточным альбумином и поливалентным адьювантом Фрейнда на болевую чувствительность//Росс, журнал, боли.-2011.-№ 1.-С. 16-19. (*)

10. Никенина Е.В., Абрамова А.Ю.. Умрюхин А.Е. Изменение ноцицептивных порогов у крыс с различной прогностической устойчивостью к стрессорной нагрузке после иммунизации БСА и ПАФ II VII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым, Украина, 2011 г. Тезисы докладов, с. 313.

11. Абрамова А.Ю- Особенности ноцицептивных реакций у крыс при введении липополисахарида в разные структуры головного мозга // VII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым, Украина, 2011 г. Тезисы докладов, с. 41.

12.Gourine А., Абрамова А.Ю., Перцов С.С., Судаков К.В.. Содержание АТФ в поясном пучке головного мозга крыс при стимуляции вентромедиального гипоталамуса // III Съезд физиологов СНГ, Ялта, Украина, 2011 г. Тезисы докладов, с. 84.

13.Азимова Ю.Э., Мещерина М.И., Сергеев A.B., Климов Е.А., Табеева Г.Р., Бычков A.A., Женило В.М., Игонькина С.И., Графова В.Е., Смирнова B.C., Кукушкин M.JL, Каракулова Ю.В., Козлов А.Ю., Абрамова А.Ю.. Никенина Е.В., Крупина H.A., Чурюканов М.В., Алексеев В.В., Лихачев С.А., Рыбакова В.Д. и др. Фундаментальные аспекты боли // XVII Научно-практическая конференция с международным участием «Болевые синдромы в медицинской практике», Ростов-на-Дону, Россия, 2011 г. Тезисы докладов. Росс, журнал боли. -2011. - Т. 31. -№ 2. - С. 8-20.

14. Козлов А.Ю., Абрамова А.Ю.. Никенина Е.В., Мезенцева Л.В. Ноцицептивные пороги у крыс при введении липополисахарида в лимбические структуры головного мозга // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2012. - № 5. - Т. 153. - С. 689-692. (*)

15. Козлов А.Ю., Абрамова А.Ю.. Никенина Е.В., Мезенцева Л.В. Ноцицептивные пороги у крыс при введении липополисахарида в специфические ядра таламуса головного мозга // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2012. - № 12. - Т. 154. - С. 674-678. (*)

16. Никенина Е.В., Абрамова А.Ю.. Козлов А.Ю. Ноцицептивная чувствительность и лимфоцитарный индекс периферической крови у крыс с разной поведенческой активностью на модели воспалительной боли, вызванной введением полного адьюванта Фрейнда и бычьего сывороточного альбумина // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2012. - № 5. - Т. 153. - С. 582-584. (*)

17. Козлов А.Ю., Никенина Е.В., Абрамова А.Ю. Эмоциональный компонент боли после стимуляции, введения местного анестетика и иммуноактивного вещества в каудальный отдел поясного пучка мозга у крыс // Седьмая Российская конференция «Нейроиммунопатология». Тезисы докладов. Патогенез. - 2012. - Т.10. - № 3. - С. 53.

18. Цатрян В.В., Абрамова А.Ю.. Никенина Е.В., Козлов А.Ю., Коновалов О.Н. Ноцицептивные реакции и лимфоцитарный индекс при введении липополисахарида в дорсальный гиппокамп и специфические ядра таламуса головного мозга крыс // Вторая Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций». Бодрум, Турция, 2012 г. Тезисы докладов, с. 192-193.

19. Козлов А.Ю., Абрамова А.Ю.. Никенина Е.В. Ноцицептивная реактивность при стимуляции иммунных процессов в лимбических и алгических структурах головного мозга крыс // Международный симпозиум по проблемам боли. Подходы к пониманию механизмов и лечению симптомов боли. Санкт-Петербург, 2012. Тезисы докладов, с. 55-56.

20. Никенина Е.В., Абрамова А.Ю.. Козлов А.Ю. Ноцицептивная чувствительность и лимфоцитарный индекс периферической крови у крыс с разной поведенческой активностью на модели воспалительной боли // Международный симпозиум по проблемам боли. Подходы к пониманию механизмов и лечению симптомов боли. Санкт-Петербург, 2012. Тезисы докладов, с. 74-76.

