Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффект отбора по поведению серых крыс на экспрессию гена рецептора глюкокортикоидов

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эффект отбора по поведению серых крыс на экспрессию гена рецептора глюкокортикоидов"

004612017

На правах рукописи

I ^ ГЕРБЕК ЮРИЙ ЭМИЛЬЕВИЧ

ЭФФЕКТ ОТБОРА ПО ПОВЕДЕНИЮ СЕРЫХ КРЫС НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА РЕЦЕПТОРА ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 РОЯ 7010

Новосибирск 2010

004612017

Работа выполнена в лаборатории эволюционной генетики Учреждения Российск академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Оськина И.Н. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Серов О.Л.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Селятицкая В.Г. Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН,

г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «23> ноября 2010 г. на утреннем заседа! диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание учё] степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-з Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, пр-т Ак. Лаврентьева, д. 10, т. (383)363-49-06, факс. (383)3 12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики РАН.

Автореферат разослан « ЙТоктября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук '¿) Хлебодарова Т.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стресс - одно из важнейших свойств организма, позволяющее сохранять гомеостаз в экстремальных ситуациях. В то же время длительное действие стрессора может привести к истощению организма, необратимым преобразованиям и смерти (Селье, 1979). Поэтому при продолжительном сохранении изменившихся условий пониженная стресс-реактивность, вероятно, является одним из основных критериев приспособленности (Беляев, Бородин, 1982). В этом ключе, представляет особенный интерес эксперимент по доместикации животных, который проводится в Институте цитологии и генетики СО РАН. По мнению Д. К. Беляева, при историческом одомашнивании решающим фактором являлся отбор по поведению по отношению к человеку, который, по-видимому, включал в себя отбор на стресс-реактивность (Науменко, Беляев, 1981).

Показано, что отбор на доместикацию снижает функциональную активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) (Дыгало и др., 1985; Naumenko et al., 1987; Оськина, Плюснина, 2000), являющейся ключевой в развитии стресс-ответа. У серых крыс, селекционируемых на элиминацию и усиление агрессивного поведения по отношению к человеку («ручные» и «агрессивные», соответственно), выявлены различия в динамике стресс-реакции, а также в базальном и стресс-индуцированном уровнях глюкокортикоидов (конечного звена ГГНС) в крови. Установлено, что у ручных крыс уровень глюкокортикоидов в плазме крови ниже, чем у агрессивных (Дыгало и др. 1985; Naumenko et al., 1989; Оськина, Плюснина, 2000). В регуляции стресс-ответа ведущее место занимают рецепторы глюкокортикоидов (ГР) гиппокампа. Они участвуют в отрицательной обратной связи ГГНС, купируя стресс-реакцию (Pfaff et al., 2004). Установлено, что у крыс, селекционируемых на контрастное поведение по отношению к человеку, количество ГР в гиппокампе различно (Оськина, Плюснина, 2000).

Наиболее исследованным путём регуляции ГР у крыс, влияющий на ГГНС, является механизм, связанный с альтернативным сплайсингом мРНК ГР (McCormick et al., 2000). Он описан при неонатальных воздействиях, которые вызывают повышение количества ГР в гиппокампе и снижение активности ГГНС (Meaney et al., 1996). Это наводит на мысль о схожести механизмов изменения стресс-реактивности при отборе по поведению и вследствие неонатальных влияний. Показано, что уровень транскрипции гена ГР под контролем промотора альтернативного экзона I7 повышается в гиппокампе под влиянием раннего опыта (Weaver et al., 2004), что связывают с деметилиро-ванием этого промотора. Если же вводить в мозг крысам, подвергнутым таким воздействиям, метионин, то уровень метилирования ДНК повышается, что вызывает снижение экспрессии гена ГР и усиление активность ГГНС (Weaver et al., 2004). Полагают, что подобный механизм задействован и при пренатальных влияниях (Seckl, Holmes, 2007). С другой стороны, содержание крыс во время беременности на малобелковых диетах влияет на уровень мРНК ГР с экзоном 1ю в печени их потомков (Lillycrop et al., 2007). Транскрипция под контролем промотора этого экзона составляет более 60% от общей транскрипции гена ГР

(McCormick et al., 2000) и регулируется метилированием ДНК (Lillycrop et al., 2007). Однако в пренатальный период развития не было исследовано влияние метионина на экспрессию гена ГР. В то же время известно, что материнская метилобогащённая диета вызывает различные изменения в формировании центральной нервной системы и в профиле метилирования некоторых генов у потомков (Cooney et al., 2002; Van den Veyver, 2002).

Эксперимент по содержанию крыс во время беременности на метилобогащённой диете, проведённый на крысах, селекционируемых на контрастное поведение по отношению к человеку, позволяет оценить влияние метионина в эмбриональный период развития на уровень метилирования промотора гена ГР и экспрессию этого гена во взрослом состоянии. Результаты эксперимента также дают возможность выяснить, являются ли схожими механизмы изменения активности ГТНС при отборе по поведению и перинатальных воздействиях.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов у серых крыс, селекционируемых на ручное и агрессивное поведение, и исследование механизмов возможных различий.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Оценить общую экспрессию гена ГР в гиппокампе и периферических органах у ручных и агрессивных крыс.

2. Исследовать активность периферических звеньев ГГНС и общую экспрессию гена ГР у первого и второго поколений потомков ручных и агрессивных серых крыс, содержавшихся на метилобогащённой диете в период беременности.

3. Проанализировать профиль метилирования промотора экзона Ъ гена ГР и количество мРНК ГР с альтернативным экзоном I7 в гиппокампе у потомков крыс, содержащихся на метилобогащенной диете или стандартном питании во время беременности.

4. Определить уровень мРНК ГР с альтернативным экзоном 1 ю в гиппокампе у крыс, матери которых содержались на стандартном питании во время беременности, а также у первого и второго поколений потомков животных, получавших в период беременности метилсодержащие добавки. Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе

впервые изучено влияние отбора по поведению на экспрессию гена ГР у крыс. Отбор на ручное поведение повышает количество мРНК ГР в гиппокампе, однако не затрагивает мРНК ГР в печени и селезёнке. Впервые исследовано влияние материнской метилобогащённой диеты на активность ГГНС и экспрессию гена ГР у потомков. Материнская диета у животных из ручной популяции приводит к более позднему возвращению уровня кортикостерона в крови к базальным показателям после рестрикционного стресса и к снижению общего количества мРНК ГР и уровня мРНК ГР с экзоном 1ю в гиппокампе, что свидетельствует об ослаблении отрицательной обратной связи ГГНС. В то же время, достоверных влияний пренатальной диеты на динамику стресс-ответа и экспрессию гена ГР у животных из популяции, селекционируемой на усиление агрессивного поведения по отношению к человеку, выявлено не было.

Обнаружено отличное от описанного ранее метилирование промотора экзона I7 гена ГР крысы в гиппокампе. Выявлено гипометилирование участка ДНК, считавшегося ранее гиперметилированым у крыс. Данная работа расширяет представления о механизмах изменения активности ГГНС при эволюционных преобразованиях животных вследствие отбора по поведению. Кроме того, освещается вопрос о влиянии пренатальной метилобогащённой диеты на экспрессию гена ГР и о зависимости эффектов диеты от генотипа животных. Полученные данные могут иметь значение в исследованиях патологий раннего развития. Результаты исследования используются в качестве материала для курса лекций И. 3. Плюсниной «Нейробологические и нейрофизиологические закономерности поведения», читаемого на 4 курсе ФЕН НГУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Отбор серых крыс на доместикационное поведение повышает уровень экспрессии гена ГР в гиппокампе.

2. Выявлены различия в эффекте материнской метилобогащённой диеты на экспрессию гена ГР в гиппокампе у потомков крыс, селекционируемых на элиминацию и усиление агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку, свидетельствующие о роли метилирования ДНК в эффектах отбора по поведению.

3. Установлен значительный вклад мРНК с экзоном 1ю в регуляцию экспрессии гена ГР в гиппокампе и активности ГГНС под влиянием пренатальной метилобогащённой диеты.

4. Выдвинуто предположение, что метилирование промотора экзона 17, на котором основан ранее описанный механизм регуляции экспрессии гена ГР и активности ГГНС, является эктопическим.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на XX съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), Международной конференции «Current Evolution Thinking in Biology, Medicine and Sociology International Conference Dedicated to 90 Anniversary of Prof. Dmitry K. Belyaev» (Новосибирск, 2007), IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), международном конгрессе «The 7th International Congress of Neuroendocrinology» (Руан, Франция, 2010) и XXI съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова. Также полученные результаты были представлены и обсуждены на отчётной сессии по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Новосибирск, 2009) и отчётной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Уровень кортикостерона в крови животных определялся к.б.н. Осышной И. Н. Тестирование и отбор по поведению серых крыс проводились к.б.н. Плюсниной И. 3.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы. Работа

изложена на 128 страницах, содержит 17 рисунков, 5 таблиц, список цитируемой литературы включает 241 ссылку.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для экспериментов служили две аутбредные линии серых крыс (Rattus norvegicus), селекционируемых с 70-х годов на элиминацию и усиление агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку. Животные содержались в стандартных условиях вивария ИЦиГ СО РАН. В опыт были взяты взрослые самцы 64-70 поколений селекции. Также были исследованы дикие серые крысы (самцы), отловленные в окрестностях новосибирского Академгородка и в Новосибирской области.

Матери опытных ручных и агрессивных крыс содержались во время беременности и 5 дней после родов на метилобогащенной диете (Прасолова и др., 2009), а матери контрольных - на стандартном питании. Эксперимент проводили на трехмесячных самцах.

Для оценки активности ГГНС в ответ на стрессорное воздействие исследовали содержание кортикостерона в периферической крови. В качестве стрессорного воздействия использовали ограничение подвижности в течение 30 мин. Пробы крови брали из хвостовой вены до начала эксперимента (базальный уровень) и через разные отрезки времени после окончания стресса. Уровень кортикостерона в плазме крови определяли методом конкурентного белкового связывания (Murphy, 1967; Тинников, Бажан, 1984).

Крыс быстро декапитировали, извлекали печень, селезёнку и головной мозг, от которого отделяли гиппокамп. Ткани замораживали и хранили в азоте. Суммарную РЖ, а также ДНК выделяли с использованием «TRI Reagent» («Sigma», США) в соответствии с протоколом фирмы изготовителя. Раст вор РНК обрабатывали ДНКазой I («Fermentas», Литва). Затем синтезировали кДНК с помощью рекомбинантной обратной транскриптазы RevertAid M-MuLV («Fermentas», Литва).

Для оценки количества мРНК ГР в образцах использовали метод полуколичественной ОТ-ПЦР (Horikoshi, Sakakibara, 2000). Условия стандартизовали путём побора концентрации кДНК и количества циклов ПЦР, при которых реакция находилась в экспоненциальной фазе роста количества продукта, для исследуемого гена и внутреннего контроля. Также использовали метод ОТ-ПЦР в реальном времени (Pfaffl, 2004), который позволяет регистрировать накопление продукта амплификации исследуемого гена и внутреннего контроля в каждом цикле реакции. Для этого использовали комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I и референсного красителя ROX (Синтол, Россия) и амплификаторы ABI PRISM 7000 и 7900НТ (Applied Biosystems, США).

Для определения метилирования промотора экзона 17 гена ГР использовали метод бисульфитного секвенирования (Clark et al., 1994). После обработки ДНК бисульфитом натрия, при которой все неметилированные цитозины превращались в урацил, проводилась ПЦР с «вложенными» праймерами (Weaver et al., 2006). После чего полученный продукт клонировали в химически-модифицированных бактериях с помощью набора pGEM®-T Easy Vector System

II (Promega, США), амплифицировали с использованием универсальных праймеров М13 и секвенировали.

Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу с помощью набора BigDye™ Terminator Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Электрофоретический анализ проводился в центре коллективного пользования «Секвенирование ДНК» СО РАН на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130x1.

Статистический анализ результатов определения содержания кортикостерона в крови проводили с использованием двухфакгорного дисперсионного анализа с последующим сравнением межгрупповых различий по критерию Ньюмена-Кейлса, учитывая повторные измерения (ANOVA-MANOVA; Statistica 6.0). Для сравнения результатов определения количества мРНК использовался t-критерий Стьюдента (для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени) или рандомизированный критерий с двухточечным перераспределением и алгоритм Тейлора (только для ОТ-ПЦР в реальном времени; REST 2008-2009). При анализе данных по метилированию ДНК применяли U-критерий Манна-Уитни (Statistica 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень мРНК рецептора глюкокортикоидов у серых крыс, контрастных по поведению

Известно, что у ручных крыс количество ГР в гиппокампе достоверно выше, чем у агрессивных (Оськина, Плюснина, 2000), что, по всей видимости, усиливает отрицательную обратную связь ГГНС и снижает активность системы. Методом полуколичественного ОТ-ПЦР (рис. 1А,Б) и ОТ-ПЦР в реальном времени (рис. 1В) показано, что уровень мРНК ГР в гиппокампе ручных крыс почти в 2 раза выше, чем у агрессивных. Таким образом, можно заключить, что появившиеся в результате отбора по поведению различия в количестве цитозольных ГР в гиппокампе у агрессивных и ручных крыс (Оськина, Плюснина, 2000) в значительной степени связаны с уровнем мРНК ГР в этой же структуре мозга.

При исследовании влияния отбора по поведению на активность ГГНС важно выяснить, изменяется ли количество ГР в периферических органах, основных мишенях глюкокортикоидов. Метод ОТ-ПЦР в реальном времени не выявил достоверных отличий в содержании мРНК ГР ни в печени, ни в селезёнке между ручными и агрессивными крысами (REST 2009). Таким образом, можно предполагать, что наблюдаемые в результате отбора по поведению изменения коснулись, главным образом, именно ГР в гиппокампе, участвующих в отрицательной обратной связи ГГНС.

Влияние пренатальной метилобогащённой диеты на активность ГГНС у крыс, селекционируемых по поведению

Из литературы известно, что метилирование CpG-динуклеотидов регуляторной зоны гена ГР может играть немалую роль в регуляции количества ГР в гиппокампе, а, следовательно, и активности ГГНС через усиление или ослабление глюкокортикоидной отрицательной обратной связи (Weaver et al.,

2004). Показано также, что введение метионина в мозг крыс взрослым животным изменяет профиль метилирования ДНК и уровень экспрессии ряда генов, в том числе и гена ГР (Weaver et al., 2004а, 2004b, 2005, Colvis et al., 2005). Единственным доступным методом повышения уровня метионина при пренатальном развитии является введение компонентов цепи метаболизма S-аденозилметионина в организм матери. Известно, что материнская метилсодержащая диета приводит к изменениям в формировании ЦНС и в профиле метилирования некоторых генов (см. Van den Veyver, 2002; Cooney et al., 2002). Для исследования связи метилирования ДНК с различиями между ручными и агрессивными крысами и его влияния на пренатальное «программирование» активности ГГНС был поставлен эксперимент по пренатальному содержанию крыс на метилобогащённой диете. Исследовались четыре группы животных: 1) потомки ручных крыс, содержавшихся во время беременности на метилобогащённой диете (ручные опытные); 2) потомки агрессивных крыс, содержавшихся во время беременности на метилобогащённой диете (агрессивные опытные); 3) потомки ручных крыс, получавшие во время беременности стандартное питание (ручные контрольные); 4) потомки агрессивных крыс, получавшие во время беременности стандартное питание (агрессивные контрольные).

GR201 пл

GAPDH 397П.Н,-1.2 1.0

-4 -А

twiS^I

в

тт.

0.8-

0.6-

с:

о

0.4-

0.2-

0.0

агрессивные ручные

Рис. 1. Количество мРНК ГР в гиппокампе агрессивных и ручных серых крыс. А - электрофореграмма амплификацированного с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР участка мРНК ГР (201 п.н.) и GAPDH (397 п.н.; внутреннего контроля); Б - относительная оптическая плотность амплифи-цированного в полуколичественной ОТ-ПЦР участка мРНК ГР (п = 8 животных в каждой группе); В - отношение количеств мРНК ГР, определённое с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (п = 4 животных в каждой группе) - верхняя и нижняя границы прямоугольника охватывают 50% наблюдений, медиана соответствует значению отношения количеств мРНК ручных крыс по сравнению с агрессивными (REST 2009); **Р<0,01, ***Р<0,001 у ручных крыс больше по сравнению с агрессивными.

Влияние пренатальной метилобогащённой диеты на базальный и стрессориый уровень кортикостерона в крови у взрослых крыс

У четырёх групп крыс была изучена временная динамика ответа ГТНС на 30-минутный рестрикционный стресс (рис. 3). Были повторены результаты,' полученные при сравнении контрольных ручных и агрессивных крыс (Дыгало и др., 1985; Оськина, Плюснина, 2000). Уровень кортикостерона в крови у ручных животных ниже, чем у агрессивных, а также различна динамика ответа ГГНС на рестрикционный стресс (FI2o = 20,2, Р<0,001). Двухфакторный дисперсионный анализ также выявил отличия в динамике ответа и между опытными и контрольными ручными крысами (F^mj = 18,4, Р<0,001), тогда как у агрессивных животных различий в опыте и контроле не выявлено. Уровень кортикостерона через час и 2 часа после окончания стресса у ручных опытных крыс достоверно выше, чем у их контроля (Р<0,001), тогда как у агрессивных животных достоверные различия в этих временных точках не выявлены. Базальный же уровень кортикостерона не отличался между опытом и контролем ни у ручных, ни у агрессивных. Таким образом, по-видимому, можно заключить, что метилобогащённая диета ослабляет глюкокортикоидную отрицательную обратную связь.

Экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе серых крыс, матери которых содержались во время беременности на метилобогащённой диете

Метод полуколичественной ОТ-ПЦР показал разницу в уровне мРНК ГР в гиппокампе между ручной контрольной и ручной опытной группами (рис. 4). Достоверных различий между агрессивной опытной и агрессивной контрольной группами выявлено не было (рис. 4). Это хорошо согласуется с данными о временной динамике уровня кортикостерона в ответ на стресс (рис. 3) и является дополнительным подтверждением предположения о влиянии материнской метилобогащенной диеты на отрицательную обратную связь у ручных крыс.

Поскольку регуляция количества ГР и, соответственно, активности ГГНС, по-видимому, во многом происходит за счёт изменения уровня мРНК ГР с разными альтернативными экзонами (McCormick, 2000), важно было исследовать их содержание в гиппокампе у ручных и агрессивных крыс. Кроме того, известно, что их регуляция может происходить с помощью метилирования ДНК (Weaver et al„ 2005; Lillycrop et al., 2008), поэтому необходимо также было исследовать количества сплайс-вариантов мРНК ГР у потомков крыс, содержащихся на метилобогащённой диете во время беременности. Специфичным для гиппокампа является вариант мРНК ГР с экзоном 17, тогда как мРНК с экзоном 1 ю преобладает во всех тканях.

Метод ОТ-ПЦР в реальном времени не выявил различий в уровне мРНК ГР с экзоном 17 в гиппокампе ни у одной из четырёх групп крыс (контрольные ручные - 0,54±0,03, контрольные агрессивные - 0,44±0,20, опытные ручных -0,63±0,25, опытные агрессивные - 0,44±0,19; Р>0,05; п = 3 животных в каждой группе). Исследования количества мРНК ГР с экзоном 1ю в гиппокампе показали достоверные различия между ручной контрольной группой крыс и ручной и агрессивной опытными группами животных (рис. 5). Достоверного

30-,

25-

£ 20-

5

г о о. 15-

£

Ь -

10-

к о.

5-

Агрессивные

—о— контроль —о— опыт

Стресс

Ьазальныи уровень

Ручные

0 12 4

Время после окончания стресса, час

—в— контроль

—О— ОПЫТ

Базальный о

уровень

Время после окончания стресса, час

Рис. 3. Уровень кортикостерона в крови после 30-мин. рестрикционного стресса (п = 12 животных в каждой группе) у потомков агрессивных (А) и ручных (Б) крыс, содержавшихся во время беременности на метилобогащённой диете или стандартном питании. **Р<0,01 агрессивные опытные по сравнению со своим контролем; ***Р<0,001 ручные опытные по сравнению со своим контролем; +Р<0,05, +++Р<0,001 ручные опытные по сравнению с агрессивными контрольными.

РК

РО

АК АО

С11сот 201 г ОАРШ 397 I

I I контроль опыт

Ручные Агрессивные

Рис. 4. Влияние материнской метилобогащённой диеты на количество мРНК ГР в гиппокампе серых крыс (п = 8 животных в каждой группе); А - электрофореграмма амп-лифицированного с помощью ОТ-ПЦР участка мРНК ГР (201 п.н.); Б - относительная оптическая плотность амплифицированного участка мРНК ГР; ***Р<0,001 ручные опытные по сравнению со своим контролем; ШР<0,001 агрессивные контрольные по сравнению с ручными контрольными; ++Р<0,01 ручные опытные по сравнению с агрессивными опытными.

□ контрольные Н опытные

Ручные Агрессивные

Рис. 5. Влияние материнской метилобогащённой диеты на количество мРНК ГР, содержащей экзон 110, в гиппокампе серых крыс (п = 3 животных в каждой группе). Количественный анализ амплифицированного участка экзона 110 транскрипта гена ГР; **Р<0,01 ручные контрольные по сравнению с ручными и агрессивными опытными.

различия между агрессивной контрольной группой и другими группами обнаружено не было (1Д6±0,19; Р>0,05).

Таким образом, экзон 1ю достоверно снижается у ручных крыс под влиянием метилобогащённой диеты, тогда как его роль в изменении количества мРНК ГР при отборе по поведению не установлена.

Исспедование метилирования промотора экзона 17 гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе

Чтобы установить, влияет ли материнская метилобогащённая диета на профиль метилирования промотора экзона 17 гена ГР в гиппокампе крыс, контрастных по поведению, а также выяснить, вызвал ли отбор по поведению изменение этого профиля, был использован метод бисульфитного секвенирова-ния ДНК. Промотор экзона 17 гена ГР во всех группах оказался гипо-метилирован и уровень метилирования ДНК промотора достоверно не различался между группами (рис. 6А). Таким образом, уровень метилирования промотора экзона гена ГР в гиппокампе не изменялся под влиянием материнской метилобогащённой диеты как у ручных, так и у агрессивных крыс.

16 и 17-ый CpG-динуклеотиды исследованного участка являются 5'- и 3'-CpG в консенсусной последовательности фактора транскрипции NGFI-A, соответственно. По мнению Вивера с соавт., деметилирование именно 5'-CpG этого участка при неонатальных воздействиях повышает общее количество мРНК ГР и уровень мРНК ГР с экзоном 17, а также снижает активность ГГНС. При этом З'-CpG остаётся гиперметилирован независимо от раннего опыта (Weaver et al., 2004). Анализ показал низкий уровень метилирования как 16-го, так и 17-го CpG в гиппокампе и у ручных, и у агрессивных крыс (рис. 6Б). Материнская метилобогащённая диета также достоверно не изменила уровень метилирования этого участка промотора экзона 17 (рис. 6Б).

Таким образом, профиль метилирования экзона 17 гена ГР в гиппокампе не изменялся ни под влиянием материнской метилобогащённой диеты, ни при отборе по поведению.

1 ручные контрольные ■ ручные опытные й агрессивные конгро/ьные □ агрессивные опытные

Рис. 6. Анализ уровня метилирования промотора экзона 17 гена ГР у потомков крыс, содержавшихся во время беременности на метилобогащённой диете или стандартном питании (п = 3 животных в каждой группе). А - общий уровень метилирования; Б - уровень метилирования индивидуальных 16 и 17-го СрО-динуклеотидов.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

□ ручные контрольные Вручные опытные ^агрессивные контрольныевагрессивные опытные

5' (site 16)

3' (site 17) CpG-динуклеотиды

Полученные результаты гипометилирования промотора экзона 17 гена ГР у ручных и агрессивных крыс подняли вопрос о том, не является ли метилирование этого участка ДНК характерным только для определённой линии крыс. Вместе с тем, считается, что в популяциях диких серых крыс также существуют различия в поведении и связанных с ним физиологических реакциях. Различный уровень стресс-ответа считается адаптивным для животных, живущих в местах, отличающихся по комфорту и обогащённости ресурсами. Предполагается, что этот уровень связан с материнской средой и устанавливается с помощью тех же механизмов, что и обнаруженные при хэндлинге и различном уровне материнской заботы (Meaney et al., 1996). Исследования, проведённые на диких серых крысах, отловленных в окрестностях Академгородка и в Новосибирской области дали результаты, аналогичные полученным на крысах, селекционируемых по поведению. Промотор экзона Ь гена ГР в гиппокампе диких крыс также оказался гипометилирован (0,54±0,33%; п=5), при этом 5' и 3' CpG-динуклеотиды в консенсусной последовательности фактора транскрипции NGFI-A были вообще неметилированы.

Изучение последствий материнской метилобогащённой диеты на активность ГГНС второго поколения потомков серых крыс, селекционируемых по поведению

Из литературы известно, что резкое изменение гормональных систем регуляции путём введения некоторых веществ в организм крысы во время беременности могут сказываться на потомстве в ряду поколений (Anway et al., 2006; Skinner et al., 2008). Поэтому небезынтересным казалось исследовать и второе поколение (F2) потомков крыс, получавших во время беременности метилобогащённую диету. Матери (Fi) этих животных содержались на стандартном питании.

Исследование уровня кортикостерона в крови показало, что эффекты материнской метилобогащённой диеты сохраняется и во втором поколении потомков. Двухфакторный дисперсионный анализ выявил отличия в динамике ответа ГГНС на рестрикционный стресс между опытными и контрольными ручными крысами из поколения F2 (рис. 7; F]n=7,64, Р<0,05), тогда как у агрессивных животных различий в опыте и контроле не выявлено. Уровень кортикостерона через час после окончания стресса у ручных опытных крыс достоверно выше, чем у их контроля (Р<0,01), однако уже через 2 часа, в отличие от животных из поколения Fi, возвращается к базальным показателям. У агрессивных крыс достоверные различия в этих временных точках не выявлены. Базальный же уровень кортикостерона не отличается между опытом и контролем ни у ручных, ни у агрессивных крыс.

Оценка уровня мРНК ГР в гиппокампе также выявила влияние материнской диеты на второе поколение потомков. Метод ОТ-ПЦР в реальном времени показал, что в отличие от крыс из материнского поколения (Р) количество мРНК ГР в гиппокампе у ручных крыс из поколения F2 ниже, чем у агрессивных животных из того же поколения (рис. 8А). Близкие результаты были получены в исследовании количества мРНК ГР с экзоном 1ю. Анализ полученных данных

25-

20-

=115-

X

о о. 0)

10-

5

Я 5

5-

Агрессивньв

•— контроль о— опыт, Р2

Стресс

Баэальиый уровень

25 -I Ручные

1 2 4

Время после окончания стресса, час

—•— контроль —О— опыт, Р2

1 2 4

Время после окончания стресса, час

Рис. 7. Уровень кортикостерона в крови после 30-минутного рестршсционного стресса (п=10 животных в каждой группе) у потомков из агрессивных (А) и ручных (Б) крыс, содержавшихся во время беременности на метилобогащённой диете или стандартном питании. **Р<0,01 агрессивные опытные по сравнению со своим контролем; ***Р<0,001 ручные опытные по сравнению со своим контролем; ^<0,01 ручные опытные по сравнению с агрессивными контрольными.

Рис. 8. Количество мРНК ГР в гиппокампе агрессивных и ручных серых крыс из поколения F2 (п=4 животных в каждой группе), определённое с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени; описание графика представлено в подписи к рис. 1В. А - отношение общих количеств мРНК ГР в гиппокампе, Б - отношение количеств мРНК ГР с экзоном 1 м в гиппокампе; *Р<0,05 у ручных крыс меньше по сравнению с агрессивными.

также выявил, что уровень мРНК ГР с экзоном 1)0 в гиппокампе ручных крыс из поколения F2 ниже, чем у агрессивных из того же поколения (рис. 8Б).

Таким образом, исходя из полученных данных, можно заключить, что метилобогащённая диета влияет на активность ГГНС у потомков как первого, так и второго поколения. При этом изменение экспрессии гена ГР, по-видимому, происходит за счёт уровня транскрипции под контролем промотора экзона 1 ю-Возможно, это связано с изменением уровня его метилирования. В то же время, наблюдаемая различная чувствительность к повышению концентрации предшественников S-аденозилметионина у ручных и агрессивных крыс, может быть связана с метилированием неисследованных нами участков генома.

С другой стороны, отличия в экспрессии гена ГР у ручных и агрессивных крыс, по-видимому, не обусловлены изменением количества мРНК с экзоном lio. Вероятно, отбор по поведению вообще не вызывает специфических изменений в уровне транскрипции под контролем альтернативных промоторов гена ГР, а приводит к общему снижению количества мРНК ГР независимо от альтернативных экзонов 1, что и даёт достоверные отличия. Такой вариант регуляции гена рецептора был обнаружен при хроническом стрессе у крыс (Freeman et al., 2004). Было установлено значительное снижение количества всех исследованных вариантов мРНК ГР, однако механизм этого снижения не установлен. В то же время, можно предположить, что пренатальные манипуляции, как и пренатальная метилобогащённая диета затрагивают экспрессию гена ГР именно под контролем промотора экзона 1 ,о.

выводы

1. Сравнительный анализ уровня мРНК рецептора глюкокортикоидов (ГР) выявил более высокий уровень экспрессии гена ГР в гиппокампе «ручных» серых крыс - селекционируемых на элиминацию агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку, чем у «агрессивных» животных - селекционируемых на усиление этой реакции. В то же время различий в количестве мРНК ГР в печени и селезёнке между ручными и агрессивными животными не обнаружено, что свидетельствует о том, что мишенями отбора служат ГР в гиппокампе, являющиеся существенным звеном глюкокортикоидной отрицательной обратной связи.

2. Не выявлено достоверных различий экспрессии гена ГР в гиппокампе под контролем промоторов альтернативных экзонов 17 и 1м между серыми крысами, селекционируемыми на ручное и агрессивное поведение.

3. Содержание крыс во время беременности на метилобогащённой диете приводит к более позднему возвращению базальных значений стресс-индуцированного уровня кортикостерона в крови у первого и второго поколения потомков ручных матерей, тогда как у потомков агрессивных крыс эффекта диеты на активность гипотоламо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) не выявлено.

4. Изменение активности ГГНС под влиянием материнской метилобогащённой диеты в значительной степени связано с количеством мРНК ГР, содержащей экзон 110, в гиппокампе. У первого поколения потомков ручных крыс материнская диета снижает уровень мРНК ГР с экзоном 110 и общее количество мРНК ГР почти до уровня агрессивных животных, у которых эти показатели не изменяются под влиянием диеты. Во втором поколении общее количество мРНК ГР и уровень мРНК ГР с экзоном 1ю в гиппокампе у ручных крыс ниже, чем у агрессивных. Полученные факты могут свидетельствовать, что пренатальная метилобогащённая диета ослабляет у ручных животных глюкокортикоидную отрицательную обратную связь.

5. Анализ профиля метилирования промотора экзона 17 гена ГР в гиппокампе не выявил достоверных различий между ручными и агрессивными крысами как в условиях стандартной, так и материнской метилобогащённой диеты и показал гипометшгарование этого участка ДНК.

6. Совокупность полученных в работе данных даёт основание считать, что отбор по поведению в отличие от материнской метилобогащённой диеты изменяет количество всех вариантов мРНК ГР; материнская же метилобогащённая диета, эффект которой наблюдается только у ручных потомков, вероятно, по-разному меняет профиль метилирования ДНК у животных контрастного поведения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Оськина И.Н., Гербек Ю.Э.. Шихевич С.Г., Плюснина И.З., Гулевич Р.Г. Изменения гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем при отборе животных на доместикационное поведение // Информ. вестник ВОГиС. — 2008. — Т. 12. — № 1/2. — С. 39—49. (перечень ВАК)

2. Herbeck Yu.E.. Gulevich R.G., Amelkina O.A., Plyusnina I.Z., Oskina I.N. Conserved methylation of the glucocorticoid receptor gene exon Ь promoter in rats subjected to a maternal methyl-supplemented diet // Int. J. Dev. Neurosci. - 2010. - V. 28. - N 1. - P. 9-12. (перечень ВАК)

3. Гербек Ю.Э.. Оськина И.Н., Гулевич Р.Г., Плюснина И.З. Влияние материнской метилобогащённой диеты на экспрессию гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе у крыс селектируемых по поведению // Цитол. генет. — 2010. — Т. 44. — № 2. — С. 45—52. (перечень ВАК)

4. Оськина И.Н., Гербек Ю.Э.. Ильина О.В., Гулевич Р.Г. Экспрессия гена глюкокортикоидных рецепторов у серых крыс при отборе по поведению // XX съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов — М., 2007. — С. 364.

5. Гербек Ю.Э.. Ильина О.В., Оськина И.Н. Глюкокортикоидные рецепторы мозга и изменение их экспрессии при экспериментальной доместикации серых крыс // Тез. междунар. конф. «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине». — Новосибирск, 2007. — С. 25.

6. Плюснина И.З., Оськина И.Н., Гербек Ю.Э. Взаимодействие генотипа и материнских факторов в детерминации поведения и гормонального ответа на стресс у серых крыс // Тез. докл. VI Сибирского физиологического съезда. — Т. 2. — Барнаул, 2008. — С. 7.

7. Гербек Ю.Э., Оськина И.Н., Гулевич Р.Г., Плюснина И.З. Влияние отбора по поведению и метилобогащенной диеты на экспрессию гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе крыс // Сб. научн. труд. «Фактории експерименталыкл еволюцп opraHÍ3MÍB». — Т. 4. — К., 2008. — С. 246—250.

8. Гербек Ю.Э., Оськина И.Н., Плюснина И.З. Влияние материнской диеты на экспрессию сплайс-вариантов гена рецептора глюкокортикоидов у потомков крыс, селекционируемых на доместикацию // Тез. докл. V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21—28 июня 2009 г. — Ч. 2. — С. 111.

9. Herbeck Y.E.. Plyusnina I.Z., Oskina I.N. Is the methylation of the glucocorticoid receptor exon Ь promoter universal in rats? // The 7th International Congress of Neuroendocrinology, Rouen, France, 11-15 July 2010-P. 122.

10. Гербек Ю.Э.. Оськина И.Н. Эффекты отбора по поведению и пренатальной метилобогащённой диеты на экспрессию гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе серых крыс // XXI съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тез. докл. — М. — Калуга, 2010. —С. 141.

Подписано к печати 05.10.2010 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1 л. Уч. Изд. 0,7

Тираж 110 экз. Заказ 85.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гербек, Юрий Эмильевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Доместикация как модель эволюции.

1.2. Стресс и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система.19^

1.2.1. Стресс как адаптивная реакция.

1.2.2. Рецепторы кортикостероидов головного мозга и регуляция ответа на стресс.

1.3. Изменения ГГНС при отборе на доместикацию и при ранних воздействиях.

1.3.1. Изменение ГГНС при отборе на доместикацию серебристо-чёрных лисиц и серых крыс.

1.3.2. Пластичность развития ГГНС.

1.3.3. Изменения ГГНС под влиянием ранних воздействий и доместикации у разных видов животных.

1.4. Ген рецептора глюкокортикоидов.

1.4.1. Полиморфизм гена рецептора глюкокортикоидов.

1.4.2. Факторы транскрипции, участвующие в регуляции экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов.

1.4.3. Тканеспецифичная транскрипция гена рецептора глюкокортикоидов и её изменение под влиянием внешних факторов.

1.4.4. Метилирование ДНК и регуляция экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов.

1.5. Метил содержащая материнская диета.

1.6. Передача эпигенетических меток в ряду поколений.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.¿

2.1. Экспериментальные животные.

2.2. Экспериментальные воздействия.

2.2.1. Материнская метилобогащённая диета.

2.2.2. Кратковременный рестрикционный стресс.

2.3. Методики исследования.

2.3.1. Определение содержания кортикостерона в крови.

2.3.2. Выделение РНК.

2.3.3. Выделение ДНК.

2.3.4. Удаление геномной ДНК из препаратов РНК и обратная транскрипция

2.3.5. Полуколичественная ОТ-ПЦР.

2.3.6. ОТ-ПЦР в реальном времени.

2.3.7. Бисульфитное секвенирование ДНК.

2.3.8. Определение первичной структуры ДНК.

2.4. Статистическая обработка результатов.67.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Изучение уровня мРНК рецептора глюкокортикоидов у серых крыс, контрастных по поведению.

3.1.1. Исследование количества мРНК рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе.

3.1.2. Исследование количества мРНК рецептора глюкокортикоидов в периферических органах.71'

3.2. Изучение влияния пренатальной метилобогащённой диеты на активность ГГНС у крыс, селекционируемых по поведению.

3.2.1. Исследование влияния пренатальной метилобогащённой диеты на базальный и стрессорный уровень кортикостерона в крови у взрослых крыс

3.2.2. Изучение экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе серых крыс, матери которых содержались во время беременности на метилобогащённой диете.

3.2.2.1. Исследование общего количества мРНК рецептора глюкокортикоидов.

3.2.2.2. Исследование количества мРНК рецептора глюкокортикоидов с различными альтернативными экзонами.

3.2.3. Исследование метилирования промотора экзона 17 гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе.

3.2.4. Изучение последствий материнской метилобогащённой диеты на активность ГГНС у второго поколения потомков серых крыс, селекционируемых по поведению.

3.3. Исследование метилирования промотора экзона гена рецептора глюкокортикоидов в гиппокампе диких крыс.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эффект отбора по поведению серых крыс на экспрессию гена рецептора глюкокортикоидов"

Актуальность проблемы. Способность адаптироваться к изменяющимся условиям среды — одно из важнейших свойств живых организмов, неотъемлемой частью которого является стресс. Он позволяет сохранять гомеостаз в экстремальных ситуациях, однако при продолжающемся действии стрессирующего агента, когда возможностей для адаптивных преобразований уже не достаточно, приводит к истощению организма, необратимым преобразованиям и, как следствие, смерти (Селье, 1979). Поэтому при резком изменении окружающей среды и продолжительном сохранении новых условий пониженная стресс-реактивность может являться одним из основных критериевг приспособленности (Беляев, Бородин, 1982).

С этой точки зрения, представляет особый интерес многолетний эксперимент по доместикации животных (серебристо-чёрной лисицы, американской норки, серой крысы), который проводится в Институте цитологии и генетики СО РАН. Этот эксперимент, рассматриваемый как модель эволюции, позволяет проследить процессы, вероятно, происходившие при исторической доместикации (Беляев, 1962). Следует отметить, что решающим фактором одомашнивания, по-видимому, являлся отбор по поведению по отношению к человеку, который, по мнению Д. К. Беляева, в первую очередь, включает в себя отбор на стресс-реактивность (Науменко, Беляев, 1981).

Сотрудниками Института показано, что отбор на доместикацию привёл к снижению функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-. надпочечниковой системы (ГГНС) (Беляев, 1981; Науменко, Беляев, 1981; Дыгало и др., 1985; Naumenko et al., 1987; Оськина, Плюснина, 2000), являющейся ключевой в развитии стрессорного ответа и участвующей в регуляции многих систем организма, а также некоторых форм поведения, таких как тревожность, реакция страха и агрессия (Körte, 2001; Körte et al., 2005), Конечным звеном ГТНС являются стероидные гормоны глюкокортикоиды. У серых крыс, селекционируемых на элиминацию и усиление агрессивного поведения по отношению к человеку («ручные» и «агрессивные», соответственно), были выявлены различия во временной динамике стресс-' реакции, а также в базальном и стресс-индуцированном уровнях глюкокортикоидов в крови. Установлено, что у ручных крыс уровень? глюкокортикоидов в плазме крови ниже, чем у агрессивных (Дыгало и др. 1985; Naumenko et al., 1989; Оськина, Плюснина, 2000).

Известно, что в регуляции временной динамики стрессорного ответа ведущее место занимают рецепторы глюкокортикоидов (ГР) головного мозга и, t в частности, гиппокампа. Они участвуют в глюкокортикоидной отрицательной обратной связи, купируя стресс-реакцию (Pfaff et al., 2004). Специфичность ответа организма на гормональные сигналы ГГНС во многом зависит от количества ГР в тканях-мишенях. Установлено, что у крыс, селекционируемых на контрастное поведение по отношению к человеку, количество ГР в гиппокампе различно (Оськина, Плюснина, 2000).

ГР имеют сложную регуляцию, и их количество зависит от многих, внешних и внутренних факторов, однако механизмы этих вариаций мало изучены и лишь немногие из них сопряжены с изменением активности ГГНС (DeRijk, de Kloet, 2005). Наиболее исследованным в настоящее время является механизм, связанный с альтернативным сплайсингом мРНК ГР (McCormick et al., 2000), однако он был описан только для неонатальных воздействий на крыс из аутбредной линии Long-Evans hooded (Meaney, Shyf, 2005). Вместе с тем, показано, что ранние воздействия вызывают не только повышение количества" ГР в гиппокампе, но и снижение активности ГГНС (Meaney et al., 1996). Это наводит на мысль о схожести путей изменения стресс-реактивности при отбора на доместккационное поведение и вследствие неонатальных влияний.

Известно, что 5'-нетранслируемая область гена ГР включает альтернативные экзоны 1 (McCormick et al., 2000). Уровень транскрипции гена рецептора под контролем промотора альтернативного экзона I7 может повышаться в тканях гиппокампа под влиянием раннего опыта (Weaver et а!.,

2004а). В то же время, хорошо известно, что одним из основных путей регуляции экспрессии генов является изменение профиля метилирования ДНК-(Jablonka, Lamb, 1995). Канадскими исследователями (Weaver et al., 2004а) установлено, что неонатальные влияния могут вызывать деметилирование промотора экзона 17 в гиппокампе. Если же вводить в мозг крысам, подвергнутым таким воздействиям, метионин, то уровень метилирования ДНК повышается, что, по-видимому, вызывает снижение экспрессии гена ГР и усиление активность ГГНС (Weaver et al., 2004а).

Полагают, что подобный механизм задействован и в изменениях" активности ГГНС при пренатальных воздействиях (Seckl, Holmes, 2007). С другой стороны, установлено, что содержание крыс во время беременности на малобелковых диетах влияет на уровень мРНК ГР с экзоном 1ю в печени их потомков (Lillycrop et al., 2007). Транскрипция под контролем промотора этого экзона составляет более 60% от общей транскрипции гена рецептора-(McCormick et al., 2000) и также регулируется метилированием ДНК (Lillycrop et al., 2007). Однако, в пренатальный период развития, в отличие от раннего постнатального, не было исследовано влияние метионина на экспрессию гена ГР. В то же время известно, что пренатальное введение метионина в организм с помощью материнской метилобогащённой диеты вызывает различные изменения в формировании центральной нервной системы (ЦНС) и в профиле метилирования некоторых генов (Cooney et al., 2002; Van den Veyver, 2002).

Эксперимент по содержанию крыс во время беременности на* метилобогащённой диете, ■ проведённый на крысах, селекционируемых на контрастное поведение по отношению к человеку, позволяет оценить влияние метионина в эмбриональный период развития на уровень метилирования промотора гена ГР и экспрессию этого гена во взрослом состоянии. Результаты эксперимента также дают возможность проверить предположение об общности механизмов изменения активности ГГНС при отборе по поведению и перинатальных воздействиях.

Целью данной работы явилось изучение экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов у серых крыс, селекционируемых на элиминацию («ручные») или усиление («агрессивные») агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку, и исследование механизмов возможных различий.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Оценить общую экспрессию гена ГР в гиппокампе и периферических органах у ручных и агрессивных крыс.

2. Исследовать активность периферических звеньев гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и общую экспрессию гена ГР у первого и второго поколений потомков ручных и агрессивных серых крыс, содержавшихся на метилобогащённой диете в период беременности.

3. Проанализировать профиль метилирования промотора экзона 17 гена ГР и количество мРНК ГР с альтернативным экзоном 17 в гиппокампе' у потомков крыс, содержащихся на метилобогащенной диете или стандартном-питании во время беременности.

4. Определить уровень мРНК ГР с альтернативным экзоном 1ю в гиппокампе у крыс, матери которых содержались на стандартном питании во время беременности, а также у первого и второго поколений потомков животных, получавших в период беременности метилсодержащие добавки.

Научная новизна работы. В данной работе впервые изучено влияние отбора по поведению на экспрессию гена ГР у крыс. Отбор на ручное поведение повышает количество мРНК ГР в гиппокампе, однако не затрагивает" мРНК ГР в печени и селезёнке. Впервые исследовано влияние материнской метилобогащённой диеты на активность ГГНС и экспрессию гена ГР у потомков. Материнская диета у животных из ручной популяции приводит к более позднему возвращению уровня кортикостерона в крови к базальным показателям после рестрикционного стресса и к снижению общего количества мРНК ГР и уровня мРНК ГР с экзоном 110 в гиппокампе, что свидетельствует об ослаблении отрицательной обратной связи ГГНС. В то же время, достоверных влияний пренатальной диеты на динамику стресс-ответа и экспрессию гена ГР у животных из популяции, селекционируемой на усиление агрессивного поведения по отношению к человеку, выявлено не было. Обнаружено отличное от описанного ранее метилирование промотора экзона 17 гена ГР крысы в гиппокампе. Выявлено гипометилирование участка ДНК, считавшегося ранее гиперметилированым у крыс.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о механизмах изменения активности ГГНС при эволюционных преобразованиях-животных вследствие отбора на доместикационное поведение. Кроме того, освещается вопрос о влиянии пренатальной метилобогащённой диеты на экспрессию гена ГР и о зависимости эффектов диеты от генотипа животных. Полученные данные могут иметь значение в исследованиях патологий раннего развития. Результаты исследования используются в качестве материала для курса лекций И. 3. Плюсниной «Нейробологические и нейрофизиологические закономерности поведения», читаемого на 4 курсе ФЕН НГУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Отбор серых крыс на доместикационное поведение повышает уровень экспрессии гена ГР в гиппокампе.

2. Выявлены различия в эффекте материнской метилобогащённой диеты на экспрессию гена ГР в гиппокампе у потомков крыс, селекционируемых на элиминацию и усиление агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку, свидетельствующие о роли метилирования ДНК в эффектах отбора по поведению.

3. Установлен значительный вклад мРНК с экзоном 1ю в регуляцию экспрессии гена ГР в гиппокампе и активности ГГНС под влиянием пренатальной метилобогащённой диеты.

4. Выдвинуто предположение, что метилирование промотора экзона Ь, на котором основан ранее описанный механизм регуляции экспрессии гена ГР и-активности ГГНС, является эктопическим.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на XX съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), Международной конференции «Current Evolution Thinking in Biology, Medicine and Sociolögy International Conference Dedicated to 90 Anniversary of Prof. Dmitry K. Belyaev» (Новосибирск, 2007), IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), V съезде Вавиловского общества.« генетиков и селекционеров (Москва, 2009), международном конгрессе «The 7th International Congress of Neuroendocrinology» (Руан, Франция, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова. Также полученные результаты были представлены и обсуждены на отчётной сессии по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Новосибирск, 2009) и отчётной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Гербек, Юрий Эмильевич

101 выводы

1. Сравнительный анализ уровня мРНК рецептора глюкокортикоидов (ГР) выявил более высокий уровень экспрессии гена ГР в гиппокампе «ручных» серых крыс - селекционируемых на элиминацию агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку, чем у «агрессивных» животных - селекционируемых на усиление этой реакции. В то же время различий в количестве мРНК ГР в печени и селезёнке между ручными и« агрессивными животными не обнаружено, что свидетельствует о том, что мишенями отбора служат ГР в гиппокампе, являющиеся существенным звеном глюкокортикоидной отрицательной обратной связи.

2. Не выявлено достоверных различий экспрессии гена ГР в гиппокампе под контролем промоторов альтернативных экзонов 17 и 1ю между серыми крысами, селекционируемыми на ручное и агрессивное поведение.

3. Содержание крыс во время беременности на метилобогащённой диете

•л приводит к более позднему возвращению базальных значений стресс-индуцированного уровня кортикостерона в крови у первого и второго поколения потомков ручных матерей, тогда как у потомков агрессивных крыс эффекта диеты на активность гипотоламо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) не выявлено.

4. Изменение активности ГТНС под влиянием материнской метилобогащённой диеты в значительной степени связано с количеством мРНК ГР, содержащей экзон 1ю, в гиппокампе. У первого поколения потомков ручных крыс материнская диета снижает уровень мРНК ГР с экзоном 1ю и общее количество мРНК ГР почти до уровня агрессивных животных, у которых эти показатели не изменяются под влиянием диеты. Во втором поколении общее количество мРНК ГР и уровень мРНК ГР с экзоном 1 ю в гиппокампе у ручных крыс ниже, чем у агрессивных. Полученные факты могут свидетельствовать, что пренатальная метилобогащённая диета ослабляет у ручных животных глюкокортикоид-ную отрицательную обратную связь.

Анализ профиля метилирования промотора экзона 17 гена ГР в гиппокампе не выявил достоверных различий между ручными и агрессивными крысами как в условиях стандартной, так и материнской метилобогащённой диеты и показал гипометилирование этого участка ДНК.

Совокупность полученных в работе данных даёт основание считать, что отбор по поведению в отличие от материнской метилобогащённой диеты изменяет количество всех вариантов мРНК ГР; материнская же метилобогащённая диета, эффект которой наблюдается только у ручных потомков, вероятно, по-разному меняет профиль метилирования ДНК у животных контрастного поведения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гербек, Юрий Эмильевич, Новосибирск

1. Бажан Н.М., Красс П.М., Колпаков М.Г., Трут Л.Н. Изменение активности коры надпочечников у серебристо-черных лисиц в процессе доместикации // Докл. АН СССР. — 1974. — Т. 216. — № 4. — С. 922—924. 'I

2. Беляев Д.К. Биологические аспекты доместикации животных // Генетика и селекция новых пород сельскохозяйственных животных: Мат. Всесоюз. совещ. 24 — 26 октября 1968 г. — Алма-Ата, 1970. — С. 30 — 44.

3. Беляев Д.К. Генетика и проблемы селекции животных // Генетика. — 1966. — №Ю. — С. 36—48.

4. Беляев Д.К. Генетические аспекты доместикации и некоторые проблемы теории отбора // Второй съезд ВОГиС им. Н. И. Вавилова: Плен, засед. (тез. докл.) — Симп. (тез. докл.). 31 января — 5 февраля 1972 г. — М., 1972. — С. 8—11.

5. Беляев Д.К. Дестабилизирующий отбор как фактор доместикации // Генетики и благосостояние человечества. — М., 1981. — С. 53—66.

6. Беляев Д.К. О некоторых проблемах коррелятивной изменчивости и их значении для теории эволюции и селекции животных // Известия СО АН СССР. — 1962. —№10. —С. 111—124.

7. Беляев Д.К., Бородин П.М. Влияние стресса на наследственную изменчивость и его роль в эволюции // Эволюционная генетика. — Л., 1982. — С. 35—59.

8. Беляев Д.К., Исакова Г.К., Трут JI.H. Раннее эмбриональное развитие серебристо-чёрных лисиц в условиях доместикации // Ж. Общ. Биол. — 1986а!4. —С. 450.

9. Беляев Д.К., Трут JI.H. От естественного отбора к искусственному: чудеса селекции // Наука в СССР. — 1982. — С. 24—29, 60—64.

10. Бородин П.М., Беляев Д.К. Влияние стресса на частоту кроссинговера на 2-ой хромосоме домовой мыши // Докл. АН СССР. — 1980. — Т. 258. — № 12.1. С. 727—729.

11. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика. — 2006.

12. Т. 42. —№9. —С. 1186—1199.

13. Даев Е.В., Дукельская A.B. Мутагенное действие стрессоров у домовой мыши // Съезд генетиков и селекционеров, посвящённый 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. V съезд Вавиловского общества генетиков иселекционеров. — Ч. 2. — М., 2009. — С. 328.

14. Дарвин Ч. Изменения животных и растений в домашнем состоянии: пер. с англ. — М.-Л.: ОГИЗ—Сельхозгиз, 1941. — 619 с. (Русский перевод Darwin C.R. The variation of animals and plants under domestication // London: John Murray. — 2 ed. — 1875.)

15. Дмитриева Н.И., Гоццо Ст. Структурные особенности головного мозга крыс, селектированных по порогу возбудимости // Архив анатомии, гистологии t и эмбриологии. — 1985. — Т. 88. — № 2. — С. 5—10.

16. Ефимов С.В., Вайдо А.И., Ширяева Н.В., Шаляпина, В.Г. Глюкокортикоидные рецепторы в гиппокампе у крыс с разной возбудимостью нервной системы // Физиол. ж. им. И. М. Сеченова. — 1994. — Т. 80. — № 11.1. С. 51—56.

17. Иваницкий Г.Р. XXI век: что такое жизнь с точки зрения физики // УФН.2010. — Т. 180. — № 4. — С. 337—369.

18. Колчинский Э.И. Неокатастрофизм и селекционизм: Вечная дилемма или возможность синтеза? (Историческо-критические очерки). — СПб.: Наука, 2002 — 554 с.

19. Кушев В.А. Механизмы генетической рекомбинации. — Л.: Наука, Ленингр. отд-ние, 1971. — 247 с. (цит. по: Беляев, Бородин, 1982)

20. Ланкин B.C. Доместикационное поведение овец // Генетика. — 1997. — Т. 33 — № 8. — С. 1119—1125.

21. Логинова В.В., Керкис Ю.Я. Влияние адреналэктомии на радиочувствительность хромосом в клетках эпителия роговицы и костного мозга крыс линии Вистар // Генетика. — 1967. — Т. 7. — № 1. — С. 48—50. (цит. по: Беляев, Бородин, 1982)

22. Логинова В.В., Керкис Ю.Я., Попова И.Д. Анеуплоидия в клетках костного мозга крыс после инъекции гидрокортизона // Цитология. — 1970. — Т. 12. — № 12. — С. 84—91. (цит. по: Беляев, Бородин, 1982)

23. Луценко Н.Д., Трут Л.Н., Иванова Л.Н., Особенности строения коры надпочечников у доместицированных серебристо-черных лисиц Vulpes fulvus в постнатальном онтогенезе // Ж. Эволюц. Биох. и физиол. — 1980. — Т. 16. — №5.

24. Майр Э. Популяция, виды и эволюция — М.: Мир, 1974. — 464 с.

25. Маркель A.JI. Стресс и эволюция // Информ. вестник ВОГиС. — 2008. — Т. 12. —№ 1/2. —С. 206—215.

26. Науменко Е.В., Беляев Д.К. Нейроэндокринные механизмы при доместикации животных // Вопросы общей генетики. — М., 1981. — С. 230—* 240.

27. Науменко Е.В., Дыгало H.H. Реактивность гипаталамо-гипофизарно-надпочечникового комплекса взрослых крыс после введения гидрокортизона их матерям во время беременности // Онтогенез. — 1979. — Т. 10. — С. 476—482.

28. Науменко Е.В., Попова Н.К., Иванова JI.H. Нейроэндокринные и нейрохимические механизмы доместикации животных // Генетика. — 1987. — Т.23. —№6. —С. 1011—1025.

29. Оськина И.Н., Осадчук JT.B. Изменение динамики кортикостероидного ответа на АКТГ у серебристо-черных лисиц при селекции по поведению // Известия СО АН СССР. Серия биологических наук. Выпуск 2. — Новосибирск, 1985. —С. 118—122.

30. Оськина И.Н., Плюснина И.З. Гипофизарно-надпочечниковая система при отборе животных на доместикационное поведение // Сб. науч. тр. / ИЦиГ СО РАН — Новосибирск, 2000. — С. 327—333.

31. Оськина И.Н., Плюснина И.З., Сысолетина А.Ю. Влияние отбора пе поведению на гипофизарно-надпочечниковую функцию серых крыс Rattusnorvegicus в постнатальном онтогенезе // Ж. Эволюц. Биох. и физиол. — 2000.

32. Т. 36. — № 2. — С. 122—126.

33. Плюснина И.З. Материнские эффекты на продолжительность чувствительного периода первичной социализации у серебристо-черных лисиц // Эволюционно-генетические и генетико-физиологические аспекты" доместикации пушных зверей. — Новосибирск, 1991. — С. 23—35.

34. Плюснина И.З., Оськина И.Н. Онтогенез поведения и отбор на доместикацию диких серых крыс // Сб. науч. тр. / ИЦиГ СО РАН — Новосибирск, 2000. — С. 341—349.

35. Прасолова Л.А., Оськина И.Н., Плюснина И.З., Трут Л.Н. Влияние метилсодержащей диеты матерей на эффекты гена agouti у потомков крыс разного типа поведения // Генетика. — 2009. — Т. 45. — № 5. — С. 670—676.

36. Прасолова Л.А., Трут Л.Н. Эффект гена "Star" на скорость миграции, меланобластов у эмбрионов серебристо-чёрных лисиц (Vulpes vulpes) // ДАН.1993. — Т. 329. — С. 787—789.

37. Прасолова Л.Н., Оськина И.Н. Эффект отбора по поведению диких серых крыс (Rattus Norvegicus) на морфологию коры надпочечников // Генетика. — 2001. — Т. 37. — № 2. — С. 1—5.

38. Ребриков Д.В., Саматов Г. ПНР в реальном времени. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. — 215 с.

39. Рэфф Р., Коффмен Т. Эмбрионы, гены и эволюция: пер. с англ. — М.Мир, 1986.—403 с.

40. Сапунов В.Б. О роли эндокринной системы в процессе возникновения мутаций // Журн. общей биол. — 1980. — Т. 41. — № 2. — С. 192—199. (цит. по: Беляев, Бородин, 1982)

41. Селье Г. Стресс без дистресса. — М.: Прогресс, 1979. — 124 с.

42. Серова И.А., Керкис Ю.Я. Цитогенетический эффект некоторых стероидных гормонов и изменение активности лизосомных ферментов // Генетика. — 1974. — Т. 10. — № 2. — С. 142—149.

43. Слозина Н.М., Никифоров A.M., Неронова Е.Г., Зыбина H.H. Генетика человека и экстремальные воздействия // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития: Тез. докл. IV съезда ВОГИС. — Т. 2. —М., 2004. —С. 473.

44. Тинников A.A., Бажан Н.М. Определение глюкокортикоидов в плазме крови и инкубатах надпочечников методом конкурентого связывания гормонов белками без предварительной экстракции // Лаб. дело. — 1984. — № 12. — С. 709—713.

45. Трут JI.H. Очерки о генетике поведения. — Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1978. —739 с.

46. Трут JI.H. Проблема формообразования и целостность организма в контексте дестабилизирующего отбора // Генетика. — 1987. — Т. 23. — №6. — С. 974.

47. Трут JI.H., Науменко Е.В., Беляев Д.К. Изменение гипофизарно-надпочечниковой фунции серебристо-черных лисиц при селекции цо поведению // Гентика. —1972. — Т. 8. — № 5. — С. 35—43.

48. Трут Л.Н., Плюснина И.З., Оськина И.Н. Эксперимент по доместикации лисиц и дискуссионные вопросы эволюции собак // Генетика. — 2004. — Т. 40.6. — С. 794—807.

49. Трут Л.Н. Проблема дестабилизирующего отбора в развитии. Современные концепции эволюционной генетики // Сб. науч. тр. / ИЦиГ СО РАН — Новосибирск, 2000. — С. 7—21.

50. Хайнд Р. Поведение животных — М.: Мир, 1975. — 856 с.

51. Шишкин М.А. Фенотипические реакции и эволюционный процесс. (Ещё раз об эволюционной роли модификации) // Экология и эволюционная теория.1. Л., 1984. —С. 196—216.

52. Шмальгаузен И.И. Факторы эволюции — М.: Наука, 1968. — 452 с.

53. Ancel Meyers L., Bull J J. Fighting change with change: adaptive variation in an uncertain world // Trends in Ecology and Evolution. 2002. - V. 17. - 551-557. (цит. no Badyaev, 2005)

54. Anway M.D., Leathers C., Skinner M.K. Endocrine disruptor vinclozolin induced epigenetic transgenerational adult-onset disease // Endocrinology. 2006. -V. 147.-N 12.-P. 5515-5523.

55. Badyaev A.V. Stress-induced variation in evolution: from behavioural plasticity to genetic assimilation // Proc. Biol. Sci. 2005. - V. 272. - N 1566. --?. 877-186.

56. Barbazanges A., Piazza P.V., LeMoal M., Maccari S. Maternal glucocorticoid secretion mediates long-term effects of prenatal stress // J Neurosci. 1996. - V. 16. -P. 3943-3949.

57. Bear M.F., Connors M.A. Neuroscience: Exploring the Brain, Baltimore: Lippincott Williams and Wilkins, 2001. - 875 c. (u,ht. no: Saetre et al., 2004)

58. Belyaev D.K. Destabilizing selection as a factor in domestication // J. Hered. -1979.-N5.-P. 301-308.

59. Belyaev D.K. Domestication of animals // Sci. J. 1969. - N 5. - P. 47-52.

60. Belyaev D.K., Khvostova V.V. Domestication, Plant and Animal // The New Encyclopaedia Britannica. 15th ed. - Chicago et al.: Encyclopaedia Britannica, Inc. et al., 1974.-V. 5.-P. 936-942.

61. Belyaev D.K., Plusnina I.Z., Trut L.N. Domestication in the silver fox (VulpesT fulvus Desm.): Changes in physiological boundaries of the sensitive period of primary socialization // Appl. Anim. Behav. Sci. 1985. - V. 13. - P. 359-370.

62. Bhatnagar S., Shanks N., Meaney M.J. Hypothalamic-pituitary-adrenal function in handled and nonhandled rats in response to chronic stress //, J. Neuroendocrinology. 1995. - N. 7. - P. 107-119. (ijht no: Meaney et al., 1996)

63. Boandle K.B., Wohlt J.E., Carsia R.V. Effect of handling, administration of local anesthetic and electrical de-horning on plasma Cortisol in Holstein calves // J. Dairy Sci. 1989. - V. 72. - P. 2193-2197. (uht. no: Grandin, Deesing, 1998)

64. Breslin M.B., Geng C.D., Vedeckis W.V. Multiple promoters exist in the human GR gene, one of which is activated by glucocorticoids // Mol. Endocrinol. -2001.-V. 15. N 8. - P. 1381-1395.

65. Breslin M.B., Vedeckis W.V. The human glucocorticoid receptor promoter upstream sequences contain binding sites for the ubiquitous transcription factor, Yin„ Yang 1 // J Steroid Biochem Mol Biol. 1998. - V. 67. - N 5/6. - P. 369-381.

66. Brunton P.J., Russell J.A. Prenatal social stress in the rat programmes neuroendocrine and behavioural responses to stress in the adult offspring: sex specific effects // J. Neuroendocrinol. 2010. - V. 22. - N 4. - P. 258-271.

67. Cervoni N., Szyf M. Demethylase activity is directed by histone acetylation // J Biol Chem. 2001. - V. 276. - N 44. - P. 40778-40787.

68. Chang H.S., Anway M.D., Rekow S.S., Skinner M.K. Transgenerational epigenetic imprinting of the male germline by endocrine disruptor exposure during< gonadal sex determination // Endocrinology. 2006. - V. 147. - N 12. - P. 5524-5541.

69. Chen F.H., Watson C.S., Gametchu B. Multiple glucocorticoid receptor transcripts in membrane glucocorticoid receptor-enriched S-49 mouse lymphoma cells // J. Cell. Biochem. 1999. - V. 74. - P. 418-429.

70. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. -1987. -V.162.-P. 156-159.

71. Clark S .J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines // Nucleic Acids Res. 1994. - V. 22. - N 15. - P. 2990-2997. ,

72. Cooney C.A., Dave A.A., Wolff G.L. Maternal methyl supplements in mice affect epigenetic variation and DNA methylation of offspring // J Nutr. 2002. V. 132. - N 8 (Suppl). - P. 2393S-2400S.

73. Cropley J.E., Suter C.M., Beckman K.B., Martin D.I. CpG methylation of asilent controlling element in the murine Avy allele is incomplete and unresponsive tomethyl donor supplementation // PLoS One. 2010. - P. 5. - N 2. - P. e9055.

74. Cropley J.E., Suter C.M., Beckman K.B., Martin D.I. Germ-line epigenetic * modification of the murine Avy allele by nutritional supplementation // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. - P. 103.-N46.-P. 17308-17312.

75. Csaba G. Interactions between the genetics programme and environmental influences in the perinatal critical period // Zoological Science of Japan. 1991. - N 8.-P. 813-825.

76. Cuzin F., Grandjean V., Rassoulzadegan M. Inherited variation at the epigenetic level: paramutation from the plant to the mouse // Curr Opin Genet Dev. -2008. V. 18.-N 2. - P. 193-196.

77. De Boer S., van der Gugten J. Daily variations in plasma noradrenaline, adrenalin and corticosteron in the rat // Physiol. Behav. 1987. - V. 40. - P. 323-328. (ijht no: OctKHHa, rDiiocHHHa, 2000)

78. De Boer S.F, van der Vegt B.J., Koolhaas J.M. Individual variation in aggression of feral rodent standard for the genetics of aggression and violence? // Behav. Gen. 2003. - V. 33. - N 5. - P. 485-501.

79. De Kloet E.R. Brain corticosteroid receptor balance and homeostatic control //" Front Neuroendocrinol. 1991. - V. 12. - № 2. - P. 95-64. (uht. no: OcBKHHa, IIjiiocHHHa, 2000)

80. De Kloet E.R. Brain corticosteroid receptor balance and homeostatic control // Front. Neuroendocrinol. V. 12. - P. 95-164. (ijht no: Meaney et al., 1996)

81. De Kloet E.R., Korte S.M., Rots N.Y., Kruk M.R. Stress Hormones, Genotype, and Brain Organisation // Annals New York Academy of Sciens. 1996b. -V. 794.-P.179-191.

82. De Kloet E.R., Oitzl M.S., Jorls M. Functional implications of brain corticosteroid receptor diversity // Cell. Mol. Neurobiol. 1993. - V. 13. - P. 433-455. (ijht. no: OctKHHa, rbnocmiHa, 2000)

83. De Kloet E.R., Rots N.Y., Cools A.R. Brain-corticosteroid hormone dialogue: slow and persistent // Cell. Mol. Neurobiol. 1996a. - V. 16. - № 3. - P. 345-356.

84. De Kloet E.R., Vreugdenhil E., Oitzl M.S., Joels M. Brain corticosteroid receptor balance in health and disease // Endocr. Rev. 2005. - V. 19. - N 3. - 269301.

85. Denenberg V.N., Karas G.G. Interactive effects of age and duration of infantile experience on adult learning // Psychol. Rep. 1960. - V. 7. - P. 313-319.

86. DeRijk R., de Kloet E.R. Corticosteroid receptor genetic polymorphisms and stress responsivity // Endocrine. 2005. - V. 28. - N 3. - 263-270.

87. Diorio D., Viau V., Meaney MJ. The role of the medial prefrontal cortex (cingulate gyrus) in the regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress // J. Neurosci. 1993. - V. 13. - N 9. - 3839-3847.

88. Encio I.J., Detera-Wadleigh S.D. The genomic structure of the human' glucocorticoid receptor // J. Biol. Chem. 1991 - V. 266. - N 11. - P. 7182-7188.

89. Feldman S., Weidenfeld J. Neural mechanisms involved in the corticosteroid feedback effects on the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis // Prog. Neurobiol. 1995.-P. 45.-N2.-P. 129-141.

90. Flough H.H. The effect of temperature on crossing-over in Drosophila II J; Exp. Zool. 1917. - V. 24. - P. 147-209. (цит. по: Беляев, Бородин, 1982)

91. Francis D., Diorio J., Liu D., Meaney M.J. Nongenomic transmission across generations of maternal behavior and stress responses in the rat // Science. 1999. -V. 286.- 1155-1158.

92. Freeman A.I., Munn H.L., Lyons V., Dammermann A., Seckl J.R., Chapman K.E. Glucocorticoid down-regulation of rat glucocorticoid receptor does not involve differential promoter regulation // J. Endocrinol. 2004. - V. 183. - N 2. - 365-374.

93. Garner S.C., Mar M.H., Zeisel S.H. Choline distribution and metabolism in< pregnant rats and fetuses are influenced by the choline content of the maternal diet // J. Nutr. 1995. - V. 125. - P. 2851-2858. (цит. no: Van den Veyver, 2002)

94. Gehring M., Reik W., Henikoff S. DNA demethylation by DNA repair // Trends Genet. 2009 - V. 25. - N 2. - P. 82-90.

95. Grandin Т., Deesing M.J. Genetics and Behavior during Handling, Restraint and Herding // Genetics and the behavior of domestic animals / Ed. T. Grandin. San Diego: Academic Press, 1998. - P. 113-144.

96. Gray J.A., MeNaughton N. Comparison between the behavioral effects, of septal and hippocampi lesions: A review // Neurosci. Biobehav. 1983. -V. 7. - P. 119-188 (цит. по: Оськина, Плюснина, 2000)

97. Gross K.L., Lu N.Z., Cidlowski J.A. Molecular mechanisms regulating glucocorticoid sensitivity and resistance // Mol Cell Endocrinol. 2009. - V. 300. - N 1/2.-P. 7-16.

98. Hale E.B. Domestication and the Evolution of Behavior // The Behavior of Domestic Animal / Ed. E.S.E. Hafez. London: Bailliere, Tindall and Cassell LTD, 1969.-P. 22-42.

99. Hastings B.E., Abbot D.E., George L.M., Stradler S.G. Stress factors influencing plasma Cortisol levels and adrenal weights in Chinese Water deer // Res. < Vet. Sci. 1992. - V. 53. - P. 375-380. (mrr. no: Grandin, Deesing, 1998)

100. Henry C., Kabbaj M., Simon H., Le Moal M., Maccari S. Prenatal stress increases the hypothalamo-pituitary-adrenal axis response in young and adult rats // J. Neuroendocrinol. 1994. - V. 6. - N 3. - P. 341-345.

101. Herman J.P., Spenser R. Regulation of hippocampal glucocorticoid recepto:-gene transcription and protein expression in vivo // The J. of Neurosci. 1998. - V. 18.-N18.- P. 7462-7473.

102. Herre W., Rohrs M. Haustier zoologischen gesehen. Jena: VEB Gustav Fisher-Verlag, 1973. - 240 p. (mrr. no: Kojihhhckhh, 2002)

103. Hollenberg S.M., Weinberger C., Ong E.S., Cerelli G., Oro A., Lebo R., Thompson E.B., Rosenfeld M.G., Evans R.M. Primary structure and expression of a functional human glucocorticoid receptor cDNA // Nature. -1985. V. 318. - P. 635641.

104. Holliday R. The possibility of epigenetic transmission of defects induced by teratogens // Mutat Res. 1998. - V. 422. - N 2. - P. 203-205.

105. Holliday R., Pugh J.E. DNA modification mechanisms and gene activity during development // Science. 1975. - V. 187. - N 4173. - P. 226-232

106. Horikoshi T., Sakakibara M. Quantification of relative mRNA expression in' the rat brain using simple RT-PCR and ethidium bromide staining // J. Neurosci. Methods. 2000. - V.99. - P. 45-51.

107. Hughes C.W. Early experience in domestication // J. Comp. Physiol. Psychol. 1975.-V. 88.-N l.-P. 407-417.

108. Hydbring-Sandberg E., von Walter L.W., Hoglund K., Svartberg K., Swenson L., Forkman, B. Phisiological reactions to fear provocation in dogs // Journal of Endocrinology. 2004. - V. 180. - P. 439-448.

109. Iversen S., Iversen L., Saper C.B. The autonomic nervous system and the hypothalamus // Principles of Neural Sciences / Ed. E.R. Kandel, J.H. Schwartz, T.M. Jessell. N.Y., 2000. - P. 960-981.

110. Jablonka E., Lamb M.J. Epigenetic inheritance and evolution: The Lamarckian dimension. N.Y., 1995. - 346 p.

111. Jablonka E., Lamb M.J. Evolution in four dimensions: Genetic, epigenetic,, behavioral, and Symbolic Variantion in the history of life. Cambridge, London, 2005. - 462 p.

112. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals // Nat Genet. 2003. - V. 33. -P. 245-254.

113. Joels M., Karten Y., Hesen W., de Kloet E.R. Corticosteroid effects on electrical properties of brain cells: temporal aspects and role of antiglucocorticoids //* Psychoneuroendocrinology. 1997. - V. 22. - P. 81-86.

114. Kangaspeska S., Stride B., Metivier R., Polycarpou-Schwarz M., Ibberson D., Carmouche R.P., Benes V., Gannon F., Reid G. Transient cyclical methylation of promoter DNA // Nature. 2008. - V. 452. - N 7183. - P. 112-115.

115. Kim J., Kollhoff A., Bergmann A., Stubbs L. Methylation-sensitive binding of transcription factor YY1 to an insulator sequence within the paternally expressed, imprinted gene, Peg3 // Hum Mol Genet. 2003. - V. 12. - N 3. - P. 233-245.

116. Kitraki E., Kittas C., Stylianopoulou F. Glucocorticoid receptor gene expression during rat embryogenesis. An in situ hybridization study // Differentiation. 1997.-V. 62.-Nl.-P. 21-31.

117. Koban M., Swinson K.L. Chronic REM-sleep deprivation of rats elevates metabolic rate and increases uncoupling protein-1 gene expression in brown adipose tissue // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005. - V. 289. - N 1. - P.68-74.

118. Korte S.M. Corticosteroids in relation to fear, anxiety and psychopatalogy// Neuruscience and Biobehavioral Rewiews. 2001. - V. 25. - P. 117-142.

119. Korte S.M., Koolhaas, J.M., Wingfield, J.C., McEwen, B.S. The Darwinian concept of stress: benefits of allostasis and costs of allostatic load and the trade-offs in health and disease // Neurosci. Biobehav. Rev. 2005. - V. 29. - P. 3-38.

120. Kruk M.R., Westphal K.G., Van Erp A.M., van Asperen J., Cave B.J., Slater

121. E., de Koning J., Haller J. The hypothalamus: cross-roads of endocrine and*behavioural regulation in grooming and aggression // Neurosci. Biobehav. Rev. -1998.-V. 23.-P. 163-177.

122. Kukekova A.V., Trut L.N., Oskina I.N, Kharlamova A.V., Shikhevich S.G, Kirkness E.F., Aguirre G.D, Acland G.M. A marker set for construction of a genetic map of the silver fox (Vulpes vulpes) // J. Hered. 2004. - V. 95. - N 3. - P. 185-194.

123. Kunzl C., Sachser N. The behavioral endocrinology of domestication: A comparison between the domestic guinea pig (Cavia aperea f. porcellus) and its,wild ancestor, the cavy (Cavia aperea) // Horm. Behav. 1999. - V. 35. - P. 28-37.

124. Lab Ref: A Handbook of Recipes, and Other Reference Tools for Use at the Bench / ed. Roskams J., Rodgers L. N.Y., 2002. - 272 p.

125. Landman O.E. The inheritance of acquired characteristics // Annu. Rev. Genet. 1991.-V. 25.-P. 1-20.

126. LaRocque S., O'Donnell D., Seckl J.R., Meaney M.J. Postnatal handling increases hippocampal glucocorticoid, but not mineralocorticoid receptor mRNA levels in the rat // Sot. Neurosci. Abstr. 1992. - V. 18. - P. 479. (ijht. no: Diorio-et al., 1993)

127. Leonard J.A., Vila C., Wayne R.K. From wild wolf to domestic dog // Thé dog and its genome / Ed. E.A. Ostrander, U. Giger, R. Lindblad-Toh. N.Y., 2006. -P. 95-117.

128. Levine S. Infantile experience and resistance to physiological stress // Science. 1957. - V. 126. - N 3270. - P. 405.

129. Levine S. Influence of psychological variables on the activity of the hypothalamic-pituitaiy-adrenal axis // Eur. J. Pharmacol. 2000. - V. 405. - P. 149160.

130. Levins R. Theory of fitness in a heterogeneous environment II. Developmental flexibility and niche selection // American Naturalist. 1963. - V. 97,- P. 75-90. (u,ht. no: Badyaev, 2005)

131. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2"AACt method II Methods. 2001. - V. 25. - N 4. -P. 402-408.

132. Lu N.Z, Cidlowski J.A. The origin and functions of multiple humaii glucocorticoid receptor isoforms // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. - V. 1024. - P. 102123.

133. Lu N.Z., Cidlowski J.A. Glucocorticoid receptor isoforms generate transcription specificity // Trends Cell. Biol. 2006. - V. 16. - N 6. - P. 330-307.

134. Lu N.Z., Cidlowski J.A. Translational regulatory mechanisms generate N-terminal glucocorticoid receptor isoforms with unique transcriptional target genes // Mol. Cell. 2005. - V. 18. - N 3. - P. 331-342.

135. Maccari S., Piazza P.V., Kabbaj M., Barbazanges A., Simon H., Le Moal M., Adoption reverses the long-term impairment in glucocorticoid feedback induced by prenatal stress // J. Neurosci. 1995. - V. 15 - N 1. - P. 110-116.

136. Mayr E. The growth of biological thought: Diversity, evolution and inheritance . Cambridge, 1982 - 974 p. (u;ht. no: Jablonka, Lamb, 1995)

137. McEwen B.S. Stress and hippocampal plasticity // Annu. Rev. Neurosci. -1999.-V. 22.-P. 105-122.

138. McGowan P.O., Meaney M.J., Szyf M. Diet and the epigenetic (re)programming of phenotypic differences in behavior // Brain Res. 2008. - V. 1237.-P. 12-24.

139. McGowan P.O., Sasaki A., D'Alessio A.C., Dymov S., Labonte В., Szyf M., Turecki G., Meaney M.J. Epigenetic regulation of the glucocorticoid receptor -in human brain associates with childhood abuse // Nat Neurosci. 2009. - V. 12. - N 3. -P. 342-348.

140. McGowan R.A., Martin C.C. DNA methylation and genome imprinting in the zebrafish, Danio rerio: some evolutionary ramifications // Biochem Cell Biol. -1997. V. 75. - N 5. - P. 499-506.

141. Meaney M. Early postnatal handling alters glucocorticoid receptor, concentrations in selected brain regions // Behav. Neurosci. 1985. - V. 99. - P. 760765.

142. Meaney M.J. Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations // Annu. Rev. Neurosci.2001.-V. 24.-P. 1161-1192.

143. Meaney M.J., Aitken D.H., van Berkel C., Bhatnagar S., Sapolsky, R.M. Effect of neonatal handling on age-related impairments associated with the hippocampus // Science. 1988. - V. 12. - N 239. - P. 766-768.

144. Meek W.H., Smith R.A., Williams C.L. Pre- and postnatal choline supplementation produces long-term facilitation of spatial memory // Dev. Psychobiol. 1988. - V. 21. - P. 339-353. (IJht no: Van den Veyver, 2002)

145. Miesfeld R., Rusconi S., Godowski P.J., Maler B.A., Okret S., Wikstrom A.C., Gustafsson J. A., Yamamoto K.R. Genetic complementation of a glucocorticoid receptor deficiency by expression of cloned receptor cDNA // Cell. 1986. - V. 46. -N3.-P. 389-399.

146. Mitchell J.B., Rowe W., Boksa P., Meaney MJ. Serotonin regulates type II, corticosteroid receptor binding in cultured hippocampal cells // J. Neurosci. 1990. -V. 10. - P. 1745-1752. (ijht no: Meaney et al., 1996)

147. Mizoguchi K.3 Ishige A., Aburada M., Tabira T. Chronic stress attenuates glucocorticoid negative feedback: involvement of the prefrontal cortex and hippocampus //Neuroscience. 2003. - V. 119. - N 3. - P. 887-897.

148. Moalli P.A., Pillay S., Krett N.L., Rosen S.T. Alternatively spliced glucocorticoid receptor messenger RNAs in glucocorticoid-resistant human multiple myeloma cells // Cancer Res. 1993. - V. 53. - N 17. - P. 3877-3879.

149. Morgan H.D., Santos F., Green K., Dean W., Reik W. Epigenetic reprogramming in mammals // Hum Mol Genet. 2005. - V. 14. - Spec. N 1. - R47-58.

150. Morgan H.D., Sutherland H.G., Martin D.I., Whitelaw E. Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse // Nat Genet. 1999. - V. 23. - N 3. - P. 314-318.

151. Moser D., Molitor A., Kumsta R., Tatschner Т., Riederer P., Meyer J. // World J Biol Psychiatry. 2007. - V. 8. - N 4. - P. 262-268.

152. O'Donnell D., Larocque S., Seckl J.R., Meaney M.J. Postnatal handling4 alters glucocorticoid, but not mineralocorticoid messenger RNA expression in the hippocampus of adult rats // Brain Res. Mol. Brain. Res. 1994. - V. 26. - P. 242248.

153. Oskina I.N. Analysis of functional state of the pituitary-adrenal axis during postnatal development of domesticated silver foxes (Vulpes vulpes) // Sceintifur. -1996.-V. 20.-P. 159-161.

154. Pfaff D.W, Ian Phillips M., Rubin R.T. Principles of hormone/behavior relations. Amsterdam et al., 2004. - 335 p.

155. Pfaffl M.W. Quantification strategies in real-time RT-PCR assay // A-Z of Quantitative PCR / Ed. S.A. Bustin La Jolla, 2004. - P. 87-120.

156. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - N 9. - P. e36.

157. Plyusnina I.Z., Oskina I.N., Trut L.N. An analysis of fear and aggression during early development of behaviour in silver fox // Applied Animal Behaviour Science. 1991. - V. 32. - P. 253-268.

158. Popova N.K., Voitenko N.N., Kulikov A.V., Avgustovich D.F. Evidence ofor the involvoment of central serotonin in mechanism of domestication of silver foxes // Pharmacol. Biochem. And Behav. 1991. - V. 40. - P. 751-756.

159. Pottinger T.G., Carrick T.R. Modification of the plasma Cortisol response to stress in rainbow trout by selective breeding // Gen. Comp. Endocrinol. 1999. - V. 116.-N1.-P. 122-132.

160. Price E.O. Animal Domestication and Behavior. N.Y., 2002. - 297 p.

161. Price E.O. Behavioral aspects of animal domestication // Q. Rev. Biol. » 1984. N 1. - P. 1-32.

162. Pryce C.R. Postnatal ontogeny of expression of the corticosteroid receptor genes in mammalian brains: Inter-species and intra-species differences // Brain Res Rev. 2008. - V. 57.-N 2. - P. 596-605.

163. Rakyan V.K, Preis J, Morgan H.D, Whitelaw E. The marks, mechanisms and memory of epigenetic states in mammals // Biochem J. 2001. - V. 356. - P. 10.

164. Ramakers C, Ruijter J.M, Deprez R.H, Moorman A.F. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data // Neurosci Lett. 2003. - V. 339. - N 1. - P. 62-66.

165. Rando O.J, Verstrepen K.J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance // Cell. 2007. - V. 128. - N 4. - P. 655-668.

166. Rassoulzadegan M, Grandjean V, Gounon P, Vincent S, Gillot I, Cuzin F. * RNA-mediated non-mendelian inheritance of an epigenetic change in the mouse // Nature. 2006. - V. 441. - N 7092. - P. 469-474.

167. Reul J.M.H.M, de Kloet E.R. Anatomical resolution of two types of corticosterone receptor sites in rat brain with in vitro autoradiography and computerazed image analysis // J Steroid Biochem. 1986. - V. 24. - N 1. - P. 269272.

168. Reul J.M.H.M, de Kloet E.R. Two receptors systems for corticosterone in rat brain: microdistribution and differential occupation // Endocrinology. 1985. - V, 117.-P. 2505-2511.

169. Reynolds E.H, Carney M.W, Toone B.K. Methylation and mood // Lancet. V. 2. - 196-198.

170. Richards E.J. Inherited epigenetic variation—revisiting soft inheritance // Nat Rev Genet. 2006. - V. 7. - N 5. - P. 395-401.

171. Ricker J.P, Skoog L.A, Hirsch J. Domestication and the behavior-genetic analysis of captive populations // Appl. Anim. Behav. Sci. 1987. - V. 18. - N 1. - P. 91-103.

172. Ronemus M., Martienssen R. RNA interference: methylation mystery // Nature. 2005. - V. 433. - N 7025. - P. 472-473.

173. Ross S.A. Diet and DNA methylation interactions in cancer prevention // Ann N Y Acad Sci. 2003. - V. 983. - P. 197-207.

174. Saetre P., Lindberg J., Leonard J.A., Olsson K., Pettersson U., Ellegren H., Bergstrom T.F., Vila C., Jazin E. From wild wolf to domestic dog: gene expression changes in the brain // Mol. Brain Res. 2004. - V.126. - P. 198-206. .

175. Sandi C., Borell J., Guaza C. Behavioral, neuroendocrine, and immunological outcomes of escapable or inescapable shocks // Physiol. Behav: -1992. V. 51. - № 3. - P. 651-656.

176. Sarrieau A., Sharma S., Meaney M.J. Postnatal development and environmental regulation of hippocampal glucocorticoid and mineralocorticoid receptors // Brain. Res. 1988. - V. 471. - N. 1. - P. 158-162. (ijht no: Meaney et al., 1996)

177. Seckl J.R. Glucocorticoid programming of the fetus; adult phenotypes and molecular mechanisms // Mol. Cell. Endocrinol. 2001. - N. 185. - P. 61-71.

178. Seckl J.R., Holmes M.C. Mechanisms of disease: glucocorticoids, their' placental metabolism and fetal 'programming' of adult pathophysiology // Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2007. - V. 3. - N 6. - P. 479-488.

179. Silva A.J., White R. Inheritance of allelic blueprints for methylation patterns // Cell. 1988. - V. 54. - N 2. - P. 145-152.

180. Skinner M.K., Anway M.D., Savenkova M.I., Gore A.C., Crews D. Transgenerational epigenetic programming of the brain transcriptome and anxiety behavior // PLoS One. 2008. - V. 3. - N. 11. - e3745.

181. Spenser R.L., Kim P.J., Kalman B.A., Cole M.A. Evidence: for mineralocorticoid receptor facilitation of glucocorticoid receptor-dependent, regulation of hypotalamic-pituitary-adrenal axis activity // Endocrinology. 1998" -V. 139.-N6.-P. 2718-2726.

182. Strathdee G., Brown R. Aberrant DNA methylation in cancer: potential clinical interventions // Expert Rev Mol Med. 2002. - V. 4. - N 4. - P. 1-17.

183. Sudakov S.K., Borisova E.V., Lyupina Y.V. Influence of inheritance and fostering on sensitivity to effects of morphine on nociception and locomotor activity in two inbred rat strains // Neuropharmacology. 1996. - V. 35. - N 8. - P. 1131 - * 1134.

184. Sullivan R.M. Hemispheric asymmetry in stress processing in rat prefrontal cortex and the role of mesocortical dopamine // Stress. 2004. - V. 7. - N 2. - P. 131143.

185. Trut L.N. Circadian rhythm of photosensitivity and seasonal reproduction cycles in silver fox (Vulpes vulpes) // 3 Congr. In Sei. Prod. Anim. Fourrure-Versailes (France), 1984. - Communication. - N 36. - P. 2-8.

186. Trut L.N. Early canid domestication: the farm-fox experiment // Am. Sei. -1999.-V. 87.-P. 160-169.

187. Turner J.D., Muller C.P. Structure of the glucocorticoid receptor (NR3C1) gene 5' untranslated region: identification, and tissue distribution of multiple new human exon 1 // J Mol Endocrinol. 2005. - V. 35. - N 2. - P. 283-292.

188. Van den Veyver I.B. Genetic effects of methylation diets // Annu Rev Nutr. -2002. V. 22. - P. 255-282.

189. Van Durme J.J., Bettler E., Folkertsma S., Horn F., Vriend G. NRMD: Nuclear Receptor Mutation Database // Nucleic Acids Res. 2003 - V. 31. - P. 331333.

190. Van Eekelen J.A.M., Kiss J.Z., Westphal H.M., de Kloet E.R.1.munocytochemical study on the intracellular localization of the type • 2 glucocorticoid receptor in the rat brain // Brain Res. 1987. - V. 436. - N 1. - P. 120128.

191. Van Haarst A.D., Oizl M.S., de Kloet E.R. Facilitation 'of feedback inhibition through blockade of glucocorticoid receptors in the hippocampus // Neurochem. Res. 1997. - V. 22. - N 11. - P. 1323-1328.

192. Van Rossum E.F., Lamberts S.W. Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and their associations with metabolic parameters and body composition // Recent Prog. Horm. Res. 2004. - V. 59. - P. 333-357.

193. Wang R.Y., Gehrke C.W., Ehrlich M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues // Nucleic Acids Res. 1980. -V. 8.-N20.-P. 4777-4790.• i

194. Warriar N., Page N., Govindan M.V. Expression of human glucocorticoid receptor gene and interaction of nuclear proteins with the transcriptional control element // J Biol Chem. 1996. - V. 271. - N 31. - P. 18662-18671.

195. Weaver I.C., Cervoni N., Champagne F.A., D'Alessio A.C., Sharma S., Seckl J.R., Dymov S., Szyf M., Meaney M.J. Epigenetic programming by maternal behavior // Nat. Neurosci. 2004a. - N 7. - 847-854.

196. Weaver I.C, Meaney M.J, Szyf M. Maternal care effects on the hippocampal transcriptome and anxiety-mediated behaviors in the offspring that are reversible in adulthood // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006. V. 103. - N 9: - P, 3480-3485.

197. Wei P, Vedeckis W.V. Regulation of the glucocorticoid receptor gene by the AP-1 transcription factor // Endocrine. 1997. - V. 7. - N 3. - P. 303-310.

198. Welberg L.A, Seckl J.R. Prenatal stress, glucocorticoids and the programming of the brain // J. Neuroendocrinol. 2001. - V. 13. - N 2. - P. 113-128.

199. West-Eberhard M.J. Developmental plasticity and evolution N.Y, 2003. -794 p.

200. Wilkins J.F. Genomic imprinting and methylation: epigenetic canalization and conflict // Trends Genet. 2005. - V. 21. - N 6. - P. 356-365.

201. Wolff G.L, Kodell R.L, Moore S.R, Cooney C.A. Maternal epigenetics and methyl supplements affect agouti gene expression in Avy/a mice // FASEB J. -1998. V. 12. - N 11. - P. 949-957.