Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae

Верещагин, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae"

На правах рукописи

Верещагин Владимир Александрович

Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae

03.00.04-Биохимия 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Научно-исследовательском институте физико-химической медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Говорун Вадим Маркович

кандидат биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Колесанова Екатерина Федоровна

кандидат биологических наук, Прилипов Алексей Геннадиевич

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр по антибиотикам"

Защита диссертации состоится « 49 » О/СнеЗ&рЯ^ 2006 года в /Г часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН. Автореферат разослан « // _» ¿¿и-МЛ^и*. 2006 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

B.C. Былинкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гонорея - одна из распространенных на сегодняшний день инфекций, передающихся половым путём, - остается актуальной проблемой в области практического здравоохранения. К особенностям гонореи относят распространение вялотекущих и диссеминированных форм, увеличение частоты выявления мультирезистентных штаммов. Для гонококка характерны высокая пластичность, естественный морфофизиологический и генетический полиморфизм, и, как следствие, выраженная гетерогенность популяции.

Молекулярные методы исследования популяции N. gonorrhoeae способны не только дополнить традиционные микробиологические методики идентификации и характеристики микроба, но и преодолеть ограничения последних (длительность анализа, трудоемкость и сложностью стандартизации). В настоящий момент среди многообразия предложенных методов не определен приоритетный подход, способный стать стандартным и общепринятым.

Разработка современных молекулярных подходов типирования и штаммо-вой идентификации гонококка особенно актуальна для нашей страны, поскольку в РФ нет стандартной системы типирования штаммов N. gonorrhoeae, а имеющаяся информация о региональных особенностях возбудителя крайне скудна, разрознена и зачастую неактуальна. Разработка соответствующего арсенала методов и исследование гетерогенности популяции позволит иметь ее актуальную молекулярно-эпидемиологическую характеристику, сделает возможным регулярный мониторинг и обоснованный прогноз эпидемиологической ситуации.

Цель работы. Цель работы - разработка и сравнение различных методов молекулярного типирования N. gonorrhoeae и использование их для характеристики популяции возбудителя, распространённой на территории Российской Федерации.

Задачи исследования;

1. Формирование коллекции образцов ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов N. gonorrhoeae, полученных от больных из различных регионов Российской Федерации.

2. Разработка системы комплексной оценки антибиотикоустойчивости N. gonorrhoeae на основе знаний о генетических механизмах формирования устойчивости возбудителя, включающей определение известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции миниссквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.

3. Оптимизация методики прямого масс-спектрометрического белкового профилирования и оценка возможности типирования клинических штаммов N. gonorrhoeae с использованием данного подхода.

4. Реализация схемы рог-типирования для характеристики коллекции российских клинических штаммов N. gonorrhoeae.

5. Анализ гетерогенности генов «домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae и разработка схемы типирования мультилокусным секвенированием клинических штаммов гонококка.

6. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика группы клинических штаммов N.. gonorrhoeae, выделенных на территории РФ.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе продемонстрированы возможности современных молекулярных подходов к характеристике и типированию клинических штаммов N. gonorrhoeae, условия отдельных методик отработаны впервые. На основе ПЦР-амплификации и масс-спектрометрического анализа продуктов реакции минисеквенирования предложена высокопроизводительная система одновременного исследования 15 генетических локусов гонококка - маркеров устойчивости к пяти классам антибиотиков. Впервые для характеристики штаммов N. gonorrhoeae использовапы возможности белкового профилирования с помощью прямого масс-спектрометрического анализа. Также в ходе работы существенно дополнены

представления о возможностях анализа изменчивости рог гена и некоторых «генов домашнего хозяйства» для типирования штаммов гонококка.

Впервые для географически неоднородной группы клинических штаммов N. gonorrhoeae, распространенных на территории РФ, исследован полиморфизм рог генов и 13 генов «домашнего хозяйства» (abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, glrtA, gnd, pdhC, pgm, pilA, pip, pyrD, serC), показана значительная гетерогенность исследованной выборки и описаны механизмы, участвующие в формировании фенотипически регистрируемого уровня антибиотикоустойчивости.

Результаты работы имеют значение для решения ряда теоретических вопросов молекулярной эпидемиологии N. gonorrhoeae, однако в большей степени представляют практическую ценность и направлены на прикладное использование. Предложенные методические схемы и их технологические решения делают реальным их использование в практических лабораториях для решения двух из трех основных задач клинической микробиологии: 1) быстрая оценка антибиотикорезистентности гонококка, 2) характеристика локальной (географической, временной) структуры популяции/субпопуляции возбудителя, идентификация циркулирующих штаммов или групп штаммов.

Реализадия и внедрение результатов работы в практику. Осуществляется внедрение результатов работы в клинико-лабораторную практику бактериологической лаборатории ФГУ ЦНИКВИ Росздрава.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава (Москва, 20 июля 2006 года), а также в ходе следующих конференций: IX Всероссийский съезд дерматовенерологов (Москва, 2005), 15-я Международная конференция по патогенным нейссериям (Кэрнс, 2006).

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 11 публикациях (5 в рецензируемых журналах, 6 - тезисы сообщений на конференциях). Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 14 рисунков. Состоит из сле-

дующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение и выводы», «Список литературы», который включает 175 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. Использовали контрольный (АТСС 49226) и 464 клинических штамма N. gonorrhoeae, выделенных от больных неосложнённой гонореей из 14 региональных центров РФ. Штаммы, охарактеризованные по чувствительности к 5 антибиотикам, представителям 4 классов (пенициллин, иефотаксим; тетрациклин; ципрофлоксацин; спекти-номицин) предоставлены бактериологической лабораторией ФГУ ЦНИКВИ Росздрава. Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae. Использовали свежую 48-ми часовую культуру гонококка, находящуюся в стационарной фазе роста. В качестве референтного микроорганизма использовали свежую 18-ти часовую культуру лабораторного штамма E.coli DH5a. Материал бактериальной культуры (одиночная колония) ресуспендиро-вали в растворе «AT» (50% ацетонитрил / 2,5% трифторуксусная кислота). Центрифугировали 1 мин X 14000 об/мин. 1 мкл супернатанта наносили на ячейки стального планшета для масс-спектрометрии (MSP 96 target ground steel, Braker Daltonics, Германия), смешивали с насыщенным в «AT» раствором одного из матричных соединений (а-циано-4-гидроксициннамовая кислота, а-СНСА; синапиновая кислота, SA; феруловая кислота, FA) и высушивали па воздухе в течение 5 минут.

Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием MALDI-TOF масс-спсктрометра Microflex (Bruker Daltonics, Германия), используя следующие параметры измерения: линейный режим, частота импульсов - 10 Гц, детекция положительно заряженных ионов с ускоряющим напряжением - 20.0 кВ, напряжение на накапливающем электроде - 18.6 кВ, время задержки экстракции - 350 нсек. Образец наносили на три ячейки планшета, для каждой из которых записывали конечный спектр (500 импульсов лазера), полученный суммированием 10 одиночных спектров (50 импульсов лазера). Внешнюю калибровку проводили с использованием точных значений масс известных белков Escherichia coli. Полученные спектры анализировали с использованием программы flexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия). Формирование пик-листа проводили в автоматическом режиме, используя единые стандартные условия отбора пиков: 1) центроидный алгоритм поиска (80% высоты пика), 2) отношение сигнал/шум — 15, 3) пороговое значение относительной интенсивности — 10%, 4) максимальное число пиков — 100, 5) максимальная ширина пика — 2 m/z. Идентификацию белков проводили путем поиска совпадения значений экспериментальных масс с массами

белков, аннотированных в базах данных (SwissProt/TrEMBL) с использованием ресурсов Ех-PASy-сервера (Ъ№з://са.ехра5у.от/5гз5Л. При этом учитывали инструментальную погрешность измерения, которая составляла 3 Да, а также возможную посттрансляционную утрату N-хонцевого метионина.

Генетический анализ штаммов N. gonorrhoeae. Выделение ДНК проводили по методу Boom с соавторами [Boom R. Et al., 1990]. Для амплификации фрагментов генов N. gonorrhoeae использовали праймеры, приведенные в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Праймеры, использованные для амплификации фрагментов генома N. gonorrhoeae,

связанных с рассматриваемыми механизмами устойчивости.

Мишень Праймер S'-3' последовательность Размер продукта, п.н.

рог, А M13F-Por01l M13R-Por08' eteac2acpttetaaaac2aceeccaetct2actttgeca°ccctt cacacageaaacaKctateaccatattgtgcgaagaagc 500-60Q2

рог, В M13F-Porll' M13R-Porl4' stcacffacettztaaaacaaceeccaatctftccEtacEctaca cacacaffeaaacagctatEiaccneattaGaarttirtgircgc 500-6002

Ыа Blf D2r B3f D4r tactcaatcggtaattggct gcccaaaaaagggacgaaag cgtatatctagttgaggcac gtgcctcaactagatatacg 340 (Asia, Africa) 142 (Toronto)

репА penA-f penA-r cgtgattgcgaaggcatlgg gtgcgtcagtgcggtatagg 379

ропА PonAl-f PonAl-r gagaaaatgggggaggaccg ggctgccgcattgcctgaac 206

gyrA GyrAFEx GyrAREx gacggcctaaagccggtgca atgttggtcgccataccgac 431

рагС ParCFEx ParCREx gtttcagacggccaaaagccc ggaacaacagcaattccgcaat 300

потМ Norl Nor2 tgggcagtacgtcggcg gggcggtcagcaggcgg 449

mtrR MtrAF MtrAR gacgacagtgccaatgcaacg ttaagattatttccggcgcaggcag 957

fc<(M) Tetl Tet2 atcctttctgggcttccattg ccgagcagggatttctccac 436

rpsJ RPS-for RPS-rev gtgctgttgtaaaaggcccg cggccggcaaatccagcttc 186

ermB Bfor Brev agtaacggtacttaaattgtitac gaaaaggtactcaaccaaata 640

erntF Ffor Frev cgggtcagcactttactattg ggacctacctcatagacaag 466

те/ Mfl Mf2 gataggaagaagataatgattgg aagagctgtttgcacaccgc 790

ITS 16Sfor 16Srev aaggccgttgccaatatcg tgtatgacgtgtgaagccc 785

1 - последовательности праймеров M13F и M13R подчеркнуты.

2-длины амплифицируемых фрагментов варьируют для разных генотипов.

Мишень Праймер 5'-3' последовательность' Размер продукта, п.».

abcZ abcZ abcZ-r EatctEtaaaacgacEEccaEtaaatcctcaccEECgtgca 716

adk adk adk-r gatctetaaaacpacggccagtagecaggcacgcccttgg eatccaEEaaacagctatgaccctgcccstgggtacgacct 602

aroE aroE aroE-r gatctgtaaaacgacgaccagtgcaaatcgccgcagattcatc eatccaEgaaaca?ctatEaccagccat№>acgatgcEEaac 830

fumC fumC fumC-r EatctgtaaaacgacggccagtccEgcctEccgffiEtcaE satccaeeaaacaactatEacceecaeecacaaccaattca 655

gdh gdh gdh-r EatctgtaaaacgacggccaetatcaaaccgatstgecEcet gatccagEaaacagctatEaccEteatttcagacegcatatccc 1156

glnA glnA glnA-r gatctataaaacgacpgccagtccgcatattttgccatttccc 685

gnd gnd gnd-r gatctgtaaaacgacgEccagttcctacgacgaaatacaccgc 698

pdhC pdhC pdhC-r 724

pgm pgm pgm-r gatctgtaaaacEacggccagtcEatgcceaccgcttEE gatccaggaaacagctatgaccgtgatsatttcggttgcgcc 533

pilA pilA pilA-r gatctgtaaaacEacEECcagtaccgtgctgattaccggcg gatccaggaaacagctatgacctttgcagcacgcgcttcac 563

pip pip pip-r EatctEtaaaacEacgsccaEtssattEtcaEaaEcaatatgggaa EatccaggaaacaEctatEaccaagctgcttttttgtgcggaac 1032

pyrD pyrD pyrD-r EatctEtaaaacgaceeccagtgtatEtttggcgeeatttcpe aatccaesaaacaEctatgaccacgcgpgcgatgtcttcg 795

serC serC serC-r gatctEtaaaacgacgpccagtcaggaaatgtcggactacaacgg EatccaggaaacasctatEacccgcptaagttgacgEcEtp 719

1 - последовательности праймеров M13F и Ml 3R подчеркнуты.

Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 66 мМ ТрисНС1, pH 9.0, 16.6 мМ (NH4)2S04, 2 мМ MgC12, по 100 мкМ каждого dNTP, 1 Ед Taq-полимеразы (Promega, USA) и по 10 пмолей каждого праймера в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research, США). Использовали единый температурный профиль: 94°С, 15 сек, 58°С, 15 сек, 72°С, 16 сек; 35 циклов. Продукты амплификации генов Ыа, tet(M), ermB, ermF, mefA анализировали в 2% агарозном геле.

Дефосфорилирование dNTP и элиминацию оставшихся праймеров в пост-амлификациошюй смеси проводили, инкубируя образцы с 1 Ед антарктической фосфатазы (New England BioLabs, Великобритания) и 5 Ед экзонуклеазы I (Fermentas, Евросоюз) при 37°С в течение 30 минут с последующей инактивацией ферментов при 85° С в течение 10 мипут.

Реакцию термоциклического минисеквенирования проводили в 10 мкл реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCl pH 9.0; 16.6 мМ (NH4)iS04; 2.5 мМ MgCh; по 0.2 мМ необходимых dNTP и/или ddNTP; по 10 пмолей каждого праймера (табл. 3) и 2 Ед TermiPol DNA Polymerase (Solis Biodyne, Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты ДНК. Наработку продуктов реакции осуществляли по универсальному профилю: 94° С - 20 сек, 58° С - 20 сек, 72° С -15 сек, 70 циклов.

Таблица 3. Праймеры, использованные в реакции минисеквенирования.

Ген II рай мер 5'-3' последовательность; масса Смесь ddNTP; dNTP Масса продуктов реакции минисеквенирования для дикого генотипа Масса продуктов реакции минисеквенирования для мутантного генотипа

репЛ penAz ggggtaaacatgggtatcg; 5933 Да dTTP; ddCTP 6206 Da (+ddCTP) 6510 Da (+dTTP+ddCTP) ins Asp345a

ропА ponAz ggttcaagagccgttgc; 5227 Да dTTP; dGTP; ddCTP 6133 Da (+dTTP+dGTP4 ddCTP) Leu421 5500 Da (+ddCTP) Leu421Pro

grA91 ataccacccccacggcgatt; dTTP; dATP; 6293 Да (+ddCTP) Ser91 6597 Да (+dTTP+ddCTP) Ser91Phe

6020 Да ddCTP 6606 Да (+dATP+ddCTP) Scr91Tyr

gyrA 6143 Да (+ddCTP) Asp95Gly

grA95 cgccatacggacgatggtg; 5870 Да dTTP; ddCTP; ddGTP 6447 Да (+dTTP+ddCTP) Asp 9 5 6183 Да (+ddGTP) Asp950Ala

6791 Да (+dTTP+dTTP+ddGTP) Asp95Asn

погМ CT-35 ccccgtatccgccgt; 4465 Да dATP; dTTP; ddCTP; ddGTP 4738 Да (+ddCTP) C-35 5386 Да (+dTTP+dTTP+ddGTP) C-35T

AG-RBS gacggcatttttattgactg; 6138 Да dATP; dTTP; ddCTP; ddGTP 7037 Да (+dATP+dATP+ddCTP) A-7 6451 Да (+ddGTP) A-7G

mtrRl acatacacgattgcacggat; 6110 Да dATP; dCTP; ddTTP; ddGTP 7676 Да (+5dATP) A-35 7363 Да (+4dATP) deIA-35

rntrR mtrR4 attgcacggataaaaagtc; 5595 Да dATP; dCTP; ddTTP; ddGTP 7474 Да (+6dATP) 8101 Да (+8dATP) insTT-10

mtrR6 tgaaatgccaatagagcgcg; 6175 Да dATP; dCTP; ddTTP; ddGTP 6770 Да (+dCTP + dCTP +ddGTP) Gly45 6463 Да (+ddTTP) Gly45Asp

rrs NgC1192 ggccatgaggacttgac 5236 Да dGTP, ddATP, ddTTP 5853 Да (+dGTP+ddTTP) CI 192 5533 Да (+ddATP) C1192U

rrl C2611T-f cgtcgtgagacagtttggtc 6164 dCTP, ddTTP 7030 (+dCTP, +ddTTP) C2611 6452 (+ddTTP) C2611T

rpsJ RPSZ acattttccgttctccgcac 5979 Да dATP, dTTP, ddGTP 6292 Да (+ddGTP) Val57 6910 Да (+dATP, +dTTP, +ddGTP) 1 Val57Met

Очистку продуктов реакции минисеквенирования проводили следующими образом: входящий в состав набора SpectroCLEAN Kit (Scquenom, США) сорбент в количестве 8 мг растворяли в 16 мкл ультрачистой воды (Mcrck, Германия), полученную суспензию в объеме 24 мкл вносили в пробирку с продуктами реакции минисеквенирования. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 15 мин. Затем осаждали сорбент центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин.

Для проведения масс-спсктрометрического анализа продуктов реакции аликвоту образца (0.2-1 мкл) с концентрацией олигонуклеотидов 10-30 пмоль/мкл, наносили на предва-рительпо высушенную на планшете AnchorChip (600 мкм, Broker Daltonics, Германия) матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, Германия) в 50% ацетонитриле (Merck, Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосповного (Fluka, Германия), и высушивали на воздухе.

Масс-спсктрометрический анализ проводили с использованием MALDI-TOF масс-спсктрометра Microflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного азотным лазером (Х=337 нм) с частотой импульсов до 20 Гц. Все измерения проводили в линейной режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением - 20.0 кВ, накапливающем электроде - 18.65 кВ, фокусирующей лише - 9.2 кВ и временем задержки анализатора - 400 нсек. Для получения каждого масс-спектра использовали 50 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца.

По наличию в масс-спектрах продуктов реакции пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, судили о нуклеотидном контексте в данном положении (табл. 3).

Определение нуклеотидной последовательности рог генов, фрагментов гена рагС и 13 генов «домашнего хозяйства» проводили модифицированным методом Сенгера [Sanger, et al., 1977] с использованием ABI Prism® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США; "Hitachi" Япония) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. В реакции секвенирования рог генов и фрагментов 13 генов «домашнего хозяйства» использовали стандартные праймеры -21 М13 TGTAAAACGACGGCCAGT-3', М13 reverse CAGGAAACAGCTATGACC-3', в реакции секвенирования рагС гена — те же праймеры, которые использовали в реакции амплификации (табл.1). Восстановление полноразмерных последовательностей рог гена, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax Ine, США). Расчёт параметров гетерогенности анализируемых последовательностей и тест на селекцию проводились с использовани-

ем программы MEGA version 3.1 [Kumar et al., 2004]. Нуклеотидные последовательности рог генов анализируемых штаммов сравнивали с последовательностями, представленными в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (bttrr//www.ncbi.nlrTi.riih.eov/BLAST). По результатам анализа тестируемому штамму ставился в соответствие серотип N. gonorrhoeae, последовательность рог гена которого максимально гомологична анализируемой.

Статистический анализ. Для учёта результатов исследования, формирования промежуточных таблиц, осуществления элементарных расчетов, описательной статистики и построения диаграмм использовали программные ресурсы пакета Microsoft Office Excel 2003.

Все статистические тесты проводили для уровня значимости /><0,05. Так как в исследовании мы имели дело с качественными номинальными признаками (значения которых не могут быть упорядочены по какому-либо семантическому принципу), для подтверждения наличия ассоциации генотипов и категорий чувствительности, оценки силы связи выбраны критерий х2 и коэффициент сопряженности Крамера соответственно. Основные статистические расчёты производили с помощью пакета Statistica 6.0. Для численной оценки дискриминирующей способности методов типирования использовали индекс разнообразия Симпсона D [Simpson, 1949]. Согласно общепринятой практике, приемлемыми считаются методы типирования (или их комбинации), имеющие значение индекса Симпсона 0.9 и выше [Hunter et al., 1988].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae

В исследование включена группа из 464 клинических штаммов N. gonorrhoeae, выделенных от пациентов из 14 региональных центров РФ. Географическая неоднородность исследуемой группы клинических штаммов делает эту выборку хорошей моделью для отработки молекулярных подходов к характеристике и изучению внутривидовой изменчивости гонококка, рассмотренных далее. Представленность различных географических областей территории РФ в выборке, с одной стороны, даёт возможность оценить региональные особенности популяции возбудителя, с другой — обобщить получаемые данные и экстраполировать формулируемые выводы на территорию РФ в целом.

Проведено выделение ДНК клинических штаммов, сформирован лабораторный банк ДНК. Анализ генетических маркеров резистентности и рог-

типирование осуществлены для 464 штаммов; прямое белковое профилирование реализовано для 278 штаммов; детальное сравнение методов рог- и мульти-локусного типирования проведено для группы из 84 штаммов.

Прямое белковое профилирование N. gonorrhoeae

С целью получения воспроизводимых и максимально насыщенных масс-спектров на лабораторном штамме Е. coli DH5a отработана методика белковой экстракции и условия масс-спектрометрического анализа (см. «Методы исследования»). Выбрано оптимальное матричное соединение - a-СНСА, область анализа масс-спектра ограничена диапазоном m/z 4000 - 12000, в рамках которого отработаны критерии выбора пикЬв при формировании пик-листа (набор значений m/z и относительных интенсивностей пиков). В предшествующих работах предлагается использовать различные матричные растворы и методики подготовки образца бактериальной культуры для масс-спектрометрического анализа [Edwards-Jones et al., 2000; Hettick et al., 2004; Meetani et al., 2005], показаны результаты разной степени качества и информативности. Сравнение достигнутых нами характеристик масс-спектра (среднее разрешение в указанном диапазоне, отношение сигнал/шум) с данными, полученными в указанных работах, свидетельствует об эффективности отработанной методики. Использование в качестве матрицы а-СНСА позволяет получить максимально гомогенную структуру и форму кристаллов в сравнении с двумя другими исследованными матрицами, что играет роль для сохранения от спектра к спектру необходимой точности измерения масс, а также для успешной записи спектров в автоматическом режиме.

Поиск в базе данных SwissProt/TrEMBL позволил соотнести 16 регистрируемых значений m/z с молекулярными массами бактериальных белков, причём большинство из них представляли собой белки рибосом бактерии. Установлены точные значения m/z для этих пиков в спектре штамма Е. coli DH5a, который дополнительно анализировали в каждом из последующих экспериментов с N. gonorrhoeae и использовали для внешней калибровки. Ранее было показано

преобладание в составе регистрируемых масс-спектров бактериальных клеток рибосомальных белков, что, вероятно, связано с их локализацией в цитозоле (в отличие от мембранных), присутствием в достаточно большом количестве, относительно небольшой массой, а также основностью большей части из них, что в условиях кислой экстракции повышает эффективность ионизации и десорбции, а также масс-спектрометрического анализа в режиме положительных ионов [Ryzhov and Fenselau, 2001].

Аналогичным образом получена серия масс-спектров для лабораторного штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226 (рис. 1), проведен их качественный и количественный анализ. Воспроизводимость полученных спектров оценивали на основании дисперсии значений m/z, относительной интенсивности и частоты регистрации отдельных пиков: максимальное среднеквадратичное отклонение для m/z составило 2.8 Да, для относительной интенсивности - 0.24. Выделены 20 устойчиво воспроизводимых пиков, для которых частота регистрации f > 0.7. Усреднённые по 10 измерениям значения m/z этих пиков составляют: 4474, 4511, 4689, 4784, 5010, 5052, 5130, 5484, 5908, 5946, 6053, 6404, 7080, 7227, 8068, 8167, 8225, 9379, 9570, 10260. По базе данных SwissProt/TrEMBL 12 пиков соотнесены с рибосомальными белками: 4473 - RL36, 5051 - RL34, 5907 -RL33, 6402* - RL32, 6805* - RL30, 7078 - RL29, 7226* - RL35, 8165 - RL31, 8224* - RS21, 8687* - RL28, 9377* - RS20, 9568* - RL27, 10259* - RS19 (* - масса с учётом утраты начального метионина).