21 Абрамова А.Ю.. Никенина Е.В., Алексеева И В. Цитокиновый статус структур головного мозга у крыс при стимуляции иммунитета липополисахаридом // III Конференция молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология». Москва, 2012 г. Тезисы докладов, с. 3.

22. Сынкова Д А., Абрамова А.Ю- Никенина Е В. Изучение перцептуального компонента ноцицепции методом "tail-flick" при введении липополисахарида // III Конференция молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология». Москва, 2012 г. Тезисы докладов, стр. 41.

23. Цатрян В В., Никенина Е.В., Абрамова А.Ю. Эмоциональный компонент ноцицепции у крыс при внутрибрюшинном и подкожном введении липополисахарида // III Конференция молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология». Москва, 2012 г. Тезисы докладов, стр. 47-48.

24. А.Ю. Абрамова. С.С. Перцов, А.Ю. Козлов, Е В. Никенина, J1.C. Калиниченко, Е.Н. Дудник, И В. Алексеева. Содержание цитокинов в крови и структурах головного мозга у крыс при введении липополисахарида // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2013. - Т. 155. - № 4. - С. 405-409. (*)

Подписано в печать: 24.04.2013 Объем: 1,5 уел п л. Тираж: 100 экз. Заказ № 835 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Рождественка, д. 5/7 стр. 1 8 (495) 623-93-06; www reglet ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Абрамова, Анастасия Юрьевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» Российской академии медицинских наук

На правах рукописи УДК 591.1

04201357069

Абрамова Анастасия Юрьевна

НОЦИЦЕПТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: д.м.н. Перцов Сергей Сергеевич

Москва, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................13

2.1. Современные представления о боли ......................................................13

2.1.1. Механизмы восприятия и формирования боли ..........................15

2.1.2. Компоненты ноцицептивной реакции .........................................18

2.2. Иммунные процессы в реализации ноцицептивного ответа ...............21

2.2.1. Взаимосвязь иммунных и ноцицептивных реакций ..................21

2.2.2. Цитокины и ноцицепция ...............................................................24

2.3. Биологическая роль липополисахаридов ..............................................32

2.3.1. Общие сведения о липополисахаридах .......................................32

2.3.2. Механизмы действия липополисахаридов ..................................34

2.3.3. Липополисахариды и ноцицепция ...............................................42

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................48

3.1. Условия содержания крыс.......................................................................48

3.2. Определение показателей ноцицептивных реакций у крыс................48

3.2.1. Анализ перцептуального компонента ноцицепции....................48

3.2.2. Анализ эмоционального компонента ноцицепции.....................49

3.3. Исследование цитокинового профиля

периферической крови и тканей головного мозга крыс ......................50

3.3.1. Определение содержания цитокинов

в сыворотке крови крыс.................................................................50

3.3.2. Определение содержания цитокинов

в ткани структур мозга крыс .........................................................51

3.4. Схема экспериментов ..............................................................................51

3.4.1. Экспериментальная серия I...........................................................52

3.4.2. Экспериментальная серия II .........................................................54

3.5. Статистическая обработка данных.........................................................55

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ..................................................................56

4.1. Цитокиновый профиль сыворотки крови у крыс

при внутрибрюшинном введении липополисахарида .........................57

4.2. Цитокиновый профиль ткани головного мозга у крыс

при внутрибрюшинном введении липополисахарида .........................61

4.2.1. Содержание цитокинов в дорсальном гиппокампе крыс

после внутрибрюшинного введения липополисахарида ...........63

4.2.2. Содержание цитокинов в передней поясной коре головного мозга крыс после внутрибрюшинного

введения липополисахарида .........................................................66

4.3. Ноцицептивная чувствительность у крыс

при внутрибрюшинном введении липополисахарида .........................72

4.4. Корреляционный анализ иммунологических и ноцицептивных показателей

у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида ..............79

4.4.1. Корреляционный анализ ноцицептивных порогов и содержания цитокинов в сыворотке крови крыс........................80

4.4.2. Корреляционный анализ ноцицептивных порогов и содержания цитокинов в структурах головного мозга крыс ...._82

4.5. Ноцицептивная чувствительность у крыс при введении липополисахарида в структуры головного мозга .................................88

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .....................................................................96

