Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности взаимодействия гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем у серых крыс, селекционируемых по поведению

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимодействия гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем у серых крыс, селекционируемых по поведению"

/

ШИХЕВИЧ

Светлана Геннадьевна

На правах рукописи

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГИПОФИЗАРНО-НАДПОЧЕЧНИКОВОЙ И ИММУННОЙ СИСТЕМ У СЕРЫХ КРЫС, СЕЛЕКЦИОНИРУЕМЫХ ПО ПОВЕДЕНИЮ

03 00.13 ФИЗИОЛОГИЯ

Автореферат

На соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2004

Работа выполнена в лаборатории эволюционной генетики Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель

кандидат биологических наук ОськинаИ. Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бажан Н.М. доктор биологических наук Идова Г.В.

Ведущая организация:

Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск.

Защита состоится_на заседании диссертационного

совета

Д.001.014.01 при Институте физиологии СО РАМН (630017, г. Новосибирск, ул. Тимакова,4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии

Автореферат разослан i4.Of.Of. Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Елисеева А.Г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Известно, что нервная, эндокринная и иммунная системы анатомически и функционально взаимосвязаны. Эти системы имеют общие регуляторные молекулы, включая стероидные гормоны, нейропептиды, медиаторы и цитокины, которые обеспечивают молекулярную основу для координированных реакций этих систем на изменения гомеостаза в ответ на стресс, воспаление или инфекцию. Особое место при этом занимает гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система (ГГНС), так как ее активность является определяющим фактором при нарушении гомеостаза, независимо от причин, вызывающих его (Wilder, 1995, Besedovsky and del Rey, 1996, Tumbull, Rivier, 1999). Во многих случаях регуляторные эффекты нейроэндокринных систем на функцию иммунных клеток опосредуются гормонами этой системы и, прежде всего, глюкокортикоидами (McEwen et al., 1997). Глюкокортикоиды являются важными медиаторами нейроэн-докрино-иммунных взаимодействий, обладая широким спектром регуляторных влияний на пролиферацию и секреторную активность практически всех иммуно-компетентных клеток (Munck et al., 1984, Bateman, 1989, Blalock, 1989). Так, они влияют на распределение иммунных клеток, ингабируют рост лимфоидных клеток и могут подавлять продукцию провоспалительных субстанций, включая цитокины, производные арахидоновой кислоты, гистамин и брадикинины (Derijk, Stenberg, 1995). Кроме того, глюкокортикоиды могут стимулировать генетически програми-рованную смерть клеток (апоптоз) (Wilder, 1995).

До недавнего времени считалось, что глюкокортикоиды являются мощными иммуносупрессорами. Это представление сложилось на основе исследований с использованием фармакологических доз глюкокортикоидов и синтетических гормонов, таких как дексаметазон. Однако в последние годы показано, что действие фармакологических и физиологических доз или эндогенных гормонов может иметь прямо противоположные эффекты (Ashwell et al., 2000, Steinberg, 2001). В настоящее время глюкокортикоиды рассматривают как модуляторы иммунной системы, которые могут иметь как супрессивное, так и стимулирующее влияние, изменяя ход и развитие иммунного ответа. При этом стероидные гормоны могут оказывать свое действие как непосредственно на компоненты иммунной системы, так и опосредованно через механизмы центральной нервной системы, изменяя продукцию и работу других модуляторов иммунной функции (MeEwen et al., 1997). Показано, что глюкокортикоиды способны смещать равновесие в дифференцировке предшественников Th: они подавляют образование и секреторную активность ТЫ и стимулируют Th2 (Derijk, Stenberg, 1995).

В свою очередь иммунная система способна модулировать активность ГГНС и поведенческие реакции организма. Показано влияние интерлейкина-1 (ИЛ-1), ИЛ-6 и фактора некроза опухолей на гипоталамус, ИЛ-1, ИЛ-2 и гормонов тимуса - на гипофиз, интерферона - на надпочечники (Захарова, Петров, 1990, Judd et al, 1995, Gonzalez-Hernandez et al, 1994). В процессе воспаления именно цитокины являются основными регуляторами функции ГГНС, а в некоторых ситуациях регулируют восприимчивость данной системы к гормональным сигналам внутри самой системы (Гриневич и др., 1999). Предполагается, что некоторые из этих цитокинов могут участвовать в функционировании ГГНС в условиях покоя и при действии стрессоров "неиммунной природы" (Гриневич и др., 1999, Turnbull, Rivier, 1995). В последнее время в литературе появились данные об участии цитокинов в поведенческих реакциях организма и развитии ряда психических заболеваний (Wilder, 1995).

1 ------

ГСС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

oTZ^Q

В современной литературе достаточно широко представлены данные о роли ГГНС в развитии аутоиммунных заболеваний (Kavelaars et al, 1997, Dhabhar et al., 1995). При этом на моделях аутоиммунных заболеваний, которые спонтанно возникают у разных видов животных, прежде всего, наблюдаются изменения в периферическом уровне глюкокортикоидов, хотя молекулярные механизмы этих нарушений могут быть различны (Wick et al, 1998). Следует отметить, что изучение роли ГГНС при развитии аутоиммуных или воспалительных заболеваний проводится в основном на инбредных линиях животных, т.е. генетически однородных. Меньше всего в литературе затрагивается вопрос о связи ГГНС и иммунной систем с поведением и реорганизации взаимодействия между двумя системами при генетическом преобразовании поведения. К настоящему времени имеется только один пример исследования взаимосвязи этих регуляторных систем и поведения на аутбредных линиях крыс, селекционируемых на различную чувствительность к апоморфину (Ellenbroek, Cools, 2002).

Более 40 лет назад по инициативе Д. К. Беляева в Институте цитологии и генетики СО РАН начаты селекционные эксперименты по доместикации животных (Belyev, 1969). Согласно концепции Д. К. Беляева основным критерием при одомашнивании животных является элиминация агрессивного поведения по отношению к человеку (Беляев, 1966). С точки зрения научной идеологии экспериментов по доместикации эффекты отбора рассматриваются как следствие регуляторных изменений на организменном уровне, которые происходят на самых первых этапах отбора (Trut, 1998). Эксперимент по доместикации был начат на серебристо-черных лисицах. В настоящее время модельные эксперименты осуществляются на серебристо-черной лисице, американской норке и серой крысе. Однако новые для животных социальные условия и непосредственный контакт с человеком в процессе доместикации являются сильными стрессирующими факторами, поэтому отбор на домести-кационное поведени является и отбором на стресс-реактивность (Беляев, 1966, Belyev, 1969). Исследования, проводимые на разных объектах доместикации, продемонстрировали изменения в нейроэндокринных и нейрохимических системах организма, и в первую очередь ГГНС как гормональной системе адаптации и стресса (Оськина, Плюснина, 2000, Попова, 2000, Науменко и др., 1987, Науменко, Беляев, 1981, Oskina, 1996).

Следует отметить, что в популяциях животных, содержащихся на промышленных фермах или в лабораторных условиях, также происходит бессознательный отбор на уменьшение агрессии по отношению к человеку. Однако данный отбор идет значительно медленнее и имеет меньшее влияние на поведенческие и эндокринные характеристики, чем направленный отбор на доместикационное поведение (Трут и др., 2004, Kiinzl et al., 2002, Trut, 1999, Plyusnina, Oskina, 1997). Поэтому был начат отбор лисиц и крыс на поддержание и усиление агрессивного поведения по отношению к человеку. В недавно опубликованной работе было показано, что агрессивные и совхозные популяции лисиц достоверно не отличаются по различным показателям активности ГГНС (Gulevich et al., 2004). Это дает нам основание рассматривать линию крыс, селекционируемых на усиление агрессивного поведения, в качестве контроля для доместицируемой линии крыс.

Как уже сказано выше, существует тесная взаимосвязь между ГГНС, иммунной системой и поведением. Они взаимно влияют друг на друга на протяжении всего периода индивидуального онтогенеза. Однако, если изучению преобразований поведения и нейроэндокринных систем при отборе животных на доместикационное

поведение посвящено достаточное количество работ, то до последнего времени исследования иммунной системы и ее взаимоотношений с нейроэндокринными системами не проводились.

Целью данной работы было изучение взаимодействия гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем у серых крыс, селекционируемых на домести-кационное и агрессивное поведение по отношению к человеку.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. изучить реакцию гипофизарно-надпочечниковой системы (ГНС) на стрес-сорные и иммунологические стимулы у ручных и агрессивных животных;

2. исследовать первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ и изменения активности ГНС при развитии гуморального ответа у крыс, селекционируемых по поведению;

3. изучить активность ГНС при длительном 4-часовом и хроническом 10-дневном рестрикционном стрессе и влияние данных воздействий на гуморальный иммунный ответ у животных контрастного поведения;

4. исследовать клеточный иммунный ответ на примере реакции гиперчувствительности замедленного типа и экспериментальные модели аутоиммунных заболеваний с преобладанием Т-клеточных процессов у крыс, селекционируемых на доместикационное и агрессивное поведение.

Научная новизна. В данном исследовании впервые было изучено влияние отбора по поведению на различные аспекты иммунного ответа. Отбор на доместика-ционное поведение снижает не только базальную и стрессорную активность ГНС, но и ее реакцию на такие иммунные стимулы, как липополисахарид и ИЛ-2. Проведенные эксперименты показали, что первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ снижен у ручных крыс по сравнению с агрессивными. Уровень кортико-стерона в крови у ручных животных повышается в меньшей степени и остается повышенным более короткое время, чем у агрессивных животных в ответ на введение Т-зависимого антигена. Длительный стресс усиливает гуморальный иммунный ответ у обеих поведенческих групп, причем гуморальный иммунный ответ у ручных крыс после длительного стресса равен таковому у контрольных агрессивных животных. Повторяющийся стресс оказывает иммуностимулирующее действие только на животных с агрессивным поведением и не влияет на ручных. Клеточный иммунный ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа, а также преобладающий в экспериментальном артрите и энцефаломиелите, развивается в большей степени у ручных крыс по сравнению с агрессивными. Полученные результаты свидетельствуют, что отбор на элиминацию агрессивного поведения по отношению к человеку изменяет функционирование иммунной системы и, по-видимому, одну из ключевых ролей в этом играет гипофизарно-надпочечниковая система.

Научно-практическая значимость работы. Данное исследование расширяет представления о взаимосвязи ГГНС и иммунной систем. Кроме того, освещает ранее не исследованный вопрос об иммунном статусе животного при отборе на домести-кационное поведение. Это может помочь в прогнозировании предрасположенности и риска аутоиммунных заболеваний в различных популяциях доместицированных животных. Результаты исследования используются в качестве материала для курса лекций Плюсниной И.З. "Физиология ВИЦ и поведение", читаемого на 4 курсе ФЕН и 2 курсе ПФ НГУ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции памяти Е. В. Науменко "Genetic and developmental

psychoneuroendocrinology" (Новосибирск, 1999), V Всероссийской конференции "Нейроэндокринология-2000", посвященной 75-летию Андрея Львовича Поленова (1925-1996) (Санкт-Петербург, 2000), второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии", посвященной 80-летию со дня рождения профессора М. Г. Колпакова (Новосибирск, 2002), всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты" (Новосибирск, 2002), XIX съезде физиологического общества имени И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы, включающий наименований. Работа изложена на 124 страницах, содержит 19 рисунков и 3 таблицы.

Благодарности. Автор выражает благодарность И.З. Плюсниной за предоставленных серых крыс, селекционируемых по поведению и Н.А. Поповой за помощь в освоении методик и обсуждении результатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для экспериментов служили две популяции серых крыс (Rattus norvegicus), которых с 70-х годов селекционировали на усиление и ослабление агрессивной реакции по отношению к человеку. Селекция крыс проводилась в аут-бредном режиме Плюсниной И.З. Животные содержались в стандартных условиях вивария ИЦиГ. В опыт были взяты половозрелые самцы 49-59 поколения селекции. Всего исследовалось 329 животных из них 163 агрессивных и 156 ручных крыс, каждая группа состояла из 9-14 особей. Животные за 4 суток до начала эксперимента рассаживались в индивидуальные клетки. Пробы крови для определения уровня кортикостерона брали из хвостовой вены в гепаринизированные полиэтиленовые пробирки, затем центрифугировали в течение 15 минут при 4000 об/мин. Плазму хранили при температуре -20 °С до определения гормона. Измерение уровня корти-костерона в плазме крови проводили методом конкурентного белкового связывания (Murphy, 1967) в модификации Тинникова А.А. и Бажан Н.М. (1984).

Для оценки активации ГНС на стрессорные и иммунные стимул отдельным группам животных были произведены следующие инъекции: одной группе вводили рекомбинантный ИЛ-2 человека (МПО "Вектор", Кольцове), разведенный в физиологическом растворе по 600 ЕД на крысу внутрибрюшинно, другой - липополиса-харид (Е. coli серотип 055В5, Sigma), разведенный в физиологическом растворе в дозе 250 мкг/кг веса тела животного, третью группу животных помещали в сетчатые металлические трубки диаметром 5 см (Науменко, Дыгало, 1979) на 20 минут (20-минутный рестрикционный стресс).

Гуморальный иммунный ответ оценивался на 5 сутки после внутрибрюшин-ного введения эритроцитов барана (по 2Х10? клеток на крысу) по количеству анти-телообразующих клеток (АОК) в селезенке. Для исследования вторичного гуморального иммунного ответа крысам контрастного поведения дважды, с промежутком в 14 дней, была сделана инъекция эритроцитов барана (по клеток на крысу), количество АОК в селезенке было определено на 19 день эксперимента. Количество АОК в селезенке определяли методом локального гемолиза в жидкой среде (Cunningham, 1965). Титры антител в плазме крови был измерен при помощи реакции прямой агглютинации ЭБ (Bhatnagar et al., 1996).

Влияние стресса на уровень гуморального иммунного ответа исследовали на примере длительного 4-часового рестрикционного стресса и хронического стресса (часовое ограничение подвижности, повторяющееся 10 дней). После окончания стрессорных воздействий опытную группу животных иммунизировали эритроцитами барана. Контрольные группы составляли интактные крысы, которым в это же время была сделана инъекция аналогичного количества антигена.

Клеточный иммунный ответ оценивался по реакции гиперчувствительности замедленного типа. Для этого крысам внутрибрюшинно вводили эритроциты барана в количестве 2x10' клеток на крысу (0,5 мл 50% суспензии эритроцитов барана), повторную иммунизацию проводили в подушечку одной из задних лап по 0,2 мл 50% суспензии эритроцитов барана. Степень проявления реакции измеряли по разнице в весе контрольной лапы и лапы, в которую была сделана инъекция.

Экспериментальный артрит у крыс вызывали введением парафиновое масло, содержащего 10 мг/мл микобактерий (Mycobacterium Butyricum, DIFCO laboratories, USA), 0,1 мл, подкожно, в основание хвоста (Sarlis et al., 1992). Контрольным животным была сделана инъекция парафинового масла. Выраженность заболевания определяли по разнице в объеме лап у контрольных и опытных животных. Другой моделью аутоиммунного заболевания был экспериментальный аллергический энцефаломиелит. Для его индукции крысам вводили 0,1 мл раствора основного белка миелина содержащего 1,5 мг основного белка миелина (Sigma Chemical Co, USA) в 1 мл физиологического раствора с добавлением 1 мл полного адъюванта Фрейнда (DIFCO laboratories, USA), подкожно в одну из задних лап. Степень заболевания с 7 по 25 день эксперимента определяли по следующим параметрам: 0 — нет проявлений, 1 — мягкий хвост, 2 — паралич хвоста, 3 — паралич одной лапы, 4 — паралич обеих лап, 5 — паралич до диафрагмы.

Статистический анализ результатов экспериментов проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующим сравнением межгрупповых различий критерием Ньюмена-Кейлса, учитывающим повторные измерения (ANOVA-MANOVA) (программа для ПЭВМ STATISTICA). Для сравнения внутри одной поведенческой группы использовался и t-критерий Стъюдента для зависимых переменных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнение реакций ГНС на стрессорные стимулы эмоциональной и иммунной природы показало, что у ручных крыс активность этой системы значительно снижена как при действии рестрикционного стресса, так и после введения ЛПС и ИЛ-2 (рис. 1). Во всех исследованных временных точках, кроме 4 часов после стресса, уровень кортикостерона в крови у ручных животных был достоверно ниже, чем у агрессивных (Fuo=53,34, Р<0,001). У ручных и агрессивных крыс была различна и динамика реакции ГНС на стрессорное воздействие

Липополисахарид (ЛПС) является компонентом клеточной стенки бактерий и его введение моделирует инфекционное воздействие на организм. Известно, что при введении ЛПС выделяются такие цитокины как ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа (Givalois et al, 1994), которые активируют ГГНС. Различия в реакции ГНС на введение ЛПС между агрессивными и ручными животными были достоверны Во

всех исследованных временных точках у ручных животных уровень гормона был в 2 и более раза ниже, чем аналогичное значение у агрессивных (рис. 1Б). Через час после инъекции уровень гормона у ручных и агрессивных животных достоверно повышался по сравнению с базальным уровнем (Р<0,01 и Р<0,001 соответственно).

Следует отметить, что в отличие от эмоционального стресса уровень гормона и через 4 часа после инъекции остается повышенным, и значительно превышал базаль-ные значения. Это, возможно, связано с тем, что сам очаг воспаления или экзогенный ЛПС способны модифицировать отрицательные обратные связи (^ИёепГеИ, Уиш1уа, 1996).

Рис.1. Динамика уровня кортикостерона в плазме крови у агрессивных и ручных крыс при действии 20-минутного рестрикционного стресса (А), липополисахарида (Б) и ИЛ-2 (В) Баз - базальный уровень, 0, 1, 2, 4 - уровень сразу и через 1, 2, 4 часа после воздействия * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001 по сравнению с агрессивными крысами, + Р<0,05, ++ Р<0,01, +++ Р<0,001 по сравнению с базальным уровнем.

ИЛ-2, который участвует в механизмах активации лимфоидных клеток, также активирует и ГНС (СЬеБпокоуа, Вшюк, 1992; В1а1оск, 1994; Оагёеппе, 8аушо, 1996) (рис. 1В). У разных поведенческих групп различалась как реакция ГНС на введение ИЛ-2 (Р[ |з=39,85, Р<0,001) , так и динамика ответа этой системы на него (Бз 39=13,25, Р<0,001)„ Через час после введения цитокина наблюдалось значительное повышение содержания кортикостерона в крови (Р<0,001). Причем его абсолютное значение было одинаково у обеих групп крыс. У агрессивных крыс уровень гормона в крови продолжал оставаться высоким, достоверно не изменяясь и через 4 часа после введения ИЛ-2, что совпадает с имеющимися в литературе данными (КагапШ, 1991). У ручных же животных через 2 часа после инъекции происходило резкое падение уровня кортикостерона в крови, и его значение достоверно не отличалось от базального.

Таким образом, при отборе серых диких крыс на доместикационное поведение изменяется реакция ГНС на иммунологические стимулы. Динамика изменения уровня кортикостерона у агрессивных крыс сходна как при введении ЛПС, так и ИЛ-2. У ручных же животных снижена реакция на введение ЛПС по сравнению с агрессивными. В то время как инъекция ИЛ-2 вызывает повышение кортикостерона

до одного и того же уровня у обеих поведенческих групп, но у ручных он значительно быстрее возвращается к базальным значениям по сравнению с агрессивными.

Рис. 2. Первичный (А) и вторичный (Б) гуморальный иммунный ответ у агрессивных и ручных крыс. * Р<0.01, *** Р<0.001 по сравнению с агрессивными.

Первичный гуморальный иммунный ответ снижен у ручных крыс по сравнению с агрессивными (рис.2А). Хотя из-за особенностей метода ошибки среднего были велики, и полученные различия в количестве АОК между ручными и агрессивными животными были значимыми только с достоверностью Р<0,1. Однако относительное число АОК у ручных животных было достоверно меньше, чем у агрессивных (Р<0,02).

Вторичный иммунный ответ вызывался повторным введением Т-зависимого антигена на 14 сутки после первой инъекции (рис.2Б). У ручных крыс абсолютное число АОК было в 9 раз, а относительное в 7 раз ниже аналогичных показателей агрессивных животных (Р<0,001). Следует отметить, что относительное количество АОК в селезенке при вторичном ответе было значительно выше, чем при первичном иммунном ответе. Известно, что после окончания первичного иммунного ответа в организме сохраняются клетки памяти, которые и обеспечивают более интенсивное и специфичное образование антител при повторной встрече с тем же антигеном. На основании данных по вторичному иммунному ответу можно предположить, что у ручных крыс уменьшено и количество клеток иммунологической памяти.

В литературе существуют противоречивые данные об активации ГНС в ходе иммунного ответа (Везеёоузку й а1., 1983; Ме Е%>еп й а1., 1997; Воиег й а1., 2001), поэтому представляло интерес исследование активности этой системы при развитии гуморального иммунного ответа. У агрессивных и ручных крыс различалась как реакция ГНС, наблюдавшаяся в ходе иммунного ответа (р1,п=41,27, Р<0,001), так и динамика этой реакции (р4,б8=Ю,64, Р<0,001). Максимальная реакция ГНС на введение ЭБ у обеих групп животных наблюдалась на 1 сутки, причем у ручных эта реакция была в 2 раза меньше, чем у агрессивных (Р<0,001). Однако если у ручных животных уровень гормона значительно снижался (Р<0,01) и достоверно не отличался от базальных значений, то у агрессивных животных на 5 сутки уровень кортикосте-рона практически не изменялся по сравнению с уровнем на 1 сутки после введения ЭБ.

Уровень кортикостерона в крови у ручных крыс при вторичном иммунном ответе (рис.ЗБ) также как и при первичном ответе бьи достоверно ниже у ручных крыс по сравнению с агрессивными п=38,98, Р<0,001).. На 5 день после однократной иммунизации наблюдалось достоверное повышение уровня кортикостерона в крови у обеих поведенческих групп (Р<0,05). На 14-й день эксперимента уровень кортикостерона не изменялся у животных с разным типом поведения по сравнению с 5-м днем. Затем на 19-й день эксперимента у ручных животных происходило дос-

товерное его увеличение (Р<0,001), тогда как у агрессивных крыс не наблюдалось дальнейшего изменения уровня гормона. В литературе имеются данные, что стрес-сорный уровень кортикостерона при введении антигена стимулирует развитие иммунного ответа (Shanks, Kusnecov, 1998). Вероятно, повышенное содержание кортикостерона в крови перед повторной иммунизацией также вносит свой вклад в развитие более высокого вторичного иммунного ответа у агрессивных животных по сравнению с ручными.

Рис. 3. Динамика содержания кортикостерона в крови в ходе первичного (А), вторичного иммунного ответа (Б) и титр антител в крови при вторичном иммунном ответе (В) у агрессивных и ручных крыс. Баз - базальный уровень, 4 4- уровень через 4 часа, 1 Д. 5 Д, 14 Д, 19 Д - уровень через 1, 5, 14 и 19 дней после введения эритроцитов барана. * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001 по сравнению с агрессивными крысами. + Р<0,05, ++ Р<0,01,+++ Р<0,001 по сравнению с базальным уровнем # Р<0,05, ### Р<0,001 по сравнению с 19 днем.

Продуктом гуморального иммунного ответа являются антитела. Титр антител после однократного введения ЭБ на 5-й, и 14-й дни у ручных крыс был почти в 2 раза ниже, чем агрессивных (рис.ЗВ). Двухфакторный дисперсионный анализ также показал, что достоверно различался как титр антител между поведенческими группами (р|,18=12,58, р<0,01), так и общая динамика его изменения (Ег.36^,97, Р=0,01). Достоверных отличий между 5-м и 14-м днями по данному показателю не наблюдалось ни у одной из поведенческих групп. При вторичном иммунном ответе, на 19-й день эксперимента, у ручных крыс он достоверно увеличивался (Р<0,001 по сравнению с 5-м днем, Р<0,05 - с 14-м днем), в то время как у агрессивных животных титр антител существенно не менялся по сравнению с предыдущими днями. Следует отметить, что более низкому титру антител в крови у ручных крыс по сравнению с агрессивными соответствует и меньшее количество АОК в селезенке (рис.ЗВ и 2Б). Таким образом, проведенные исследования показали, что как первичный, так и вторичный гуморальный иммунный ответ на введение Т-зависимого антигена снижены у ручных крыс по сравнению с агрессивными. Кроме того, у ручных животных, в ходе гуморального иммунного ответа, ГНС активируется в меньшей степени, чем у агрессивных.

а е а

Рис 4 Динамика кортикостерона в крови крыс на 1-ьй (А), 5-ый (Б) и 10-ый (6) дни хронического рестрищионного стресса (одночасовая рестрикция в течение 10 дней) 1 - ба-зальный уровень, 2 и 3 - уровни через 30 мин и 1 час после начала стресса, 4 - уровень через 1 час после окончания стресса * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,С01 по сравнению с агрессивными крысами + Р<0,05, ++ Р<0,01, +++ Р<0,001 по сравнению с аналогичной точкой в 1-й день стресса

Гуморальный иммунный ответ чувствителен к модулирующим влияниям различных стрессорных стимулов (Соске et 1993, Zarbcman, Anisman, 1993). В данной работе использовались хронический 10-дневный и длительный 4-часовой рестрикционные стрессы предъявляемые непосредственно перед иммунизацией. Ранее описанные результаты свидетельствуют о том, что наряду с изменениями поведения в ходе доместикации происходит изменение активности ГНС как в покое, так и при стрессе (рис.1 А, Оськина, Плюснина, 2000). Результаты по действию хронического стресса, представленные на рис. 4, полностью совпадают с этими данными. Из рисунка видно, что в большинстве исследованных временных точек уровень кортикостерона в крови агрессивных животных был выше, чем у ручных. Двухфактор-ный дисперсионный анализ показал достоверные различия между поведенческими группами по уровеню кортикостерона на 1, 5 и 10 дни (Б),14=21,77, Р<0,001; Б],¡9=34,13, р<0,001; р1,19=55,16, Р<0,001, соответственно). У агрессивных животных не наблюдалось снижения максимального уровня кортикостерона в ответ на стресс, но базальный уровень и его концентрация в крови через 1 час после окончания стресса достоверно снижались к 10 дню. В то же время у ручных животных максимальный уровень кортикостерона в плазме крови уже на 5 день становился достоверно ниже по сравнению с аналогичным показателем в первый день эксперимента. По-видимому, у ручных крыс, в отличие от агрессивных, наблюдалось привыкание к действию стресса. Можно предполагать, что у этих животных под влиянием 10-дневного стресса происходит усиление отрицательной обратной связи в ГНС. Наши результаты согласуются с данными литературы. Крысы с более низкой активностью ГНС быстрее адаптируются к условиям 10-дневного стресса (Dhabhar et э1., 1997).

Рис. 5. Динамика кортикостерона в крови у агрессивных и ручных крыс в ходе длительного рестрикционного стресса. Баз - базальный уровень, 1,2, 3 и 4 -уровень через 1, 2, 3 и 4 часа после начала стресса. +++ Р<0,001 по сравнению с базальным уровнем.

Результаты, полученные в ходе длительного стресса в целом совпадают с данными, полученными в ходе 10-дневного стресса (рис.5). Уровень кортикостерона при действии длительного стресса достоверно ниже у ручных крыс по сравнению с агрессивными ^7=4,88, Р=0,05). Ответ ГНС на длительный стресс наблюдался во всех исследованных временных точках, что выражалось в достоверном увеличении уровня кортикостерона у обеих поведенческих групп по сравнению с базальными значениями.

Результаты влияния хронического 10-дневного стресса на величину гуморального иммунного ответа представлены на рис. 6А. Общее число АОК было более чем в 12 раз ниже у ручных крыс по сравнению с агрессивными (Р<0,001). Хронический стресс не влиял на общее количество АОК у ручных крыс. В то же время стрессорное воздействие приводило к достоверному увеличению аналогичного показателя у агрессивных крыс по сравнению с контролем (Р<0,05), что еще больше усиливало различия между двумя поведенческими группами животных. 10-дневный стресс не оказывал достоверного влияния на относительное число АОК у обеих поведенческих групп. Этот показатель был достоверно ниже у ручных крыс по сравнению с агрессивными животными, как в контроле, так и после стресса. Так как стрессорное воздействие не влияло на относительное содержание АОК, можно сделать вывод, что увеличение их числа у стрессированных агрессивных крыс происходило за счет увеличения содержания в селезенке клеток-предшественников - В-

лимфоцитов (Корнева, 1993). Можно предположить, что у ручных крыс не наблюдалось подобных изменений количестве АОК из-за адаптации к действию хронического

стресса.

Рис. б. Первичный гуморальный иммунный ответ у агрессивных и ручных крыс после 10-ти дневного (А) и 4-часового (Б) стрессорных воздействий. * Р<0,05, " Р<0,01 *** Р<0,001 по сравнению с агрессивными + Р<0,05, +++ Р<0,001 по сравнению с контролем.

На рис. 6Б представлен гуморальный иммунный ответ у крыс разного поведения в контроле и после длительного стресса. Абсолютное количество АОК из-за большого разброса значений достоверно не различалось между поведенческими группами, как в контроле, так и после длительного стресса. После стрессорного воздействия абсолютное количество АОК увеличилось у обеих групп животных, но это увеличение было достоверно только у ручных крыс (Р<0,05). У контрольных ручных крыс, без стрессорного воздействия, относительное количество АОК в селезенке было существенно ниже, чем у агрессивных (Р<0,05). Рестрикционный стресс повышал этот показатель гуморального иммунного ответа у крыс обоего типа поведения (Р<0,05). При этом различия в относительном числе АОК между ручными и агрессивными крысами после действия стресса были более выражены, так как у ручных крыс относительное количество АОК при стрессе возрастало менее чем в два раза, а у агрессивных в 3 раза.

Инъекция антигена была произведена непосредственно после окончания стрессорного воздействия. Известно, что стресс, производимый перед иммунизацией, увеличивает иммунный ответ (Соске et al., 1993, Zarbcman, Anisman, 1993). Из полученных нами данных видно, что гуморальный иммунный ответ усиливался в меньшей степени у ручных животных по сравнению с агрессивными. Как уже отмечалось выше, и реакция ГНС на стресс у ручных крыс была слабее, чем у агрессивных. Данные литературы свидетельствуют о разном влиянии стресса на гуморальный иммунный ответ у мышей линий BALB/cByJ и C57BL/C различающихся также и по активности ГНС (Shanks, Kusnekov, 1998), что подтверждает факт влияния активности ГНС животного на чувствительность его иммунного ответа к стрес-сорным воздействиям.

По-видимому, значительный вклад в наблюдаемые различия в уровне гуморального иммунного ответа в норме и после стресса у агрессивных и ручных животных вносят изменения в активности ГНС, которые возникли в результате доместикации. В недавно опубликованной работе Fleshner с соавторами (2001) показано, что величина базального уровня кортикостерона важна для начала синтеза иммуноглобулинов класса М, а повышение уровня этого гормона на 5 и 7 дни после введения антигена необходимо для переключения синтеза на иммуноглобулины класса G. Поэтому у адреналэктомированных животных снижен уровень ответа обоих иммуноглобулинов на антигенную стимуляцию (Fleshner et al.,1995). Предполагается, что глюкокортикоиды играют важную роль в ходе иммунной реакции, принимая участие в определении преимущественного направления ее развития в сторону клеточного или гуморального иммунного ответа (McEwen et al., 1997). К настоящему времени опубликован ряд данных о том, что у инбредных и аутбредных линий животных с повышенной активностью ГНС наблюдается преимущественно гуморальный, а у животных с пониженной активностью — клеточный иммунный ответ (Kavelaars et al., 1997, McEwen et al., 1997).

Во всех предыдущих экспериментах исследовался гуморальный иммунный ответ в результате развития которого, повышается содержание специфических антител в организме. Другой составной частью иммунной реакции является клеточный иммунный ответ, в ходе которого активируются различные популяции иммуноком-петентных клеток, такие как Т-киллеры и макрофаги. Следующей задачей данной работы являлось изучение клеточноопосредованного иммунного ответа у серых крыс разного поведения. Реакция гиперчувствительности замедленного типа является одним из основных форм клеточного иммунного ответа. Проведенные нами ис-

следования показали, что относительное увеличение веса лап в результате данной реакции было в 3 раза выше (Р<0,001) у ручных животных по сравнению с агрессивными (0,12±0,015 г и 0,043±0,0096 г соответственно).

Рис. 7. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (А) и экспериментальный артрит(Б)у агрессивных и ручных крыс. * Р<0,05, " Р<0,01, *** Р<0,001 по сравнению с агрессивными, ++ Р<0,01 по сравнению с контролем.

Одним из экспериментальных моделей аутоиммунного заболевания с преобладанием Т-клеточного механизма является экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ). Он вызывается введением основного белка миелина в полном адъ-юванте Фрейнда. Это одна из экспериментальных моделей рассеянного склероза -демиелинезирующего заболевания человека, которое также обусловлено аутоиммунным процессом Т-клеточной природы. Двухфакторный дисперсионный анализ показал высоко достоверные различия в динамике ответа на данное воздействие у агрессивных и ручных крыс Р<0,001). Признаки развития ЭАЭ у руч-

ных животных начинали проявляться раньше, чем у агрессивных (рис. 7А). На 8 день после введения миелина у ручных балл, свидетельствующий о степени заболевания, был уже достоверно выше, чем в предыдущий день (Р<0,01), в то время как у агрессивных животных проявлений заболевания не наблюдалось. Максимальный уровень реакции у ручных крыс наблюдался на 16 день, когда у агрессивных животных признаков проявления заболевания уже не выявлялось. У агрессивных же крыс максимум наблюдался на 11-12 дни после начала эксперимента. Максимальный балл проявления заболевания, наблюдаемый в ходе ЭАЭ, у ручных крыс был в 19 раз выше, чем у агрессивных. Во всех временных точках эксперимента, когда наблюдались признаки заболевания, балл его проявления был достоверно выше у ручных крыс про сравнению с агрессивными (Р<0,05).

Другой моделью экспериментального аутоиммунного заболевания является ревматоидный артрит, который вызывается введением полного адъюванта Фрейнда. Данное экспериментальное воздействие является одной из моделей аутоиммунного артрита у человека. Главным фактором поражения служит Т-клеточный механизм. Основным клиническим показателем экспериментального артрита является воспаление суставов задних лап. Максимум реакции наблюдался на 14-21 день после начала эксперимента. Степень проявления экспериментальной модели заболевания различается между группами животных разного поведения На

14 день эксперимента объем лап у ручных животных достоверно увеличивался по сравнению с контролем (Р<0,01) и был достоверно больше, чем у агрессивных крыс

(Р<0,01). У агрессивных животных на 14 день после введения микобактерий объем лап так же достоверно отличался от контрольных значений. На 21 день эксперимента у агрессивных крыс дальнейшего развития клинических признаков заболевания не наблюдалось. Тогда как у ручных животных объем лап продолжал увеличиваться по сравнению с 14 днем, причем в данной временной точке этот показатель у ручных крыс был в 1,5 раза больше чем у агрессивных (Р<0,01). Таким образом, у ручных крыс, по сравнению с агрессивными, наблюдались более выраженные реакции в моделях аутоиммунных заболеваний, в основе которых лежит клеточный иммунный ответ.

А грессивны с Ручны с

I 1м >СЛО " ~

Рис. 8. Динамика уровеня кортикостерона в крови у агрессивных и ручных крыс после введения масла и микобактерий Баз - базальный уровень, 7,14, 21 - уровень на 7,14 и 21 дни эксперимента. * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001 по сравнению с агрессивными, + Р<0,05, ++ Р<0,01, +++ Р<0,001 по сравнению с базальным уровнем.

Чувствительность к аутоиммунным заболеваниям с преобладанием Т-клеточного механизма зависит как от генетических факторов, так и от факторов окружающей среды. К генетическим факторам относятся различия по главному комплексу гистосовместимости и многим другим генам, которые могут влиять на иммунные функции (Нарр et al., 1988). Однако предрасположенность и степень проявления экспериментальных аутоиммунных заболеваний зависит от реакции ГНС на воспалительные процессы (Schobitz et al., 1994). Селекция на чувствительность к экспериментальному артриту сопровождается соответствующими изменениями в базальных параметрах ГНС (Steinberg et al., 1992). Более чувствительная к данному заболеванию линия Lewis отличается от линии Fischer, не восприимчивой к артриту и ЭАЭ, и сниженной активностью ГНС в ответ на стрессорные стимулы (Sternberg et al., 1989, Mason et al., 1990). В нашем эксперименте введение парафинового масла не оказывало существенного влияния на уровень кортикостерона ни у одной из поведенческих групп (рис. 8). В ответ на введение микобактерий уровень коргикосте-рона у ручных крыс был снижен по сравнению с агрессивными Р—0,001). Максимальное его значение у крыс разного поведения наблюдалось на 7 день после введения микобактерий, когда клинических проявлений заболевания еще не наблюдалось. В данной точке уровень гормона у ручных крыс был почти в 2 раза ниже, чем у агрессивных (Р<0,01). Затем у ручных животных происходило плавное снижение уровня гормона. Сходные изменения в уровне кортикостерона наблюда-

лись и у агрессивных животных. Однако на 21 день уровень гормона у ручных крыс снижался до базальных значений, тогда как у агрессивных он оставался достоверно повышенным (Р<0,05).

Отмеченные нами различия в динамике развития моделей заболевания у крыс контрастного поведения могут быть связаны с разным базальным уровнем активности ГНС, на фоне которого была сделана инъекция. Высокие концентрации гормона предотвращают развитие ЭАЭ, в то время как предварительная адреналэктомия повышает чувствительность к артриту у малочувствительных к данному заболеванию линий крыс (Harbuz et al, 1993), а у предрасположенных к нему животных может привести к летальному исходу (Schobitz et al., 1994, Mac Phee et al., 1989).

Помимо ГНС в модуляции развития иммунного ответа принимают участие нейромедиаторные системы. Так дофаминергическая система имеет иммуностимулирующее, а серотонинергическая иммуноингибирующее действие (Девойно и др.,1991). При доместикации происходит и изменение соотношения нейромедиато-ров в головном мозге животных. У ручных животных достоверно снижается активность дофаминергической и увеличивается активность серотонинергической системы по сравнению с агрессивными крысами (Попова, 2000). Можно предположить, что такие изменения, вызванные доместикацией, тоже вносят свой вклад в формирование различий в уровне иммунного ответа у животных разных поведенческих групп.

Итак, полученные нами данные дают основание предположить, что у ручных животных преобладает клеточный иммунный ответ, а у агрессивных — гуморальный. Известно, что в иммунном ответе принимают участие Т-хелперы первого и второго типа (ТЫ и Th2). Цитокины, секретируемые ТЫ такие как ИЛ-2, ИЛ-12 и ИНФ-у стимулируют клеточный иммунный ответ, а ИЛ-4, ИЛ-5 и другие цитокины, секретируемые Th2 — гуморальный иммунный ответ (Stevens et al., 1988). Действительно показано, что образование АОК в селезенке мышей в ответ на введение ЭБ коррелирует с увеличением уровня ИЛ-4 и ИЛ-5, секретируемых Th2 (Mashimo, Mita, 1995). Глюкокортикоиды способствуют дифференцировке и повышают секреторную активность Th2 (Kovalovsky et al., 2000, Miyaura et al., 2002). He исключена возможность, что у агрессивных крыс, также как и у других линий грызунов с повышенной активностью ГНС (Kavelaars et al., 1997; Kidd, 2003), преобладают Т-хелперы второго типа, а у ручных крыс преобладают Т-хелперы первого типа. Соотношение в популяциях данных клеточных элементов у крыс селекционируемых на контрастное поведение не измерялось. Однако это предположение подтверждается полученными нами данными.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что отбор серых крыс на элиминацию агрессивного поведения по отношению к человеку изменяет не только гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, но также и иммунные функции, и, вероятно, их взаимодействие. Нами выявлена сниженная реакция ГНС на иммунные стимулы у ручных крыс по сравнению с агрессивными. Кроме того, у агрессивных животных преобладают иммунные реакции, связанные с гуморальным иммунным ответом, тогда как у ручных крыс выражен более сильно клеточнный иммунный ответ. Недавно предложена концепция о различных'страте-гиях поведения (активной и пассивной) в ответ на меняющиеся условия окружающей среды (Koolhaas et al., 1999). По мнению авторов в популяциях животных имеются особи, демонстрирующие различные поведенческие реакции на данные изменения. При этом стратегия поведения животных тесно связана как с активностью

ГНС, так и иммунным статусом животного. Однако большинство работ этого направления либо изучали только один поведенческий или иммунный признак, либо были проведены на инбредных линиях животных, где большой вклад имеет эффект основателя (Koolhaas et al, 1999, Chover-Gonzalez et al., 1998). Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что агрессивные и ручные крысы отличаются по различным показателям в поведенческих тестах. У ручных более выражено исследовательское поведение, а у агрессивных животных преобладает тревожность, то есть у ручных крыс по сравнению с агрессивными существенно снижена стратегия активного избегания (Плюснина, 2004). В данной работе впервые были проведены эксперименты на аутбредных линиях крыс, которые охватывают как различные аспекты функционирования ГНС, так и разные типы иммунного ответа. Проведенные комплексные исследования показали, что отбор, проводимый по одному из поведенческих признаков, а именно агрессивной реакции по отношению к человеку, приводит к коррелированным изменениям, как в нейроэндокринной, так и в иммунной системах. Тесные взаимосвязи внутри этих систем способствуют поддержанию гомеостаза в организме в условиях постоянно меняющейся окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. Отбор серых диких крыс на элиминацию агрессивного поведения по отношению к человеку приводит к изменению взаимодействия между иммунной и гипофи-зарно-надпочечниковой системами. У ручных крыс по сравнению с агрессивными снижена реакция ГНС на введения липополисахарида и изменена динамика ответа этой системы на введение ИЛ-2.

2. У крыс, селекционируемых на доместикационное поведение, снижен первичный и вторичный гуморальный ответ на фоне меньшей активации ГНС на введение Т-зависимого антигена.

3. Длительный стресс (ограничение подвижности в течение 4 часов), также как и кратковременный (20 минут рестрикции), вызывает меньшую активацию ГНС у ручных животных по сравнению с агрессивными. Длительная активация гипота-ламо-гипофизарно-надпочечниковой системы стимулирует гуморальный ответ у обеих поведенческих групп, однако, у ручных крыс в меньшей степени, чем у агрессивных.

4. У ручных животных, в отличие от агрессивных, происходит адаптация к хроническому стрессу (часовому ограничению подвижности в течение 10 дней). Хронический стресс повышает иммунный ответ только у агрессивных животных и не влияет на этот показатель у ручных.

5. Клеточный иммунный ответ (реакция гиперчувствительности замедленного типа) повышен у крыс, селекционируемых на доместикационное поведение по сравнению с агрессивными. Ручные крысы по сравнению с агрессивными более предрасположены к аутоиммунным заболеваниям Т-клеточной природы, таким как экспериментальный ревматоидный артрит и аллергический энцефаломиелит. ГНС в ходе развития артрита активируется в меньшей степени у ручных животных, чем у агрессивных.

6. Аутбредные линии крыс с контрастным агрессивным поведением по отношению

к человеку различаются типом иммунного ответа. У крыс с высокой агрессией преобладает гуморальный иммунный ответ, а у животных с отсутствием агрессивного поведения — клеточный и повышена восприимчивость к аутоиммунным заболеваниям. Возможно, одним из факторов, способствующих повышению

аутоиммунных реакций у ручных крыс является сниженная активность гипофи-зарного-надпочечниковой функции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Львова (Шихевич) С. Г. Влияние доместикации на взаимодействие между иммунной и гипофизарно-надпочечниковой системой у серых крыс // Материалы XXXVI международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". Новосибирск, 1998. С. 62.

2. Oskina I.N., Shikhevich S.G., Kariagina A.Y., Gulevich R.G. Humoral immune response in Norway rats selected for reduced and high aggressiveness towards man // Genetic and developmental psychoneuroendocrino logy.Abstracts of the international symposium dedicated to prof. Eugene V.Naumenko. Novosibirsk, 12-16 July 1999. P. 78.

3. Оськина И.Н., Шихевич С.Г Гипофизарно-надпочечниковая и иммунная системы серых крыс, селекционируемых на доместикационное поведение // Тезисы докладов V Всероссийской конференции "Нейроэндокринология-2000", посвященной 75-летию Андрея Львовича Поленова (1925-1996). Санкт-Петербург, 18-20 апреля 2000. С. 102-103.

4. Оськина И.Н., Шихевич С.Г., Карягина А.Ю., Гулевич Р.Г. Гуморальный иммунный ответ у серых крыс, селекционируемых по поведению // Доклады академии наук . 2001. Т. 378. № 5. С. 715-717.

5. Шихевич С.Г., Оськина И.Н., Плюснина И.З. Реакция гипофизарно-надпочечниковой системы на стрессорные и иммунные стимулы у серых крыс, селекционирумых по поведению // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2002. Т. 88. № 6. С.781-789.

6. Шихевич С.Г., Оськина И.Н., Гулевич Р.Г. Реакция гипофизарно-надпочечниковой системы на эмоциональный и иммунный стресс серых крыс разного поведения // Тезисы докладов второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии", посвященной 80-летию со дня рождения профессора М. Г. Колпа-кова. Новосибирск, 15-17 октября 2002. С. 182.

7. Оськина И.Н., Шихевич С.Г., Плюснина И.З. Гипофизарно-надпочечниковая система и чувствительность к аутоиммунному экспериментальному артриту серых диких крыс, селекционируемых по поведению // Тезисы докладов второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии", посвященной 80-летию со дня рождения профессора М. Г. Колпакова. Новосибирск, 15-17 октября 2002. С. 114.

8. Оськина И.Н., Шихевич С.Г., Прасолова Л.А., Гулевич Р.Г. Влияние хронического стресса на функцию ГНС и иммунный ответ серых крыс разного поведения // Материалы всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты". Новосибирск, 4-6 ноября 2002. С. 156.

9. Шихевич С.Г., Оськина И.Н., Гулевич Р.Г. Влияние повторяющегося стресса на функцию гипофизарно-надпочечниковой и имунной систем у серых крыс селекционируемых по поведению // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2003. Т. 89. № 1. С. 75-82.

10. Оськина И.Н., Шихевич С.Г., Гулевич Р.Г. Влияние отбора по поведению на первичный и вторичный иммунный ответ у серых диких крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136. N. 10. С. 455-458.

11. Прасолова Л.А., Оськина И.Н., Шихевич С.Г. Влияние рестрикционного сресса на некоторые морфо-функциональные характеристики селезенки у крыс разного поведения // Морфология. 2004. Т. 125. N. 1. С. 59-63.

12. Оськина И.Н., Шихевич С.Г., Плюснина И.З. Иммунная и гипофизарно-надпочечниковая системы при отборе серых крыс по поведению // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8(2). XIX съезде физиологического общества имени И.ППавлова. Екатеринбург. С 224-225.

Подписано к печати 30.12.04.

Формат бумаги 60X90. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 159.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр.ак. Лаврентьева, 10

«--148Í

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шихевич, Светлана Геннадьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Взаимодействие ГГНС и иммунной системы.

1.1.1. Представления о существовании единой нейроиммуноэндокринной системы.

1.1.2. Влияние медиаторов иммунной системы на функцию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы.

1.2. Влияние ГНС на иммунную систему.

1.2.1. Влияние кортикотропин-рилизинг-гормона на иммунную систему.

1.2.2. Действие адренокортикотропного гормона на иммунную систему.

1.2.3. Влияние глюкокортикоидов на иммунную систему.

1.2.4. Внутринадпочечниковые взаимодействия.

1.3. Роль взаимосвязи между иммунной и ГГНС в поддержании гомеостаза в организме.

1.4. Взаимодействие иммунной и ГГНС в процессе иммунного ответа.

1.5. Влияние стресса на иммунный ответ.

1.5.1. Влияние факторов стресса на иммунную систему.

1.5.2. Влияние стресса на иммунокомпетентные клетки.

1.6. Нервная система и иммунный ответ.

1.7. Экспериментальные модели животных, применяемые для исследования взаимосвязи внутри нейроиммуноэндокринной системы.

1.8. Экспериментальные модели доместикации животных.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Экспериментальные животные.

2.2. Иммунизация животных.

2.2.1. Влияние введения ИЛ-2 на активность ГНС у ручных и агрессивных крыс.

2.2.2. Влияние введение липополисахарида на активность ГНС у крыс контрастного поведения.

2.2.3. Первичный гуморальный иммунный ответ и его влияние на активность ГНС у крыс, селекционируемых по поведению.

2.2.4. Вторичный гуморальный иммунный ответ и его влияние на активность ГНС у ручных и агрессивных животных.

2.3. Стрессорные воздействия.

2.3.1. Влияние кратковременного рестрикционного стресса на активность

ГНС у крыс, селекционируемых по поведению.

2.3.2. Влияние длительного рестрикционного стресса на активность ГНС и первичный гуморальный иммунный ответ у животных контрастного поведения.

2.3.3. Влияние хронического рестрикционного стресса на активность ГНС и первичный гуморальный иммунный ответ у ручных и агрессивных крыс.

2.4. Методики исследования.

2.4.1. Определение содержания кортикостерона в крови.

2.4.2. Определение содержания транскортина в плазме крови.

2.4.3. Определение числа антителообразующих клеток в селезенке.

2.4.4. Определение титра антител.

2.4.5. Реакция гиперчувствительности замедленного типа.

2.4.6. Экспериментальный артрит и его влияние на активность ГНС у крыс, селекционируемых по поведению.

2.4.7. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.

2.5. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Реакция на стрессорные стимулы.

3.1.1. Реакция ГНС на кратковременный рестрикционный стресс у ручных и агрессивных крыс.

3.1.2. Реакция ГНС на введение липополисахарида у животных контрастного поведения.

3.1.3. Реакция ГНС на введение интерлейкина-2 у крыс, селекционируемых по поведению.

3.1.4. Реакция ГНС на введение физиологического раствора у ручных и агрессивных животных.

3.2. Гуморальный иммунный ответ.

3.2.1. Первичный иммунный ответ у крыс контрастного поведения.

3.2.2. Вторичный иммунный ответ у животных, селекционируемых по поведению.

3.3. Влияние стресса на иммунный ответ.

3.3.1. Влияние длительного рестрикционного стресса на активность ГНС и гуморальный иммунный ответ у крыс контрастного поведения.

3.3.2. Влияние хронического рестрикционного стресса на активность ГНС и гуморальный иммунный ответ у животных, селекционируемых по поведению.

3.4. Клеточный иммунный ответ.

3.4.1. Реакция гиперчувствительности замедленного типа у ручных и агрессивных крыс.

3.4.2. Экспериментальные модели аутоиммунных заболеваний.

3.4.2.1. Экспериментальный артрит и его влияние на активность

ГНС у животных, различающихся по поведению.

3.4.2.2. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит у крыс, селекционируемых по поведению.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 90 ВЫВОДЫ 107 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ адренокортикотропный гормон

АОК антителообразующие клетки

ГГНС гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГНС гипофизарно-надпочечниковая система гк глюкокортико иды ил интерлейкин

ИНФ интерферон

КРГ кортикотропин-рилизинг-гормон лпс липополисахарид мсг меланоцитстимулирующий гормон помк проопиомеланокортин ть Т-хелперы

ФНО фактор некроза опухолей

ЭБ эритроциты барана

Ьэр белки теплового шока

ЭАЭ экспериментальный аллергический энцефаломиелит

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности взаимодействия гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем у серых крыс, селекционируемых по поведению"

Актуальность проблемы. Известно, что нервная, эндокринная и иммунная системы анатомически и функционально взаимосвязаны. Эти системы имеют общие регуляторные молекулы, включая стероидные гормоны, нейропептиды, медиаторы и цитокины, которые обеспечивают молекулярную основу для координированных реакций этих систем на изменения гомеостаза в ответ на стресс, воспаление или инфекцию. Особое место при этом занимает гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система (ГГНС), так как ее активность является определяющим фактором при нарушении гомеостаза, независимо от причин, вызывающих его (Wilder, 1995, Besedovsky and del Rey, 1996, Turnbull, Rivier, 1999). Bo многих случаях регуляторные эффекты нейроэндокринных систем на функцию иммунных клеток опосредуются гормонами этой системы и, прежде всего, глюкокортикоидами (McEwen et al., 1997). Глюкокортикоиды являются важными медиаторами нейроэндокрино-иммунных взаимодействий, обладая широким спектром регуляторных влияний на пролиферацию и секреторную активность практически всех иммунокомпетентных клеток (Munck et al., 1984, Bateman, 1989, Blalock, 1989). Так, они влияют на распределение иммунных клеток, ингибируют рост лимфоидных клеток и могут подавлять продукцию провоспалительных субстанций, включая цитокины, производные арахидоновой кислоты, гистамин и брадикинины (Derijk, Stenberg, 1995). Кроме того, глюкокортикоиды могут стимулировать генетически програмированную смерть клеток (апоптоз) (Wilder, 1995).

До недавнего времени считалось, что глюкокортикоиды являются мощными иммуносупрессорами. Это представление сложилось на основе исследований с использованием фармакологических доз глюкокортикоидов и синтетических гормонов, таких как дексаметазон. Однако в последние годы показано, что действие фармакологических и физиологических доз или эндогенных гормонов может иметь прямо противоположные эффекты (Ashwell et al., 2000, Sternberg, 2001). В настоящее время глюкокортикоиды рассматривают как модуляторы иммунной системы, которые могут иметь как супрессивное, так и стимулирующее влияние, изменяя ход и развитие иммунного ответа. При этом стероидные гормоны могут оказывать свое действие как непосредственно на компоненты иммунной системы, так и опосредованно через механизмы центральной нервной системы, изменяя продукцию и работу других модуляторов иммунной функции (McEwen et al., 1997). Показано, что глюкокортикоиды способны смещать равновесие в дифференцировке предшественников Th: они подавляют образование и секреторную активность Thl и стимулируют Th2 (Derijk, Stenberg, 1995).

В свою очередь иммунная система способна модулировать активность ГГНС и поведенческие реакции организма. Показано влияние интерлейкина-1 (ИЛ-1), ИЛ-6 и фактора некроза опухолей на гипоталамус, ИЛ-1, ИЛ-2 и гормонов тимуса - на гипофиз, интерферона - на надпочечники (Захарова, Петров, 1990, Judd et al, 1995, González-Hernández et al, 1994). В процессе воспаления именно цитокины являются основными регуляторами функции ГГНС, а в некоторых ситуациях регулируют восприимчивость данной системы к гормональным сигналам внутри самой системы (Гриневич и др., 1999). Предполагается, что некоторые из этих цитокинов могут участвовать в функционировании ГГНС в условиях покоя и при действии стрессоров "неиммунной природы" (Гриневич и др., 1999, Tumbull, Rivier, 1995). В последнее время в литературе появились данные об участии цитокинов в поведенческих реакциях организма и развитии ряда психических заболеваний (Wilder, 1995).

В современной литературе достаточно широко представлены данные о роли ГГНС в развитии аутоиммунных заболеваний (Kavelaars et al., 1997, Dhabhar et al., 1995). При этом на моделях аутоиммунных заболеваний, которые спонтанно возникают у разных видов животных, прежде всего, наблюдаются изменения в периферическом уровне глюкокортикоидов, хотя молекулярные механизмы этих нарушений могут быть различны (Wick et al, 1998). Следует отметить, что изучение роли ГГНС при развитии аутоиммуных или воспалительных заболеваний проводится в основном на инбредных линиях животных, т.е. генетически однородных. Меньше всего в литературе затрагивается вопрос о связи ГГНС и иммунной систем с поведением и реорганизации взаимодействия между двумя системами при генетическом преобразовании поведения. К настоящему времени имеется только один пример исследования взаимосвязи этих регуляторных систем и поведения на аутбредных линиях крыс, селекционируемых на различную чувствительность к апоморфину (Ellenbroek, Cools, 2002).

Более 40 лет назад по инициативе Д. К. Беляева в Институте цитологии и генетики СО РАН начаты селекционные эксперименты по доместикации животных (Belyev, 1969). Согласно концепции Д. К. Беляева основным критерием при одомашнивании животных является элиминация агрессивного поведения по отношению к человеку (Беляев, 1966). С точки зрения научной идеологии экспериментов по доместикации эффекты отбора рассматриваются как следствие регуляторных изменений на организменном уровне, которые происходят на самых первых этапах отбора (Trut, 1998). Эксперимент по доместикации был начат на серебристо-черных лисицах. В настоящее время модельные эксперименты осуществляются на серебристо-черной лисице, американской норке и серой крысе. Однако новые для животных социальные условия и непосредственный контакт с человеком в процессе доместикации являются сильными стрессирующими факторами, поэтому отбор на доместикационное поведение является и отбором на стресс-реактивность (Беляев, 1966, Ве1уеу, 1969). Исследования, проводимые на разных объектах доместикации, продемонстрировали изменения в нейроэндокринных и нейрохимических системах организма, и в первую очередь ГГНС как гормональной системе адаптации и стресса (Оськина, Плюснина, 2000, Попова, 2000, Науменко и др., 1987, Науменко, Беляев, 1981, СШпа, 1996).

Следует отметить, что в популяциях животных, содержащихся на промышленных фермах или в лабораторных условиях, также происходит бессознательный отбор на уменьшение агрессии по отношению к человеку. Однако данный отбор идет значительно медленнее и имеет меньшее влияние на поведенческие и эндокринные характеристики, чем направленный отбор на доместикационное поведение (Трут и др., 2004, Кйпг1 е1 а!., 2002, ТгЩ, 1999, Р1уизпта, Оэкта, 1997). Поэтому был начат отбор лисиц и крыс на поддержание и усиление агрессивного поведения по отношению к человеку. В недавно опубликованной работе было показано, что агрессивные и совхозные популяции лисиц достоверно не отличаются по различным показателям активности ГГНС (Ои1еУюИ е1 а1., 2004). Это дает нам основание рассматривать линию крыс, селекционируемых на усиление агрессивного поведения, в качестве контроля для доместицируемой линии крыс.

Как уже сказано выше, существует тесная взаимосвязь между поведением, ГГНС и иммунной системой. Они взаимно влияют друг на друга на протяжении всего периода индивидуального онтогенеза. Однако, если изучению преобразований поведения и нейроэндокринных систем при отборе животных на доместикационное поведение посвящено достаточное количество работ, то до последнего времени исследования иммунной системы и ее взаимоотношений с нейроэндокринными системами не проводились.

Целью данной работы было изучение взаимодействия гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем у серых крыс, селекционируемых на доместикационное и агрессивное поведение по отношению к человеку.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. изучить реакцию гипофизарно-надпочечниковой системы (ГНС) на стрессорные и иммунологические стимулы у ручных и агрессивных животных;

2. исследовать первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ и изменения активности ГНС при развитии гуморального ответа у крыс, селекционируемых по поведению;

3. изучить активность ГНС при длительном 4-часовом и хроническом 10-дневном рестрикционном стрессе и влияние данных воздействий на гуморальный иммунный ответ у животных контрастного поведения;

4. исследовать клеточный иммунный ответ на примере реакции гиперчувствительности замедленного типа и экспериментальные модели аутоиммунных заболеваний с преобладанием Т-клеточных процессов у крыс, селекционируемых на доместикационное и агрессивное поведение.

Научная новизна. В данном исследовании впервые было изучено влияние отбора по поведению на различные аспекты иммунного ответа. Отбор на доместикационное поведение снижает не только базальную и стрессорную активность ГНС, но и ее реакцию на такие иммунные стимулы, как липополисахарид и ИЛ-2. Проведенные эксперименты показали, что первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ снижен у ручных крыс по сравнению с агрессивными. Уровень кортикостерона в крови у ручных животных повышается в меньшей степени и остается повышенным более короткое время, чем у агрессивных животных в ответ на введение Т-зависимого антигена. Длительный стресс усиливает гуморальный иммунный ответ у обеих поведенческих групп, причем гуморальный иммунный ответ у ручных крыс после длительного стресса равен таковому у контрольных агрессивных животных. Повторяющийся стресс оказывает иммуностимулирующее действие только на животных с агрессивным поведением и не влияет на ручных. Клеточный иммунный ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа, а также преобладающий в экспериментальном артрите и энцефаломиелите, развивается в большей степени у ручных крыс по сравнению с агрессивными. Полученные результаты свидетельствуют, что отбор на элиминацию агрессивного поведения по отношению к человеку изменяет функционирование иммунной системы и, по-видимому, одну из ключевых ролей в этом играет гипофизарно-надпочечниковая система.

Научно-практическая значимость работы. Данное исследование расширяет представления о взаимосвязи ГГНС и иммунной систем. Кроме того, освещает ранее не исследованный вопрос об иммунном статусе животного при отборе на доместикационное поведение. Это может помочь в прогнозировании предрасположенности и риска аутоиммунных заболеваний в различных популяциях доместицированных животных.

Результаты исследования используются в качестве материала для курса лекций Плюсниной И.З. "Физиология ВНД и поведение", читаемого на 4 курсе ФЕН и 2 курсе ПФ НГУ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции памяти Е. В. Науменко "Genetic and developmental psychoneuroendocrinology" (Новосибирск, 1999), V Всероссийской конференции "Нейроэндокринология-2000", посвященной 75-летию Андрея Львовича Поленова (1925-1996) (Санкт-Петербург, 2000), второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии", посвященной 80-летию со дня рождения профессора М. Г. Колпакова (Новосибирск, 2002), всероссийской конференции (0 "Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты"

Новосибирск, 2002), XIX съезде физиологического общества имени И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. т ш

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Шихевич, Светлана Геннадьевна

выводы

1. Отбор серых диких крыс на элиминацию агрессивного поведения по отношению к человеку приводит к изменению взаимодействия между иммунной и гипофизарно-надпочечниковой системами. У ручных крыс по сравнению с агрессивными снижена реакция ГНС на введения липополисахарида и изменена динамика ответа этой системы на введение ИЛ-2.

2. У крыс, селекционируемых на доместикационное поведение, снижен первичный и вторичный гуморальный ответ на фоне меньшей активации ГНС на введение Т-зависимого антигена.

3. Длительный стресс (ограничение подвижности в течение 4 часов), также как и кратковременный (20 минут рестрикции), вызывает меньшую активацию ГНС у ручных животных по сравнению с агрессивными. Длительная активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы стимулирует гуморальный ответ у обеих поведенческих групп, однако, у ручных крыс в меньшей степени, чем у агрессивных.

4. У ручных животных, в отличие от агрессивных, происходит адаптация к хроническому стрессу (часовому ограничению подвижности в течение 10 дней). Хронический стресс повышает иммунный ответ только у агрессивных животных и не влияет на этот показатель у ручных.

5. Клеточный иммунный ответ (реакция гиперчувствительности замедленного типа) повышен у крыс, селекционируемых на доместикационное поведение по сравнению с агрессивными. Ручные крысы по сравнению с агрессивными более предрасположены к аутоиммунным заболеваниям Т-клеточной природы, таким как экспериментальный ревматоидный артрит и аллергический энцефаломиелит. ГНС в ходе развития артрита активируется в меньшей степени у ручных животных, чем у агрессивных.

6. Аутбредные линии крыс с контрастным агрессивным поведением по отношению к человеку различаются типом иммунного ответа. У крыс с высокой агрессией преобладает гуморальный иммунный ответ, а у животных с отсутствием агрессивного поведения — клеточный и повышена восприимчивость к аутоиммунным заболеваниям. Возможно, одним из факторов, способствующих повышению аутоиммунных реакций у ручных крыс является сниженная активность гипофизарного-надпочечниковой функции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шихевич, Светлана Геннадьевна, Новосибирск

1. Альперина Е.А., Павина Т.А. Изменение иммунологической реактивности у мышей линии С57В1/6 в условиях зоосоциального конфликта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1996. -Т. 122, № 11. - С. 541-543.

2. Бажан Н.М., Красс П.М., Колпаков М.Г., Трут JI.H. Изменение секреторной активности коры надпочечников у серебристо-черных лисиц в процессе доместикации. Докл. Академии наук СССР. - 1974. - Т. 216, С. 922-924.

3. Беляев Д.К. Бородин П.М. Влияние стресса на наследственную изменчивость и его роль в эволюции // Эволюционная генетика. 1982. - С. 35-59.

4. Беляев Д.К. Дестабилизирующий отбор как фактор доместикации // Генетика и благосостояние человека. М., Наука. 1981. - С. 53-65.

5. Беляев Д.К. О некоторых вопросах стабилизирующего и дестабилизирующего отбора // История и теория эволюционного учения. JL: Наука, 1974. - С. 76-84.

6. Беляев Д.К. Генетика и проблемы селекции животных // Генетика. 1966. - С. 36-48.

7. Вишнивецкая Г.Б., Плюснина И.З., Попова Н.К. участие 5-НТ1А-рецепторов в регуляции разных видов агрессивного поведения // Журн.высш.нерв.деят. Т. 51, №. 6. -С. 704-708.

8. Гриневич В.В., Поскребышева Е.А., Савелов Н.А, Абрамова Н.А, Акмаев И.Г. Иерархические взаимоотношения между органами гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС) при воспалении // Успехи физиологических наук. 1999. -Т. 30, № 4, С. 50-66.

9. Девойно JI.B., Альперина E.J1. Анализ взаимодействия дофаминергической и соротонинергической систем в иммуномодуляции // Физиол. журн. СССР им.Сеченова. 1984-Т. 70, С. 239-246.

10. Девойно J1.B., Альперина E.JL, Кудрявцева H.H., Попова Н.К. Изменение иммунного ответа у мышей-самцов с агрессивным и субмиссивным типами поведения // Физиол. журн. СССР им.Сеченова. -1991 Т. 77, С. 62-66.

11. Девойно Jl.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л., Чейдо М.А. Нейрохимическая установка мозга экспериментальный механизм психонейроиммуномодуляции // Вестник РАМН.- 1998 -Т. 9, С. 19-24.

12. Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю. Моноаминергические системы в регуляции иммунных реакций. Новосибирск: Наука. - 1983. - С. 134.

13. Дыгало H.H., Шишкина Г.Т., Бородин П.М., Науменко Е.В. Роль нейрохимических систем мозга в изменении реактивности гипофизарно-надпочечникового комплекса серой крысы при селекции по поведению // Журн.эвол.биохим. и физиол. 1985 . - Т. 21, С. 342-346.

14. Захарова Л.А., Петров Р.В. Медиаторы нейроиммунного взаимодействия // Итоги науки * и техники. Сер. Иммунология. ВИНИТИ. 1990. - Т. 25, С. 7-47.

15. Идова Г.В., Чейдо М.А., Жукова E.H. Влияние иммобилизационного стресса на иммунный ответ у мышей с различным стереотипным поведением И Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. 1999. - Т. 49, С. 847-853.

16. Идова Г.В., Чейдо М.А., Жукова E.H., Девойно Л.В. Стимуляция иммунного ответа при активации дофаминергической системы у мышей с оппозитными формами поведения // Росс. Физиол. Журн. Им. И.М. Сеченова 2002. - Т. 88, № 11, С. 1394-1400.

17. Колесникова Л.А., Беляев Д.К., Трут Л.Н. Изменение в морфологии эпифиза серебристо-черных лисиц при доместикации // Журн.общ.биологии. 1988. - Т. 49, С. 487-492.

18. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л: Наука. - 1988. - С. 251.

19. Корнева Е.А. Иммунофизиология. Санкт-Петербург: Наука. - 1993. - С. 251.

20. Кудрявцева H.H., Бакштановская И.В., Нейрохимический контроль агрессии и подчинения // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова . 1991. - Т. 41, С. 459-466.

21. Луценко Н.Д., Трут Л.Н., Иванова Л.Н. Особенности строения коры надпочечников у доместицируемых серебристо-черных лисиц Vulpes vulvus в постнатальном онтогенезе //Журн.эвол.биохим. и физиол. 1980. - Т. 16, С. 483-487.

22. Мицкевич М.С. Гормональные регуляции в онтогенезе животных. М: Наука . - 1978. -С.224.

23. Науменко Е.В., Беляев Д.К. Нейроэндокринные механизмы при доместикации животных. Вопросы общей генетики. М: Наука. - 1981. - С. 230-240.т