Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная и биологическая характеристика лиганда рецептора NOD1, выделенного из Neisseria meningitidis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная и биологическая характеристика лиганда рецептора NOD1, выделенного из Neisseria meningitidis"

На правах рукописи

4ВЭЭО if

Тухватулин Амир Ильдарович

Молекулярная и биологическая характеристика лиганда рецептора NOD1, выделенного из Neisseria meningitidis

03.02.03 - микробиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

10 НОЯ 2011

Москва-2011

4859619

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации ( ФГБУ "НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России)

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Ведущая организация:

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Защита диссертации состоится «02» декабря 2011 года в 11.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098, г.Москва, ул. Гамалеи, д.18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «27» октября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Логунов Денис Юрьевич

Официальные оппоненты:

. доктор медицинских наук, профессор Грубер Ирина Мироновна

доктор биологических наук, профессор Наровлянский Александр Наумович

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение принципов распознавания патогенов клетками макроорганизма, а также молекулярных механизмов активации последующих иммунных реакций, в настоящее время остается актуальной задачей. Важным событием, позволившим сделать значительный шаг в понимании этих механизмов, стало открытие около 20 лет назад первых представителей патгерн-распознающих рецепторов. Было установлено, что эти рецепторы, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, узнают не уникальные эпитопы антигенов, а определенные высококонсервативные молекулярные структуры (паттерны) (pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)), находящиеся в составе клеток патогенных организмов (Medzhitov R, et al., 2000).

К настоящему моменту у человека идентифицировано гать семейств патгерн-распознающих рецепторов: То11-подобные рецепторы, лектиновые рецепторы С-типа, RIG-подобные рецепторы, NOD-подобные рецепторы, фикколины, а также пентраксины и коллектины, относимые к суперсемейству лектиновых рецепторов С-типа (Ковальчук JI.B. с соавт., 2011).

Связывание лигандов (PAMPs) с патгерн-распознающими рецепторами (PRR) инициирует запуск внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих, в конечном итоге, к активации ряда транскрипционных факторов (АР-1, NF-kB, IRF 3,5,7 и др.), определяющих развитие тех или иных реакций иммунной системы. Среди перечисленных транскрипционных факторов NF-kB играет одну из ключевых ролей в развитии реакций как врожденного, так и приобретенного иммунитета (Baeuerle Р.А., et al., 1994).

Одними из наиболее важных типов PRR в распознавании бактериальных патогенов являются представители семейства То11-подобных и NOD-рецепторов. Лигандами мембраносвязанных То11-подобных рецепторов являются молекулы различной химической природы и структуры, такие, как липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий, флагеллин, бактериальные липопептиды, бактериальная и вирусная ДНК и другие.

На сегодняшний день получено множество данных, доказывающих участие данных рецепторов в целом спектре иммунных реакций: усилении фагоцитоза, секреции антибактериальных пептидов, процессинге и презентации антигена дендритными клетками, активации зрелых Т-клеток, пролиферации и созревания В-клегок во время инфекции, прямой активации В клеток памяти и последующей продукции антител, в том числе IgG, и других (Palm N.W., et al., 2009).

Способность лигандов То11-подобных рецепторов запускать различные реакции иммунной системы позволяет использовать данные молекулы в качестве .различных молекулярных адьювантов, средств немедленной защиты против инфекции и др. (Vijay-Kumar М., et al., 2008, Kaisho Т., et al., 2002).

Лигандами цитозольных NOD рецепторов являются различные молекулы, представляющие собой фрагменты пептидогликана грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Было показано, что минимальным фрагментом пептидогликана, достаточным для активации NOD1-рецептора, является дипептид £>-Glu-mDAP (iE-DAP), присутствующий в составе клеточной стенки большинства грамотрицательных бактерий: Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica Typhimurium и др. (Girardin S.E.et ah, 2003). Однако вклад других аминокислот и моносахаридов, входящих в состав пептидогликана бактерий различных видов, в активацию NOD1-рецептора на сегодняшний день мало изучен. Кроме того, по сравнению с То11-подобными значение NOD рецепторов в формировании защитных иммунных реакций и протективного иммунитета описано в значительно меньшей степени (Kobayashi K.S, etal., 2005).

Еще меньше данных получено при изучении совместного функционирования То11-подобных и NOD рецепторов в распознавании целого патогенного микроорганизма и определение вклада того или иного типа патгерн-распознающего рецептора в формировании полноценного протективного иммунитета организма.

Изучение совместного функционирования мембраносвязанных Toll-подобных и цитозольных NOD рецепторов позволит не только идентифицировать фундаментальные механизмы функционирования данных рецепторов, необходимые для формирования полноценного протективного иммунитета, но и предоставит возможность создания на основе композиций лигандов патгерн-распознающих рецепторов целого спектра иммунобиологических препаратов: эффективных средств немедленной защиты от инфекции; молекулярных адъювантов в составе вакцин нового поколения и многих др.

Цель работы: Изучение NF-kB-активирующей способности NOD рецептора 1, а также его роли в индукции иммунных реакций, включая участие в формировании антибактериального иммунитета совместно с То11-подобными рецепторами.

В процессе выполнения работ предстояло решить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ различных видов бактерий с целью выявления наиболее эффективного продуцента лиганда NOD1 рецептора.

2. Разработать технологию очисттш лиганда NOD1 рецептора из наиболее эффективного бактериального штамма-продуцента.

3. Идентифицировать первичную структуру лиганда NOD1 рецептора, выделенного из бактериального штамма-продуцента.

4. Провести сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда NOD1 рецептора, выделенного из бактериального штамма-продуцента, с другими лигандами NOD1 рецептора с различной структурой в условиях in vitro.

5. Определить влияние совместной стимуляции NOD1 и То11-подобных рецепторов на уровень активности транскрипционного фактора NF-kB в условиях in vitro и in vivo.

6. Определить влияние совместной стимуляции NOD1 рецептора и ТоН-подобного рецептора 5 на уровень секреции цитокинов в условиях in vivo.

7. Определить влияние совместной активации NODI и То11-подобного рецептора 5 на формирование антибактериального иммунитета в условиях in vivo.

Научная новизна

- впервые из Neisseria meningitidis серогруппы В была выделена молекула-лиганд NOD1 рецептора и идентифицирована ее первичная структура;

- впервые был проведен сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда NOD1 рецептора, выделенного из Neisseria meningitidis серогруппы В, с другими лигандами NOD1 рецептора с различной структурой в условиях in vitro, а также впервые были определены характеристики (интенсивность, кинетика) NODl-опосредованной активации NF-kB в условиях in vivo;

- впервые были определены различия в способности лигандов NOD1 и Toll-подобных рецепторов активировать NF-kB в условиях in vitro и in vivo;

- впервые было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту повышения (потенцирования) активации NF-kB по сравнению с изолированной стимуляцией данных патгерн-распознающих рецепторов в условиях in vitro и in vivo. Была показана зависимость данного эффекта от последовательности стимуляции указанных патгерн-распознающих рецепторов;

- в условиях in vivo впервые было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит также к повышению (потенцированию) уровней секреции цитокинов в периферической крови и тканях тонкого кишечника;

- впервые показано, что по сравнению с изолированной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, последовательная стимуляция данных рецепторов увеличивает на 50% выживаемость животных при инфекции летальными дозами Salmonella enterica Typhimurium.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизма распознавания патогенов врояеденной иммунной системой организма хозяина и последующем формировании иммунных реакций, но и в перспективе может иметь практическое применение. Полученные данные, показывающие эффект усиления реакций иммунного ответа организма при введении сочетаний лигандов патгерн-распознающих рецепторов, принадлежащих к различным семействам, могут быть использованы при создании многокомпонентных молекулярных адьювантов. Данные адъюванты могут применяться в составе более эффективных вакцин нового поколения совместно с протективными антигенами, обладающими низкой иммуногенностью (например, калсульным полисахаридом Neisseria meningitidis серогруппы В).

Результаты, полученные в данной работе, также могут быть использованы в применении комбинаций лигандов паттерн-распознающих рецепторов в качестве средств немедленной защиты от патогенных микроорганизмов. Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Использование тест-системы на основе эукариотических клеток человека линии HEK293-hNODl для определения биологической активности лигандов NOD1 рецептора». М.-2011, утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФЕБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России, протокол №15 от 14.07.11.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды», (Казань, 2009г.), а также на Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И.Иоффе, (Санкт-Петербург, 2011г.).

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отдела «Медицинской микробиологии» и отдела «Генетики и молекулярной биологии бактерий» 16 июня 2011 г. ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 2 статьи в сборниках Всероссийских конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», Выводы, Список используемой литературы (226 источников, из которых 9 отечественных и 217 иностранных). Работа содержит 3 таблицы и 28 рисунков.

Основные положения выносимые на защиту.

- Для изучения NF-kB-актавирующей способности NOD рецептора 1, а также его роли в индукции иммунных реакций необходимо было выбрать наиболее эффективный бактериальный продуцент лиганда NOD1 рецептора. При выбранном термическом способе разрушения бактерий различных видов наибольшую NOD1 -опосредованную активацию NF-kB показал штамм 591 (B:NT:P1.1,2) Neisseria meningitidis. Данный микроорганизм был выбран в качестве наиболее эффективного продуцента лиганда NOD1 рецептора для последующей очистки, идентификации первичной структуры и характеристики биологических свойств исследуемой молекулы.

- В работе было показано, что последовательная стимуляция NOD и TLR рецепторов по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов приводит к эффекту повышения (потенцирования) уровня активации NF-kB в условиях in vitro и in vivo, а также вызывает повышенные уровни секреции цитокинов в периферической крови и тканях тонкого кишечника.

- На модели инфекции мышей летальными дозами Salmonella eníerica Typhimurium было показано, что животные, которым последовательно вводились лиганды NOD1 и TLR5 рецепторов, характеризовались повышенной выживаемостью по сравнению с животными, получавших инъекции индивидуальных лигандов данных рецепторов.

- Полученные данные описывают значение совместного участия различных патгерн-распознающих рецепторов врождённого иммунитета в формировании эффективных защитных реакций организма и являются существенными для понимания одного из принципов функционирования иммунной системы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2007 по 2011 годы в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ. Препаративное наращивание культуры менингококков штаммов 591 (B:NT:P1.1,2), 270 (B:NT:P1.1.3), 63 (А:4:1.9), а также типирование проводилось совместно с сотрудниками группы по изучению условно патогенной микрофлоры лаборатории хламидиоза ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ. Эксперименты по изучению влияния изолированной и совместной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень активности NF-kB в условиях in vitro и in vivo были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории д.б.н., проф. A.B. Гудкова, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY.

В работе были использованы:

- лабораторные штаммы Escherichia coli DH5a, штаммы Neisseria meningitidis 591 (B:NT:P1.1,2), 270 (B:NT:P1.1.3), 63 (A:4:1.9) были любезно предоставлены д.м.н., проф. H.H. Костюковой; штамм Yersinia enterocolitica 03 и Salmonella eníerica Typhimurium C53 были любезно предоставлены д.б.н. С.А. Ермолаевой, д.б.н. В.И. Пушкаревои и к.б.н. Л.Н. Нестеренко, д.б.н., проф. Ю.М. Романовой;

- клеточные линии HEK293-hNODl (клетки эмбриональной почки человека, содержащие ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора и экспрессирующие NOD1 рецептор); НСТ116 (аденокарцинома толстого кишечника человека), LIM1215 (карцинома толстого кишечника человека), ТНР-1 (острого моноцитарного лейкоза человека) были любезно предоставлены д.б.н., проф. A.B. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY);

- плазмидный вектор pLRV-NF-kB-Luc, содержащий ген люциферазы под контролем NF-kB -зависимого элемента. Вектор был любезно предоставлен д.б.н., проф. A.B. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY);

- коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз и других ферментов фирм "Fermentas MBI" (Литва), "Promega" (США) и «NEBioLabs» (США). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол».

Эксперименты по определению уровня активации NF-kB в условиях in vivo проводили с использованием самок трансгенных мышей BALB/c-

Tg(NFkB-RE -luc[Oslo])-Xen (Caliper Life Sciences, США) весом 18-20 г, содержащих в геноме репортерный ген люциферазы светлячка (из pGL3-Basic Vector, Promega, США) под экспрессионным контролем NF-kB-зависимого промотора, состоящего из трех NF-kB-связывающих участков в промоторе гена легкой цепи IgK. Эксперименты по определению выживаемости мышей в условиях пероральной инфекции S. typhimurium проводились на самках весом 18-20 г линии BALB/c. Содержание лабораторных животных и проведение экспериментальных исследований проводилось согласно санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию вивариев, утвержденных Главным Государственным санитарным врачом 06.041973 г. N 1045-73

Все генно-инженерные манипуляции проводили по стандартным методам, изложенным в Т. Maniatis et al. (1982). Анализ активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках проводили спектрофотометрически по реакции на ß-галактозидазу, щелочную фосфатазу (SEAP) и методом иммуноблотгинга. Анализ выживаемости в клетках проводили по реакции с субстратом МТТ, окраской клеток метиленовым голубым; анализ экспрессии цитокинов проводили при помощи проточного цитофлюориметра с использованием коммерческого набора FlowCytomix BenderMedsystems (Австрия).

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с к.б.н. Д.Ю. Логуновым, к.б.н. Е.А. Черентаевой, к.б.н. Д.В. Щебляковым, н.с. П.В. Куданом, м.н.с. Н.М. Артемичевой - сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии, д.б.н., проф. А.Ф. Мороз, к.б.н. A.A. Аджиевой - сотрудниками группы по изучению условно патогенной микрофлоры лаборатории хламидиоза, д.м.н., проф. H.H. Костюковой ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ; И.И. Гитлиным, М.П. Анточ, A.B. Гудковым - сотрудниками Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY, которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ способности различных грамотрицательных бактерий активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействия с NODI рецептором.

Для проведения экспериментов, связанных с изучением участия NOD1 рецептора в индукции иммунных реакций, необходимо было на первом этапе определить вид грамотрицательной бактерии, способный обеспечить максимально эффективную NOD 1-опосредованную активацию NF-kB в эукариотических клетках. При этом выделение лиганда NOD1 рецептора из микроорганизма должно быть наиболее простым и технологичным.

Для выполнения поставленной задачи был проведен скрининговый эксперимент, в котором была определена способность различных грамотрицательных бактерий активировать NF-kB NODI-зависимым способом. Для разрушения бактериальных клеток и выделения из них лиганда NOD1 рецептора использовали наиболее простой и технологичный способ

термической обработки. В эксперименте использовали инактивированные нагреванием образцы суспензий Y. enterocolitica, Е. coli, S. typhimurium, N. meningitidis в питательной среде

Для определения NOD 1-зависимой NF-kB активирующей способности грамотрицательных бактерий была использована клеточная линия эмбрионального почечного эпителия человека HEK293-hNODl, экспрессирующая только NOD1 рецептор. Для контроля активации NF-kB методом лентивирусной трансфекции в указанные клетки был введен ген Ь-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора.

После добавления анализируемых образцов бактерий проводили измерение активности NF-kB в клетках. В качестве положительного контроля активации NF-kB использовали ФНО-а (фактор некроза опухоли альфа). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, к которым добавляли образцы интактной бактериальной культуральной среды.

Результаты проведенного эксперимента (см. рисунок 1) свидетельствуют о том, что среди инактивированных нагреванием образцов суспензий, вышеперечисленных грамотрицательных бактерий, наибольшую NOD1-опосредованную активацию NF-kB вызывает образец, содержащий N. meningitidis.

HEK293-HNOD1 НБОвЭ-hNODI

Рисунок 1. Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках HEK293-hNODl, экспрессирующих NOD1 рецептор после добавления к ним инактивированных нагреванием образцов суспензий в среде К enterocolitica, £ coli, S. typhimurium, N. meningitidis (А). Определение выживаемости клеток НЕК293-ЫЧОШ после обработки их анализируемыми образцами (Б). Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов.

На следующем этапе работы предстояло определить наиболее эффективный штамм-продуцент N. meningitidis, образец которого, способен максимально эффективно активировать NF-kB, взаимодействуя с NOD1 рецептором

Анализ способности менингококков различных серогрупп активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействия с NO E l рецептором.

Для поиска наиболее оптимального штамма-продуцента N. meningitidis было выбрано несколько штаммов менингококка, принадлежащих к различным сорогруппам: 591 (B:NT:P1.1,2), 270 (B:NT:P1.1.3), 63 (А:4:1.9). Для определения NOD 1-зависимой NF-kB активирующей способности штаммов N.

meningitidis использовали клеточную линию HEK293-hNODl.Указанные клетки обрабатывали инактивированными нагреванием образцами суспензий каждого из трех штаммов менингококка (591,270,63) в питательной среде BHI (Brain-Heart Infusion), после чего проводили измерение активности NF-kB в клетках.

Основываясь на полученных данных (см.рисунок 2), обработка клеток инактивированными образцами суспензий штаммов 591,270 и 63 менингококка в среде BHI, приводила к достоверному (р<0,05) увеличению уровня NF-kB-зависимой экспрессии ß-галактозидазы. При этом наибольшую NF-kB активирующую способность показал штамм 591, принадлежащий к серогруппе В.

HEK293-hNOD1 HEK293-hNOD1

IlihUllllil

д 591 270 63 8HI ФНОл К- 5 591 270 63 BHJ ФНО-0 К-

Рисунок 2. Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках HEK293-WSOD1, экспрессируинцих NOD1 рецептор (А). Определение выживаемости клеток HEK293-hNODl после обработки их анализируемыми образцами (Б). Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов.

Таким образом, среди анализируемых, штамм N. meningitidis 591, относящийся к серогруппе В, показал наибольшую эффективность NOD1-зависимой активации NF-kB и был выбран в качестве наиболее оптимального штамма-продуцента для последующего выделения, очистки и идентификации фрагмента бактерий, являющихся лигандом NOD1 рецептора.

Выделение и очистка молекулы, способной активировать транскрипционный фактор NF-kB при взаимодействии с NOD рецептором 1.

Для идентификации структуры лиганда NOD1 рецептора в составе N. meningitidis 591 была разработана методика выделения и очистки данной молекулы при постадийном контроле NOD 1-зависимой NF-kB-активирующей способности получаемых очищенных образцов. На первом этапе инактивированный нагреванием образец суспензии N. meningitidis 591 в среде BHI, подвергался центрифугированию для удаления клеточного дебриса. Затем супернатант был очищен от наиболее гидрофобных молекул и крупных белков путем фенол-хлороформенной экстракции с нагреванием и перемешиванием фенол-водной смеси при 70°С в течение ЗОмин. На следующем этапе проводилось удаление из полученной водной фазы остальных молекул с высокой молекулярной массой методом тангенциальной ультрафильтрации (Millipore, USA) с использованием фильтра, пропускающего глобулярные белки массой не более 30 кДа.

После проведения предварительной очистки, образец, содержащий лиганд NODI рецептора, был подвергнут хроматографическому разделению с

использованием жидкостного хроматографа Bioalliance 2796 (Waters, США). Было разработано три последовательных метода очистки, основанных на принципах обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Разделение веществ проводили на основании существующей разницы в гидрофобных/гидрофильных свойствах молекул, находящихся в анализируемой смеси. В ходе первых двух методов очистки хроматографическое разделение проводилось на хроматографической колонке Symmetry Cl 8 Column 4.6мм х 75мм, с диаметром частиц 5 мкм (Waters, США). Для проведения заключительного третьего этапа хроматографического разделения была использована колонка Synergi Hygro-RP (Phenomenex, USA) Змм x 250мм с диаметром частиц 4мкм, обладающая более высокой эффективностью разделения. Детектирование веществ проводили по интенсивности оптического поглощения молекул с использованием спектрофотометрического детектора 2487 (Waters, США) при длине волны 205 и 280 нм. На заключительном этапе очистки для достижения большей чувствительности регистрации разделяемых веществ помимо спектрофотометрического детектора использовали масс-спектрометрический детектор QSTAR Elite (Applied Biosystems/MDS SCIEX, США). В качестве полярного растворителя использовали высокоочищенную деионизированную (mQ) воду, в качестве элюируЮщего неполярного агента был использован ацетонитрил.

В результате последовательного проведения трех методов хроматографической очистки был получен хроматографически чистый образец, содержащий лиганд NOD1 рецептора. Полученный образец затем был подвергнут масс-спектрометрическому анализу для определения компонентного состава, по результатам которого было обнаружено присутствие единственного однозарядного иона с массой 851.171 Да (см. рисунок 3).

ж 851.1710 s

|isoj

g 100!

i SOI x ;

5 ,1.... . —__— . . .. ------——

m/z, Да

Рисунок 3. Масс-спектр хроматографически очищенного образца, содержащего лиганд NOD1 рецетпора. Ось абсцисс - отношение массы к заряду анализируемы* ионов. Ось ординат- количество зарегистрированных ионов за 1 с.

Таким образом, в результате трех последовательных хроматографических методов разделения был получен образец, содержащий лиганд NOD1 рецептора хроматографической и масс-спектрометрической чистоты.

На даном этапе была проведена верификация присутствия идентифицированной молекулы в анализируемом образце с регистрируемой биологической активностью. Для этого был использован контрольный отрицательный образец интактной культуральной среды BHI. Данный образец прошел вышеперечисленные стадии очистки, после чего был подвергнут масс-

спектрометрическому анализу. По результатам анализа в очищенном образце интактной кулыуральной среды BHI молекула с идентифицированной массой не регистрировалась. Дополнительно был подобран метод химической модификации анализируемой молекулы, позволяющий ингибировать биологическую активность образца. Так, обработка анализируемого образца содержащего лиганд NOD1 рецептора бромной водой (реагента, селективно взаимодействующего с ненасыщенными углеродными связями и фенольными группами молекул) приводило к исчезновению из спектра зарегистрированного сигнала при одновременной утрате образцом биологической активности, что также косвенно подтверждает связь между биологической активностью и присутствием идентифицированной молекулы в анализируемом образце.

Полученный образец был подвергнут дальнейшему масс-спектрометрическому анализу для определения первичной структуры исследуемой молекулы.

Идентификация первичной структуры фрагмента менингококка серогруппы В, являющегося лигандом NOP1 рецептора.

После проведения трехстадийной хроматографической очистки образца содержащего лиганд NOD1 рецептора, выделенного из N. meningitidis серогруппы В, была проведена идентификация первичной структуры данной молекулы. Общий алгоритм проведения идентификации первичной структуры анализируемой молекулы изображен на рисунке 4.

Очищенный ВЭЖХ ri ; образен, У

NOD1 лиганда Neisseria Ц

meningitidis W

— 1

I ' ifj

'' «dinpoii^igNit -V'j

Р * Л-А ё Ы^маирмк, *

V

II12) Определение гочноймассц

Ш г '■•^бЩ} ^¿ЛЖ' +

j , /С ^ 'фрапйен^Й^ fffoafi'

_ I

4) СеимниромниеI С ЧИЧН«|

аминокислотной последояктельчосзи

j исследуемого вещества)

Рисунок 4. Алгоритм проведения процедуры идентификации первичной структуры молекулы, являющейся лигандом NOD1 рецептора.

Для идентификации структуры анализируемой молекулы на первом этапе масс-спектрометрического анализа была определена ее точная молекулярная

1

Определение

фрагментации неиепггидной части 4 4 йбна

£) Определение ; "точных ««ее I фрагментов иона

I 7) Расчет варианте« химического

ft - s > ,._ :

обеспечение Protein

" PSot {Applied Bfe*y«tems/M0S

к m.m,

{определение

I еоаможных врупо

К . ~ *рормул) .

PubChem

Compound ID 25f71081

масса, которая составила 850,353Да (измерение было проведено с использованием внутренних стандартов масс: Csl и CsCI)

После этого ионы анализируемого вещества были подвергнуты диссоциации посредством столкновений с нейтральными молекулами азота. Полученные данные позволили провести секвенирование пептидной части молекулы с использованием програмного обеспечения Protein Pilot (Applied Biosystems/MDS SCIEX, США). По результатам проведенного анализа был идентифицирован пептидный фрагмент, представленный последовательностью остатков аланина, глутаминовой и диаминопимелиновой кислот.

Для идентификации небелковой части молекулы методом псевдо-МСЗ (изучение продуктов фрагментации ионов, полученных путем предварительной фрагментации иона анализируемой молекулы в интерфейсе ионизации при атмосферном давлении) были изучены пути распада основных фрагментов иона анализируемой молекулы, что позволило определить точные массы нейтральных групп, связанных с отщеплением отдельных структурных единиц (групп атомов) молекулы. Используя полученные данные, а также вышеуказанное програмное обеспечение, были определены и отобраны наиболее вероятные брутго-формулы оставшейся небелковой части молекулы. Сравнение спектров фрагментации с контрольными молекулами N-ацетилглюкозамина и анализируемого вещества в идентичных условиях позволило подтвердить наличие остатка N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты в составе лиганда NOD1 рецептора. В результате проведения всех стадий масс-спектромеггрического анализа была определена первичная структура лиганда NOD1, выделенного из N. meningitidis 591 серогруппы В (см. рисунок 5) -М-ацетил-Б-глюкозамин (ангидрид) N-ацетилмурамил- L-Ala-D-Glu-M-Dap (GM-TriDAP)

Рисунок 5. Установленная первичная структура лиганда NOD1, выделенного из N. meningitidis 591 серогруппы В: 1Ч-ацетил-0-глюкозамнн (GIcNAc) N-ацетилмурамил (MurNAc) -трипептнда L-Ala-D-Glu-M-Dap (GM-TriDAP). Брутто формула молекулы C34H54N6019. Молекулярная масса = 850.3444 Да; отклонение от теоретической массы равно Юррт.

Сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда ¡УОШ рецептора, выделенного та N. meningitidis, с другими молекулами различной структуры в условиях in vitro.

После идентификации первичной структуры лиганда NOD1 рецептора, выделенного из N. meningitidis штамма 591, принадлежащего к серогруппе В, на

он

следующем этапе работы необходимо было изучить NF-kB активирующую способность данной молекулы в условиях in vitro, сравнив ее с другими лигандами NOD1 рецептора, имеющими различную химическую структуру.

Известно, что ключевой последовательностью, необходимой и достаточной дня активации NOD1 рецептора, является дипептид D-Glu-mDAP присутствующий в структуре грамотрицательных бактерий (Girard R. et al., 2003). Участие других аминокислот и моносахаридов, входящих в состав структурных молекул пептидогликана грамотрицательных бактерий, в процессе распознавания NOD1 рецептором остается не до конца выясненным.

Для измерения активности NF-kB к клеточной линии HEK293hNODl добавляли различные по структуре лиганды NOD1 рецептора: химически синтезированный дипептид D-Glu-mDAP, трипептид L-Ala-D-Glu-L-mDAP (Tri-DAP), трипептид, ковалентно связанный с моносахаридом MurNAc-L-Ala-D-Glu-L-mDAP (M-Tri-DAP), а также идентифицированный трипептид ковалентно связанный с дисахаридом GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-L-mDAP (GM-Tri-DAP), полученный из N. meningitidis 591.

Как видно из рисунка 6, добавление дипептида D-Glu-mDAP приводило к достоверному повышению NF-kB-зависимой активации экспрессии гена р-галактозидазы лишь при максимальных концентрациях (1-10мкг/мл), тогда как производные данной молекулы с ббльшей молекулярной массой Tri-DAP, М-Tri-DAP и GM-Tri-DAP, вызывали достоверное увеличение NF-kB-зависимой экспрессии гена Р-галактозидазы при более низких концентрациях (от 0,5мкг/мл). При этом NF-kB активирующая способность данных лигандов NOD1 рецептора (Tri-DAP, M-Tri-DAP и GM-Tri-DAP), структура которых отличается содержанием сахаридов GlcNAc и MurNAc, была одинакова.

-Ç0.6 S

,-0,7

о 0,5

S

jf»«

¿0,3

I Oil

—if-DAP -• • Tri-DAP

■•*■■ M-Tri-DAP -»- GM-Tri-DAP

160пг/мл 800пг/мл 4нг/мл 20нг/ил 100нг/мл 500нг/мл 2,5мкг/мл 10лшг/мл концентрация вегцеств

Рисунок 6. Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетка* HEK293hNODl, экспрессирующих рецептор NODI.

Таким образом, по результатам данного эксперимента было показано, что увеличение аминокислотной последовательности в структуре лиганда NOD1 рецептора приводит к достоверному увеличению NF-kB-активирующей способности молекулы по сравнению с основной последовательностью D-Glu-mDAP, тогда как присутствие в составе молекулы моносахаридов не влияет на дальнейшее увеличение активности лигандов NOD1 рецептора. Кроме того, было показано, что молекула лиганда NOD1 рецептора, выделенного из N. meningitidis штамма 591, обладает сходной NF-kB активирующей

способностью, что и синтетические лиганды, имеющие в своей структуре трипептидный фрагмент L-Ala-D-Glu-L-mDAP.

Сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лигандов NOD1 и TLR рецепторов в условиях in vitro.

Для сравнения NF-kB активирующей способности NOD1 и TLR рецепторов в условиях in vitro, была использована клеточная линия острого моноцитарного лейкоза человека (ТНР-1), в норме одновременно экспрессирующая NODI, а также большинство типов TLR рецепторов. Для сравнения NF-kB актирующей способности были выбраны наиболее изученные типы ТоН-подобных рецепторов, лигандами которых являются молекулы бактериального происхождения - TLR2,4,5. Клетки данной линии обрабатывали GM-Tri-DAP (лиганд NOD1), а также синтетическим диациллипопептидом R-Pam2 (лиганд TLR2), ЛПС E.coli (лиганд TLR4) и флагеллином (лиганд TLR5) в различных концентрациях. Затем после 18-часовой инкубации проводили измерение активности NF-kB по экспрессии щелочной фосфатазы, ген которой был введен в геном клеток под транскрипционным контролем NF-kB-зависимого элемента

а 70 -

1

s 60 -

1 50

% | 40 -

30 -

s а 20

=гЗ

а 10

8 0

X

1 У

ТНР-1

^ ч^ ^ ^ ^ v^

л..

V;

,Я я-'

Рисунок 7. Измерение уровня активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках ТНР-1.В качестве отрицательного контроля (К-) использовали интактные клетки.

Результаты эксперимента показывают (см. рисунок 7), что каждый из используемых лигандов дозозависимым способом приводит к активации транскрипционного фактора NF-kB.

При этом лиганд NOD1 рецептора - GM-Tri-DAP - вызывает сравнимый с лигандами TLR2,4,5 уровень активации NF-kB, но в концентрациях в 10-100 раз превышающих таковую диациллипопептида R-Pam2, ЛПС и флагеллина. По результатам проведенного эксперимента можно сделать вывод, что лиганды NOD1 рецептора обладают меньшей NF-kB активирующей способностью по сравнению с лигандами ТоН-подобных рецепторов (TLR2,4,5), по крайней мере, при использованном пути доставки.

Определение влияния совместной стимуляции NOD1 и TLR рецепторов на уровень активации NF-kB в условиях in vitro.

Известно, что в условиях in vivo в ходе развивающейся инфекции присутствие патогенного микроорганизма детектируется сразу несколькими патгерн-распознающими рецепторами, относящимися, в том числе, и к разным семействам (Rasmussen S.B. et al, 2009). Таким образом, можно предположить, что каждый из участвующих в распознавании структур патогена патгерн-распознающий рецептор будет вносить свой вклад в индукцию развития иммунных реакций посредством активации собственного набора транскрипционных факторов.

Задача следующего эксперимента заключалась в определении влияния совместной стимуляции нескольких патгерн-распознающих рецепторов, принадлежащих к различным семействам (NOD1 и TLR2,4,5) на уровень активации транскрипционного фактора NF-kB по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов. Для этого, к клеткам линии ТНР-1 проводили однократное добавление препаратов GM-Tri-DAP, ЛПС, R-Pam2 и флагеллина в концентрации 1мкг/мл, а также совместное в трех схемах: 1) одновременное добавление лигандов NOD1 и TLR рецепторов, 2) добавление лиганда NOD1 рецептора за 2 часа до добавления лиганда TLR, 3) добавление лиганда TLR рецептора за 2 часа до добавления лиганда NOD 1.

Рисунок 8. Измерение уровня активации NF-kB в клетках линии ТНР-1 при изолированной и совместной (одновременной и последовательной) стимуляции NOD1 и TLR2,4,5.

Как видно из рисунка 8, при совместном добавлении лигандов NOD1 и одного из TLR рецепторов наблюдается повышение уровня активации NF-kB по сравнению с изолированным добавлением лигандов. При этом наибольший (потенциирующий) эффект повышения активации NF-kB (до 4 раз) наблюдался при совместной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов. Данный тип Toll-подобного рецептора был выбран для дальнейшего изучения роли совместной

активации паттерн-распознающих рецепторов различных семейств в формировании иммунных реакций.

Для подтверждения идентифицированного эффекта повышения уровня активации NF-kB в ответ на совместную стимуляцию NOD1 и TLR5 рецепторов, эксперимент был проведен на клеточных линиях эпителия карциномы прямой кишки человека (НСТ116 и LIM1215), в норме одновременно экспрессирующих оба типа рецепторов (NOD1 и TLR5). Клетки данных линий обрабатывали лигандами NODI (GM-Tri-DAP) и TLR5 (флагеллином) рецепторов в концентрации 100нг/мл. Затем после 8 часовой инкубации проводили измерение активности NF-kB по экспрессии люциферазы, ген которой был введен в геном клеток под транскрипционным контролем NF-kB-зависимого элемента.

и контроль- ES GM-Tli-OAP НЮшЛш Щ фмгешин 1 ООнЛм-2 час»-

GM-W-DAP 100нг/мл

ОШ флягг.шпн КЮижг/мя ■ CM-Tri-DAP ÍOOnr/я» ¡§¡ GM-Tri-DAP 100иг/Ш1 - 2 часа -+ флагеяянв lOOur/мл флзгеллан 100нг/ып

Рисунок 9. Измерение уровня активации NF-kB в клетках линии НСТ116 и LIM1215 при индивидуальном, одновременном и последовательном (через 2 часа) добавлении лигандов NOD1 и TLR5 рецепторов (GM-Tri-DAP и флагеллина).

Как видно из рисунка 9 лишь при последовательном добавлении данных лигандов наблюдается повышение уровня активации NF-kB по сравнению с изолированным добавлением лигандов. При этом, наибольший потенциирующий эффект достигался в случае добавления к клеткам лиганда NOD1 рецептора, а затем через 2 часа лиганда TLR5. Данный феномен может быть объяснен показанным ранее фактом преимущественной экспрессии TLR5 рецептора на базальной стороне клеток кишечника (Gewirtz А,Т. 2001). Таким образом, стимуляция соответствующими лигандами NOD1, а затем TLR5 рецепторов имитирует последовательность активации данных рецепторов в случае реальной бактериальной инвазии, что может обеспечивать повышенный уровень активации NF-kB.

Влияние совместной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень активации NF-kB в условиях in vivo.

На следующем этапе нашей работы предстояло определить, существует ли идентифицированный эффект потенциирования уровня активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов в условиях in vivo.

Для изучения поставленного вопроса нами были использованы трансгенные мыши линии Balb/C, в геном которых встроен репортерный ген люциферазы под контролем NF-kB зависимого промотора. Используемая

система позволяет измерять степень активации NF-kB (в том числе прижизненно в реальном времени) в различных органах мышей по интенсивности люминисцентного свечения после введения животным лигандов паттерн-распознающих рецепторов (Carlsen Н. et al. 2002).

Вышеописанным трансгенным мышам проводили изолированное введение GM-Tri-DAP и флагеллина в дозе 200мкг/мышь и 1мкг/мышь, соответственно. Кроме того, третьей группе мышей последовательно вводили лиганды NOD1 и TLR5 рецепторов по схеме, обеспечивающей эффект потенциирования уровня активации NF-kB.

Через 2,4,6,8,10 часов после последнего введения лиганда брали органы мышей (см. рисунок 10).

Рисунок 10. Измерение уровни активности транскрипционного фактора NF-kB в образцах гомогенатов органов мышей после введения лигандов NOD1 и TLR5 рецепторов. U - активность NF-kB в органах контрольных мышей, которым вводили раствор фосфатного буфера (ФСБ); Н - активность NF-kB в органах мышей, которым вводили флагеллин в концентрации 1мкг/мышь; И - активность NF-kB в органах мышей, которым вводили GM-Tri-DAP (200мкг/мышь); &S - активность NF-kB в органах мышей, которым вводили сначала GM-Tri-DAP (200мкг/мышь), а затем через 2 часа флагеллин в концентрации 1мкг/мышь.

По результатам представленного эксперимента можно заключить, что идентифицированный в условиях in vitro эффект потенцирования уровня

активации NF-kB в ответ на последовательную стимуляцию NOD1 и TLR5 рецепторов сохраняется и условиях in vivo. Кроме того идентифицированный эффект является органоспецифичным (максимальное повышение активации NF-kB наблюдается лишь в тонком и толстом кишечнике). Данный факт позволяет сделать предположение о том, что повышенный уровень активации NF-kB возможно играет важную роль в формировании иммунных реакций в вышеперечисленных органах.

Влияние эффекта усиления активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень секреции цитокинов и хемокииов в сыворотке периферической крови и гомогенате тонкого и толстого кишечника.

На следующем этапе работы необходимо было определить, способен ли повышенный уровень активации NF-kB, вызванный последовательной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, приводить к большему выбросу цитокинов в условиях in vivo по сравнению с изолированной стимуляцией указанных рецепторов.

Для выполнения поставленной задачи нам был проанализирован спектр экспрессии 19 хемокинов и цитокинов (ИЛ-1а,2,4,5,6,10,12р70,13,17,18,21, 22,27, ИФН-у, ФНО-а, CXCL1/KC, МСР-3, МСР-1, М1Р-1а, MIP-ip, RANTES, GM-CSF) в организме животных (мышей) в ответ на изолированное и последовательное введение лигандов NOD1 и TLR5 рецепторов в схеме, приводящей к эффекту потенциирования уровня активации NF-kB. Концентрация цитокинов определялась с использованием набора FlowCytomix BenderMedsystems (США) в сыворотке периферической крови животных, а также в образцах тонкого и толстого кишечника, в которых наблюдался наибольший эффект потенциирования уровня активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов. На рисунках 11 и 12 представлены данные для цитокинов, концентрация которых была повышена в ответ на последовательное введение лигандов NOD1 и TLR5 по сравнению с изолированным введением какого-либо из лигандов патгерн-распознающих рецепторов в сыворотке крови и гомогенате тонкого кишечника, соответственно.

9000 »ООО f 7000 |«00

5 5000 §-4000

* зооо 2000 1000

ИЛ-6

"V

ч

\

^ — - QM-TfbDAP

\ —* • флвгеллич

ч \

\

\

. V.-

f---------4-,.,

Рисунок 11. Определение концентрации интерлейкина-6 в сыворотках периферической кровн мышей, при изолированном внутримышечном введении им фосфатпо-солевого буфера (ФСБ), флагеллина (1мкг/мышь), ОМ-Тп-ВЛР (200мкг/мышь), а также

последовательном введении ОМ-Тп-1)ЛР (200мкг/мышь) через 2 часа после введения флагеллина (Тмю/мышь). После введения мышам линии ВАЬВ/С указанных лигандов паттера-распознающих рецепторов или фосфатно-солевого буфера, через 2,4,6,8 часов отбирали кровь для нриготавливления сыворотки. Полученные образцы сыворотки использовали для определения концентрации цитокинов. Каждая точка представляет собой среднее значение, полученное от трех образцов (мышей).

ШФСБ

эоао • т

К бМ-ТЛ-ВАР

ИЛ-3 ИЛ-6 ИЛ-В tüMJ

Рисунок 12. Определение концентрации цитокинов в гомогенате тонкого кишечника мышей при изолираваином внутримышечном введении им фосфатно-солевого буфера (ФСБ), флагеллина (1мкг/мышь), GM-Tri-DAP (200мкг/мышь), а также последовательном введении GM-Tri-DAP (200мкг/мышь) через 2 часа после введения флагеллина (1мкг/мышь). После введения мышам линии BALB/C указанных лигандов наттерн-раепознаюидих рецепторов или фосфатно-солевого буфера, через 2 часа после последней инъекции был произведен отбор образца тонкого кишечника (соответствующий отделу тощей кишки), используемый для получения гомогената, в котором определяли концентрации цитокинов.

По результатам данного эксперимента было показано, что повышенный уровень активации NF-kB, вызванный последовательной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, способен приводить к повышению продукции (до 8 раз) ряда цитокинов как непосредственно в ткани тонкого кишечника, так и в периферической крови животного. При этом ранее было показано, что все идентифицированные цитокины (ИЛ-5,6,13,21) принимают ключевое участие в развитии адаптивного иммунного ответа по ТЬ2-типу (Mosmarm Т. et al., 1996).

Влияние эффекта усиления активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 на формирование протективного иммунитета к летальным дозам S. typhimuríum в условиях in vivo.

На заключительном этапе нашего исследования предстояло определить способен ли повышенный уровень активации NF-kB в кишечнике животных, вызванный последовательной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, повысить эффективность иммунной защиты животных против инфекции энтеропатогенными микроорганизмами, вызывающими патологический процесс, проникая через эпителий кишечника.

Для этого мыши линии Ва1В/С, были перорально инфицированы S. iyphimurium в дозе 106 КОЕ/мышь. За 9 часов до заражения животных производили однократное введение изолированных препаратов GM-Tri-DAP и флагеллина, а также совместное введение данных лигандов по схеме, вызывающей повышенный уровень активации NF-kB. На рисунке 13 представлены диаграммы изменения среднего веса по группе и выживаемости мышей, участвующих в эксперименте.

а

9 10 13 12 13 14 15 16 17 lg 19 20 21 12 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3«

Время, дни

jrfr-frfrfri* A j

ш«**ТпППг1 fl-l I

Б

зо

90

"iltt

-JrA-A-A.

Ш• флагеллин 1мкг/мышь

-♦-GM-Tri-DAP 200мкг/мышь

f

го

10

-A- GM-Tri-DAP 200мкг/мышь+ флагеллин 1мкг/мыи|ь

о

7

11 13 IS 17 19 21 23 25 37 29 31 33 35

Рисунок 13. Диаграмма среднего веса (А) и выживаемости (Б) мышей линии BALB/c. К- контрольная группа мышей, перорально зараженных S. typhimurium в дозе 1x10' КОЕ/мышь; флагеллин 1мкг/мышь — группа мышей, которым за 9 часов до пероралыюго заражения S. typhimurium в дозе 5x1 (Iй КОЕ/мышь вводили внутримышечно флагеллин - 1мкг/мышь; GM-Tri-DAP 200мкг/мышь + флагеллин 1мкг/мышь - группа мышей, которым за 11 часов до пероралыюго заражения S. typhimurium в дозе 5х106 КОЕ/мышь внутримышечно вводили GM-Tri-DAP 200мкг/мышь, а через 2 часа (за 9 часов до заражения) тем же животным вводили флагеллин - 1мкг/мышь; GM-Tri-DAP 200мкг/мышь - группа мышей, которым за 9 часов до перорального заражения S. typhimurium в дозе 5x106 КОЕ/мышь внутримышечно вводили GM-Tri-DAP 200мкг/мышь.

В результате эксперимента было установлено, что повышенные относительно контрольной группы животных показатели выживаемости (до 80%) были получены только в группе животных, получивших последовательную инъекцию флагеллина в дозе 1 мкг/мышь через 2 часа после введения GM-Tri-DAP (200мкг/мышь). Кроме того, мыши данной группы показали меньшую потерю веса среди остальных групп в ходе всего периода наблюдения.

Таким образом, результаты эксперимента доказывают, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов, приводящая к эффекту потенциирования уровня активации NF-kB в тонком и толстом кишечнике формирует протективный иммунитет животных при инфекции энтеропатогенным видом бактерий.

Полученные в результате работы данные описывают сочетанную работу различных патгерн-распознающих рецепторов врождённого иммунитета и определяют один из принципов функционирования иммунной системы, при

котором поэтапное распознавание структур патогенного микроорганизма в процессе его инвазии необходимо для формирования наиболее эффективного противоинфекционного иммунитета.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что среди проанализированных видов бактерий наиболее эффективным продуцентом лиганда NOD1 рецептора является штамм Neisseria meningitidis 591(B:NT:P 1.1,2).

2. Разработана методика очистки лиганда NOD1 рецептора, выделенного из наиболее эффективного бактериального штамма-продуцента - N. meningitidis.

3. Идентифицирована первичная структура лиганда NOD1 рецептора, выделенного из N. meningitidis, являющаяся фрагментом пептидогликана бактерии: М-ацетил-О-глкжозамин N-ацетилмурамил- L-Ala-D-Glu-M-Dap (GM-TriDAP).

4. Показано, что лиганд NOD1 рецептора - GM-Tri-DAP, выделенный из N. meningitidis, обладает сравнимой NF-kB активирующей способностью с синтетическими лигандами, имеющими в своей структуре трипептид L-Ala-D-Glu-L-mDAP.

5. Впервые показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту потенциирования (повышения до 4 раз) уровня активации транскрипционного фактора NF-kB в условиях in vitro и in vivo по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов.

6. Впервые показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту потенциирования (повышения до 8 раз) уровней секреции ИЛ-5,6,13,21 в условиях in vivo (в периферической крови и тканях тонкого кишечника животных).

7. Впервые показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов на 50% увеличивает выживаемость животных при инфекции летальными дозами Salmonella enterica Typhimurium по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Тухватулин А. И., Логунов Д. Ю., Гитлин И. И., Шмаров М. М., Кудан П. В., Аджиева А. А., Мороз А. Ф., Костюкова Н. Н., Бурделя JI. Г., Народицкий Б. С., Гинцбург A. JI., Гудков А. В. Изучение способности лигандов рецептора NOD 1 активировать транскрипционный фактор NF-kB в условиях in vitro и in vivo/ Acta naturae.-2011.- томЗ.-№ 1 (8) .-С. 69-77

2. Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народицкий Б.С., Гудков A.B., Гинцбург А.Л. TOLL-подобные рецепторы и их адапторные молекулы / Биохимия. -2010. -том 75. -вып. 9. -С. 1224 - 1243.

3. Щебляков Д. В., Логунов Д. Ю., Тухватулин А. И., Шмаров М. М., Народицкий Б. С., Гинцбург А. Л. Толл-подобные рецепторы (TLR) и их значение в опухолевой прогрессии/ Acta naturae. -2010. -том 2. - № 3 (6) . -С.28-37

4. Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Костюкова H.H., Мороз А.Ф., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Лиганд NOD рецептора 1, полученный из Neisseria meningitidis серогруппы В. Его структура и биологические свойства in vitro и in vivo. /Материалы XIV-ro Всероссийского форума с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И.Иоффе. - Санкт-Петербург. -2011г.

5. Тухватулин А.И.. Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Костюкова H.H., Мороз А.Ф., Народицкий Б.С. Поиск эффективных молекулярных адъювантов, с использованием эукариотической тест-системы, созданной на основе клеток, экспрессирующих различный набор Толл-подобных рецепторов / Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Казань. -2009г.

Подписано в печать 25.10.2011 г.

Заказ № 378 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тухватулин, Амир Ильдарович

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика То11-подобных рецепторов.

1.1.1. Классификация, структура и функции То11-подобных рецепторов.

1.1.2. Сигнальные пути, ассоциированные с То11-подобными рецепторами.

1.1.3. Участие То11-подобных рецепторов в формировании реакций врожденного и приобретенного иммунитета.

1.2. Общая характеристика NOD-подобных рецепторов.

1.2.1. Общая характеристика NOD-подобных рецепторов.

1.2.2. Сигналирование NOD-подобных рецепторов.

1.2.3. Лиганды и биологические эффекты NOD рецепторов.

1.3. Участие NOD- и То11-подобных рецепторов в формировании полноценного иммунного ответа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Лиганды паттерн-распознающих рецепторов (NODl,TLR2,4,5).

2.1.5. Лабораторные животные.

2.1.6. Ферменты и другие реактивы.

2.1.7. Лабораторное оборудование.

2.2. Методы.

2.2.1. Подготовка компетентных клеток Escherichia coli штамма DH5a.

2.2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.3. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.4. Условия культивирования Neisseria meningitidis для препаративного выделения лиганда NOD1 рецептора.

2.2.5. Определение интенсивности биолюминесценции в эукариотических клетках.

2.2.6. Определение интенсивности биолюминесценции в образцах гомогенатов органов трансгенных мышей линии BALB/c.

2.2.7. Измерение интенсивности биолюминисценции в организме трансгенных мышей BALB/c в режиме реального времени.

2.2.8. Измерение концентрации цитокинов в сыворотке периферической крови и гомогенате кишечника.

2.2.9. Постановка полимеразной цепной реакции.

2.2.10. Измерение активности Р-галактозидазы в культуре эукариотических клеток.

2.2.11. Измерение активности щелочной фосфатазы SEAP в культуре эукариотических клеток.

2.2.12. Определение количества живых клеток по окраске метиленовым голубым.

2.2.13. Определение количества живых клеток по реакции с субстратом МТТ.

2.2.14. Получение лентивируса методом котрансфекции.

2.2.15. Выделение тотальной РНК из культуры клеток.

2.2.16. Реакция обратной транскрипции.

2.2.17. Трансформация клеток Е. coli.

2.2.18. Иммуноблотинг.

2.2.19. Получение модифицированных линий клеток.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Анализ способности различных грамотрицательных бактерий активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействия с NOD 1 рецептором.

3.2. Анализ способности менингококков различных серогрупп активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействия с NOD1 рецептором.

3.3. Выделение и очистка молекулы, способной активировать транскрипционный фактор NF-kB при взаимодействии с NOD1 рецептором.

3.4. Идентификация первичной структуры фрагмента менингококка серогруппы В, являющегося лигандом NOD1 рецептора.

3.5. Сравнительный анализ NF-kB-активирующей способности лиганда NOD1 рецептора выделенного из N. meningitidis с другими молекулами различной структуры в условиях in vitro.

3.6. Сравнительный анализ NF-kB-активирующей способности лигандов NOD1 и TLR рецепторов в условиях in vitro.

3.7. Определение влияния совместной стимуляции NOD1 и TLR рецепторов на уровень активации NF-kB в условиях in vitro.

3.8. Изучение NF-kB-активирующей способности NOD1 рецептора в-условиях in vivo.

3.9. Определение влияния совместной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень активации NF-kB в условиях in vivo.

3.10. Определение влияния эффекта усиления активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень секреции* цитокинов и хемокинов в сыворотке периферической крови и гомогенате тонкого и толстого кишечника.

3.11. Определение влияния эффекта усиления активации NF-kB при совместной стимуляции NOD1 и TLR5 на формирование протективного иммунитета к летальным дозам Salmonella enterica typhimurium в условиях in vivo.

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота дцРНК - двухцепочечная РНК

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон кДа - килодальтон

КОЕ - колониеобразующая единица оцРНК - одноцепочечная РНК оч. - (реактив) бой чоты

РНК — рибонуклеиновая кислота

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа х.ч. — (реактив) химически чистый

AD - acidic transactivating domain

ASC - Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD AP-1— активаторный белок

BHI — культуральная среда, содержащая экстракт сердца и мозга крупного рогатого скота

BIR - домен белка ингибитора апоптоза бакуловируса

CARD - домен, рекрутирующий и активирующий каспазу

CD — кластер дифференцировки c-IAPl - белок, ингибитор апоптоза

CLR- лектиновый рецептор С-типа

CMV - цитомегаловирус

Сох-2 - циклооксигеназа

DAP - диаминопимелиновая кислота

DD - домен смерти

GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа GlcNAc - N-ацетилглюкозамин

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

HMGB1 - High-mobility group protein B

HSP70 - белок теплового шока с молекулярной массой 70кДа

IAP — ингибитор апоптоза

IFN - интерферон

IgG - иммуноглобулин

IkB - ингибитор ядерного фактора «каппа-би» IKK - IkB киназа

IL-1R - рецептор к интерлейкину iNOS - индуцируемая NO-синтаза

IRAK - киназа, ассоциированная с рецептором ИЛ

IRF - интерферон регулирующий фактор

JNK — с-Jim N-концевая киназа

LRR — повторы богатые лейцином

Lys — лизин

MAL - Му088-подобный адаптерный белок

MAP - митоген активируемая киназа

МСР-1 - моноцитарный хемоатрактантный белок

MD2 - лимфоцитарный антиген 96,

MDP - мурамилдипептид

МНС - главный комплекс гистосовместимости MIP-1 - макрофагальный воспалительный белок 1 МКК = МЕК - киназы MAP киназ MurNAc - N-ацетилмурамовая кислота

MyD88 - белок 88 первичного ответа миелоидной дифференциации

NAIP - Baculoviral IAP repeat-containing protein

NEMO - эссенциальный модулятор NF-kB

NF-kB - ядерный фактор «каппа-би»

NLR - NOD-подобный рецептор

NOD - белок содержащий олигомеризующийся домен, связывающий нуклеотиды

OD - оптическая плотность

ONPG - О-нитрофенил-Ь-Б-галактопиранозид

PAMP - патоген-ассоциированный молекулярный паттерн

PGN - пептидогликан

PRR - паттерн-распознающий рецептор

PYD - N-terminal pyrin domain р38 - митоген-активируемая киназа с молекулярной массой 38кДа RHIM -RIP homotypic interaction motif

RICK - серин/треониновая киназа, взаимодействующая с рецептором

RIG — белковый продукт гена, индуцибельного ретиноевой кислотой

RIP- киназа, взаимодействующая с рецептором

RLR - RIG-подобный рецептор

ROS - активные формы кислорода

SDS - натрия додецилсульфат

SOD - супероксиддисмутаза

SP-A - сурфактантный белок А

SP-B- сурфактантный белок В

ТАВ1 — ТАК1-связывающий белок

ТАК - transforming growth factor-b-activated protein kinase

TIR -домен гомологичный Toll/интерлейкин 1 рецепторам

TLR - То11-подобный рецептор

TNFa - фактор некроза опухоли альфа

TRADD - белок, ассоциированный с «доменом смерти» рецептора ФНОа TRAF - фактор, ассоциированный с рецептором к фактору некроза опухоли TIRAP - toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain containing adaptor protein

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная и биологическая характеристика лиганда рецептора NOD1, выделенного из Neisseria meningitidis"

Изучение принципов распознавания патогенов клетками макроорганизма, а также молекулярных механизмов активации последующих иммунных реакций, остается актуальной задачей до настоящего времени.

Важным событием позволившим сделать значительный шаг в понимании механизмов первичного распознавания иммунной системой патогенов стало открытие около 20 лет назад первых представителей паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета (pattern-recognition receptors (PRRs)): Toll (у насекомых), и То11-подобных (у хордовых) рецепторов [115, 135]. Было установлено, что эти рецепторы, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, узнают не уникальные эпитопы антигенов (в том числе и высоковариабельные), а определенные высококонсервативные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)), находящиеся в составе патогенных организмов [135].

К настоящему моменту, идентифицировано пять семейств паттерн-распознающих рецепторов: мембраносвязанные То11-подобные рецепторы (Toll-like receptors (TLR)) и лектиновые рецепторы С-типа (C-type lectin receptors (CLR)), цитозольные RIG-подобные (RIG-like receptors (RLR)) и NOD-подобные (NOD-like receptors (NLR)), а также секретирующиеся во внеклеточную среду пентраксины и коллектины, относимые к суперсемейству лектиновых рецепторов С-типа, и фикколины [3,9].

Представители данных семейств рецепторов экспрессируются широким спектром клеток, включая как иммунокомпетентные, так и неиммунокомпетентные клетки эпителиального и мезенхимального происхождения. При этом большинство PRR способно распознавать целый спектр РАМР, имеющих различную химическую структуру и происхождение [214].

Таким образом, используя ограниченный набор эмбрионально-кодируемых PRR клетки макроорганизма способны распознавать присутствие различных патогенов (бактерий, грибов, вирусов, простейших, гельминтов).

Связывание собственных лигандов с паттерн-распознающими рецепторами приводит к запуску внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих, в конечном итоге, к активации ряда транскрипционных факторов (АР-1, NF-kB, IRF 3,5,7 и др.), регулирующих развитие тех или иных защитных реакций иммунной системы.

Среди них NF-kB является основным провоспалительным транскрипционным фактором, регулирующим экспрессию ряда молекул, которые могут принимать участие в развитии реакций как врожденного, так и приобретенного иммунитета: секреция провоспалительных цитокинов и хемокинов, синтез антимикробных пептидов, активация фагоцитоза макрофагами, созревание дендритных клеток и др. [19].

Одними из PRR, активация которых приводит к индукции NF-kB являются представители наиболее изученного семейства мембраносвязанных То11-подобных рецепторов. Действительно, на сегодняшний день получено множество данных, доказывающих участие данных рецепторов в целом спектре иммунных реакций: усилении фагоцитоза, секреции антибактериальных пептидов, активации макрофагов, активации, и созревании дендритных клеток, процессинге и презентации антигена дендритными клетками, активации зрелых Т-клеток, повышении экспрессии костимуляторных молекул CD80 и CD86 (необходимых для активации наивных С04+-Т-клеток), пролиферации и созревания В-клеток во время инфекции, прямой активации В клеток памяти и последующей продукции антител, в том числе IgG и многих других [155].

Ключевая роль То11-подобных рецепторов в формировании полноценного антимикробного иммунитета была показана в различных экспериментах с г■ использованием мышей с нокаутными генами данных рецепторов. Было показано, что отсутствие TLR2,4,11 драматически сказывается на выживаемости мышей при инфекции их различными патогенными

10 микроорганизмами: Mycobacterium tuberculosis [166], Staphylococcus aureus [193] Trypanosoma cruzi [104] и др.

Способность лигандов То11-подобных рецепторов запускать различные реакции иммунной системы позволяет использовать данные молекулы в качестве средств немедленной защиты против патогенов, молекулярных адьювантов и др. [89,205].

По сравнению с То11-подобными рецепторами способность NOD рецепторов активировать NF-kB изучена в значительно меньшей степени.

Лигандами NOD рецепторов являются различные молекулы, представляющие собой фрагменты пептидогликана грамположительных и грамотрицательных бактерий. Было показано, что минимальным фрагментом пептидогликана достаточным для активации NOD1-рецептора, является дипептид D-Glu-mDAP (iE-DAP), присутствующий в составе клеточной стенки большинства грамотрицательных бактерий: Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica typhimurium и др. [31]. Однако вклад других аминокислот и моносахаридов, входящих в состав пептидогликана бактерий различных видов в NF-kB-активирующую способность лигандов NOD1-рецептора на сегодняшний день мало изучен. Также практически отсутствуют данные, описывающие значение NOD рецепторовв< формировании защитных иммунных реакций и протективного иммунитета в условиях in vivo [103].

Еще меньше данных получено при изучении совместного функционирования То11-подобных и NOD рецепторов в распознавании целого патогенного« микроорганизма и определение вклада того или иного типа паттерн-распознающего рецептора в формировании полноценного протективного иммунитета организма.

Изучение совместного функционирования мембраносвязанных Tollподобных и цитозольных NOD рецепторов позволит не только идентифицировать фундаментальные механизмы функционирования данных рецепторов, необходимые для формирования полноценного протективного

11 иммунитета, но и предоставит возможность создания на основе композиций лигандов паттерн-распознающих рецепторов целого спектра иммунобиологических препаратов: эффективных средств немедленной защиты от инфекции; молекулярных адъювантов, в составе вакцин нового поколения и многих др. [7].

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы являлось изучение NF-kB-активирующей способности NOD рецептора 1, а* также его роли в индукции иммунных реакций, включая участие в формировании антибактериального иммунитета совместно с ТоН-подобными рецепторами.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие.задачи.

1. Провести сравнительный анализ различных видов бактерий с целью выявления наиболее эффективного продуцента лиганда NOD 1 рецептора.

2. Разработать технологию очистки лиганда NOD1 рецептора из наиболее эффективного бактериального штамма-продуцента.

3. Идентифицировать первичную структуру лиганда NOD1 рецептора выделенного из бактериального штамма-продуцента.

4. Провести сравнительный анализ NF-kB-активирующей способности лиганда NOD1 рецептора, выделенного из бактериального- штамма-продуцента, с другими лигандами NOD1 рецептора с различной*, структурой в условиях in vitro.

5. Определить влияние совместной стимуляции NOD1 и То11-подобных рецепторов на уровень активности, транскрипционного фактора NF-kB в условиях in vitro и in vivo.

6. Определить влияние совместной стимуляции NOD1 рецептора и Toll-подобного рецептора 5 на уровень секреции цитокинов в условиях in vivo.

7. Определить влияние совместной активации NOD1 и То11-подобного рецептора 5 на формирование антибактериального иммунитета в условиях in vivo.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В результате проведенной работы впервые из Neisseria meningitidis серогруппы В была выделена молекула-лиганд NOD1 рецептора и идентифицирована ее первичная структура. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизма1 распознавания' врожденной иммунной системой организма хозяина внутриклеточное локализованных бактерий. Впервые был проведен сравнительный анализ NF-kB-активирующей способности лиганда NOD1 рецептора, выделенного из Neisseria meningitidis серогруппы В, с другими лигандами NOD1 рецептора с различной структурой в условиях in vitro, а также впервые были определены характеристики (интенсивность, кинетика) NOD 1-опосредованной активации NF-kB в условиях in vivo.

Впервые были определены различия в способности лигандов NOD1 и Toll-подобных рецепторов активировать NF-kB в условиях in vitro и in vivo.

Впервые* было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту повышения (потенцирования) активации NF-kB по сравнению с изолированной стимуляцией данных паттерн-распознающих рецепторов в условиях in vitro и in vivo. Была показана зависимость данного эффекта от последовательности стимуляции указанных паттерн-распознающих рецепторов. В условиях in vivo впервые было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит также к повышению (потенцированию) уровней секреции цитокинов в периферической крови и тканях тонкого кишечника.

Впервые показано, что по сравнению с изолированной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, последовательная стимуляция данных рецепторов увеличивает на 50% выживаемость животных при инфекции летальными дозами Salmonella enterica Typhimurium.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизма распознавания патогенов врожденной иммунной системой организма хозяина и последующем формировании иммунных реакций, но и в перспективе может иметь практическое применение. Полученные данные, показывающие эффект усиления реакций иммунного ответа организма при введении сочетаний лигандов паттерн-распознающих рецепторов, принадлежащих к различным семействам, могут быть использованы при создании многокомпонентных молекулярных адъювантов. Данные адъюванты могут применяться в составе более эффективных вакцин нового поколения совместно с протективными антигенами, обладающими низкой иммуногенностью (например, капсульным полисахаридом Neisseria meningitidis серогруппы В) [7].

Результаты, полученные в данной работе, также могут быть использованы в применении комбинаций лигандов паттерн-распознающих рецепторов в качестве средств немедленной защиты от патогенных микроорганизмов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тухватулин, Амир Ильдарович

выводы

1. Показано, что среди проанализированных видов бактерий наиболее эффективным продуцентом лиганда NOD Г рецептора является штамм Neisseria meningitidis 591 (B:NT:P1.1,2).

2. Разработана технология очистки лиганда NOD1 рецептора; выделенного из наиболее эффективного бактериального;штамма-продуцента N. meningitidisС

3. Идентифицирована: первичная: структура лиганда' NOD1 рецептора' выделенного из N. meningitidis, являющаяся фрагментом; пептидогликана бактерии: №ацетилтО-глюкозамин-№ацетилмурамил- L-Alä-D.-Glü-MrDap (GM-TriDAP). : .

4. Показано, что лиганд NOD1 рецептора - GM-Tri-DAP, выделенный из N. meningitidisобладает: сравнимой NF-kB-активирующей способностью с синтетическими? лигандами, имеющими в своей структуре трипептид L-Ala-D-Glu-L-mDAP. • '

5. Впервые показано, что последовательная стимуляция; NOD Ь и TLR5 рецепторов; приводит к: эффекту потенциирования (повышения? до 4 раз) уровня^активации транскрипционного фактора NF-kB в условиях in vitro и in vivo по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов.

6. Впервые показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту потенциирования (повышения до 8 раз) уровней секреции ИЛ-5, 6, 13, 21 в условиях in vivo (в> периферической крови и тканях тонкого кишечника животных).

7. Впервые показано, что последовательная стимуляция NÖD1- и TLR5, рецепторов на 50% увеличивает выживаемость,; животных при инфекции летальными? дозами; Salmonella enterica Typhimurium по сравнению с изолированной стимуляцией'данных рецепторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тухватулин, Амир Ильдарович, Москва

1. Дьяченко А.Г. Демьянова А.А., Балута И.М., Кучма И.Ю., Леизин В.В., Волянский А.Ю. Факторы вирулентности сальмонелл патогенез сальезной инфекции // Микробиология и биотехнология — 2010. 4-С. 26-43

2. Ивашкин В.Т. Основные понятия и положения фундаментальной иммунологии // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии 2008. - 4, С.4-13

3. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., ЕЬ1конова А.С., Распознающие рецепторы врожденного иммунитета (NLR, RLR и CLR)// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2011.-N 1.-С.93-100

4. Костюкова Н.Н. Молекулярно-биологические механизмы менингококкового бактерионосительства// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000.-N 4п.-С. 17-22

5. Лабинская А.С., Костюкова Н.Н., Иванова С.М., Руководство по медицинской микробиологии. БИНОМ 2010. 1152с.

6. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета.// Иммунология — 2005. — 26(6) — С. 368-376.

7. Петров Р.В.Хаитов P.M. Иммуногены и вакцины нового поколения М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 608 с. :

8. Стыскин Е.Л. Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография Москва.1986— 114 с.

9. Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народицкий Б.С., Гудков А.В., Гинцбург А.Л.ТоН-подобные рецепторы и их адаптерные молекулы.//Биохимия 2010. - 75(9) - С.1098-114.

10. Abbott D:W., Wilkins A., Asara J.M., Cantley L.C. The Crohn's disease protein, NOD2, requires RIP2 in order to induce ubiquitinylation of a novel site on NEMO.//Curr. Biol. 2004. - 14(24) - C.2227-27.

11. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signalling.//Nat. Rev. Immunol. 2004. - 4(7) - C.499-511.

12. Akira S., Hemmi H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family .//Immunol. Lett. -2003. 85(2) - C.85-95.

13. Alexopoulou L., Holt A.C., Medzhitov R., and Flavell R.A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.//Nature 2001. - 413(6857) - C.732-8.

14. Amer A.O., Swanson M.S. Autophagy is an immediate macrophage response to Legionella pneumophila.//Cell Microbiol. 2005. - 7(6) - C.765-78.

15. Andersen-Nissen E., Smith K.D., Strobe K.L., Barrett S.L., Cookson B.T., Logan S.M., and Aderem A. Evasion of Toll-iike receptor 5 by flagellated bacteria.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2005. - 102(26) - C.9247-52.

16. Aravind L., Dixit V.M., and Koonin E.V. Apoptotic molecular machinery: vastly increased complexity in vertebrates revealed by genome comparisons.//Science 2001. - 291(5507) - C.1279-84.

17. Baeuerle P.A., Henkel T. Function and activation of NF-kappa B in the immune system.//Annu. Rev. Immunol. 1994 - 12 - C.141-79.

18. Barton G.M., Medzhitov R. Toll-like receptor signaling pathways.//Science — 2003. 300(5625) - C.1534-5.

19. Bergsbaken T, Cookson BT. Macrophage activation redirects Yersinia-infected host cell death from apoptosis to caspase-l-dependent pyroptosis.//PLoS Pathog.- 2007 3:el61

20. Boyden E.D., Dietrich W.F. Nalplb controls mouse macrophage susceptibility to anthrax lethal toxin.//Nat. Genet. 2006 - 38(2) - C.240-4.

21. Bruey J.M., Bruey-Sedano N., Newman R., Chandler S., Stehlik C., Reed J.C. PAN1/NALP2/PYPAF2, an inducible inflammatory mediator that regulates NFkB and caspase-1 activation in macrophages.//!; Biol. Chem. 2004 - 279(50) —1. C.51897-907.

22. Carlsen H., Moskaug J.O., Fromm S.H., Blomhoff R. In vivo imaging of NF-kappa B activity .//J. Immunol. 2002. -168(3) - C.1441-6.

23. Carmody R.J., Chen Y.H. Nuclear factor-kappaB: activation and regulation during toll-like receptor signaling.//Cell. Mol. Immunol. 2007. - 4(1) - C.31-41.

24. Chen G., Shaw M.I I., Kim Y.G., Nunez G.NOD-like receptors: role in innate immunity and inflammatory disease.//Annu. Rev. Pathol. — 2009. 4 - C.365-98.

25. Chen Z.J.Ubiquitin signalling in the NF-kappaB pathway.//Nat. Cell Biol. — 2005 -7(8)-C.758-65.

26. Chow J.C., Young D.W., Golenbock D.T., Christ W.J., and Gusovsky F. Tolllike receptor-4 mediates lipopolysaccharide-induced signal transduction.//J; Biol. Chem. 1999 274(16) - C.l 0689-92.

27. Compton T., Kurt-Jones E.A., Boehme K.W., Belko J'.,.Eatz E., Golenbock

28. D.T., and Finberg R.W. Human cytomegalovirus activates inflammatory cytokine responses via CD 14 and Toll-like receptor 2.// J: Virol. 2003: 77(8) -C.4588-96.

29. Dostert C., Petrilli V., Van Bruggen R., Steele C., Mossman B.T., Tschopp J. Innate immune activation through Nalp3 inflammasome; sensing of asbestos and silica.//Science 2008. - 320(5876) - C.674-7.

30. Dziarski^ R., and Gupta, D. Staphylococcus aureus peptidoglycan is a toll-like receptor 2 activator: a reevaluation.//Infect. Immun. — 2005. 73(8) - C.5213-6.

31. Faustin B, Lartigue L, Bruey JM, Luciano F, Sergienko E, Bailly-Maitre B, Volkmann N, Hanein D, Rouiller I, Reed JG. Reconstituted NALP1 inflammasome reveals two-step mechanism of caspase-1 activation.//Mol. Cell — 2007. 25(5) - C.713-24.

32. Figucircdo M.D., Vandenplas M.L., Hurley D.J.,. Moore J.N. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides induce inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2.//Vet Immunol Immunopathol. 2009. - 127(1-2) - C.l 25-34.

33. Fink S.L., Bergsbaken T., Cookson B.T. Anthrax lethal toxin and Salmonella elicit the common cell death pathway of caspase-l-dependent pyroptosis via distinct mechanisms.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2008. - 105(11) - C.4312-7.

34. Fink. S.L., Cookson B.T. Pyroptosis and host cell death responses during Salmonella infection.//Cell Microbiol. 2007. - 9(11) - C.2562-7

35. Fitzgerald K.A., McWhirter S.M., Faia K.L., Rowe DlC., Latz E., Golenbock D.T., Coyle A.J., Liao S.M. and Maniatis T. IKKepsilon and TBK1 are essential components of the IRF3 signaling pathway .//Nat. Immunol. — 2003. 4(5) -C.491-6:

36. Franchi L., Kanneganti T.D., Dubyafc Gr;R:, Nunez G. Differential? requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria.//J. Biol. Chem., 2007. - 282(26) -C.18810-8

37. Frasnelli M.E., Tarussion D., Chobaz-Peclat V., Busso N., and So A. TLR2 modulates inflammation in zymosan-induced arthritis in mice.//Arthritis Res. Ther. 2005. - 7(2) - C.370-9.

38. Gazzinelli R.T., and Denkers E.Y.Protozoan encounters with Toll-like receptor signalling pathways: implications for host parasitism.//Nat. Rev. Immunol., — 2006. 6(12) - C.895-906

39. Gewirtz A.T., Navas T.A., Lyons S., Godowski P.J., Madara J.L. Cutting edge: bacterial flagellin activates basolaterally expressed TER5 to induce epithelial proinflammatory gene expression.//!. Immunol. 2001. - 167(4) - C.1882-5.

40. Girard R., Pedron T., Uematsu S., Balloy V., Chignard M., Akira S., and Chaby R. Lipopolysaccharides from Legionella and Rhizobium stimulate mouse bone marrow granulocytesvia Toll-like receptor 2.//J'. Cell Sci. 2003. - 116(Pt 2) - C.293-302.

41. Girardin S.E., Tournebize R., Mavris M., Page A.L., Li X., Stark G.R., Bertin J., DiStefano P.S., Yaniv M., Sansonetti P.J., Philpott D.J. CARD4/Nodl mediates NF-kB and JNK activation by invasive Shigella flexneri.//EMBO Rep. -2001.-2(8)-C.736-42.

42. Hasegawa M., Fujimoto Y., Lucas P.C., Nakano H., Fukase K., Nünez G., Inohara N.A critical role of RICK/RIP2 polyubiquitination in Nod-induced NF-kB activation.//EMBO J. 2008. 27(2) - C.373-83.

43. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn T.R., Yi E.C., Goodlett D.R., Eng J.K., Akira S., Underhill D.M. and Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5.//Nature 2001. -410(6832) - C.1099-103.

44. Hayden M.S., Ghosh S. Signaling to NF-KB.//Genes Dev. 2004. - 18(18) -C.2206-225.

45. Hedl M., Li J., Cho J.H., Abraham C. Chronic stimulation of Nod2 mediates tolerance to bacterial products.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. - 104(49) -C.19440-5

46. Heil F., Hemmi H., Hochrein H., Ampenberger F., Kirschning C., Akira S., Lipford G., Wagner H., and Bauer S. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8.//Science 2004. 303(5663) -C.1536-9

47. Hemmi H., Kaisho T., Takeuchi O., Sato S., Sanjo H., Hoshino K., Horiuchi T., Tomizawa H., Takeda K. and Akira S. Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway .//Nat. Immunol. 2002 - 3(2) - C. 196-20

48. Herskovits A.A., Auerbuch V., Portnoy D.A. Bacterial ligands generated in a phagosome are targets of the cytosolic innate immune system. //PLoS Pathog -2007. 3(3):e51.

49. Hirschfeld M., Kirschning C.J., Schwandner R., Wesche H., Weis J.H., Wooten R.M., and Weis J.J. Cutting edge: inflammatory signaling by Borrelia burgdorferi lipoproteins is mediated by toll-like receptor 2.//J. Immunol. 1999. -163(5) - C.2382-6

50. Hisamatsu T., Suzuki M., Reinecker H.C., Nadeau W.J., McCoraiick B.A., Podolsky D.K. CARD15/NOD2 functions as an antibacterial factor in human intestinal epithelial cells.//Gastroenterology. 2003. - 124(4) - C.993-1000.

51. Inohara N, Koseki T, del Peso L, Hu Y, Yee G, Chen S, Carrio R, Merino J, . Liu D, Ni J, Nunez G. Nodl, an Apaf-l-like activator of caspase-9 and nuclearfactor-KB.//J. Biol. Chem. 1999. - 274(21) -C.14560-7. :

52. Inohara N., Koseki T., Lin J, del Peso L., Lucas P.G., Chen F.F., Ogura Y., Nunez G. An induced proximity model for NF-kB activation in the Nodi/RICK and RIP signaling pathways.//J. Biol. Chem. 2000. - 275(36) - C.27823-31.

53. Iwasaki A., Medzhitov R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. //Science. 2010. - 327(5963) - C.291-295.

54. Johnson G.B., Brunn G.J., Kodaira Y., and Piatt J.L. Rieceptor-mediated . monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparan sulfate by Toll. like receptor 4.//J/Immunol., 2002; -168(10)- C.5233-9

55. Jurk M., Heil F., Vollmer J;, Schetter G., Krieg A.M., Wagner H., Lipford G., and Bauer S. Human TLR7 or TLR8 independently confer responsiveness to the antiviral compound R-848.//Nat. Immunol., 2002. - 3(6) - C.499.

56. Kaisho T., Akira S.Toll-like receptors as adjuvant receptors.//Biochim Biophys Acta.-2002.-1589(1)-C.l-13.

57. Kanneganti T.D., Ozoren N., Body-Malapel ML, Amer A., Park J.H., Franchi L., Whitfield J., Barchet W., Colonna M., Vandenabeele P., Bertin J., Coyle A.,

58. Grant E.P., Akira S., Nunez G. Bacterial RNA and small antiviral compounds activate caspase-1 through cryopyrin/Nalp3. //Nature 2006. - 440(7081) -C.233-6

59. Kawai T., Adachi O., Ogawa T., Takeda K., Akira S. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin.//Immunity. 1999. - 11(1) - C.115-22.

60. Kawai T., Akira S. TLR signaling.//Cell Death Differ. 2006. - 13(5) - C.816-25.

61. Kawasaki K., Akashi S., Shimazu R., YoshidaT., Miyake K., and Nishijima M. Mouse toll-like receptor 4.MD-2 complex mediates lipopolysaccharide-mimetic signal transduction by Taxol.//J. Biol. Chem., 2000; - 275(4) - C.2261-4.

62. Kim J.G., tee S.J., Kagnoff M.F. Nodi is an essential' signal transducer in intestinal epithelial cells infected with bacteria that avoid'recognition by toll-like receptors .//Infect. Immun. 2004. - 72(3) - C.1487-95.

63. Kim- Y.G., Park J.H., Shaw M.H., Franchi L., Inohara N:, Nunez G. The cytosolic sensors-Nodi and Nod2 are critical for bacterial recognition and host defense after exposure to Toll-like receptor ligands.//Immunity. 2008 - 28(2) -C.246-57

64. Kirschning C.J., Wesche H., Ayres T.M., and. Rothe M. Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide.//J. Exp. Med.,- 1998. 188(11) - C.2101-7.

65. Kobayashi K., Hernandez L.D., Galan J.E., Janeway Jr. C.A., Medzhitov R. and Flavell R.A. IRAK-M is a negative regulator of Toll-like receptor signaling.//Cell 2002. -110(2) - C.191-203.

66. Kobayashi K.S, Chamaillard M1., Ogura Y., Henegariu O., Inohara N., Nunez G., Flavell R.A. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract.//Science. 2005 - 307(5710) - C.731-4.

67. Koga R., Hamano S., Kuwata H. h ,n,p. TLR-dependent induction of IFN-beta mediates host defense against Trypanosoma cruzi.//J. Immunol. 2006 - 177(10)- C.7059-7066.

68. Kufer T.A., Kremmer E., Adam A.C., Philpott D.J., Sansonetti P.J. The pattern^ecognition molecule Nodi is localized at the plasma membrane at sites of bacterial interaction.//Cell Microbiol. 2008. - 10(2) - C.477-86

69. Latz E., Schoenemeyer A., Visintin A., Fitzgerald K.A., Monks-B.G., Rnetter C.F., Lien E., Nilsen N.J., Espevik T., and Golenbock D.T. TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome.//Nat. Immunol., — 2004. 5(2) - C,190-8

70. Leadbetter E.A., Rifkin I.R., Hohlbaum A.M., Beaudette B.C., Shlomchik M.J., and Marshak-Rothstein A. Chromatin-IgG complexes activate B cells by dual engagement of IgM and Toll-like receptors.//Nature, 2002 - 416(6881) -C.603-7.

71. Leber J.H., Crimmins G.T., Raghavan S., Meyer-Morse N.P., Cox J.S., Portnoy D.A. Distinct TLR- and NLR-mediated transcriptional responses to an intracellular pathogen.//PLoS Pathog. 2008. - 4(l):e6.

72. Lee J.Y., Sohn K.H., Rhee S.H., and Hwang D. Saturated fatty acids, but not unsaturated fatty acids, induce the expression of cyclooxygenase-2 mediated through Toll-like receptor 4.//J. Biol. Chem., 2001. - 276(20) - C. 16683-9.

73. Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, Hoffmann JA. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults .//Cell. — 1996. 86(6) - C.973-83.

74. Locovei S., Wang J., Dahl G. Activation of pannexin 1 channels by ATP through P2Y receptors and by cytoplasmic calcium.//FEBS Lett. 2006. - 580(1) - C.239-44

75. Lopez,.M., Sly, L.MÍV Luü, Y., Young, D;, Cooper, H., and Reiner, N.E. The 19-kDa Mycobacterium tuberculosis protein induces macrophage apoptosis through Toll-like receptor-2. //J. Immunol.,-2003. 170(5) - C.2409-16.

76. Mariathasan S., Weiss D.S., Dixit V.M., Monack D.M. Innate immunity against Francisella tularensis is dependent on the ASC/caspase-1 axis.//J. Exp. Med. 2005: - 203(8) - C.1043-9. .

77. Mariathasan- S;, Weiss D':S;,. Newton: K., McBride J., O'Rourke K., Roose-Girma M., Lee W.P., Weinrauch Y., Monack. D.M., Dixit V.M. Cryopyrin activates the inflammasome in: response to toxins and ATP.//Nature 2006: -440(7081) - C.228-32 ' : / Í ,

78. Martinon F., Agostini L., Meylan E., Tschopp. J. Identification: of bacterial muramyl dipeptide as activator of the NALP3/cryopyrin inflammasome.//Curr. Biol-- 2004;-14(21)- C.1929-34.

79. Martinon F., Burns K., Tschopp J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of pro-IL-p.//Mol. Cell. 2002. -10(2) - C.417-26.

80. Martinon F., Petrilli V., Mayor A., Tardivel A., Tschopp J; Gout-associated, uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome.//Nature — 2006. -440(7081)- C.237-41

81. Massari P;, Henneke P., Ho Y., Latz E., Golenbock D.T., and Wetzler L.M. Cutting edge: Immune stimulation by neisserial porins is toll-like receptor 2 and MyD88 dependent.//!; Immunol., 2002. -168(4) - C.1533-7.

82. Mazzoni A., and Segal D.M. Controlling the Toll road to dendritic cell polarization.//J. Leukoc. Biol., 2004. - 75(5) - C.721-30.

83. McDonald C, Chen FF, Ollendorff V, Ogura Y, Märchetto S, Lecine P, Borg JP^. Nunez G. A role for Erbin in the regulation of Nod2-dependent NF-kB signaling.//J. Biol. Chem. 2005. - 280(48) - C.40301-9

84. McDonald C., Inöhara N., Nunez G. Peptidoglycan signaling in innate immunity and inflammatory disease.//J. Biol. Chem. 2005. - 280(21) -C.20277-80

85. Medzhitov R., Janeway C. Jr. Innate immunity.//N Engl J Med. 2000. -343(5) - C.338-44. ■.';" . '

86. Medzhitov R., Prcston-IIurlburt P., Janeway C.A. Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity .//Nature. — 1997. 388(6640) - C.394-7. '

87. Medzhitov R^Toll-like receptors and innate immunity .//Nat. Rev. Immunol. 2001. 1(2) - C.l 35-45. . ; ; ,

88. Meylan E., Burns K., Hofmann K., Blancheteau V., Martinon F., Kelliher M. and Tschopp J. RIP1 is an essential mediator of Toll-like, receptor 3-induced NF-kappaB activation.//Nat. Immunol.— 2004 5(5):503-7 ,

89. Miao E.A., Ernst R.K., Dors M., Mao D.P., Äderem A. Pseudomonas-aeruginosa activates caspase 1 through Ipaf.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. - 105 - C.2562-67 -V"V;'

90. Molofsky A.B., Byrne B.G., Whitfield N.N., Madigan C.A., Fuse E.T., Tateda K., Swanson M.S. Cytösolic recognition of flagellin by mouse macrophages restricts Legionella pneumophila infection .//J; Exp. Med. 2006: - 204(4) -C.1093-104.

91. Mösmann T.R., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2 and more. //Immunol. Today. 1996. - 17(3) - C.138-46.

92. Netea M.G., van der Graaf C., van der Meer J.W., and Kullberg B.J. Recognition of fungal pathogens by Toll-like receptors .//Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004. - 23(9) - C.672-6

93. Nigro G., Fazio L.L.,. Martino M.C., Rossi G., Tattoli I., Liparoti V., De Castro C., Molinaro A., Philpott DJ., Bernardini M.L. Muramylpeptide shedding modulates cell sensing of Shigella flexneri. //Cell Microbiol. 2008. - 10(3) -C.682-95.

94. Ogura Y., Inohara N., Benito A., Chen F.F., Yamaoka S., Nunez G. Nod2, a Nodl/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-kappaB.//J Biol Chem. 2001. - 276(7) - C.4812-8.

95. Ohashi K., Burkart V., Flohe S., and Kolb H. Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex.//J. Immunol., 2000. - 164(2) - C.558-61.

96. Okamoto T., Sanda T., Asamitsu K. NF-kappa B' signaling and • carcinogenesis.// Gurr Pharm Des, 2007. - 13(5) - C.447-462.

97. Opitz B., Förster S., Hocke A.C., Maass M., Schmeck B., Hippenstiel S., Suttorp N., Knill M. Nodl-mediated endothelial cell activation by Chlamydophila pneumoniae.//Circ. Res. 2005. - 96(3) - C.319-26

98. Oshiumi H., Matsumoto M., Funami K., Akazawa T. and Seya T. TICAM-1 an adaptor molecule that participates in Toll-like receptor 3-mediated interferonbeta induction. //Nat. Immunol 2003. - 4(2) - C.161-7

99. Palm N.W., Medzhitov R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity .//Immunol Rev. 2009. - 227(1) - C.222-33.

100. Park J.H., Kim Y.G., Shaw M., Kanneganti T.D., Fujimoto Y., Fukase K., Inohara N., Nünez G. Nodl/RICK and TLR signaling regulate chemokine and antimicrobial innate immune responses in mesothelial cells.//J. Immunol. 2007. - 179 - C.514-21

101. Park J.H., Kim Y.G., McDonald C., Kanneganti T.D., Hasegawa M., Body-Malapel M., Inohara N., Nünez G. RICK/RIP2 mediates innate immune responses induced through Nodi and Nod2 but not TLRs. //J. Immunol. 2007. -178 - C.2380-86.

102. Park J.S., Svetkauskaite D., He Q., Kim J.Y., Strassheim D., Ishizaka A., and Abraham E. Involvement of toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by high mobility group box 1 protein.//J. Biol. Chem., 2004. - 279(9) - C.7370-7.

103. Pasare C., Medzhitov. R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity .//Microbes Infect. 2004. - 6(15) - C.1382-7.

104. Pauleau A.L., Murray PJL Role of nod2 in the response of macrophages to toll-like receptor agonists.//Mol. Cell Biol. 2003. - 23(21) - C.7531-9.

105. Pelegrin P., Surprenant A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-lß release by the ATP-gated P2X7 receptor.//EMBO J. 2006. -25(21) - C. 5071-82

106. Pop C., Timmer J., Sperandio S., Salvesen G.S. The apoptosome activates caspase-9 by dimerization.//Mol. Cell 2006. 22(2) - C.269-75.

107. Rassa J.C., Meyers J.L., Zhang Y., Kudaravalli R., and Ross S.R. Murine retroviruses activate B cells via interaction with toll-like receptor 4.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2002. - 99(4) - C.2281-6.

108. Reiling N., Hölscher C., Fehrenbach A. Cutting edge: Toll-like receptor (TLR)2- and TLR4-mediated pathogen recognition in resistance to airborne infection with Mycobacterium tuberculosis.//! Immunol. 2002. - 169(7) -C.3480-3484.

109. Ren T., Zamboni D.S., Roy C.R., Dietrich W.F., Vance R.E. Flagellin-deficient Legionella mutants evade caspase-1- and Naip5-mediated macrophage immunity.//PLoS Pathog. 2006. - (3):el8

110. Rosenzweig H.L., Galster K.T., Planck S.R., Rosenbaum J.T. NODI expression in the eye and functional contribution to IL-lbeta-dependent ocular inflammation in mice.//Invest Ophthalmol Vis Sei. 2009. - 50(4) - C.1746-53.

111. Sansonetti P.J., Phalipon A., Arondel J., Thirumalai K., Banerjee S., Akira S., Takeda K., Zychlinsky A. Caspase-1 activation of IL-lß and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation.//Immunity 2000. - 12(5) - C.581-90.

112. Scheibner K.A., Lutz M.A., Boodoo S., Fenton M J., Powell J.D., and Horton M.R. Hyaluronan fragments act as an endogenous' danger signal by engaging TLR2.//J. Immunol. 2006. - 177(2) - C.1272-81.

113. Schnare M., Holt A.C, Takeda K., Akira S. and Medzhitov R. Recognition of CpG DNA is mediated by signaling pathways dependent on the adaptor protein MyD88. //Curr. Biol. 2000. -10(18) - C.1139-42.

114. Schütze S., Potthoff K., Machleidt T., Berkovic D., Wiegmann K., Krönke M. TNF activates NF-kappa B by phosphatidylcholine-specific phospholipase C-induced "acidic" sphingomyelin breakdown.//Cell. 1992. - 71(5) - C.765-76.

115. Sharma S., tenOever B.R., Grandvaux N., Zhou G.P., Lin R. and Hiscott J. Triggering the interferon antiviral response through an IKK-related pathway .//Science, 2003. - 300(5622) - C.1148-51

116. Shaulian E. and Karin M. AP-1 as a regulator of cell life and death. //Nat. Cell. Biol. 2002. - (5):E131-6.

117. Shimizu T., Kida Y., and Kuwano K. A dipalmitoylated lipoprotein from Mycoplasma pneumoniae activates NF-kappa B through TLR1, TLR2, and TLR6. //J. Immunol., 2005. -175(7) - C.4641-6.

118. Simberg D., Weisman S., Talmon Y., Barenholz Y. DOTAP (and other cationic lipids): chemistry,biophysics, and transfection. //Crit. Rev. Ther. Dm.«; Carrier Syst. 2004. - 21(4) - C.257-317.

119. Smiley S.T., King J.A., and Hancock, W.W. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through toll-like receptor 4.//J. Immunol. —2001. -167(5) C.2887-94.

120. Soulas C., Baussant T., AubryJ.P., Delneste Y., Barillat N., Carón G., Renno T., Bonnefoy J.Y., and Jeannin P. Outer membrane protein A (OmpA) binds to and activates human macrophages.//!. Immunol., 2000. - 165(5) - C.2335-40.

121. Srinivasula S.M1, Poyet J.L., Razmara M., Datta PI, Zhang Z., Alnemri E.S. The PYRIN-CARD protein ASC is an activating adaptor for caspase-l.//J. Biol. Chem. 2002. - 277(24) - C.21219-22

122. Sugimoto M., Germain R.N., Chedid L., Benacerraf B. Enhancement of carrier-specific helper T cell function by the synthetic adjuvant, N-acetyl muramyl-l-alanyl-d-isoglutamine (MDP). //J. Immunol. 1978. - 120(3) -C.980-982

123. Sun L. and Chen ZJ. The novel functions of ubiquitination in signaling.//Cuirr Opin. Cell Biol. 2004. - 16(2) - C.119-26.

124. Takeda K. and Akira S. Toll-like receptors in innate immunity .//Int.Immunol. -2005.- 17(1)-C.l-14.

125. Takeuchi O., Akira S. Toll-like receptors; their physiological role and signal transduction system.// Int Immunopharmacol. 2001 Apr;l(4):625-35.

126. Takeuchi O., Hoshino K., Akira S. Cutting edge: TLR2-deficient and MyD88-deficient mice are highly susceptible to Staphylococcus aureus infection.//J Immunol. 2000. - 165(10) - C.5392-5396.

127. Tanamoto K.I., Kato H., Haishima Y., and Azumi S. Biological properties of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum.//Clin. Diagn. Lab. Immun -2001. 8(3) - C.522-7.

128. Termeer C., Benedix F., Sleeman J., Fieber C., Voith U., Ahrens T., Miyake K., Freudenberg Mi, Galanos C., and Simon J'.C. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4.//J. Exp. Med. 2002. - 195(1) - C. 99-111.

129. Theofilopoulos A.N., Baccala R., Beutler B. and Kono D.H. Type I interferons (alpha/beta) in immunity and autoimmunity.//Annu. Rev. Immunol. — 2005. 23"- C.307-36.

130. Tsuji N.M., Tsutsui H., Seki E., Kuida K., Okamura H., Nakanishi K., Flavell R.A. Roles of caspase-1 in Listeria infection in mice.//Int. Immunol. — 2004. — 16- C.335-43

131. Uehara A., Takada H. Synergism between TLRs and NODI/2 in oral epithelial cells.//J Dent Res. 2008. - 87(7) - C.682-6.

132. Uematsu S., and Akira S. //Handb. Exp. Pharmacol., 2008. - (183) - C.l-20.

133. Vijay-Kumar M., Aitken J.D., Sanders C.J., Frias A., Sloane V.M., Xu J., Neish A.S., Rojas M., Gewirtz A.T.Flagellin treatment protects against chemicals, bacteria, viruses, and radiation. //J Immunol. 2008. - 180(12) -C.8280-5.

134. Voss E., Wehkamp J., Wehkamp K., Stange E.F., Schroder J.M., Harder J. NOD2/CARD15 mediates induction of the antimicrobial peptide human defensin-2.//J. Biol. Chem. 2006. - 281 - C.2005-11

135. Wang J.P., Kurt-Jones E.A., Shin 0:S., Mnachak M:D., Levin M.J., and Finberg R.W. Varicella-zoster virus activates inflammatory cytokines in human monocytes and macrophages via Toll-like receptor 2.//J. Virol. 2005. - 79(20) -C.l 2658-66.

136. Wang T., Lafuse W.P., and Zwilling B.S. Regulation of toll-like receptor 2 expression by macrophages following Mycobacterium avium infection.//J. Immunol., — 2000; -165(11) C 6308-13.

137. Warren S.E., Mao D.P., Rodriguez A.E., Miao E.A., Aderem A. Multiple Nod-like receptors activate caspase-1 during Listeria monocytogenes infection. //J. Immunol. 2008.- 180(11) - C.7558-64.

138. Wehkamp J., Harder J., Weichenthal M., Schwab Ml, Schaffeler E., Schlee MI, Herrlinger K.R., Stallmach A., Noack F., Fritz P., Schroder J.M., Bevins

139. C.L;, Fellermann K., Stange E.F. NOD2(CARD15) mutations in Crohn's disease ; are associated: with diminished mucosal (x-defensin expression.//Gut 2004.53(11)-.C.1658-64. , , .

140. Wells J.M., Rossi O., Meijerink M., van Baarlen P. Epithelial crosstalk at the microbiota-mucosal interface.//Proc Natl Acad Sci U S A. — 2011. 108 Suppl 1 - C.4607-14.213: Welter-Stahl L, Ojcius DM, Viala J, Girardin Sx Liu. W, Delarbre C, Philpott

141. D, Kelly KA, Darville T. Stimulation of the cytosolic receptor for peptidoglycan, Nodi, by infection; with Chlamydia trachomatis or Chlamydia muridarum.//Cell Microbiol. 2006. - 8(6) - C.1047-57.

142. West A.P., Koblansky A.A., Ghosh S. Recognition and signaling by toll-like rcceptors.//Annu Rev. Cell Dev. Biol. 2006. - 22 - C.409-37.

143. Wyllie D.H., Kiss-Toth E., Visintin A., Smith S.C., Boussouf S., Segal D.MV Duff G.W., and Dower S.K. Evidence for an accessory protein function for Tolllike receptor 1 in anti-bacterial responses.Ilh Immunol. 2000. - 165(12) -C.7125-32

144. Yamamoto Y., Klein T.W., Friedman H. Genetic control of macrophage susceptibility to infection? by Legionella pneumophila.//FEMS Microbiol: Immunol. 1992. - 4(3) - G.137-45. :

145. Yang Y., Jiang; Y., Yin» Q;, Liang H;, and She R. Ghicken intestine deifensins activated murine peripheral, blood mononuclear cells through the TLR4-NF-kappaB pathway. //Vet. Immunol; Immunopathol. 2010; -133(1) - C.59-65

146. Zhang Di, Zhang G., HaydemMiS., Greenblatt MIB^, Büssey G., FlavelliRLA., and Ghosh S. A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria. Science 2004. - 303(5663) - C.1522-6.

147. Zughaier S.ML Neisseria meningitidis capsular polysaccharides induce inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2.//J. Leukoc. Biol. -2011.89(3) C.469-80.