Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика лимфоцитов крови и лимфоидных органов у крыс с генетической предрасположенностью к каталепсии

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика лимфоцитов крови и лимфоидных органов у крыс с генетической предрасположенностью к каталепсии"

На правах рукописи

Пантелеева Наталья Григорьевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ И ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ У КРЫС С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К КАТАЛЕПСИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005531765

Новосибирск - 2013

005531765

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (Новосибирск)

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Труфакин Валерий Алексеевич

Шурлыгина Анна Вениаминовна

Толстикова Татьяна Генриховна

заведующая лабораторией фармакологических исследований ФГБУН «Новосибирский институт органической химии им. Н.Н.Ворожцова» СО РАН

Архипов Сергей Алексеевич

заведующий лабораторией цитологии и клеточных структур ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗРФ

Защита диссертации состоится « 2013 г. в/^час.

на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01

Молодых Ольга Павловна

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нарушения психической сферы человека и животных часто сопровождаются изменениями иммунного статуса, что ведет к снижению резистентности к инфекциям, повышению риска развития опухолевого процесса, преждевременному старению. Биологически активные вещества (цитокины и нейромедиаторы), вырабатываемые иммунокомпетентными клетками, влияют на функции головного мозга (Девойно Л.В., Ильючонок З.Ю., 1993; Крыжановский Г.Н., 2002; Гусев Е.И., Крыжановский Г.Н., 2009; Restak R., 2006; Goodvin G. et al, 2009; Freudenreich O. et al, 2010). Нарушение выработки нейротропных биологически активных веществ в условиях психонейроиммунопатологии может привести к прогрессированию и поддержанию психических сдвигов. В связи с этим исследование психонейроиммунных взаимодействий на моделях психопатологии у животных представляет актуальную научную проблему.

Для эффективного изучения механизмов развития психосоматических и психоиммунологических нарушений, а также возможностей их комплексной коррекции, необходимы адекватные модели подобных состояний у животных.

В этом отношении представляют интерес крысы неинбредной линии с генетически обусловленными нарушениями функции центральной нервной системы (генетическая предрасположенность к каталепсии -ГК), выведенной в Институте цитологии и генетики СО РАН. У этих животных обнаруживается сходство целого ряда нейрофизиологических и нейропсихических параметров с характеристиками некоторых патологических состояний нервной системы у человека, в частности, с тем, что известно о шизофрении и депрессии (Колпаков В.Г., 1999). Особый интерес представляет то, что крысы ГК обнаруживают патологическую реакцию на стресс как в поведенческом, так и нейроэндокринном аспектах. Кроме того, ранее были обнаружены особенности морфоцитохими-ческих характеристик лимфоцитов у данных животных по сравнению с крысами Wistar, позволяющие предположить, что у крыс ГК имеются нарушения иммунного гомеостаза, вероятно, обусловленные сдвигами в деятельности нервной и эндокринной систем (Грязева Н.И. и др., 1994; 1998; 1999).

На сегодняшний день практически отсутствуют сведения о характере функционирования иммунной системы у этих животных. Изучение морфофункциональных характеристик иммунокомпетентных клеток у крыс ГК в сравнении с исходной популяцией Wistar могло бы пролить свет на некоторые аспекты иммунонейроэндокринных взаимодействий особенно в связи с развитием психопатологических проявлений, а также обосновать возможность и целесообразность использования крыс линии ГК в качестве адекватной модели для исследования иммунонейроэндо-

кринных взаимосвязей и скрининга методов комплексной коррекции их нарушений.

Функциональное состояние иммунной системы тесно связано с ее структурно-временной организацией (Козлов В.А. и др., 1978,1982; Бородин Ю.И. и др., 1992,2000,2007; Щурлыгина A.B. и др., 1992,2000,2008,2011; Труфакин В.А. и др., 2004, 2005, 2008, 2012). Поэтому при исследовании морфоцитохимических параметров лимфоидных клеток во временном аспекте можно получить более полную информацию об особенностях иммунного гомеостаза. В связи с этим является актуальным изучение суточных вариаций клеточного состава лимфоидных органов и активности ферментов окислительно-восстановительного метаболизма лимфоцитов крови.

Учитывая имеющуюся у самцов ГК андрогенную недостаточность (Шульга В.А. и др., 1996; Колпаков В.Г. и др., 2004), представляет интерес исследовать характер влияния на поведенческие и иммунные параметры анаболических стероидов, в частности, ретаболила. Известны стрес-спротекторные, анксиолитические и иммуномодулирующие свойства анаболических стероидов (Грундинг П., Бахман М., 2011), поэтому мы предположили, что ретаболил может оказать комплексное воздействие на нейроиммунные нарушения у крыс с генетической предрасположенностью к каталепсии.

Цель исследования — дать сравнительную морфоцитохимическую характеристику лимфоцитов с учетом суточных вариаций показателей у интактных крыс ГК и Wistar и оценить влияние ретаболила на поведенческие и иммуноморфологические параметры у этих животных.

Задачи исследования:

1. Изучить общее количество и субпопуляционный состав лимфоцитов в тимусе, селезенке и паховом лимфоузле у крыс ГК и Wistar.

2. Изучить активность ферментов энергетического метаболизма лимфоцитов крови у крыс ГК и Wistar.

3. Изучить особенности суточных вариаций иммуноморфологических параметров у крыс ГК и Wistar.

4. Изучить морфоцитохимические параметры лимфоцитов (субпопуляционный состав клеток тимуса и селезенки, активность дегидрогеназ лимфоцитов крови) у крыс ГК и Wistar после введения ретаболила.

5. Оценить влияние ретаболила на поведенческие характеристики крыс ГК и Wistar.

Научная новизна. Получены новые данные об особенностях клеточного состава лимфоидных органов и крови, а также активности дегидрогеназ лимфоцитов крови у крыс ГК в сравнении с Wistar.

Впервые обнаружено, что у крыс ГК изменены суточные вариации иммуноморфологических параметров по сравнению с крысами Wistar, что свидетельствует об изменении временной организации иммунной системы и согласуется с данными об особенностях суточных вариаций метаболизма моноаминов в головном мозге этих животных.

Впервые показано, что ретаболил по разному влияет на лимфоциты крови и лимфоидных органов крыс ГК и \^1з1аг, что свидетельствует о межлинейных особенностях эндокринно-иммунных взаимоотношений.

Получены ранее неизвестные факты о том, что крысы ГК и \Vistar различаются по характеру комплексной реакции поведенческих параметров и показателей иммунокомпетентных клеток в ответ на введение ретаболила. Гормон оказывает разнонаправленное действие на выраженность каталептической реакции у этих животных, однако у крыс ГК при выраженном корригирующем эффекте на поведенческий статус ретаболил почти не изменяет характеристики иммунокомпетентных клеток.

Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований дополняют знания об особенностях структурно-метаболических характеристик клеток иммунной системы при различных психоэмоциональных состояниях и поведенческих расстройствах с учетом временного фактора.

Выявленные межлинейные особенности реакций нервной и иммунной системы у крыс ГК и на гормональное воздействие позволяют ис-

пользовать данную модель для изучения механизмов психонейроиммун-ных взаимодействий и для разработки методов персонифицированной коррекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Крысы ГК и Wistar значительно различаются по ряду морфологических и цитохимических показателей клеток иммунной системы, что позволяет предполагать единый генез психонейроиммунных нарушений у крыс ГК.