6. ВЫВОДЫ .......................................................................................................116

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................. 118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон;

А-5 волокна - А-дельта волокна;

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер;

ИЛ-1 а - интерлейкин-1 -альфа;

ИЛ-1(3 - интерлейкин-1-бета;

ИЛ-2 - интерлейкин-2;

ИЛ-6 - интерлейкин-6;

ИЛ-4 - интерлейкин-4;

ИЛ-10 - интерлейкин-10;

ИФН-у - интерферон-гамма;

ЛПРОХ - латентный период реакции отведения хвоста;

ЛПС - липополисахарид;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

ц-опиоидные рецепторы - мю-опиоидные рецепторы;

ПВ - порог вокализации;

ТЛР - толл-лайк рецепторы;

ФНО-а - фактор некроза опухолей-альфа;

ЦНС - центральная нервная система;

ЭКГ - электрокардиограмма;

С014-рецептор - Cluster of differentiation 14 - рецептор;

DNA - deoxyribonucleic acid (дезоксирибонуклеиновая кислота);

IASP - International Association for the Study of Pain (Международная

ассоциация по изучению боли);

IgG - иммуноглобулин G;

IgM - иммуноглобулин М;

N0 - монооксид азота;

NMDA-рецептор - N-метил-О-аспартат - рецептор.

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Несмотря на достигнутые успехи в изучении различных аспектов формирования и развития болевых синдромов, исследование боли остается одной из наиболее актуальных проблем как в клинической медицине, так и в медико-биологической науке. В соответствии с определением, данным Международной ассоциацией по изучению боли (IASP, 1994 год), боль - это неприятное сенсорное и эмоциональное переживание, связанное с истинным или потенциальным повреждением ткани или описываемое в терминах такого повреждения. В современных экспериментальных исследованиях с целью четкой дифференцировки между физиологическими процессами и психологической реакцией на болевые воздействия применяют термин «ноцицепция», предложенный Ч.С.Шеррингтоном в 1900 году. Ноцицепция -нейрофизиологическое понятие, обозначающее восприятие, проведение и центральную обработку сигналов о вредоносных процессах и воздействиях.

Выделяют следующие пять основных компонентов ноцицептивной реакции млекопитающих: перцептуальный, эмоционально-аффективный, вегетативный, двигательный и когнитивный [Яхно H.H., Кукушкин М.Л., 2011]. Указанные компоненты ноцицепции доступны для изучения и анализа [Вальдман A.B., Игнатов Ю.Д., 1976; Буреш Я. и др., 1991; Мулик А.Б., Шатыр Ю.А., 2012; D'Amour F., Smith D., 1941; Alshahrawi S. et al., 2011; Gursoy S. et al., 2011]. Относительно недавно описан иммунный компонент ноцицептивного ответа [Никенина Е.В., 2010], исследование которого -относительно новый подход к изучению боли. Работы в этой области открывают новые перспективы к комплексной оценке периферических и центральных механизмов, лежащих в основе реализации системного ноцицептивного ответа у млекопитающих [Абрамов Ю.Б. и др., 2002].

В настоящее время накоплены данные, свидетельствующие о роли иммунологических механизмов в развитии болевых синдромов [Wiertelak Е.

et al., 1994; Yezierski R., 2001; Widerstrom-Noga E.G. et al., 2009; Rekand T. et al., 2012; Kukkar A. et al., 2013]. Между тем, отсутствует сопоставление данных экспериментально-клинических исследований болевого синдрома при патологических изменениях иммунитета и результатами, полученными в ходе анализа иммунозависимых механизмов регуляции ноцицепции в норме. В научной литературе имеются лишь отдельные сведения, указывающие на взаимосвязь между иммунным статусом и ноцицепцией у млекопитающих [Василенко A.M., 1995; Абрамов Ю.Б. и др., 2005].

Высокую актуальность в связи с этим приобретают исследования, посвященные изучению роли нейроиммунных взаимодействий в механизмах формирования боли. Особое внимание в этом плане уделяется корковым и лимбическим структурам ЦНС, в частности - дорсальному гиппокампу и поясной области мозга. Дорсальный гиппокамп, имеющий тесные анатомические и функциональные связи с ретикулярной формацией мозга, вовлечен в реализацию эмоционально-аффективного компонента боли [Liu M.G., Chen J., 2009]. Факт участия поясной коры и поясного пучка головного мозга в формировании ноцицептивного ответа у млекопитающих получил подтверждение в работах российских и зарубежных исследователей [Никенина Е.В. и др., 2006, 2010; Абрамов Ю.Б. и др., 2009; Johansen J.P. et al., 2001]. При этом существенно, что как гиппокамп [Магаева C.B., Морозов С.Г., 2005; Геворкян М.М. и др., 2010; Devi R.S. et al., 2004], так и поясная область мозга [Абрамов Ю.Б. и др., 2009; Abramov Y.B. et al., 2003] занимают важное место в модуляции иммунных реакций. Несмотря на значительный интерес к исследованию физиологических механизмов регуляции боли, роль функционального сопряжения нервных и иммунных процессов в системных ноцицептивных реакциях у млекопитающих остается неясной.

В плане изучения участия иммунной системы в формировании и реализации ноцицептивных реакций у млекопитающих отдельного внимания заслуживают цитокины. Цитокины — эндогенные полипептидные медиаторы межклеточного взаимодействия, участвующие в формировании и регуляции

защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008]. Существует несколько классификаций цитокинов, основанных на тех или иных свойствах этих иммуномодулирующих соединений. Одной из широко распространенных является классификация, предполагающая рассмотрение цитокинов в зависимости от доминирующего биологического действия [Фрейдлин И.С., 1998]. В соответствии с данной классификацией, цитокины подразделяются на провоспалительные (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-ос, ИФН-а, ИФН-уи др.) и противовоспалительные (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, ТФР-ß). В клинической практике и экспериментальных исследованиях активно используется термин «цитокиновый баланс», характеризующий соотношение про- и противовоспалительных цитокинов при различных физиологических и патологических состояниях. Это позволяет объективно оценить степень отклонений функциональной активности иммунной системы при различных изменениях иммунного статуса млекопитающих [Еричев В.П. и др., 2009].

Цитокины могут рассматриваться в качестве сигнальных молекул, информирующих мозг о состоянии - активации или подавлении - иммунных процессов на периферии. Продукция цитокинов является частью клеточного ответа, связанного с распознаванием клетками миеломоноцитарного ряда сходных структурных компонентов различных патогенов - патоген-ассоциированных молекулярных паттернов [Medzhitov R., Janeway С., 1997]. Такими структурами являются, например, липополисахариды грамотрицательных бактерий. После взаимодействия микроорганизмов или их компонентов с «толл-лайк» рецепторами (ТЛР) запускается каскад передачи сигнала, приводящий к изменению функциональной активности иммунных клеток и экспрессии генов цитокинов [Фрейдлин И.С., 1998].

Существуют немногочисленные данные, иллюстрирующие взаимосвязь между болевой чувствительностью и уровнем цитокинов в биологических тканях млекопитающих. В отдельных работах рассмотрены возможные

механизмы участия цитокинов в регуляции боли. К ним относятся, в частности, модулирующее действие этих биологически активных веществ на опиоидергические [Peek J. et al, 2006] и глутаматергические процессы [Ren К., Dubner R., 2008], секрецию кортикотропин-рилизинг гормона и дофамина [Bianchi M., Panerai А., 1995], активность простагландинов [Yabuuchi К. et al., 1996]. По мнению Ю.Б. Абрамова (2009), цитокины вовлекаются в регуляцию ноцицептивных реакций, обеспечивая взаимодействие глиальных клеток и нейронов. Однако в целом роль цитокинов в супраспинальных механизмах реализации ноцицептивного ответа изучена недостаточно.

Для исследования механизмов формирования и регуляции иммунных реакций достаточно широко применяются липополисахариды (ЛПС). ЛПС -естественные стимуляторы иммунных процессов, что обусловлено их присутствием в составе мембран микробных клеток. ЛПС относятся к классу бактериальных антигенов, запускающих каскад иммунных реакций в ЦНС и периферических иммунных органах, в том числе, высвобождение цитокинов [Basta-Kaim A. et al., 2012]. Установлено, например, что провоспалительные цитокины являются главными посредниками нейроэндокринных реакций на введение ЛПС [Quang D., Bach D., 2008]. ЛПС служат основными лигандами ТЛР, во многом определяющих нормальное протекание реакций врожденного иммунитета у млекопитающих [Buckley К., Rast J., 2012].

В современной научной литературе имеются указания о характере и механизмах влияния иммуноактивных веществ, в том числе ЛПС, на болевую чувствительность млекопитающих [Wadachi R., Hargreaves К., 2006; Cao L. et al, 2009; Seo J.W. et al, 2012]. Модулирующее воздействие ЛПС на ноцицептивные реакции связано, в частности, с изменением синтеза кининов и простагландинов [Matsuzaki S. et al, 2002], влиянием на нейрохимические процессы в ЦНС [Dunn A.J., 1992; Seo J.W. et al, 2012], повышением функциональной активности нейронов в структурах мозга [Gavrilov Yu. et al, 2008]. Таким образом, введение ЛПС является оптимальной моделью для экспериментального изучения механизмов ноцицепции.

Несмотря на большое число исследований, посвященных анализу физиологических и патофизиологических механизмов боли, многие вопросы в этой области остаются нерешенными. Сведения о роли иммуноактивных веществ, в том числе цитокинов, в формировании и реализации различных компонентов ноцицептивных реакций у млекопитающих немногочисленны и противоречивы. Требуют дальнейшего изучения центрально-периферические механизмы вовлечения иммунных факторов в системную организацию физиологических функций на разных стадиях болевого ответа. В литературе практически отсутствуют данные о роли различных структур головного мозга в реализации взаимодействия между нервными и иммунными процессами, лежащими в основе формирования и регуляции ноцицептивных реакций. Представленная работа направлена на решение этих вопросов.

Цели и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение участия иммунных процессов в формировании различных компонентов ноцицептивных реакций у крыс при периферическом и центральном введении липополисахарида.

В соответствии с общей целью, конкретными задачами работы были:

1. изучить изменения эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

2. определить содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в периферической крови крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

3. измерить концентрацию цитокинов в тканях дорсального гиппокампа и поясной области мозга у крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

4. выявить взаимосвязь между ноцицептивными показателями и уровнем цитокинов в периферической крови и тканях структур головного мозга крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;

5. установить возможные особенности участия дорсального гиппокампа и поясной области головного мозга крыс в реализации эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций при внутримозговом введении липополисахарида.

Научная новизна работы

В работе впервые показано, что внутрибрюшинное введение крысам липополисахарида приводит к специфическим изменениям ноцицептивной чувствительности животных в разные временные периоды исследования. Обнаружено, что в 1-е сутки после антигенной стимуляции происходит усиление только перцептуального, а на 7-е сутки - как перцептуального, так и эмоционального компонентов ноцицепции животных.

Установлено, что повышение ноцицептивной чувствительности крыс при воздействии липополисахарида сопровождается разнонаправленными изменениями уровня цитокинов в крови и тканях головного мозга. В отличие от наблюдающегося в этих условиях уменьшения концентрации провоспалительных (ИЛ-1а, ИЛ-1|3, ИЛ-2, ИЛ-6, интерферона-у и фактора некроза опухоли-а) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) в периферической крови животных, антигенная стимуляция приводит к увеличению содержания ИЛ-4 и ИЛ-10 в тканях дорсального гиппокампа и поясной области мозга. Показано, что формирование у крыс отрицательных корреляционных связей между ноцицептивными и иммунными показателями соответствует позднему периоду после введения липополисахарида.

Выявлено, что внутримозговое введение крысам липополисахарида не оказывает значимого влияния на перцептуальный компонент ноцицептивных реакций, но сопровождается выраженными изменениями эмоционального компонента ноцицепции животных на 7-е сутки исследования. Обнаружено, что микроинъекция указанного антигена в дорсальный гиппокамп приводит к подавлению, а в поясную область мозга - усилению эмоционального компонента ноцицепции у крыс.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в ходе выполненного исследования результаты могут быть использованы как в научно-исследовательской работе, так и в клинической практике. Теоретическое значение работы определяется расширением знаний о роли иммунных факторов в центральных и периферических механизмах формирования и реализации ноцицептивных реакций у млекопитающих. Представлены новые доказательства того, что изменения ноцицептивной чувствительности животных при введении липополисахарида опосредованы специфическими механизмами, зависящими в частности от харак