Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae"

На правах рукописи

КУШНИР АНАСТАСИЯ ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МУЛЬТИЛОКУСНОГО VNTR-АНАЛИЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ИЗОЛЯТОВ NEISSERIA GONORRHOEAE

03.01.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2013

005531724

005531724

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.б.н. Филипенко Максим Леонидович

Официальные оппоненты:

Тикунова Нина Викторовна, д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией.

Карпенко Лариса Ивановна, д.б.н., доцент Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, зав. лабораторией

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится «21» июня 2013 г. в «10:00» часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «11» марта 2013 г.

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Бактерии Neisseria gonorrhoeae являются возбудителем гонореи, инфекционного заболевания человека, передаваемого половым путём. По данным ВОЗ в мире ежегодно возникает более 80 миллионов новых случаев заболевания гонореей. Заболеваемость гонореей в России в 2011 году составила 38.35 случаев на 100000 населения, что превышает аналогичные показатели для Нидерландов (21.49 случаев), Венгрии (13.74 случаев), Швеции (10.09 случаев) и других стран Европейского Союза [ВОЗ, 2011]. Существенную проблему во многих странах представляет повсеместное распространение устойчивости к антибактериальным препаратам, ранее рекомендованным для лечения гонореи (например, ципрофлоксацин), а также снижение чувствительности к антибиотикам, рекомендованным недавно, таким как азитромицин и цефалоспорины третьего поколения. Таким образом, при определённых обстоятельствах гонорея может стать неизлечимой болезнью. Поэтому особое значение приобретают молекулярно-эпидемиологические исследования, направленные на изучение популяционной структуры гонококков. Традиционные фенотипические методы типирования имеют такие существенные недостатки, как низкая дискриминирующая способность, трудоёмкость и проблемы с воспроизводимостью результатов. Молекулярно-генетические методы позволяют преодолеть эти проблемы. Эти методы можно разделить на две группы. Первая группа включает методы, основанные на анализе набора полос ДНК в геле после электрофореза. Общими ограничениями этих методов являются субъективная интерпретация результатов, а также сложность сравнения результатов, полученных в разных лабораториях. Вторая группа содержит методы, которые предполагают секвенирование ДНК. Достоинствами этих методов является объективность полученных результатов и возможность их сравнения при помощи существующих баз данных, однако ограничениями являются потребность в специальном оборудовании для секвенирования и высокая стоимость. В последние годы для типирования многих патогенных микроорганизмов, в том числе N. meningitidis, широко применяют альтернативный подход,

основанный на анализе варьирующих по числу тандемных повторов (Variable Number Tandem Repeat, VNTR) [Schouls et al., 2006; Liao et al., 2006]. Метод мультилокусного VNTR-анализа основан на амплификации каждого VNTR-локуса с последующим электрофорезом продуктов ПЦР, что позволяет определить количество тандемных повторов во всех VNTR-локусах и получить для каждого изолята VNTR-профиль, состоящий из последовательности чисел. Таким образом, результаты VNTR-анализа сопоставимы между лабораториями, как и результаты секвенирования. В России отсутствует стандартная система типирования изолятов N. gonorrhoeae, а информация о региональных популяциях гонококков крайне скудна и разрознена, поэтому актуальна разработка и применение методики мультилокусного VNTR-анализа изолятов N. gonorrhoeae. Цель и задачи исследования. Целью исследования является разработка метода мультилокусного VNTR-анализа для N. gonorrhoeae и применение данного метода для изучения генетического разнообразия коллекций изолятов N. gonorrhoeae, собранных в России и Казахстане.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1) Выявить в геноме N. gonorrhoeae потенциальные VNTR-локусы in silico, разработать методику мультилокусного VNTR-анализа, оценить уровень полиморфизма выбранных VNTR-локусов на ограниченной выборке изолятов N. gonorrhoeae-,

2) Провести VNTR-анализ коллекций изолятов N. gonorrhoeae, выделенных в России и Казахстане, выявить региональные особенности изолятов N. gonorrhoeae;

3) Оценить дискриминирующую способность мультилокусного VNTR-анализа и сравнить его с другими методами типирования N. gonorrhoeae;

4) Проанализировать полученные данные с целью установления возможной взаимосвязи между наличием генетических маркёров устойчивости к антибиотикам и принадлежностью изолятов к разным VNTR-типам и кластерам.

Научная новизна. В геноме N. gonorrhoeae обнаружены локусы, содержащие тандемные повторы различной длины и кратности. Разработана методика генотипирования изолятов N. gonorrhoeae, основанная на определении количества тандемных повторов в семи VNTR-локусах. Впервые проведён мультилокусный VNTR-анализ коллекций из 218 изолятов N. gonorrhoeae, собранных в России, и 48 изолятов N. gonorrhoeae, собранных в Казахстане. Коллекция изолятов N. gonorrhoeae из Казахстана впервые охарактеризована методами ора-типирования и NG-MAST. Обнаружен ряд статистически значимых ассоциаций между принадлежностью изолятов к определённым VNTR-типам и кластерам и наличием лекарственной устойчивости, а также наличием генетических маркёров устойчивости к антибиотикам.

Теоретическая и практическая значимость. Настоящая работа вносит существенный вклад в развитие молекулярной эпидемиологии гонореи, а также в понимание механизмов распространения гонококков в популяции. Разработанный метод VNTR-анализа изолятов N. gonorrhoeae может быть полезен для изучения генетического разнообразия гонококков, циркулирующих на определённой территории, для определения наиболее вирулентных и патогенных типов N. gonorrhoeae. Кроме того, предложенный метод может быть использован для принятия решения о наличии повторного заражения либо о факте неудачного лечения, для установления идентичности или различия штаммов в судебно-медицинских целях. В целом молекулярно-эпидемиологические исследования N. gonorrhoeae необходимы для разработки эффективных мер контроля над распространением гонореи. Апробация результатов. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых ВАК. Результаты работы были представлены на научных конференциях: «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе интеграции университетской науки и индустрии» (Долгопрудный, 2011), «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (248 наименований). Работа изложена на 129 страницах и содержит 16 таблиц и 13 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка методики мультилокусного VNTR-анализа

Поиск потенциальных VNTR-локусов в геноме N. gonorrhoea На основании полных геномных последовательностей N. gonorrhoeae штаммов FA 1090 (GenBank АЕ004969) hNCCP11945 (GenBank СР001050.1) с помощью программного обеспечения «Tandem Repeats Finder» 4.03 [Benson, 1999] выбрано 15 потенциальных локусов, содержащих тандемные повторы. VNTR-локусы выбирали на основании двух критериев: наличие в геномах обоих штаммов и размер тандемного повтора составляет от 9 до 300 п.н.

Тестирование VNTR-локусов на коллекции ДНК N. gonorrhoeae Все обнаруженные VNTR-локусы были протестированы на коллекции из 48 ДНК изолятов N. gonorrhoeae, собранных в городе Алматы. Коллекция была предоставлена Научно-исследовательским кожно-венерологическим институтом Министерства Здравоохранения республики Казахстан. Восемь локусов были исключены из дальнейшей схемы VNTR-анализа в силу различных причин. При амплификации локусов VNTR57, VNTR77 и VNTR1117 были получены множественные продукты ПЦР, что, вероятно, обусловлено неспецифичным протеканием реакции. Локусы VNTR48, VNTR1432 и VNTR1604 отсутствовали в геномах некоторых изолятов. При амплификации локуса VNTR1405 для всех образцов были получены фрагменты одинаковой длины (отсутствовал полиморфизм). Локус VNTR1192 имел сложную структуру и состоял из комбинаций тандемного повтора длиной 9 п.н. (TTCGGCAGG) и его укороченного варианта длиной 6 п.н. (TTCGGC), что затрудняет его электрофоретический анализ. Для остальных локусов (VNTR264, VNTR471, VNTR947, VNTR1609, VNTR1638,

VNTR2048, VNTR2168) при амплификации всех образцов были получены специфичные фрагменты, которые различались по длине. Таким образом, предложенный нами метод основан на амплификации семи VNTR-локусов с последующим разделением продуктов ПЦР при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. По длине продуктов ПЦР определяется количество повторов в каждом локусе, в результате получается VNTR-профиль, состоящий из семи чисел.

2. Мультилокусный VNTR-анализ изолятов N. gonorrhoeae, выделенных в городе Алматы (Казахстан) и в семи городах России

Мультилокусный VNTR анализ изолятов N. gonorrhoeae из города Алматы Казахстана

Коллекция из города Алматы содержала 48 образцов ДНК клинических изолятов, выделенных у больных острой не осложнённой гонореей, которые проходили лечение в поликлинике Научно-исследовательского кожно-венерологического института в период с 2008 по 2009 год. В результате VNTR-анализа для всех 48 изолятов был определен VNTR-профиль, состоящий из семи чисел. Амплификация всех локусов проходила специфично и с воспроизводимыми результатами. Секвенирование продуктов амплификации разной длины подтвердило, что различия в длине фрагментов соответствуют изменениям количества повторов. Число аллелей для разных VNTR-локусов варьировало от двух до четырёх. Для точной оценки степени полиморфизма каждого локуса был рассчитан индекс аллельного полиморфизма (h) [Selander, 1986], который варьировал для отдельных локусов от 0.283 (VNTR2168) до 0.539 (VNTR1638). В результате VNTR-анализа 48 изолятов N. gonorrhoeae из Алматы было выделено 24 VNTR-типа, любые два из которых различаются хотя бы на один повтор в одном локусе. Индекс дискриминации Хантера-Гастона (HGDI) [Hunter, Gaston, 1988] для метода VNTR-анализа по семи локусам для 48 изолятов N. gonorrhoeae составил 0.966 (95% CI, 0.952 — 0.981).

Мультилокусный VNTR анализ изолятов N. gonorrhoeae из городов России Коллекция содержала 218 образцов ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae, выделенных у больных острой не осложнённой гонореей в период с 2004 по 2005 год. Коллекция была предоставлена Государственным научным центром дерматовенерологии и косметологии и включала образцы из Москвы (п = 29), Санкт-Петербурга (п = 30), Мурманска (п = 33), Самары (п = 32), Архангельска (п = 32), Екатеринбурга (п = 29) и Иркутска (п = 33), где п — это количество образцов.

В результате VNTR-анализа для всех 218 изолятов был определен VNTR-профиль, состоящий из семи чисел. Секвенирование новых аллелей, обнаруженных на этом этапе, подтвердило, что различия в длине фрагментов соответствуют изменениям числа повторов.

Число аллелей для разных VNTR-локусов варьировало от двух до семи. На рисунке 1 для всех VNTR-локусов представлены электрофореграммы с продуктами ПЦР, соответствующими различному количеству повторов.

VNTR1609 VNTR163S VNTR2048 VNTR2168

Рисунок 1. Электрофореграммы продуктов ПЦР, демонстрирующие полиморфизм семи VNTR-локусов

Цифрами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 обозначено количество тандемных повторов для данного образца ДНК N. gonorrhoeae. М - маркёр длин ДНК pBlueSK/MspI (длины ДНК в парах нуклеотидов указаны на правой стороне первой панели).

Для точной оценки степени полиморфизма каждого локуса был рассчитан индекс аллельного полиморфизма (Ь), который варьировал для отдельных локусов от 0.237 (УЫТЯ2168) до 0.689 (УКПШ!) (Таблица 1).

Таблица 1.

Характеристики VNTR-локусов, определённые при VNTR-анализе ДНК изолятов N. gonorrhoeae из Казахстана и России

\ N 1 K- .111 KM1 Pi! і Mt'p пошир» . [іііііііі lull числа повторов Число ІІ.І.ІС.ІСІІ • h (Ка і.іхгіан) Индекс І) (Россия)

VNTR264 159 п.н. 1-3 0.391 0.295

VNTR471 12 п.н. 1-6, 8 7 0.383 0.689

VNTR947 13 п.н. 1-4 4 0.472 0.309

VNTR1609 16 п.н. 1-2 2 0.478 0.495

VNTR1638 87 п.н. 0-2 3 0.539 0.377

VNTR2048 134 п.н. 1-5 5 0.511 0.615

VNTR2168 19 п.н. 1-4 4 0.283 0.237

В результате для 218 изолятов N. gonorrhoeae было выявлено 83 VNTR-типа, любые два из которых различаются хотя бы на один повтор в одном локусе. Среди них 47 VNTR-типов были представлены одним изолятом, другие VNTR-типы были обнаружены в случае от двух до десяти изолятов, а тип VNTR-16 оказался наиболее распространённым и был выявлен у тридцати четырёх (15.6%) изолятов из разных городов: Мурманска (п = 12), Самары (п = 8), Иркутска (п = 7), Москвы (п = 5), Архангельска (n = 1) и Санкт-Петербурга (п = 1).

Индекс дискриминации HGDI для 218 изолятов N. gonorrhoeae из России составил 0.963 (95% CI, 0.950-0.977). Суммарно для обеих коллекций (266 изолятов) индекс дискриминации HGDI составил 0.973 (95% CI, 0.964-0.983). Таким образом, VNTR-анализ удовлетворяет критерию HGDI > 0.95, рекомендованному Европейским обществом клинической микробиологии и инфекционных болезней для новых методов типирования бактерий [Van Belkum et al., 2007].

VNTR-локусы и кодирующие последовательности в геноме N. gonorrhoeae Мы проанализировали расположение VNTR-локусов относительно кодирующих последовательностей в соответствии с полными аннотированными последовательностями геномов штаммов FA 1090 и NCCP11945. Обнаружено, что два из трёх наиболее полиморфных локусов с индексом аллельного полиморфизма h > 0.5 (VNTR471 и VNTR1638) расположены в кодирующих участках генома.

Локус VNTR471 расположен в участке гена NGK_0571, который кодирует субъединицу HsdS системы рестрикции-модификации I типа. Поскольку последовательность тацдемного повтора состоит из 12 пар нуклеотидов, изменение количества повторов на один приводит к добавлению или удалению четырёх аминокислот (Thr-Leu-Glu-Ala) после аланина в 23-ей позиции. Ранее было показано, что наличие повторов из 4 аминокислот характерно для субъединицы HsdS в системах рестрикции-модификации типа 1С у разных бактерий. Этот участок имеет две функции: определяет длину неспецифического спейсера в узнаваемой последовательности ДНК и опосредует взаимодействие между субъединицами [Adamczyk-Poplawska et al„ 2003].

Локус VNTR1638 расположен в участке гена NGK_1977, кодирующего предшественник белка внешней мембраны GNA2001, состоящий из 223 аминокислот. Длина тандемного повтора составляет 87 пар нуклеотидов, поэтому изменение количества повторов в локусе VNTR1638 приводит к добавлению или исключению 29 аминокислот после глутаминовой кислоты в 43-ей позиции, что может существенно изменять эпитопы белка и его антигенную специфичность.

Наиболее консервативным для обеих коллекций изолятов оказался локус VNTR2168 (h = 0.283 и h = 0.237, соответственно). Локус VNTR2168 расположен в гене NGK_2579, который кодирует гипотетический белок. Поскольку длина тандемного повтора составляет 19 пар нуклеотидов и не кратна трём, при изменении числа повторов происходит сдвиг рамки считывания белка. Число тандемных повторов для локуса VNTR2168 варьировало от одного до четырёх, однако наиболее часто был обнаружен

аллель, содержащий 2 повтора: для 39 изолятов (81.25%) из Казахстана и для 188 изолятов (86.24%) из России. Таким образом, логично предположить, что изменение числа повторов приводит к повреждению белка и подвергается отрицательному давлению отбора. Географическое распределение VNTR-munoe

Было проведено сравнение генетических профилей изолятов N. gonorrhoeae, выделенных в разных регионах. Количество обнаруженных VNTR-типов варьировало от 9 (Самара) до 27 (Архангельск). Индекс дискриминации, рассчитанный для выборок из различных городов, варьировал от 0.841 (Мурманск) до 0.990 (Архангельск) (Таблица 2).

Среди VNTR-типов, обнаруженных в России и Казахстане, шесть VNTR-типов были одинаковыми, поэтому суммарно был обнаружен 101 VNTR-тип.

Таблица 2.

Количество VNTR-типов и индексы дискриминации для разных городов

Город Ко.шчесгио обра шоп Ко.'інчесі но VN ГК-тшюн IIGDI (95% СТ>

Алматы 48 24 0.966 (0.952-0.981)

Архангельск 32 27 0.990 (0.980 -1.000)

Екатеринбург 29 15 0.906 (0.833-0.980)

Иркутск 33 17 0.920 (0.868 - 0.973)

Москва 29 21 0.966 (0.928 -1.000)

Мурманск 33 12 0.841 (0.743-0.938)

Самара 32 9 0.849 (0.792-0.905)

С.-Петербург 30 25 0.989(0.977-1.000)

Наиболее генетически разнородными оказались популяции гонококков из Алматы, Архангельска, Москвы и Санкт-Петербурга (HGDI > 0.960), а наиболее однородны - популяции из Самары и Мурманска (HGDI < 0.850). Высокая генетическая неоднородность изолятов N. gonorrhoeae из Москвы, Санкт-Петербурга и Алматы, вероятно, обусловлена большой численностью населения и миграционным приростом населения в этих городах. Высокий уровень генетического разнообразия популяции гонококков в Архангельске

при меньшей численности населения (около 350 ООО человек), возможно, связан с тем, что этот город является крупным морским портом. Кроме того, для Архангельской области в 2011 году характерна в два раза более высокая частота заболеваемости гонореей - 77.2 на 100 ООО населения (по базе данных «ЭпиНорт», www.epinorth.org), чем в среднем в России- 38.35 на 100 ООО населения [ВОЗ, 2011].

3. Сравнение метода мультилокусного VNTR-анализа с другими методами типирования N. gonorrhoeae

Ора-типирование и NG-MAST изолятов N. gonorrhoeae из города Алматы Все изоляты N. gonorrhoeae были охарактеризованы при помощи метода ора-типирования [O'Rourke et al., 1995]. На основе электрофоретических профилей было выделено 27 ора-типов, шестнадцать изолятов имели уникальные ора-типы, остальные ора-типы включали от двух до шести изолятов. Индекс дискриминации HGDI для ора-типирования 48 изолятов N. gonorrhoeae составил 0.965 (95% CI, 0.944-0.985).

На основе секвенирования полиморфных фрагментов генов рог В и tbpB все изоляты были охарактеризованы методом мультиантигенного типирования последовательностей (N.. gonorrhoeae Multiantigen Sequence Typing, NG-MAST) [Martin et al., 2004]. Было обнаружено 10 аллелей гена рогВ и 15 аллелей гена tbpB, что в результате привело к выделению 22 типов последовательностей (sequence type, ST). Выявлено 11 ST, содержащих от 2 до 6 изолятов, остальные 11 ST представлены уникальными изолятами. В работе было обнаружено два новых аллеля гена рогВ, шесть новых аллелей гена tbpB, а также 16 (73%) новых ST, все новые аллели и ST были депонированы в международной базе данных по методу NG-MAST (http://www.ng-mast.net). Среди шести ST, известных ранее, четыре ST уже встречались в России: ST205 — в Самаре, ST807 - в Мурманске, Архангельске и Санкт-Петербурге, ST1318 и ST2857 - в Архангельске [Ilina et al., 2010, Unemo et al., 2007]. Наиболее распространёнными в выборке из Алматы оказались ST1751, ST5264, ST1318, ST5253, ST5262, среди которых ST5264, ST5253, ST5262 были описаны нами впервые. Индекс дискриминации HGDI для метода NG-MAST составил 0.953 (95% CI, 0.933-0.973).

Сравнение VNTR-анализа, ора-типирования и NG-MAST Все использованные нами методы для типирования N. gonorrhoeae позволили определить тип для всех изолятов, дискриминирующая способность методов оказалась высокой (Таблица 3).

Таблица 3.

Количество выделенных типов и индексы дискриминации для разных

методов типирования

Мсто.1 пшировямпя Ko.lll'iccmo I III10B Индекс 1«;П1 (95% СП

о/га-типирование 27 0.965 (0.944-0.985)

NG-MAST 22 0.953 (0.933-0.973)

VNTR-анализ 24 0.966 (0.952-0.981)

Однако, поскольку доверительные интервалы для значений индекса перекрываются, мы не можем исключить гипотезу, что методы имеют одинаковую дискриминирующую способность с уровнем значимости 95%. Для количественной оценки конгруэнтности результатов, полученных разными методами типирования, были определены скорректированные коэффициенты Рэнда (Adjusted Rand, AR) и коэффициенты Уоллеса [Carrico et al„ 2006].

Скорректированный коэффициент Рэнда является количественной мерой сходства двух распределений и может принимать значения от 0 до 1, «О» указывает на отсутствие согласованности между распределениями, «1» - на то, что распределения полностью идентичны. Полученные значения AR указывают на достаточно низкую согласованность результатов, полученных разными методами (AR < 0.500).

Для определения направленной согласованности между результатами разных методов были определены коэффициенты Уоллеса. Коэффициенты Уоллеса позволяют оценить, насколько распределение, полученное при помощи одного метода, позволяет предсказать распределение, полученное при помощи другого метода. Полученные значения коэффициентов Уоллеса указывают на то, что два изолята с одинаковым VNTR-типом с вероятностью 31.6% имеют одинаковый ора-тип и с вероятностью 31.6% - одинаковый ST

по методу NG-MAST. Таким образом, способность VNTR-анализа предсказывать ора-тип и ST не очень высока.

Сравнение VNTR-анализа, рог-типирования, MLST и NG-MAST на выборке из 102 изолятов N. gonorrhoeae из России

Часть коллекции из России, содержащая 102 изолята, ранее охарактеризована методами рог-типирования, NG-MAST и мультилокусного типирования последовательностей (Multilocus Sequence Typing, MLST) [Ilina et al., 2010]. Для сравнения дискриминирующей способности методов были рассчитаны индексы дискриминации Хантера-Гастона (Таблица 4). Дискриминирующая способность VNTR-анализа, рог-типирования и NG-MAST оказалась достаточно высокой. Метод MLST оказался наименее дискриминирующим со значением HGDI < 0.95.

Таблица 4.

Количество выделенных типов и индексы дискриминации для разных

методов типирования

Метол типиривапия Количество типов Индекс HGDI (95% СИ

MLST 30 0.909 (0.877-0.942)

ро/*-типирование 50 0.963 (0.948-0.977)

NG-MAST 60 0.979 (0.970-0.989)

VNTR-анализ 57 0.970 (0.952-0.988)

Для оценки конгруэнтности результатов, полученных разными методами типирования, были посчитаны скорректированные коэффициенты Рэнда и коэффициенты Уоллеса.

Общая согласованность между результатами VNTR-анализа и других методов оказалась низкой, со значениями AR, варьирующими от 0.216 до 0.275. Наибольшая согласованность (AR = 0.701) была обнаружена между результатами NG-MAST и рог-типирования, что неудивительно, поскольку оба метода основаны на секвенировании гена рогВ. Согласно полученным коэффициентам Уоллеса два изолята, имеющие одинаковый ST по методу NG-MAST, со 100% вероятностью имеют одинаковый рог-тип и с вероятностью 80.2% имеют одинаковый тип MLST. Метод VNTR-анализа

способен предсказать тип MLST с вероятностью 50.6%. Способность VNTR-анализа предсказывать рог-тип и ST, определённый методом NG-MAST, оказалась достаточно низкой.

Низкий уровень конгруэнтности можно объяснить тем, что разные методы анализируют разные участки генома, и замены в них накапливаются с неодинаковыми скоростями. Метод VNTR-анализа выявляет различия в числе тандемных повторов, расположенных по всему геному, в то время как другие методы сфокусированы на анализе конкретных генов. Кроме того, изменения количества тандемных повторов с большей вероятностью может быть подвержено давлению естественного отбора, если VNTR-локус располагается в кодирующих участках по сравнению с VNTR-локусами, расположенными в некодирующих участках.

Методы NG-MAST и рог-типирования опираются на анализ нуклеотидных последовательностей высоко полиморфных и быстро эволюционирующих генов рогВ и tbpB, кодирующих поверхностные антигены. Поскольку оба метода включают секвенирование гена рогВ, согласованность результатов, полученных данными методами, оказалась наибольшей (AR = 0.701). Метод ора-типирования основан на анализе семейства генов ора, которые кодируют поверхностные антигены и подвержены фазовым и антигенным изменениям. Метод MLST основан на анализе генов ферментов «домашнего хозяйства», которые достаточно консервативны и эволюционно нейтральны. Вероятно, поэтому MLST обладает наименьшей дискриминирующей способностью.

Альтернативная схема мультилокусного VNTR-анализа Недавно была описана методика VNTR-анализа изолятов N. gonorrhoeae, основанная на пяти VNTR-локусах, с разделением продуктов ПЦР на автоматическом секвенаторе и определением числа повторов при помощи программного обеспечения «GeneMarker» [Heymans et al., 2011]. Все пять VNTR-локусов отличаются от локусов, выбранных нами. Индекс дискриминации для данного метода при анализе коллекции из 854 изолятов составил 0.960. Ограничением этого метода является потребность в дорогостоящем оборудовании для капиллярного электрофореза, что связано с малым размером тандемных повторов - от 4 до 16 п.н.

4. Результаты VNTR-анализа и устойчивость к антибиотикам

Множественная лекарственная устойчивость и VNTR-анализ В Государственном научном центре дерматовенерологии и косметологии все изоляты были протестированы на уровень чувствительности к пенициллину G, тетрациклину и ципрофлоксацину. В научно-исследовательском институте физико-химической медицины для всех изолятов были определены хромосомные и плазмидные маркёры устойчивости к пенициллину, тетрациклину и фторхинолонам [Ilina et al., 2008].

Исследуемая коллекция содержит 97 изолятов (44.5%), которые обладают множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), т.е. имеют средний уровень чувствительности или устойчивость одновременно к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину. При подсчёте индекса дискриминации обнаружено, что изоляты с МЛУ более генетически однородны (HGDI = 0.885, 95% CI, 0.834 - 0.937), чем изоляты, не имеющие МЛУ (HGDI = 0.983, 95% CI, 0.976 — 0.990). Следовательно, гонококки, обладающие лекарственной устойчивостью, имеют эволюционное преимущество, что приводит к распространению определенных более «успешных» клональных вариантов и снижению генетического разнообразия, в том числе и к снижению количества обнаруживаемых VNTR-типов.

Проанализировано наличие связи между распределением изолятов N. gonorrhoeae по VNTR-типам и наличием устойчивости к антибиотикам. Поскольку большинство VNTR-типов представлено отдельными изолятами, были рассмотрены только VNTR-типы, содержащие не менее пяти изолятов. Среди них VNTR-типы 16 (п = 34, р < 0.001) и близкие к нему VNTR-типы 17 (п = 8, р = 0.003) и 21 (п = 10, р = 0.008) ассоциированы с МЛУ. Таким образом, распространение VNTR-типа 16 от Москвы до Иркутска, вероятно, обусловлено тем, что гонококки этого типа более «успешны» в отношении трансмиссии благодаря наличию лекарственной устойчивости.

Иерархический кластерный анализ

Для выявления взаимосвязей между VNTR-типами был проведён иерархический кластерный анализ с построением минимального остовного дерева при помощи алгоритма goeBURST [Francisco et al., 2009]. На этом

дереве вершины (УЫТЯ-типы) соединены рёбрами таким образом, чтобы суммарный вес рёбер был минимален. Вес ребра равен количеству УМТЯ-локусов, по которым различаются два данных УОТЯ-типа. На минимальном остовном дереве определены кластеры — локализованные группы, содержащие не менее 7 УЫТЯ-типов, где любые два соседних УМТІІ-типа различаются по одному УМТІІ-локусу. Было выделено шесть кластеров: А (п = 67), В (п = 13), С (п = 24), Б (п = 33), Е (п = 37) и Р (п = 34). Все кластеры содержат суммарно 208 (95.4%) изолятов. В состав кластеров не входят УЫТК-типы 34, 35, 63, 64, 74, 82, которые отличаются от других типов не менее чем по двум УОТЯ-локусам и УМТЯ-тип 83, отличающийся не менее чем по трём УЫТЯ-локусам от любого другого типа (Рисунок 2).

Ш'ущ. III

а

8}

'•¿ШШШшкШ

шШШЯШ і

' \ 41-* :

ч в Ш " 1 '

__......................................- ! .Л 46

1І

ЯШЬ^Г"™®і І47ЯШ

I

¡¡И 1

р

1 ЩЙШ1

1 17 /1 • щт

Л 1 І І І

> '15 ' і

ГЇ7А

ІГ

172!

28

ЧМІг

т

Рисунок 2. Минимальное остовное дерево для 83 УМТИ-типов Каждый круг представляет УКТЯ-тип, внутри круга указан номер УТЧТК-типа, размер круга соответствует числу изолятов с данным УЫТЯ-типом. ■уТМТЯ-типы, соединённые сплошными линиями, различаются по 1 УЫТК-локусу; УТ^ТЯ-типы, соединённые штрихованными линиями, - по 2 УМТЯ-локусам; УМТК-тип 83, соединённый пунктирной линией, - по 3 УМТ11-локусам. Кластеры обозначены серой заливкой.

Распределение изолятов по кластерам и устойчивость к антибиотикам Анализ взаимосвязей между принадлежностью изолятов N. gonorrhoeae к определённым кластерам и наличием устойчивости к антибиотикам позволил выявить ряд статистически значимых ассоциаций (Таблица 5).

Таблица 5.

Наличие ассоциации между принадлежностью изолята к кластеру и наличием устойчивости или чувствительности к антибиотику

К.1ЯС1С|1 Ассоциации с наличием усюйчииосш к антибиотикам

А МЛУ (р < 0.001), устойчивость к тетрациклину (р < 0.001) и ципрофлоксацину (р < 0.001)

В Чувствительность к ципрофлоксацину (р = 0.001)

С Чувствительность к ципрофлоксацину (р = 0.016)

D Устойчивость к пенициллину (р = 0.001)

Е Чувствительность к ципрофлоксацину (р < 0.001)

F Ассоциаций не обнаружено

Обнаружена значительная ассоциация между принадлежностью к кластеру А и наличием МЛУ, а также устойчивости к тетрациклину и ципрофлоксацину. Кластер D ассоциирован с наличием устойчивости к пенициллину. Кластеры В, С и Е ассоциированы с чувствительностью к ципрофлоксацину. Проанализировано распределение генетических маркёров устойчивости среди изолятов N. gonorrhoeae из разных кластеров (Таблица 6). Обнаружена ассоциация между принадлежностью изолятов к кластеру А и наличием мутаций в генах репА, ропА, rpsJ, mtrR, gyrA, и рагС, которые важны для формирования устойчивости к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину. Для кластера D была показана ассоциация с наличием мутаций в генах ропА и rpsJ и наличием плазмидного гена Ыа^грм-о, который кодирует фермент бета-лактамазу, гидролизующий пенициллин. Кластер F был ассоциирован с наличием мутаций в генах rpsJ, gyrA и рагС. Принадлежность изолятов к кластерам В, С и Е ассоциирована с отсутствием мутаций в генах ропА, rpsJ, gyrA и рагС.

Таблица 6.

Наличие ассоциации между принадлежностью изолята к кластеру и наличием или отсутствием генетических маркёров устойчивости

К.тясюр Ассоциация с наличием или отсутствием мутаций-

А Наличие мутаций в генах репА (р = 0.002), ропА {р = 0.003), rpsJ (р < 0.001), mtrR (р = 0.001), gyrA (р < 0.001) и рагС (р < 0.001)

В Отсутствие мутаций в генах ропА (р = 0.001), rpsJ(p < 0.001), gyrA (р = 0.003) и рагС (р = 0.004)

С Отсутствие мутаций в генах ропА (р = 0.004), rpsJ(p = 0.001), gyrA (р = 0.016) и рагС (р = 0.014)

D Наличие мутаций в генах ропА (р = 0.007), rpsJ (р = 0.003) и наличие гена ЬЦтем-пСр < 0.001)

Е Отсутствие мутаций в генах репА (р < 0.001), ропА (р = 0.002), rpsJ(p< 0.001), gyrA (р < 0.001) и рагС (р < 0.001)

F Наличие мутаций в генах rpsJ(p = 0.003), gyrA (р = 0.008) и рагС (р = 0.006)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе разработана методика мультилокусного VNTR-анализа изолятов N. gonorrhoeae. Для VNTR-анализа были выбраны такие VNTR-локусы, которые можно анализировать в полиакриламидном геле и оценивать количество тандемных повторов визуально, не используя специальные программы. При выборе метода типирования существенную роль играет его стоимость, особенно в том случае, когда необходимо проанализировать большое количество образцов. Предложенная нами схема VNTR-анализа проста и применима в лабораториях с минимальным молекулярно-биологическим оборудованием. Получаемые VNTR-профили компактны, хорошо воспроизводимы и сопоставимы между лабораториями, как и результаты MLST и NG-MAST. Показано, что метод VNTR-анализа является высоко дискриминирующим, и применим для решения различных эпидемиологических и клинико-лабораторных задач.

выводы

1. Разработана методика УИТЯ-анализа на основе семи УЫТЯ-локусов (\ТЧТЯ264, УЭТЯ471, УЫТЯ947, УЖЯ1609, VNTR1638, УЫТЯ2048, \ГЫТК2168), содержащих тандемные повторы различной длины и кратности.

2. УМТЯ-анализ позволил выявить 101 УЬГШ-тип для 266 изолятов из России и Казахстана и продемонстрировал генетическую неоднородность исследованных изолятов. Показано, что наиболее генетически гетерогенны популяции гонококков из Москвы, Санкт-Петербурга, Архангельска и Алматы, а наиболее однородны - популяции из Самары и Мурманска. На основе УМТЯ-профилей для изолятов из России построено минимальное остовное дерево, на котором выделено шесть кластеров, содержащих 95.4 % изолятов.

3. Метод УЭТЛ-анализа обладает высокой дискриминирующей способностью и удовлетворяет критерию Н001 > 0.95, рекомендованному Европейским обществом клинической микробиологии и инфекционных болезней для новых методов типирования бактерий.

4. Обнаружена статистически значимая ассоциация между принадлежностью изолятов к различным УКТЛ-типам и кластерам и наличием лекарственной устойчивости.

1) Наиболее распространённый в России У1^Т11-тип 16 и близкие к нему УЬТт-типы 17 и 21 ассоциированы с наличием множественной устойчивости к антибиотикам.

2) Принадлежность изолятов к кластеру А ассоциирована с устойчивостью к ципрофлоксацину и тетрациклину, а также наличием мутаций в генах репА, ропА, грз^ rn.tr Я, &гА, и рагС.

3) Принадлежность изолятов к кластеру О ассоциирована с устойчивостью к пенициллину и наличием мутаций в генах ропА и rpsJ и с наличием плазмидного гена Ыа^^.ц.

4) Принадлежность изолятов к кластерам В, С и Е ассоциирована с чувствительностью к ципрофлоксацину и отсутствием мутаций в генах ропА, грьЗ, %угА и рагС.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Кушнир, А. В., Муминов, Т. А., Баев, А. И., Храпов, Е. А., Филипенко, М. Л. Использование метода VNTR-типирования для оценки генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. - № 1. -С. 24-29.

2. Кушнир, А. В., Ильина, Е. Н., Малахова, М. В., Припутневич, Т. В., Филипенко, М. Л. VNTR-типирование изолятов Neisseria gonorrhoeae в России // Вестник НГУ. Серия: биология, клиническая медицина. - 2012. - № 5. - С. 11-18.

3. Kushnir, А. V., Muminov, Т. A., Bayev, A. I., Khrapov, Е. A., Filipenko, М. L. Molecular characterization of Neisseria gonorrhoeae isolates in Almaty, Kazakhstan, by VNTR analysis, Opa-typing and NG-MAST // Infect. Genet. Evol. - 2012. - V. 12. - P. 570-576.

4. Kushnir, A. V., Ilina, E. N., Malakhova, M. V., Priputnevich, Т. V., Filipenko, M. L. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis of Neisseria gonorrhoeae Isolates in Russia // Infect. Genet. Evol. - 2013. - V. 14 - P. 814.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

CI (Confidence Interval) - доверительный интервал

AR (Adjusted Rand index) - скорректированный коэффициент Рэнда

HGDI (Hunter-Gaston Discriminatory Index) - индекс дискриминации

Хантера-Гастона

MLST (Multilocus Sequence Typing) - мультилокусное типирование последовательностей

NG-MAST (N. gonorrhoeae Multiantigen Sequence Typing) мультиантигенное типирование последовательностей ДНК N. gonorrhoeae ST (Sequence Type) - тип последовательности

VNTR (Variable Number Tandem Repeat) - варьирующие по числу тандемные повторы

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность всем коллегам по работе, а также персонально к.б.н. Дымовой Майе Александровне, д.б.н. Тикуновой Нине Викторовне за внимательное прочтение рукописи диссертации и полезные замечания, д.б.н., доценту Ильиной Елене Николаевне за сотрудничество и помощь в написании статьей, к.б.н. Филипенко Максиму Леонидовичу за научное руководство работой.

Подписано в печать 18.02.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 148.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кушнир, Анастасия Викторовна, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

04201357748 ^а пРавахРУкописи

Кушнир Анастасия Викторовна

Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae

Специальность 03.01.03 — молекулярная биология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -к.б.н. Филипенко M.JT.

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение...................................................................................................................4

1 Обзор литературы...........................................................................................12

1.1 Биология Neisseria gonorrhoeae........................................................................ 12

111 Общая характеристика N gonorrhoeae 12

\

112 Организация генома и факторы патогенности N gonorrhoeae 13

113 Инфекционный процесс, вызванный N gonorrhoeae 24

1.2 Устойчивость N gonorrhoeae к антибиотикам.....................................................30

12 1 Применение антибиотиков дія лечения гонореи 30

12 2 Механизмы устойчивости к антибиотикам 34

1.3 Молекулярная эпидемиология гонореи......................................................... 40

13 1 Важность типирования N gonorrhoeae для эпидемиологических цепей 40 13 2 Методы типирования изочятов N gonorrhoeae на основе фенотипа 42 13 3 Методы типирования изочятов N gonorrhoeae на основе генотипа 44

2 Материалы и методы......................................................................................53

2 1 Материалы........................................................................................................ 53

2 11 Коплекции ДНК клинических изочятов N gonorrhoeae 53

2 12 Реактивы 53

2 13 Растворы и буферы 54

2 14 Очигонукчеотидные праймеры 54

2 2 Методы ......................................................................................................................................................................... 56

2 2 1 Поиск VNTR-чокусов 56

2 2 2 Мучътилокусный VNTR-аначиз 56

22 3 Секвенирование ДНК 58

2 2 4 Ора-типирование 58

2 2 5 NG-MAST 59

2 2 6 Статистический анашз данных 59

3 Результаты исследования..............................................................................61

3 1 Разработка методики мультилокусного VNTR-анализа............... .... 61

3 11 Поиск потенциачьных VNTR-чокусов в геноме N gonorrhoeae 61 312 Тестирование VNTR-чокусов на коччекции ДНК N gonorrhoeae 62

3 13 Распочожение VNTR-чокусов в геноме N gonorrhoeae относитечьно кодируюгци\ посчедовательностей 64

3.2 Изучение генетического разнообразия изолятов N gonorrhoeae, выделенных в городе

Алматы (Казахстан).............................................................................................68

3 2 1 Мультичокусный VNTR-анализ изолятов N gonorrhoeae 68

3 2 2 Ора-типирование и NG-MAST 70

3 2 3 Сравнение методов типирования 73

3 3 Изучение генетического разнообразия изолятов N gonorrhoeae, выделенных в семи

городах России............................................................................................................ 75

3 3 1 Мупътичокусный VNTR анапиз изолятов N gonorrhoeae 75

3 3 2 Кластерный анализ 81

3 33 Резучътаты VNTR-анализа и устойчивость к антибиотикам 83

3 3 4 Сравнение методов типирования на выборке из 102 изочятов 86

4 Обсуждение результатов...............................................................................88

Выводы...................................................................................................................97

Список сокращений и условных обозначений...................................................98

Список литературы...............................................................................................99

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Бактерии Neisseria gonorrhoeae являются возбудителем гонореи, инфекционного заболевания человека, передаваемого половым путём. По данным ВОЗ в мире ежегодно возникает более 80 миллионов новых случаев заболевания гонореей [1]. Заболеваемость гонореей в России в 2011 году составила 38.35 случаев на 100000 населения, что превышает аналогичные показатели для Нидерландов (21.49 случаев), Венгрии (13.74 случаев), Швеции (10.09 случаев) и других стран Европейского Союза [2].

Гонорея может вызывать тяжёлые осложнения, такие как эпидидимит (воспаление придатка яичка) у мужчин и воспаление органов малого таза у женщин, которое в свою очередь, повышает риск внематочной беременности и бесплодия. Бактерии N. gonorrhoeae могут инфицировать слизистые оболочки новорожденных (гонококковая бленнорея новорожденных) при прохождении через родовые пути заражённой матери, что может привести к слепоте [3]. Важно также отметить, что гонорея ассоциирована с трансмиссией вируса иммунодефицита человека [4].

К настоящему моменту не существует вакцины против гонореи, а для лечения гонореи используют антибиотики. Своевременная идентификация заболевания и эффективное лечение антибиотиками являются основными подходами для предотвращения распространения гонореи. Однако во многих странах существуют такие проблемы, как рост заболеваемости гонореей и распространение устойчивости к антибактериальным препаратам, ранее рекомендованным для лечения гонореи (например, пенициллин, эритромицин, тетрациклин и ципрофлоксацин), а также снижение чувствительности к антибиотикам, рекомендованным недавно, таким как азитромицин и цефалоспорины третьего поколения (цефиксим и цефтриаксон) [5, 6]. Таким образом, при определённых обстоятельствах гонорея может стать неизлечимой болезнью.

Поэтому особое значение приобретают молекулярно-эпидемиологические исследования, направленные на изучение популяционной структуры гонококков. В круг задач, решаемых методами молекулярной эпидемиологии, входит определение генетического разнообразия изолятов N. gonorrhoeae в разных географических регионах, обнаружение наиболее биологически успешных вирулентных штаммов, дифференциация случаев неудачного лечения и повторного заражения, установление идентичности штаммов для решения судебно-медицинских вопросов и так далее. Основной подход молекулярной эпидемиологии - это типирование изолятов бактерий, то есть установление степени их сходства по различным признакам, на основании чего устанавливается предполагаемые филогенетические связи между изолятами.

Для типирования N. gonorrhoeae применяют как фенотипические, так и генотипические методы. Фенотипические методы основаны на определении профилей чувствительности к антибиотикам, потребности в различных питательных веществах, антигенной неоднородности белка внешней мембраны порина (РогВ), разнообразии ферментов «домашнего хозяйства». Хотя фенотипические методы и позволяют различать ауксотипы и серовары N. gonorrhoeae, с их помощью невозможно проводить дифференциацию на уровне штаммов. Существенными недостатками этих методов являются низкая дискриминирующая способность, проблемы с воспроизводимостью результатов, появление атипичных штаммов, для которых невозможно определить серовар [7].

В связи с этим, решающую роль в типировании гонококков играют молекулярно-генетические методы. Эти методы могут быть разделены на две больших группы: методы, основанные на анализе набора полос ДНК в геле после электрофореза, и методы, основанные на анализе последовательностей ДНК. К первой группе относятся такие методы, как анализ содержания плазмид, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP), определяемый при помощи электрофореза в пульсирующем поле (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE), риботипирование и ора-типирование. Общими недостатками указанных методов являются трудоёмкость,

субъективная интерпретация результатов, а также сложность сравнения результатов, полученных, в разных лабораториях.

Вторая группа методов включает в себя полное или частичное секвенирование гена рогВ, мультиантигенное типирование последовательностей N. gonorrhoeae (N. gonorrhoeae Multiantigen Sequence Typing, NG-MAST) и мультилокусное типирование последовательностей (Multilocus Sequence Typing, MLST). Данные методы лишены перечисленных выше недостатков и более предпочтительны для типирования изолятов гонококков, поскольку они объективны, надёжны, воспроизводимы и обладают высокой дискриминирующей способностью [7].

В последние годы в связи с доступностью полных нуклеотидных последовательностей геномов для типирования различных микроорганизмов, в том числе N. meningitidis [8, 9], широко применяется подход, основанный на анализе варьирующих по числу тандемных повторов (Variable Number Tandem Repeat, VNTR). Метод мультилокусного VNTR-анализа (Multiple Loci VNTR Analysis, MLVA) предполагает определение количества тандемных повторов в каждом VNTR-локусе и получение для каждого изолята VNTR-профиля, состоящего из последовательности чисел. Таким образом, результаты типирования воспроизводимы и сопоставимы между лабораториями. Недавно была предложена схема MLVA для типирования изолятов N. gonorrhoeae, которая включает в себя проведение двух мультиплексных ПЦР с последующим разделением фрагментов ДНК при помощи автоматического секвенатора [10]. Данный метод требует наличия дорогостоящего оборудования для проведения капиллярного электрофореза, а также специального программного обеспечения. В этой связи актуальна разработка альтернативной схемы мультилокусного VNTR-анализа, позволяющей разделять фрагменты ДНК в полиакриламидном геле и определять число повторов без использования специальных приборов и программного обеспечения.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является разработка метода мультилокусного VNTR-анализа для N. gonorrhoeae и применение данного метода для изучения генетического разнообразия коллекций изолятов N. gonorrhoeae, собранных в России и Казахстане.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Выявить в геноме N. gonorrhoeae потенциальные VNTR-локусы in silico, разработать методику мультилокусного VNTR-анализа, оценить уровень полиморфизма выбранных VNTR-локусов на ограниченной выборке изолятов N. gonorrhoeae;

2) Провести VNTR-анализ коллекций изолятов N. gonorrhoeae, выделенных в России и Казахстане, выявить региональные особенности изолятов N. gonorrhoeae;

3) Оценить дискриминирующую способность мультилокусного VNTR-анализа и сравнить его с другими методами типирования N. gonorrhoeae;

4) Проанализировать полученные данные с целью установления возможной взаимосвязи между наличием генетических маркёров устойчивости к антибиотикам и принадлежностью изолятов к разным VNTR-типам и кластерам.

Научная новизна

В геноме N. gonorrhoeae обнаружены локусы, содержащие тандемные повторы различной длины и кратности. Разработана методика генотипирования изолятов N. gonorrhoeae, основанная на определении количества тандемных повторов в семи VNTR-локусах. Впервые проведён мультилокусный VNTR-анализ коллекций из 218 изолятов N. gonorrhoeae, собранных в России, и 48 изолятов N. gonorrhoeae, собранных в Казахстане. Коллекция изолятов N. gonorrhoeae из Казахстана впервые охарактеризована методами ора-типирования и NG-MAST. Обнаружен ряд статистически значимых ассоциаций между принадлежностью изолятов к определённым VNTR-типам и кластерам и

наличием лекарственной устойчивости, а также наличием генетических маркёров устойчивости к антибиотикам.

Теоретическая и практическая значимость Настоящая работа вносит существенный вклад в развитие молекулярной эпидемиологии гонореи, а также в понимание механизмов распространения гонококков в популяции.

Разработанный метод VNTR-анализа изолятов N. gonorrhoeae может быть полезен для изучения генетического разнообразия гонококков, циркулирующих на определённой территории, для определения наиболее вирулентных и патогенных типов N. gonorrhoeae. Кроме того, предложенный метод может быть использован как диагностический инструмент для выявления источников инфекции, для принятия решения о наличии повторного заражения либо о факте неудачного лечения, для установления идентичности или различия штаммов в судебно-медицинских целях.

В целом, молекулярно-эпидемиологические исследования N. gonorrhoeae необходимы для разработки эффективных мер контроля над распространением гонореи.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана методика VNTR-анализа на основе семи VNTR-локусов (VNTR264, VNTR471, VNTR947, VNTR1609, VNTR1638, VNTR2048, VNTR2168), содержащих тандемные повторы различной длины и кратности.

2. VNTR-анализ позволил выявить 101 VNTR-тип для 266 изолятов из России и Казахстана и продемонстрировал генетическую неоднородность исследованных изолятов. Показано, что наиболее генетически гетерогенны популяции гонококков из Москвы, Санкт-Петербурга, Архангельска и Алматы, а наиболее однородны - популяции из Самары и Мурманска. На основе VNTR-профилей для изолятов из России построено минимальное остовное дерево, на котором выделено шесть кластеров, содержащих 95.4 % изолятов.

3. Метод VNTR-анализа обладает высокой дискриминирующей способностью и удовлетворяет критерию HDGI > 0.95, рекомендованному Европейским

обществом клинической микробиологии и инфекционных болезней для новых методов типирования бактерий. 4. Обнаружена статистически значимая ассоциация между принадлежностью изолятов к различным VNTR-типам и кластерам и наличием лекарственной устойчивости.

4.1.Наиболее распространённый в России VNTR-тип 16 и близкие к нему VNTR-типы 17 и 21 ассоциированы с наличием множественной устойчивости к антибиотикам.

4.2.Принадлежность изолятов к кластеру А ассоциирована с устойчивостью к ципрофлоксацину и тетрациклину, а также наличием мутаций в генах реп А, ропА, rpsJ, mtrR, gyrA, и parC.

4.3.Принадлежность изолятов к кластеру D ассоциирована с устойчивостью к пенициллину и наличием мутаций в генах ропА и rpsJ и с наличием плазмидного гена Ьіа^м-і).

4.4.Принадлежность изолятов к кластерам В, С и Е ассоциирована с чувствительностью к ципрофлоксацину и отсутствием мутаций в генах ропА, rpsJ, gyrA и par С.

Апробация результатов

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией для публикации основных научных результатов диссертаций:

1) Кушнир, А. В., Муминов, Т. А., Баев, А. И., Храпов, Е. А., Филипенко, М. JI. Использование метода VNTR-типирования для оценки генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. - №1. - С. 24-29.

2) Кушнир, А. В., Ильина, Е. Н., Малахова, М. В., Припутневич, Т. В., Филипенко, М. JI. VNTR-типирование изолятов Neisseria gonorrhoeae

в России // Вестник НГУ. Серия: биология, клиническая медицина. -2012. - №5. - С 11-18.

3) Kushnir, А. V., Muminov, Т. A., Bayev, A. I., Khrapov, Е. A., Filipenko, M. L. Molecular characterization of Neisseria gonorrhoeae isolates in Almaty, Kazakhstan, by VNTR analysis, Opa-typing and NG-MAST // Infection, Genetics and Evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases. - 2012. - Vol. 12. - P. 570576.

4) Kushnir, A. V., Ilina, E. N., Malakhova, M. V., Priputnevich, T. V., Filipenko, M. L. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis of Neisseria gonorrhoeae Isolates in Russia // Infection, Genetics and Evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases. - 2013. - Vol. 14 - P. 8-14.

Результаты исследования были представлены на научных конференциях.

Вклад автора

Основные результаты получены лично автором. Сбор коллекции изолятов N. gonorrhoeae в городе Алматы проведён Научно-исследовательским кожно-венерологическим институтом республики Казахстан. Сбор коллекции изолятов N. gonorrhoeae в различных регионах России и определение чувствительности к антибиотикам проведено Государственным научным центром дерматовенерологии и косметологии.

Поиск тандемных повторов в геноме N. gonorrhoeae, VNTR-анализ изолятов N. gonorrhoeae, ора-типирование и типирование методом NG-MAST, подготовка образцов к секвенированию, а также статистический анализ полученных результатов были проведены лично автором.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (248 наименований). Работа изложена на 129 страницах и содержит 16 таблиц и 13 рисунков.

Автор выражает искреннюю благодарность всем коллегам по работе, и персонально к.б.н. Дымовой Майе Александровне, д.б.н. Тикуновой Нине Викторовне за внимательное прочтение рукописи диссертации и полезные замечания, д.б.н., доценту Ильиной Елене Николаевне за сотрудничество и помощь в написании статьей, к.б.н. Филипенко Максиму Леонидовичу за научное руководство работой.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биология Neisseria gonorrhoeae

1.1.1 Общая характеристика N. gonorrhoeae

Род Neisseria представляет собой группу бета-протеобактерий, которые являются облигатными симбионтами человека и животных и обитают на слизистых поверхностях. Бактерии Neisseria gonorrhoeae вызывают гонорею и связанные с ней клинические симптомы (уретрит, цервицит, сальпингит и др.). Близкий вид Neisseria meningitidis вызывает одну из форм бактериального менингита. Патогенные виды Neisseria очень близки по генетическим и физиологическим свойствам, не смотря на различия в проявлении болезней. Род Neisseria также содержит такие симбиотические виды, как Neisseria lactamica и Neisseria mucosa, которые обитают на слизистых поверхностях носоглотки и крайне редко вызывают заболевание у здоровых людей [3, 11].

Упоминания о контагиозной природе гонореи относятся к библейским временам, поэтому гонорея является одной из древнейших описанных болезней человека. Гонорея является классическим примером инфекции, передаваемой при непосредственном контакте со слизистой поверхностью инфицированного человека. Первичны