2. Крысы ГК и значительно различаются по суточным вариациям морфологических и цитохимических показателей лимфоцитов, что свидетельствует об измененной суточной временной организации нейроиммунных взаимоотношений у крыс ГК.

3. У крыс ГК и \Vistar существуют различия в способности нервной системы и иммунокомпетентных клеток реагировать на гормональный стимул, что проявляется в разнонаправленных эффектах введения ретаболила на клетки иммунной системы и поведенческие параметры у этих животных.

Апробация работы. Результаты работы обсуждены на Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Москва, 1999); VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999); IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); научной конференции с международным участием «Проблемы лимфологии и интерстициаль-ного массопереноса» (Новосибирск, 2004); Международном конгрессе «Эндоэкологическая медицина» (Новосибирск, 2007); Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2008); межлабораторной научной конференции ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (Новосибирск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 8 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 283 работы, из них 96 отечественных авторов и 187 - зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования: В работе использовались крысы (самцы) линии Wistar и ПС (генетическая предрасположенность к каталепсии) массой 200 - 300 г. Всего было использовано 80 животных. Крысы были получены из питомника лабораторных животных Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Животных содержали в виварии НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН при свободном доступе к воде и пище и при естественном световом режиме в пластиковых клетках «Animark» (Финляндия). Эксперименты проводили в зимнее время года. Сообщество животных перед началом экспериментов было синхронизировано в течение 14 дней.

Дизайн экспериментов. Все животные были разделены на 6 групп: 1-я и 2-я - Wistar и ГК интакгные, 3-я и 4-я - Wistar и ГК с введением ретаболила, 5-я и 6-я - Wistar и ГК с введением оливкового масла (активный контроль). Использовали масляный раствор ретаболила (Gedeon Richter), который вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг веса, однократно. В качестве активного контроля использовали стерильное оливковое масло, которое вводили в том же объеме, что и ретаболил (100- 125 мкл). Интактных животных декапитировали под легким эфирным наркозом с 9.00 до 10.00 ч и с 18.00 до 19.00. Крыс после введения ретаболила и масла забивали таким же способом на 13-е сутки после инъекции с 9.00 до 10.00 ч утра.

Забирали кровь из декапитационной раны и лимфоидные органы -тимус, селезенку и паховые лимфатические узлы. Извлеченные органы взвешивали на торсионных весах с точностью до 1 мг, после чего готовили клеточную суспензию мягким раздавливанием в стеклянном, слабо притертом гомогенизаторе с добавлением холодной питательной среды 199. Суспензию фильтровали через капроновую сетку с целью удаления кусочков соединительной ткани и крупных клеточных агрегатов и доводили до конечного объема 3 мл для тимуса, 5 мл для селезенки, 1,5 мл для лимфатического узла. Все процедуры по приготовлению клеточной суспензии проводили на льду. В суспензии подсчитывали количество ядросодержащих клеток с использованием камеры Горяева.

Препараты готовили на предметных стеклах методом «высушенной капли» по общепринятой методике (Методы общей бактериологии, 1984). Заворачивали стекла в фолыу и хранили при -20°С до момента иммуноги-стохимического исследования лимфоцитов с помощью моноклональных антител против мышиных CD4, CD8 и активированных лимфоцитов (Mouse MAb Anti-Rat CD4, CD8, aktiv, lymph., Biosours). Количество лейкоцитов крови подсчитывали в камере Горяева. Из крови делали мазки на предметных стеклах, фиксировали в 96% этаноле, окрашивали по Романов-скому-Гимза и подсчитывали количество лимфоцитов, нейтрофилов и эо-зинофилов. В мазках крови определяли активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лакгатдегидрогеназы (ДЦГ) и альфа-шицерофосфатдегид-рогеназы (альфа-ГФДГ) с помощью цитохимического количественного метода (Нарциссов Р.П., 1984).

Все эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.

Метод иммуногистохимического исследования. Для определения субпопуляций лимфоцитов использовали непрямой иммунопероксидазный метод. За основу был взят протокол окрашивания (Полак Дж., Норден С. Ван, 1987).

Замороженные при -20°С цитологические мазки отогревали при комнатной температуре, фиксировали в ацетоне 5 мин. Хорошо просушенные мазки промывали 2 раза по 5 мин фосфатным буфером (ФБР, pH = 7,2 - 7,4). Для блокирования эндогенной пероксидазной активности мазки помещали в раствор 10% перекиси водорода в метаноле, с добавлением 0,1% азида натрия на 30 мин при комнатной температуре. Затем остатки раствора тщательно стряхивали и промывали мазки 3 раза в фосфатном буфере. Для блокирования участков неспецифического связывания мазки обрабатывали 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС) или 0,1 % бычьим сывороточным альбумином (БСА) 30 мин при 37°С. После этого наносили первичные антитела. Антитела разводили в ФБР (pH 7,2 - 7,4) с добавлением 0,5% БСА и 0,1% азида натрия (согласно инструкции). Рабочее разведение подбиралось предварительно и составляло для анти-С041:20, для анти-С08 1:100, для анги-активированные лимфоциты 1:100.

Мазки с нанесенными на них антителами помещали во влажную камеру и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Затем антитела трижды отмывали ФБР, содержащим 0,1% БСА, и наносили вторичные антитела, коньюгированные с биотином. Перед использованием биоти-нилированные антитела разводили в фосфатном буфере с добавлением 1% БСА 1:20. Мазки инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После этого мазки тщательно промывали 3 раза ФБР, содержащим 0,1% БСА, и наносили авидин-перок-сидазу, разведенную в ФБР 1:20 на 30 мин при комнатной температуре. Затем мазки промывали 3 раза ФБР по 5 мин.

Для выявления пероксидазы использовали диаминбензидин (ДАБ), который растворяли в дистиллированной воде с добавлением перекиси водорода (30 таблеток ДАБ на 100 мл дистиллированной воды с добавлением 100 мкл 30% перекиси водорода). Мазки окрашивали 10 мин и отмывали в проточной воде. Ядра клеток докрашивали 0,5% раствором малахитового зеленого. Препараты исследовали в световом микроскопе при увеличении окуляра 10, объектива 100. Исследовали по 10 полей зрения на каждом мазке. Всего в каждом препарате было подсчитано 100 клеток. Затем вычислялся процент клеток, давших положительную реакцию на пероксидазу (коричневый ободок).

Методика определения активности оксидоредуктаз. Для определения активности окислительно-восстановительных ферментов в лимфоцитах периферической крови использовали количественный метод Р.П.Нарциссова (1969,1984) В качестве акцептора электронов (индикатора ферментативной реакции) использовали п-нитротетразолий фиолетовый, который при восстановлении образует в клетке крупные гранулы форма-зана, поддающиеся количественному учету.

Свежеприготовленные и высушенные на воздухе мазки крови фиксировали в холодном 60% ацетоне в течение 1 мин. Затем мазки хорошо просушивали и помещали в инкубационную среду на 1 ч при 37° С. Для выявления ЛДГ использовали инкубационную смесь следующего состава: в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,2 - 7,4) растворяли 26 мг п-нитротетразолия фиолетового и 25 мг НАД. Добавляли 25 мл 0,2М раствора лактата натрия. Для выявления СДГ в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,2 -7,4) растворяли 26 мг п-нитротетразолия фиолетового и 1575 мг сукцината натрия. Для выявления а-ГФДГ в 100 мл фосфатного буфера, рН 7,2 -7,4, растворяли 26 мг п-нитротетразолия фиолетового и 1575 мг а-глицерофосфата натрия. После инкубации мазки хорошо промывали дистиллированной водой и докрашивали ядра 0,5% раствором малахитового зеленого в течение 2-3 мин. Мазки вновь промывали и высушивали.

Подсчитывали под микроскопом (окуляр 10, объектив 100) среднее количество гранул формазана в 30 лимфоцитах, которое и считали уровнем активности фермента.

Метод определения кататонической реакции у лабораторных крыс. За основу был взят метод (Колпакова В.Г., 1990). Если приподнять животное палочкой за передние лапы в углу клетки или у стенки, оно сохраняет в некоторых случаях вертикальную позу с более или менее выраженной восковой гибкостью (каталепсия) после того, как палочка убрана. Степень выраженности такой каталепсии оценивается по 3-балльной системе: 1 - после убирания палочки крыса немного оседает, не доставая пола передними лапами; 2 - крыса сохраняет вертикальную позу с поднятыми передними лапами и мордой; 3 - крысу удается положить на спину или, по крайней мере, заставить коснуться пола клетки крестцом. Время сохранения насильственно приданной позы оценивают в секундах.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием описательной статистики с расчетом средних арифметических (М) и стандартных ошибок среднего (ш) в программе «Statistica 10.0» (лицензия AXA103E893916FACN4-0). Для определения значимости различий между экспериментальными группами (попарное сравнение) использовали критерий Манна-Уитни. Предварительно было установлено, что распределение полученных данных отличается от нормального. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование морфофункционального состояния иммунной системы при нарушении высшей нервной деятельности является важным этапом как в выяснении механизмов нейроиммунных взаимоотношений, так и в разработке методов комплексной диагностики и терапии патологии высшей нервной деятельности. Проведенные ранее исследования указывают на изменение функции серотонинергической, катехоламинергической, дофаминергичесюой и шнадонадпочечниковой систем у крыс каталептической линии ГК (Колпаков В.Г., 1990). В связи с этим представляет интерес исследование ряда показателей иммунного статуса с учетом суточных ритмов у этих животных в сравнении с исходной популяцией Wistar, имеющей «нормальный» поведенческий и нейроэндокринный статус.

В тимусе интактных крыс Wistar, между утренними и вечерними показателями не обнаружено достоверных различий, можно проследить лишь тенденцию: наибольшее количество клеток в органе, максимальное количество CD4+, CD8+- клеток и активированных лимфоцитов наблюдается в утреннее время суток. В селезенке крыс Wistar достоверные утренне-вечерние различия (р<0,05) отмечаются только для количества СЕ)8+-лимфоцитов: утренние значения (250,8± 10,5x10б клеток) выше вечерних (133,78±6,8*10б клеток). Возможно, что пул спленоцитов в большей степени, чем клетки тимуса, находится под влиянием пнококор-тикоидов и снижение количества С08+-лимфоцитов к вечеру отражает подъем продукции кортикостерона в это время суток.

В паховом лимфоузле общее количество клеток имеет минимальное значение в утреннее время (22,5±5,0><10б клеток) и достоверно увеличивается вечером (3 9,6±5,3 * 106 клеток), что совпадает с часами наибольшей физической активности крыс - животных ведущих преимущественно вечерне-ночной образ жизни (паховые лимфоузлы дренируют скелетную мускулатуру).

У крыс ГК наименьшее количество клеток в тимусе отмечено утром, а к вечеру оно достоверно увеличивается (табл. 1, 2). Количество CD8+ и активированных лимфоцитов достоверно возрастает в вечернее время. Абсолютное число клеток с фенотипом CD4+ достоверных суточных

Таблица 1. Суточные вариации клеточного состава тимуса у интактных крыс ГК (абсолютное значение: 106 клеток в органе) (М±т)

Показатель Количество наблюдений (п) Утро 10.00 ч Вечер 18.00 ч

Количество клеток в тимусе (хЮ6) 5 229,0 ± 68,4 487,1 ±97,7*

Количество клеток СБ4+ (х 106) 5 113,81±6,5 160,74 ±19,5

Количество клеток С08А (хЮ6) 5 73,96± 2,5 243,5± 4, Г

Количество активированных лимфоцитов (хЮ6) 5 76,94±3,4 245,15± 4,2*

Примечание: * - достоверные отличия между значениями утро - вечер (р <0,05).

Таблица 2. Суточные вариации клеточного состава тимуса (в %) у ннтактных крыс ГК (М±т)

Показатель Количество наблюдений (п) Утро 10.00 ч Вечер 18.00 ч

CD4+ 5 49,7±9,5 33,0±2,0

CD8+ 5 _ 32,3±3,6 50,0 ±4,2*

Активированные лимфоциты 5 33,6±5,1 50,3±4,2*

Примечание: * - достоверные отличия между значениями утро - вечер (р <0,05).

колебаний не имеет. Суточные вариации процентного соотношения исследуемых субпопуляций лимфоцитов в тимусе интактных крыс ГК выглядят следующим образом: процент С 08+-лимфоцитов так же, как и их абсолютное количество, имеет максимальное значение вечером, а утром достоверно снижается (см. табл. 2). Процент активированных лимфоцитов выше вечером, чем утром (р <0,05).

Исследование суточных вариаций количества клеток в селезенке и их субпопуляционного состава показало, что только количество спленоцитов с фенотипом С04+ имеет достоверные суточные колебания - утренние значения (161,81±4,5 клеток хЮ6) ниже вечерних (172,62±13,6 клеток *106). Остальные параметры достоверных суточных вариаций не имеют. Количество клеток в паховом лимфатическом узле у интактных крыс ГК было минимальным утром (32,5±3,0 клеток х 10б) и достоверно увеличивалось •в вечернее время (69,8±14,8 клеток х 106). Сходная картина наблюдалась и у интактных крыс \Vistar.

Таким образом, у крыс ГК и \Vistar различается характер суточных вариаций клеточного состава тимуса и селезенки, что, вероятно, отражает различную суточную временную организацию их иммунной системы.

Сложные нейроэндокринные изменения, происходящие в течение суточного цикла, получают определенные отражения в морфологическом составе белой крови (Гаркави Л.Х. и др., 1990). Суточные вариации

Таблица 3. Суточные вариации клеточного состава крови у интактных крыс Wistar (M±m)

Показатель Количество наблюдений (п) Утро 10.00 ч Вечер 18.00 ч

Количество лейкоцитов (х 106/мл) 5 4,6 ±0,8 3,7 ±0,8*

% лимфоцитов 5 85,1 ±4,5 81,1 ±2,4

Количество лимфоцитов (х 106/мл) 5 3,8 ±0,2 3,1 ±0,1

% нейтрофилов 5 14,8 ±0,5 11,6 ± 1,3

Количество нейтрофилов (х 106/мл) 5 0,6 ±0,1 0,4 ± 0,07*

% эозинофилов 5 2,2 ± 0,7 2,2 ± 0,5

Количество эозинофилов (х Ю6/мл) 5 0,1 ±0,01 0,1 ±0,02

Примечание: * - достоверные отличия между значениями утро - вечер (р <0,05)

Таблица 4. Суточные вариации активности оксидоредуктаз в лимфоцитах крови интактных крыс Wistar (среднее количество гранул формазана на 1 лимфоцит) (М±ш)

Фермент Количество наблюдений (п) Утро 10.00 ч Вечер 18.00 ч

ЛДГ 5 20,9 ± 1,5 17,1 ±0,9*

СДГ 5 17,8 ±2,5 10,0 ± 1,3*

Альфа-ГФДГ 5 10,9 ± 1,3 6,4 ± 0,8*

Примечание: * - достоверные отличия между значениями утро - вечер (р <0,05).

клеточного состава крови интактных крыс Wistar представлены в табл. 3. В крови интактных животных Wistar тотальное количество лейкоцитов имело достоверные различия в утренние и вечерние часы. Утром этот показатель был выше. Абсолютное количество нейтрофилов утром также было максимальным (р<0,05).

Сравнение активности оксидоредуктаз лимфоцитов крови у интактных крыс Wistar в разное время суток (табл. 4) показывает, что активность всех исследуемых ферментов утром достоверно выше, чем вечером (р<0,05). Это, очевидно, отражает суточный биоритм функционального состояния лимфоцитов крови, которое обеспечивается определенным уровнем энергетического метаболизма клеток.

В крови крыс ГК только тотальное количество лейкоцитов достоверно выше (р<0,05) в утренние часы (20,0±2,5 хю6 клеток на мл), чем в вечерние (13,60±2,6 * 106 клеток на мл). Абсолютное число и процентное содержание лимфоцитов, нейтрофилов и эозинофилов не имеет достоверных суточных колебаний.

Изучение активности СДГ, ЛДГ и альфа-ГФДГ лимфоцитов крови у крыс ГК в утренние и вечерние часы показывает, что только ЛДГ имеет суточные вариации активности - достоверное понижение (р<0,05) в вечернее время (9,7±0,3 гранул на клетку утром и 9,0±0,8 гранул на клетку

вечером). Активности СДГ и альфа-ГФДГ суточных колебаний не имеют. Из данных литературы известно о корреляции активности дегидрогеназ мозга и лимфоцитов крови и о том, что депрессия активности окислительных ферментов крови может служить показателем изменений в ЭЭГ и отклонений в развитии психомоторных функций (Марголина Н.Е., 1981; Чиковани М.И., 1981). В связи с этим не исключено, что в наших экспериментах активность лимфоцитарных дегидрогеназ отражает состояние энергетического метаболизма в центральной нервной системе.

При исследовании межлинейных различий морфоцитохимических показателей иммунокомпетентных клеток у крыс \Vistar и ГК в разное время суток получены следующие результаты.

Количество клеток в тимусе крыс ГК достоверно снижено в утренние часы по сравнению с крысами \Vistar (р<0,05). В вечернее время достоверных межлинейных различий по этому показателю не обнаружено (рис. 1). Количество клеток в селезенке у крыс ГК и \Vistar не имеет достоверных межлинейных различий. Количество клеток в паховых лимфатических узлах 2 крыс ГК в вечернее время достоверно больше (р<0,05) по сравнению с крысами (рис. 2).

Межлинейное сравнение субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса и селезенки в разное время суток показало отсутствие достоверных различий в соотношении субпопуляций тимоцитов у крыс ГК и \Vistar. Наблюдалась лишь тенденция. Следует отметить, что в утреннее время межлинейные различия были более выражены: так, клеток с фенотипом СБ4+ у крыс \Vistar было почти в 1,6 раза больше, СБ8+ - клеток больше в 3,3 раза, активированных лимфоцитов было больше в 1,5 раза по сравнению с крысами ГК. В селезенке крыс линии Wistar по сравнению с животными ГК количество СЭ4+- лимфоцитов было повышено утром и снижено в вечернее время. Обнаружено достоверное уменьшение количества клеток с фенотипом СБ8+ у крыс ГК (рис. 3) по сравнению с крысами в утренние часы (р<0,01). Количество активированных

лимфоцитов межлинейных различий не имеет.

Интактные крысы ГК и \Vistar значительно различаются по клеточному составу крови в разное время суток (рис. 4, 5,6). У крыс ГК абсолютное количество лейкоцитов (см. рис. 4), лимфоцитов (см. рис. 5) и эозинофи-лов (см. рис. 6) достоверно повышено по сравнению с крысами \Vistar как утром (р<0,05), так и вечером (р<0,01).

Активность оксидоредуктаз лимфоцитов крови интактных крыс ГК и \Vistar представлена на рис. 7, 8,9. Активность всех исследованных нами ферментов - ЛДГ (см. рис.7), СДГ (см. рис. 8) и альфа-ГФДГ (см. рис. 9) у крыс ГК была достоверно снижена по сравнению с крысами \Vistar как утром (р<0,01), так и вечером (р <0,05).

Поскольку у крыс ГК изменены суточные колебания МАО в головном мозге (Колпаков В.Г., 1990), активность дегидрогеназ лимфоцитов крови и количество клеток в лимфоидных органах, можно предположить, что у

Рис. 1. Суточные вариации общего количества клеток в тимусе интактных крыс ГК и * - достоверные отличия от крыс \Vistar (р<0,01).

количество клеток в шиовом ииыфоузяс

егк

63 Wistar

утро вечер

Рис. 2. Суточные вариации общего количества клеток в паховом лимфоузле интактных крыс ГК и \Vistar;# - достоверные отличия от крыс \Vistar (р<0,05).

количество СВД+- лимфоцитов

шгк

Ей Wistar

Рис. 3. Суточные вариации количества CD81-лимфоцитов в селезенке интактных крыс ГК и Wistar; * - р<0,0] при сравнении с крысами Wistar.

Рис. 4. Суточные вариации количества лейкоцитов в крови интактных крыс ГК и \Vistar; *- р<0,01 и р<0,05 при сравнении с крысами \Vistar.

Рис. 5. Суточные вариации количества лимфоцитов в крови интактных крыс ГК и \Vistar; *- р<0,01 и р<0,05 при сравнении с крысами \Vistar.

Рис. 6. Суточные вариации количества эозинофилов в крови интактных крыс ГК и \Vistar;р<0,05 при сравнении с крысами Wistar.

Рис. 7. Суточные вариации активности ЛДГ в лимфоцитах крови интактных крыс ГК и \Vistar; *- р<0,01 и я- р<0,05 при сравнении с крысами \Vistar.

Рис. 8. Суточные вариации активности СДГ в лимфоцитах крови интактных крыс ГК и \Vistar; *- р<0,01 и р<0,05 при сравнении с крысами \Vistar.

Рис. 9. Суточные вариации активности альфа-ГФДГ в лимфоцитах крови интактных крыс ГК и ^^аг; *- р<0,01 и р<0,05 при сравнении с крысами \Vistar.

них нарушена и вся суточная временная организация нейроиммуноэндо-кринных взаимоотношений.

Таким образом, полученные данные в целом указывают на изменение клеточного состава лимфоидных органов и на возмоясное снижение функций иммунитета у крыс ГК (утреннее снижение количества клеток в тимусе, численности субпопуляции эффекторных клеток СБ8+ в селезенке и снижение активности оксидоредуктаз лимфоцитов крови у крыс ГК по сравнению с крысами \Vistar).

Для комплексного воздействия на поведенческие и иммунные параметры мы исследовали возможность использования анаболического стероида ретаболила. Особый интерес представляют его эффекты, связанные со стресс-лимитирующими механизмами и реализующиеся через нейроэндо-кринные каналы (ЕЬе1и^ Р., Котз1:о V., 1994). Однако о непосредственном влияние ретаболила на функции иммунной системы известно мало.

Эксперименты показали, что введение ретаболила крысам \Vistar вызывает в тимусе достоверное увеличение общего количества клеток, что, возможно, связано с анаболическим действием гормона (табл. 5). Количество клеток с фенотипом СВ4+ достоверно увеличивается, по сравнению с активным контролем (р<0,05), а вот количество С08+-клеток резко уменьшается (р<0,05), что приводит к повышению соотношения СЮ4+/ С08+ клеток, и свидетельствует о сдвиге дифференцировки в тимусе в сторону предшественников хелперной субпопуляции.

Введение ретаболила не оказало никакого влияния на селезенку крыс Wistar - общее количество клеток в органе и их субпопуляционный состав достоверно не изменились. Также введение ретаболила не повлияло и на общее количество клеток в лимфоузле. Введение ретаболила оказало выраженное влияние на клеточный состав крови крыс ^/¡з1аг. Количество лейкоцитов и эозинофилов достоверно уменьшилось по сравнению с активным контролем (р<0,05). Активность оксидоредуктаз СДГ и ЛДГ под влиянием ретаболила не изменилась.

Крысам ГК ретаболил и растворитель вводили в той же дозе и в те же часы, что и крысам \Vistar (табл. 6). У крыс ГК, в противоположность крысам \Vistar, введение ретаболила вызывало достоверное уменьшение общего количества клеток в тимусе по сравнению с активным контролем. Количество лимфоцитов с фенотипом С08+ достоверно снижалось по сравнению с активным контролем (р<0,05), но это снижение было выражено в меньшей степени, чем у крыс \Vistar (в 1,9 раза у ГК и в 8,9 раза у \№з1аг).

В селезенке крыс ГК ретаболил вызывал достоверное увеличение количества активированных лимфоцитов. По остальным параметрам достоверных различий мы не обнаружили. На клеточный состав крови и активность оксидоредуктаз лимфоцитов у крыс ГК введение ретаболила достоверного влияния не оказывало.

Таким образом, представленные данные показывают, что клеточный состав лимфоидных органов и крови крыс \Vistar и ГК по-разному реаги-

Таблица 5. Клеточный состав крови и лнмфондных органов у крыс Wistar после введения ретаболила (М ± т)

Показатель Количество наблюдений (п) Активный контроль Ретаболил

Тимус (клетки х10в в органе)

Клеток в органе 10 359,5±1,8 563,4±48,1*

CD4+ 10 44,3±3,6 96,4±5,3 *

CD8+ 10 189,7±34,4 22,9±5,3 *

Активированные лимфоциты 10 184,8±5,6 232,3±41,4

Селезенка (клетки хЮй в органе)

Клеток в органе 10 659,4± 100,2 673,8±84,7

CD4+ 10 75,06±6,1 68,64±5,4

CD8+ 10 80,62±8,5 65,52±6,6

Активированные лимфоциты 10 75,89±6,3 65,55±7,5

Лимфоузел (клетки хЮ6 в органе)

Клеток в органе 10 56,4±4,7 49,9±9,8

Кровь (106 клетки/мл)

Лейкоциты 10 13,0±1,6* 9,4±1,0*

Лимфоциты 10 7,8±0,9 6,2±0,8

Нейтрофилы 10 4,4±0,7 2,8±0,4

Эозинофилы 10 0,7±0,1* 0,3±0Д *

Активность оксидоредуктаз лимфоцитов (гранул на клетку)

ЛДГ 10 9,3±0,б 10,6±0,1

СДГ 10 11,9±0,5 10,9±0,8

Примечание: * - параметры, достоверно отличающиеся от активного контроля (Р <0,05).

рует на введение ретаболила. У крыс ГК ретаболил приводит к уменьшению общего количества клеток в тимусе и С08+-тимоцитов относительно активного контроля. У крыс Wistar под влиянием ретаболила, наоборот, увеличивается общее количество клеток в тимусе и гораздо сильнее, чем у ГК, снижается численность С08+-субпопуляции. На клеточный состав крови у крыс ГК ретаболил не оказал никакого влияния, а у крыс Wistar достоверно уменьшилось общее количество лейкоцитов и абсолютное количество эозинофилов.

Поскольку мы исходили из предположения о едином генезе нейроэн-докринных и иммунных расстройств у крыс ГК, необходимо было про-

Таблица 6. Клеточный состав крови и лнмфондных органов у крыс ГК после введения ретаболила (М±ш)

Показатель Количество наблюдений (п) Масло Ретаболил

Тимус (клетки *106 в органе)

Клеток в органе 10 423,9 ±58,6 338,2 ± 49,2*

СБ4+ 10 294,9 ±50,5 192,4 ±41,8

СБ8+ 10 242,8 ±28,6 129,5 ±41,8*

Активированные лимфоциты 10 164,9 ±21,2 200,5 ±30,1

Селезенка (клетки х106 в органе)

Клеток в органе 10 713,8 ±54,0 720,3 ± 80,9

СБ4+ 10 58,75 ±6,4 84,04± 8,2

СБ8+ 10 80,42 ± 8,2 93,00 ± 5,2

Активированные лимфоциты 10 39,9 ±6,1 91,54 ±4,8*

Лимфоузел (клетки х106 в органе)

Клеток в органе 10 53,0 ± 12,6 36,9 ±8,9

Кровь (106 клетки/мл)

Лейкоциты 10 10,25 ± 1,4 10,5 ± 1,5

Лимфоциты 10 7,0± 0,9 7,1 ± 1,0

Нейтрофилы 10 2,5 ± ОД 2,8 ±0,6

Эозинофилы 10 0,4 ±0,1 0,4 ±0,1

Активность оксидоредуктаз лимфоцитов (гранул на клетку)

лдг 10 8,9 ±0,5 9,6 ± 1,0

СДГ 10 12,9 ± 0,9 11,8 ±0,6

Примечание: * - параметры, достоверно отличающиеся от активного контроля (р <0,05).

следить, как изменения клеточного состава лимфоидных органов и крови под влиянием ретаболила связаны с поведенческими реакциями. Крысы ГК и АМбйг по-разному реагировали на однократное введение ретаболила (табл. 7): у крыс ГК время застывания уменьшалось относительно активного контроля, что можно было расценивать, как коррекцию поведенческой аномалии, но почти не влияло на иммунокомпетентные клетки. Это может свидетельствовать об относительной независимости функций нервной и иммунной систем у крыс ГК.

У крыс введение ретаболила, напротив, приводило к увеличе-

нию времени застывания, что сопровождалось выраженными изменениями в клеточном составе крови и органов иммунной системы.

Таблица 7. Влияние ретабалила на время застывания (секунды) V кпыс ГК и \Vistar (М±т) н

Группа Активный контроль (секунды) Ретаболил (секунды)

ГК 11,8 ±3,4 4,9 ±2,4*

\Vistar 1,9 ±0,6 8,4 ± 3,5*

Примечание: *- параметры, достоверно отличающиеся от активного контооля (р<0,05). у

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о модулирующем влиянии ретаболила на поведенческие реакции и характеристики лимфоидных клеток.

ВЫВОДЫ

1. У крыс ГК и \Vistar обнаружены различия в характере суточных вариаций клеточного состава тимуса и селезенки: а) общее количество клеток в тимусе и селезенке крыс ГК максимально вечером, а у крыс \Vistar утром; б) у крыс \Vistar достоверные различия между утренними и вечерними значениями обнаружены только для количества СБ8+-спленоцитов (вечерние значения ниже утренних); в) у крыс ГК достоверные суточные вариации выявлены для количества СБ8+- тимоцитов, активированных лимфоцитов и С04+-спленоцитов, причем вечерние значения этих параметров оказались достоверно повышенными по сравнению с утренними.

2. Общее количество клеток в паховом лимфоузле достоверно повышается в вечернее время и у крыс и у крыс ГК.

3. У крыс \Vistar определяются достоверные суточные вариации активности всех исследованных дегидрогеназ: утренние значения параметров выше вечерних. У крыс ГК активность дегидрогеназ снижена во всех исследованных временных точках по сравнению с крысами Wistar, и достоверные суточные вариации определены только для ЛДГ (утром'ее активность несколько выше, чем вечером).

4. Клеточный состав тимуса и крови крыс \Vistar и ГК по-разному реагирует на введение ретаболила. У ГК в тимусе общее количество клеток и СБ8+-тимоцитов после введения гормона достоверно уменьшается, клеточный состав крови не изменяется. У крыс \Vistar происходит увеличение общего количества клеток в тимусе и С04+-тимоцитов. Количество СБ8+-тимоцитов достоверно уменьшается. Количество лейкоцитов и эозинофилов в крови достоверно снижается.

5. Введение ретаболила оказывает прямо противоположное влияние на поведение крыс ГК и \Vistar: у крыс ГК время застывания уменьшается, а у крыс \Vistar, наоборот, увеличивается.

6. Введение ретаболила привело к нормализации поведенческого craiyca крыс ГК, но в очень малой степени повлияло на исследованные параметры их лимфоцитов, что свидетельствует об отсутствии прямой связи между нейроэндокринной системой и состоянием иммунокомпе-тентных клеток у животных этой линии .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ГрязеваН.И., Алехина Т.А., Барыкина Н.Н., Вербицкая Л.В., Голова-тюк А.В., Мельникова Е.В., Пантелеева Н.Г., Робинсон М.В., Шурлыгина А.В., Колпаков В.Г., Труфакин В.А. Взаимосвязь нарушений некоторых показателей нервной и иммунной систем у крыс, генетически предрасположенных к каталепсии // Нейроиммунология: Материалы Всерос. конф. 12 - 13 октября 1999 г. - Москва: РАМН, 1999. - С. 21.

2. Труфакин В.А., Колпаков В.Г., Грязева Н.И., Шурлыгина А.В., Вербицкая Л.В., Алехина Т.А., Барыкина Н.Н., Пантелеева Н.Г., Мельникова Е.В., Лунегова Е.В. Коррекция поведенческих нарушений у крыс с наследственно обусловленной патологией ЦНС с помощью ретаболила // Тезисы докладов VI Российского нац. конгресса «Человек и лекарство». -Москва, 1999.-С. 71.

3. Gryazeva N.I., Golovatyuk A.V., Verbitskaja L.V., Melnikova E.V., Panteleeva N.G., Shurlygina A.V., Alekhina T.A., Barykina N.N., Kolpakov V.G., Trufakin V.A. Retabolil-induced changes in behavior and some immunological characteristics of Wistar and cataleptic GC rats // Genetic and developmental Psyhoneuroendocrinology. - Novosibirsk, 1999. - P. 36.

4. Пантелеева Н.Г., Грязева Н.И., Вербицкая Л.В., Шурлыгина А.В., Труфакин В.А., Колпаков В.Г., Алехина Т.А., Барыкина Н.Н. Сравнительный анализ некоторых параметров иммунного статуса у крыс ГК (генетическая каталепсия) и Вистар // Бюллетень СО РАМН. - 2001. - № 4.-С. 83 - 86.

5. Пантелеева Н.Г., Грязева Н.И., Вербицкая Л.В., Шурлыгина А.В., Труфакин В.А., Колпаков В.Г., Алехина Т.А., Барыкина Н.Н. Клеточный состав лимфоидных органов у крыс с генетической предрасположенностью к каталепсии в сравнении с исходной популяцией Вистар // Материалы науч. конф. с международ, участием «Проблемы лимфологии и интерсти-циального массопереноса». - Новосибирск, 2004. - Т. 10 (2). - С. 7 - 10.

6. Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., Мичурина С.В., Дергачева Т.И., Литвиненко Г.И., Ковшик И.Г., Пантелеева Н.Г., Вербицкая Л.В., Мельникова Е.В. Биоритмы в оценке и коррекции патологии иммунной системы // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, посвященная памяти профессора М.Я.Субботина. - Новосибирск, 2004.-С. 122-125.

7. Пантелеева Н.Г., Грязева Н.И., Вербицкая JI.B., Шурлыгина A.B., Труфакин В.А., Колпаков В.Г., Алехина Т.А., Барыкина H.H. Сравнительный анализ суточной динамики субпопуляционного состава лимфоцитов лимфоидных органов крыс с генетической каталепсией и Вистар // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2004. - Т. 137, №3. - С. 325-328.

8. Пантелеева Н.Г., Шурлыгина A.B., Труфакин В.А. Влияние рета-болила на клеточный состав лимфоидных органов у крыс ВИСТАР и ГК (генетическая предрасположенность к каталепсии) // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 4. - С. 51 - 56.

Соискатель „ ,Н.Г.Пантелеева

Подписано в печать 26.04.2013. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 56. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пантелеева, Наталья Григорьевна, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт

клинической и экспериментальной лимфологии»

Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Пантелеева Наталья Григорьевна {U201 3581 86

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ И ЛИМФОИДИЫХ ОРГАНОВ У КРЫС С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К

КАТАЛЕПСИИ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология.

Научные руководители: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.А. Труфакин доктор медицинских наук, профессор A.B. Шурлыгина

Новосибирск 2013

На правах рукописи

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................10

1.1. Психонейроиммунные взаимодействия........................................................10

1.2. Морфофункциональная характеристика клеток иммунной системы........13

1.2.1. Характеристика поверхностного фенотипа различных субпопуляций

клеток иммунной системы.........................................................................15

1.3. Суточные биоритмы иммунной системы.....................................................22

1.3.1. Суточные биоритмы морфофункциональных характеристик лимфоцитов крови......................................................................................23

1.3.2. Суточные вариации морфофункциональных параметров клеток лимфоидных органов..................................................................................26

1.4. Суточные биоритмы иммунных функций....................................................31

1.5. Кататония у крыс. Крысы с генетической предрасположенностью к каталепсии (ГК), как модель психопатологических состояний человека. ..........................................................................................................................34

1.5.1. Кататония...................................................................................................34

1.5.2.Крысы с генетической предрасположенностью к каталепсии (ГК).....36

1.5.3. Моноаминэргические системы мозга у крыс ГК...................................37

1.5.4. Особенности стресса у крыс ГК..............................................................39

1.6. Анаболические стероиды и их влияние на психоэмоциональное

состояние, стрессреактивность и иммунную систему............................42

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................50

Методика определения активности оксидоредуктаз......................................55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................59

3.1. Суточные вариации клеточного состава лимфоидных органов и крови у интактных крыс \Vistar..................................................................................59

3.2. Суточные вариации клеточного состава лимфоидных органов и крови у

интактных крыс ГК........................................................................................65

3.3. Сравнительный анализ морфологических показателей лимфоидных органов и крови у интактных крыс \Vlstar и ГК.........................................70

3.4. Морфологические показатели и субпопуляционный состав лимфоидных органов и крови у крыс \Vistar и ГК после введения ретаболила.............82

3.5. Влияние ретаболила на кататонические реакции (время застывания) у крыс с генетической предрасположенностью к каталепсии (ГК) и у крыс ^й^аг...............................................................................................................86

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................102

ВЫВОДЫ..................................................................................................................105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................107

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Известно, что нарушения психической сферы человека и животных, часто сопровождаются изменениями иммунного статуса, что ведет к снижению резистентности к инфекциям, повышению риска развития опухолевого процесса, преждевременному старению, с другой стороны, есть данные о том, что биологически активные вещества (цитокины и нейромедиаторы), вырабатываемые иммунокомпетентными клетками, влияют на функции головного мозга (Девойно JI.B., Илыочонок З.Ю., 1993; Крыжановсекий Г.Н., 2002; Гусев Е.И., Крыжановский Г.Н., 2009; Restak R, 2006; Goodvin G. et al., 2009; Freudenreich O. et al, 2010). Нарушение выработки нейротропных биологически активных веществ в условиях психонейроиммунопатологии может привести к прогрессированию и поддержанию психических сдвигов. В связи с этим исследование психонейроиммунных взаимодействий на моделях психопатологии у животных представляет актуальную научную проблему.

Об актуальности подобных исследований говорит формирование нового научного направления - психонейроиммунологии.

Для эффективного изучения механизмов развития психосоматических и психоиммунологических нарушений, а также возможностей их комплексной коррекции, необходимы адекватные модели подобных состояний у животных.

В этом отношении представляют интерес крысы неинбредной линии ГК, с генетически обусловленными нарушениями функции центральной нервной системы (генетическая предрасположенность к каталепсии), выведенной в ИЦиГ СО РАН. У этих животных обнаруживается сходство целого ряда нейрофизиологических и нейропсихических параметров с характеристиками некоторых патологических состояний нервной системы у человека, в частности, с тем, что известно о шизофрении и депрессии (Колпаков В.Г., 1999). Особый интерес представляет то, что крысы ГК обнаруживают патологическую реакцию на стресс, как в поведенческом, так и нейроэндокринном аспекте. Кроме того, в предварительных исследованиях нами были обнаружены

особенности морфоцитохимической характеристики лимфоцитов данных животных по сравнению с крысами Wistar, позволяющие предположить, что у крыс ГК имеются нарушения иммунного гомеостаза, вероятно обусловленные, сдвигами в деятельности нервной и эндокринной систем (Грязева Н.И. и др., 1994; 1998; 1999; Пантелеева Н.Г. и др., 2001; 2007; 2010)

Каталептический тип реагирования представляет собой широко распространенный в животном мире способ адаптации. В настоящее время имеются данные, позволяющие предположить, что сниженный порог этого типа реагирования может рассматриваться как биологическая основа для развития психопатологии (Колпаков В.Г., 1990; Kolpakov V.G. et al., 1996). Можно предполагать, что и в обычных условиях у человека существует тип нервно-психической адаптации, эволюционно восходящий к каталептическому. Как бы то ни было, широкое распространение его в животном мире определяет интерес к исследованию его характеристик и механизмов.

Результаты ряда исследований указывают на существование связи между активностью моноаминергических систем мозга и гипофизарно-надпочечниковой системы с одной стороны и состоянием иммунитета - с другой (Девойно JI.B., Илыочонок З.Ю., 1983; Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина E.JL, 2009). Однако, практически отсутствуют сведения о характере функционирования иммунной системы у этих животных. Изучение морфофункциональных характеристик лимфоцитов крыс ГК в сравнении с исходной популяцией Wistar могло бы пролить свет на некоторые аспекты иммунонейроэндокринных взаимодействий, особенно, в связи с развитием психопатологических проявлений.

Известно, что функциональное состояние иммунной системы тесно связано с ее структурно-временной организацией (Козлов В.А. и др., 1978; 1982; Бородин Ю.И. и др., 1992; 2000; 2007; Труфакин В.А и др., 2004; 2005; 2008; 2012; Шурлыгина A.B. и др., 1992; 2000; 2008; 2011). Поэтому, исследование морфоцитохимических параметров лимфоидных клеток во временном аспекте даст более полную информацию об особенностях

иммунного гомеостаза. В связи с этим было предпринято изучение суточных вариаций клеточного состава лимфоидных органов и активности ферментов окислительно-восстановительного метаболизма лимфоцитов крови.

Учитывая имеющуюся у самцов ГК андрогенную недостаточность (Шульга В.А. и др., 1996; Колпаков В.Г. и др., 2004), представляет интерес исследовать характер влияния на поведенческие и иммунных параметры анаболических стероидов, в частности, ретаболила.

Известны стресспротекторные, анксиолитические и

иммуномодулирующие свойства анаболических стероидов (Грундинг П., Бахман М., 2011). Показано, что анаболические стероиды являются самым активным классом соединений, из всех известных анаболических средств. При правильном применении они дают значительный прирост массы тела, увеличивают силу мышц, нормализуют липидный обмен, снижают уровень холестерина (Грундинг П., Бахманн М., 2011). В геронтологии анаболические стероиды применяют для замедления развития возрастных заболеваний (Sheffield-Moore М., 2000; Rudolph I., Palombo-Kinne Е. et al., 2004). Анаболические стероиды используются и для лечения нервной депрессии. В самых тяжелых случаях их комбинируют с психотропными препаратами и добиваются хороших результатов (Sinitskii T.N., Usherenko L.S., Zapotochnyi В.А., Kryzhanovskii L.A., 1988).

Анаболические стероиды оказывают влияние и на иммунную систему. В последнее время появились исследования, подтверждающие способность анаболических стероидов повышать все виды иммунитета и соответственно возможность их использовать в комплексной терапии хронических воспалительных заболеваний (Yoshida S. et al., 1988; Johns К. et al., 2005).

Поэтому, мы предположили, что ретаболил окажется эффективным в комплексном воздействии на нейроиммунные нарушения у крыс с генетической предрасположенностью к каталепсии.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы - дать сравнительную морфоцитохимическую характеристику лимфоцитов с учетом суточных вариаций показателей у интактных крыс ГК и \Vistar и оценить влияние ретаболила на поведенческие и иммуноморфологические параметры у этих животных.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Изучить общее количество и субпопуляционный состав лимфоцитов в тимусе, селезенке и паховом лимфоузле у крыс ГК и Wistar.

2. Изучить активность ферментов энергетического метаболизма лимфоцитов крови у крыс ГК и \Vistar.

3. Изучить особенности суточных вариаций иммуноморфологических параметров у крыс ГК и

4. Изучить морфоцитохимические параметры лимфоцитов (субпопуляционный состав клеток тимуса и селезенки, активность дегидрогеназ лимфоцитов крови) у крыс ГК и Wistar после введения ретаболила.

5. Оценить влияние ретаболила на поведенческие характеристики крыс ГК и \Vistar.

Научная новизна полученных данных.

1. Получены новые данные об особенностях клеточного состава лимфоидных органов и крови, а также активности дегидрогеназ лимфоцитов крови у крыс ГК в сравнении с

2. Впервые обнаружено, что у крыс ГК изменены суточные вариации иммуноморфологических параметров по сравнению с крысами \Vistar, что свидетельствует об изменении временной организации иммунной системы и согласуется с данными об особенностях суточных вариаций метаболизма моноаминов в головном мозге этих животных.

3. Впервые показано, что ретаболил по разному влияет на лимфоциты крови и лимфоидных органов крыс ГК и \Yistar, что свидетельствует о межлинейных особенностях эндокринно-иммунных взаимоотношений.

4. Получены ранее неизвестные факты о том, что крысы ГК и \Vistar различаются по характеру комплексной реакции поведенческих параметров и показателей иммунокомпетентных клеток в ответ на введение ретаболила. Гормон оказал разнонаправленное действие на выраженность каталептической реакции у этих животных, однако у крыс ГК при выраженном корригирующем эффекте на поведенческий статус ретаболил почти не изменил характеристики иммунокомпетентных клеток.

Научно- практическая значимость работы.

1. Результаты проведенных исследований дополняют знания об особенностях структурно-метаболических характеристик клеток иммунной системы при различных психоэмоциональных состояниях и поведенческих расстройствах, с учетом временного фактора.

2. Выявленные межлинейные особенности реакции нервной и иммунной системы у крыс ГК и \Vistar на гормональное воздействие, позволяет использовать данную модель для изучения механизмов психонейроиммунных взаимодействий и для разработки методов их персонифицированной коррекции.

Положения, выносимые на защиту

1. Крысы ГК и значительно различаются по ряду морфологических и цитохимических показателей клеток иммунной системы, что позволяет предполагать единый генез психонейроиммунных нарушений у крыс ГК.

2. Крысы ГК и \Vistar значительно различаются по суточным вариациям морфологических и цитохимических показателей лимфоцитов, что

свидетельствует об измененной суточной временной организации нейроиммунных взаимоотношений у крыс ГК.

3. У крыс ГК и \Vistar существуют различия в способности нервной ситемы и иммунокомпетентных клеток реагировать на гормональный стимул, что проявляется в разнонаправленных эффектах введения ретаболила на клетки иммунной системы и поведенческие параметры у этих животных.

Апробация результатов диссертации.

Результаты работы обсуждены на Всероссийской конференции «Нейроиммунология», Москва, 1999; VI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство », Москва, 1999; IV съезд физиологов Сибири, Новосибирск, 2002; Научная конференция с международным участием «Проблемы лимфологии и интерстициального массопереноса», Новосибирск,2004; Международный конгресс «Эндоэкологическая медицина», Новосибирск, 2007; Международная конференция «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии», Новосибирск, 2008.

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текстаи содержит 15 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 284 работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Психонейроиммунные взаимодействия.

Нервная и иммунная системы в комплексе с эндокринной системой выполняют совместную функцию сохранения и поддержания динамического гомеостаза в организме. Они объединяются в нейроиммунноэндокринную систему, в которой они взаимодействуют по принципу взаимной регуляции, осуществляемой нейромедиаторами, нейропептидами, трофическими факторами, гормонами, лимфокинами через соответствующий рецепторный аппарат.

Эта взаиморегуляция, с одной стороны, и определяет надежность их совместной деятельности, но с другой стороны, создает риск развития функциональных расстройств общей системы при первичном нарушении какой-либо из подсистем. Такого рода расстройства можно определить как дизрегуляционную патологию, патогенез которой может быть связан с нервными, эндокринными или иммунными механизмами (Крыжановский Г.Н. и др., 1997; 2002; 2009).

Связь между психическими расстройствами и иммунными процессами изучается давно. Нарушения клеточного и гуморального иммунитета были отмечены при шизофрении, эпилепсии, органических поражениях ЦНС (Семенов С.Ф. и др., 1984; Ветлугина Е.П., 2000; Evans D. et al.,1988; Restak R., 2006; Goodwin G., 2009). Выявлены изменения иммунного статуса и у больных с различными невротическими расстройствами (Потапова В.А., ТрубниковВ.И., 1987; Крыжановский Г.Н., Магаева C.B., 1995; Гаврилова Е.А., Шабанова Л.Ф., 1998; Арушанян Э.Б., Бейер Э.В. , 2004; Ветлугина Е.П и др., 2006; Ader R., 2000; BabaY. et al, 2005; Bonartsev P. et al., 2009; Freudenreich О. et al., 2010). В настоящее время известно о роли нейромедиаторов в модуляции иммунного ответа. Большое значение придается анализу роли нейромедиаторных систем мозга в этиологии и патогенезе психических болезней (Девойно Л.В.,

Илыочонок ЗЛО., 1993; Девойно Л.В. и др., 2009). Имеются убедительные работы с использованием фармакологического анализа и электролитического выключения определенных структур мозга, показывающие тормозное действие серотонинергической системы и иммуностимулирующее действие дофамин - и ГАМК - ергической систем в иммуномодуляции (Девойно Л.В., Илыоченок З.Ю., 1993; РеПевппо Т., Вауег В., 1998; Вази 8. ^ а1., 2000; 8аЬа В. ег а1., 2001; Багкаг С. & а!., 2009).

Каждая из нейромедиаторных систем действует на иммунную функцию во взаимодействии с другими, а не изолированно (Девойно Л.В., Илыочонок З.Ю., 1993), в основе чего лежат морфофункциональные связи (Ке11апё М., е! а1., 1990; ВеЫоиоК 8. & а1., 1991; Казтиззоп А. ег а1., 1994; М1з8а1е С. е1 а1., 1998; Азе А. е1 а1., 2000; УиШегпк* 8. ег а1, 2009). В результате этого взаимодействия создается определенная нейрохимическая картина мозга с преобладанием в мозговых структурах доминирующей системы (серотонинергической или дофаминергической), которая оказывает определенное воздействие на состояние организма (психосоматика) и, в частности, на иммунную систему (Девойно Л.В., Илыочонок З.Ю., 1993; Девойно Л.В. и др., 2009). Нейрохимическая установка мозга может быть создана фармакологическим путем, а также формируется при определенных формах поведения, сопровождающихся психоэмоциональным напряжением, при психопатологии.

В настоящее время вскрыты механизмы нейроиммунных взаимодействий на уровне рецепторного аппарата мембран клеток. На мембранах лимфоцитов обнаружены рецепторы к медиаторам - бета-эндорфину, метэнкефалину, белку Р, адренергическим в