Сравнительный анализ масс-спектров для 278 клинических штаммов N. gonorrhoeae выявил три пика со значениями m/z 4473, 5051 и 8165 (согласно масс-спектру N. gonorrhoeae АТСС 49226), которые меняются у ряда штаммов на 4487, 5081 и 8146 соответственно. Соотнесение этих пиков с рибосомальными белками RL36, RL34 и RL31 подтвердили секвенированием полноразмерных последовательностей генов N. gonorrhoeae — rpmJ, гртН и гртЕ. В каждом из них обнаружен единственный значимый нуклеотидный полиморфизм, приводящий к соответствующей аминокислотной замене. Теоретически рассчитанные изменения массы белков при данных заменах совпадали с изменением, ре-

гистрируемым в ходе масс-спектрометрического анализа: 1) RL36: 4473 (wt) / 4487 (V7I); 2) RL34: 5051 (wt) / 5081 (А37Т); 3) RL31: 8165 (wt) / 8146 (R10H).

Рисунок 1. Масс-спектр белкового экстракта клеток штамма N. gonorrhoeaa АТСС 49226, ограниченный диапазоном m/z 2000 -16000.

Из восьми теоретически возможных комбинаций, выявленных для значений m/z 3-х белков, среди исследованной группы штаммов обнаружены четыре варианта. Учитывая неизменность остальных значений m/z в спектре, выделено четыре типа белковых масс-профилей (протеотипов) гонококка и проведена оценка их распределения в исследованной группе штаммов (табл. 4). Проведено сравнение распространенности различных протеотипов в отдельных регионах и в целом в РФ (рис.2).

Таблица 4. Распределение протеотипов гонококка в исследованной группе штаммов

Белок М Кластеры варьирующих пиков для:

типа 1 типа 2 типа 3 типа 4

RL36 4474 4474 4474

4487 4487 4487

RL34 5052 5052 5052 5052

5082 5082

RL31 8147 8147

8167 8167 8167 8167

Число штаммов 236 26 15 1

Относительная частота, % 84,9 9,4 5,4 0,4

Рисунок 2. Встречаемость протеотипов гонококка в регионах РФ в сравнении с общей распространенностью (включены регионы, для которых исследовано более 10 штаммов).

Наблюдаемые незначительные отличия качественного состава масс-спектров в группе клинических штаммов гонококка согласуются с представлением о ключевой роли рибосомальных белков в жизнедеятельности клетки, консервативности их аминокислотных последовательностей и соответствующих генов. Напомним, что 12 из 20 устойчиво регистрируемых пиков соотнесены с рибосомальными белками, другие 8 пиков также характеризовались постоянством значений m/z.

Предложенная методика получения воспроизводимых масс-спектрометрических профилей бактериальных клеток апробирована на географически неоднородной группе штаммов. Обусловленная низкой вариабельностью белковых профилей (4 протеотипа) низкая дискриминирующая способность (D — 0.27) делает невозможным применение этого подхода для типирова-ния патогена. Обратная сторона этого результата — относительная стабильность качественного состава профилей — позволяет говорить о перспективности видовой идентификации возбудителя с использованием данного подхода. Сформи-

рованный набор из 20 устойчиво воспроизводимых пиков масс-спектра может рассматриваться как кандидатный список для формирования видоспецифично-го профиля возбудителя.

Использование MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа для характеристики микробной клетки предложено, например, для идентификации мико-бактерий [Hettick et al., 2004], представителей семейства Enterobacteriaceae [Lynn et al., 1999], типирования штаммов бетагемолитических стрептококков [Kumar et al., 2004], однако в нашей работе впервые произведена оценка этого подхода для характеристики штаммов N. gonorrhoeae.

Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae

Осуществлен дизайн праймеров для реакций амплификации, минисекве-нирования и секвенирования 15 генетических локусов, изменения которых ассоциированы с возникновением феномена лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae к пяти классам АМП (пенициллины, тетрациклины, фторхинолоны, спектиномицин, макролиды). Используемая схема анализа включала регистрацию генетических маркеров, обусловленных как приобретением новых элементов, так и мутациями в специфических хромосомных локусах бактерии. С целью уменьшения себестоимости и повышения общей производительности анализа, отработаны универсальные условия проведения реакций амплификации, минисеквенирования и секвенирования, в цепочке последовательных технологических этапов минимизировано количество операций по переносу и разведению образцов, все процедуры приведены к формату 96-ти луночного планшета. Проведен комплексный анализ 464 клинических штаммов N. gonorrhoeae, для каждого из которых получен индивидуальный профиль из 15 генетических маркеров резистентности.

Осуществлено сравнение профиля чувствительности к АМП с частотами обнаружения соответствующих генетических маркеров устойчивости:

1) по данным тестов на чувствительность к пенициллину в исследованной группе 122 штамма (26,3 %) относились к категории чувствительных и 342 (73,7 %) к категории резистентных. Частоты обнаружения генетических маркеров устойчивости составили: Ыа — 3,9 % (18 из 464 штаммов), мутации в генах ропА - 71,3 % (326), репА - 87,7 % (407), репВ - 54,3 % (252), т/гД - 48,3 % (224). Отсутствие выбранных маркеров резистентности наблюдалось в 12,1 % случаев (55 штаммов). По данным тестов на чувствительность к цефотаксиму все штаммы относились к категории чувствительных.

2) согласно тестам на чувствительность к тетрациклину в исследованной группе штаммов 168 (36,2 %) относились к категории чувствительных и 296 (63,8 %) - к категории резистентных. Частоты обнаружения маркеров устойчивости составили: /е/М— 0,9 % (4 из 464 штаммов), мутации в генах г/иУ— 79,1 % (367), репВ - 54,3 % (252), т1гК - 48,3 % (224). Отсутствие выбранных маркеров резистентности наблюдалось в 19,8 % случаев (92 штамма).

3) по данным тестов на чувствительность к ципрофлоксацину в исследованной группе штаммов 249 (53,7 %) относились к категории чувствительных и 215 (46,3 %) к категории резистентных. Для анализа генетических механизмов формирования резистентности гонококка к фторхинолонам выбраны следующие генетические маркеры: полиморфизмы генов гиразы и топоизомеразы IV (&угЛ, рагС), полиморфизм промотора и гена т1гК эффлюксного белка М^Я. Частоты обнаружения специфических маркеров устойчивости составили: &гА - 45,5 % (211 из 464 штаммов), рагС - 44,4 % (206); неспецифических маркеров: т1гЯ - 48,3 % (224). Отсутствие выбранных маркеров резистентности наблюдалось в 31,7 % случаев (147 штаммов).

4) по данным тестов на чувствительность к спектиномицину в исследованной группе подавляющее большинство штаммов - 453 (97,6 %) относились к категории чувствительных, остальные 11 (2,4%) - к категории умереннорези-стентных. Для описания генетических механизмов формирования резистентности гонококка к спектиномицину в панель генетических маркеров был включен

ген 16Б рРНК (гг$). В исследованной группе штаммов описанный в литературе полиморфизм не обнаружен.

5) с целью анализа распространенности известных генетических механизмов устойчивости гонококка к макролидам выбраны следующие генетические маркеры: те/ (кодирует белок специфического эффлюкса), егтВ, егтР (гены рибосомальных метилаз), мутации в гене гг1 (ген 23 Б рРНК). В исследованной группе у 5 штаммов выявлен ген егтВ, у одного штамма — егтГ и у 2 штаммов те/ген; описанного ранее полиморфизма в гене гг1 не обнаружено.

При анализе данных профиля антибиотикочувствительности обращает на себя внимание высокий процент штаммов, устойчивых к пенициллину (73,7 %), тетрациклину (63,8 %) и ципрофлоксацину (46,3 %). При этом штаммы, характеризующиеся устойчивостью одновременно к двум или трём антибиотикам (мультирезистентные), также составляют большинство (64 %). Вместе с тем практически все анализируемые штаммы чувствительны к цефотаксиму и спек-тиномицину. При отсутствии значимых региональных отличий в уровне лекарственной устойчивости гонококка, можно говорить о повсеместной распространенности резистентных и мультирезистентных штаммов, что подтверждает и продолжает описанную ранее тенденцию, характерную как для отдельных исследованных территорий РФ [Никулин и соавт., 1999; Страчунский и соавт., 1999; Кобенко и соавт., 1999; Верещагин и соавт., 2005], так и для микробной популяции гонококка в целом [ТаряаП, 2002].

В настоящем исследовании впервые реализован одновременный анализ 15 генетических маркеров резистентности и использована методика анализа известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим МАЫ)1-ТОР масс-спектрометрическим анализом. Техническое решение данной задачи представляет отдельный интерес. Этот подход уже применяется с успехом на практике, например, для анализа полиморфизма генов человека. При этом в последние годы масс-спектрометрия как высокоточный метод молекулярного анализа получает все большее распространение в биологии и медицине. МАЬВ1-ТОР масс-спектрометрический анализ все чаще

рассматривается как рутинный инструмент экспериментальной, а в отдельных его реализациях, и клинической микробиологии с достаточно широким полем возможных приложений [Fenselau and Demirev, 2001; Ben L.M. van Baar, 2000; Jackson O, Lay Jr., 2001]. Результаты нашей работы подтверждают возможность использования описанной технологии для анализа SNPs бактериального генома и, в частности, для мутаций - маркеров лекарственной устойчивости бактерии. Разработанная система (дизайн праймеров, состав реакционных смесей, протоколы детекции), а также полученные экспериментальные данные могут служить одним из компонентов комплексного анализа микроба, объединенного единой инструментальной базой (MALDI-TOF масс-спектрометр) и потому удобного для использования в практике клинико-диагностических лабораторий.

Полученные результаты позволили проанализировать частоты встречаемости различных генетических детерминант устойчивости. Ген уЗ-лактамазы обнаружен у 3,9 % штаммов (18 из 464) со следующей географической принадлежностью: Санкт-Петербург (5), Самара (5), Москва (4), Чебоксары (1), Мурманск (1), Нижний Новгород (1), Екатеринбург (1). Все штаммы с наличием tetM-детерминанты (0,9 %) относились к Московскому региону. Приведенные данные свидетельствуют о большей распространенности плазмидных маркеров резистентности в субпопуляциях крупных промышленных и торговых центров с числом жителей, превышающим 1 миллион, при этом уровень распространенности плазмидных факторов резистентности в целом достаточно низкий. Последний факт на фоне общего высокого процента резистентных к пенициллину и тетрациклину штаммов указывает на то, что формирование регистрируемой резистентности, главным образом, обуславливается другими механизмами, что подтверждено высоким процентом встречаемости генетических детерминант резистентности, локализованных на хромосоме.

Для установления ассоциации генотипа (совокупности определяемых генетических признаков) и фенотипа (категорий антибиотикочувствительности) проведена статистическая оценка полученных данных с помощью построения соответствующих таблиц сопряженности. Показана статистически значимая

связь анализируемых признаков по критерию Пирсона, р<0,001 и коэффициенту сопряженности Крамера, который составил 0.64 / 0.53 / 0.89 при анализе данных по устойчивости к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину соответственно. Анализ распределения отдельных маркеров и их сочетаний в группах чувствительных и резистентных штаммов позволил оценить информативность анализируемых генетических признаков для прогнозирования лекарственной устойчивости. Учитывались уровень значимости выявленных отличий в группах чувствительных и резистентных, а также абсолютная частота встречаемости маркера. Так, для каждого из трёх препаратов можно выделить генетические маркеры (и их сочетания), обнаружение которых позволяет отнести тестируемый штамм к резистентной категории с вероятностью более 81 % (табл. 5).

Таблица 5. Маркеры и их сочетания, для которых показана прогностическая ценность при оценке анти-биотикорезистентности N. gonorrhoeae к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину.

Антибиотик Генетический маркер Р

Пенициллин Ыар„, 94%

ропАт1 81 %

Тетрациклин 100%

rspJmM.penB„„ 81 %

Ципрофлоксацин Ю>гА„„ 83%

РагСти, 83%

gyrAm„ parCmut 93%

Р - Вероятность отнесения штамма к резистентной категории.

Такой выбор маркеров согласуется с современными (на момент оформления работы) теоретическими представлениями о соответствующих механизмах резистентности и является ожидаемым. В частности, исключение репАтШ из числа отобранных маркеров согласуется с данными о доминирующей роли мо-заичности структуры гена ргпА в механизме устойчивости не только к пени-циллинам, но и цефалоспоринам [Ameyama et al., 2002]. При этом описанная ранее и включенная в список анализируемых нами маркеров мутация в гене репА (Asp-345a) обеспечивает низкий уровень устойчивости (0.125 мкг/мл) и, вероятно, является лишь первым этапом в серии изменений структуры гена

репЛ и соответствующего ПСБ2, обуславливающих резистентность к беталак-тамным антибиотикам.

Стоит отметить, что большинство выделенных маркеров соответствуют достаточно полно изученным механизмам, определяющим высокий, клинически значимый уровень резистентности. В то же время другие рассмотренные нами маркеры ассоциированы с ещё плохо исследованными механизмами резистентности, каждый из которых в отдельности даёт незначительный вклад в общий уровень устойчивости, и, лишь действуя синергично в различных комбинациях, они способны формировать клинически значимый уровень резистентности. Например, роль маркеров penBmut и mtrRmu, в формировании клинически значимого уровня резистентности к пенициллину остается неясной. Последние публикации на эту тему подтверждают сложность механизмов хромосомно-детерминированной устойчивости гонококка к пенициллину, в частности, указывают на существование взаимосвязи между этими двумя механизмами, которая необходима для реализации значимого уровня устойчивости [01е-sky et al., 2006; Shafer et al., 2006], кроме того, описан на молекулярном уровне механизм действия обнаруженной ранее детерминанты periC [Ropp et al., 2002; Zhao et al., 2005].

He показано значимого вклада двух эффлюксных механизмов, соответствующих маркерам mtrmu, и погМтШ. Примечательно, что все штаммы исследованной группы по значениям МПК ципрофлоксацина отнесены либо к чувствительным, либо к резистентным, тогда как умереннорезистснтные не обнаружены. При этом сами по себе обе указанные мутации лишь незначительно повышают значения МПК фторхинолонов, не обеспечивая даже уровня порогового значения (0.06 мкг/мл), однако, действуя одновременно с модификациями мишеней действия (гиразы, топоизомеразы IV), умножают эффект последних. Таким образом, полученные результаты дают дополнительные подтверждения относительности вклада эффлюксных систем NorM и MtrRCDE в формирование устойчивости к фторхинолонам. Однако в ближайшей перспективе значимость эффлюксных механизмов может быть пересмотрена в связи с недавним описа-

нием у ряда грамположительных и грамотрицательных видов бактерий мобильных детерминант фторхинолоновой устойчивости (плазмидные гены qnr), обеспечивающих низкий уровень устойчивости [Jacoby et al., 2006].

Типирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции.

рог-типирование. Определены нуклеотидные последовательности рог-генов 464 клинических штаммов, по результатам сравнения с ранее описанными аллельными вариантами установлены соответствующие серотипы. Проведен анализ распространенности сероваров PIA/PIB и отдельных серотипов в группе исследованных штаммов (табл. 6, рис.3).

Рисунок 3. Распространенность серотипов PIA и PIB в отдельных регионах РФ в сравнении с суммарной распространенностью по всем анализируемым регионам (р<.0,001).

Впервые получены значимые данные, подтверждающие гетерогенность популяции гонококка, распространенной на территории РФ. Данные, представленные в рамках системы серотипирования, могут быть сопоставлены с уже накопленной в разных странах мира информацией о распространенности и многообразии циркулирующих в популяции гонококка сероваров и серотипов и, следовательно, аллельных вариантов рог гена.

Региональный центр Количество штаммов Р1А серотипы РГО серотипы

1А2 IA3 IA6 IA8 IA10 IA18 IB1 IB2 IB3 1В4 IB5 IB3/6 IB8 IB9 IB22 IB26 IB29

Архангельск^ . • '109 . *0 0' ' ."25 , з • ; 2 0. .0 29' зо 0 -5 , 0 ' 1!' 4" ' 2 8 • -0

Ькагерянбург ' 1 "¡0! ' о- I в" , » ' . 0 • 0, 18 • в* ■Ж, . 0 'Л г». f V Р

Иркутск ' . 1 • % • А'* .,0 3- " Л'"- «i ' i . -у'1 12- 24*' 0 ' ,6- 'l ■ 0 ' •• 2* 20 i .0.

Калуга 5 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 1 0 0

Киров 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Москва * ' ,• 26 - - 0 ,0 1 1 ■ о: 13 - - 0' - 1 . 1 • 0 •• J-0 • ■ J , 'l- 0

Мурманск '< ,85 . ' о: 0 Г, "5 , о< 0 0 ' о", 52 17 . 0- ; i , 2 , :'о ' '4 » /4 , ,.0

Н. Новгород " 0 . 0 0" ч <Г- : о.'. 0" 10 0 2"' о : 0 ■в, 4 - ' 0- й

Пскйв ' , : 11 1 0 0 . ' 0 d\ ' 0 • : о , 0 , 2 . : 'i 1 0 ,'2 ' 1 0 '0 ^ L

Рязань б 0 0 0 0 0 0 0 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0

С?Икт-Ийер%рГт1 ~е 1.40 , 0 . 0 2 •l- : 1' 0 ' 0' ' '14 1, ' 3 ' :„4 2 • "'г; 3 , г

Самара • 35 ■ - ' О I * 2f" '1 , 0 ' г р * -У • 9, 5 ' 8 9- 1 ; 0 0 « ,3 ; 2"- 8 ;

Ставрополь 8 0 0 0 0 0 0 0 5 1 0 1 0 0 0 1 0 0

Чебоксары ' ';, 13- ., • 0. < 0 , а о l, *0 . м 3 ' 6 ; ' 9-' .0 Го ■ 0 1 h ■ 0

464 1 2 37 5 6 1 6 170 122 10 20 и 4 9 41 18 1

ВСЕ РЕГИОНЫ % 0,22 0,43 7,97 1,08 1,29 0,22 1,29 36,64 26,29 2,16 4,31 2,37 0,86 1,94 8,84 3,88 0,22

52 (11,2%) 412(88,6%)

ОТДРЛЬНЫР ч РЕГИОНЫ' Ь «4 1 • i. J> 5 6 156 11$ to ; 19-; 4 , Л» . 39 1

* 0,21 , OAS Ъз- 135, о^Г !.С35 . 35,И 26,«?, 2,25 43«' 7мг 405 , 6,23

-ЩЧ,7%) - ' . .. i'ij. 'Л-. 392^88,3»/«) , (

Примечания:1 - включены регионы, для которых исследовано более 10 штаммов, жирным шрифтом отмечены частоты встречаемости доминирующих серотипов.

Всего в исследованной группе штаммов выявлено 11 PIB и 6 PIA серова-ров, отмечено преобладание в выборке PIB серовара (88,6%) с высоким процентом встречаемости серотипов IB2 (41,3%), IB3 (29,6%) и IB22 (9,9%). В группе штаммов, относящихся к PIA серовару (11,2%), доминирует серотип IA6 (71,2%). Результаты согласуются с данными, полученными нами ранее для небольшой группы клинических изолятов, выделенных в Москве, Московской области и Смоленске [Ильина и соавт., 2003]. Следует отметить, что убедительные данные о низкой встречаемости PIA серовара и представленности основных серотипов также получены для российской популяции впервые.

Для проверки гипотезы о связи PIB серовара с феноменом мультирези-стентности гонококка [Bygdem et al., 1984, Backman et al., 1985], определенной как устойчивость к двум классам АМП и более, проведен соответствующий статистический анализ. Построены таблицы сопряженности, вычислены критерий х2 Пирсона и коэффициент сопряженности Крамера: 1) для оценки наличия ассоциации между сероваром и признаком мультирезистености (табл. 7), 2) а также для проверки гипотезы о роли в этой ассоциации мутаций репВ локуса (табл. 8).

Таблица 7. Наличие ассоциации между сероваром и фенотипом резистентности.

Ссровар Фенотип

S R Multi-R Всего

PIA 7 19 26 52

50% 50%

PIB 78 | 63 271 412

34% 66%

Критерий х2 Пирсона, р<0,001; Коэффициент сопряженности Крамера - ОД 7

Таблица 8. Вклад мутацийpcnß локусд в ассоциацию между РШ сероваром и мультирезистентностъю.

Серовар/ генотип Фенотип

S R Multi-R Всего

PIA 7 19 26 52

50% 50%

PIB 68 1 28 63 159

60% 40%

PIB /репВ 10 | 35 208 253

18% 82%

Критерий ï2 Пирсона, /><0,001 ; Коэффициент сопряженности Крамера - 0,36

Статистический анализ полученных данных показал достоверно слабую ассоциацию между ними (коэффициент сопряженности Крамера составил 0,17). Отчасти это может быть объяснено резким количественным отличием сравниваемых групп — относящихся к PIA серовару (52 штамма) и относящихся к PIB серовару (412 штамма), что снижает точность статистической оценки. Возможно, в будущих работах при значительном увеличении выборки штаммов и, как следствие, увеличения абсолютного числа штаммов Р1Л серовара можно будет выявить более выраженную ассоциацию или опровергнуть наблюдаемый феномен. С другой стороны, полученные результаты показывают, что частота встречаемости мультирезистентных штаммов в группе серовара PIB достоверно выше частоты «немультирезистентных» (чувствительные + резистентные к одному препарату) штаммов: 66 % и 34 % соответственно (р<0,001). Высказано предположение, что наблюдаемая нами слабая ассоциация обусловлена известными изменения репВ локуса, которые, как было показано [Gill et al., 1998; Ole-sky et al., 2002, Olesky et al., 2006], вносят определенный вклад в формирование неспецифической резистентности гонококка путём снижения проницаемости поринового канала для ксенобиотиков. Проведенный статистический анализ распределения относительных частот указывает на справедливость высказанного предположения.

Для ограниченной группы, включающей 87 штаммов, проведен детальный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей рог генов с оценкой их гетерогенности. При сравнении двух основных вариантов рог гена для аллели рогВ показана сравнительно большая гетерогенность, выражающаяся в большем числе аллельных вариантов, полиморфных сайтов, наличии 3-, 6-, 12-нуклеотидных инсерций и 6-нуклеотидных делеций. Вычисление нуклео-тидного разнообразия (п) подтвердило эту предварительную оценку: величина п составила 0,004 и 0,03 для аллельных вариантов рог А и рогВ, соответственно. Тест на селекцию также выявил отличия в эволюции этих аллельных вариантов: рогВ аллель достоверно вероятнее подвержена положительной селекции; в случае рогА варианта получены противоположные результаты, свидетельствующие

о действии стабилизирующего отбора в эволюции этого локуса. Полученные данные согласуются с имеющимися в литературе указаниями на отличия в особенностях изменчивости и эволюции этих вариантов гена [Posada et al., 2000].

. В ходе исследования описаны 55 нуклеотидных вариантов рог гена. Для рог-типирования индекс разнообразия Симпсона составил 0.97, что говорит о высокой дискриминирующей способности. Дендрограмма, построенная с использованием матрицы попарных нуклеотидных отличий между анализируемыми рог-последовательностями, позволила разделить исследованную выборку на две крупные группы, соответствующие аллелям рогА и рогВ, а также несколько групп внутри рогВ аллели, однако это разделение не выявило какой-либо ассоциации с географией выделения этих штаммов. В целом, полученные данные свидетельствуют о достаточно высоком уровне гетерогенности исследованной выборки.

Типирование мультилокусным секвенированием. Определены нуклео-тидные последовательности фрагментов 13 генов «домашнего хозяйства» для 84 штаммов N. gonorrhoeae. Для каждого из 13 локусов проведено сравнение полученных последовательностей между собой, а также с последовательностями, представленными в базе данных GenBank. В соответствии с ранее принятой практикой каждый уникальный вариант последовательности (отличающийся от другого как минимум на один нуклеотид) рассматривался как отдельный ал-лельный вариант, которому присваивался соответствующий номер (согласно данным, полученным Vischidi с соавт. и представленным в базе данных GenBank) или новый номер для аллелей, обнаруженных впервые. Таким образом, для каждого штамма получен аллельный профиль, представленный набором аллельных вариантов по всем 13 локусам.

Анализ гетерогенности фрагментов 13 генов «домашнего хозяйства» выявил значительные отличия в уровне их изменчивости. При выборе генетических локусов, которые могут быть в дальнейшем использованы для схемы мультилокусного типирования гонококка, ориентировались на максимально

выявленное количество аллельных вариантов. Полученные характеристики генов были сравнимы с результатами, полученными ранее Viscidi et al. на группе из 25 штаммов [Viscidi et al., 2003]. В 2005 году этой же группой авторов (параллельно с ходом нашей работой) были опубликованы результаты аналогичного исследования, проведенного уже на группе около 200 штаммов, но представляющих территориально ограниченную популяцию гонококка (штаммы выделены в двух клиниках Балтимора).

Сравнение результатов нескольких исследований, проведенных с использованием качественно разных выборок клинических штаммов, позволяет с ещё большей уверенностью считать обоснованным выбор 7 локусов (fumC, gdh, glnA, grid, pilA, pyrD, serC) для использования в схеме мультилокусного типи-рования гонококка.

Выбранные локусы были использованы для оценки дискриминирующей способности метода, анализа гетерогенности и структуры исследованной выборки. В сравнении с другими рассмотренными методами типирования показана максимальная дискриминирующая способность этого подхода: индекс разнообразия Симпсона составил 0.98. Дендрограмма, построенная с использованием матрицы попарных отличий между аллсльными профилями штаммов, подтвердила высокий уровень гетерогенности, разделила исследованную выборку на несколько групп, отличных от групп, полученных по результатам сравнительного анализа аллелей рог гена.

Полученные данные вносят вклад в создание наиболее информативной, стандартизированной системы мультилокусного типирования N. gonorrhoeae.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

gonorrhoeae. Разработка методов молекулярного типирования штаммов N. gon-

orrhoeae для российской популяции возбудителя актуальна и имеет важное практическое и эпидемиологическое значение.

В настоящей работе предложен комплексный подход оценки клинически и эпидемиологически значимых свойств возбудителя, апробированный на географически неоднородной группе российских штаммов N. gonorrhoeae. Для всех исследованных регионов подтверждена высокая распространенность резистентных и мультирезистентных штаммов, охарактеризованных с позиций известных генетических механизмов формирования лекарственной устойчивости. Впервые исследованы возможности прямого белкового профилирования для характеристики штаммов гонококка. Полученные результаты указывают на возможность использования этого подхода для видовой идентификации возбудителя. Данные о гететерогенности исследованной выборки штаммов получены с использованием двух подходов (рог-типирование, мультилокусное секвени-рование), основанных на прямом анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов генома, отличающихся по уровню изменчивости и подверженности селекции в эволюционном процессе. Описана дискриминирующая способность и специфика молекулярно-эпидемиологической информации, получаемой каждым из методов.

Результаты представленной работы способствуют осуществлению на территории РФ мониторинга гонококковой инфекции на современном методологическом и технологическом уровне.

ВЫВОДЫ

1. Сформирована коллекция из 464 образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae, выделенных от пациентов из 14 региональных центров РФ.

2. Разработан и реализован подход к оценке антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae, основанный на одновременном анализе 15 генетических локу-сов, позволивший выделить маркеры (и их сочетания), обнаружение которых с точностью более 81 % прогнозирует фенотипическую устойчивость гонококка к пенициллинам, тетрациклину, фторхинолонам.

3. Предложена методика прямого белкового профилирования с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии. Показана низкая дискриминирующая способность этого подхода (D = 0.27), что не позволяет использовать его для типирования N. gonorrhoeae, но указывает на возможность видовой идентификации.

4. Показана высокая дискриминирующая способность рог-типирования (D = 0.97) и возможность анализа получаемых данных в рамках системы сероти-пирования (D = 0.78). Установлен вклад мутаций репВ локуса рог гена в формирование мультирезистентности.

5. Анализ пуклеотидных вариаций 13 генов «домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae позволил установить 7 наиболее информативных локусов: fumC, gdh, glnA, gnd, pilA, pyrD, serC, позволяющих осуществлять молекулярного типирования с высокой степенью дискриминации (D = 0.98).

6. Впервые на основании молекулярно-эпидемиологической характеристики географически неоднородной группы штаммов N. gonorrhoeae, выделенных на территории РФ, а) показан преимущественно хромосомный механизм формирования лекарственной устойчивости к пенициллину и тетрациклину; б) определены частоты встречаемости различных серотипов с преобладание PIB серовара (88.6 %); в) выявлено значительное генетическое разнообразие циркулирующих в популяции штаммов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Малахова М.В., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Зубков М.М., Припутневич Т.В., Кисина В.И., Кубанова А.А. Анализ генетических маркеров резистентности N. gonorrhoeae к 6-лактамным антибиотикам // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2006. - Т. 141, № 5. - С. 549-554.

2. Верещагин В. А., Ильина Е. Н., Зубков М. М., Припутневич Т.В., Кубанова А. А., Говорун В. М. Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии для выявления в генах gyrA и parC Neisseria gonorrhoeae однонуклеотидных замен, определяющих формирование устойчивости к фторхинолонам Н Мол. биол. - 2005. - Т. 39, № 6. - С. 923-932.

3. Верещагин В .А., Ильина Е.Н., Малахова М.В., Зубков М.М., Сидоренко С.В., Кубанова А.А., Говорун В.М. Устойчивость к фторхинолонам среди Российских изолятов Neisseria gonorrhoeae II Мол. ген. микробиол. вир. - 2005 — № 1. — С. 23-27.

4. Vereshchagin V.A., Ilina E.N., Malakhova M.V., Zubkov M.M., Sidorenko S.V., Kubanova A.A., Govorun V.M. Fluoroquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates from Russia: molecular mechanisms implicated // J. Antimicrob. Chem. - 2004. -Vol. 53. — P. 653-656.

5. Ильина E.H., Малахова M.B., Верещагин B.A., Говорун В.М., Сергиенко В.И., Зубков М.М., Васильев М.М., Кубанова А.А. Молекулярное типирование штаммов N. gonorrhoeae, распространенных на территории РФ // Бюлл. экспер. биол. мед. -2003. -Т.136, № 8. - С. 205-208.

6. Vereshchagin V., Ilina Е., Al-khafaji N., Priputnevich Т., Kubanova A., Sidorenko S. and Govorun V. Intact-cell MALDI-TOF Mass-spectrometry for Identification and Subtyping of Pathogenic Neisseria. // In 15 th International Pathogenic Neisseria Conference (IPNC 2006 Australia). Program and Abstract Book. - 2006. - P. 77.

7. Ilina E. N., Vereshchagin V. A., Malakhova M. V., Priputnevich Т. V., Al-khafaji N. C., Kubanova A. A., Govorun V. M. Molecular Characterization of Clinical Neisseria Gonorrhoeae (NG) Strains in Russia. Poster # ICAAC06-A-2308-ASM in "46th ICAAC (USA, San Francisco) Abstracts book". - 2006.

8. Верещагин B.A., Ильина E.H., Припутневич T.B., Кострюкова Е.С. Челыше-ва В.В., Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Прямое белковое профилирование для идентификации и типирования бактерий // В Тезисах научных работ IX всероссийского съезда дерматовенерологов. - 2005, Москва. - Т. 2. - С. 40.

9. Ильина Е.Н., Малахова М.В., Верещагин В А., Припутневич Т.В., Говорун В.М. Масс-эррей как инструмент анализа резистентности бактериальной флоры // В Тезисах научных работ IX всероссийского съезда дерматовенерологов. — 2005, Москва. - Т.2 - С.41.

10. Ilina E.N., Malahova M.V., Vereschagin V.A., Kubanova A.A., Zubcov M.M. and V.M. Govorun. Typing N. gonorrhoeae Strains In Russia // GENOMES 2004: International Conference on the Analysis of Microbial and Other Genomes, Abstract Book. — 2004. - P. 50.

11. Sidorenko S.V., Vereschagin V.A., Malahova M.V., Ilina E.N., Govorun V.M., Zubkov M.M., Kubanova A.A. Emergence of Fluoroquinolone Resistance among Neisseria gonorrhoeae in Russia I 142th ICAAC Abstracts book. — 2003, Chicago, Illinois.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АМП - антимикробные препараты.

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

МПК - минимальная подавляющая концентрация

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РФ - Российская Федерация

ФГУ ЦНИКВИ - Федеральное государственное учреждение Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт MALDI-TOF масс-спектрометрия - времяпролётная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией (Matrix-Assisted Laser Desorp-tion/Ionization Time of Flight Mass-Spectrometry)

Принято к исполнению 18/09/2006 Исполнено 18/09/2006

Заказ № 633 Тираж: 70 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56

www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Верещагин, Владимир Александрович

Список используемых сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Общая характеристика Neisseria gonorrhoeae

1.2 Гонококковая инфекция.

1.2.1 Основные факторы патогенности и патогенез гонореи

1.2.2 Эпидемиология

1.2.3 Лечение. Проблема лекарственной устойчивости

1.3 Внутривидовая вариабельность N. gonorrhoeae и гетерогенность популяции

1.3.1 Морфологический полиморфизм гонококков

1.3.2 Физиологическая и серологическая гетерогенность гонококков

1.3.3 Фепотипическая гетерогенность гонококков. Лекарственная устойчивость

1.3.3.1 Формирование устойчивости к различным классам антимикробных препаратов

1.3.3.2 Методы оценки лекарственной устойчивости возбудителя. Анализ генетических маркеров

1.3.4 Современные подходы к оценке гетерогенности популяции N. gonorrhoeae

1.3.4.1 рог-типирование

1.3.4.2 Типирование мультилокусным секвенированием

1.3.4.3 Прямое белковое профилирование с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии

2 Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы

2.2 Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae

2.2.1 Бактериальные клетки

2.2.2 Экстракция белков (грубый лизис бактериальных клеток)

2.2.3 Сокристализация матрицы и аналита

2.2.4 Масс-спектрометрический анализ

2.2.5 Интерпретация масс-спектров

2.3 Генетический анализ штаммов N. gonorrhoeae

2.3.1 Выделение тотальной ДНК N. gonorrhoeae

2.3.2 Амплификация фрагментов генома N. gonorrhoeae

2.3.3 Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа

2.3.4 Минисеквенирование и масс-спектрометрический анализ продуктов реакции

2.3.5 Секвенирование фрагментов генов рог, рагС, «домашнего хозяйства»

2.3.6 Анализ нуклеотидных последовательностей генов рог, рагС, «домашнего хозяйства»

2.4 Математический анализ данных

3 Результаты

3.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов Ж gonorrhoeae

3.2 Прямое белковое профилироваиие штаммов N. gonorrhoeae

3.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae

3.4 Типирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции

3.4.1 /?ог-типирование

3.4.2 Типирование мультилокуспым секвенированием

4 Обсуждение

4.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N.gonorrhoeae

4.2 Прямое белковое профилирование

4.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae

4.4 Типирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae"

Гонорея - одна из наиболее распространенных на сегодняшний день инфекций, передающихся половым путём, остается актуальной проблемой в области практического здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость гонореей в мире составляет около 60 миллионов случаев в год [1]. В России этот показатель также остается на достаточно высоком уровне - около 100 случаев на 100 тысяч населения в год [2, 3]. По этой причине, как в Российской Федерации (РФ), так и во многих странах мира, гонорея включена в список инфекций, подлежащих обязательной статистической регистрации на национальном уровне (наряду с сифилисом, хламидийной инфекцией и др.) [4, 5].

Возбудитель гонореи - грамотрицательный диплококк Neisseria gonorrhoeae, способный колонизировать эпителий уретры, шейки матки, глотки, прямой кишки, конъюнктивы и некоторые другие эпителии с развитием инфекций нижних отделов мочеполового тракта, воспалительных заболеваний органов малого таза, конъюнктивита, проктита, фарингита, диссеминированной гонококковой инфекции. Особенностью современной гонореи является увеличение вялотекущих и асимптомных форм заболевания, хроническое течение, многоочаговость поражения верхнего и нижнего отделов мочеполового тракта. Отмечен высокий уровень постгонорейных осложнений, приводящих к женскому и мужскому бесплодию, случаев генерализации гонококковой инфекции с поражением суставов, клапанов сердца, аорты, кожи [6].

Объяснением указанных свойств гонококковой инфекции, очевидно, служит высокая изменчивость и пластичность возбудителя, способность к быстрому адаптивному изменению фенотипических и генетических характеристик. Так, предпосылки для хронизации и генерализации патологического процесса создает способность гонококка к L-трансформации и внутриклеточной инвазии. Генетические механизмы, способствующие формированию гетерогенности популяции N. gonorrhoeae, включают внутри- и межвидовую ДНК-трансформацию, что примечательно, в любом периоде жизненного цикла, активную передачу информации с помощью плазмид, рекомбинацию. Гонококк характеризует высокое содержание в геноме супермутабельных и мозаичных генов, значительная вариабельность структуры пилей, белков наружной мембраны (Рог, Ора), и как следствие, культуральных и антигенных свойств гонококка (в частности, антигенная мимикрия), его вирулентных и персистентных характеристик. Благодаря высокой пластичности генома, под давлением воздействия антибактериальных средств N. gonorrhoeae реализует практически все известные механизмы лекарственной устойчивости.

Поэтому, с точки зрения современной клинической микробиологии, особенно актуальным становится разработка не только максимально точных, но и быстрых, сравнительно недорогих методик идентификации и характеристики N. gonorrhoeae по основным, клинико-эпидемиологическим параметрам (так называемых, методов «быстрой микробиологии»). Между тем, использование традиционных подходов к диагностике гонококковой инфекции сопряжено на практике с известными трудностями. Гонококки относятся к достаточно прихотливым бактериям, требуют сложных питательных сред для культивирования и высокой квалификации персонала лаборатории. Поэтому процедуры микробиологической идентификации гонококка, включающие высев на питательной среде отделяемого уретры или цервикального канала, выделение чистой культуры гонококка, поддержание жизнеспособности микроба для определения профиля чувствительности к антибиотикам, характеризуются сложностью стандартизации, трудоемкостью и длительностью анализа.

Тогда как современные достижения молекулярной биологии открывают возможности альтернативных подходов к идентификации и характеристике отдельных штаммов N. gonorrhoeae и популяции в целом. Вслед за различными диагностическими тестами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (nucleic acid amplification tests, NAATs), для оценки лекарственной устойчивости возбудителя был предложен новый подход, представляющий собой определение генетических детерминант устойчивости. В его основе лежит амплификация мобильных детерминант устойчивости наравне с амплификацией генов, белковые продукты которых являются мишенями для действия антибиотиков, и определение в структуре детерминант точечных нуклеотидных полиморфизмов, являющихся маркерами формирования устойчивости, с помощью реакции минисеквенирования и анализом продуктов с использованием MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.

Этот же высокоточный и быстрый метод анализа молекулярных масс биополимеров (нуклеиновых кислот, белков, липидов) лежит в основе предложенного недавно подхода, предназначенного для быстрой идентификации и внутривидовой классификации микроорганизмов путём регистрации и сравнительного анализа белковых масс-спектров, специфичных для разных видов. Интересным представляется оценка возможности использования этого подхода для идентификации и, возможно, типирования гонококка, проявляющего, как указывалось выше, высокую пластичность и гетерогенность в популяции.

Действительно, давно описанный морфофизиологический полиморфизм, а затем и генетическая пластичность N. gonorrhoeae, являются центральными проблемами молекулярной эпидемиологии гонококка. Разрабатываются и совершенствуются различные методы штаммовой идентификации и типирования N. gonorrhoeae с целью прояснить некоторые общие аспекты структуры популяции гонококка, а также выявить локальные эпидемиологические особенности возбудителя, определить тенденции в динамике и распространении клинически значимых признаков в популяции.

Одним из перспективных признан подход, заключающийся в определении изменений последовательности рог гена гонококка (рог-типирование). Стоит отметить, что Рог белок, играющий важную роль в процессах адгезии к эпителиоцитам и инвазии внутрь клеток, характеризуется высокой изменчивостью, поэтому отдельные структурные вариации в соответствующих генетических локусах рог гена, могут иметь эволюционные преимущества, из чего следует подверженность их селекции. Эти свойства "объекта" типирования позволяют использовать данный подход для оценки быстрых адаптационных изменений гонококка, краткосрочных эволюционных тенденций развития популяции, а также для оценки её гетерогенности в небольших, относительно замкнутых группах пациентов.

Отличную идеологию содержит в себе, предложенный относительно недавно для типирования популяции N. gonorrhoeae, метод мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST, в основе которого лежит секвенирование строго определенного набора фрагментов «генов домашнего хозяйства», имеющих достаточное число аллельных вариантов, характеризующихся медленным накоплением мутаций и селективно нейтральных. Предполагаемая область его использования - это оценка макроэволюции популяции в целом и тенденций в динамике больших популяций, затрагивающих обширные территории.

Отдельно следует заметить, что в РФ отсутствует какая-либо развитая система типирования N. gonorrhoeae, информация о региональных особенностях лекарственной устойчивости крайне скудна, разрознена и зачастую неактуальна (ретроспективные исследования).

Таким образом, дальнейшая разработка и адаптация методов молекулярного типирования гонококка, а также комплексная характеристика популяции N.gonorrhoeae, распространенной на территории РФ, представляются актуальными задачами, решение которых подразумевает фундаментальные и медицинские аспекты исследования.

Целыо настоящей работы являлалсь разработка и сравнение различных методов молекулярного типирования N. gonorrhoeae и использование их для характеристики популяции возбудителя, распространённой на территории Российской Федерации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Формирование коллекции образцов ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от больных из различных регионов Российской Федерации.

2. Разработка системы комплексной оценки антибиотикоустойчивости N. gonorrhoeae на основе знаний о генетических механизмах формирования устойчивости возбудителя, включающей определение известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.

4. Реализация схемы рог-типирования для характеристика коллекции российских клинических штаммов N.gonorrhoeae.

5. Анализ гетерогенности «генов домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae и разработка схемы типирования мультилокусным секвенированием клинических штаммов гонококка.

6. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика группы клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных на территории РФ, включающая 1) анализ распространенности и вклада различных механизмов в формирование лекарственной устойчивости N.gonorrhoea, 2) анализ структуры и оценка гетерогенности исследуемой популяции N.gonorrhoea.

1 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Верещагин, Владимир Александрович

6 Выводы

2. Разработан и реализован подход к оценке антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae, основанный на одновременном анализе 15 генетических локусов, позволивший выделить маркеры (и их сочетания), обнаружение которых с точностью более 81 % прогнозирует фенотипическую устойчивость гонококка к пенициллинам, тетрациклину, фторхинолонам.

3. Предложена методика прямого белкового профилирования с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии. Показана низкая дискриминирующая способность этого подхода (D = 0,27), что не позволяет использовать его для типирования N. gonorrhoeae, но указывает на возможность видовой идентификации.

4. Показана высокая дискриминирующая способность рог-типирования (D = 0,97) и возможность анализа получаемых данных в рамках системы серотипирования (D = 0,78). Установлен вклад мутаций репВ локуса рог гена в формирование мультирезистентности.

5. Анализ нуклеотидных вариаций 13 генов «домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae позволил установить 7 наиболее информативных локусов: fumC, gdh, glnA, gnd, pilA, pyrD, serC, позволяющих осуществлять молекулярного типирования с высокой степенью дискриминации (D = 0,98).

6. Впервые на основании молекулярно-эпидемиологической характеристики географически неоднородной группы штаммов N. gonorrhoeae, выделенных на территории РФ, а) показан преимущественно хромосомный механизм формирования лекарственной устойчивости к пенициллину и тетрациклину; б) определены частоты встречаемости различных серотипов с преобладание PIB серовара (88,6 %); в) выявлено значительное генетическое разнообразие циркулирующих в популяции штаммов.

5 Заключение

Высокий уровень изменчивости N. gonorrhoeae обуславливает продолжающийся рост лекарственной устойчивости возбудителя и увеличение числа бессимптомных, хронических и диссеминированных форм инфекции. В РФ отсутствует какая-либо система эпидемиологического мониторинга популяции N. gonorrhoeae. Разработка методов молекулярного типирования штаммов N. gonorrhoeae для российской популяции возбудителя актуальна и имеет важное практическое и эпидемиологическое значение.

В настоящей работе предложен комплексный подход оценки клинически и эпидемиологически значимых свойств возбудителя, апробированный на географически неоднородной группе российских штаммов N. gonorrhoeae. Для всех исследованных регионов подтверждена высокая распространенность резистентных и мультирезистентных штаммов, охарактеризованных с позиций известных генетических механизмов формирования лекарственной устойчивости. Впервые исследованы возможности прямого белкового профилирования для характеристики штаммов гонококка. Полученные результаты указывают на возможность использования этого подхода для видовой идентификации возбудителя. Данные о гетерогенности исследованной выборки штаммов получены с использованием двух подходов (рог-типирование, мультилокусное секвенирование), основанных на прямом анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов генома, отличающихся по уровню изменчивости и подверженности селекции в эволюционном процессе. Описана дискриминирующая способность и специфика молекулярно-эпидемиологической информации, получаемой каждым из методов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Верещагин, Владимир Александрович, Москва

1. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections. Overview and estimates. WHO, 2001. - P.43.

2. CDC. Case Definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. // MMWR. 1997. - Vol. 46 (RR10). - P. 1-55.

3. European STD Guidelines. // Inter. J. of STD & AIDS. 2001. - Vol. 12, № 10,supp.3.

4. Бухарин O.B., Усвяцов Б.Я., Карташова O.JI. Биология патогенных кокков. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 2002. - 282 с.

5. Медицинская микробиология / Гл. ред. В.И.Покровский, О.К.Поздеев. -М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. 1200 с.

6. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова O.JI. Биология патогенных кокков. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 2002. - 282 с.

7. Murray P. R. Medical Microbiology, 3rd ed. / P. R. Murray. Mosby, 1998.-464 p.

8. Cannon J.G., Sparling P.F. The genetics of the gonococcus // Annu. Rev. , Microbiol. 1984. - Vol. 38. - P. 111-133.

9. Tinsley C. R., Nassif X. Analysis of the genetic differences between Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae: Two closely related bacteria expressing two different pathogenicities // Microbiology. 1996. - Vol. 93, № 20.- P. 11109-11114.

10. Sox Т. E., Mohammed W., Blackman E., Biswas G., Sparling P.F. Conjugative plasmids in Neisseria gonorrhoeae // J. Bacteriol. 1978. - Vol. 1346№1. -P. 278-286.

11. Palmer H.M., Leeming J.P., Turner A. A multiplex polymerase chain reaction to differentiate P-lactamase plasmids of Neisseria gonorrhoeae И J. Antimicrob. Chemoter. 2000. - Vol. 45. - P. 777-782.

12. Dillon J.R., Li H., Yeung K.H., Aman T.A. A PCR assay for discriminating Neisseria gonorrhoeae P-lactamase-producing plasmids // Mol. Cell Probes. 1999.-Vol. 13.-P. 89-92.

13. Morse S.A., Johnson S.R., Biddle J.W., Roberts M.C. High-level tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeae is result of acquisition of streptococcal tetM determinant // Antimicrob. Agents Chemother. 1986. - Vol. 30,№5.-P. 664-670.

14. Fussenger M., Rudel Т., Barten R. et al. Transformation competence and typ-4 pilus biogenesis in Neisseria gonorrhoeae a review // Gene. - 1997. -Vol. 192,№ l.-P. 125-134.

15. Saunders N., Hood D., Moxon E. Bacterial evolution: bacteria play pass the gene//Curr. Biol. 1999. - Vol. 9, № 5. - P. 180-183.

16. Kellogg D. S., Peacock W. L., Deacon W. E., Brown L., and Pirkle C. L. Neisseria gonorrhoeae I. Virulence genetically linked to clonal variation. // J. Bacteriol. 1963.-Vol. 85.-P. 1274.

17. Kellogg D., Cohen O., Norins L., et al. Neisseria gonorrhoeae II. Colonial variation and pathogenity during 35 months in vitro // J.Bacteriol. -1968. Vol. 96. - P. 596 - 605.

18. Seifert H. Questions about gonococcal pilus phase- and antigenic variation // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 21, №3. - P. 433 - 440.

19. Gregg C.R., Johnson A.P., Taylor-Robinson D., Melly M.A., McGee Z.A. Host species-specific damage to oviduct mucosa by Neisseria gonorrhoeae lipopolysaccharide // Infect Immun. 1981. -Vol. 34. - P. 1056 - 1058.

20. Apicella M.A., Westerink M.A.J., Morse S.A., Schneider H., Rise P.A., Griffiss J.M. Bactericidal antibody response of normal human serum to the lipooligosaccharide of Neisseria gonorrhoeae I I J. Infect. Dis. 1986. - Vol. 153.-P. 520-526.

21. Blake M.S. Functions of the outer membrane proteins of Neisseria gonorrhoeae, P.51-66. In G.G.Jackson and H.Thomas (ed.), The pathogenesis of bacterial infections. Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. 1985.

22. Gorby G., Simon D., and Rest R. F. Escherichia coli that express Neisseria gonorrhoeae opacity-associated proteins attach to and invade human fallopian tube epithelium. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 730. - P. 286289.

23. Rest R. F., Liu J., Talukdar R., Frangipane J. V., and Simon D. Interaction of pathogenic Neisseria with host defenses. What happens in vivo? // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 730. - P. 182 -196.

24. Morse S.A. The biology of the gonococcus // CRC Crit. Rev. Microbiol. 1978.-Vol. 7,№2.-P. 93-189.

25. Morse S.A. Neisseria gonorrhoeae: physiology and metabolism // Sex. Transm. Dis. 1979. - Vol. 6, № 1. - P. 28-37.

26. Morse S.A., Cacciapuoti A.F., Lysko P.G. Physiology of Neisseria gonorrhoeae. Adv. Microb. Physiol. 1979. - Vol. 20. - P. 251-320.

27. Guidelines for the management of sexually transmitted infections. -WHO, 2003. P. 33-34.

28. CDC. Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines, 2002 // MMWR. 2002. - Vol. 51, (RR-6). - P.37-38.

29. CDC. Increases in Fluoroquinolone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Among Men Who Have Sex with Men United States, 2003, and Revised RecoMMendations for Gonorrhea Treatment, 2004. // MMWR. - 2004. - Vol. 53. -P. 335-338.

30. Лечение и профилактика гонореи. Методические рекомендации. Минздрав РФ.- М., 1993.

31. Васильев М.М. Диагностика, клиника и терапия гонорейной инфекции // Рус. мед. жур. 1998. - Т.6, № 15.

32. Кисина В.И., Колиева Г.Л. Клинико-микробиологическое и фармакоэкономическое обоснование выбора фторхинолонов для лечения гонорейной и хламидийной инфекций // Пробл. стандар. здравоохр. 2001.- № 4. С. 120-121.

33. Кубанова А.А., Кисина В.И., Васильев М.М. Результаты изучения эффективности и переносимости цефтриаксона (роцефина) и спектиномицина (тробицина) при лечении неосложненной гонореи // Кремл. мед. клин. вест. 2001. - № 1. - С. 59 - 62.

34. Методические материалы по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций передаваемых половым путем (ИППП), и заболеваний кожи. Протоколы ведения бодьных, лекарственные средства / под ред. А.А. Кубановой. -М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2003. С. 53-56.

35. Кунцевич Л.Д., Никулин Н.К., Жукова Г.И., Борщевская Р.П., Мишанов В.Р., Воронова Н.Ю. Динамика чувствительности к пенициллину и b-актамазопродуцирующая способность гонококков // Вест. дерм, венер.- 1999. N 1. - С. 35 - 37.

36. Протокол ведения больных «Гонококковая инфекция». Утвержден приказом Минздрава России от 20.08.2003 г. N 415. М.- 2003.

37. Jephcott А. Е., Reyn A., Birch-Andersen A. Brief report: Neisseria gonorrhoeae. III. Demonstration of presumed appendages to cells from different colony type // Acta Pathol. Microbiol. Scan B.: Microbiol. Immunol. 1971. -Vol. 79, №3.-P. 437-439.

38. Swanson J, Kraus SJ, and Gotschlich EC. Studies on gonococcus infection. I. Pill and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns// J. Exp. Med. 1971.-Vol. 134.-P. 886.

39. Sandstrom, E., and D. Danielsson. 1980. Serology of Neisseria gonorrhoeae. Classification by co-agglutination // Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B. 1980. - Vol. 88. - P. 27-38.

40. Tam M.R., Buchanan T.M., Sandstrom E.G., Holmes K.K., Knapp J.S., Siadak A.W., Nowinski R.C. Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with monoclonal antibodies // Infect. Immun. 1982. Vol. 36. - P. 1042- 1053.

41. Knapp J.S., Tam M.R., Nowinski R.C., Holmes K.K., Sandstrom E.G. Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with use of monoclonal antibodies to gonococcal outer membrane protein I // J. Infect. Dis. 1984. -Vol. 150.-P. 44-48.

42. Cannon J. G., Buchanan Т. M., Sparling P. F. Confirmation of association of protein I serotype of Neisseria gonorrhoeae with ability to cause disseminated infection // Infect. Immun. 1983. - Vol. 40. - P. 816 - 819.

43. Sandstrom E. G., Knapp J. S., Reller L. В., Thompson S. E., Hook E. W., Holmes К. K. Serogrouping of Neisseria gonorrhoeae: correlation of serogroup with disseminated gonococcal infection // Sex. Transm. Dis. 1984. - Vol. 11.-P. 77 - 80.

44. Brunham R. C., Plummer F., Slaney L., Rand F., DeWitt W. Correlation of auxotype and protein I type with expression of disease due to Neisseria gonorrhoeae. J. Infect. Dis. 1985. - Vol. 152. - P. 339 - 343.

45. Van Putten J.P.M., Duensing T.D., Carlson J. Gonococcal invasion of epithelial cells driven by the P.IA porin // Abstr. 11 Inter, pathogenic Neisseria conference / Edited by X.Nassif, M.J. Quentin-Millet, M.K.Taha. Paris, 1998. -P. 35 35.

46. Bygdeman S. M., Mardh P. A., Sandstrom E. G. Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae to rifampicin and thiamphenicol: correlation with protein I antigenic determinants // Sex, Transm. Dis. 1984. - Vol. 11. - P. 366 - 370.

47. Abeck D., Johnson A.P., Grimm W., Zaba R., Korting H.C. Plasmid content, serotypes, and antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeaestrains isolated in Munich in 1987-1988 // Eur. J. Epidemiol. 1989 Vol. 5. - P. 170-172.

48. Gill M.J. Serotyping Neisseria gonorrhoeae: a report of the Fourth International Workshop // Genitourin. Med. -1991. Vol. 67. - P. 53-57.

49. NCCLS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. 1993. Approved standard M7-A3. NCCLS, Villanova, Pa.

50. Surveillance of antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae in the World Health Organization Western Pacific Region, 2003 // Commun. Dis. Itell. -2005.-Vol. 29.-P. 62-64.

51. CDC. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2003 Supplement: Gonococcal Isolate Surveillance Project (GISP) Annual Report 2003. Atlanta, Georgia: U.S. Department of Health and Human Services, November 2004.

52. Berron S., Vazquez J.A., Gimenez M.J., Fuente L., Aguilar L. In vitro susceptibilities of 400 Spanish isolates of Neisseria gonorrhoeae to gemifloxacin and 11 other atimicrobial agents // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 2543-2544.

53. Zarantonelli L., Borthagaray G., Lee E-H, Shafer W.M. Decreased Azithromycin Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Due to mtrR Mutations // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43, № 10. - P. 2468-2472.

54. Zarantonelli L., Borthagaray G., Lee E-H, Veal W., Shafer W.M. Decreased Susceptibility to Azithromycin and Erythromycine mediated by a novel mtr(R) promoter mutation in Neisseria gonorrhoeae II J. Antimicrob. Chemother. 2001. - Vol. 47. - P. 651 -654.

55. Cousin S.L.J., Whittington W.L., Roberts M.C. Acquired macrolide resistance genes and the 1 bp deletion in the mtrR promoter in Neisseria gonorrhoeae //J. Antimicrob. Chemother.-2003. Vol. 51,№ l.-P. 131-133.

56. Veal W.L., Nicholas R.A., Shafer W.M. Overexpression of the MtrC-MtrD-MtrE Efflux Pump Due to an mtrR Mutation Is Required for Chromosomally Mediated Penicillin Resistance in Neisseria gonorrhoeae // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 5619-5624.

57. Ropp P.A., Ни M., Olesky M., Nicholas R.A. Mutations in ponA, the Gene Encoding Penicillin-binding Protein 1, and a novel Locus, penC, are required for high-level Chromosomally mediated penicillin resistance in

58. N.gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46, № 3. - P. 769-777.

59. Neeling A.J., Santen-Verheuvel M., Spaargaren J., Willems R.J.L. Antimicrobial Resistance of Neisseria gonorrhoeae and emerging ciprofloxacin resistance in the Netherlands, 1991 to 1998 // Antimicrob. Agents Chemother. -2000.-Vol. 44.-P. 3184-3185.

60. Nikaido H. Multiple antibiotic resistanse and efflux // Curr. Opin. Microbial. 1998.-Vol. 1. P. 516-523.

61. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Control and Prevention Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR Morb Mortal WklyRep 1989; 38:S8.

62. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1993; 42 (RR-14):4-5.

63. Верещагин B.A., Ильина E.H., Малахова M.B., Зубков М.М., Сидоренко С.В., Кубанова А.А., Говорун В.М. Устойчивость к фторхинолонам среди Российских изолятов Neisseria gonorrhoeae // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2005. - Т.1. - С. 23-27.

64. Belland R.J., Morrison S.G., Ison С., Huang W.M. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in ana-logous regions of gyrA and parC in fluoroquinolone-resistant isolates 11 Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 14. - P. 371380.

65. Deguchi Т., Yasuda M., Asano M., Tada К., Iwata H., Komeda H., et al. DNA gyrase mutations in fluoro-quinolone-resistant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 1995. Vol. 39. - P. 561-563.

66. Trees D.L., Sandul A.L., Whittington W.L., Knapp J.S. Identification of novel mutation patterns in the parC gene of ciprofloxacin-resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - Vol. 42. P. 2103-2105.

67. Corkill J.E., Percival A., Lind M. Reduced uptake of ciprofloxacin in a resistant strain of Neisseria gonorrhoeae and transformation of resistance to other strains // J. Antimicrob. Chemother. 1991. - Vol. 28. - P. 601-604.

68. Tanaka M., Fukuda H., Hirai K., Hosaka M., Matsumoto Т., Kumazawa J. Reduced uptake and accumulation of norfloxacin in resistant strains of Neisseria gonorrhoeae isolated in Japan. // Genitourin. Med. 1994. - Vol. 70. P. 253-255.

69. Poole K. Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-negative bacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 2233-2241.

70. Rouquette-Loughlin C, Dunham SA, Kuhn M, Balthazar JT, Shafer WM. The NorM Efflux Pump of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis Recognizes Antimicrobial Cationic Compounds // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185, №3.- 1101-1106.

71. Luna V.A., Cousin S. Jr, Whittington W. L., and Roberts M. C. Identification of the conjugative mef gene in clinical Acinetobacter junii and Neisseria gonorrhoeae isolates // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, №9. -P. 2503-2506.

72. Ng L-K, Martin I., Liu G., Bryden L. Mutation in 23S rRNA Associated with Macrolide Resistance in Neisseria gonorrhoeae II Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46, № 9. - P. 3020-3025.

73. Сидоренко С.В. Бета-лактамазы расширенного спектра действия: клиническое значение и методы детекции // Инфек. антимикроб, терап.2002. Т.4 - №6. - С. 23-29

74. Wang S.A., Lee M.V., O'Connor N., et al. Multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae with decreased susceptibility to cefixime Hawaii, 2001 // Clin. Infect. Dis. - 2003. Vol. - 37. P. 849-852.

75. Australian Gonococcal Surveillance Programme. Annual report of the Australian Gonococcal Surveillance Programme, 2002 // Commun. Dis. Intell.2003.-Vol. 27.-P.l 89-95.

76. Tanaka M., Nakayama H., Notomi Т., et al. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae in Japan, 1993 to 2002: continuous increasing of ciprofloxacin-resistant isolates // Int. J. Antimicrob. Agents 2004. - 24S:S15-22.

77. Ray K., Bala M., Kumari S., Narain J.P. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae in selected World Health Organization Southeast Asia Region countries: an overview // Sex. Transm. Dis. 2005. - Vol. 32. - P. 17884.

78. Ito M., Deguchi Т., Mizutani K.S., et al. Emergence and spread of Neisseria gonorrhoeae clinical isolates harboring mosaic-like structure of penicillin-binding protein 2 in central Japan I I Antimicrob. Agents Chemother. -2005.-Vol. 49.-P. 137-143.

79. Galimand M., Gerbaund G., Courvalin P. Spectinomycin Resistance in Neisseria spp. Due to Mutations in 16S rRNA // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, № 5. - P. 1365-1366.

80. Marta C.C., Olga A.S., Olga M.N., Aida P.R.H. In vitro Comparison of Disk Diffusion and Agar Dilution Antibiotic Susceptibility Test Methods for Neisseria gonorrhoeae II Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 1998. - Vol. 93, № 4. - P. 517-522.

81. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9. 1999. - V.19. - N.l.

82. Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. EUCAST Definitive document // Clin. Microbiol. Infect. -1998. Vol. 4.-P. 291-296.

83. Courvalin P. Genotypic approach to the study of bacterial resistance to antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. 1991. - Vol. 35, № 6. - P. 10191023.

84. Tenover B. F. C., Kirby W. and Crick. Antimicrobial susceptibility testing in the molecular era // ASM News. 1992. - Vol. 58. - P. 669-672.

85. Lapierre P, Huletsky A, Fortin V, Picard FJ, Roy PH, Ouellette M, Bergeron MG. Real-Time PCR Assay for Detection of Fluoroquinolone Resistance Associated with grlA Mutations in Staphylococcus aureus II J. Clin. Microbiol. 2003.-Vol.41. - P. 3246-3251.

86. Bergeron M.G., Ouellette M. Preventing Antibiotic Resistance through Rapid Genotypic Identification of Bacteria and of Their Antibiotic Resistance Genes in the Clinical Microbiology Laboratory // J. Clin. Microbiol. 1998. - P. 2169-2172.

87. Pitt T.L., Saunders N.A. Molecular bacteriology: a diagnostic tool for the millennium. 2000. - J. Clinical. Pathol. - Vol. 53. - P. 71-75.

88. Fluit C., Visser M.R., and Schmitz F.-J. Molecular detection of antimicrobial resistance // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol.14. - P. 836-871.

89. Woodford N., Sundsfjord A. Molecular detection of antibiotic resistance: when and where? // J. Antimicrob. Chemother. 2005. - Vol. 56. - P. 259-261.

90. Persing DH, Relman DA, Tenover FC. Genotypic detection of antimicrobial resistance, p. 33-57. In D. H. Persing (ed.), PCR protocols for emerging infectious diseases. ASM Press, Washington, D.C., 1996.

91. Иванов И., Ершов Г., Барский В., Бельговский А., Кириллов Е., Крейндлин Э., Паринов С., Мологина Н., и Мирзабеков А. Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах // Мол. Биол. -1997.-Т.31.-С. 159-167.

92. Storm N., Darnhofer-Demar В., van den Boom D., Rodi C.P. 2002. MALDI-TOF Mass Spectrometry-Based SNP Genotyping // Meth. Mol. Biol. -Vol. 212.-P. 241-262.

93. Nordhoff E., Luebbert C., Thiele G., Heiser V. and Lehrach H. Rapid determination of short DNA sequences by the use of MALDI-MS // Nucl. Acids Res. 2000. - Vol. 28. - P. 86-92.

94. Camarena J.J., Nogueira J. M., Dasi M. A., Moreno F., Garcia R., Ledesma E., Llorca J., Hernandez J. DNA amplification fingerprinting for subtyping Neisseria gonorrhoeae strains I I Sex. Transm. Dis. 1995. - Vol. 22. -P. 128 - 136.

95. Poh С. L., Ramachandran V., Tapsall J. W. Genetic diversity of Neisseria gonorrhoeae IB-2 and IB-6 isolates revealed by whole-cell repetitive element sequence-based PCR // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 292 -295.

96. Palmer H.M., Arnold C. Genotyping Neisseria gonorrhoeae Using Fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39, № 6. - P. 2325 - 2329.

97. Poh CL, Lau QC. Subtyping of Neisseria gonorrhoeae auxotype-serovar groups by pulsed-field gel-electrophoresis // J. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 38.-P. 366 - 370.

98. Xia M., Whittington W.L., Holmes K.K., PIuMmer F.A., Roberts M.C. Pulsed-field gel electrophoresis for genomic analysis of Neisseria gonorrhoeae //J. Infect. Dis. 1995. - Vol.171. - P. 455-458.

99. Ng L., Carballo M., Dillon J.R. Differentiation of Neisseria gonorrhoeae isolates requiring proline, citrulline, and uracil by plasmid content, serotyping, and pulsed-field gel electrophoresis // J. Clin. Microbiol. 1995. - P. 1039 -1041.

100. Cooke SJ, de la Paz H, La Poh C, Ison CA, Heckels JE. Variation within serovars of Neisseria gonorrhoeae detected by structural analysis of outer-membrane protein PIB and by pulsed-field gel electrophoresis // Microbiol. 1997.-Vol. 143.-P. 1415 1422.

101. Gurtler V, Stanisich VA. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S- 23S rDNA spacer region //Microbiol. 1996. - Vol. 142. -P. 3-16.

102. Heyndrickx M, Vauterin K, Vandamme P, Kerstens K, De Vos P. Applicability of combihed amplified ribosomal DNA // 1996;

103. O Rourke M., Ison CA, Renton AM, Spratt BG. Opa-typing: a high-resolution tool for studying the epidemiology of gonorrhoea // Mol. Microbiol. -1995.-Vol. 8.-P. 151-156.

104. Van Looveren M, Ison CA, Ieven M, Vandamme P, Martin IM, Vermeulen K, Renton A, Goossens H. Evaluation of the Discriminatory Power of Typing Methods for Neisseria gonorrhoeae. // J. Clin. Microbiol. 1999. -Vol.37. P.2183-2188.

105. Lau QC, Chow VT, Poh CL. Differentiation of Neisseria gonorrhoeae strains by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of outer membrane protein IB genes // Genitourin. Med. 1995. -Vol.71, No. 6.-P.363-366.

106. Gotschlich EC, Seiff ME, MS Blake, Koomey M. Porin protein of Neisseria gonorrhoeae: cloning and gene structure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987.-Vol. 84. -P. 8135-8139.

107. Butt NJ, Lambden PR, Heckels JE. The nucleotide sequence of the por gene from Neisseria gonorrhoeae strain P9 encoding outer membrane protein PIB // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18, No. 14. - P. 4258.

108. Poh CL, Lau QC, Chow VT. Differentiation of Neisseria gonorrhoeae IB-3 and IB-7 serovars by direct sequencing of protein IB gene and pulsed-field gel electrophoresis // J. Med. Microbiol. - 1995. - Vol 43. - P. 201-207.

109. Fudyk TC, Maclean IW, Simonsen JN, Njagi EN, Kimani J, Brunham RC, Plummer FA. Genetic Diversity and Mosaicism at the por Locus of Neisseria gonorrhoeae //J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, No. 18. - P.5591-5599.

110. Viscidi RP, Demma JC, Gu J, Zenilman J. Comparison of Sequencing of the por Gene and Typing of the opa Gene for Discrimination of Neisseria gonorrhoeae Strains from Sexual Contacts // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 4430-4438.

111. Thompson DK, Deal CD, Ison CA, Zenilman JM, Bash MC. Typing System for Neisseria gonorrhoeae Based on Biotinylated Oligonucleotide Probes to PIB Gene Variable Regions // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 1652-1660.

112. De la Fuente L, Vazquez JA. Multilocus enzyme analysis of African type penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae (PPNG) strains isolated in Spain. // Sex. Transm. Dis. 1991. - Vol.18. -P.l50-152.

113. Poh CL, Ocampo JC, Loh GK. Genetic relationships among Neisseria gonorrhoeae serovars analysed by multilocus enzyme electrophoresis // Epidemiol. Infect. 1992. - Vol. 108. - P. 31-38.

114. O'Rourke M, Stevens E. Genetic structure of Neisseria gonorrhoeae populations: a non-clonal pathogen // J. Gen. Microbiol. 1993. - Vol. 139. - P. 2603-2611.

115. Gutjahr TS, O'Rourke M, Ison CA, Spratt BG. Arginine-, hypoxanthine-, uracil-requiring isolates of Neisseria gonorrhoeae are a clonal lineage within a non-clonal population // Microbiol. 1997. - Vol. 143. - P. 633-640.

116. Viscidi RP, Demma JC. Genetic Diversity of Neisseria gonorrhoeae Housekeeping Genes // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41 - P. 197-204.

117. Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria using mass spectrometry // Anal. Chem. 1975. - Vol.47. - P. 219-225.

118. Despeyroux D, Phillpotts R, Watts P. Electrospray mass spectrometry for detection and characterization of purified cricket paralysis virus (CrPV) // Rapid. Commun. Mass Spectrom. 1996 . - Vol. 10. - P.937-941.

119. Krishnamurthy T, Ross PL, Rajamani U. Detection of pathogenic and non-pathogenic bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 1996. - Vol. 10. -P. 883-888.

120. Fenselau C, Demirev PA. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectr. Rev. 2001. - Vol. 20. - P. 157-171.

121. Lynn EC, Chung MC, Tsai WC, Han С С. Identification of Enterobacteriaceae Bacteria by Direct Matrix-assisted Laser Desorption/ionization Mass Spectrometric Analysis of Whole Cells // Rapid Comm. Mass Spectrom. 1999. - Vol.13. - P. 2022-2027.

122. Edwards-Jones V, Claydon MA, Evason DJ, Walker J, Fox AJ, Gordon DB. Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant

123. Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry // J. Med. Microbiol. -2000.-Vol. 49.-P. 295-300.

124. Hettick JM, Kashon ML, Simpson JP, Siegel PD, Mazurek GH, Weissman DN. Proteomic Profiling of Intact Mycobacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry // Anal. Chem. -2004.-Vol. 76.-P. 5769-5776.

125. Kumar MP, Vairamani M, Raju RP, Lobo C, Anbumani N, Kumar CP, Menon T, Shanmugasundaram S. Rapid discrimination between strains of beta haemolytic streptococci by intact cell mass spectrometry // Indian J. Med. Res. -2004.-Vol. 119.-P. 283-288.

126. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9. 1999. - Vol. 19. - N.l.

127. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.H., Wertheim van Dillen P.M.E., Van der Noordaa J. Rapid and Simple method for purification of nucleic acids // J. Clinical. Microb. 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495-503.

128. Turner A., Gough K.R., Leeming J.P. Molecular epidemiology of tetM genes in Neisseria gonorrhoeae II Sex. Transm. Inf. 1999. - Vol. 75. - P. 6066.

129. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Academ. Sci. USA. 1977. - Vol.74. - P. 5463-5467.

130. Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief. Bioinform. -2004.-Vol. 5.-P.l50-163.

131. Jolley KA, Feil EJ, Chan MS, Maiden MC. Sequence type analysis and recombinational tests (START) // Bioinform. 2001. - Vol.17. - P.1230-1231.

132. Simpson E. H. Measurement of diversity // Nature (London). 1949. -Vol. 163.-P. 688.

133. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol.26, №11.- P. 2465-2466.

134. Meetani MA, Voorhees KJ. MALDI Mass Spectrometry Analysis of High Molecular Weight Proteins from Whole Bacterial Cells: Pretreatment of Samples with Surfactants // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2005. - Vol.16. - P. 1422-1426.

135. Ryzhov V, Fenselau C. Characterization of the Protein Subset Desorbed by MALDI from Whole Bacterial Cells // Anal. Chem. 2001. - Vol.73. -P.746-750.

136. Arnold RJ, Reilly JP. Observation of Escherichia coli Ribosomal Proteins and Their Posttranslational Modifications by Mass Spectrometry // Anal. Biochem. 1999. - Vol. 269. - P.105-112.

137. Tapsall J. Current concepts in the managment of gonorrhoeae. Expert Opin Pharmacother. 2002. - Vol. 3. - P. 147-157.

138. Lay JO Jr. MALDI-TOF Mass Spectrometry of Bacteria // Mass Spectr. Rev.-2001.-Vol. 20. P. 172-194.

139. Olesky M, Zhao S, Rosenberg RL, Nicholas RA. Porin-Mediated Antibiotic Resistance in Neisseria gonorrhoeae: Ion, Solute, and Antibiotic Permeation through PIB Proteins with penB Mutations. J. Bacteriol. - 2006. -Vol. 188,No. 7.-P. 2300-2308.

140. Shafer WM, Folster JP. Towards an Understanding of Chromosomally Mediated Penicillin Resistance in Neisseria gonorrhoeae: Evidence for a Porin-Efflux Pump Collaboration // J. Bacteriology. 2006. - Vol. 188, No. 7. - P. 2297-2299.

141. Jacoby GA, Walsh KE, Mills DM, Walker VJ, Oh P, Robicsek A, Hooper DC. qnrB, Another Plasmid-Mediated Gene for Quinolone Resistance // Antimicrob. Agents Chemoth. - 2006. - Vol. 50, No. 4. - P. 1178-1182.

142. Posada GD, Crandall KA, Nguyen M, Demma JC, Viscidi RP Population Genetics of the porB Gene of Neisseria gonorrhoeae: Different Dynamics in Different Homology // Mol. Biol. Evol. 2000. - Vol. 17, № 3. - P. 423 - 436.

Информация о работе

Верещагин, Владимир Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы