Роль основного стрессового белка млекопитающих (БТШ70) в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина

Рожкова, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль основного стрессового белка млекопитающих (БТШ70) в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль основного стрессового белка млекопитающих (БТШ70) в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина"

На правах рукописи

РОЖКОВА Елена Александровна

РОЛЬ ОСНОВНОГО СТРЕССОВОГО БЕЛКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ (БТШ70) В ЗАЩИТЕ МИЕЛОИДНЫХ КЛЕТОК ОТ ДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЭНДОТОКСИНА

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ 9 ЛЕН 2010

Москва - 2010

004616224

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Зацепина Ольга Георгиевна

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Евгеньев Михаил Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Купраш Дмитрий Владимирович,

доктор биологических наук, профессор Сапожников Александр Михайлович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт

биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН.

Защита состоится «/ С *> ЯЛК&7)Р& 2010 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан «'//Г» ШУ&дрА 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

Крицын А. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время сепсис является одной из наиболее сложных проблем медицины. Так, в США и странах Европы сепсис ежегодно диагностируется у 700 ООО пациентов, причем число подтвержденных случаев растет на 1,5% в год (Riedemann et al., 2003). Несмотря на огромное число работ, посвященных этому вопросу, и значительные успехи в области выяснения механизмов развития, сепсис, а также его осложнение, септический шок, остаются главной причиной смерти в палатах интенсивной терапии (Cross, Opal, 2003) и занимают 13-е место среди всех причин смертности в США (Parrillo, 1993). По данным за последние десятилетия госпитальная смертность от сепсиса варьирует от 25 до 80% (Angus, Wax, 2001). При этом сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями, встречается в 45-60% случаев от общего числа заболевших и в 65-70% случаев становится причиной эндотоксинового шока (Bone, 1995), в патогенезе которого ключевая роль принадлежит липополисахаридам (Rietschel et al., 1994).

Эндотоксины (липополисахариды, ЛПС) - это компоненты бактериальной стенки, играющие основную роль в инициировании ответа организма на вторжение грамотрицательных бактерий. В случае массивного попадания бактерий в организм происходит активация клеток-мишеней эндотоксинами, что вызывает синтез провоспалительных цитокинов, обладающих ауто- и паракринным действием. Высвободившиеся свободно циркулирующие цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, что, в конечном итоге, приводит к развитию эндотоксинового шока (Rietschel et al., 1996).

Основными стрессовыми белками у многих организмов, включая млекопитающих, являются белки теплового шока (БТШ), в частности БТШ70, интенсивный синтез которого индуцируется в клетке самыми разными стрессовыми агентами (Lindquist, Craig, 1988; Welch, 1993; Hartl, Hayer-Hartl, 2002; Todryk et al., 2003; Kiang, 2004). В последние годы появилось много данных о том, что БТШ70 могут находиться во внеклеточном пространстве, функционируя как специализированные сигнальные молекулы - цитокины (Asea et al., 2000). Появление внеклеточного БТШ70 вызывает активацию различных звеньев иммунной системы, воспринимаясь ею как сигнал «опасности». Это приводит к усилению продукции цитокинов, повышению скорости фагоцитоза и активации системы комплемента, что увеличивает его потенциал, как противовоспалительного фактора (Евдонин, Медведева, 2009). Следует отметить, что данные эффекты вызывает как БТШ70, высвобождаемый из клеток во внеклеточное пространство, так н добавленный экзогенный белок (Zheng et al., 2010).

В работах на крысах, ранее выполненных нами совместно с центром по испытанию лекарственных препаратов в г. Пущино, было показано, что предварительное введение БТШ70, выделенного из мышцы быка, до введения ЛПС оказывает защитное действие, снижая смертность животных и влияя на параметры их гемостаза и гемодинамики (Kustanova et al., 2006). Было важно

повторить эти эксперименты не только на модельных животных, но и на различных типах клеток, используя чистый рекомбинантный человеческий БТШ70, наработанный в экспрессионной системе в клетках шелкопряда {Spodoptera frugiperdá). Для лучшего понимания процессов, происходящих в клетке, было необходимо выявить молекулярные механизмы действия экзогенного БТШ70, и показать, что данный препарат обладает значительным антисептическим эффектом, не зависящим от контаминации белка ЛПС.

Для того чтобы охарактеризовать защитную роль экзогенного БТШ70 млекопитающих на клеточном уровне, мы исследовали комбинированное действие БТШ70 и ЛПС на миелоидных клетках млекопитающих, которые играют важную роль в ответе системы врожденного иммунитета на полимикробный сепсис (Ulmer et al., 2002).

Основными клетками, участвующими в воспалении и обеспечивающими устойчивость к инфекциям, являются нейтрофилы, моноциты и макрофаги. Макрофаги и моноциты под действием ЛПС продуцируют различные цитокины и клеточные медиаторы и играют важную роль в развитии сепсиса.

Известно, что в воспалительном ответе на ЛПС-индуцированный бактериальный сепсис ключевую роль играют нейтрофилы (Alves-Filho et al., 2008). ЛПС праймирование нейтрофилов вызывает усиление продукции активных форм кислорода (АФК) и экспрессию р2-интегриновых рецепторов (Everton et al., 2009; Detmers et al., 1998). Кроме того, под действием эндотоксинов происходит ингибирование апоптоза этих клеток, препятствующее эффективному клиренсу нейтрофилов, что становится причиной повреждения тканей при воспалении. В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход к лечению ряда воспалительных заболеваний, в том числе и сепсиса (Wesche-Soldato et al., 2007).

Большая часть исследований по защитной роли БТШ70 против действия ЛПС проводилась с использованием рекомбинантного человеческого белка, экспрессированного в Е. coli, а потому зачастую загрязненного бактериальными эндотоксинами (Tsan, Gao, 2009). Было важно провести анализ препаратов БТШ70 млекопитающих различного происхождения на возможные антисептические эффекты. Для сравнения выбрали рекомбинантный человеческий индуцибельный БТШ70 (рБТШ70), экспрессированный в клетках Spodoptera и БТШ70, выделенный из сердечной мышцы верблюда, ткани, имеющей высокую концентрацию БТШ70. В обоих случаях было показано явное защитное влияние БТШ70 на активацию и апоптоз нейтрофилов человека при действии ЛПС из Е. coli. Мы исследовали также возможные антисептические эффекты БТШ70 на макрофагах, чтобы определить, насколько универсально действие данного белка. Для лучшего понимания процессов, лежащих в основе защитного влияния БТШ70 при ЛПС-индуцированном сепсисе, было необходимо изучить, что происходит в клетках на молекулярном уровне. Для этого мы сравнили белковые паттерны макрофагов при комбинированном воздействии теплового шока, рБТШ70 и ЛПС. Мы обнаружили и идентифицировали ряд белков, изменяющих свою экспрессию в ответ на данные воздействия.

Цель работы. Изучение роли препаратов БТШ70 млекопитающих в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина (ЛПС). Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать влияние рекомбинантного человеческого БТШ70, экспрессированного в клетках Spodoptera, на смертность животных в модели экспериментального грамотрицательного сепсиса у крыс,

а) генерацию активных форм кислорода;

б) экспрессию р2-интегриновых рецепторов;

в) апоптоз.

3. Исследовать влияние препаратов БТШ70 и ЛПС на продукцию N0 макрофагами.

4. Изучить воздействие комбинированной обработки макрофагов тепловым шоком (ТШ) и ЛПС на продукцию N0.

5. Провести анализ белковых паттернов макрофагов при комбинированном воздействии ЛПС, рБТШ70 и ТШ, и идентифицировать белки, экспрессия которых значительно меняется в ответ на такие воздействия.

Научная новизна. Впервые показан на клеточном уровне защитный эффект экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердечной мышцы верблюда) при действии бактериального эндотоксина. Установлено, что предварительное введение БТШ70 снижает генерацию АФК в различных типах миелоидных клеток, нормализует апоптоз нейтрофилов, ингибируемый при их стимуляции ЛПС, снижает ЛПС-индуцированный уровень экспрессии ß2-интегриновых рецепторов нейтрофилов. Идентифицированы белки, изменяющие свою экспрессию в ответ на комбинированное действие ТШ, рБТШ70 и ЛПС, что расширяет наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе антисептической роли БТШ70 при эндотоксемии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный человеческий БТШ70, экспрессированый в клетках Spodoptera, обладает антисептическими свойствами, значительно снижая процент смертности крыс в модели экспериментального грамотрицательного сепсиса.

2. Предварительное введение экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердца верблюда) демонстрирует защитный эффект, влияя на функциональные ответы и апоптоз нейтрофилов при действии ЛПС из Е. coli.

3. Прекондиционирование макрофагов с препаратами БТШ70 снижает ЛПС-индуцированную продукцию N0.

4. Предварительная обработка макрофагов ТШ снижает продукцию N0, обусловленную действием ЛПС из Е. coli.

5. Защитный эффект БТШ70 при действии ЛПС реализуется на молекулярном уровне, затрагивая различные сигнальные пути в клетке.

Практическая ценность. Полученные в ходе исследований результаты демонстрируют важную роль экзогенного внеклеточного БТШ70 млекопитающих в модуляции врожденного иммунитета, что делает этот белок многообещающим для создания на его основе эффективных противовоспалительных лекарств,

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований -от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: 13th Congress of the International Association of Biomédical Gerontology: "Aging, cancer and age-related diseases; common mechanisms?" (Quebec, Canada,); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2009); Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010).

Публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 7 печатных работах, из них 3 - статьи в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на _ страницах и

включает_рисунков,_таблицы и список литературы. Диссертация состоит из

введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов и библиографического указателя (_источника).

Список сокращений:

БТШ70 - белок теплового шока 70 кДа

ЛПС - липополисахарид

ТШ - тепловой шок

АФК - активные формы кислорода

ХЛ - хемилюминесценция

ШЬР - формил-метионил-лейцил-фенилаланин

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали нейтрофилы человека, выделенные из крови здоровых доноров, клеточную культуру мышиных макрофагов J774, а также крыс линии Wistar.

Верблюжий БТШ70 выделяли по ранее описанной методике (Guzhova et al., 1998) с незначительными модификациями, а ген рекомбинантного человеческого белка БТШ70 был клонирован для дальнейшей экспрессии под полиэдриновым промотором в бакмиду, как описано (Luckow et al., 1993). Рекомбинантный белок, экспрессированный в клетках шелкопряда, очищали на Ni-NTA колонках согласно рекомендациям производителя («QIAGEN»).

Крыс содержали в стандартных условиях, они получали корм и воду ad libitum. Грамотрицательный сепсис моделировали внутривенным введением ЛПС из Е. coli в дозе 2 мг/кг. рБТШ70 вводили внутривенно в дозе 266 мкг/кг за 10 минут до ЛПС. В качестве контроля вводили 0,9% раствор NaCl. Объем введения веществ составлял 1 мл/кг.

Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров методом центрифугирования в двухступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина (1,119 и 1,077). После центрифугирования отбирали фракцию нейтрофилов. Чистоту выделенных нейтрофилов контролировали по их морфологии. Содержание нейтрофилов в образце составляло ~ 98% от общего количества клеток.

Жизнеспособность клеток определяли на основе способности живых клеток исключать флуоресцентный зонд иодид пропидия (PI) (Afanasyev et al., 1993). Процент живых клеток рассчитывали по полученным результатам. В наших экспериментах жизнеспособность выделенных нейтрофилов составляла 98 - 99%. В некоторых экспериментах жизнеспособность исследуемых клеток контролировали с помощью флуоресцентного микроскопа, подсчитывая процент неокрашенных иодидом пропидия клеток.

Регистраиию образования АФК нейтрофилами проводили с помощью хемилюминесцентного метода (Владимиров, Шерстнёв, 1989). Нейтрофилы в растворе Хэнкса (1><106 клеток/мл) были праймированы 20 нг/мл ЛПС в течение 30 мин при 37°С в присутствии 2% плазмы (пул плазмы 10-ти здоровых доноров перед использованием хранился при -70°С). Клетки были стимулированы с 1 мкМ

формил-метионил-лейцил-фенилаланина (fMLP) в присутствии 35 мкМ люминола. Образцы помещали в люменометр 1250 LKB (Швеция). Хемилюминесценцию (XJI) регистрировали в течение 10 мин. Суммарную продукцию АФК рассчитывали как площадь под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени. Эффекты праймирующих агентов или ингибиторов оценивали по отношению продукции АФК обработанных и интактных клеток.

Для изучения уровня экспрессии клеточных рецепторов CD1 lb/CD 18 на поверхности нейтрофилов применяли метод проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител (анти-CDl lb), конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (Caltag, США).

При исследовании апоптоза выделенные нейтрофилы (10б клеток/мл) культивировали в среде, содержащей RPMI-1640, 1% L-глутамина, 1% пенициллина, 1% стрептомицина и 10% термоинактивированной ЭТС при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг, в течение 14 часов. Апоптоз регистрировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием 1 мкг/мл флуоресцентного зонда Hoechst-33258 (Винокуров и др., 2006). Жизнеспособность нейтрофилов после окончания культивирования составляла 96-98%.

Культуру клеток мышиных макрофагов J774 (из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН) культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (Sigma) с добавлением термоинактивированной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Logan UT), тестированной на наличие эндотоксина (0,01 эндотоксина ед/мл), 1% пенициллина, 1% стрептомицина, 2 мМ L-глутамина при 37°С в среде, содержащей 5% СОг-

Для измерения оксида азота в макрофагах J774 отбирали 10б клеток в культуральной среде за 24 часа до эксперимента. Концентрация NO оценивалась на основании показаний концентраций нитрита. Нитриты являются финальным продуктом метаболизма высоко нестабильного NO. Уровень нитритов определяли, используя реагент Грисса (Sigma) как описано в (Prestes-Carniero et al., 2007).

Для подготовки проб к двумерному электрофорезу клетки J774 собирали центрифугированием, определяли их количество и переводили в свежую культуральную среду в концентрации 2 х 106/мл клеток. На каждую пробу брали от 5 до 6 млн. клеток в пенфлаконах объемом 10 мл. В день эксперимента тепловой шок проводили на водяной бане при +43°С в течение 30 минут. После

теплового шока в пробы добавляли БТШ70 и/или ЛПС из Е. coli 055:В5 или Е. coli Olli:В4 (Sigma, USA) в концентрации 1 мкг/мл. В экспериментах по защитному действию БТШ70 ЛПС добавляли спустя 10 минут после введения БТШ70 (при комнатной температуре). Затем все пробы культивировали при +37°С в течение 3 часов. Затем снова определяли концентрацию клеток и их жизнеспособность, на пробу брали 1,5 х 106 клеток, которые метили в 200 мкл раствора Хэнкса, добавляя 1 мкл (1,85 MBq) 358-метионина (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ) в течение 1 часа при +37°С. После этого клетки отмывали в HBSS, осадок растворяли в 75 мкл буфера О'Фаррелла, замораживали в жидком азоте и помещали на -70°С.

Двумерный гель-электрофорез проводили согласно классическому методу О'Фаррелла (O'Farrell, 1975) с некоторыми вариациями. На трубку брали 1,2 х 106 клеток и проводили изоэлектрофокусирование при 300В 16 часов. Разделение во втором направлении проводили в 12% полиакриламидном геле. После электрофореза гели окрашивали Кумасси R-250, высушивали и закладывали с рентгеновской пленкой на 5 дней. Белковые пятна, соответствующие белкам с изменяющейся экспрессией, что оценивалось по включению 358-метионина, вырезали из препаративного геля и подвергали гидролизу трипсином в геле.

Анализ полученных образцов проводили на масс-спектрометре MALDI-TOF/TOF Ultraflex II (Bruker, Германия). Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot (Matrix science) в базе данных NCBI.

Определения уровня включения 35 S-метионина проводили в жидком сцинтилляторе (MP Biomedicals Ecolume). Для этого белковое пятно вырезали из геля и растворяли в 60 мкл 30% перекиси водорода в течение ночи при 65°С. Полученный раствор смешивали с 5 мл сцинтиллятора и просчитывали радиоактивность на жидкостносцинцилляционном счётчике (Intertechnique) по 1 мин на пробу.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета статистических программ Statistica и Origin Pro 6.1. Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. При сравнении смертности применяли тест хи-квадрат. Достоверными считали различия при Р<0,05.

Результаты исследования

1. Исследование влияния рБТШ70 на выживаемость крыс в модели экспериментального грамотрицателыюго сепсиса

Ранее в работах, проводимых совместно с центром по испытанию лекарственных препаратов в г. Пущино, нами впервые было показано, что введение БТШ70, выделенного из мышцы быка, оказывает значительное защитное действие, снижая смертность и улучшая параметры гемостаза и гемодинамики в модели эндотоксинового шока у крыс (Кл^апоуа е1 а1., 2006). Надо заметить, что препараты БТШ70 из мышцы быка (Кш(апоуа е1 а1., 2006), содержали в равных количествах индуцибельную и конститутивную формы этого белка.

В большинстве экспериментов мы использовали рекомбинантный индуцибельный человеческий БТШ70, экспрессированный в клетках 5рос1ор1ега. Можно было ожидать, что чистый рекомбинантный человеческий БТШ70 будет иметь больший терапевтический потенциал при лечении людей. С другой стороны, не исключено, что защитный эффект, демонстрируемый бычьим БТШ70, может быть обусловлен присутствием двух форм БТШ70 в препарате, и мы не были уверены, будет ли чистый человеческий индуцибельный БТШ70, экспрессированный в клетках 5ройор1ега, демонстрировать сходный защитный эффект.

Для того, чтобы доказать, что рекомбинантный человеческий БТШ70 имеет такой же защитный эффект, как и бычий, мы провели эксперимент, используя модель ЛПС-индуцированной эндотоксемии на крысах линии '\¥1з1аг. Эксперимент показал, что инъекция рБТШ70 крысам до введения ЛПС значительно уменьшает смертность животных (табл. 1). Это позволило нам заключить, что рБТШ70 проявляет антисептические свойства, сходные с ранее описанными для бычьего БТШ70.

Таблица 1. Влияние рекомбинантного человеческого БТШ70 (рБТШ70) на

смертность животных в модели экспериментального грамотрицателыюго сепсиса.

Группа Процент гибели животных

0.9 % раствор NaCl 0

ЛПС из E.coli 86,7%

рБТШ70 + ЛПС из E.coli 31,3%

Далее, для понимания механизмов, лежащих в основе этого защитного влияния, было важно исследовать действие БТШ70 на клеточном и молекулярном уровнях.

2. Прекондиционированис с БТШ70 ослабляет ЛПС-индуцироваиный воспалительный ответ на клеточном уровне

В первой серии экспериментов мы сравнили влияние человеческого рБТШ70 и БТШ70, выделенного из сердечной мышцы верблюда (вБТШ70), на продукцию АФК, которые генерируются при стимулировании нейтрофилов fMLP. Инкубирование нейтрофилов с ЛПС (30 мин перед введением fMLP) значительно увеличивало величину хемилюминесценции (ХЛ) клеток, по сравнению с контролем (рис. 1, I и II). В качестве контроля был принят уровень ХЛ нейтрофилов в отсутствие ЛПС, при 37°С.

Увеличение концентрации БТШ70 относительно ЛПС от 1:1 до 1:50 вызывало значительное ослабление ЛПС-индуцированной продукции АФК, четко зависящее от дозы БТШ70. Надо отметить, что вБТШ70 в данном эксперименте оказался более эффективным относительно рБТШ70 (рис. 1,1 и II).

Анализ кинетики процесса показал, что защитный эффект БТШ70 на продукцию АФК, оцененный по изменению уровня ХЛ, достигал 50% через 2 минуты инкубации с БТШ70 до применения эндотоксина и почти 100% через 4 минуты (рис. 1, III). Поэтому в экспериментах прекондиционирование с БТШ70 проводили в течение 5 минут.

Надо заметить, что присутствие рБТШ70 вызывает незначительное увеличение продукции АФК, по сравнению с экспериментами, где использовали вБТШ70, и с контрольными нейтрофилами. Возможно, это связано с небольшой контаминацией рБТШ70 бактериальными ЛПС. Уровень ХЛ в присутствии обеих форм БТШ70 и полимиксина В (антибиотик, связывающий ЛПС) не отклонялся от контрольных значений.

Чтобы доказать, что наблюдаемая толерантность нейтрофилов к действию ЛПС обусловлена влиянием самих БТШ70, а не загрязнением белков эндотоксином, мы провели дополнительные эксперименты. Препараты БТШ70 денатурировали кипячением при 100°С в течение 20 минут. Клетки, обработанные денатурированным БТШ70, не демонстрировали устойчивости к ЛПС-индуцированной активации нейтрофилов, что определяли по измерению уровня АФК (рис. 1, IV). Эти эксперименты обеспечили дополнительное подтверждение того, что наблюдаемый защитный эффект препаратов БТШ70 не зависит от контаминации эндотоксином, который выдерживает кипячение.

180 160 140 ■ 120 ■ 100 so -60

180 160 • 140 120 100

ВБТШ70, нг/мл

Рис. 1. Действие препаратов БТШ70 на продукцию активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами человека.

ЛПС (20 нг/мл) добавляли через 5 мин после обработки БТШ70, а через 25 мин вводили fMLP (1 мкМ).

(I и II) I - рекомбинантный БТШ70 (рБТШ70); II - БТШ70, выделенный из сердечной мышцы верблюда (вБТШ70); а - без добавления ЛПС; б - с добавлением ЛПС; в - в присутствии полимиксина В (20 мг/мл). Результаты представлены как процент от контроля. Показаны значения ± стандартная ошибка (Р < 0,001).

(III) Влияние временного интервала между введением БТШ70 и обработкой ЛПС на продукцию АФК нейтрофилами. Через 1, 2, 4 и 10 мин инкубации с БТШ70 (1 мкг/мл), добавляли ЛПС и через 30 мин после начала инкубации в каждую пробирку добавляли fMLP (1 мкМ). Показаны значения ± стандартная ошибка (Р < 0,001).

(IV) Влияние денатурированного нагреванием БТШ70 на продукцию АФК нейтрофилами. Препараты БТШ70 кипятили при 100'С в течение 20 мин и затем их тестировали на способность вызывать продукцию АФК. К - контроль. Результаты представлены как процент от контроля. Показаны значения ± стандартная ошибка (Р < 0,001).

1 10 100 1000 рБТШ70, нг/мл

Iii

1 10 100 1000

III

160

120

РБТШ70 ВБТШ70

200 180

о 140 120

100

к>

-i

2 4 6

Время, мин

ЛПС К рБТШ70 ВБТШ70

3. Прекондиционирование с БТШ70 значительно модифицирует ЛПС индуцированную экспрессию р2-интегриновых рецепторов нейтрофилов

Хорошо известно, что бактериальные эндотоксины способны значительно увеличивать уровень экспрессии различных рецепторов нейтрофилов (Van Amersfoort et al., 2003). Так, под действием ЛПС наблюдается увеличение адгезивных молекул ((32-интегринов - CDllb/CD18 рецепторов), посредством которых нейтрофилы взаимодействуют с эндотелием, и происходит поступление нейтрофилов в ткани между клетками эндотелия (Lynn et al., 1991). Во второй серии экспериментов мы исследовали влияние предварительной обработки препаратами вБТШ70 и рБТШ70 на экспрессию рецепторов CDllb/CD18 после действия ЛПС.

160

140

120

100

д.

Рис. 2. Связывание Р1ТС конъюгированных моноклональных антител к СВ11Ь с нейтрофилами.

1 - контроль;

2 - рекомбинантный БТШ70 (1мкг/мл);

3 -БТШ70, выделенный из сердца верблюда (1 мкг/мл). а - нейтрофилы без ЛПС;

б - нейтрофилы, инкубированные с ЛПС (100 нг/мл).

На рисунке 2 (эксперимент 1) видно, что добавление ЛПС значительно увеличивает уровень экспрессии рецепторов CD1 lb/CD 18 нейтрофилов. Следует отметить, что сами препараты БТШ70 незначительно увеличивали экспрессию исследуемых рецепторов (рис. 2, эксперименты 2а и За). При этом предварительное инкубирование нейтрофилов с любым препаратом БТШ70 (1 мкг/мл в течение 5 минут) заметно снижало эндотоксин-индуцированное увеличение экспрессии рецепторов CD1 lb/CD18 (рис. 2, эксперименты 26 и 36).

4. Предварительная обработка БТШ70 частично нормализует апоптоз

нейтрофилов

Известно, что бактериальные эндотоксины при сепсисе и in vitro значительно ингибируют апоптоз нейтрофилов (Sheth et al., 2001; Keel et al., 1997), что имеет негативное влияние, приводя к повреждению тканей и усилению воспаления (Power et al., 2002). Мы исследовали действие обоих препаратов БТШ70 на апоптоз нейтрофилов в присутствии ЛПС из Е. coli.

110 100

m SO о

с о

с <

Рис. 3. Влияние БТШ70 на апоптоз нейтрофилов . а-ЛПС (100 нг/мл); б - рекомбинантный БТШ70; в - верблюжий БТШ70.

1-100 нг/мл БТШ70;

2-100 нг/мл БТШ70 в присутствии ЛПС (100 нг/мл);

3 - 1 мкг/мл БТШ70;

4 - 1 мкг/мл БТШ70 в присутствии ЛПС (100 нг/мл). Апоптоз в контрольных клетках принят за 100%.

12 3 4

Эксперименты продемонстрировали, что ЛПС (100 нг/мл) ингибировал апоптоз контрольных нейтрофилов почти на 35% (рис. 3), что хорошо согласуется с данными работы (Винокуров и др., 2006). В этой серии экспериментов за 100% был принят апоптоз нейтрофилов в отсутствие ЛПС. Характерно, что оба препарата БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл незначительно ингибировали апоптоз нейтрофилов (рис. 3, б и в в экспериментах 1 и 3). С другой стороны, предварительное инкубирование клеток с 0,1 или 1 мкг/мл БТШ70 достоверно (на несколько процентов) ослабляло эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов. Хотя вБТШ70 был более эффективен, обе формы БТШ70 сходным образом оказывали зависимое от дозы влияние, снижая ЛПС-индуцированную задержку апоптоза нейтрофилов.

5. Прекондиционирование с препаратами БТШ70 ингибирует продукцию NO

Еще одним признаком ответа на воспаление, обычно наблюдаемым в миелоидных клетках после ЛПС обработки, является индукция продукции N0 (Poltorak et al., 1998; Zhang, Ghosh, 2000). Используя мышиные макрофаги (клеточная линия J774), при измерении ЛПС-индуцированной продукции N0, мы обнаружили значительное и зависящее от дозы защитное действие рБТШ70 (рис. 4). Препараты БТШ70 заметно дозозависимо уменьшали ЛПС-индуцированную продукцию воспалительных факторов, и в этом смысле вБТШ70 был эффективнее рекомбинантного.

£ 20 ■

10 100 1000 рВТШ70, нг/мл

10 100 1000 ВБТШ70, нг/мл

Рис. 4. Действие препаратов БТШ70 и ЛПС на продукцию N0. Клеточную культуру J774 (10б клеток/мл) перед введением ЛПС инкубировали с БТШ70 в течение 5 мин. Через 24 ч после добавления ЛПС определяли концентрацию N0 в культуральном супернатанте. Измерение проводили косвенно, на основании концентрации нитрита, используя реактив Грисса. рБТШ70 - рекомбинантный БТШ70; вБТШ70 -верблюжий БТШ70. а - без добавления ЛПС; б - с добавлением ЛПС (1 мкг/мл). Показаны значения ± стандартная ошибка (Р < 0,001).

Известно, что БТШ70-индуцированная передача сигнала обладает свойствами, близкими к эндотоксин-индуцированной (Tsan, Gao, 2004; Guzhova, Margulis, 2006). Следовательно, наблюдаемые эффекты после прекондиционирования с БТШ70 могут быть обусловлены контаминацией ЛПС препаратов БТШ70. Для того, чтобы исключить эту возможность и доказать защитную роль именно БТШ, мы провели эксперименты по проверке влияния эндогенных БТШ, индуцированных повышением температуры (тепловой шок), на устойчивость клеток к действию ЛПС.

6. Повышение температуры (ТШ) и экзогенный БТШ70 сходным образом ингибируют ЛПС-иидуцированную продукцию NO

Так как ранее на мышиных макрофагах ЛАУ/ 264.7 некоторыми авторами было показано, что обработка тепловым шоком значительно снижает ЛПС-индуцированный воспалительный ответ (^-^¡шага е1 а!., 2007), мы решили использовать обработку тепловым шоком и в нашей работе. Мы определили уровни БТШ70 после увеличения температуры (30 мин при 43°С) и других обработок клеток 1774. После ТШ и восстановления в течение 3 часов при 37°С добавляли ЛПС и инкубировали 24 часа.

Эти эксперименты показали, что обработка клеток ТШ значительно уменьшала ЛПС-индуцированный уровень N0 (рис. 5В), аналогично тому, что наблюдалось в экспериментах с прекондиционированием экзогенным БТШ70 (рис. 4).

1 2 3 4 5

z £

6 7 8

«—» |гшп 4

]

;

Рис. 5. Влияние комбинированной обработки тепловым шоком и введения ЛПС из Е. coli на клетки J774.

(А) Уровни эндогенного БТШ70 через 1 час после разных обработок, детектированные 358-метионином. 1 - контрольные клетки при 37°С; 2 - клетки при 37°С обработанные ЛПС; 3 - клетки, обработанные тепловым шоком (30 мин при 43°С); 4 - клетки, обработанные ТШ и ЛПС; 5 - клетки при 37°С с добавлением рекобминантного БТШ70 (рБТШ70); 6 - клетки при 37'С с добавлением рБТШ70 за 10 мин до ЛПС; 7 - клетки, обработанные ТШ с добавлением рБТШ70; 8 - клетки, обработанные

ТШ с добавлением рБТШ70 за 10 мин до ЛПС. рБТШ70 использовали мкг/мл и ЛПС из Е. coli брали в концентрации 1 мкг/мл.

и введения ЛПС на продукцию NO клетками J774. J774 (106 при 43 °С), после чего им давали 3 ч на

в концентрации

(Б) Влияние ТШ и введения ЛПС на продукцию N0 клетками 1774. 1774 клеток/мл) подвергали ТШ (30 мин при 43°С), после чего им давали 3 1 восстановление перед стимуляцией ЛПС (1 мкг/мл). N0 определяли через 24 ч после введения ЛПС. Концентрацию нитрита в культуральном супернатанте измеряли используя реактив Грисса. 1 и 3 - без ЛПС при 37°С и 43°С, соответственно; 2 и 4 -обработанные ЛПС (1 мкг/мл) при 37°С и 43°С, соответственно. Показаны значения ± стандартная ошибка (Р < 0,001).

7. Протеомный анализ клеток J774 при комбинированной обработке

рБТШ70, ЛПС и ТШ

Для дальнейшей характеристики молекулярных механизмов комбинированного действия ЛПС и БТШ70, мы решили проанализировать изменение белковых паттернов клеток под влиянием обоих этих факторов. Надо заметить, что, хотя протеомы моноцитов обработанных ЛПС были описаны до нас (Gadgil et al., 2003; Pabst et al., 2008), до сих пор не было определено влияние комбинированного действия ЛПС и БТШ70 на изменение белковых паттернов. Как часть исследования мы провели протеомный анализ макрофагов (J774) активированных ЛПС из Е. coli в сочетании с прекондиционированием БТШ70 и ТШ. Так как основной целью данного эксперимента был анализ белков, меняющих свою экспрессию при определенных воздействиях, то мы решили, что наиболее наглядно это можно проследить, анализируя включение "Б-метионина в белки. Белковые пятна, которые меняли свой профиль в разных условиях, вырезали и проводили масс-спектрометрический анализ с целью определения соответствующего этому пятну белка.

Рис. 6. Двумерный электрофорез клеток ¡114 меченных 353-метионином. А - контрольные клетки, культивирование при 37°С. Б - клетки, обработанные БТШ70 перед введением ЛПС при 37°С.

В результате проведенных экспериментов мы обнаружили восемь внутриклеточных белков (рис. 6), экспрессия которых значительно варьировала при активации макрофагов (1774) бактериальным эндотоксином в комбинации с прекондиционированием БТШ70 и обработкой ТШ, по сравнению с контрольными клетками (табл. 2).

Таблица 2. Характеристика обнаруженных белков и уровня их экспрессии.

№ Название белка и номер в NCBI Описание роли белка в клетке Экспериментально полученное изменение экспрессии белка

1 Grp94, или Hsp90bl, gp96 NP 035761. • Относится к семейству БТШ90 в ЭПР. • Иммунорегуляторная роль (внеклеточная форма). • Повышение экспрессии при стрессе приводит к воспалительному ответу. • Не усиливает экспрессию при ТШ. Усиление при обработке ЛПС. Снижение при БТШ70 + ЛПС. Некоторое снижение при ТШ.

2 Trapl, или TNF receptor-associated protein 1 NP_080784.I • Митохондриальный БТШ75. • Участвует в образовании рецепторного комплекса для передачи сигнала от ЛПС. • Защита от окислительного стресса. • Антиапоптотическая роль. Усиление при всех воздействиях. Наиболее значительное усиление под действием ЛПС. Снижение в комбинации БТШ70+ЛПС.

3 Dpysl2, или Dihydropyrimidinase -like 2 protein, Crmp2 NP_034085.2 • Участвует в реорганизации цитоскслета клеток, регулируя их миграцию. Его экспрессия зависит от активного статуса клетки. Усиление во всех пробах при ТШ и при совместной обработке БТШ70 + ЛПС на 37'С.

4 hnRNP К, или Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein К NP_079555.1 • Вовлечен во множество процессов, составляющих экспрессию генов. • Служит «стыковочной платформой» для объединения сигнальных каскадов. • Фосфорилируется в ответ на внеклеточные сигналы (например, при окислительном стрессе). Усиление в ответ на ТШ и на введение ЛПС. При 37'С наибольшая экспрессия на введение БТШ70 + ЛПС.

5 Sqstml, или Sequestosome 1, p62 NP_035148.1 • Убиквитин-связывающий белок, который удаляет полиубиквитинилированные белки из клетки. • Предупреждает чрезмерный воспалительный ответ. • Индуцируется в ответ на оксидативный стресс. Значительное усиление при введении ЛПС, как одного, так и в комбинациях с БТШ70 и ТШ.

6 Hspdl NP_034607.3 • Митохондриальный БТШ60. • Участвует во многих видах стресса. • Эндогенный белок защищает от клеточной смерти, поддерживая митохондриальное окислительное фосфорилированне. • Проапоптотическая роль. Значительное усиление при ТШ, но относительное снижение в вариантах ТШ с ЛПС. Усиление на введение БТШ70 + ЛПС при 37°С.

7 Enol, или enolase 1 NP_075608.2 • Фермент гликолиза и глюконеогенеза. • Регуляторная роль во многих стрессовых состояниях. • Играет важную роль в организации активного цитоскелета, обеспечивая подвижность клеток в ответ на ЛПС стимулы. Усиление при ТШ и при обработке ЛПС на 37°С. На введение БТШ70 + ЛПС при 37°С снижение до контрольного уровня.

8 A«xa5, или Anncxin A5 NP_033803.1 • Вспомогательное вещество, которое влияет на поглощение апоптотическихи некротических клеток макрофагами. • Антивоспалительный эффект. Усиление в ответ на введение ЛПС и наТШ. Наиболее значительное повышение экспрессии при 37°С на введение БТШ70 + ЛПС.

Обсуждение результатов исследования

Несмотря на существенные успехи в развитии антисептической терапии, до сих пор практически не существует эффективного способа борьбы с бактериальным сепсисом и эндотоксическим шоком, который является наиболее тяжелым осложнением, зачастую приводящим к летальному исходу. Основные направления исследований, нацеленные на решение этой проблемы, заключаются в усиленном поиске новых антибиотиков и антисептических средств (Brandenburg, Wiese, 2004), использовании антител к О - антигену и липиду А ЛПС (Fujihara et al., 1993; Andra et al., 2006) и блокировании специфических провоспалитсльных медиаторов (Riederman et al., 2003). К тому же, делались попытки использовать действие растворимых цитокинов (Shcth et al., 2001), связывающих рецепторы, а также различных агентов, формирующих стабильные комплексы с ЛПС (Andra et al., 2006). Были также использованы антагонисты токсина (lanaro et al., 2009).

Хорошо известно, что септический синдром включает в себя ингибирование апоптоза нейтрофилов, что препятствует их нормальному клиренсу и имеет негативное влияние, приводя к повреждению тканей и усилению воспаления (Power et al., 2002). Параллельно с поиском химических агентов, которые могут блокировать связывание эндотоксинов со специфическими рецепторами моноцитов и макрофагов, регуляция апоптоза нейтрофилов представляет собой другой терапевтический подход к ингибированию воспаления, вызванного ЛПС-индуцированным сепсисом (Hofman, 2004).

Хотя индукция БТШ впервые была описана в ответ на гипертермию, показано, что количество БТШ увеличивается и при других видах клеточного стресса. БТШ участвуют в защите организмов от различных повреждающих воздействий, включая сепсис, вирусную инфекцию, инфаркт, ишемию, гипертонию и нейродегенеративные заболевания (Bruemmer-Smith et al., 2001; Njemini et al., 2003; Calabrese et al., 2008; Brodsky, Chiosis, 2006; Tytell, Hooper, 2001).

В наших предыдущих исследованиях, где в качестве модельных животных использовали крыс, было показано, что экзогенный БТШ70 млекопитающих уменьшает проявления ЛПС-индуцированного сепсиса на уровне организма. Надо заметить, что только профилактическое, а не терапевтическое введение белка до ЛПС оказывало защитный эффект на животных (Kustanova et al., 2006). Поэтому во всех экспериментах мы исследовали влияние предварительного введения белка до эндотоксина.

Миелоидные клетки играют основную роль в воспалении и устойчивости к бактериальной инфекции, и они выступают в качестве главной мишени действия эндотоксинов. В данной работе мы исследовали действие прекондиционирования экзогенным БТШ70 на последующую активацию, нейтрофилов и макрофагов, вызванную ЛПС.

Полученные нами данные позволяют заключить, что добавление БТШ70 к нейтрофилам не вызывает индукцию детектируемого уровня АФК в широком диапазоне концентраций. С другой стороны, прекондиционирование с БТШ70 эффективно способствует устойчивости нейтрофилов к эндотоксину (рис.1, I и II). Большая эффективность влияния препаратов БТШ70 на снижение продукции АФК нейтрофилами, активированными эндотоксином, по-видимому, обусловлена тем, что мы регистрировали суммарную продукцию АФК (внеклеточную и внутриклеточную).

Быстрое взаимодействие токсинов со специфическими рецепторами миелоидных клеток-мишеней, по-видимому, представляет собой ключевой шаг в эндотоксин-индуцированной активации этих клеток. Анализ кинетики защитного

действия обоих препаратов БТШ70 (рис. 1, III) показал, что эти белки обеспечивают максимальную защиту нейтрофилов от ЛПС-индуцированной генерации АФК через 4-5 минут инкубации с белком до действия эндотоксина. Время предварительной обработки нейтрофилов БТШ70, необходимое для более эффективного подавления ЛПС-индуцированной продукции АФК, которое мы определили в экспериментах, подтверждает полученные ранее результаты (Kitchens et al., 1999), в которых демонстрировалось связывание бактериальных эндотоксинов с мембранными CD 14 рецепторами за несколько минут. Эти выводы были также подтверждены в экспериментах, демонстрирующих очень быструю кинетику взаимодействия ЛПС с рекомбинантными CD14, TLR4 и MD2 белками (Shin et al., 2007). Было также показано, что через 5 минут после действия ЛПС на макрофаги, наблюдается значительное увеличение концентраций TLR4 и БТШ70 в липидных микродоменах этих клеток (Cuschieri et al., 2006).

Несколькими авторами было продемонстрировано, что внеклеточный БТШ70 действует через CD 14 и TLR4 путь и, таким образом, конкурирует за те же рецепторы, что и ЛПС (Dybdahl et al., 2002). Этим хорошо объясняется наблюдаемый эффект защитного влияния именно предварительного введения БТШ70 до эндотоксина (Kustanova et al., 2006). Этот вывод был подтвержден в экспериментах на макрофагах и нейтрофилах, где индуцированная устойчивость к ЛПС также обнаруживалась после прекондиционирования с БТШ70 (Aneja et al., 2006; Wheeler et al., 2009).

Таким образом, накопленные данные свидетельствуют о том, что внеклеточный БТШ70, даже в низкой концентрации, может эффективно защищать нейтрофилы от ЛПС-индуцированной продукции АФК (рис. 1, I и II). Используемые препараты БТШ70 осуществляют свое защитное действие с очень быстрой кинетикой, что позволяет их считать многообещающими антисептическими агентами.

В работе было показано, что при обработке клеток БТШ70 экспрессия CD1 lb в мембране нейтрофилов практически не меняется (рис. 2), тогда как ЛПС-индуциро ванные уровни этих рецепторов снижаются вследствие профилактической обработки БТШ70.

Эндотоксины усиливают экспрессию р2-интегриновых рецепторов (CD1 lb/CD18), которые обладают специфическим сайтом связывания ЛПС (Wesche-Soldato et al., 2007). Эти рецепторы, а также рецепторы CD 14 способствуют передаче эндотоксинов от лиганд-связывающего домена к Толл-подобным рецепторам клеток-мишеней. Исследование взаимодействия различных БТШ с CD] lb рецепторами показало, что эти рецепторы связывают также БТШ70 (Binder et al., 2000). После взаимодействия БТШ70 с рецепторами, как и в случае

молекул ЛПС, связанных с рецепторным комплексом эндотоксинов, происходит их интернализация в клетку. Возможно, эти процессы ответственны за неполное ингибирование эндотоксин-индуцированной экспрессии CDllb рецепторов в экспериментах с экзогенными препаратами БТШ70. Снижение ЛПС-индуцированной продукции АФК и экспрессии рецепторов адгезии после обработки нейтрофилов с БТШ70 может служить признаком взаимосвязи между этим белком и рецепторами эндотоксинов. При сепсисе наблюдается повышенная экспрессия различных белков теплового шока, включая БТШ70 (Hashiguchi et al., 2001). Данные об усилении экспрессии БТШ70 и TLR4 в липидных микродоменах миелоидных клеток под действием эндотоксинов (Cuschieri et al., 2006) подкрепляют нашу гипотезу.

Активация нейтрофилов эндотоксинами in vitro демонстрирует всю совокупность функциональных ответов, включая ингибирование апоптоза, в результате чего увеличивается время жизни нейтрофилов, что приводит к повреждению тканей и усилению воспаления (Hofman, 2004). Мы показали, что исследуемые препараты БТШ70 (рекомбинантный и выделенный из сердечной мышцы верблюда) частично нормализуют апоптоз нейтрофилов, ингибированный в ответ на введение ЛПС. Надо заметить, что ранее Zheng и Kettritz использовали повышение температуры (тепловой шок) для индукции синтеза БТШ в нейтрофилах и предотвращения подавления апоптоза, вызванного введением эндотоксина (Zheng et al., 2004; Kettritz et al., 2006).

Таким образом, наши данные указывают на то, что прекондиционирование с БТШ70 более эффективно обеспечивает защиту нейтрофилов от ЛПС-индуцированной продукции АФК, чем от эндотоксин-индуцированной задержки апоптоза (рис. 3). Это не удивительно, если учесть, что механизмы, лежащие в основе ЛПС-индуцированной генерации АФК в нейтрофилах и регуляции апоптоза этих клеток различны (Alvarado-Kristensson et al., 2002).

Еще одним отличительным признаком действия бактериальных эндотоксинов является увеличение экспрессии индуцибельной формы NO-синтазы в различных миелоидных клетках, включая макрофаги. ЛПС, действуя через TLR4, вызывает активацию ядерного транскрипционного фактора NF-kB с последующим усилением транскрипции NO-синтазы и продукции TNF-a, а также других провоспалительных цитокинов (Zhang, Ghosh, 2000).

Необходимо подчеркнуть, что защита, обеспечиваемая воздействием БТШ70, не являлась следствием загрязнения используемых препаратов эндотоксином. Как и авторы других исследований (Aneja et al., 2006), мы провели несколько экспериментов, чтобы исключить контаминацию с ЛПС, включая кипячение препаратов БТШ70 и использование полимиксина В.

В работе нами были выявлены белки, синтез которых изменялся в ответ на тепловой шок, введение экзогенного БТШ70 или эндотоксина. Эти белки играют, по-видимому, различные, в некоторых случаях противоположные, роли в клетке при стрессе. При этом, по изменению характера их экспрессии видно, что предварительное введение экзогенного БТШ70 до обработки макрофагов ЛПС, оказывает заметный эффект на молекулярном уровне.

Большая часть обнаруженных белков, а именно Hspdl, Dpysl2, Enol, Anxa5, относятся к семействам, экспрессия которых изменяется при различных видах стресса и чаще всего фигурируют в протеомных исследованиях (Petrak et al., 2008). Также к общестрессовым белкам можно отнести белки теплового шока Grp94 и Trapl.

В клетке белки теплового шока из разных семейств, участвуя в различных сигнальных путях, могут по-разному реагировать на стресс, что отражено и в наших результатах. Так, митохондриальный БТШ60 (Hspdl), в основном, экспрессировался в пробах, которые подвергали ТШ. При этом известно, что он играет проапоптотическую роль (Samali et al., 1999), обеспечивая активацию прокаспазы-3 (превращение в каспазу 3). В то же время, обнаруженный в эксперименте белок Grp94, расположенный в эндоплазматическом ретикулуме, как по литературных данным (Melnick et al., 1992), так и в нашем эксперименте, не увеличивал уровень экспрессии в ответ на тепловой шок. Известно, что при стрессе этот белок может выходить во внеклеточное пространство, выполняя иммунорегуляторную роль (Calderwood et al., 2007), с чем вероятно связано уменьшение его количества в клетке. Grp94 индуцируется в значительных количествах при введении ЛПС, но, что интересно, снижается при комбинированном воздействии БТШ70 и ЛПС. Интересным белком, обнаруженным в данном эксперименте, является Trapl, или митохондриальный БТШ75. Он значительно индуцировался при введении эндотоксина, а при прекондиционировании с БТШ70 перед ЛПС экспрессия снижалась. Причем, такая зависимость наблюдалась как при нормальной температуре, так и при ТШ. Усиление экспрессии данного белка хорошо согласуется с данными о том, что этот белок защищает клетки от окислительного стресса и апоптоза, вызванного различными воздействиями (Gesualdi et al., 2007).

Белок, демонстрирующий наибольшую индукцию при комбинированной обработке клеток с БТШ70 и ЛПС, Annexin А5, как известно, оказывает на клетки антивоспалительное действие. Этот белок функционирует как вспомогательное вещество, эффективно влияя на поглощение апоптотических и некротических клеток макрофагами (Muñoz et al., 2007).

На введение эндотоксина в различных комбинациях, а также в ответ на ТШ индуцируется белок hnRNP К, который вовлечен в регулирование множества процессов, связанных с экспрессией различных генов. Этот белок служит «стыковочной платформой» для взаимодействия многих сигнальных каскадов (Bomsztyk et al., 2004).

В макрофагах, стимулированных эндотоксином в различных комбинациях с БТШ70 и ТШ, была отмечена значительная индукция белка Sqstml. Его увеличение на введение ЛПС отмечалось и ранее (Swearingen et al., 2010). Известно, что Sqstml может ослаблять NF-kB-зависимую экспрессию провоспалительных цитокинов в макрофагах, предупреждая чрезмерный воспалительный ответ. Его экспрессия значительно увеличивается в INF/TLR стимулированных макрофагах (Kim, Ozato, 2009).

Один из обнаруженных белков, Dpysl2, участвует в реорганизации цитоскелета клеток, регулируя их миграцию (Vuaillat et al., 2008). Его экспрессия зависит от активности клетки.

Enol - это мультифункциональный белок, который впервые был охарактеризован как фермент гликолитического пути и обладает регуляторной ролью при разных видах стресса. Так Enol считается стрессовым белком при гипоксии и тепловом шоке (Petrak et al., 2008), что было показано и в нашей работе, так как мы наблюдали значительную индукцию этого белка в ответ на ТШ. Было также показано, что ЛПС может активировать киназы МАРК семейства, включая ERK 1/2, которые вовлечены в экспрессию мРНК енолазы 1. В ЛПС-стимулированных макрофагах нами наблюдалось повышение экспрессии Enol, что согласуется с литературными данными (Saba et al., 2007). Интересно, что в ЛПС-стимулированных моноцитах наблюдается быстрая транслокация Enol к клеточной поверхности, что приводит к локальному накоплению плазмина и, в результате, к миграции клеток к месту воспаления (Wygrecka et al., 2009).

Таким образом, очевидно, что молекулярные механизмы защитного действия БТШ70 затрагивают различные сигнальные пути в клетке, а потому очень сложны и требуют более глубокого изучения. В связи с этим мы планируем продолжить работу в этом направлении и, во-первых, проследить поведение экзогенного внеклеточного БТШ70, меченного флуоресцентным красителем (Alexa) при введении его в культуры миелоидных клеток. Во-вторых, провести всесторонний анализ как протеомов других культур миелоидных клеток, так и их транскриптомов, чтобы определить на каком уровне происходит изменение экспрессии обнаруженных белков. В дальнейшем это поможет понять молекулярные механизмы защитного влияния БТШ70 на миелоидные клетки и организм в целом при действии бактериального эндотоксина.

выводы

1. На клеточном уровне нрекондиционирование с экзогенным БТШ70 значительно ингибирует эндотоксин-индуцированную продукцию активных форм кислорода в нейтрофилах.

2. Предварительное воздействие БТШ70 снижает экспрессию 02-интегриновых рецепторов нейтрофилов, индуцированную липополисахаридом.

3. На основании данных по снижению эндотоксин-индуцированной продукции активных форм кислорода и экспрессии рецепторов адгезии в результате предварительной обработки БТШ70, можно предположить, что механизмы, лежащие в основе защитного действия этого белка, реализуются на уровне мембранных рецепторных комплексов миелоидных клеток.

4. Предварительное инкубирование с БТШ70 эффективно снижает липополисахарид-индуцируемую задержку апоптоза нейтрофилов.

5. Предварительная обработка макрофагов экзогенным БТШ70, а также воздействие на них теплового шока, сходным образом снижают возрастающую после введения липополисахарида продукцию N0.

6. На основании протеомного анализа показано, что прекондиционирование макрофагов экзогенным БТШ70 и тепловым шоком до введения эндотоксина, оказывает заметный эффект на молекулярном уровне, затрагивая различные сигнальные пути.

7. Предварительное введение рекомбинантного человеческого БТШ70, экспрессированного в клетках Зрос1ор1ега, эффективно защищает крыс, значительно снижая их смертность при моделировании грамотрицательного сепсиса.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Юринская М.М., Винокуров М.Г., Зацепина О.Г., Гарбуз Д.Г., Гужова И.В., Рожкова Е.А., Сусликов А.В., Карпов В.Л., Евгеньев М.Б. Экзогенные белки теплового шока БТШ70 подавляют эндотоксин-индуцированную активацию нейтрофилов человека. Докл. Академии наук, 2009, Т. 426, № 3, стр. 406-409.

2. Остров В.Ф., Слащёва Г.А., Жармухамедова Т.Ю., Рожкова Е.А.. Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Влияние человеческого рекомбинантного и бычьего белков теплового шока (70 кДа) на гемодинамику и гемостаз при эндотоксиновом шоке у крыс. Докл. Академии Наук, 2009, Т. 429, №5, стр. 691-693.

3. Rozhkova Е, Yurinskaya М, Zatsepina О, Garbuz D, Karpov V, Surkov S, Murashev A, Ostrov V, Margulis B, Evgen'ev M, Vinokurov M. Exogenous mammalian extracellular HSP70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels. AnnNY Acad Sci. 2010; 1197: 94-107.

Тезисы конференций

• Evgen'ev M.B., Vinokurov M.G., Yurinskaya M.M., Kustanova G.I., Karpov V.L., Zatsepina O.G., Rozhkova E.A.. Murashev A.N. Exogenous heat shock protein mediates sepsis manifestation in rats. Abstracts of the 13th Congress of the International Association of Biomedical Gerontology: "Aging, cancer and age-related diseases; common mechanisms?" Quebec, Canada, May 18-20 2009, IABG-51.

• Юринская M.M., Винокуров М.Г., Зацепина О.Г., Гарбуз Д.Г., Гужова И.В., Рожкова Е.А.. Евгеньев М.Б. Действие рекомбинантного белка теплового шока HSP70 на активацию нейтрофилов человека при действии эндотоксина. Сборник статей международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 2-4 июня 2009 г. Т. 2, стр. 507511.

• Рожкова Е.А.. Юринская М.М., Зацепина О.Г., Гарбуз Д.Г., Мурашев А.Н., Остров В.Ф., Маргулис Б.А., Винокуров М.Г., Евгеньев М.Б., Экзогенный внеклеточный БТШ70 млекопитающих ослабляет проявления сепсиса на уровне клетки и организма. 14-я международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 19-23 апреля 2010 г. Сборник тезисов, Т. 1, стр. 170-171.

• Рожкова Е.А., Юринская М.М., Зацепина О.Г., Гарбуз Д.Г., Мурашев А.Н., Остров В.Ф., Маргулис Б.А., Евгеньев М.Б., Винокуров М.Г. Влияние экзогенного внеклеточного БТШ70 млекопитающих на проявления ЛПС-индуцированного сепсиса на уровне клеток и организма. XXI съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Калуга, 19-25 сентября 2010г. Тезисы докладов, стр. 519.

Заказ № 223-аЛ0/10 Подписано в печать 28.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 )) www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рожкова, Елена Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Определение и эпидемиология сепсиса.

1.2. Клетки врожденной иммунной системы и пути их взаимодействия с патогенами

1.3. Липополисахарид грамотрицательных бактерий и его роль в развитии сепсиса.

1.3.1. Строение молекулы липополисахарида и его формы.

1.3.2. Взаимодействие бактериального эндотоксина с рецепторами клеток врожденной иммунной системы.

1.3.3. Сигнальные каскады, запускаемые после узнавания ЛПС.

1.4. Характеристика семейства БТШ70.

1.5. Использование БТШ70 в медицине.

1.6. Роль БТШ70 при воспалении и эндотоксемии.

1.6.1. Действие эндогенного внутриклеточного БТШ70 при воспалении.

1.6.2. Действие внеклеточного БТШ70 при воспалении.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Выделение нейтрофилов из периферической крови человека.

2.1.1.1. Определение жизнеспособности нейтрофилов.

2.1.1.2. Морфологический контроль клеток.

2.1.2. Ведение культуры клеток мышиных макрофагов .1774.

2.1.3. Содержание животных.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение белков.

2.2.1.1. Выделение БТШ70 из сердечной мышцы верблюда.

2.2.1.2. Экспрессия и очистка рекомбинантного БТШ70.

2.2.2. Регистрация образования АФК нейтрофилами с помощью хемилюминесцентного метода.

2.2.3. Регистрация апоптоза нейтрофилов.

2.2.3.1. Культивирование нейтрофилов для определения апоптоза.

2.2.3.2. Окрашивание клеток флуоресцентным зондом НоесЬз1-33258.

2.2.4. Регистрация экспрессии р2-интегриновых рецепторов нейтрофилов.

2.2.5. Измерение продукции оксида азота макрофагами (3774).

2.2.6. Диск-электрофорез белков в ПААГ с ДЦС-Иа (по Лэммли).

2.2.6.1. Окрашивание гелей «Кумасси 11-250».

2.2.7. Двумерный электрофорез белков по О'Фарреллу.

2.2.7.1.Подготовка проб к двумерному электрофорезу.

2.2.7.2. Включение 338-метионина в белки.

2.2.7.3. Двумерное разделение белков в ПААГ.

2.2.7.4. Идентификация белков методом пептидного фингерпринта.

2.2.7.5. Подсчёт общего включения 358-метионина в белки.

2.2.8. Моделирование экспериментального грамотрицательного сепсиса у крыс.

2.2.9. Определение шаперонной активности БТШ70 методом ИФА.

2.2.10. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование влияния рБТШ70 на выживаемость крыс в модели экспериментального грамотрицательного сепсиса.

3.2. Сравнение шаперонной активности БТШ70 млекопитающих из разных объектов

3.3. Прекондиционирование с БТШ70 ослабляет ЛПС-индуцированный воспалительный ответ на клеточном уровне.

3.4. Прекондиционирование с БТШ70 значительно модифицирует ЛПС-индуцированную экспрессию Рг-интегриновых рецепторов нейтрофилов.

3.5. Предварительная обработка БТШ70 частично нормализует апоптоз нейтрофилов.

3.6. Прекондиционирование с препаратами БТШ70 ингибирует продукцию N0.

3.7. Повышение температуры (ТШ) и экзогенный БТШ70 сходным образом ингибируют ЛПС-индуцированную продукцию N0.

3.8. Анализ протеома клеток 1774 при комбинированной обработке рБТШ70, ЛПС и

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль основного стрессового белка млекопитающих (БТШ70) в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина"

В настоящее время сепсис является одной из наиболее сложных проблем медицины. Так, в США и странах Европы сепсис ежегодно диагностируется у 700 ООО пациентов, причем число подтвержденных случаев растет на 1,5% в год (Riedemann et al., 2003а). Несмотря на огромное число работ, посвященных этому вопросу, и значительные успехи в области выяснения механизмов развития, сепсис, а также его осложнение, септический шок, остаются главной причиной смерти в палатах интенсивной терапии (Cross and Opal, 2003) и занимают 13-е место среди всех причин смертности в США (Parrillo, 1993). По данным за последние десятилетия госпитальная смертность от сепсиса варьирует от 25 до 80% (Angus and Wax, 2001). При этом, сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями, встречается в 45-60% случаев от общего числа заболевших и в 65-70% случаев становится причиной эндотоксинового шока (Bone, 1995), в патогенезе которого ключевая роль принадлежит липополисахаридам (Rietschel et al., 1994).

Эндотоксины (липополисахариды, ЛПС) — это компоненты бактериальной стенки, играющие основную роль в инициировании ответа организма на вторжение грамотрицательных бактерий. В* случае массивного попадания бактерий в организм происходит активация, клеток-мишеней эндотоксинами, что вызывает синтез провоспалительных цитокинов; обладающих ауто- и паракринным действием. Высвободившиеся свободно циркулирующие цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, что, в конечном итоге, приводит к развитию эндотоксинового шока (Rietschel et al., 1996).

Основными, стрессовыми белками у многих организмов, включая млекопитающих, являются белки теплового шока (БТШ), в частности БТШ70, интенсивный синтез которого индуцируется в клетке самыми разными стрессовыми агентами (Lindquist and Craig, 1988; Welch, 1993). В последние годы появилось много данных о том, что БТШ70 могут находиться во внеклеточном пространстве, функционируя как специализированные сигнальные молекулы — цитокины (Asea et al., 2000а). Появление внеклеточного БТШ70 вызывает активацию различных звеньев иммунной системы, воспринимаясь ею как сигнал «опасности». Это приводит к усилению продукции цитокинов, повышению скорости фагоцитоза и активации системы комплемента, что увеличивает его потенциал, как противовоспалительного фактора (Евдонин и Медведева, 2009). Следует отметить, что данные эффекты вызывает как БТШ70, высвобождаемый из клеток во внеклеточное пространство, так и добавленный экзогенный белок (Zheng et al., 2010).

В работах на крысах, ранее выполненных нами совместно с центром по испытанию лекарственных препаратов < в г. Пущино, было показано, что предварительное введение БТШ70, выделенного из мышцы быка, до введения ЛПС оказывает защитное действие, снижая смертность животных и влияя на параметры их гемостаза и гемодинамики (Kustanova et al., 2006). Было важно повторить эти эксперименты не только на модельных животных, но и на различных типах клеток, используя чистый рекомбинантный человеческий БТШ70, наработанный в экспрессионной системе в клетках насекомых (Spodoptera frugiperda). Для лучшего понимания процессов, происходящих в клетке, было необходимо выявить молекулярные механизмы, действия экзогенного БТШ70, и показать, что данный препарат обладает значительным антисептическим эффектом, не зависящим от контаминации белка ЛПС.

Известно, что в воспалительном ответе на ЛПС-индуцированный бактериальный-сепсис ключевую роль играют нейтрофилы (Alves-Filho et al., 2008). ЛПС праймирование нейтрофилов вызывает усиление продукции активных форм кислорода (АФК) и экспрессию Рг-интегриновых рецепторов (Andrades et al., 2009; Detmers et al., 1998). Кроме того, под действием эндотоксинов происходит ингибирование апоптоза этих клеток, что препятствует эффективному клиренсу нейтрофилов и становится причиной повреждения тканей при воспалении. В настоящее время, направленная регуляция апоптоза нейтрофилов. рассматривается, как возможный терапевтический подход к лечению ряда воспалительных заболеваний, в том числе и сепсиса (Wesche-Soldato et al., 2007).

Большая часть исследований по защитной роли БТШ70 против действия ЛПС проводилась с использованием рекомбинантного человеческого белка, экспрессированного в Е. coli, а потому зачастую загрязненного бактериальными эндотоксинами (Tsan and Gao, 2009). Было важно проанализировать препараты БТШ70 млекопитающих различного происхождения на возможные антисептические эффекты. Для сравнения выбрали рекомбинантный человеческий индуцибельный БТШ70 (рБТШ70), экспрессированный в клетках Spodoptera и белок, выделенный из сердечной мышцы верблюда, ткани, имеющей высокую концентрацию БТШ70. В обоих случаях был показан явный защитный эффект БТШ70 на активацию и апоптоз нейтрофилов человека при введении ЛПС из Е. coli. Мы исследовали также возможные антисептические эффекты БТШ70 на макрофагах, чтобы определить, насколько специфично действие данного белка. Для лучшего понимания процессов, лежащих в основе защитного действия БТШ70 при ЛПС-индуцированном сепсисе, было необходимо изучить, что происходит в клетках на молекулярном уровне. Для этого мы сравнили белковые паттерны макрофагов при комбинированном воздействии теплового шока, введения рБТШ70 и ЛПС. Мы обнаружили и идентифицировали ряд белков, изменяющих свою экспрессию в ответ на данные воздействия.

Целью данной работы являлось изучение роли препаратов БТШ70 млекопитающих в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина (ЛПС). Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

2. Исследовать влияние экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердечной мышцы верблюда) на функциональные ответы нейтрофилов, вызываемые действием эндотоксина из Е. coli (ЛПС), а именно на: а) генерацию активных форм кислорода; б) экспрессию р2-интегриновых рецепторов; в) апоптоз.

3. Исследовать влияние препаратов БТШ70 и ЛПС на продукцию N0 макрофагами.

4. Изучить воздействие комбинированной обработки макрофагов тепловым шоком (ТШ) и ЛПС на продукцию N0.

Научная новизна. Впервые показан на клеточном уровне защитный эффект экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердечной мышцы верблюда) при действии эндотоксина. Установлено, что предварительное введение БТШ70 снижает генерацию АФК в различных типах миелоидных клеток, нормализует апоптоз нейтрофилов, ингибируемый при их стимуляции ЛПС, снижает ЛПС-индуцированный уровень экспрессии р2-интегриновых рецепторов нейтрофилов. Идентифицированы белки, изменяющие свою экспрессию в ответ на комбинированную обработку высокой температурой (ТШ), БТШ70 и ЛПС, что расширяет наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе антисептической роли БТШ70 при эндотоксемии.

Практическая ценность. Полученные в ходе исследований результаты демонстрируют важную роль внеклеточного БТШ70 млекопитающих в модуляции врожденного иммунитета, что позволит в будущем использовать этот белок для создания на его основе эффективных противовоспалительных лекарств.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Предварительное введение экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердечной мышцы верблюда) оказывает защитный эффект, влияя на функциональные ответы и апоптоз нейтрофилов при действии ЛПС из Е. соП.

3. Прекондиционирование макрофагов с препаратами БТШ70 снижает ЛПС-индуцированную продукцию N0.

4. Предварительная обработка макрофагов ТШ снижает продукцию N0, обусловленную действием ЛПС.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рожкова, Елена Александровна

выводы

1. На клеточном уровне прекондиционирование с экзогенным БТШ70 значительно ингибирует эндотоксин-индуцированную продукцию активных форм кислорода в нейтро филах.

2. Предварительное воздействие БТШ70 снижает экспрессию Рг-интегриновых рецепторов нейтрофилов, индуцированную липополисахаридом.

7. Предварительное введение рекомбинантного человеческого БТШ70, экспрессированного в клетках Еройор1егаь эффективно защищает крыс, значительно снижая их смертность при моделировании грамотрицательного сепсиса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рожкова, Елена Александровна, Москва

1. Брюсов П. Г., Костюченко А. Л. (1997). Воен-мед. Журнал 3, 28-34.

2. Винокуров М. Г., Юринская М. М., Прохоренко И. Р., Грачев С. В. (2006). Действие различных хемотипов липополисахарида Е. coli на апоптоз и активацию PMN человека. Бюлл. эксп. биол. и мед. 147(8), 136-138.

3. Владимиров Ю. А., Шерстнёв М. Р. (1989). Итоги науки и техники. Биофизика. М. ВИНИТИ 24, 176 С.

4. Евдонин А. Л., Медведева Н. Д. (2009). Внеклеточный белок теплового шока 70 и его функции. Цитология 51(2), 130 137.

5. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., Воробьев A.A. (1992) Эндогенные иммуномодуляторы. СПб.: Гиппократ.

6. Коваленко Е. И., Власкин П. А., Каневский Л. М., Стрельникова Ю. И., Сапожников A.M. (2006). Влияние белков теплового шока 70 кДа на продукцию у интерферона натуральными киллерами человека. Докл. Акад. Наук 406(1), 121 — 124.

7. Козлов В. К. (2006). Сепсис: этиология, иммунопатогенез, концепция современной иммунотерапии. СПб.: Диалект, 304 с.

8. Маргулис Б.А., Гужова И.В. (2000). Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология 42(4), 323 342.

9. Мурашев А. Н., Медведев О. С., Давыдова С. А. Руководство по экспериментальной физиологии кровообращения. Саратов, 1992. -47 с.

10. Новоселов С. С., Новоселова Т. В., Москалева О. С., Маргулис Б. А., Гужова И. В. (2004). Динамика шаперонных комплексов Hsp70 с белками-помощниками Hdj 1 и Bag 1 в реакции клеток эритролейкемии человека К562 на тепловой стресс. Цитология 46(7), 620-627.

11. Пастухов Ю. Ф., Екимова И. В. (2005). Молекулярные, клеточные и системные механизмы протективной функции белка теплового шока 70 кДа. Молекулярная и клеточная нейробиология 2(2), 3-25.

12. Afanasyev, V. N., Korol, В. A., Matylevich, N. P., Pechatnikov, V. A., and Umansky, S. R. (1993). The use of flow cytometry for the investigation of cell death. Cytometry 14, 603-609.

13. Akira, S., and Takeda, K. (2004). Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol 4, 499-511.

14. Akira, S., Uematsu, S., and Takeuchi, 0. (2006). Pathogen recognition and innate immunity. Cell 124,783-801.

15. Alves-Filho, J. C., de Freitas, A., Spiller, F., Souto, F. O., and Cunha, F. Q. (2008). The role of neutrophils in severe sepsis. Shock 30 Suppl 1, 3-9.

16. Andra, J., Gutsmann, T., Garidel, P., and Brandenburg, K. (2006). Mechanisms of endotoxin neutralization by synthetic cationic compounds. J Endotoxin Res 12, 261-277.

17. Andrades, M. E., Ritter, C., and Dal-Pizzol, F. (2009). The role of free radicals in sepsis development. Front Biosci (Elite Ed) 1, 277-287.

18. Aneja, R., Odoms, K., Dunsmore, K., Shanley, T. P., and Wong, H. R. (2006). Extracellular heat shock protein-70 induces endotoxin tolerance in THP-1 cells. J Immunol 177, 7184-7192.

19. Angus, D. C., and Wax, R. S. (2001). Epidemiology of sepsis: an update. Crit Care Med 29, S109-116.

20. Anwar, S., and Whyte, M. K. (2007). Neutrophil apoptosis in infectious disease. Exp Lung Res 33, 519-528.

21. Asea, A. (2003). Chaperokine-induced signal transduction pathways. Exerc Immunol Rev 9, 25-33.

22. Asea, A., Kabingu, E., Stevenson, M. A., and Calderwood, S.' K. (2000a). HSP70 peptidembearing and peptide-negative preparations act as chaperokines. Cell Stress Chaperones 5,425-431.

23. Basu, S., Binder, R. J., Ramalingam, T., and Srivastava, P. K. (2001). CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. Immunity 14, 303

24. Bausero, M. A., Gastpar, R., Multhoff, G., and Asea, A. (2005). Alternative mechanism by which IFN-gamma enhances tumor recognition: active release of heat shock protein 72. J Immunol 175, 2900-2912.

25. Becker, T., Hartl, F. U., and Wieland, F. (2002). CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. J Cell Biol 158, 1277-1285.

26. Benjamini E., Sunshine G., Leskowitz S. (1996) Immunology, a short course. WILEYLISS, New York, 451.

27. Beutler, B., Hoebe, K., Du, X., and Ulevitch, R. J. (2003). How we detect microbes and respond to them: the Toll-like receptors and their transducers. J Leukoc Biol 74, 479485.

28. Beutler, B., Jiang, Z., Georgel, P., Crozat, K., Croker, B., Rutschmann, S., Du, X., and Hoebe, K. (2006). Genetic analysis of host resistance: Toll-like receptor signaling and immunity at large. Annu Rev Immunol 24, 353-389.

29. Binder, R. J., Harris, M. L., Menoret, A., and Srivastava, P. K. (2000). Saturation, competition, and specificity in interaction of heat shock proteins (hsp)-gp96, hsp90, and hsp70 with CDllb+ cells. J Immunol 165, 2582-2587.

30. Blachere, N. E., Udono, H., Janetzki, S., Li, Z., Heike, M., and Srivastava, P. K. (1993). Heat shock protein vaccines against cancer. J Immunother Emphasis Tumor Immunol 14, 352-356.

31. Bomsztyk, K., Denisenko, O., and Ostrowski, J. (2004). hnRNP K: one protein multiple processes. Bioessays 26, 629-638.

32. Bone, R. C. (1995). Sepsis and controlled clinical trials: the odyssey. Crit Care Med 23, 11651166.

33. Brandenburg, K., and Wiese, A. (2004). Endotoxins: relationships between structure, function, and activity. Curr Top Med Chem 4, 1127-1146.

34. Brodsky, J. L., and Chiosis, G. (2006). Hsp70 molecular chaperones: emerging roles in human disease and identification of small molecule modulators. Curr Top Med' Chem 6, 1215-1225.

35. Broquet, A. H., Thomas, G., Masliah, J., Trugnan, G., and Bachelet, M. (2003). Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release. J Biol Chem 278, 21601-21606.

36. Brown, G. D. (2006). Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6, 33-43.

37. Bruemmer-Smith, S., Stuber, F., and Schroeder, S. (2001). Protective functions of intracellular heat-shock protein (HSP) 70-expression in patients with severe sepsis. Intensive Care Med 27, 1835-1841.

38. Burchardi, H., and Schneider, H. (2004). Economic aspects of severe sepsis: a review of intensive care unit costs, cost of illness and cost effectiveness of therapy. Pharmacoeconomics 22, 793-813.

39. Calderwood, S. K., Mambula, S. S., and Gray, P. J., Jr. (2007a). Extracellular heat shock proteins in cell signaling and immunity. AnnN Y Acad Sci 1113, 28-39.

40. Calderwood, S. K., Theriault, J., Gray, P. J., and Gong, J. (2007b). Cell surface receptors for molecular chaperones. Methods 43, 199-206.

41. Campisi, J., and Fleshner, M. (2003). Role of extracellular HSP72 in acute stress-induced potentiation of innate immunity in active rats. J Appl Physiol 94, 43-52.

42. Campisi, J., Leem, T. H., and Fleshner, M. (2003). Stress-induced extracellular Hsp72 is a functionally significant danger signal to the immune system. Cell Stress Chaperones 8, 272-286.

43. Caroff, M., and Karibian, D. (2003). Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydr Res 338, 2431-2447.

44. Carper, S. W., Duffy, J. J., and Gerner, E. W. (1987). Heat shock proteins in thermotolerance and other cellular processes. Cancer Res 47, 5249-5255.

45. Chang, L., and Karin, M. (2001). Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature 410, 37-40.

46. Chen, H., Wu, Y., Zhang, Y., Jin, L., Luo, L., Xue, B., Lu, C., Zhang, X., and Yin, Z. (2006). Hsp70 inhibits lipopolysaccharide-induced NF-kappaB activation by interacting with TRAF6 and inhibiting its ubiquitination. FEBS Lett 580, 3145-3152.

47. Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., and Tabi, Z. (2005). Induction of heat shock proteins inB-cell exosomes. J Cell Sci 118, 3631-3638.

48. Corradin, S. B., Mauel, J., Gallay, P., Heumann, D., Ulevitch, R. J., and Tobias, P. S. (1992). Enhancement of murine macrophage binding of and response to bacterial lipopolysaccharide (LPS) by LPS-binding protein. J Leukoc Biol 52, 363-368.

49. Cross, A. S., and Opal, S. M. (2003). A new paradigm for the treatment of sepsis: is it time to consider combination therapy? Ann Intern Med 138, 502-505.

50. Currie, R. W., Karmazyn, M., Kloc, M., and Mailer, K. (1988). Heat-shock response is associated with enhanced postischemic ventricular recovery. Circ Res 63, 543-549.

51. Cuschieri, J., Billigren, J., and Maier, R. V. (2006). Endotoxin tolerance attenuates LPS-induced TLR4 mobilization to lipid rafts: a condition reversed by PKC activation. J Leukoc Biol 80, 1289-1297.

52. Deguchi, Y., and Kishimoto, S. (1990). Spontaneous activation of heat shock protein gene transcription in peripheral blood mononuclear cells of individuals with active systemic lupus erythematosus. Clin Rheumatol 9, 182-185.

53. Dokladny, K., Lobb, R., Wharton, W., Ma, T. Y., and -Moseley, P. L. (2010). LPS-induced ' cytokine levels are repressed by elevated'expression of HSP70 in rats: possible role of NF-kappaB. Cell Stress Chaperones 15, 153-163.

54. Ensor, J. E., Wiener, S. M., McCrea, K. A., Yiscardi, R. M., Crawford, E. K., and Hasday, J. D. (1994). Differential effects of hyperthermia on macrophage interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha expression. Am J Physiol 266, C967-974.

55. Fleshner, M., Campisi, J., Amiri, L., and Diamond, D. M. (2004). Cat exposure induces both intra- and extracellular Hsp72: the role of adrenal hormones. Psychoneuroendocrinology 29, 1142-1152.

56. Floto, R. A., MacAry, P. A., Boname, J. M., Mien, T. S., Kampmann, B., Hair, J. R., Huey, O. S., Houben, E. N., Pieters, J., Day, C., et al. (2006). Dendritic cell stimulation by mycobacterial Hsp70 is mediated through CCR5. Science 314,.454-458.

57. Freeman, B. C., and Morimoto, R. I. (1996). The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native proteinand protein refolding. EMBO J 15, 2969-2979.

58. Freudenberg, N., Freudenberg, M. A., Guzman, J., Mittermayer, C., Bandara, K., and Galanos, C. (1984). Identification of endotoxin-positive cells in the rat lung during shock. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 404, 197-211.

59. Frydman, J. (2001). Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu Rev Biochem 70, 603-647.

60. Fujihara, M., Muroi, M., Tanamoto, K., Suzuki, T., Azuma, H., and Ikeda, H. (2003). Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by lipopolysaccharide: roles of the receptor complex. Pharmacol Ther 100, 171-194.

61. Fujihara, Y., Bogard, W. C., Lei, M. G., Daddona, P. E., and Morrison, D. C. (1993). Monoclonal anti-lipid A IgM'antibodies HA-1A and E-5 recognize distinct epitopes on lipopolysaccharide and lipid A. J Infect Dis 168; 1429-1435.

62. Gebauer, M., Zeiner, M., and Gehring, U. (1998). Interference between proteins Hap46 and Hop/p60, which bind to different domains of the molecular chaperone hsp70/hsc70. Mol Cell Biol 18, 6238-6244.

63. Ghosh, S., May, Mc. J., and Kopp, E. B. (1998). NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol 16, 225-260.

64. Guzhova, I., Kislyakova, K., Moskaliova, O., Fridlanskaya, I., Tytell, M:, Cheetham, M., and

65. Margulis, В. (2001). In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res 914, 66-73.

66. Guzhova, I., and Margulis, B. (2006). Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int Rev Cytol 254, 101-149.

67. Hagiwara, S., Iwasaka, H., Matsumoto, S., and Noguchi, T. (2007). Changes in cell culture temperature alter release of inflammatory mediators in murine macrophagic RAW264.7 cells. Inflamm Res 56, 297-303.

68. Hamilton, K. L., Gupta, S., and Knowlton, A. A. (2004). Estrogen and regulation of heat shock protein expression in female cardiomyocytes: cross-talk with NF kappa В signaling. J Mol Cell Cardiol 36, 577-584.

69. Hampton, R. Y., Golenbock, D. Т., Penman, M., Krieger, M., and Raetz, C. R. (1991). Recognition and plasma clearance of endotoxin by scavenger receptors. Nature 352, 342-344.

70. Hashimoto, C., Hudson, K. L., and Anderson, К. V. (1988). The Toll gene of Drosophila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein. Cell 52, 269-279.

71. Haurum, J. S., Thiel, S., Jones, I. M., Fischer, P. В., Laursen, S. В., and Jensenius, J. C. (1993). Complement activation upon binding of mannan-binding protein to HIV envelope glycoproteins. AIDS 7, 1307-1313.

72. He, H., Chen, C., Xie, Y., Asea, A., and Calderwood, S. K. (2000). HSP70 and heat shock factor 1 cooperate to repress Ras-induced transcriptional activation of the c-fos gene. Cell Stress Chaperones 5, 406-411.

73. Herlaar, E., and Brown, Z. (1999). p38 МАРК signalling cascades in inflammatory disease. MoliMed Today 5, 439-447.

74. Hofrnan, P. (2004). Molecular regulation of neutrophil apoptosis and potential targets for therapeutic strategy against the inflammatory process. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 3, 1-9.

75. Horng, T., Barton, G. M., and Medzhitov, R. (2001). TIRAP: an adapter molecule in the Toll ' signaling pathway. Nat Immunol 2, 835-841.

76. Hotchkiss, R., Nunnally, I., Lindquist, S., Taulien, J., Perdrizet, G., and Karl, I. (1993). Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin. Am J Physiol 265, R1447-1457.

77. Huber, M., Kalis, C., Keck, S., Jiang, Z., Georgel, P., Du, X., Shamel, L., Sovath, S., Mudd, S., Beutler, B., et al. (2006). R-form LPS, the master key to the activation ofTLR4/MD-2-positive cells. Eur J Immunol 36, 701-711.

78. Jaattela, M. (1993). Overexpression of major heat shock protein hsp70 inhibits tumor necrosis factor-induced activation of phospholipase A2. J Immunol 151, 4286-4294.

79. Jaattela, M., Wissing, D., Bauer, P. A., and Li, G. C. (1992). Major heat shock protein hsp70 protects tumor cells from tumor necrosis factor cytotoxicity. EMBO J 11, 3507-3512.

80. Janssens, S., and Beyaert, R. (2003). Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clin

81. Microbiol Rev 16, 637-646.

82. Jiang, W., Sun, R., Wei, H., and Tian, Z. (2005a). Toll-like receptor 3 ligand attenuates LPS-induced liver injury by down-regulation of toll-like receptor 4 expression on macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 17077-17082.

83. Jiang, Z., Georgel; P., Du, X., Shamel, L., Sovath, S., Mudd, S., Huber, M., Kalis, C., Keck, S., Galanos, C., et al. (2005b). CD14 is required for MyD88-independent LPS signaling. Nat Immunol 6, 565-570.

84. Kagan, J. C., and Medzhitov, R. (2006). Phosphoinositide-mediated adaptor recruitment controls Toll-like receptor signaling. Cell 125, 943-955.

85. Kantari, C., Pederzoli-Ribeil, M., and Witko-Sarsat, V. (2008). The role of neutrophils and monocytes in innate immunity. Contrib Microbiol 15, 118-146.

86. Keel, M., Ungethum, U., Steckholzer, U., Niederer, E., Hartung, T., Trentz, O., and Ertel, W. (1997). Interleukin-10 counterregulates proinflammatory cytokine-induced inhibition of neutrophil apoptosis during severe sepsis. Blood 90; 3356-3363.

87. Kettritz, R., Choi, M., Salanova, B., Wellner, M., Rolle, S., and Luft, F. C. (2006). Fever-like temperatures affect neutrophil NF-kappaB signaling, apoptosis, and ANCA-antigen expression. J Am Soc Nephrol 17, 1345-1353.

88. Kim, J. Y., and Ozato, K. (2009). The sequestosome l/p62 attenuates cytokine gene expression in activated macrophages by inhibiting IFN regulatory factor 8 and TNF receptor-associated factor 6/NF-kappaB activity. J Immunol 182, 2131-2140.

89. Kim, S., Nollen, E. A., Kitagawa, K., Bindokas, V. P., and Morimoto, R. I. (2002). Polyglutamine protein aggregates are dynamic. Nat Cell Biol 4, 826-831.

90. Kitchens, R. L., Wolfbauer, G., Albers, J. J., and Munford, R. S. (1999). Plasma lipoproteins promote the release of bacterial lipopolysaccharide from the monocyte cell surface. J Biol Chem 274, 34116-34122.

91. Mackey, M. F., Barth, R. J., Jr., and Noelle, R. J. (1998). The role of CD40/CD154 interactions in the priming, differentiation, and effector function of helper and cytotoxic T cells. J Leukoc Biol 63, 418-428.

92. Malhotra, R., and Bird, M. I. (1997). L-Selectin—a signalling receptor for lipopolysaccharide. ChemBiol 4, 543-547.

93. Malhotra, R., Priest, R., and Bird, M. I. (1996). Role for L-selectin in lipopolysaccharide-induced activation of neutrophils. Biochem J 320 ( Pt 2), 589-593.

94. Malhotra, R., Priest, R., Foster, M. R., and Bird, M. I. (1998). P-selectin binds to bacterial lipopolysaccharide. Eur J Immunol 28, 983-988.

95. Mambula, S. S., and Calderwood, S. K. (2006). Heat shock protein 70 is secreted from tumor cells by a nonclassical pathway involving lysosomal endosomes. J Immunol 177, 78497857.

96. Mambula, S. S., Stevenson, M. A., Ogawa, K., and Calderwood, S. K. (2007). Mechanisms for Hsp70 secretion: crossing membranes without a leader. Methods 43, 168-175.

97. Martin, G. S., Mannino, D. M., Eaton, S., and Moss, M. (2003). The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med 348,1546-1554.

98. Matzinger, P. (2002). The danger model: a renewed sense of self. Science 296, 301-305.

99. Mayer, M. P., Brehmer, D., Gassier, C. S., and Bukau, B. (2001). Hsp70 chaperone machines. Adv Protein Chem 59, 1-44.

100. Medzhitov, R. (2001). Toll-like receptors and innate immunity. Nat Rev Immunol 1, 135-145.

101. Medzhitov, R., and Janeway, C. A, Jr. (1997a). Innate immunity: impact on the adaptive immune response. Curr Opin Immunol 9, 4-9.

102. Medzhitov, R., and Janeway, C. A., Jr. (1997b). Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. Cell 91, 295-298.

103. Medzhitov, R., Preston-Hurlburt, P., and Janeway, C. A., Jr. (1997). A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 388, 394397.

104. Mehta, H. B., Popovich, B. K., and Dillmann, W. H. (1988). Ischemia induces changes in the level of mRNAs coding for stress protein 71 and creatine kinase M. Circ Res 63, 512517.

105. Melnick, J., Aviel, S., and Argon, Y. (1992). The endoplasmic reticulum stress protein

106. GRP94, in addition to BiP, associates with unassembled immunoglobulin chains. J Biol Chem 267,21303-21306.

107. Millar, D. G., Garza, K. M., Odermatt, B., Elford, A. R., Ono, N., Li, Z., and Ohashi, P. S. (2003). Hsp70 promotes antigen-presenting cell function and converts T-cell tolerance to autoimmunity in vivo. Nat Med 9,1469-1476.

108. Minota, S., Cameron, B., Welch, W. J., and Winfield, J. B. (1988). Autoantibodies to the constitutive 73-kD member of the hsp70 family of heat shock proteins in systemic lupus erythematosus. J Exp Med 168, 1475-1480.

109. Montesano Gesualdi, N., Chirico, G., Pirozzi, G., Costantino, E., Landriscina, M., and Esposito, F. (2007). Tumor necrosis factor-associated protein 1 (TRAP-1) protects cells from oxidative stress and apoptosis. Stress 10, 342-350.

110. Morimoto, R. I. (1998). Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. Genes Dev 12, 3788-3796.

111. Morimoto R, Tissieres A, Georgopoulos C. (1990) The Stress Response, Function of the Proteins, and Perspectives. Stress Proteins in Biology and Medicine. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1—32.

112. Muchowski, P. J., Schaffar, G., Sittler, A., Wanker, E. E., Hayer-Hartl, M. K., and Hartl, F. U. (2000). Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. ProcNatl Acad SciU S A 97, 7841-7846.

113. Murry, C. E., Jennings, R. B., and Reimer, K. A. (1986). Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation 74, 1124-1136.

114. Nagai, Y., Akashi, S., Nagafuku, M., Ogata, M., Iwakura, Y., Akira, S., Kitamura, T., Kosugi, A., Kimoto, M., and Miyake, K. (2002). Essential role of MD-2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution. Nat Immunol 3, 667-672.

115. Nauseef, W. M. (2007). How human neutrophils kill and degrade microbes: an integrated view. Immunol Rev 219, 88-102.

116. Nelson, R. J., Ziegelhoffer, T., Nicolet, C., Werner-Washburne, M., and Craig, E. A. (1992). The translation machinery and 70 kd heat shock protein cooperate in protein synthesis. Cell 71, 97-105.

117. Neupert, W., Hartl, F. U., Craig, E. A., and Pfanner, N. (1990). How do polypeptides cross the mitochondrial membranes? Cell 63, 447-450.

118. Njemini, R., Lambert, M., Demanet, C., and Mets, T. (2003). Elevated serum heat-shock protein 70 levels in patients with acute infection: use of an optimized enzyme-linked immunosorbent assay. Scand J Immunol 58, 664-669.

119. Nollen, E. A., and Morimoto, R. I. (2002). Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins. J Cell Sci 115, 2809-2816.

120. O'Farrell, P. H. (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250, 4007-4021.

121. O'Neill, L. A., and Bowie, A. G. (2007). The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol7, 353-364.

122. Opal, S. M. (2007). The host response to endotoxin, antilipopolysaccharide strategies, and the management of severe sepsis. Int J Med Microbiol 297, 365-377.

123. Osawa, Y., Lee, H. T., Hirshman, C. A., Xu, D., and Emala, C. W. (2006). Lipopolysaccharide-induced sensitization of adenylyl cyclase activity in murine macrophages. Am J Physiol Cell Physiol 290, C143-151.

124. Pabst, M. J., Pabst, K. M:, Handsman, D. B., Beranova-Giorgianni, S., and Giorgianni, F. (2008). Proteome of monocyte priming by lipopolysaccharide, including changes in interleukin-lbeta and leukocyte elastase inhibitor. Proteome Sci 6, 13.

125. Panjwani, N. N., Popova, L., and Srivastava, P. K. (2002). Heat shock proteins gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs. J Immunol 168, 2997-3003.

126. Parrillo, J. E. (1993). Pathogenetic mechanisms of septic shock. N Engl J Med 328, 14711477.

127. Petrak, J., Ivanek, R., Toman, O., Cmejla, R., Cmejlova, J., Vyoral, D., Zivny, J., and Vulpe, C. D. (2008). Deja vu in proteomics. A hit parade of repeatedly identified differentially expressed proteins. Proteomics 8, 1744-1749.

128. Pierce, S. K. (1994). Molecular chaperones in the processing and presentation of antigen to helper T cells. Experientia 50, 1026-1030.

129. Pockley, A. G., Muthana, M., and Calderwood, S. K. (2008). The dual immunoregulatory roles of stress proteins. Trends Biochem Sci 33, 71-79.

130. Pockley, A. G., Shepherd, J., and Corton, J. M. (1998). Detection of heat shock protein 70 (Hsp70) and anti-Hsp70 antibodies in the serum of normal individuals. Immunol Invest 27, 367-377.

131. Poltorak, A., He, X., Smirnova, I., Liu, M. Y., Van Huffel, C., Du, X., Birdwell, D.,,Alejos, E., Silva, M., Galanos, C., et al. (1998). Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science 282, 2085-2088.

132. Power, C., Fanning, N., and Redmond, H. P. (2002). Cellular apoptosis and organ injury in sepsis: a review. Shock 18, 197-211.

133. Prestes-Carneiro, L. E., Shio, M. T., Fernandes, P. D., and Jancar, S. (2007). Cross-regulation of iNOS and COX-2 by its products in murine macrophages under stress conditions. Cell Physiol Biochem 20, 283-292.

134. Radons, J., and Multhoff, G. (2005). Immunostimulatory functions of membrane-bound and exported heat shock protein 70. Exerc Immunol Rev 11, 17-33.

135. Randow, F., and' Seed, B. (2001). Endoplasmic reticulum chaperone gp96 is required for innate immunity but not cell viability. Nat Cell Biol 3, 891-896.

136. Raposo, G., Nijman, H. W., Stoorvogel, W., Liejendekker, R., Harding, C. V., Melief, C. J., and Geuze, H. J. (1996). B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J Exp Med 183, 1161-1172.

137. Raska, M., and Weigl, E. (2005). Heat shock proteins in autoimmune diseases. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 149, 243-249.

138. Ribeiro, S. P., Villar, J., Downey, G. P., Edelson, J. D., and Slutsky, A. S. (1994). Sodium arsenite induces heat shock protein-72 kilodalton expression in the lungs and protects rats against sepsis. Crit Care Med 22, 922-929.

139. Riedemann, N. C., Guo, R. F., and Ward, P. A. (2003a). The enigma of sepsis. J Clin Invest 112, 460-467.

140. Riedemann, N. C., Guo, R. F., and Ward, P. A. (2003b). Novel strategies for the treatment of sepsis. Nat Med 9, 517-524.

141. Rifkin, I. R., Leadbetter, E. A., Busconi, L., Viglianti, G., and Marshak-Rothstein, A. (2005). Toll-like receptors, endogenous ligands, and systemic autoimmune disease. Immunol Rev 204, 27-42.

142. Rittirsch, D., Flierl, M. A., and Ward, P. A. (2008). Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat Rev Immunol 8, 776-787.

143. Ryan, A. J., Flanagan, S. W., Moseley, P. L., and Gisolfi, C. V. (1992). Acute heat stress protects rats against endotoxin shock. J Appl Physiol 73, 1517-1522.

144. Salomao, R., Martins, P. S., Brunialti, M. K., Fernandes Mda, L., Martos, L. S., Mendes, M.

145. E., Gomes, N. E., and Rigato, O. (2008). TLR signaling pathway in patients with sepsis. Shock 30 Suppl 1, 73-77.

146. Samali, A., Cai, J., Zhivotovsky, B., Jones, D. P., and Orrenius, S. (1999). Presence of a pre-apoptotic complex of pro-caspase-3, Hsp60 and HsplO in the mitochondrial fraction of jurkat cells. EMBO J 18, 2040-2048.

147. Sapozhnikov, A. M., Gusarova, G. A., Ponomarev, E. D., and Telford, W. G. (2002). Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis. Cell Prolif 35, 193-206.

148. Sato, S., Sanjo, H., Takeda, K., Ninomiya-Tsuji, J., Yamamoto, M., Kawai, T., Matsumoto, K., Takeuchi, O., and Akira, S. (2005). Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses. Nat Immunol 6, 1087-1095.

149. Sawamura, T., Kume, N., Aoyama, T., Moriwaki, H., Hoshikawa, H., Aiba, Y., Tanaka, T.,, Miwa, S., Katsura, Y., Kita, T., and Masaki, T. (1997). An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein Nature 386, 73-77.

150. Schell, M. T., Spitzer, A. L., Johnson, J. A., Lee, D., and Harris, H. W. (2005). Heat shock inhibits NF-kB activation in a dose- and time-dependent manner. J Surg Res 129, 90-93.

151. Schumann, R. R., Leong, S. R., Flaggs, G. W., Gray, P. W., Wright, S. D., Mathison, J. C., Tobias, P. S., and Ulevitch, R. J. (1990). Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. Science 249, 1429-1431.

152. Schutt, C., Schilling, T., Grunwald, U., Schonfeld, W., and Kruger, C. (1992). Endotoxin-neutralizing capacity of soluble CD14. Res Immunol 143, 71-78.

153. Serhan, C. N., and Savill, J. (2005). Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat Immunol 6, 1191 -1197.

154. Shanley TP, Hallstrom C, Wong HR. (2006) Sepsis. In: Fuhrman BP, Zimmerman JJ, editors. Pediatric Critical Care Medicine. St. Louis: Mosby 3, 1474-1493.

155. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., and Mann, M. (2006). In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc 1, 28562860.

156. Shin, H. J., Lee, H., Park, J. D., Hyun, H. C„ Sohn, H. O., Lee, D. W., and Kim, Y. S. (2007). Kinetics of binding of LPS to recombinant CD 14, TLR4, and MD-2 proteins. Mol Cells 24, 119-124.

157. Singleton, K. D., and Wischmeyer, P. E. (2006). Effects of HSP70.1/3 gene knockout on acute respiratory distress syndrome and the inflammatory response following sepsis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290, L956-961.

158. Stefanova, I., Horejsi, V., Ansotegui, I. J., Knapp, W., and Stockinger, H. (1991). GPI-anchored cell-surface molecules complexed to protein tyrosine kinases. Science 254, 1016-1019.

159. Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., and Raposo, G. (2002). The biogenesis and functions of exosomes. Traffic 3, 321-330.

160. Swearingen, K. E., Loomis, W. P., Zheng, M., Cookson, B. T., and Dovichi, N. J. Proteomic profiling of lipopolysaccharide-activated macrophages by isotope coded affinity tagging. J Proteome Res 9, 2412-2421.

161. Terlecky, S. R., Chiang, H. L., Olson, T. S., and Dice,.J. F. (1992). Protein and peptide binding and stimulation-of in vitro lysosomal proteolysis by the 73-kDa heat shockcognate protein. J Biol Chem 267, 9202-9209.

162. Teshima, S., Rokutan, K., Takahashi, M., Nikawa, T., and Kishi, K. (1996). Induction of heat shock proteins and their possible roles in macrophages during activation by macrophage colony-stimulating factor. Biochem J 315 ( Pt 2), 497-504.

163. Theriault, J. R., Mambula, S. S., Sawamura, T., Stevenson, M. A., and Calderwood, S. K. (2005). Extracellular HSP70 binding to surface receptors present on antigen presenting cells and endothelial/epithelial cells. FEBS Lett 579, 1951-1960.

164. Tissieres, A., Mitchell, H. K., and Tracy, U. M. (1974). Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: Relation to chromosome puffs. J Mol Biol 85, 389-398.

165. Tobias, P. S., Soldau, K., and Ulevitch, R. J. (1986). Isolation of a lipopolysaccharide-binding acute phase reactant from rabbit serum. J Exp Med 164, 777-793.

166. Tobias, P. S., and Ulevitch, R. J. (1993). Lipopolysaccharide binding protein and CD14 in LPS dependent macrophage activation. Immunobiology 187, 227-232.

167. Triantafilou, K., Triantafilou, M., and Dedrick, R. L. (2001). Interactions of bacterial lipopolysaccharide and peptidoglycan with a 70 kDa and an 80 kDa protein on the cell surface of CD 14+ and CD 14- cells. Hum Immunol 62, 50-63.

168. Triantafilou, Mr, and Triantafilou, K. (2002). Lipopolysaccharide recognition: CD 14, TLRs and the LPS-activation cluster. Trends Immunol 23, 301-304.

169. Triantafilou, M., and Triantafilou, K. (2005). The dynamics of LPS recognition: complex orchestration of multiple receptors. J Endotoxin Res 11,5-11.

170. Tsan, M. F., and Gao, B. (2004a). Cytokine function of heat shock proteins. Am J Physiol Cell Physiol 286, C739-744.

171. Tsan, M. F., and« Gao, B. (2004b). Heat shock protein and innate immunity. Cell Mol Immunol 1, 274-279.

172. Tsan, M. F., and Gao, B. (2009). Heat shock proteins and immune system. J Leukoc Biol 85, 905-910.

173. Tytell, M., and Hooper, P. L. (2001). Heat shock proteins: new keys to the development of cytoprotective therapies. Expert Opin Ther Targets 5, 267-287.

174. Ulmer, A.J. et al. (2002). Lipopolysaccharide: structure, bioactivity, receptors, and signaltransduction. Trends in Glycoscience and Glycotechnology 14, 53-68.

175. Underhill, D. M., and Ozinsky, A. (2002). Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol 20, 825-852.

176. Van Molle, W., Wielockx, B., Mahieu, T., Takada, M., Taniguchi, T., Sekikawa, K., and Libert, C. (2002). HSP70 protects against TNF-induced lethal inflammatory shock. Immunity 16, 685-695.

177. Villar, J., Ribeiro, S. P., Mullen, J. B., Kuliszewski, M., Post, M., and Slutsky, A. S. (1994). Induction of the heat shock response reduces mortality rate and organ damage in a sepsis-induced acute lung injury model. Crit Care Med 22, 914-921.

178. Viriyakosol, S., Tobias, P. S., Kitchens, R. L., and Kirkland, T. N. (2001). MD-2 binds to bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem 276, 38044-38051.

179. Visintin, A., Mazzoni, A., Spitzer, J. A., and Segal, D. M. (2001a). Secreted MD-2 is a large polymeric protein that efficiently confers lipopolysaccharide sensitivity to Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 12156-12161.

180. Visintin, A., Mazzoni, A., Spitzer, J. H., Wyllie, D. H., Dower, S. K., and Segal, D. M. (2001b). Regulation of Toll-like receptors in human monocytes and dendritic cells. J Immunol 166, 249-255.

181. Wang, Y., Li, C., Wang, X., Zhang, J., and Chang, Z. (2002). Heat shock response inhibits1.-18 expression through the JNK pathway in murine peritoneal macrophages. Biochem Biophys Res Commun 296, 742-748.

182. Wawrzynow, A., and Zylicz, M. (1995). Divergent effects of ATP on the binding of the DnaK and DnaJ chaperones to each other, or to their various native and denatured protein substrates. J Biol Chem 270, 19300-19306.

183. Welch, W. J. (1993). Heat shock proteins functioning as molecular chaperones: their roles in normal and stressed cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 339, 327-333.

184. Welch, W. J., and Suhan, J. P. (1986). Cellular and biochemical events in mammalian cells during and after recovery from physiological stress. J Cell Biol 103, 2035-2052.

185. Wesche-Soldato, D. E., Swan, R. Z., Chung, C. S., and Ayala, A. (2007). The apoptotic pathway as a therapeutic target in sepsis. Curr Drug Targets 8, 493-500.

186. Wong, H. R. (1998). Potential protective role of the heat shock response in sepsis. New Horiz 6, 194-200.

187. Worthen, G. S., Avdi, N., Vukajlovich, S., and Tobias, P. S. (1992). Neutrophil adherence induced by lipopolysaccharide in vitro. Role of plasma component interaction with lipopolysaccharide. J Clin Invest 90, 2526-2535.

188. Wright, S. D., and Jong, M. T. (1986). Adhesion-promoting receptors on human macrophages recognize Escherichia coli by binding to lipopolysaccharide. J Exp Med 164, 18761888.

189. Wright, S. D., Ramos, R. A., Tobias, P. S., Ulevitch, R. J., and Mathison, J. C. (1990). CD14, a receptor for complexesiof lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science 249, 1431-1433.

190. Wygrecka, M., Marsh, L. M., Morty, R. E., Henneke, I., Guenther, A., Lohmeyer, J., Markart, P., and Preissner, K. T. (2009). Enolase-l promotes plasminogen-mediated recruitmentof monocytes to the acutely inflamed lung. Blood 113, 5588-5598.

191. Yamamoto, M., Sato, S., Hemmi, H., Hoshino, K., Kaisho, T., Sanjo, H., Takeuchi, O., Sugiyama, M., Okabe, M., Takeda, K., and Akira, S. (2003). Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science 301, 640-643.

192. Zhang, G., and Ghosh, S. (2000). Molecular mechanisms of NF-kappaB activation induced by bacterial lipopolysaccharide through Toll-like receptors. J Endotoxin Res 6, 453-457.

193. Zhao, Y., Wang, W., and Qian, L. (2007). Hsp70 may protect cardiomyocytes from stress-induced injury by inhibiting Fas-mediated apoptosis. Cell Stress Chaperones 12, 83-95.

194. Zheng, H., Nagaraja, G. M., Kaur, P., Asea, E. E., and Asea, A. (2010). Chaperokine function of recombinant Hsp72 produced in insect cells using a baculovirus expression system is retained. J Biol Chem 285, 349-356.

195. Zheng, L., He, M., Long, M., Blomgran, R., and Stendahl, O. (2004). Pathogen-induced apoptotic neutrophils express heat shock proteins and elicit activation of human macrophages. J Immunol 173, 6319-6326.

196. Zheng, Y., Im, C. N., and Seo, J. S. (2006). Inhibitory effect of Hsp70 on angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy. Exp Mol Med 38, 509-518.1. БЛАГОДАРНОСТИ

197. Особая благодарность моему мужу Рожкову Николаю за понимание и поддержку на всем протяжении выполнения диссертационной работы.

198. Кроме того, выражаю искреннюю признательность Зеленцовой Е.С., Мяснянкиной E.H., Шостак Н.Г., Гарбузу Д.Г., Юшеновой И.А. за чуткое отношение, понимание и создание в лаборатории доброжелательной дружеской обстановки, располагающей к плодотворной работе.

Информация о работе

Рожкова, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Роль основного стрессового белка млекопитающих (БТШ70) в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы