Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы

Ильина, Елена Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы"

На правах рукописи

Ильина Елена Николаевна

«Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы»

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

□и347Б72В

Москва 2009

003476728

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Говорун Вадим Маркович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук,

профессор Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук,

профессор Северинов Константин Викторович

доктор биологических наук,

профессор Колесанова Екатерина Федоровна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится « 22 » октября 2009 года в часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН. Автореферат разослан « 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук > Карпова Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Болезни бактериальной и вирусной природы занимают лидирующие позиции в структуре заболеваемости в России [Гос. доклад Роспотребнадзора, 2008], а инфекционные осложнения у пациентов хирургических и терапевтических стационаров представляют угрозу жизни и являются реальной причиной длительной потери трудоспособности. Серьезную проблему, обусловленную увеличением интенсивности курсов химиотерапии, представляет замещение дикой популяции возбудителей штаммами с множественной лекарственной устойчивостью, обладающими большей вирулентностью и патогенностью. На этом фоне задачи, связанные с созданием и реализацией новых эффективных средств идентификации, характеристики и типирования клинически-значимых патогенов, выглядят актуальными и своевременными.

Развитие методов обнаружения, описания структуры и функции природных биополимеров, к числу которых принадлежат молекулы нуклеиновых кислот и белков, во многом изменило наши представления о скорости мутационных процессов, предопределяющих природную вариабельность бактерий и вирусов и способствующих формированию устойчивости к используемым химиотерапевтическим средствам.

В этой связи возникла насущная необходимость модернизации применяемых в клинической микробиологии диагностических и исследовательских средств. Актуальным стало создание и внедрение интегральных высокопроизводительных измерительных систем, способных давать исчерпывающее представление о микробном сообществе в испытуемой пробе и определять клинически значимые свойства микроорганизмов в максимально сжатые сроки на основании молекулярного анализа.

Традиционные методы идентификации и характеристики возбудителя, основанные на бактериологическом посеве, имеют ряд недостатков, к числу которых относятся длительность исследования, лимитированная скоростью деления микробной клетки, относительная дороговизна метода, необходимость привлечения большого числа квалифицированных специалистов в силу сложности автоматизации аналитических процедур. Кроме того, значительная часть патогенных микроорганизмов, в частности представители анаэробной бактериальной флоры, фактически не анализируется в большинстве клинических лабораторий из-за трудности культивирования.

Изобретение и внедрение в медицинскую практику методов ПЦР-диагностики позволило сократить сроки анализа клинического образца для идентификации труд-нокультивируемой бактериальной флоры и вирусов [Глик, 2002]. Однако, этот подход оказался недостаточным для установления профиля чувствительности и штаммового типирования микроорганизмов, необходимых для выбора рациональной фармакотерапии и осуществления эпидемиологического надзора.

Приоритетность данного исследования состоит в создании уникальной геном- ,

но-протеомной измерительной системы, позволяющей выявлять механизмы рования лекарственной устойчивости микроорганизмов на молекулярном уровне, р

также прогнозировать микроэволюционные события, изучая мутационные процессы в бактериальных и вирусных популяциях. Компоненты такой системы могут быть использованы в мониторинге клинически-значимых микроорганизмов, а также применены в решении фундаментальных вопросов функционирования бактериальной клетки.

Комбинация технологий генетического и протеомного типирования с использованием матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (МАЛДИ ВМС), как универсального анализатора, обеспечивает быструю идентификацию микрофлоры, позволяет осуществить молекулярное типи-рование штаммов, провести оценку лекарственной устойчивости.

Созданные системы предназначены для одновременного исследования геномных локусов, задействованных в формировании устойчивости бактерий к разным классам антимикробных препаратов (АМП), по одной универсальной технологии. Кроме того, объединение технологии анализа на ДНК-чипе и созданных на основе МАЛДИ ВМС систем регистрации генетических детерминант устойчивости открывает перспективы установления профиля чувствительности патогена непосредственно в клиническом материале от пациента, минуя стадию культивирования in vitro.

Для иллюстрации возможностей созданной измерительной платформы объектами исследования были выбраны клинически значимые микроорганизмы -Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, вирусы гепатита В и С, изучение которых безусловно актуально для практического здравоохранении России. Так, в 2007 году в России уровень заболеваемости на 100 тыс. населения составил 82,9 для туберкулеза; 60,34 для гонореи; 5,8 и 3,58 для вирусных гепатитов В и С, соответственно [Гос. доклад Роспотребнадзора, 2008], что на порядок превышает аналогичные показатели для стран Евросоюза и США [ВОЗ, 2008].

В ряде стран изменчивость возбудителей этих заболеваний и их распространение контролируются в рамках международных и национальных программ, например International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD) (www.iuatld.org) или National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention (NCHHSTP) США (www.cdc.gov/nchhstp). В России соответствующие национальные программы находятся в стадии формирования и нуждаются в разработке и внедрении средств эффективного молекулярного мониторинга возбудителей бактериальных и вирусных инфекций.

Цель работы: создание и реализация вертикально интегрированной платформы геномно-протеомного типирования патогенов бактериальной (гонококк, пневмококк, микобактерии туберкулеза) и вирусной (вирусы гепатита В и С) природы для обеспечения широкомасштабного эпидемиологического мониторинга, определения факторов вирулентности и патогенности и изучения новых молекулярных механизмов формирования лекарственной устойчивости.

Задачи исследования были:

1. Разработка и внедрение в практику комплексной технологии на основе времяпро-летной МАЛДИ масс-спектрометрии для высокопроизводительного выявления нуклеотидных полиморфизмов в геномах бактерий и вирусов. Демонстрация возможности комбинированного анализа биоматериала с применением технологии ДНК-чипов и масс-спектрометрического исследования.

2. Разработка и использование молекулярно-генетических тестов для типирования вирусов гепатита С и В, определение их аналитических характеристик.

3. Оптимизация и осуществление процедуры прямого масс-спектрометрического профилирования бактерий и оценка возможности его применения для типирования и видовой идентификации клинически значимых микроорганизмов.

4. Создание средств молекулярного типирования российской популяции М. tuberculosis и N. gonorrhoeae. Сопоставление информативности методов проте-омного и геномного типирования бактерий.

5. Проведение широкомасштабных молекулярно-эпидемиологических исследований географически неоднородных групп (коллекций) штаммов гонококка, микобакте-рий туберкулеза, пневмококка. Оценка основных тенденций генетической изменчивости в микробных популяциях на территории Российской Федерации.

6. Разработка нового алгоритма обнаружения неизвестных молекулярных механизмов лекарственной устойчивости у бактерий и его демонстрация на примере анализа гонококка с привлечением протеомных исследований и моделирования генных (метаболических)сетей.

Научная новизна

Впервые реализована возможность комбинированного применения новых молекулярных технологий - прямого МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования бактериальных белков и исследования на ДНК-чипах - для видовой идентификации типичных представителей грамотрицательной и грамположительной флоры.

Впервые разработаны и реализованы в скрининге клинических изолятов пневмококка, туберкулеза и гонококка высокопроизводительные системы выявление генетических детерминант резистентности, в которых использован метод минисеквениро-вания с последующей МАЛДИ масс-спектрометрической детекцией.

Впервые способ обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов на основании МАЛДИ масс-спектрометрического анализа продуктов реакции минисеквениро-вания использован для типирования возбудителей трансфузионных вирусных гепатитов В и С.

Для клинических изолятов S. pneumoniae и N. gonoirhoeae впервые определен спсктр генетических мутаций, достоверно ассоциированных с устойчивостью к пенициллину, фторхинолонам, тетрациклину. Молекулярно-эпидемиологическое исследование коллекций клинических изолятов N. gonorrhoeae и М. tuberculosis, собранных в

разных регионах РФ, позволило получить актуальную информацию о распространении генетических маркеров лекарственной устойчивости в микробных популяциях.

Впервые молекулярно-генетические особенности российской популяции М. tuberculosis и N. gonorrhoeae изучены с применением методов мультилокусного типирования (VNTR, NG-MAST, MLST), описаны новые сиквенс-типы, депонированные в мировые базы данных.

Впервые описан феномен резистентности к спектиномицину, обусловленный изолированной мутацией в рибосомальном белке S5; выявлены нарушения в системе транслокации белков внешней мембраны, способствующие снижению чувствительности гонококка к пенициллинам, тетрациклинам, макролидам; установлено вовлечение в развитие толерантности к цефтриаксону механизмов, ответственных за выживание бактериальной клетки в условиях осмотического стресса.

Практическая значимость

В практическом аспекте разработанная геномно-протеомная система характеристики микроорганизмов решает задачи: 1) адекватной видовой идентификации патогенов, 2) оценки профиля лекарственной устойчивости, 3) характеристики локальной (географической, временной) структуры популяции/субпопуляции возбудителя, отслеживания клонального родства и путей распространения инфекции.

На основании сопоставления спектра мутаций, выявляемых в генах мишеней действия антибиотиков с фенотипом изолята, для каждого включенного в исследование микроба (S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, М. tuberculosis) установлены генетические маркеры, достоверно ассоциированные с формированием устойчивости к применяемым в терапии этих инфекций лекарственным препаратам. Аналитическая чувствительность предложенного способа установления генетически-детерминированной лекарственной устойчивости составила от 82 % до 96 % для разных групп препаратов, что демонстрирует перспективность применения этого подхода в практическом здравоохранении.

Для повышения эффективности мониторинга вирусных и бактериальных инфекций разработаны, утверждены и внедрены в практику отечественного здравоохранения наборы реагентов для выявления геномной ДНК N. gonorrhoeae, вируса гепатита В, РНК вируса гепатита С методом полимеразной цепной реакции - «Гонопол» «Полигеп В» и «Полигеп С» ТУ-9398-405-17253567-96, ТУ-9398-410-17253567-97.

Разработанные схемы молекулярно-генетического мониторинга N. gonorrhoeae и М. tuberculosis реализованы при выполнении в рамках Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с заболеваниями социального характера (20022006 годы)» государственных контрактов № 03/ЦП «На проведение процедуры гено-типирования, молекулярно-эпидемиологического мониторинга изолятов гонококка, выделенных из разных регионов Российской Федерации» от 1 ноября 2004 г.; № 24-05 «На проведение работ по генетическому типированию выделенных штаммов гонококка» от 23 сентября 2005 г.; № 06/365 на проведение работы по теме «Мониторинг

лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в Российской Федерации с использованием технологии масс-спектрометрии» от 15 марта 2006 г.

Разработанные технологии внедрены в клинико-лабораторную практику ГУ Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, ФГУ Государственный научный центр дерматовенерологии Минздравсоцразвития.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на ежегодных итоговых конференциях НИИ ФХМ (2005 - 2008 г.г.), 15-ой и 16-ой Международных конференциях по патогенным нейссериям (15th IPNC, Cairns, Australia, 2006, 16lh IPNG, Роттердам, 2008), 17-ом и 18-ом Европейских конгрессах по клинической микробиологии и инфекционным болезням (17th ECCMID, Мюнхен, 2007, 18th ECCMID, Барселона, 2008), 46-ой Междисциплинарной конференции по антибиотикам и антимикробной химиотерапии (47th ICAAC, Сан-Франциско, 2006), Международной научно-практической конференции «Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения. Проблемы, подходы, перспективы» (Химки, 2006), VIII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной терапии» (Москва, 2006), 55-ой Конференции Американского общества масс-спектрометрии (55lh ASMS, Индианаполис, 2007), 39-ой Всемирной конференции по здоровью легких (39th Union World Conference on Lung Health, Париж, 2008), 3-ей и 4-ой Международных конференциях «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии для медицины» (3rd GPBNM, Новосибирск, 2006, 4Ü1 GPBNM, Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 39 печатных работ, из которых 34 в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 265 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты, обсуждение и выводы. Работа иллюстрирована 51 таблицей и 41 рисунками; библиографический указатель включает 514 публикаций, из которых 23 в изданиях на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы.

Объектами исследования служили лабораторные штаммы Е. coli DH5a, N. gonorrhoeae АТСС 49226, S. pneumoniae АТСС 49619, а также клинические изоляты S. pneumoniae (n = 234), М. tuberculosis (n = 693), N. gonorrhoeae (n = 585), N. meningitidis (n = 15), непатогенные нейссерии (n = 15). Клинический материал включал мазки слизистой влагалища (п = 24) от пациенток с бактериальным вагинозом, соскобы из уретры, с головки полового члена и крайней плоти (п = 60) от пациентов с баланопоститом, образцы сывороток крови (п = 329) больных вирусными гепатитами В и С. Все бактериальные изоляты прошли стандартную процедуру видовой идентификации и тестирования лекарственной чувствительности.

МАЛДИ масс-спектрометрическое пробилирование. Свежие бактериальные клетки (1-2 колонии), находящиеся в стационарной фазе роста, переносили в 300 мкл деионизированной воды, пе-

ремешивали и добавляли 900 мкл этанола. Осадок после центрифугирования (15 мин х 14000 об/мин) растворяли в 20 мкл смеси 50 % ацетонитрила, 35 % муравьиной кислоты. Полученный последующим центрифугированием супернатант анализировали с помощью масс-спектрометра Microflex™ (Bruker Daltonics, Германия), применяя а-циано-4-гидроксикоричную кислоту в качестве матрицы. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали flexControl 2.4 и flexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия). Кластерный анализ, сопоставление получаемых масс-спектров с имеющимися базами данных производили с помощью программного пакета Biotyper l.l (Bruker Daltonics, Германия).

Протеомное картирование. Свежие клетки N. gonorrhoeae, находящиеся в стационарной фазе роста, отмывали в физиологическом растворе и обрабатывали смесью нуклеаз. Белки переосаждали метанол/хлороформом и растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевины, 2 М тиомочевины, 2 % амфолинов (pH 3 - 10), 100 мМ ДТТ, 16,7 % раствора (30 % CHAPS + 10 % NP40). Концентрацию белка в образцах измеряли по методу Бредфорда с помощью Quick start Bradford dye reagent (Bio-Rad, США). При необходимости белки метили цианинами CyDye3-DIGE и CyDye5-DIGE (GE Healthcare, Великобритания) согласно рекомендациям фирмы-производителя. В первом направлении (изоэлек-трофокусирование) использовали 4 % ПААГ, 8 М мочевину и 4 % амфолины (GE Healthcare, Великобритания) pH 3-10, либо ИПГ стрипы 3-10 (Bio-Rad, США). Изоэлектрофокусировку осуществляли в режиме 100 В - 200 В- 300 В - 400 В - 500 В - 600 В - по 45 минут, 700 В - 10 часов, 900 В - 1 час. По завершению изоэлектрофокусирования гели или ИПГ-стрипы вымачивали в буфере 62,5 мМ Tris HCl, pH 6,8, 6 М мочевины, 30 % глицерола, 2 % додецилсульфата натрия, 20 мМ ДТТ, в течение 30 мин, переносили на поверхность градиентного полиакриламидного геля (9 - 16 %) и проводили электрофорез во втором направлении. Электрофореграммы сканировали при длине волны 532 нм и 633 нм на сканере TyphoonTrio (GE Healthcare, Великобритания) и анализировали программой PDQuest 8.0 (Bio-Rad, США). Дифференциальные белковые пятна вырезали из геля и подвергали трипсиноли-зу. Полученные образцы анализировали с помощью MALDI-TOF/TOF Ultraflex II (Bruker Daltonik, Германия), используя 2,5-дигидробензойную кислоту в качестве матрицы. Идентификацию белков производили методом пептидного фингерпринта с использованием программы Mascot Peptide Fingerprint (Matrix Science, США).

Экстракция нуклеиновых кислот. Геномную ДНК бактериальных возбудителей, вируса гепатита В, а также тотальную ДНК из клинического материала выделяли набором «ДНК экспресс» ООО НПФ Литех (ТУ- 9398-450-17253567-03). Выделение РНК ВГС и амплификацию фрагментов 5'-нетранслируемой области вирусного генома проводили с помощью набора «Полигеп С» ООО НПФ Литех (ТУ -9398-409-17253567-97).

Минисеквенирование с последующей МАЛДИ ВМС. Амплификацию целевых локусов бактериальных и вирусных геномов проводили в буферной смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 16,6 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCl2, по 250 мкМ каждого dNTP, 1 ед Taq-полимеразы (Promega, США) и по 5 пмоль специфичных праймеров в объеме 25 мкл. Реакцию осуществляли в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research, США), по универсальному профилю: 94еС - 5 мин.; 945С - 15 сек., 60"С - 15 сек., 72°С - 15 сек., 35 циклов. Дефосфорилирование 5'-концевых фосфатных групп dNTP в прошедшей амплификацию реакционной смеси проводили в ходе инкубации с 0,5 ед щелочной фосфатазы арктических креветок (Fermentas, Литва) в течение 20 минут при 37° С и последующей инактивации фермента прогреванием в течении 10 мин при 85° С. Предназначенные для секве-нирования образцы дополнительно обрабатывали 5 ед экзонуклеазой I Е. coli (Fermentas, Литва) в аналогичных условия инкубации.

Реакцию минисеквенирования проводили в 10 мкл реакционной смеси 66 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 16,6 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCl2; по 0,2 мМ необходимых dNTP и/или ddNTP; по 10 пмолей соответствующих праймеров и 2 Ед TermiPol DNA Polymerase (Solis Biodyne, Эстония), используя в

качестве матрицы амплифицированные фрагменты бактериальных или вирусных геномов. Реакцию осуществляли по профилю: 94°С - 20 сек, 60°С - 20 сек, 72° С - 15 сек, 70 циклов в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research, США). Для очистки продуктов реакции минисеквснирования в пробирку вносили 1 мг катион-обменной смолы SAC-50 (AHO «Синтез полимерных сорбентов») и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Сорбент осаждали центрифугированием. Супер-натант (0,2-1 мкл) анализировали с помощью масс-спектрометра Microflex™ (Bruker Daltonics, Германия), применяя 3-гидроксипиколиновую кислоту в качестве матрицы. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали flexControl 2.4 и flexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия). По наличию в масс-спектрах продуктов реакции пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, судили о нуклеотидном контексте в данном положении.

Секвенирование фрагментов геномной ДНК проводили модифицированным методом Сенгера с использованием ABI Prism® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABl Prism® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Сборку и сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с использованием модулей ContigExpress и AlignX программного пакета «Vector NT1® 9.0» (Informax Inc., США).

Исследование на ДНК-чипах. Видоспецифичные олигонуклеотидные зонды в концентрации 0,1 мМ в 50 мМ Na2HP04 разносили на стеклянные слайды CodeLink (GE Healthcare, Великобритания), используя автоматический репликатор (SDDC-2 Microarrayer, Virtek Vision, США). Нанесенные зонды фиксировали в парах NaCl в течение 12 часов. Затем стекла инкубировали 30 мин в растворе 0,1 М Tris-HCl, pH 9,0, 50 мМ этаноламин при 60°С, 2 раза промывали водой, инкубировали 30 мин в растворе 4х SSC, 0,1 % додецилсульфат натрия при 60°С, снова промывали водой и высушивали. Для контроля процесса разнесения и пространственной локализации реакционных полей использовали меченый олигонуклеотидный зонд СуЗ - 5'aaggccgttgccaatatcggcg 3'- NH2.

Амплификацию проводили в 20 мкл смеси 66 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 16,6 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCl2; 0,1 мг/мл желатина, 800 мкМ dATP, dGTP и dTTP, 200 мкМ dCTP, 1 пмоль Cy3Dye™-dCTP (GE Healthcare, Великобритания), 1 ед. Taq-полимеразы (Promega, США), 2 пмоль и 20 пмоль прямого и обратного универсальных праймеров по программе 93°С - 30 сек, 58°С - 30 сек, 72°С - 30 сек, 50 циклов. Ампликоны (15 мкл) смешивали с 15 мкл буфера 4х SSC; 0,1 % додецилсульфат натрия, инкубировали 5 мин при 94°С, вносили под гибридизационные камеры на стекла и помещали в термостат на 12 часов при 60°С. После гибридизации стекла освобождали от камер и 2 раза промывали 1 % раствором додецилсульфат натрия. Прошедшие процесс гибридизации и отмывки ДНК-чипы сканировали с помощью прибора Typhoon Trio (GE Healthcare, Великобритания). Результаты гибридизации оценивали с помощью программного пакета TotalLab v 2.01 (Nonlinear Dynamics), принимая за положительный сигнал превышение фона на 12 % в 3-х из 4-х точках, соответствующих одному зонду. Суждение о присутствии конкретного микроорганизма выносили на основании регистрации гибридизации с соответствующим зондом.

Транскрипционный анализ. РНК N. gonorrhoeae выделяли SV Total RNA Isolation System (Promega, США) и немедленно подвергали обратной транскрипции с 200 ед. обратной транскриптазы (Fermentas, Литва) в прилагающемся буфере с использованием рандомизированных праймеров длиной 8 ИТ. ПЦР в реальном времени проводили в 30 мкл смеси, содержащей 66 мМ TrisHCl, pH 9,0, 16,6 мМ (NH4)2S04, 2 мМ MgCl2) 0,1 мМ SibrGreen™, по 150 мкМ каждого dNTP, 1 ед. Taq-полимеразы (Promega, США) и по 5 пмоль соответствующих праймеров. Реакцию осуществляли в приборе AB Prizm 7000 (Applied Biosystems, США) по профилю: 94°С - 3 мин и 94°С - 30 сек, 60°С -15 сек, 72°С - 30 сек, 35 циклов. Уровень экспрессии анализируемых генов оценивали относительно экспрессии генов «домашнего хозяйства» abcZ (putative ABC transporter) и adk (adenylate kinase).

Методы молекулярного типирования. Серотип гонококка устанавливали по принципу максимальной гомологии при сравнении нуклеотидной последовательности гена рогВ анализируемого изо-

лята с представленными в базе данных GenBank. Мультиантигенное типирование N. gonorrhoeae (NG-MAST) и мультилокусное секвенирование (MLST) осуществляли по методикам, описанным ранее [Martin, 2004; Bennett, 2007]. Анализ числа тандемных повторов в геномах изолятов М. tuberculosis осуществляли по методикам Mazars, 2001 и Supply, 2006. Сполиготипирование осуществляли по протоколу Kamerbeek, 1997 с использованием набора «Spoligotyping Kit» (Isogen Lifescience, Нидерланды).

Статистические расчеты проводили с помощью программного пакета Statistica 6.0. Все тесты проводили для уровня значимости р<0,05. Наличие ассоциации исследуемых фенотипических и генетических признаков оценивали методом х-квадрат Фишера. Для оценки вариабельности генетических локусов использовали индекс аплельного полиморфизма (h) [Seiander, 1986]. Дискриминирующую способность методов типирования оценивали на основании индекса разнообразия Симпсона (D) [Simpson, 1949].

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Создание геномно-протсомной платформы молекулярного типирования микроорганизмов.

На основании современных методов анализа природных биополимеров - белков и нуклеиновых кислот - были разработаны технологии, позволяющие решать круг задач, связанных с видовой идентификацией, оценкой профиля лекарственной чувствительности и молекулярного типирования клинически-значимых микроорганизмов. К ним относятся методики, базирующиеся на МАЛДИ ВМС - прямое белковое профилирование, идентификация однонуклеотидных полиморфизмов ДНК мини-секвенированием, а также исследование на ДНК-микроматрицах.

Протокол прямого белкового профилирования, включающий обработку бактериальных клеток и параметры снятия МАЛДИ масс-спектров, был отработан на лабораторном штамме Е. coli DH5a. За основу метода была взята кислая экстракция белков и пептидов, позволяющая наиболее полно выделять основные рибосомальные белки, составляющие 20 % от общего пула белков Е. coli [Arnold, 1998]. Подобранные условия прямого МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования позволили получить спектр Е. coli, качественный состав которого аналогичен спектру, заявленному ранее для штамма Е. coli К-12 [Ryzhov, 2001].

Реакция минисеквенирования с последующей детекцией продуктов МАЛДИ ВМС была использована для обнаружения в бактериальных или вирусных геномах полиморфных локусов, ответственных за формирование лекарственной устойчивости или позволяющих установить генотип патогена. Впервые подобная система разработана в компании Sequenom для анализа однонуклеотидных полиморфизмов в геноме человека [Storm, 2002], приоритет применения этой технологии в области исследования прокариот принадлежит коллективу автора [Ilina, 2005].

Разработанные системы представляют собой последовательность процедур, разделенных условно на три блока: амплификация специфических фрагментов геномной ДНК, потенциально содержащих искомые полиморфизмы, осуществление реакций минисеквенирования в присутствии заданного набора dNTP/ddNTP, масс-

спектрометрическое исследование продуктов удлинения праймеров с последующим выводом о нуклеотидном контексте в точке полиморфизма (рис. 1).

|Г 1»)

S'-ATACCACCCCCACGttCijATT-Э 603? Д» , т л. т ö с 7 G ü :> гс с с. с т а а о а г, с g т с л а

ДИК полимер«*«. йТ. Ü'SC

5-AT*cG*ccctc*cGOCO*tTc-.j; mm/u Ж-.. .TATeSTCCGGSTGCCCCTAACCCOTCAA.,.

s . <

S'-ATACCACCCCCACGGCCIATTTC'-S'

)■.... UTU Т-ЛП !- 1>ССвСТ*»А V4.Tw.AA,, .

МЛЛДИ ВМС

: il;<">

Рнсунок 1. Схематичное представление реакции минисеквенирования с последующей МАЛДИ ВМС детекцией. Внутренние олигонуклеотидные праймеры прилегают к точке полиморфизма (вариабельные нуклеотиды выделены жирным). Терминирующие процесс элонгации праймера дидезоксинуклеотиды обозначены звездочкой. Исходные праймеры и продукты реакции минисеквенирования выделены рамкой. Масс-спектры продуктов минисеквенирования различны для дикого (а) и мутантного (в) генотипов.

Для включенных в исследование микробов был осуществлен подбор праймер-ных систем, предназначенных для селективной специфичной амплификации локусов и их последующего анализа согласно разработанному протоколу минисеквенирования. Используемая схема предполагает регистрацию детерминант устойчивости, обусловленных как приобретением мобильных генетических элементов (для S. pneumoniae и N. gonorrhoeae), так и мутациями в специфических хромосомных ло-кусах бактерий (для S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, М. tuberculosis). По аналогичному принципу сформулированы системы, направленные на установление генотипа вирусов гепатита В и С. С целью уменьшения себестоимости и повышения производительности анализа, нами были отработаны универсальные условия амплификации, использован мультипраймерный формат минисеквенирования, минимизировано количество операций по переносу и разведению образцов, все процедуры адаптированы к формату 96-ти и 384-х луночной плашки.

Ограничением использования прямого масс-спектрометрического профилирования для идентификации микробных возбудителей в биологическом образце является необходимая стадия культивирования. Хотя возможность тестирования колоний непосредственно с чашки первичного посева существенно повышает эффективность метода, проблема идентификации медленно растущей и/или трудно культивируемой флоры остается не решенной. В этой связи мы использовали комплементарную тех-

нологию ДНК-микроматриц (ДНК-чипов), ранее показавшую свою состоятельность для изучения микробного разнообразия в клиническом материале [Bouchara, 2009; You, 2008] и пищевых продуктах [Kim, 2008].

В ходе работы был создан оригинальный ДНК-чип, предназначенный для видовой идентификации 50-ти микробов и ориентированный на изучение микробиоценозов слизистых урогенитального и бронхо-легочного трактов. Мишенью для идентификации служили видоспецифичные фрагменты генов 16S рРНК. Использование ри-босомальных генов в качестве мишеней для идентификации было обусловлено их максимальной представленностью в базах данных, а также относительным консерватизмом, что облегчает задачу подбора универсальных праймеров для амплификации всей совокупности микроорганизмов. Наряду с уникальными видоспецифичными зондами в дизайн ДНК-чипа включен универсальный зонд, комплементарный консервативному участку анализируемых фрагментов генов rrs, позволяющий контролировать процесс гибридизации.

В качестве носителя при создании ДНК-чипа нами выбраны стеклянные слайды CodeLink (GE Healthcare, Великобритания), предназначенные для присоединения оли-гонуклеотидов через аминогруппу путем образования ковалентной связи с эфиром N-гидроксисукцидина, покрывающего поверхность слайда. Несмотря на существование множества аналогов, за счет высокой реакционной способности эфира N-гидроксисукцидина данный способ позволяет добиться высокой плотности посадки олигонуклеотидов, а также упростить и ускорить протокол иммобилизации [Lindroos, 2001]. Аналитическая специфичность разработанной технологии составила в среднем 96,0 %, что наряду с чувствительностью 103-104 микробных клеток, позволяет говорить о пригодности это подхода для анализа условно-патогенной флоры.

2.2. Применение разработанных методик в молекулярном мониторинге бактериальных и вирусных патогенов.

2.2.1. Масс-спектрометрическое профилирование клинических изолятов S. pneumoniae и N. gonorrhoeae.

Методикой прямого МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования исследованы грамположительные а-гемолитические стрептококки (S. pneumoniae и близкородственные «зеленящие» стрептококки) и грамотрицательные бактерии рода Neisseria.

Масс-спектры кислого экстракта клеток грамположительных стрептококков, содержащие около 60 пиков, не отличались по представительности от масс-спектров грамотрицательных Е. coli и нейссерий (около 70 пиков), что иллюстрирует универсальность отработанного протокола (рис. 2). Большинство воспроизводимо регистрируемых масс соответствовало массам рибосомальных белков протестированных микробов - 11/19 для пневмококка, 14/20 для N. gonorrhoeae и 11/17 для N. meningitidis (табл. 1).

Таблица 1. Перечень воспроизводимых пиков (частота регистрации > 0,7), регистрируемых при МАЛДИ масс-спектрометрическом профилировании лабораторных штаммов S. pneumoniae АТСС 49619, N. gonorrhoeae АТСС 49226 и клинического изолята N. meningitidis_547. Пики, предположительно соответствующие рибосомальным белкам, выделены жирным. Идентичные для N. gonorrhoeae и N. meningitidis пики обозначены серым.

Neisseria gonorrhoeae АТСС 49226__Neisseria meningitides 537 (серогруппа В) _Streptococcus pneumoniae АТСС 49619

№ М f М Тип иона D № М f М Тип D № М f М Тип D

(match) (match) иона (match) иона

1 4474 1 4473 М+Н+ RL36 1 4489 0,9 4489 м+н* RL36 1 4196 1 8387 М+2Н* RL10

2 4511 0,8 2 4419 1 4421 М+Н* RL36

3 4689 1 9377* М+2Н* RS20 ; 2 4688 0,7 9377* М+2Н* RS20 3 4534 1

4 4784 1 9570 М+2Н* RL27 4 4718 1

5 5010 1 5010 5 5044 1 10089 М+2Н* RL27

6 5052 1 5051 М+1Г RL34 3 5051 1 5051 М+Н* RL34 6 5201 1 10403* М+2Н* RS15

4 5115 0,7 10230* М+211* RS19 7 5309 0,7 5304* М+Н* RL7

7 8 5130 5484 0,9 0,7 10259* М+2Н* RS 19 5 6 5129 5541 0,8 0,9 8 9 5833 5873 0,9 1

9 5908 1 5907 М+Н" RL33 7 5624 0,7 10 5951 1

10 5946 1 8 5937 1 5937 М+Н* RL33 11 6265 1 6267* М+Н* RL30

11 6053 0,9 9 6342 1 6342 М+Н* RL32 12 6614 1

12 6404 1 6402* М+1Г RL32 10 6431 0,9 13 6638 1 6640* М+Н* RL32

13 7080 1 7078 М+Н+ RL29 11 7078 1 7078 М+Н* RL29 14 6751 1 6752* М+Н* RL28

14 7227 1 7226* М+Н* RL35 12 7226 0,7 7226* М+Н* RL35 15 6887 1

15 8068 1 13 9350 0,7 16 7983 1 7987 М+Н* RL29

16 8167 1 8165 М+Н* RL31 17 8390 1 8387* М+Н* RL10

17 8225 1 8224* М+1Г RS21 18 9513 1

18 9379 1 9377* М+Н* RS20 14 9377 0,9 9377* М+Н* RS20 ' 19 10089 1 10089 М+Н* RL27

19 9570 1 9568* М+1Г RL27 15 9557 0,8 9554* М+Н* RL27

20 10260 1 10259* М+Н* RS19 16 17 10237 11248 0,7 0,9 10237* М+Н* RS15

М — среднее значение экспериментальных m/z для каждого пика (использованы масс-спектры, полученные в ходе 10 независимых экспериментов); f — частота регистрации пика;

М (match) — масса белка согласно SwissProt/TrEMBL базе данных (Da) * - с учетом потери N-концевого метионина.

Тип иона — только для пиков, соотнесенных с конкретными белками D - описание белка согласно SwissProt/TrEMBL базе данных

щи uJ

i i

- (а)

(b)

.LI

Рисунок 2. МАЛДИ масс-спектры экстрактов клеток штаммов S. pneumoniae АТСС 49619 (а), N. gonorrhoeae АТСС 49226 (Ь), и N. meningitidis_5Al (с), отснятые при использовании а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы. По шкале абсцисс отложены значения m/z, по шкале ординат - относительная интенсивность пиков, регистрируемая при масс-спектрометрическом анализе.

(с)

Несмотря на таксономическое (филогенетическое) родство N. gonorrhoeae и N. meningitidis, только 6 пиков оказались общими в МАЛДИ масс-спектрах обоих видов.

МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование зеленящих стрептококков (п = 3) и клинических изолятов идентифицировались как S. pneumoniae согласно панели иммунологических и биохимических тестов (п = 25), продемонстрировало неоднородность исследуемой группы (рис. 3, А).

В настоящее время проблема надежной и однозначной дифференциации S. pneumoniae от других представителей а-гемолитических стрептококков - S. mitis, S. ora/is и др. однозначно не решена. Такое положение дел вынуждает использовать MLST в качестве референс-метода, устанавливающего видовую принадлежность штамма [1р, 2006], что было реализовано в текущем исследовании и позволило выявить различную видовую принадлежность 25-ти клинических изолятов - 19 идентифицированы как S. pneumoniae и 6 - как не пневмококки.

Выделенная группа, так называемые псевдопневмококки, имела аллельный профиль, отличный от «истинных» пневмококков, однако обладала свойственным пневмококку фенотипом (а-гемолиз, оптохин чувствительность и растворение в солях желчи). По данным масс-спектрометрического профилирования эта группа, хотя и образовывала отдельный кластер, все равно относилась к общему пулу пневмококков, тогда как зеленящие стрептококки имели однозначно отличные масс-спектры.

Полученные нами данные хорошо иллюстрирую ситуацию, сложившуюся в последние годы в области видовой таксономии а-гемолитических стрептококков, обусловленной их высокой степенью гомологии. Неоднозначность видовой идентификации на основании биохимических тестов и последовательностей гена 16S рРНК [Woo, 2008] приводит к существованию отличных мнений о таксономической принадлеж-

ности тех или иных групп штаммов, их роли в инфекционном процессе. И если клиническая необходимость дискриминации пневмококков от зеленящих стрептококков не вызывает сомнений, то выделение группы псевдопневмококков является весьма спорным вопросом [СагуаШо, 2003; АгЫцие, 2004].

~tr> i i i i i .t

Рисунок 3. Сравнительный анализ масс-спектров, полученных для исследуемой группы стрептококков (А) и нейссерий (В). Выделены изоляты, не относящиеся к виду S. pneumoniae, согласно MLST.

Продемонстрированная ранее возможность эффективной дискриминации зеленящих стрептококков на основании прямой масс-спектрометрии [Friedrichs, 2007] была подтверждена в нашем исследовании с применением других протоколов тестирования. Сравнительный анализ масс-спектров кислых белковых экстрактов зеленящих

стрептококков и пневмококков позволил предположить, что такой подход будет использован в практике. Кроме того, была продемонстрирована принципиальная возможность кластеризации псевдопневмококков в отдельную группу, что открывает перспективы для раздельного мониторинга этих бактерий и, возможно, дальнейшего исследования S. pseudopneumoniae с целью установления его роли в развитии легочных патологий.

МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование лабораторного штамма (n = 1) и клинических изолятов (п = 278) N. gonorrhoeae показало однородность получаемых профилей в исследуемой группе. Отдельно следует отметить, что в целом МАЛДИ масс-спектры, отснятые для гонококка по разработанному протоколу, существенно богаче аннотированных ранее при исследовании гемофильных бактерий, в том числе и N. gonorrhoeae [Haag, 1998].

Сравнительный анализ полученных масс-спектров (пик-листов) выявил три пика со значениями m/z 4473, 5051 и 8165, соответствующих рибосомальным белкам RL36, RL34 и RL31 штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226 и меняющихся у ряда изолятов на 4487, 5081 и 8146. Подобные изменения зарегистрированы для пиков, соотнесенных с рибосомальными белками RS20 и RL27 N. meningitidis (табл. 2).

Секвенирование соответствующих генов N. gonorrhoeae (rpmJ, гртН и гртЕ), и N. meningitidis (rpsT и гртА) подтвердило существование в каждом из них однонук-леотидного полиморфизма, приводящего к аминокислотной замене. Теоретически рассчитанное изменение массы белка при данной замене совпало с регистрируемым в масс-спектрометрическом анализе.

Таблица 2. Регистрируемые изменения в последовательностях рибосомапьных белков соответствующие наблюдаемым отличиям в МАЛДИ масс-спектрах клинических изолятов N. gonorrhoeae и N. meningitidis.

m/z Описание Ген Нуклеотидные Аминокислотные Рассчитанная масса, Да

(SwissProt/TrEMBL) замены замены

N. gonorrhoeae

4473 RL36 rpmJ wt wt 4473

G19—>A Val7—»lie 4487

5051 RL34 гртН wt wt 5051

G,0"->A Ala17—>Thr 5081

8166 RL31 rptnE wt wt 8165

G29—►A Arg10—»His 8146

N. meningitidis

9378 RS20 rpsT wt wt 9378

G169—»A Val"-»Ile 9393

9557 RL27 rpmA wt wt 9554

G79—»A Gly27—>Ser 9584

Среди исследованной группы изолятов N. gonorrhoeae обнаружены четыре варианта сочетаний меняющихся значений m/z этих белков. Учитывая неизменность остальных значений m/z в спектре, выделено четыре типа МАЛДИ масс-профилей (про-теотипов) гонококка. Исследуемая выборка гонококков (п = 278) распределилась следующим образом: подавляющее большинство - 236 (84,9 %) относились к протеотипу

1 (m/z 4473/5051/8165), соответствующему контрольному штамму N. gonorrhoeae 14

АТСС 49226; 26 изолятов (9,4 %) были отнесены к протеотипу 2 (m/z 4487/5051/8165); 15 изолятов (5,4 %) к протеотипу 3 (m/z 4487/5051/8147) и 1 изолят (0,4 %) - к протеотипу 4. Индекс разнообразия Симпсона при таком типировании составил 0,27.

Наблюдаемые незначительные отличия качественного состава масс-спектров в группе клинических штаммов гонококка согласуются с нашим представлением о консервативности рибосомальных белков. Высокая гомогенность качественного состава масс-спектров делает невозможным применения этого подхода для типирования гонококка, однако, открывает перспективы для видовой идентификации возбудителя. При относительной внутривидовой стабильности масс-спектров исследованных изолятов N. gonorrhoeae и N. meningitidis, МАЛДИ масс-профили, накопленные для разных видов бактерий рода Neisseria, демонстрируют существенные различия в числе и положении пиков. Этот тезис был подтвержден в ходе кластерного анализа накопленных масс-профилей близкородственных бактерий - менингококков (п = 15) и непатогенных нейссерий (п = 15) (рис. 3, В). Непатогенные нейссерии сформировали достаточно гетерогенную группу, полностью отличную от N. gonorrhoeae и N. meningitidis.

В целом, результаты, полученные в ходе тестирования гетерогенных коллекций клинических изолятов S. pneumoniae и N. gonorrhoeae, а также близкородственных им видов бактерий, подтверждают возможность применения нового, основанного на МАЛДИ ВМС, способа видовой идентификации микробов, в том числе при мониторинге бактериальных инфекций.

2.2.2. Исследование микробного сообщества при бактериальном вагинозе женщин и неспецифическом баланопостите мужчин на ДНК-микроматрицах

Для определения эффективности созданного нами ДНК-чипа мы исследовали клинический материал от пациентов с признаками неспецифических воспалительных процессов в урогенитальной сфере - бактериального вагиноза у женщин и неспецифического баланопостита у мужчин. Надо отметить, что тезис об инфекционной природе этих заболеваний до сих пор является предметом дискуссий, в силу наблюдаемых неудач на фоне антимикробной терапии, с одной стороны, и низкой высеваемо-сти микробной флоры при проводимом бактериологическом исследовании, с другой.

В группе мужчин, страдающих баланопоститами, наиболее часто выявлялись анаэробные грамотрицательные бактерии. Их наличие в содержимом препуциального мешка и отделяемом уретры обнаружено у 45/60 (75 %) пациентов. В 27/60 (45 %) случаях анаэробные бактерии были единственными микробными агентами, выявленными при первичном баланопостите. Среди них обнаружены микроорганизмы рода Prevotella - 14/27 (52 %) случаев, Bacteroides - 8/27 (27 %) случаев, Mobiluncus - 5/27 (19 %). В 9/27 (15 %) случаев выявлены различные ассоциации перечисленных анаэробных микроорганизмов. В 18/60 (30 %) случаях установлено сочетание анаэробной флоры с другими микроорганизмами - G. vaginalis, Ureaplasma spp., М. hominis, Е. coli, S. agalactiae.

На данной стадии исследования отмечена тенденция к более легкому клиническому течению баланитов и баланопоститов, вызванных только анаэробными бактериями, и утяжеление характера наблюдаемого воспаления при сочетании анаэробной флоры с U. urealyticum, М. hominis, G. vaginalis. Включение в схему терапии таких больных пероральных препаратов метронидазола позволило достичь выраженного клинического эффекта в виде эпителизации эрозивных дефектов и исчезновения болезненности в течение 3-4 дней.

Характерный для бактериального вагиноза микробный пейзаж наблюдался у всех пациенток, включенных в исследование (п = 12). Однако, спектр выявляемой микрофлоры и информативность получаемых данных отличались для бактериологического и молекулярно-генетического исследования (рис. 4).

бактериальным вагинозом до и после антибактериальной терапии. Проведено сопоставление данных бактериологического исследования и анализа на ДНК-чипе. Маркерные для бактериального вагино-

Так, по данным культурального посева почти во всех образцах выявлены S. epidermidis (12/12, 100 %), Corynebacterium spp. (10/12, 83 %), которые не являются маркерами бактериального вагиноза и относятся к сопутствующей флоре. Применение технологии анализа на ДНК-чипе на стадии лабораторного обследования позволило выявить у 10/12 (83 %) пациенток присутствие анаэробных бактерий семейства Bacteroidales (В. fragilis, В. сассае, В. stercoris, Р. melanogenica), V. parvula, А. vaginae, F. micleatum, M. curtisii, обнаружение которых с помощью стандартного бактериологического посева, как правило, затруднено.

Наблюдаемое снижение частоты обнаружения G. vaginalis и урогенитальных микоплазм при тестировании на ДНК-чипе может быть объяснено очаговой природой локализации возбудителя в слизистой влагалища, что влечет за собой отличия в микробном составе двух образцов, взятых у одного пациента.Зафиксированные изменения в спектре микрофлоры, выявляемой на фоне антимикробной терапии, касались преимущественно маркерной для бактериального вагиноза флоры (выделены рамкой на рис. 4), тогда как сопутствующие микроорганизмы были обнаружены во всех образцах, проанализированных бактериологическими методами. 16

В этой ситуации тестирование образцов с помощью ДНК-микроматриц позволило получить дополнительную информацию о состоянии микробиоценоза влагалища. В частности, обнаружение у пациентки A. vaginae, свидетельствует о недостаточной эффективности проведенного курса терапии и необходимости продолжения лечения, а «отсутствие» какой-либо флоры в 3-х образцах является сигналом резкого снижения общего титра бактерий менее 104 КОЕ/мл, что требует назначения курса заместительной терапии.

Высокая частота обнаружения трудно культивируемой флоры в проведенных исследованиях позволила нам предположить, что данная технология может быть использована в качестве дополнительного метода тестирования при анализе биоценозов, потенциально включающих анаэробную и микроаэрофильную флору, особенно для оценки эффективности антибактериальной терапии.

2.2.3. Тестирование генетических маркеров резистентности микобактернй туберкулеза, пневмококка, гонококка и оценка их вклада в формирование устойчивого фенотипа.

Мониторинг изменений в профиле лекарственной чувствительности бактериальных патогенов занимает ведущее место в мероприятиях по борьбе с ними. Сегодня понятно, что необходимо не просто регистрировать факт появления устойчивых изо-лятов, но и выявлять молекулярные изменения, предопределяющие эти процессы. Последнее особенно важно для разграничения хромосомных и плазмидных механизмов реализации резистентности, имеющих разную скорость распространения в микробной популяции.

Анализ опубликованных данных позволил нам систематизировать информацию об известных генетических механизмах формирования лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, пневмококка и гонококка к различным классам лекарственных препаратов, применяемым в терапии соответствующих инфекционных заболеваний. В данном случае всю совокупность анализируемых признаков можно разбить на две группы - наличие/отсутствие гена, что легко детектируется с привлечением амплификационных технологий, и однонуклеотидные замены в генах-мишенях, для детекции которых в рамках данного исследования разработаны оригинальные диагностические системы, реализующие принцип минисеквенирования с последующей масс-спектрометрической детекцией.

Адекватность разработанного подхода обнаружения генетически-детерминированной лекарственной устойчивости, его пригодность для осуществления молекулярно-эпидемиологического мониторинга были продемонстрированы в ходе тестирования клинических изолятов S. pneumoniae (п = 234), М. tuberculosis (п = 693) и N. gonorrhoeae (п = 585), фенотип которых был установлен на основании бактериологического тестирования.

Изучение закономерностей распространения генетических маркеров резистентности среди клинических изолятов S. pneumoniae

Для S. pneumoniae был проведен анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости к ß-лактамным антибиотикам и фторхинолонам, поскольку пенициллин, цефотаксим, наряду с моксифлоксацином являются препаратами выбора в терапии пневмококковых инфекций.

При выборе значимых маркеров формирования устойчивости пневмококка к ß-лактамным антибиотикам были отобраны три гена - pbpA, pbp2b и pbpX, продукты которых - пенициллин связывающие белки (ПСБ) 1, 2Ь и 2Х, рассматриваются как первичные мишени действия данного класса АМП [Zapun, 2008]. Поскольку единого мнения о первичном сайте возникновения мутаций, обуславливающих устойчивость S. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам не существует, мутации в этих генах рассматривались независимо, с учетом возможного кумулятивного эффекта.

По данным генетического тестирования, 55/169 (32,5 %) изолятов относились к дикому генотипу (не содержали мутаций в исследованных локусах), что достоверно ассоциировалось с чувствительностью к пенициллину (у2 = 143,3, р<0,001). Среди оставшейся части выборки были выявлены восемнадцать различных комбинаций генетических маркеров, потенциально вовлеченных в формирование резистентности пневмококка к пенициллину. В целом, из 120 изолятов S. pneumoniae со сниженной чувствительностью к пенициллину мутации в рассмотренных ПСБ были обнаружены в 111 (92,5 %) случаях (табл. 3), что реально свидетельствует о высокой диагностической чувствительности метода.

Таблица 3. Распределение изолятов пневмококка по категориям чувствительности к пенициллину, установленным по критериям CLSI (www.clsi.org) для каждого генетического варианта, сформированного согласно рабочей гипотезе: S - чувствительные, I - с промежуточной чувствительностью, R - устойчивые.

Генотип изолята, согласно тестированию генов ПСБ N (%) Категория чувствительности,N(%)

S 1 R

wt 55 (32,5) 46 (88,5) 9(11,5)

pbp2bmlA 12(7,1) 3 (25,0) 9 (75,0)

рЬр2Ьт„ьрЬрА„ш 5 (3,0) 4 (80,0) 1 (20,0)

pbpX Ile37'—Thr,pbp2bmtn 1 (0,6) 1(100)

pbpXG\nœ—G\\i,pbp2bmu, 11 (6,5) 11 (100)

pbpX lie" '—Thr, pbp2blma, pbpAmul 25 (14,8) 25(100)

pbpX Gin552—»Glu, pbp2blllia, pbpAmM 2(1,2) 2(100)

pbpX Asn6"5—>Thr, pbp2b„ „ pbpAm, 3(1,8) 2 (66,7) 1 (33,3)

pbpXUs"1—Thr, Asnw5~>TbT,pbp2blmil 2(1,2) 1 (50,0) 1 (50,0)

pbpX Ile371—»Thr, Asn6U5—»Thr, pbp2bmli, pbpAma 52 (30,7) 13(25,0) 39 (75,0)

pbpX I1e371-»Thr, Gin552—Glu, к%пт->1Ы,рЬр2Ьтп1,рЬрАта 1 (0,6) 1 (100)

Всего 169(100) 49 (30,0) 66 (38,1) 54 (31,9)

Поскольку достоверной информации о кумулятивном эффекте мутаций в транспептидазном домене ПСБ 1А нет, и оценить его в рамках настоящего исследования не представлялось возможным, мутации в pbpA гене мы не дискриминировали и рассматривали в совокупности как pbpAmub приравненные по частоте к аминокислотным заменам в Thr574 кодоне. Исходя из аналогичных предпосылок, был сформирован pbp2bmuí генотип, равный по частоте встречаемости заменам Thr445—>Ala. Стоит отметить, что в последних работах именно этот маркер фигурирует как значимый для

процесса развития пневмококком устойчивости к Р-лактамным антибиотикам [Izdebski, 2008]. При рассмотрении мутаций, выявленных в транспептидазном домене ПСБ 2Х, обращает на себя внимание факт обнаружения чувствительных изолятов с генотипом Thr338mut, Arg384—»Gly. Несмотря на то, что мутации в этих кодонах являются первыми описанными маркерами устойчивости пневмококка к пенициллинам, сейчас появляется все больше данных противоречащих этой точки зрения [Maurer, 2008]. При рассмотрении собственных результатов была принята рабочая гипотеза об отсутствии влиянии изолированных мутаций в Thr338 и Arg384 кодонах на чувствительность пневмококка. В этом случае генотипы Thr338mut, Arg384—»Gly приравнивались к дикому типу (wt), а при наличии других замен в pbpX они просто не учитывались. Полученное распределение изолятов S. pneumoniae с различными генотипами по трем категориям чувствительности к пенициллину представлено в табл. 3.

Выполненный анализ позволил нам выделить полиморфизмы, наиболее информативные для предсказания генетически-детерминированной устойчивости пневмококка к пенициллину. В этот список попали любые мутации в транспептидазном домене ПСБ 2В, в первую очередь Thr445—>А1а, сопровождающиеся изменениями в ПСБ 1А и/или ПСБ 2Х.

Традиционно транспептидазный домен ПСБ 2Х рассматривался как первичная мишень накопления мутаций при формировании устойчивости пневмококка к пенициллину [Carapito, 2006; Mouz, 1999]. Однако, в настоящем исследовании выявлены 4 изолята, имеющие дикий генотип по ПСБ 2Х, но реализующие устойчивость за счет вовлечения ПСБ 1А на фоне мутаций в ПСБ 2В. Этот факт дает основание утверждать о существовании альтернативных механизмов резистентности S. pneumoniae к пенициллину. И хотя изолированные мутации в ПСБ 2В, по нашим данным, не обеспечивают клинически-значимое снижение чувствительности S. pneumoniae к пенициллину, именно их следует рассматривать как ранний маркер формирования устойчивости пневмококка к р-лактамным антибиотикам.

Дополнительное подтверждение эта точка зрения получила при рассмотрении мутаций в ПСБ 2Х. Среди обнаруженных аминокислотных замен удалось выделить три, по-видимому, независимо возникающие мутации - Не371—»Thr, Gin552—>Glu, Asn605—»Thr, которые достоверно приводят к снижению чувствительности пневмококка к пенициллину. Данный вывод частично согласуется с работой Maurer, 2008, в которой мутации Gin552—»Glu и Asn605—»Thr также выделены как маркерные. В тоже время канонические мутации - Thr338—»Ala, Pro, Gly в активном центре фермента наряду с Arg384—»Gly, по-видимому, играют лишь вспомогательную роль в формировании клинической устойчивости. Обсуждая вариабельность транспептидазного домена ПСБ 2Х, необходимо отметить отсутствие изолятов с мутациями Phe339—»Met и Met400—»Thr, что может объясняться региональными особенностями S. pneumoniae и требует дальнейших исследований для уточнения этого предположения.

Диагностическая значимость установленных маркеров устойчивости пневмококка к пенициллину - pbp2bmat, pbpAmut и замены в кодонах Не371, Gin552 и Asn605 гена рЪрХ, была продемонстрирована путем сравнения распределения «выведенных» на основании генотипа категорий чувствительности с данными бактериологического тестирования этой же выборки (рис. 5).

■устойчивые

Рисунок 5. Сопоставление распределения изолятов по категориям чувствительности к пенициллину на основании данных генетического и бактериологического тестирования. Категория «устойчивые» включает все изоляты со сниженной чувствительностью к пенициллину.

Полученное распределение, не имеющее достоверных отличий между двумя методами тестирования (р>0,05), указывает на адекватность выбранных маркеров и перспективность применения генетического исследования как для индивидуальной оценки чувствительности пневмококка к ß-лактамным антибиотикам, так и для мониторинга распространения генетических детерминант устойчивости в популяции.

Сходное по идеологии исследование распределения мутаций в генах гираз (gyrA, gyrB) и топоизомераз (рагС, рагЕ) позволило установить ассоциацию одновременного обнаружения мутаций в генах gyrA и рагС с клинической устойчивостью S. pneumoniae к фторхинолонам. Наличие мутаций только в одном из рассмотренных генов не приводит к формированию значимой устойчивости к левофлоксацину и мок-сифлоксацину, что не противоречит данным литературы [Balsalobre, 2003; Heather, 2007], однако может рассматриваться как маркер начавшихся мутационных процессов в популяции.

В целом, высокая диагностическая чувствительность отобранных генетических маркеров дает основание утверждать о применимости разработанной системы геномного сканирования мутаций как в диагностических целях, так и в мониторинге лекарственной устойчивости пневмококка, что особенно важно для своевременного предотвращения распространения изолятов, несущих детерминанты устойчивости на фоне клинической чувствительности к ß-лактамным антибиотикам и фторхинолонам.

Молекулярный мониторинг генетически детерминированной лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis

В ходе исследования впервые осуществлено молекулярное типирование обширной коллекции клинических изолятов М. tuberculosis (п = 693), собранных из разных регионов России, по 13-ти маркерным сайтам, расположенным в четырех локусах геномной ДНК - RRDR гена гроВ, ген katG и регуляторная область inhA и ген етЬВ -

мутации в которых обуславливают устойчивость к рифампицину (RIF), изониазиду (INH) и этамбутолу (ЕМВ).

Всего мутации в RRDR обнаружены у 323 (88,0 %) из 369 устойчивых к RIF изолятов М. tuberculosis. В проанализированной выборке найдено шестнадцать вариантов однонуклеотидных замен в кодонах 533, 531, 526, 516 и 511 гена гроВ и один вариант вставки между кодонами 513 и 514. Ни один из изолятов не имел изменений в кодонах 513 и 522. Среди замен преобладали мутации в Ser531, обнаруженные у 42,5 % от общего числа изолятов. Наибольшее число вариантов мутаций - семь - выявлены в His526 среди 32 (4,6 %) изолятов. Четыре варианта замен найдено в Asp516 у 28 (4,0 %) образцов. Всего мутации в кодонах 531 и 526 гена гроВ, приводящие к высокому уровню устойчивости к RIF, выявлены у 327 (47,2 %) микобактерий, в кодонах 533, 516, 511, ассоциированные с умеренной устойчивостью, - у 44 (6,3 %).

Среди 324 изолятов, чувствительных к RIF по методу абсолютных концентраций, 266 (82,0 %) не несли мутаций в изучаемой области гена гроВ. У 58 изолятов выявлены мутации в RRDR, из них у 39-ти - в Ser531. Однако, определение ингибирую-щей концентрации RIF для этих микобактерий показало, что 15 из них устойчивы к концентрациям RIF меньшим или равным критической. Данное наблюдение подчеркивает актуальность генетического тестирования, поскольку устойчивость таких изолятов не выявляется в ходе регламентированного Приказом № 109 МЗ РФ бактериологического тестирования, однако может иметь клиническое значение при последующей химиотерапии.

Генетические маркеры устойчивости к INH (мутации в локусах kaíG и inhA) обнаружены в общей сложности у 426 (92,2 %) изолятов из 462 фенотипически устойчивых. Устойчивость оставшейся группы изолятов может быть вызвана мутациями в других генах, например, kasA (ген р-кетоацил-АПБ-синтетазы), ndh (ген НАДН-дегидрогеназы), ahpC (ген алкилгидропероксидредуктазы), потенциально вовлеченных в процесс формирования устойчивости к INH и не затронутых в данном исследовании. Изолированные мутации в кодоне Ser315 гена kaíG обнаружены у 402 (58,0 % от общего числа) изолятов, в области inhA - у 9 (1,3 %). Сочетание мутаций в обоих локусах наблюдалось в 59 (8,5 %) случаях. В целом у 461 (66,5 %) изолятов выявлены мутации, приводящие к высокому уровню устойчивости к INH.

Среди 231 изолятов, чувствительных к INH по методу абсолютных концентраций, 187 (81,0 %) не несли мутаций в изучаемых областях. Обнаружение в оставшихся образцах мутаций в локусе inhA и кодоне Ser315 гена katG может свидетельствовать о начавшемся процессе формирования клинической устойчивости к INH.

Обладая высокой аналитической чувствительностью - до 50 микробных клеток в образце - примененная методика обнаружения генетически-детерминированной устойчивости к RIF и INH продемонстрировала высокую диагностическую чувствительность - 88 % и 92 %, соответственно. Этот факт дает основание утверждать о применимости технологии минисеквенирования с последующей МАЛДИ ВМС для

анализа клинического материала - мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, минуя стадию бактериологического посева.

Известно, что структура мутаций и частоты встречаемости мутантных кодонов у М. tuberculosis различаются в зависимости от географии выделения штамма [Bottger, 2008]. Среди исследованных в нашей выборке изолятов наиболее часто точечные мутации, обуславливающие устойчивость к RIF, были обнаружены в кодонах Ser351, His526 и Asp516 гена гроВ, составляя 76,6 %, 10,7 % и 9,2 % от общего числа мутаций, соответственно. Подобное распределение характерно для многих регионов Российской Федерации [Gryadunov, 2005; Nikolayevsky, 2004]. Однако, в ряде областей наблюдаются и некоторые отличия. В частности, в Северо-Западном регионе отмечается преобладание замен в Gin513 RpoB (10,0 %) над мутациями в Asp516 (3,3 %) [Gryadunov, 2005], тогда как в настоящей выборке подобная замена была обнаружена лишь у одного устойчивого к RIF изолята.

Общая частота встречаемости точечных мутаций в кодонах Met306 и Gly406 гена етЬВ среди резистентных к ЕМВ изолятов была невысокой - около 54,0 % (97 из 181). Наши данные согласуются с представленными ранее для Северо-западного региона России (от 48,6 до 54,0 %) [Gryadunov, 2005] и Латвии (52,0 %) [Toungoussova, 2002], что свидетельствует о низкой информативности выявления этих мутаций при мониторинге устойчивости к ЕМВ.

С другой стороны, в группе чувствительных изолятов 63 из 71 (88,7 %) не имели перечисленных мутаций. Для шести из оставшихся восьми изолятов ингибирую-щая концентрация ЕМВ составила 2 мг/л, что объективно не позволяет рассматривать их как чувствительные. Все это подчеркивает значимость генетического тестирования, поскольку устойчивость таких изолятов не обнаруживается при стандартном бактериологическом исследовании, но может повлиять на эффективность терапии.

В тоже время, обнаружена достоверная связь между частотой встречаемости мутаций в гене етЬВ и числом препаратов, к которым устойчив изолят (табл. 4).

Таблица 4. Частоты встречаемости мутаций в кодонах 306 и 406 гена етЬВ в зависимости от профиля лекарственной устойчивости изолята М. tuberculosis.

'Феиотипическая устойчивость Число Число изолятов с мута- 2 изолятов циями в гене embB\ N(%) * ^

Чувствительные Устойчивые к одному препарату; RIF или INH или ЕМВ Устойчивые к двум препаратам; RIF.INH или RIF.EMB или INH, ЕМВ Устойчивые к трем препаратам; RIF, INH и ЕМВ 43 0 группа сравнения 24 1 (4,1) 1,8 0,1775 29 8 (27,5) 13,34 0,0003 169 96(57,1) 45,97 <0,0001

- устойчивость определена методом абсолютных концентраций. RIF - рифампицин, INH - изониазид, ЕМВ -эгамбутол.

Мутации в кодонах Met306 и Gly406 встречались достоверно чаще среди мульти-резистентных (MDR) изолятов (113/204; 55,4 %), чем среди моноустойчивых и чувствительных (4/81; 4,9%) (х2 = 60,99; р<0,001). Стоит отметить, что пять из восьми изо-22

лятов, чувствительных к ЕМВ, но имеющих мутации в гене етЬВ, имели MDR фенотип. При сравнении относительных частот мутаций в кодонах Met306 и Gly406 гена етЬВ в двух группах: MDR-изоляты, не имеющие генетических детерминант устойчивости к рифампицину и изониазиду, и MDR-изоляты, содержащие мутации в генах rpoB, katG и локусе inhA, значимых различий обнаружено не было (х2 = 0,02; р=0,90). Таким образом, генетические детерминанты MDR и мутации в гене етЬВ не связаны между собой, несмотря на то, что наблюдается статистически значимая ассоциация этих замен с MDR фенотипом.

Ранее подобное наблюдение было сделано для мутаций в кодоне Met306 гена етЬВ [Мокроусов, 2002], однако мутации в кодоне Gly406, как маркер MDR фенотипа, до настоящего времени не рассматривались.

Учитывая, что распространение множественной лекарственной устойчивости представляет особую проблему во многих областях медицины, включая фтизиатрию, очевидна необходимость в развитии и внедрении новых подходов для быстрого выявления MDR-изолятов М. tuberculosis. Исходя из наблюдения ассоциации мутаций в локусах етЬВ306/406 с MDR-фенотипом, мы предприняли попытку оценить возможности использования данного генетического локуса для быстрой диагностики MDR.

В исследованной выборке анализ локусов ея;ЬВ306/406 для определения MDR-фенотипа обладал низкой диагностической чувствительностью - около 55,0 % (102/185), но высокой специфичностью - 95,0 % (77/81). При этом диагностическая чувствительность определения MDR на основании двух генетических маркеров - ло-кусы гроВ и katG/inhA - составила 89,2 % (165/185), однако при использовании трех локусов - embB3Q6/406, гроВ и katG/inhA - чувствительность возрастала до 94,6 % (175/185).

Таким образом, использование комбинированного анализа перечисленных генетических локусов может рассматриваться как достаточно интересный и перспективный подход, при помощи которого можно повысить эффективность своевременного обнаружения MDR-изолятов М. tuberculosis, и обеспечить разработку мероприятий по предотвращению их появления и распространения в человеческой популяции.

Изучение закономерностей распространения генетических маркеров резистентности среди клинических изолятов N. sonorrhoeae.

В исследование включены 15 генетических локусов, для которых в литературе имеются указания на причастность к формированию устойчивости гонококка к применяемым в практике АМП [Ни, 2005; Ropp, 2002; Lindback; 2006]. В настоящей работе впервые все известные механизмы резистентности N. gonorrhoeae рассмотрены в совокупности, показана возможность прогнозировании лекарственной устойчивости на основании генетического тестирования и осуществлено молекулярное типирование клинических изолятов, собранных в различных регионах России.

О наличие плазмидных механизмов резистентности к пенициллину и тетрациклину судили на основании обнаружения гена ЫаТЕМ1 [3-лактамазы и TetM детерми-

нанты, соответственно. Для оценки специфических хромосомных механизмов формирования устойчивости к пенициллину, тетрациклину и фторхинолонам, в первом случае рассмотрены мутации генов ропА и реп А, кодирующих ПСБ 1 и 2, во втором - мутация в гене rpsJ, кодирующем рибосомальным белок S10, в третьем - мутации в QRDR генов гиразы (gyrA) и топоизомеразы IV (рагС).

Кроме того, исследованы мутации в кодирующей и промоторной областях гена mtrR, продукт которого отвечает за активацию неспецифического эффлюкса АМП и мутации в локусе репВ гена рогВ, приводящие к снижению проницаемости мембранного белка порина для ксенобиотиков. Перечисленные механизмы являются неспецифическими в отношении исследуемых АМП. Поскольку мутации в локусе репС гена pilQ мембранного белка секретина носят вспомогательный характер [Zhao, 2005], они не были включены в общую панель генетических тестов.

Проведенный анализ встречаемости генетических детерминант лекарственной устойчивости показал, что их отсутствие достоверно ассоциируется с клинической чувствительностью N. gonorrhoeae к исследованным классам АМП. Также в категорию чувствительных попали большинство гонококков, имеющих изолированные мутации в локусах репВ, mtrR, репА или rpsJ, потенциально вовлеченных в формирование устойчивости к пенициллинам и тетрациклинам (табл. 5).

При исследовании молекулярных механизмов устойчивости к пенициллину, для 54 (11,6 %) изолятов, относящихся к дикому генотипу (отсутствие мутаций в хромосомных локусах и гена ЫатЕмд, установлена достоверная ассоциация с чувствительным фенотипом (х2 = 134,3, р<0,001). Для остальных изолятов были выявлены одиннадцать различных комбинаций генетических маркеров, потенциально вовлеченных в формирование резистентности к пенициллину.

Четыре генотипа (ponAmat, репАтл), (ропАтиЬ репАтаЬ rntrRmut), (ропАтпЬ репАтЛ, репВтиt) и (ропАшл, репАтиЬ репВтл, mtrRmut) преобладали в исследованной выборке и были обнаружены у 39 (8,4 %), 62 (13,4 %), 76 (16,4 %), и 133 (28,7 %) изолятов, соответственно. Для всех этих генотипов была показана достоверная ассоциация с невосприимчивостью гонококка к пенициллину (х =281,7, р<0,001).

Присутствие гена blaTEM-i обнаружено у 18 изолятов со следующей географической принадлежностью: Санкт-Петербург (п = 5), Самара (п = 5), Москва (п = 4), Чебоксары (n = 1), Мурманск (n = 1), Нижний Новгород (n = 1), Екатеринбург (n = 1). Все изоляты, содержащие tetM-детерминанту (п = 4), относились к Московскому региону, что свидетельствуют о большей распространенности плазмидных маркеров резистентности в субпопуляции гонококка крупных промышленных и торговых центров с числом жителей, превышающим один миллион. Однако, общая частота встречаемости плазмидных факторов устойчивости в популяции гонококка оказалась низкая -менее 4,0 % для исследуемой выборки.

Таблица 5. Чувствительность к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину изолятов N. gonorrhoeae с различными генотипами. S - чувствительные, I - изоляты с промежуточным уровнем устойчивости, R — устойчивые изоляты. Категории установлены в соответствии с рекомендациями CLSI(vvmv.cfai.org). Серым выделены генотипы, достоверно ассоциированные с резистентностью.

Генотип

N (%) изолятов

N (%) изолятов по чувствительности к АМП S I R

Пенициллин

4wt 54(11,6) 49 (90,7) 5(9,3) 0 (0,0) p<0,001

penAmut 51 (9,4) 25 (49,0) 24 (47,1) 2 (3,9) p>0,05

5/ntrRmut 1 (0,2) 1 (100,0) 0 0 -

репВти, 2 (0,4) 2(100,0) 0 0 -

репА mul, репВт, 7(1,5) 2 (28,6) 5(71,4) 0 p>0,05

penAmu smtrSm„, 15(3,2) 5 (33,3) 9 (60,0) 1 (6,7) p>0,05

репАтЫ, penBmt, srntrRmut 6(1,3) 3 (50,0) 3 (50,0) 0 p>0,05

репАшл ponAmt 39 (8,4) 6(15,4) 31 (79,5) г (5,i) p<0,001

penAml, ponA„„ 5mlrRmut 62 (13,4) 6(9,7) 51 (82,3) 5(8,0) p<0,001

репАатрепВш,.ропАтт 76(16,4) 6 (7,9) 63 (82,8) 7(9,2) p<0,001

penAn„„ penB„m, ponAmu„ smtrRm„, 133 (28,7) 15(11,3) 95 (71,4) 23 (17,3) p<0,001

ЫатЕМ!ът 18(3,9) 0 3(16,7) 15 (83,3) p<0,001

Всего 464 120 (25,9) 289 (62,2) 55 (11,9)

Тетрациклин

4wt 91 (19,6) 76 (83,5) 15 (16,5) 0 p<0,001

smlrRm]it 3 (0,6) 3(100,0) 0 0 -

penBmM 3 (0,6) 2 (66,7) 1 (33,3) 0 p>0,05

rpsJmt 59 (12,7) 18 (30,5) 30 (50,8) 11 (18,7) p<0,05

rpsJmu, 78 (16,8) 2! (26,9) 21 (26,9) 36 (46,2) p<0,01

rpsJm„penB„, 87 (18,8) 18 (20,7) 22 (25,3) 47 (54,0) p<0,01

rpsjmui, penBma, !mlrRmM 139(30,0) 29 (20,9) 32 (23,0) 78 (56,1) p<0,01

6letM„„ 4 (0,9) 0 0 4 (100,0) p<0,01

Всего 464 167 (40,0) 119(25,6) 178(38,4)

Ципрофлоксацин

\vt 150(32,2) 149 (99,3) 1 (0,7) 0 p<0,001

smtrRmu 85(18,3) 82 (96,5) 0 3 (3,5) p<0,001

gyrA^, 17 (3,7) 2(11,8) 1 (5,9) 14 (82,3) P<0,001

parCna 4 (0,1) 1 (25,0) 0 3 (72,0) p>0,05

gyvimut, smlrRmlit 6(1,3) 2 (33,3) 0 4 (66,7) p>0,05

parCmM, sm(rRm„, 13 (2,8) 2(15,4) 0 11(84,6) p<0,001

g>'rAmM, parCmu, 70(15,1) 1 (1,4) 0 69 (98,6) p<0,001

gyrA„„ parCma. smtrRmu, 119(25,6) 12(10,1) 0 107(89,9) p<0,001

Всего 464 251 (54,1) 2 (0,4) 211 (45,5)

- совокупность генетических детерминант, отобранных для изучения закономерностей формирования устойчивости к пенициллину, тетрациклину и фторхинолонам, соответственно;

3 — достоверность различий между изолятами, относящимися к различным категориям чувствительности внутри одного генотипа (использован двухсторонний точный критерий Фишера);

4 - wild type (дикий тип) - отсутствие изменений нуклеотидной последовательности в локусах, вовлеченных в формирование устойчивости к пенициллину, тетрациклину и фторхинолонам, соответственно;

5 - совокупность нуклеотидных мутаций, обнаруженных как в кодирующей области гена mtrR, так и в его промоторе;

6 - комбинация присутствия гена ЫаТЕш или tet(M) детерминанты с любыми вариациями нуклеотидных последовательностей других локусов.

Настоящее исследование позволило внести некоторые коррективы в сложившуюся картину формирования резистентности гонококка к пенициллину. Так, изолированная мутация Asp345a в ПСБ 2 (ген репА ) традиционно рассматривалась как первая ступень приобретения устойчивости к пенициллину, приводящая к увеличению МПК до 0,12 - 0,25 мг/л [Brannigan, 1990; Dowson, 1989]. В нашем исследовании эта

закономерность не нашла подтверждения. Для изолятов с репАтЛ генотипом (п = 51), равно как и для 28 изолятов, несущих изолированные мутации в локусах репВ или mtrR в сочетании с репА, не удалось выявить достоверной ассоциации с устойчивым фенотипом (р>0,05). Большинство устойчивых к пенициллину изолятов гонококка (п = 310) имели мутации в генах репА и рои А в комбинации с любым вариантом нук-леотидной последовательности в локусах репВ и mtrR. И хотя ранее замена Leu421—»Pro в ПСБ 1 (ген ропА) рассматривалась только как дополнительная ступень в процесс формирования устойчивости к пенициллину [Ropp, 2002], настоящие данные свидетельствуют о важности этой мутации. Сходные результаты были получены в более узком исследовании (без анализа локусов репВ и mtrR) на выборке из 120 гонококков [Vernel-Pauillac, 2006]. Закономерно, что высокая устойчивость к пенициллину характерна для изолятов гонококка, несущих мутации во всех исследованных областях.

Как и следовало ожидать, большинство устойчивых к тетрациклину изолятов гонококка либо несли плазмидную Tet(M) детерминанту (п = 4), либо имели мутации в локусах rpsJ, mtrR и репВ хромосомной ДНК. Изоляты N. gonorrhoeae, в которых перечисленные маркеры не обнаружены (п = 91), были чувствительны или умеренно устойчивы к тетрациклину (МПК <1,0 мг/л). Аналогичная тенденция наблюдалась для 6 изолятов с мутациями в локусах mtrR или репВ.

Хотя для 59 гонококков, несущих изолированную мутацию Val45—>Met в рибо-сомальном белке S10 (ген rpsJ), не удалось установить связь с устойчивым фенотипом (р>0,05), остальные выявленные у 304 изолятов генотипы - (rpsJmub mtrRmnl), (rpsJmnt, penBmai) и (rpsJmш, репВыих, mtrRmilt), достоверно ассоциировались с лекарственной устойчивостью (% = 163,1, р<0,001). Настоящее заключение полностью согласуется с первоначальной точкой зрения на мутацию в гене rpsJ как дополнительный механизм развития устойчивости к тетрациклину [Ни, 2005].

Продемонстрирована достоверная ассоциация между выявлением различных комбинаций мутаций в QRDR гиразы (ген gyrA) и топоизомеразы (ген рагС) и устойчивостью гонококка к фторхинолонам (х2= 404,1, р<0,001). Стоит отметить, что два генотипа - (gyrAmM, mtrRmu,) и (parCmut) встречались крайне редко, что не позволило объективно оценить их роль в формировании резистентности.

В целом, анализ распределения отдельных маркеров и их сочетаний в группах чувствительных и устойчивых изолятов гонококка позволил отобрать генотипы, пригодные для прогнозирования лекарственной устойчивости гонококка к пенициллину, тетрациклину и фторхинолонам с высокой достоверностью (р<0,01) (выделены серым в табл. 5). Достоверность предсказания фенотипической устойчивости на основании отобранных маркеров (генотипов) составила 90,3 % для фторхинолонов, 91,1 % для пенициллина и 81,9 % для тетрациклина. Однако, даже в случае тетрациклина, детерминанты резистентности к которому отобраны с наименьшей достоверностью (р<0,01), нет значимых различий при сопоставлении «выведенных» на основании ге-26

нотипа категорий чувствительности с данными бактериологического исследования (рис. 6).

□ чувствительные

Рисунок 6. Сопоставление распределения изо-лятов гонококка (п = 129) по категориям чувствительности к тетрациклину на основании данных генетического и микробиологического тестирования. Категория «устойчивые» включает все изоляты со сниженной чувствительностью к тетрациклину.

В ходе работы продемонстрирована также возможность обнаружения генетических детерминант устойчивости в препаратах геномной ДНК N. gonorrhoeae, выделенной непосредственно из клинического материала. При такой постановке анализа первичная идентификация гонококка может быть осуществлена любыми методом генодиагностики, в том числе с применением ДНК-микроматриц. Сходная идеология прослеживается в исследовании Martin, 2007, продемонстрировавшем возможность молекулярного типирования ДНК гонококка, экстрагированной из ткани.

В совокупности, рассмотренные результаты тестирования клинических изоля-тов пневмококка, гонококка, туберкулеза иллюстрируют качественный скачок в процессе реформирования существующих систем мониторинга путем внедрения средств молекулярного анализа. Выбор перечисленных возбудителей, как модельных для создания на основе МАЛДИ ВМС технологии выявления нуклеотидных полиморфизмов в геномах бактерий применительно к тестированию лекарственной устойчивости, был обусловлен их несомненной клинической значимостью и позволил нам продемонстрировать универсальность разработанной методики для грамположительных (S. pneumoniae, М. tuberculosis) и грамотрицательных (N. gonorrhoeae) бактерий. Причем, если гонококк можно охарактеризовать как типичный микроб с хорошо развитыми адаптивными механизмами регулирования проницаемости клеточной стенки и эф-флюкса, легко обменивающийся генетическим материалом с другими микроорганизмами, то микобактерии, ограниченные малопроницаемой восковой капсулой, представляют замкнутую систему, возникновение лекарственной устойчивости в которой происходит исключительно за счет геномных мутаций.

2.2.4. Молекулярно-генетическое исследования популяционного полиморфизма вирусов гепатита В и С.

Используя технологическую платформу, эффективно примененную для обнаружения генетически-детерминированной лекарственной устойчивости бактериальных патогенов, нами были разработаны методы молекулярного типирования ДНК ВГВ и РНК ВГС, позволяющие оценить вариабельность этих вирусов.

На основании сравнительного анализа последовательностей рге-81/рге-82 области ДНК ВГВ и 5' нетранслируемой области (5' иТЯ) РНК ВГС выделены кластеры типоспецифичных однонуклеотидных замен, регистрация которых дает возможность установить генотип вируса, и подобраны соответствующие олигонуклеотидные прай-меры для проведения реакций амплификации и минисеквенирования с последующей МАЛДИ ВМС детекцией.

Методику типирования ВГВ применили для исследования образцов сыворотки, полученных от 260 пациентов с хроническим гепатитом В. В 103 (39,6 %) образцах обнаружена ДНК ВГВ. Среди них у 7 (6,8 %) больных установлен генотип А ВГВ, у 4 (3,9 %) - генотип С, и у 86 (83,5 %) - генотип Б. У шести пациентов (5,8 %) выявлено смешанное инфицирование генотипами Б и С вируса.

Полученные нами данные отличаются от представлений, сложившихся по результатам исследования 2000 года, когда на европейской части России доминировал генотип Б ВГВ (99 %), а остальные генотипы практически не встречались [Могогоу, 2000]. Обнаружение генотипов А и С среди проанализированных образцов можно объяснить интенсивной миграцией населения из Якутии, Кавказского и Азиатского региона, где процентное соотношение генотипов А и С относительно генотипа Б намного выше. В пользу этого утверждения свидетельствует меньшее разнообразие генотипов ВГВ, выявленных в Санкт-Петербурге [Писарева, 2007], где уровень миграции объективно ниже.

Система генотипирования ВГС была апробирована на ВГС-позитивных образцах из лабораторного банка сывороток, протестированных также аллель-специфичной амплификацией для установления генотипа вируса [Ильина, 2002]. Среди исследованных 69 образцов генотип вируса 1а выявлен в 4,5 % случаях, 1в - 48 %, 2а - 4,5 %, За - 29 %, 4-1,5 %. В 8 (12 %) образцах регистрируется микст-инфекция.

Долгое время о распространенности различных генотипов ВГС на территории РФ судили по данным НИИ вирусологии им. Ивановского [Львов, 1997], декларировавших тотальное преобладание 1Ь генотипа вируса. Эпидемиологическая картина распространенности различных генотипов ВГС в Москве не отличалась от таковой по стране в целом. Наши данные указывают на снижение доли генотипа 1Ь среди ВГС-инфицированных жителей Москвы и возрастание числа пациентов, инфицированных За генотипом ВГС и имеющих микст-инфекцию. Кроме того, применение предложенной схемы типирования позволило выявить генотип 4 ВГС, что повысило эффективность методики до 100 %.

Сам факт использования разработанной технологии для анализа как бактериальной, так и вирусной ДНК (или РНК в случае ВГС) указывает на универсальность предложенного нами подхода. Будучи реализован в плашечном формате, этот метод дает возможность использовать роботизированные системы для разнесения образцов и реагентов, автоматизированные алгоритмы считывания результатов. Внедрение данного подхода, позволяющего осуществлять одновременное тестирования

96/384/1536 образцов, может значительно ускорить масштабные исследования, направленные на мониторинг распространения ВГВ и ВГС в нашей стране. В тоже время, метод минисеквенирования имеет явное преимущество перед прямым считыванием нуклеотидной последовательности, поскольку позволяет однозначно выявлять случаи смешанного инфицирования вирусами с различными генотипами.

2.2.5. Молекулярное типирование бактериальных патогенов

Преобладание хромосомных механизмов формирования резистентности, распространяющихся клонально в микробных популяциях, диктует необходимость дополнения средств генетического тестирования резистентности средствами штаммово-го типирования, нацеленными на отслеживание путей распространения инфекции.

Поскольку для популяции пневмококка существуют общепризнанные стандартные методы типирования - MLST и серотипирование на основании капсидных антигенов, основное внимание в этой области было уделено типированию туберкулеза и гонококка. Причем ставились задачи оценить пригодность разнообразных методов для решения конкретных эпидемиологических задач, связанных с молекулярно-генетической характеристикой и оценкой природного разнообразия бактериальных популяций, а так же поиска закономерностей распространения лекарственной устойчивости.

Среди существующего разнообразия методов типирования туберкулеза основное внимание уделено двум - сполиготипирование и мультилокусное VNTR типирование, первый из которых является специфичным для М. tuberculosis. Его применение ограничивается изучением популяции микобактерий, поскольку основывается на определении структуры уникального генетического элемента (т.н. DR-региона) методом гибридизации. Второй подход - VNTR типирование - является достаточно универсальным и применяется для изучения генетического разнообразия многих микроорганизмов [Van Belkum, 2007].

Оба метода использованы для типирования ограниченной группы клинических изолятов (п = 115), выделенных от больных легочным туберкулезом жителей Москвы и Московской области (проживание не менее 5-ти лет). Согласно данным сполиготи-пирования, исследованная выборка разделена на 20 сполиготипов, входящих в состав 15 генетических семейств. Наибольший кластер образован 76-ю (66,0 %) изолятами, относящимися к семейству Beijing. Гораздо меньше изолятов входило в состав двух следующих по величине семейств - LAM и Т, 12 (10,4 %) и 10 (8,7 %) изолятов, соответственно. Шесть изолятов имели уникальный генотип, не представленный в международных базах данных. Разрешающая способность метода сполиготипирования оказалась весьма низкой (D = 0,59).

При этом для штаммов, принадлежащих к преобладающему в исследуемой выборке генетическому семейству Beijing, значение индекса разнообразия Симпсона составило всего 0,08. В то же время, для группы штаммов, не относящихся к этому семейству, разрешающая способность сполиготипирования оказалась весьма высокой

(D = 0,94). Однако, учитывая, что большая часть изолятов (66,0 %) в исследованной выборке относилась к семейству Beijing, становится очевидным, что использование метода сполиготипирования без комбинации с другими схемами молекулярно-эпидемиологического анализа, недостаточно эффективно для мониторинга М. tuberculosis в России.

Значительное преобладание в исследуемой выборке изолятов, относящихся, по данным сполиготипирования, к семейству Beijing, является характерной особенностью популяции М. tuberculosis, циркулирующей на территории Российской Федерации [Drobniewski, 2005], а также в странах - бывших республиках СССР и многих регионах мира (Азия, Южная Африка, Северная Америка) [Bifani, 2002]. В качестве одной из причин широкой мировой экспансии штаммов этого семейства предполагается ассоциация генотипа Beijing с устойчивостью (в т.ч. и MDR) к противотуберкулезным препаратам [Bifani, 2002].

В исследованной нами выборке MDR-изоляты также достоверно чаще встречались среди семейства Beijing (59/76; 77,6 %), чем среди других семейств (17/39; 43,6 %) (х2 = 13,3; р<0,001), что подтверждает ведущую роль изолятов семейства Beijing в распространении мультирезистентного туберкулеза в Московском регионе.

Анализ разнообразия исследованной микробной популяции при помощи 24-х локусного VNTR типирования позволил обнаружить 71 различных генетических вариантов, из которых 59 (83,0 %) были уникальными (выявлялись только у одного изо-лята в выборке). Остальные 56 изолятов М. tuberculosis образовывали 12 кластеров. Три основных кластера имели VNTR-профили 223325173533424454433672, 223325153533424454433682 и 22332513533424454433662 и включали 13 (11,3 %), 12 (10,4 %) и 9 (7,8 %) изолятов М. tuberculosis, соответственно. Необходимо отметить, что изоляты, образующие основные кластеры, входили в состав крупной эволюцион-но близкой группы. Разрешающая способность 24-х локусного VNTR-анализа значительно превосходила таковую для сполиготипирования - 0,97 и 0,59, соответственно.

Различная степень вариабельности тех или иных VNTR локусов позволила рассмотреть возможность оптимизации схемы VNTR типирования М. tuberculosis за счет исключения локусов, характеризующихся низким полиморфизмом. При этом шесть отобранных нами локусов (MIRU-26, MIRU-31, ETR-A, М tub21, QUB-1 lb и QUB-26), отличающихся наибольшим индексом вариабельности (более 0,5), обеспечивали высокую разрешающую способность (D = 0,94), приближающуюся к значениям разрешающей способности всей совокупности 24 локусов. Как показывают исследования других авторов [Wada, 2007], подобный подход, направленный на оптимизацию протокола VNTR анализа за счет формирования альтернативной комбинации локусов с учетом молекулярно-генетических особенностей региональной микробной популяции, представляется весьма интересным и перспективным для использования в системах национального мониторинга туберкулезной инфекции.

Сравнение разрешающей способности комбинаций различных методик геноти-пирования, использованных в данной работе (табл. 6) показало, что наилучшие результаты достигаются путем сочетания сполиготипирования с 24-х локусным VNTR анализом.

Таблица 6. Сравнительная характеристика использованных методов молекулярно-генетического типирования клинических изолятов М. tuberculosis.

Метод, исследуемая группа изолятов Общее число 'Число уникальных Число кластеров Размеры кластеризованных 5D

генотипов генотипов групп

Сполиготипирование Все изоляты 26 19 7 2-73 0,591

Изоляты семейства Beijing 3 1 2 2-73 0,077

Изоляты, не относящиеся 23 18 5 2-8 0,935

к семейству Beijing

VNTR-анализ, все изоляты

224-VNTR 71 52 12 2-13 0,968

312-MIRU-VNTR 48 36 12 2-27 0,900

"6-VNTR 49 36 13 2-20 0,940

Сполиго+24-VNTR

Все изоляты 74 63 11 2-13 0,973

Изоляты семейства Beijing 36 26 10 2-13 0,953

Сполиго+12-MIRU-VNTR

Все изоляты 53 42 И 2-25 0,913

Изоляты семейства Beijing 17 И 8 2-25 0,801

Сполиго+6-VNTR

Все изоляты 56 44 12 2-20 0,945

Изоляты семейства Beijing 22 14 8 2-20 0,880

Уникальный генотип - генотип, представленный в исследуемой выборке одним штаммом. 2 24-VNTR - типирование с использованием 24 локусов: MIRU-2,4, 10, 16, 20, 23, 24,26,27, 31, 39,40; ETR-А, В, С; Mtub-04, 21,29, 30, 34, 39; QUB-1 lb, 26,4156

312-MIRU-VNTR - типирование с использованием 12 локусов: MIRU-2, 4, 10, 16,20, 23,24, 26, 27, 31, 39, 40 4 6-VNTR - типирование с использованием шести наиболее полиморфных локусов: MIRU-26, MIRU-31, ETR-A, М tub21, QUB-1 lb и QUB-26

SD - дискриминирующая способность метода, индекс Симпсона

Необходимо отметить, что это первый опыт применения VNTR типирования по 24 локусам для российских изолятов М. tuberculosis. Будучи изначально известным как микросателлитный анализ эукариотической ДНК, начиная с 2000 года, мультило-кусное VNTR типирование активно используется для исследования микроэволюции прокариот [Grissa, 2008]. При этом М. tuberculosis был первым микроорганизмом, для которого сформулирован принцип VNTR анализа [Supply, 2000]. Сейчас общедоступная база данных (http.y/minisatellites.u-psud.fr) содержит информацию о вариабельности числа тандемных повторов в геномах более чем 150 видов бактерий, и этот метод типирования продолжает активно развивается в силу своей универсальности, возможности автоматизации в исполнении, простоте интерпретации, точности и воспроизводимости получаемых данных.

В качестве потенциальных схем типирования N. gonorrhoeae в данной работе рассмотрены прямое масс-спектрометрическое профилирование, рог-типирование и мультилокусное типирование в двух вариантах реализации - мультиантигенное (NG-MAST) и мультилокусное секвенирование (MLST).

Осуществленное прямое масс-спектрометрнческое профилирование географически разнородной группы из 278 изолятов гонококка продемонстрировало постоянство получаемых масс-профилей, что полностью закрыло вопрос о возможности применения данной методики в штаммовом типировании гонококка.

Гетерогенность популяции на уровне изменчивости гена рогВ оценивали двумя способами, в основе которых лежал анализ практически полноразмерной (более 900 п.н.) нуклеотидной последовательности гена рогВ.

Первый подход заключался в установлении серотипа возбудителя на основании сравнении анализируемых последовательностей гена рогВ с представленными в базах данных по принципу максимальной гомологии. Предложенный анализ позволил относительно легко получить общее представление о гетерогенное™ популяции, причем в терминах серотипирования - традиционного метода молекулярно-эпидемиологической характеристики штаммов N. gonorrhoeae. Таким образом, данные генетического анализа, приведенные к формату «серотипирования» могут быть сопоставлены с уже накопленной в разных странах информацией о циркулирующих в популяции гонококка сероварах и серотипах.

Всего в исследованной выборке (п = 464) выявлено 11 Р1В и 6 Р1А серотипов, отмечено преобладание в выборке Р1В серовара (88,6 %) с высоким процентом встречаемости серотипов Р1В2 (41,3 %), Р1ВЗ (29,6 %) и Р1В22 (9,9 %). В группе штаммов, относящихся к Р1А серовару (11,4 %), доминирует серотип Р1А6 (71,2 %). Индекс разнообразия Симпсона, определяющий дискриминирующую способность метода, составил 0,78, что свидетельствует о низкой эффективности такого типирования.

Следует отметить, что убедительные данные о представленности основных серотипов гонококка для российской популяции получены впервые. Кроме того, сопоставление серотипа гонококка с профилем устойчивости позволило проверить гипотезу об ассоциации Р1В серовара с феноменом мультирезистентности. Установлено, что наблюдаемая ассоциация обусловлена известными изменениями локуса репВ, участвующими в формировании неспецифической устойчивости гонококка путем снижения проницаемости поринового канала для ксенобиотиков [Shafer, 2006].

Второй подход в типировании популяции гонококка на основании регистрации изменчивости гена рогВ состоял в прямом детальном сравнении нуклеотидных последовательностей, оценке их вариабельности, выявлении уникальных аллельных профилей. Такой подход, несомненно, дает более полное представление об изменчивости гена белка порина, более информативен с точки зрения объема и точности эпидемиологической информации, хотя и более трудоемок.

На выборке, состоящей из 103 клинических изолятов N. gonorrhoeae, полученных из 5-ти областных центров РФ - Иркутск (п = 22), Самара (п = 10), Архангельск (п = 28), Мурманск (п = 14), Санкт-Петербург (п = 29), осуществлен детальный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов рогВ, а также апробированы две альтернативные системы мультилокусного молекулярного типирования.

Среди исследованных изолятов 92 имели аллель lb генарогВ, соответствующую Р1В серовару, и 11 - аллель la (PIA серовар). Всего были выявлены 55 варианта гена рогВ, при этом обнаружена более высокая гетерогенность аллеля porBlb по сравнению porBla. Индекс разнообразия Симпсона данного метода типирования составил 0,96.

Кластерный анализ позволил разделить исследованную выборку на две крупные группы, соответствующие аллелям porBla и porBlb, а также выделить несколько групп внутри аллеля porBlb. Полученное распределение свидетельствует о высокой вариабельности исследованной выборки, однако, не отражает ни географию выделения исследованных изолятов гонококка, ни их фенотип.

Поскольку в современной эпидемиологии гонококка нет устоявшихся систем штаммовой дискриминации, кроме серотипирования, базирующегося на антигенной структуре белка порина, нами рассмотрены две альтернативные системы мультило-кусного молекулярного типирования, каждая из которых имеет шансы стать основной в эпидемиологии гонококка. Это мультиантигенное типирование (NG-MAST), оценивающее полиморфизм генов рогВ и tbpB [Martin, 2004] и мультилокусное секвениро-вание (MLST) [Maiden, 1998]. Причем в случае последнего был изучен расширенный набор генов с учетом их индивидуальной вариабельности.

По результатам NG-MAST вся анализируемая выборка изолятов (п = 103) оказалась разделена на 61 сиквенс-тип, что ощутимо больше, чем при рог-типировании (55 вариантов), однако сохранилось четкое разграничение между двумя сероварами. 57 (55 %) изолятов сформировали 15 различных сиквенс-типов, представленных двумя и более изолятами. Самые крупные из них были 206 (п = 6), 285 (п = 7), 1043 (п = 8) и 972 (п = 5). Остальные 46 сиквенс-типа были представлены одиночными изолятами, включая четыре Р-лактамазных гонококка. Стоит отметить, что наиболее распространенный в странах Евросоюза сиквенс-тип 225 [Palmer, 2008] обнаружен у единственного гонококка, изолированного в Иркутске. Рассчитанный индекс разнообразия Симпсона составил 0,98, что свидетельствует в пользу высокой дискриминирующей способности метода.

Анализ генетической вариабельности 13-ти генов «домашнего хозяйства», проведенный для той же группы клинических изолятов N. gonorrhoeae (п = 103), выявил существенные отличия в уровне их изменчивости. Причем полученные характеристики генов оказались сопоставимы с результатами аналогичного исследования, проводимого в это же время на группе из 204 гонококков, выделенных в клиниках Балтимора [Pérez-Losada, 2005].

Ориентируясь на максимально выявленное количество аллельных вариантов, обоснованным для дальнейшего использования в мультилокусном типировании гонококка выглядит набор 7 локусов: fumC, gdh, glnA, gnd, pilA, pyrD, serC. Этот перечень несколько отличается от применяемого для типирования N. meningitidis (abcZ, adk, aroE,fumC, gdh, pdhC, pgm) и предложенного как универсальный типирующий инструмент для всех нейссерий (N. meningitidis, N. lactamica и N. gonorrhoeae) в рамках

общедоступного MLST сайта (www.pubmlst.org), функционирующего на базе Оксфордского университета с 2006 года [Bennett, 2007].

Осуществленное по стандартному международному протоколу MLST гонококка разделило анализируемую выборку на 30 сиквенс-типов, индекс разнообразия Симпсона в этом случае составил 0,91. В случае типирования по максимально гетерогенным локусам: fumC, gdh, glnA, gnd, pilA, pyrD, serC, стало возможным разделить исследуемую выборку на 63 сиквенс-типа. Индекс разнообразия Симпсона при таком варианте MLST стал 0,98. В обоих случаях MLST позволило отойти от обязательного в формате рог-тппирования и NG-MAST разделения на серовары с выделением отличных от упомянутых методов групп изолятов.

Стоит отметить, что оба метода типирования - NG-MAST и MLST - так или иначе группируют изоляты гонококка согласно региону их выделения. Является ли это следствием клонального распространения гонококка в изолированных группах населения, или отражает миграционные процессы - вопросы будущих исследований. Однако, большая часть изолятов имела уникальные сиквенс-типы, не связанные между собой. Более того, исследуемая выборка содержала 39/61 (64 %) новых сиквенс-типов согласно NG-MAST схеме типирования и 24/30 (80 %) - согласно MLST.

Таблица 7. Сопоставление результатов кластеризации клинических изолятов гонококка с профилем устойчивости к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину. Чувствительный (S), устойчивый (R) фенотипы и фенотип с промежуточной чувствительностью (I) установлены согласно CLSI (wivw.clsi.org) критериям.

Сиквенс-тип по N(%) преобладающий фенотип чувствительности

MLST схеме типиро- изолятов (доля изолятов с данным фенотипом, %)

вания пенициллин тетрациклин ципрофлоксацин

1595 8 (7,8) *S/I S (87,5) S (100,0)

1892 8 (7,8) S (87,5) S (87,5) S (100,0)

1901 И (10,7) 1(100) R (90,1) R (100,0)

1905 11 (10,7) 1(81,8) R(81,8) S (100,0)

6716 25 (24,3) I (84,0) R (65,0) R (100,0)

6720 5 (4,8) Sfl S (100,0) S (100,0)

* - равное соотношения изолятов

Сопоставление данных молекулярного типирования гонококка с профилем устойчивости клинических изолятов позволило установить определенную закономерность в распространении резистентности для данной выборки. Изоляты, относящиеся к шести наиболее крупным кластерам, идентифицированным согласно международному протоколу МЕ8Т, имели сходный профиль устойчивости к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину внутри каждой группы (табл. 7).

Малый объем выборки не позволил сделать выводы о существовании в российской популяции гонококка крупных клональных комплексов с характерным фенотипом. Однако, опираясь на собственные данные, мы можем предполагать преимущественное распространение сиквенс-типов 6716 и 1901, для представителей которых характерны снижение чувствительности к пенициллину, устойчивость к тетрациклину и фторхинолонам.

Полученные результаты в полной мере отражают ситуацию, существующую в сфере молекулярного типирования гонококка. Поскольку обе схемы мультилокусного секвенирования - NG-MAST и MLST, были предложены почти одновременно, идет лавинообразное накопление информации о популяционной изменчивости гонококка в разных странах - Австралии [Martin, 2004], Швеции [Olsen, 2008], Китае [Yang, 2006]. Имеются даже сведения о NG-MAST типировании 76 образцов, изолированных на территории Архангельска [Unemo, 2007]. Закономерно, что среди исследованных изолятов также преобладали вновь идентифицированные сиквенс-типы - 37/48 (77 %). Из них три сиквенс-типа - 1534, 1544 и 1548 встретились среди проанализированной нами выборке и также относились к изолятам, выделенным в Архангельске.

В настоящий момент сложно сформулировать однозначное мнение о границах применимости использованных в настоящем исследовании методов типирования гонококка. Была продемонстрирована актуальность использования рог-типирования и/или NG-MAST для отслеживания путей передачи инфекции между половыми партнерами [Bilek, 2007; Liao, 2009], имеются указания на клональность распространения лекарственной устойчивости в популяции гонококка Южной Африки и Шотландии [De Jongh, 2008; Palmer, 2008]. В тоже время мультилокусное секвенирование, имеющее дело с консервативными фрагментами генома и фиксирующее более «древние» и стабильные генетические изменения, в большей степени отвечает задачам популяционной геномики по изучению микроэволюции микроба [Martin, 2008].

Таким образом, полученные данные вносят важный вклад в создание наиболее информативной, стандартизированной системы молекулярного типирования N. gonorrhoeae. Примечательно, что в основе всех методов, адекватных задачам молеку-лярно-эпидемиологического мониторинга гонококка (рог-типирование, NG-MAST, мультилокусное секвенирование) лежит выявление аллельных полиморфизмов нук-леотидной последовательности ДНК, что открывает возможность применения новых, более дешевых высокопроизводительных технологий сканирования бактериальных геномов.

В частности, уже продемонстрирована возможность использования направленной деградации нуклеиновых кислот с последующей МАЛДИ масс-спектрометрической детекцией для анализа нуклеотидной последовательности 7-ми локусов геномной ДНК N. meningitidis, необходимых для осуществления типирования возбудителя и установления его сиквенс-типа [Honisch, 2007].

2.3. Сравнительная протсомика гонококка для выявления новых механизмов формирования лекарственной устойчивости.

В ходе молекулярно-генетического мониторинга гонококка были отобраны 2 клинических изолята со сниженной чувствительностью к цефтриаксону (МПК= 0,06 -0,12 мг/л) и один изолят с МПК пенициллина 0,25 мг/л и генотипом репАти1. Для этого генотипа не установлена достоверная ассоциация с фенотипической устойчивостью и, возможно, в этом случае бактериальные клетки реализуют некие неизвестные спосо-

бы защиты от воздействия АМП. Оба рассматриваемых препарата относятся к р-лактамным антибиотикам, что позволяет предположить возможную общность механизмов устойчивости. В качестве контроля выбран клинический изолят, чувствительный ко всему спектру тестируемых АМП и не имеющий нуклеотидных перестроек в генах, вовлеченных в процессы формирования антибиотикорезистентности гонококка, и обладающий сходным с изолятами опытной группы Рог-типом (табл. 8).

Таблица 8. Микробиологическая и генетическая характеристика штаммов, отобранных для протеомного исследования.

Маркерный параметр

Контроль е03.04

Опыт

¡19.05

ch37.06

k51.05

У С

3 I &S

а г а. >5 я о

S &

а >>

Т X

в а

н g

X w

5 а. «

пенициллин цефтриаксон тетрациклин ципрофлоксацин спектиномицин азитромицин Рог-тип

ЫаТЕШ

репА (ПСБ 2) рои А (ПСБ 1)

репВ (PorBlb)

репС (PilQ) mtrR промотор; MtrR telM rpsJ( RS10)

gyrA (GyrA)

parC (ParC) rrs (16S pPHK)

0,015 <0,005 0,03 0,001 32,0 0,06 P1B3

wt wt

0,25 <0,005 0,25 0,002 32,0 0,5 P1B3

Asp345' wt

wt wt

2 0,06 2 16 32 0,12 P1B2

Asp345' Leu421—>Pro Gly120—»Lis; Ala'21—Asn wt

delA'35; wt

Val"—»Met Ser"->Phe, Asp95—»Gly Ser87—»Arg wt

4 0,12 4 16 32 0,25 P1B2

Asp345" Leu421—>Pro Gly120—>Lis; Ala12'-. Asp wt

delA"'5; wt

Val57—>Met Ser"-»Phe, Asp95—>Gly Ser87-» Arg wt

Поскольку именно протеомные методы рассматриваются сейчас как один из основных инструментов изучения живых систем, в рамках данной работы был проведен сравнительный анализ растворимой фракции клеточных белков изолятов е03.04 и ¡19.05, что позволило обнаружить белок порин на 2В карте изолята ¡19.05 (рис. 7, табл. 9).

Порин (РогВ1 белок) является компонентом внешней мембраны клетки, который формирует каналы для пассивной диффузии небольших молекул, включая антибиотики, в периплазматическое пространство. Поскольку визуализация мембранных белков требует специальных условий экстракции и проведения 2Б электрофореза, которые не были выполнены в данном эксперименте, факт обнаружения значительных количеств порина на протеомной карте изолята ¡19.05 потребовал адекватных объяснений.

Мы предположили, что это явление может быть вызвано нарушением процесса интеграции РогВ1 во внешнюю мембрану, в результате чего белок накапливается в цитоплазме, или периплазматическом пространстве. В таком случае уменьшение доли порина в составе наружной мембраны приводит к снижению проницаемости клеточ-

ной стенки для АМП и формированию устойчивости к пенициллину в синергизме с мутацией в гене реп А.

Рисунок 7. Электрофореграммы растворимой фракции клеточных белков изолятов N. gonorrhoeae е03.04 (А) и ¡19.05 (В) после культивирования на шоколадном GC агаре в стандартных условиях. Окраска серебром.

Таблица 9. Фрагмент сравнительной характеристики белкового профиля изолята ¡19.05 относительно е03.04. Серым выделены дифференциальные белки, идентифицированные как порин.

NCBI ID Наименование белка Количественное соотношение белка (i 19.05/е03.04)

2827064 59801382 РогВ precursor (предшественник белка внешней мембраны 1) о-фактор РНК-полимеразы 30369,0 1662,8

54043055 59801813 59801766 59802457 59800521 РогВ (белок внешней мембраны 1, порин) НАДФН-зависимая-флавинмононуклеотидредуктаза белок теплового шока 3 -кетоацилредуктаза АТФаза 1411,6 515.3 257,1 160.4 115,7

54043055 РогВ (белок внешней мембраны 1, порин) 93,8

59802114 59801106 фактор рециклизации рибосомы (RRF - ribosome recycling factor) изопролилмалатизомераза 81,0 76,2

54043055 РогВ (белок внешней мембраны 1, порин) 41,8

59800747 фенилаланин-тРНК-синтетаза 17,5

59801418 белок-шаперон CIpB 5,8

59800797 уранилфосфорибозилтрансфераза 5.8

7225623 пролнндегидрогеназа 5,7

Поскольку через порины в микробную клетку поступает также тетрациклин, в пользу выдвинутой нами гипотезы свидетельствовал факт повышения МПК тетрациклина у изолята ¡19.05 (0,25 мг/л) при отсутствии известных хромосомных мутаций. Экспериментально измеренное накопление пенициллина и тетрациклина клетками изолята ¡19.05 было в три раза меньше по сравнению с изолятом е03.04 и лабораторным штаммом АТСС 49226.

Анализ транскриптов подтвердил 10-ти кратное превышение уровня экспрессии мРНК порина в изоляте ¡19.05 по сравнению с е03.04. Однако, для изолята ¡19.05 не было зафиксировано отличий в нуклеотидной последовательности промоторной области гена рогВ, способных объяснить различия в экспрессии. Кроме того, отсутст-

Цитоппажо\

вие мутаций в области сигнального пептида РогВ, включающего первые 20 а.о. полипептидной цепи, показало, что со стороны порина нет препятствий к его встраиванию во внешнюю мембрану.

Процессы биогенеза белков внешней мембраны рассмотрены нами на примере N. meningitidis (рис. 8). Анализ транскриптов всех генов, потенциально вовлеченных в биогенез порина, продемонстрировал для большинства из них гиперэкспрессию в изоляте ¡19.05 по сравнению с е03.04, однако гены secA и surA экспрессировались одинаково (табл. 10).

Рисунок 8. Модель биогенеза белков наружной мембраны. Инициирующую роль в этом процессе играет белок SecA, связывающийся при участии SecB с сигнальным пептидом белка-предшественника (prePorBl, prePilQ и т.п.). Образуемый совместно с белками Sec D, Е, F, G, Y Sec-транслокон проталкивает белок наружной мембраны сквозь внутреннюю мембрану клетки. В ходе транслокации сигнальный пептид отщепляется сери-новой протеазой, и по выходу из Sec-канала белок передается двумя шапе-ронами Skp и SurA на периплазмати-ческий фрагмент мембранного белка Отр85, завершающего процесс интеграции.

В ходе анализа нуклеотидных последовательностей были обнаружены отличия в кодирующих областях генов surA и отр85 изолятов i 19.05 и е03.04 (табл. 10). Данный факт позволяет предположить функциональную недостаточность соответствующих белков, обеспечивающих терминальные стадии интеграции порина в структуру внешней мембраны. В этом случае невстроенные в мембрану молекулы порина накапливаются в периплазме, что позволяет обнаружить их во фракции растворимых белков при протеомном анализе.

Таблица 10. Генетический анализ элементов метаболического пути, ответственного за транслокацию белков внешней мембраны гонококка, для изолятов ¡19.05 и е03.04. Серым выделены гены, экспрессия которых не отличается в тестируемых изолятах.

Периплтма

ПфоиЛгА! Внешняя мембране

Белок

Соотношение концентрации кДНК изолятов ¡19.05 и е03.04

Ген (п.н.)

Мутации, отличные для изолята i 19.05 по сравнению с е03.04

SecA SecB SecD SecE SecF SecG SecY

Сериновая протеаза SurA

_Omp85_

11,2 31,1 4,6

58.1

54.2 17,5 17,5

secA (2751) secB (444) secD (1857) secE (279) secF (936) secG (351) secX(13l I) NG00138 (1500) surA (1002)

omp85 (2379)

нет нет нет нет нет нет нет нет

Asn105—>Ser, Lys206—>Glu,

Ala' Leu:

■Thr ■ТФ

Описанный нами механизм устойчивости гонококка не является специфическим в отношении пенициллина, а затрагивает широкий спектр АПМ, что объясняет факт повышения МПК тетрациклина и азитромицина для изолята ¿19.05. Интересно, что указанные нарушения проницаемости внешней мембраны никак не сказываются на чувствительности данного изолята к цефтриаксону, что дает основание предположить существование альтернативных путей проникновения этого антибиотика в бактериальную клетку.

Феномен устойчивости к цефалоспоринам исследован на основании регистрации изменений белковых фракций изолятов е03.04, ch37.06 и к51.05, возникающих при добавлении в среду низких концентраций цефтриаксона. В данном случае применение дифференциального протеомного анализа было продиктовано существенными отличиями в генетическом профиле между опытной группой изолятов со сниженной восприимчивостью к цефтриаксону - ch37.06, k51.05, и контролем - е03.04.

Хотя основное внимание в формировании устойчивости к цефалоспоринам уделяется мозаичности ПСБ 2 [Takahata, 2006; Lindberg, 2007; Ochiai, 2008], по результатам полноразмерного секвенирования гена репА изолятов ch37.06, k51.05, е03.04 и штамма АТСС 49226 (два последних образца служили контролем), мы не обнаружили мутаций, объясняющих снижение чувствительности к цефтриаксону изолятов ch37.06 и k51.05.

Исследование изменений, происходящих в клетках N. gonorrhoeae под действием цефтриаксона, с помощью 2D электрофореза с дифференциальным окрашиванием белковых фракций флуоресцентными красителями СуЗ-DIGE и Cy5-DIGE (табл. 11) позволило сделать заключение о схожести наблюдаемого метаболического ответа.

Среди зарегистрированных изменений обращают на себя внимание выраженное увеличение экспрессии ABC-транспортеров и цистеинсинтазы на фоне резкого снижения экспрессии ферментов, обеспечивающих включение глутамата в основные метаболические пути клетки: глутаматдегидрогеназы, а-кетоглутаратдекарбоксилазы, глутаминсинтетазы, карбомоилфосфатсинтетазы, что также согласуется со снижением уровня ферментов цикла трикарбоновых кислот. В целом, под влиянием цефтриаксона наблюдается общее угнетение основных метаболических путей бактериальной клетки, что особо подчеркивает значимость белков, продукция которых возрастает.

На основании наблюдаемой картины выдвинута гипотеза, что молекулярные события, разворачивающиеся в клетке в процессе нарушения целостности пептидог-ликана под действием р-лактамных антибиотиков, напоминают ситуацию, возникающую при гиперосмотическом стрессе [Csonka, 1989]. Ионам глутамата, наряду с ионами калия, отводится ведущая роль в осморегуляции бактерий. С учетом того, что значительная часть обнаруженных нами дифференциальных изменений затрагивает метаболизм глутамата, следует рассмотреть возможные пути утилизации этой аминокислоты гонококком (рис. 9).

Таблица 11. Фрагмент сравнительной характеристики изменений белкового профиля изоля-тов е03.04, сЬ37.0б и к51.05, происходящих под действием цсфтриаксона. Маркерные для построения рабочей гипотезы белки выделены цветом: серый - снижение продукции белка в изолятах под действием антибиотика, черный - усиление.

Название белка

NCBI ID

Соотношение интенсивности свечения опыт/контроль для

_изолятов_

е03.04 ch37.06 k51.05

Биохимический процесс в про-кариотической клетке

глутаматдегидрогеназа, КФ: 1.4.1.3. глутаминсинтетаза, КФ: 6.3.1.2

шаперонин GroEL

изоцитратдегидрогеназа

а-кетоглутаратдекарбо-

ксилаза, КФ: 1.2.4.2.

ДНК-зависимая-РНК-

полнмераза

фактор элонгации G

сукцинатдег идрогеназа

полинуклсотидфосфорила-

за/полиаденилаза

фосфоенолпируватсинтаза

белок семейства перокси-

рсдоксинов/глутаредоксин

инозитол-5-

монофосфатдегидрогеназа

2-метилизоцитратдегид-

ратаза

карбомоилфосфатсинтета-за, КФ: 6.3.5.5 рибосомальный белок L7/L12

фосфопируваттидратаза сукцинил-КоА-синтстаза дигидролипоамидацетил-трансфераза

форматтстрагидрофолат-лигаза

59801706

59801928

59802396 59801449 59801313

59802172

59802164 59801317

59800780

59800653

59801322

59801213

59801590

59800515

59802173

59801045 59801308

59801312 59800526

ОД 0,32 0,13

0,38

0,48 0,48

0,2 0,2

0,15 0,35 0,36

0,22 0,37

0,3 0,22 0,01

0,34

0,39 0,33 0,44

0,39 0,79

0,4 0,46

0,41 0,45 0.2

0,41 2,73

0,45 0,46 0,41

0,47 0,39 0,17

0,48 0,47

0,29 0,4

0,23

0,27 0,18 0,28 0,17

Метаболизм глутамата

Метаболизм глутамата, синтез клеточной стенки Рефолдипг белков с ошибочной конформацией при стрессе Цикл трикарбоновых кислот Метаболизм глутамата, цикл трикарбоновых кислот

РНК полимераза

Трансляция и биогенез Цикл трикарбоновых кислот

Деградация мРНК прокариот

Метаболизм пирувата

Антиоксидантная защита

Метаболизм пуринов

Цикл трикарбоновых кислот

Метаболизм глутамата

Трансляция и биогенез

Гликолиз/Глюконеогенез Цикл трикарбоновых кислот

Цикл трикарбоновых кислот

Метаболизм дикарбоновых

Периплазматический

АВС-транспортер 59800816 2,69 3,31 2,28 транспорт широкого диапазона веществ

цистеинсинтаза, КФ: 2.5.1.47 59800785 3,5 2,67 Метаболизм цистеина.

синтез эндогенного глутатиона

ГМФ синтетаза/глутамин-

амидотрапсфараза. 59802458 2,02 Метаболизм глутамата

КФ: 6.3.5.2

пептидилпролилизомераза 59801584

1,96

Биогенез белковых молекул

При осмостреесе глутамат, в избытке присутствующий в питательной среде, аккумулируется бактериальной клеткой [Csonka, 1989; Wood, 2007]. Вероятно, в этом процессе задействованы ABC транспортеры, активация которых видна у всех исследованных изолятах. Кроме того, анализ существующих метаболических путей глутамата и цистеина позволил выдвинуть гипотезу о вовлечении этих аминокислот в синтез глутатиона, и об участии последнего в процесс формирования толерантности N. gonorrhoeae к цефтриаксону.

proD | | GCS | | GS ]

Рисунок 9. Возможные пути метаболизм глутамата в клетках N. gonorrhoeae. Функциональные белки (ферменты) обозначены розовыми кружками, нефункциональные белки и аминокислоты -зелеными. Белки, чья концентрация снижается на фоне индукции цефтриаксоном, обведены зеленым цветом, повышается - красным. Исследованные гены ферментов указаны в прямоугольниках.

Глугатион (Ь-у-глутамил-Ь-цистеинилглицин), синтезируется микробными клетками в ходе последовательных реакций, катализируемых у-глутамилцистеинсинтетазой (y-GCS, КФ: 6.3.2.2) и глутатионсинтетазой (GS, КФ: 6.3.2.3). Сегодня место эндогенного глутатиона в жизнедеятельности бактерий является предметом активного изучения. Основная роль глутатиона логично отводится редокс-регуляции и адаптации бактерий к оксидативному стрессу [Masip, 2006]. Однако, показано его участие в адаптации микробов к солевому шоку путем негативной регуляции калиевых каналов, а также в модулировании чувствительности бактерий к антибиотикам. Причем влияние глутатиона не однозначно. Так, для Е. coli продемонстрировано снижение чувствительности к фторхинолонам [Goswami, 2006] и стрептомицину [Goswami, 2007] в присутствии восстановленного глутатиона, и одновременное возрастание чувствительности к Р-лактамным антибиотикам [Goswami, 2007]. Роль эндогенного глутатиона в метаболизме гонококка, его участие в ответе микроба на воздействие АМП исследованы плохо. Имеется указание на влияние восстановленного глутатиона на рост гонококка [Gould, 1944], есть данные об использовании его в системах защиты N. gonorrhoeae от оксидативного стресса [Seib, 2006].

A. 49226mut/ATCC 49226

В. 03mut/e03.04

С. 49226mut/ATCC 49226

J .

D. 03mut/e03.04

i ~ V -

• •

* у 4

ш "d » •

Jfc» Л :

л -«

• .

•-Т

Рисунок 10. Дифференциальное протеомное картирование гонококка. Белки «родительских» штаммов окрашены СуЗ (зеленое свечение); белки модифицированных штаммов с приобретенной устойчивостью к спектиномицину, окрашены Су5 (красное свечение).

A. Сопоставление белковых профилей штаммов 49226mut и АССТ 49226.

B. Сопоставление белковых профилей штамма 03mut и изолята е03.04.

C. и D. Увеличенное изображение изменений белкового профиля штаммов 49226mut и 03mut, возникших в процессе адаптации к спектиномицину.

Нами была выдвинута гипотеза о снижении чувствительности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам за счет активации синтеза эндогенного глутатиона. Частично эта гипотеза была подтверждена снижением чувствительности к цефтриаксону и цефикси-му изолятов ch37.06 и k51.05, выращенных на среде с добавлением 10 мМ восстановленного глутатиона, тогда как для изолята е03.04 и лабораторного штамма АТСС 49226 данный эффект отсутствовал.

Анализ нуклеотидной последовательности генов ферментов, участвующих в синтезе глутатиона, позволил обнаружить мутацию, приводящую к аминокислотной замене Glu221—>Lys в глутатионсинтетазе изолятов ch37.06 и к51.05, в отличие от е03.04 изолята. Интересно, что чувствительный ко всем антибиотикам штамм FA1090 имеет последовательность, идентичную е03.04, тогда как в недавно аннотированном геноме мультирезистентного изолята NCCP11945 [Chung, 2008] ген глутатионсинте-тазы также содержит замену Glu221—>Lys.

Поскольку среди исследованной коллекции не было выявлено устойчивых к спектиномицину клинических изолятов N. gonorrhoeae, путем селекции на возрастающих концентрациях антибиотика штамма АТСС 49226 и изолята е03.04, относящихся к разным сероварам N. gonorrhoeae, были получены штаммы 49226mut и 03mut, обладающие выраженной устойчивостью к данному АМП (МПК > 256 мг/л).

Для визуализации изменений, возникающих в клетках N. gonorrhoeae под действием спектиномицина построены дифференциальные протеомные карты лабораторных штаммов 49226mut и 03mut в сравнении с исходными АТСС 49226 и е03.04 (рис. 10). При детальном рассмотрении дифференциальных белков в обоих случаях обращает на себя внимание факт появления в мутантных штаммах большого количества модифицированных по сравнению с нативной формой белков, вовлеченных в различные, часто ничем не связанные, метаболические процессы. Этот эффект более ярко проявляется в штамме 49226mut и менее выражен для штамма 03mut.

Несмотря на давнюю историю использования спектиномицина в терапии гонококковой инфекции, точный механизм его действия остается малоизученным. Показано, что антибиотик связывается с участком 308-субъединицы в районе 1060-1100 н.о. 16S рРНК (согласно нуклеотидной последовательности рРНК E.coli). Соответствующий район 16S рРНК контактирует с белками S5, S4 и S8 [Wirmer, 2006].

Секвенирование генов rrs, rpsD, rpsE, rpsH, кодирующих структуру 16S рРНК и рибосомальных белков S4, S5, S8, соответственно, установило наличие нуклеотидной мутации в кодирующей области белка S5, приводящей к аминокислотной замене Thr24 —►Pro у штаммов 49226mut и e03.04mut (рис. 11). Мутаций в генах остальных рибосомальных белков обнаружено не было.

1 50 Rps5_ATCC49226 MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRvHkWRGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM

Rps5_e03 . 04 MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRvHkWKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM

Rps5_49226mut MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRvHkWKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM

Rps5_03mut MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRVHKWKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM

Rps5_FA1090 MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRV0KWKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM

Rps5_E.coli_K12 MA-H-IEKQA GELQEKLIAV NRVSKTVKGG RIFSFTALTV VGDGNGRVGF

Рисунок 11. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности N-концевого домена рибосомального белка S5 гонококка и Е. coli. Черным обозначена область обнаруженной в штаммах 49226mut и 03mut мутации Thr24—»Pro. Подчеркнуты аминокислотные позиции, замены в которых приводят к формированию устойчивости к спектиномицину у Е. coli [Kirthi, 2006].

Факт обнаружения перестроек именно в рибосомальном белке S5 позволил логично объяснить феномен «сдвига» белковых пятен, наблюдаемый на дифференциальных 2D картах. Нарушение клеточного роста, изменение процесса сворачивание 16S рРНК, снижение точности трансляции полипептидной цепи - все эти явления описаны для штаммов Е. coli, имеющих мутации в белке S5, обуславливающие устойчивость к спектиномицину [Kirthi, 2006]. Пул «неправильных» белковых молекул, образующихся в результате сдвига рамки считывания или преждевременной терми-нации трансляции, в мутантных штаммах Е. coli был достоверно выше. Подобные

процессы, происходящие в мутантных штаммах гонококка, в свою очередь могут приводить к снижению жизнеспособности клеток, что отчасти объясняет низкий процент устойчивых к спектиномицину изолятов N. gonorrhoeae в природной популяции.

Секвенирование генов rrs, подтвержденное процедурой минисеквенирования с последующей МАЛДИ ВМС, зафиксировало наличие в исходном штамме АТСС 49226 мутаций Т459—>С и G12'5—>А во всех четырех копиях этого гена. Интересно, что в штамме 49226mut эти мутации отсутствовали, равно как в штаммах 03mut и е03.04. Этот факт объясняет наблюдаемые в эксперименте более глубокие отличия в белковых профилях штаммов 49226mut и АССТ 49226 по сравнению с парой 03mut и е03.04. Вероятно, гонококки, несущие мутации как в 16S рРНК, так и в рибосомаль-ных белках, оказались нежизнеспособными и были элиминированы в ходе селекции.

Таким образом, совокупность выявленных молекулярных изменений позволяет предположить существование у N. gonorrhoeae не описанного ранее механизма формирования устойчивости к спектиномицину за счет изолированной мутации в N-концевом домене рибосомалыюго белка S5. В пользу этого предположения свидетельствует факт обнаружения идентичной аминокислотной замены в обоих мутантных штаммах, отличающихся по своему антигенному составу гонококках и полученных в независимых экспериментах, а также локализация обнаруженной мутации в области связывания антибиотика с рибосомой. И хотя феномен формирования устойчивости к спектиномицину исключительно путем модификации рибосомальных белков до настоящего времени не описан, для родственного антибиотика - стрептомицина -такой путь известен давно, в частности, около 60 % изолятов М. tuberculosis реализуют устойчивость к стрептомицину исключительно за счет мутаций в рибосомальном белке S12 и только 10 % из них имеют мутации в 16S рРНК [Spies, 2008].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сходство молекулярной организации микроорганизмов и универсальность современных методов анализа биомолекул позволили выстроить строгую логичную систему геномно-протеомного типирования патогенов, направленную на решение практических задач, связанных с реализацией средств молекулярного мониторинга клинически-значимых возбудителей бактериальной и вирусной природы, с одной стороны, и способствующую получению новых знаний в области молекулярной микробиологии, в частности в сфере расшифровки неизвестных механизмов лекарственной устойчивости бактерий, с другой.

Унификация приборной базы, развитие коммуникационных технологий предопределяет наступление новой эры в клинической микробиологии - эры сочетания рутинных и исследовательских процедур на базе одной технологической платформы, что и было продемонстрировано в ходе данной работы. Дистанция между фенотипи-ческим описанием устойчивости бактерий и нашими знаниями о молекулярных механизмах, предопределяющим эту резистентность, стремительно сокращается, что по-

зволяет прогнозировать наступление эры «быстрой микробиологии», практически не нуждающейся в культивировании микроорганизмов.

В тоже время, высокопроизводительные системы скрининга известных генетических маркеров резистентности на большой выборке клинических изолятов позволили нам отобрать клинические изоляты, устойчивый фенотип которых невозможно было объяснить на основании регистрируемых изменений в геномной ДНК. Надо отметить, что количество таких изолятов невелико, что указывает на принципиальную возможность разработки и внедрения измерительных систем нового поколения. С другой стороны, выявление клинических изолятов, реализующих не изученные механизмы устойчивости, позволяет расшифровывать их и возвращать эти новые знания в виде тестов в практику, не отставая от изучаемых объектов по скорости ответа на применение новых АМП. Такая идеология постепенно должна заменить традиционное мышление и стать главенствующей, поскольку основой современной жизни является способность быстро отвечать на разнообразные вызовы, возникающие в разных областях, в том числе и медицине.

Фундаментальные аспекты нашей работы были сфокусированы в области расшифровки новых молекулярных механизмов формирования резистентности. Изложенный алгоритм построения исследования - отбор изолятов на основании широкомасштабного микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга гонококка, привлечение методов протеомного картирования в сочетании с генетическим анализом и системным подходом к функционированию бактериальной клетки, показал свою эффективность в изучении биохимических процессов, снижающих восприимчивость N. gonorrhoeae к пенициллину, цефтриаксону, спектиномицину.

Описанные новые механизмы устойчивости гонококка вносят существенный вклад в общее понимание феномена резистентности и расширяют наши представления о биохимических основах функционирования микробной клетки.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован и внедрен в практику протокол прямого МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования бактерий для видовой идентификации грамположительных (S. pneumoniae) и грамотрицательных (N. gonorrhoeae, N. meningitidis) микроорганизмов.

2. В ходе клинической апробации разработанных ДНК-микроматриц продемонстрирована возможность выявления анаэробной флоры при обследовании пациентов с дисбиотическими явлениями урогенитального тракта — бактериальный вагиноз женщин, неспецифический баланопостит мужчин, что особенно важно в оценке эффективности специфической терапии.

полиморфизмов в геномах бактерий и вирусов, пригодные для оценки лекарственной устойчивости S. pneumoniae, М. tuberculosis, N. gonorrhoeae и генотипирова-ния вирусов гепатита В и С, как в культуре микроорганизмов, так и непосредственно в клиническом материале.

4. Молекулярный мониторинг больших и географически неоднородных выборок изолятов S. pneumoniae, М. tuberculosis, N. gonorrhoeae позволил объяснить наблюдаемый устойчивый фенотип микробов на основании обнаруживаемых перестроек в геномной ДНК. В зависимости от возбудителя и рассматриваемой группы АМП прогностическая значимость регистрируемых маркеров генетически-детерминированной лекарственной устойчивости составила от 82 % до 96 %.

5. Осуществленное генотипирование вирусов гепатита В и С доказывает универсальность разработанного способа регистрации однонуклеотидных полиморфизмов, базирующегося на масс-спектрометрическом анализе ДНК, и открывает перспективы широкомасштабным эпидемиологическим исследованиям в этой области.

6. Расшифрован механизм формирования устойчивости N. gonorrhoeae к спектино-мицину за счет изолированной мутации в рибосомальном белке S5; объяснен феномен снижения чувствительности гонококка к пенициллину, обусловленный недостаточностью пориновых каналов, вызванной нарушением интеграции белков внешней мембраны; показано, что невосприимчивость гонококка к сублетальным концентрациям цефтриаксона обеспечивают механизмы, ответственные за выживание бактериальной клетки в условиях осмотического стресса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Афанасьев М.В., Боровская А.Д., Ильина Е.Н.. Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Говорун В.М. Выявление мутаций в 306 кодоне embB гена для молскулярно-генетической характеристики клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Пробл. Тубер. Болезн. Легких. - 2009. - № 5. - С. 48 - 52.

2. Малахова М.В., Ильина Е.Н.. Говорун В.М., Шутько С.А., Дудина К.Р., Знойко О.О., Климова Е.А., Ющук Н.Д. Масс-спектрометрическое генотипирование вируса гепатита В. // Бюлл. Экспер. Биол. мед. - 2009. - Т. 147.-№2.-С. 181-187.

3. Ильина Е.Н.. Говорун В.М. Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот в молекулярной медицине. //Биоорганическая химия. -2009. - Т. 35. -№. 2. - С. 149 - 164.

4. Владимиров Г.Н., Кононихин А.С., Ильина Е.Н.. Говорун В.М., Николаев Е.Н. Точное измерение масс продуктов полимеразно-цепной реакции как метод генотипирования. // Труды МФТИ.-2009.-Т. 1. -№ 1. - С. 36-40.

5. Ilina EN. Borovskaya AD, Malakhova MM, Vereshchagin VA, Kubanova AA, Kruglov AN, Svistu-nova TS, Gazarian AO, Maier T, Kostrzewa M, Govorun VM. Direct bacterial profiling by matrixassisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry for identification of pathogenic Neisseria. // J Mol Diagn. - 2009. - V. 11 - No 1. - P. 75 - 86.

6. Ilina E.. Shitikov E., Borovskaya A., Maier Т., Kostrzewa M., Govorun V. Comparative application of modern molecular methods for Neisseria gonorrhoeae typing. // P135 in Abst. book of 16,h International Pathogenic Neisseria Conference. - 2008. - Rotterdam - P. 203.

7. Ilina E.. Borovskaya S., Sidorenko S., Kubanova A., Maier Т., Kostrzewa M., Govorun V. A mass spectrometry based approach for Neisseria gonorrhoeae species identification. //Abst. 18"1 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases and 26lh International Congress of Chemotherapy. - 2008. - Barselona.- O. 178.

8. Afanas'ev MV, Ilina EN. Smirnova TG, Larionova EE, Kuz'min AV, Andreevskaya SN, Chernou-sova LN, Govorun VM. MIRU-VNTR genotyping of Mycobacterium tuberculosis strains from Ccn-

tral region of Russia. // Abst. 18lh European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases and 26th International Congress of Chemotherapy. - 2008. - Barselona. - P. 1559.

9. Ikryannikova LN, Shitikov EA, Zhivankova DG, Il'ina EN. Edelstein MV, Govorun VM. A MALDI TOF MS-based miniscquencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae. // J Microb Meth. - 2008. - V. 75 - No 3. - P. 385-91.

10. Ilina E.N.. Vereshchagin V.A., Borovskaya A.D., Malakhova M.V., Sidorenko S.V., Al-Khafaji N.C., Kubanova A.A., Govorun V.M. Relation between Genetic Markers of Drug Resistance and Susceptibility Profile of Clinical Neisseria gonorrhoeae Strains. // Antimicrob Agents Chemother. -2008. - V. 52. - No. 6 - P. 2175-2182.

11. Reinert RR, Filimonova OY, Al-Lahham A, Grudinina SA, Ilina EN. Weigel LM, Sidorenko SV. Mechanisms of macrolide resistance among Streptococcus pneumoniae isolates from Russia. // Antimicrob Agents Chemother. - 2008. - V. 52. - No. 6 - P. 2260 - 2262.

12. Малахова M.B., Верещагин B.A., Ильина E.H.. Говорун B.M., Филимонова О.Ю., Грудинина С.А., Сидоренко С.В. Применение метода MALDI-ToF масс-спектрометрии для анализа генетически детерминированной устойчивости S.pneumoniae к фторхинолонам. //Антибиот. Хи-миотер.-2007,-Т. 52.-№ 1 -2.-С. 10-17.

13. Мудрак Д.Е., Икрянникова JI.H., Сидоренко С.В., Ильина E.H. Изучение распространенности и молекулярных механизмов антибактериальной резистентности у грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в стационарах Москвы и Перми. // Антибиот. Химиотер. -2007,- Т. 52. - № 7 - 8. - С. 10-16.

14. Afanas'ev MV, Ikryannikova LN, Il'ina EN. Sidorenko SV, Kuz'min AV, Larionova EE, Smirnova TG, Chemousova LN, Kamaev EY, Skorniakov SN, Kinsht VN, Cherednichenko AG, Govorun VM. Molecular characteristics of rifampicin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Russian Federation. // J Antimicrob Chemother. - 2007. - V. 59. - No. 6. - P. 1057 - 1064.

15. Vereshchagin V., Ilina E.. Atroshkina M., Serebryakova M., Maier Т., Kostrzewa M., Govorun V. A new mass-spectrometric approach to antibacterial susceptibility testing. // Abst. 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases and 25th International Congress of Chemotherapy. - 2007. - Munich - P. 1648.

16. Ikryannikova LN, Afanas'ev MV, Akopian ТА, Il'ina EN. Kuz'min AV, Larionova EE, Smirnova TG, Chernousova LN, Govorun VM. Mass-spectrometry based minisequencing method for the rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. // J Microb Meth. - 2007. - V. 70. - No. 3.-P. 395 -405.

17. Ильина E.H.. M.B. Малахова, B.A. Верещагин, B.M. Говорун, T.B. Припутневич, A.A. Куба-нова Прямая оценка параметров лекарственной устойчивости гонококка. // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. -2007. - Т. 144, - № 8. - С. 194- 197.

18. Афанасьев М.В., Икрянникова JI.H., Ильина E.H.. Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин A.B., Черноусова JI.H., Камаев ЕЮ., Скорняков С.Н., Киншт В.Н., Чередниченко А.Г., Говорун В.М. Применение реакции мини-секвенирования с последующим MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом для оценки устойчивости к рифампицину и изониазиду штаммов Mycobacterium tuberculosis // Пробл. Тубер. Болезн. Легких. - 2007. - № 7. - С. 37 - 42.

19. Плахова К.И., Гомберг М.А., Атрошкина М.Е., Ильина E.H.. Говорун В.М. Идентификация микробного состава выделений из влагалища методами генодиагностики. // Вест. Дермат. Ве-нерол. - 2007. - № 6. - С. 9 -13.

20. Плахова К.И., Гомберг М.А., Атрошкина М.Е., Ильина E.H.. Говорун В.М. Роль Atopobium vaginae при рецидивировании бактериального вагиноза // Вест. Дермат, Венерол. - 2007. - № 5.-С. 10-13.

21. Боровская А.Д., Малахова М.В., Верещагин В.А., Ильина E.H.. Говорун В.М., Припутневич Т.В., Аль-Хафаджи Н., Кубанова A.A. Анализ вклада молекулярных механизмов в формирование устойчивости гонококка к тетрациклину. // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. - 2007. - Т. 144. -№3.-С. 432-437.

22. Малахова М.В., Верещагин В.А., Ильина E.H.. Говорун В.М., Зубков М.М., Припутневич Т.В., Кисина В.И., Кубанова A.A. Анализ генетических маркеров резистентности N. gonorrhoeae к ß-лактамным антибиотикам. // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. - 2006. - Т. 141. - № 5. - С. 549 -554.

23. Кубанова A.A., Говорун В.М., Ильина E.H.. Верещагин В.А., Фриго Н.В., Припутневич Т.А. Первый опыт применения метода прямого белкового профилирования для идентификации и типирования N.gonorrhoeae. // Вест. Дермат. Венерол. - 2006. - № 5. - С. 25 - 29.

24. Ильина Е.Н.. Малахова М.В., Генерозов Э.В., Говорун В.М., Арчаков А.И., Покровский В.И. Масс-спектрометричсский анализ для типирования вируса гепатита С. // Биомед. химия. -2005.-Т. 51.-№ 1.-С. 41 -47.

25. Момыналиев К.Т., Селезнева О.В., Козлова А.А., Верещагин В.А., Ильина Е.Н.. Говорун В.М.. A2144G - основная мутация в гене 23S rRNA Helicobacter pylori, ассоциированная с устойчивостью к кларитромицину // Генетика. - 2005. - Т.41. - №10. - С. 1338 - 1344.

26. Ильина Е.Н.. Малахова М.В., Степанова Ю.Н., Кубанова А.А., Говорун В.М. Идентификация бактериальной флоры с применением технологии днк-макрополей. // Мол. Медицина. - 2005. -№2.-С.41 -45.

27. Ilina EN. Malakhova MV, Gcnerozov EV, Nikolaev EN, Govorun VM. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Timc of Flight Mass Spectrometry for Hepatitis С Virus Genotyping. // J Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43. - No. 6. - P. 2810 - 2815.

28. Верещагин B.A., Ильина E.H.. Зубков M.M., Припутневич Т.В., Кубанова А.А., Говорун В.М. Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии для выявления в генах gyrA и parC Neisseria gonorrhoeae однонуклеотидных замен, определяющих формирование устойчивости к фторхи-нолонам // Мол. Биол. - 2005. - Т. 39. - № 6. - С. 923 - 932.

29. Верещагин В.А., Ильина Е.Н.. Малахова М.В., Зубков М.М., Сидоренко С.В., Кубанова А.А., Говорун В.М. Устойчивость к фторхинолонам среди Российских изолятов Neisseria gonorrhoeae // Мол. Ген. Микробиол. Вир. - 2005 - № 1. - С. 23 - 27.

30. Vereshchagin V.A., Ilina E.N.. Malakhova M.V., Zubkov M.M., Sidorenko S.V., Kubanova A.A., Govorun V.M. Fluoroquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates from Russia: molecular mechanisms implicated // J. Antimicrob. Chem. - 2004. - Vol. 53. - P. 653 - 656.

31. А.А. Кубанова, M.M. Васильев, В.М. Говорун, O.A. Терман, E.H. Ильина. T.B. Припутневич. Современные подходы к типированию штаммов N.gonorrhoeae. // Вест. Дермат. Венерол. -2004.-№ 1.-С. 4-8.

32. Ильина Е.Н. Особенности генодиагностики трансфузионных вирусных гепатитов. // Гспатоло-гия, приложение к журналу Экспер. Клин. Гастроэнтер. - 2003. - № 1. - С. 28 - 36.

33. Ильина Е.Н., Малахова М.В., Верещагин В.А., Говорун В.М., Сергиенко В.И., Зубков М.М., Васильев М.М., Кубанова А.А. Молекулярное типирование штаммов N. gonorrhoeae, распространенных на территории РФ // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2003. - Т. 136. - № 8. - С. 205-208.

34. Ильина Е.Н.. Говорун В.М., Иваников И.О. Некоторые аспекты лабораторной диагностики вирусных гепатитов В и С. Обзор. // Тер. архив. - 2003. - Т. 75. - № 4. - С. 84 - 86.

35. Ильина Е.Н.. Говорун В.М., Климова Е.А., Гаджикулисва М.М., Ющук Н.Д. Изменчивость генома вируса гепатита С при лабораторном мониторинге больных острым вирусным гепатитом. // Росс. Журн. Гастроэнтер. Гепат. Колопроктол. - 2002. - № 1. - С. 30 - 37.

36. Ильина Е.Н.. Артемов Е.К., Говорун В.М., Иванова Л.М., Иваников И.О. Генотипирование РНК вируса гепатита С аллельспецифичной амплификацией. // Кремлевская Медицина. Клинический вестник. -2002. -№ 1. - С. 38-41.

37. Ющук Н.Д., Знойко О.О., Климова Е.А., Огиенко О.Л., Говорун В.М., Гущин А.Е., Ильина Е.Н. Роль персистенции HCV в плазме и лейкоцитах при хронической HCV инфекции. // Росс. Журн. Гастроэнтер. Гепат. Колопроктол. - 2000. - № 4. - С. 59 - 64.

38. Ильина Е.Н.. Гущин А.Г., Говорун В.М., Знойко О.О., Климова Е.А., Ющук Н.Д. Новый подход в генотипировании вируса гепатита С. // Эпидем. Инфекц. Болезни. - 1999. - № 5. - С. 2326.

39. Ющук Н.Д., Климова Е.А., Гаджикулиева М.М., Кареткина Г.Н., Говорун В.М., Гущин А.Е., Ильина Е.Н.. Соколова М.В., Елисеева И.Я., Чешик Д.С., Малышев Н.А. Распространенность маркеров герпссвирусных инфекций у больных парентеральными гепатитами. // Росс. Журн. Гастроэнтер. Гепат. Колопроктол. - 1999. -№ 5. - С. 36 -41.

Список сокращений

а.о. — аминокислотный остаток

АМП - антимикробный препарат

ВГВ - вирус гепатита В

ВГС - вирус гепатита С

ВМС - времяпролегная масс-спектрометрия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - дитиотрейтол

МАЛДИ - матрично-актавированная лазерная десорбция/ионизация

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ПСБ - пенициллин связывающий белок

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ddNTP - дидезоксинуклеозидтрифосфаты

dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфаты

ЕМВ - этамбутол

INH - изониазид

MDR (multidrug resistant) - применительно к М. tuberculosis, изолят устойчивый как минимум к рифампицину и изониазиду

MLST (multilocus scqucncing typing) -типирование мультилокусным секвенированием NG-MAST (N. gonorrhoeae multiantigen sequence typing) - мультиантигенное типирование гонококка

QRDR (quinolone resistance-determining region) - область, определяющая устойчивость к хинолонам. RIF - рифампицин

RRDR (rifampicin resistance determinant region) - область, определяющая устойчивость к рифампицину

SSC (20х) - буферная смесь ЗМ NaCl и 0,ЗМ цитрата натрия (рН 7,0)

VNTR (variation number tandem repeats) - вариации числа повторяющихся фрагментов

ДНК

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ильина, Елена Николаевна

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Принципиальные подходы к мониторингу бактериальных и вирусных возбудителей инфекционных заболеваний человека.

2.1.1 Классическая микробиология в мониторинге бактериальных и вирусных патогенов.

2.1.2 Методы молекулярного анализа в мониторинге инфекций.

2.2 Масс-спектрометрические технологии - современный способ анализа биологических макромолекул.

2.2.1 Масс-спектрометрия жирных кислот.

2.2.2 Масс-спектрометрия белков и пептидов.

2.2.2.1 Протеомика микроорганизмов.

2.2.2.2 Прямое профилирование бактерий

2.2.3 Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот 34 2.2.3.1 Применение масс-спектрометрии нуклеиновых кислот.

2.3 Общие принципы возникновения и распространения резистентности к антимикробным препаратам.

2.4 Частные проблемы мониторинга включенных в исследование микроорганизмов.

2.4.1 Проблемы мониторинга легочных патогенов — пневмококка, микобактерий туберкулеза.

2.4.2 Подходы к мониторингу гонококка, как одного из возбудителей инфекций, передающихся половым путем.

2.4.3 Современное состояние лабораторной диагностики и мониторинга транс-фузионных вирусных гепатитов В и С.

2.5 Создание универсальных методов геномно-протеомного типирования патогенов в перспективе реформирования существующих систем мониторинга клинически-значимых инфекций.

3 Материалы и методы. 87 3.1 Объекты исследования.

3.1.1 Бактериальные возбудители легочных инфекций и инфекций, передающихся половым путем.

3.1.2 Клинический материал.

3.1.3 Анализируемые последовательности ДНК/РНК.

3.2 Протеомные методы.

3.2.1 Прямое МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование бактерий.

3.2.2 Протеомное картирование.

3.3 Генетические методы.

3.3.1 Выделение ДНК.

3.3.2 Постановка реакций амплификации.

3.3.3 Обработка продуктов амплификации, предназначенных для постамплифи-кационных манипуляций.

3.3.4 Минисеквенирование и масс-спектрометрический анализ продуктов реакции

3.3.5 Секвенирование и анализ фрагментов генома

3.3.6 Исследование на ДНК-чипе

3.3.7 Методы молекулярного типирования

3.3.8 Транскрипционный анализ

3.4 Биоинформационные и статистические методы 110 4 Результаты

4.1 Методики молекулярного сканирования — компоненты единой технологической платформы

4.1.1 Прямое МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование бактериальных штаммов.

4.1.2 Разработка на основе МАЛДИ ВМС технологии выявления однонуклео-тидных полиморфизмов в геномной ДНК бактерий и вирусов.

4.1.3 Дизайн ДНК-микроматриц и разработка протокола исследования возбудителей инфекций, передающихся половым путем, и бронхо-легочных патогенов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы"

Несмотря на реализацию национальных мероприятий по контролю над распространением бактериальных и вирусных патогенов, достигнутые успехи в области химиотерапии инфекционных заболеваний и вакцинации, доля инфекционных болезней в структуре заболеваемости населения продолжает занимать лидирующие позиции [16]. Более того, происходят изменения природы инфекционных возбудителей, выражающиеся в замещении дикой популяции штаммами с множественной лекарственной устойчивостью, обладающими большей вирулентностью и патогенностыо. На этом фоне задачи, связанные с созданием и реализацией новых эффективных средств видовой идентификации патогенов, их штаммового типирования и определения профиля лекарственной устойчивости, выглядят особенно актуальными.

Последнее десятилетие прошлого века существенно изменило наши представления о многих важных природных явлениях-и механизмах, предопределяющих их развитие. Во многом это обусловлено интенсивным развитием технологий анализа биологических объектов, возникновением и.совершенствованием технологии чтения.генетических последовательностей, а также методов обнаружения и идентификации структуры природных биополимеров, к числу которых относятся молекулы ДНК, РНК и белки.

В области клинической и прикладной микробиологии принципиально изменились представления о скорости мутационных-процессов, изменчивости геномов бактерий и вирусов, и, как следствие формирование устойчивости к применяемым^химиотерапевтиче-ским агентам. В связи с этим, в последние годы возникла реальная возможность принципиальной модернизации диагностического потенциала исследовательских и, практических лабораторий. Такая модернизация заключается в разработке и внедрении методов, так называемой, быстрой микробиологии, которые будут давать исчерпывающее представление о микробном сообществе в испытуемой пробе и определять клинически значимые свойства микроорганизмов в максимально сжатые сроки.

Традиционные методы идентификации возбудителя, основанные на проведении микробиологического посева, не лишены ряда недостатков — длительность исследования, лимитированная скоростью деления бактериальной клетки, относительная дороговизна метода, необходимость привлечения большого числа квалифицированных специалистов в силу сложности автоматизации аналитических процедур. Кроме того, значительная часть патогенных микроорганизмов, в частности представители анаэробной^актериальной флоры, являются труднокультивируемыми или некультивируемыми и фактически не анализируется в большинстве клинических микробиологических лабораторий.

Ведущей проблемой современного здравоохранения, во многом обусловленной интенсивным применением антибактериальных препаратов, является проблема формирования лекарственной устойчивости, требующая как минимум адекватной оценки и контроля в ходе лечения. Традиционные подходы, основанные на выращивании микроорганизмов на селективных питательных средах, зачастую не позволяют получить результат в предельно сжатые сроки и оказываются малоинформативными в силу ретроспективности анализа.

Предлагаемое исследование направлено на решение актуальных задач клинической микробиологии, связанных с созданием средств быстрого выявления и характеристики возбудителей бактериальных и вирусных инфекций и их практическим использованием, как для осуществления молекулярного мониторинга, так и для получения новых знаний об особенностях молекулярной организации патогенов.

Первые шаги к разработке новых методов в микробиологии были сделаны в 90х годах прошлого века с внедрением методов ПЦР-диагностики, что позволило сократить сроки анализа клинического образца для идентификации труднокультивируемой бактериальной флоры и вирусов [2]. Тем не менее, этот подход оказался недостаточным для решения задач по определению свойств микроорганизмов — штаммового типирования, установления профиля лекарственной чувствительности, необходимых для выбора правильной стратегии лечения, рациональной фармакотерапии и мониторинга инфекционных заболеваний.

Сложившаяся ситуация в области мониторинга клинически значимых микроорганизмов продиктовала необходимость создания комплексных систем, позволяющих адекватно сканировать, выявлять и расшифровывать молекулярные механизмы формирования лекарственной устойчивости, а также прогнозировать микроэволюционные события исходя из мониторинга изменчивости бактериальных и вирусных популяций.

Приоритетность данного исследования состоит в решении этой проблемы путем разработки универсального комплексного вертикально-интегрированного подхода, основанного на комбинации технологий генетического и протеомного типирования с использованием времяпролетной матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) масс-спсктрометрии, как универсального анализатора.

Реализация такого подхода позволяет не только обеспечить быструю идентификацию микрофлоры, осуществить молекулярное типирование штаммов, провести оценку лекарственной чувствительности, но и раскрыть новые механизмы формирования клинически значимых признаков — толерантности к лекарственной терапии, патогенности.

Для иллюстрации возможностей создаваемой измерительной платформы объектами исследования выбраны группы клинически значимых микроорганизмов

Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, вирусы гепатита В и С.

Выбор объектов основан на безусловной актуальности изучения этих патогенов для практического здравоохранении России. Так, в 2007 году в России уровень заболеваемости на 100 тыс. населения составил 82,9 для туберкулеза; 60,34 для гонореи; 5,8 и 3,58 для вирусных гепатитов В и С, соответственно [16].

В большинстве стран распространение инфекционных заболеваний, изменчивость их возбудителей, процессы формирования лекарственной устойчивости контролируются в рамках .международных и национальных программ, например International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD) (www.iuatld.org) или National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and ТВ Prevention (NCHHSTP) США (www. cdc.gov/nchhstp).

В России соответствующие национальные программы находятся в стадии формирования и нуждаются в разработке и внедрении средств эффективного молекулярного мониторинга возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, в частности микобактерий туберкулеза, пневмококка, гонококка, вирусов гепатита В и С.

Цель работы: создание и реализация вертикально интегрированной платформы геномно-протеомного типирования патогенов бактериальной (гонококк, пневмококк, ми-кобактерии туберкулеза) и вирусной (вирусы гепатита В и С) природы для обеспечения широкомасштабного эпидемиологического мониторинга, определения' факторов вирулентности и патогенности и изучения новых молекулярных механизмов формирования лекарственной устойчивости.

Задачи:

1. Разработка и внедрение в практику комплексной технологи на основе времяпро-летной МАЛДИ масс-спектрометрии для высокопроизводительного выявления нуклео-тидных полиморфизмов в геномах бактерий и вирусов. Демонстрация возможности комбинированного анализа биоматериала с применением технологии ДНК-чипов и масс-спектрометрического исследования.

4. Создание средств молекулярного типирования российской популяции М. tuberculosis и N. gonorrhoeae. Сопоставление информативности методов протеомного и геномного типирования бактерий.

5. Проведение широкомасштабных молекулярно-эпидемиологических исследований географически неоднородных групп (коллекций) изолятов гонококка, микобактерий туберкулеза, пневмококка. Оценка основных тенденций генетической изменчивости в микробных популяциях на территории РФ.

6. Разработка и демонстрация нового алгоритма обнаружения неизвестных молекулярных механизмов лекарственной устойчивости у бактерий на примере анализа гонококка с привлечением протеомных исследований и моделирования генных (метаболических) сетей.

2 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ильина, Елена Николаевна

6 Выводы

1. Оптимизирован и внедрен в практику протокол прямого МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования бактерий для видовой идентификации грамполо-жительных (S pneumoniae) и грамотрицательных (N. gonorrhoeae, N. meningitidis) микроорганизмов.

2. В ходе клинической апробации разработанных ДНК-микроматриц продемонстрирована возможность выявления анаэробной флоры при обследовании пациентов с дисбио-тическими явлениями урогенитального тракта — бактериальный вагиноз женщин, неспецифический баланопостит мужчин, что особенно важно в оценке эффективности.специфической терапии.

3. На основе МАЛДИ масс-спектрометрии фрагментов нуклеиновых кислот, сопряженной с последовательными реакциями амплификации и минисеквенирования, разработаны высокопроизводительные системы обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов в геномах бактерий и вирусов, пригодные для оценки лекарственной устойчивости S. pneumoniae, М. tuberculosis, N. gonorrhoeae и генотипирования вирусов гепатита В и С, как в культуре микроорганизмов, так и непосредственно в клиническом материале.

4. Молекулярный мониторинг больших и географически неоднородных выборок изолятов S. pneumoniae, М. tuberculosis, N. gonorrhoeae позволил объяснить наблюдаемый устойчивый фенотип микробов на основании обнаруживаемых перестроек в геномной ДНК. В зависимости от возбудителя и рассматриваемой группы АМП прогностическая значимость регистрируемых маркеров гепетически-детерминированной лекарственной устойчивости составила от 82 % до 96 %.

6. Расшифрован механизм формирования устойчивости N gonorrhoeae к спектиномицину за счет изолированной мутации в рибосомальном белке S5; объяснен феномен снижения чувствительности гонококка к пенициллину, обусловленный недостаточностью по-риновых каналов, вызванной нарушением интеграции белков внешней мембраны; показано, что невосприимчивость гонококка к сублетальным концентрациям цефтриаксона обеспечивают механизмы, ответственные за выживание бактериальной клетки в условиях осмотического стресса.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ильина, Елена Николаевна, Москва

1. Александров М. Л., Галль JI. Н., Краснов Н. В. и др. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении новый метод масс-спектрометрического анализа // ДАН СССР. - 1984. -Т. 277.-№2.-С. 379-383.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Москва, Мир, 2002.

3. Зубков М. Н., Гугуцидзе Е. Н. Микробиологические аспекты диагностики пневмоний //I

4. Пульмонология. 1997. - Т. 1. - С. 41-45.

5. Иванов И., Ершов Г., Мирзабеков А. и др. Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах // Молекулярная Биология. 1997. - Т.31. - С. 159-167.

6. Ильина Е. Н., Артемов Е .К., Говорун В. М., Иванова Л. М., Иваников И. О. Генотипирова-ние РНК вируса гепатита С аллельспецифичной амплификацией // Кремлевская Медицина. Клинический вестник. 2002. - № I. - С. 38 - 41.

7. Коршунов В. М., Володин Н. Н., Ефимов Б. А. и др. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах. Москва. 1999. с. 80.

8. Львов Д. К. Вирусные гепатиты: от А до G и далее // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. 1997. - № 1. - С. 70 — 77.

9. Львов Д. К., Самохвалов Е. И., Миширо С., и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ // Вопросы вирусологии. — 1997. № 4. - С. 157 - 161.

10. Мавров И.И. Половые болезни. Энциклопедический справочник. Москва, АСТ-Пресс, 1994, с. 365-367.

11. Мамырин Б. А., Каратаев В. И., Шмикк Д. В., Загулин В. А. Масс-рефлектрон: новый немагнитный времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения //Журнал экспериментальной и теоретической физики. 1973. -Т. 64. - Вып. 1. - С. 82 - 89.

12. Мирзабеков А.Д., Прокопенко Д.В., Чечеткин В.Р. Применение матричных биочипов с иммобилизованной ДНК в биологии и медицине. Информационные медико-биологические технологии (под ред. В.А. Княжева и К.В. Судакова). ГЭОТАР-МЕД, Москва, 2002, с. 166 198.

13. Министерство здравоохранения РФ. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации // Приказ № 109 от 21 марта 2003 г.

14. Ноников В.Е., Зубков М.Н., Гугуцидзе Е.Н. Этиология острых пневмоний у лиц пожилого и старческого возраста//Терапевтический архив. 1990.-Т. З.-С. 30-33.

15. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2007 году. // Государственный доклад. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. — 2008.

16. Осипов Г.А., Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах // Вестник РАМН. 1996. -Т. 2. - С. 52-59.

17. Писарева М.М. Молекулярно-биологические особенности вируса гепатита В дикой и му-тантной форм в трех регионах российской федерации // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Санкт-Петербург, 2007

18. Сидоренко С.В. Бета-лактамазы расширенного спектра действия: клиническое значение и методы детекции // Инфекции и антимикробная терапия. 2002. - Т. 4 . - № 6. - С. 23-29.

19. Сидоренко С.В. Проблемы этиотропной терапии внебольничных инфекций дыхательных путей // Инфекции и антимикробная терапия. 1999. - Т. 4. - № 1. - С. 4—9.

20. Сидоренко С.В. Резистентность микроорганизмов и антибактериальная терапия // Русский медицинский журнал. 1998. - Т. 6. - № 11.

21. Страчунский J1.C., Кречикова О.И., Решедько Г.К. и др. Чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных от здоровых детей из организованных коллективов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. -1999. Т. 1. - № 1. - С. 31 - 39.

22. Шилова М.В. Распространенность туберкулеза в Российской Федерации /М.В. Шилова // Главврач. 2005. - № 3. - С. 73-87.

23. Abeck D., Johnson А.Р., Grimm W. et al. Plasmid content, serotypes, and antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Munich in 1987-1988 // Eur J Epidemiol. 1989. -Vol. 5.-P. 170-172.

24. Abel A., Sanchez S., Arenas J. et al. Bioinformatic analysis of outer membrane proteome of Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica // Int Microbiol. 2007. —Vol. 10. — P. 5-11.

25. Adam H.J., Schurek K.N., Nichol K.A. Molecular characterization of increasing fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae isolates in Canada, 1997 to 2005 // Antimicrob Agents Chemother. -2007. -Vol. 51. P. 198-207.

26. Ahmad S., Jaber A.A., Mokaddas E. Frequency of embB codon 306 mutations in ethambutol-susceptible and -resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Kuwait. // Tuberculosis. 2007. -Vol. 87.-P. 123-129.

27. Ahmad S., Mokaddas E., Jaber A.-A. Rapid detection of ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by PCR-RFLP targeting embB codons 306 and 497 and iniA codon 501 mutations // Mol Cell Probes. 2004. -Vol. 18. -P. 299-306.

28. Akhras M.S., Unemo M., Thiyagarajan S. et al. Connector inversion probe technology: a powerful one-primer multiplex DNA amplification system for numerous scientific applications // PLoS ONE. -2007.-Vol. 2.-P. e915.

29. Alangaden G.J., Kreiswirth В., Aouad A. et al. Mechanism of resistance to amikacin and kana-mycin in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. 1998. - Vol. 42. - P. 12951297.

30. Albrethsen J. Reproducibility in Protein Profiling by MALD1-TOF Mass Spectrometry // Clinical Chemistry. 2007. - Vol. 53. - P. 852-858.

31. A. Fernardo, Pfyffer G.E., Telenti A. Role of embB in Natural and Acquired Resistance to Ethambutol in Mycobacteria//Antimicrob Agents Chemother. 1997.-Vol. 41.-P. 2270-2273.

32. Alexander S., Martin I.M., Fenton K., Ison C.A. The prevalence of proline iminopeptidase negative Neisseria gonorrhoeae throughout England and Wales // Sex Transm Infect. 2006. -Vol. 82. - P. 280-282.

33. Al-Haroni M., Skaug N., Bakken V., Cash P. Proteomic analysis of ampicillin-resistant oral Fu-sobacterium nucleatum. // Oral Microbiol Immunol. -2008. -Vol. 23. P. 36-42.

34. Allix-Beguec C., Supply P., Fauville-Dufaux M. Utility of fast mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat genotyping in clinical mycobacteriological analysis // Clin Infect Dis. -2004. -Vol. 39. -P. 783-789.

35. Anhalt J.P., Fenselau C. Identification of bacteria using mass spectrometry // Analytical Chemistry. -1975. -Vol. 47. -P. 219-225.

36. Annenkov V.V., Levina A.S., Danilovtseva E.N., et al. Functionalized nanocomposite coating of a glass surface for oligonucleotide immobilization // Bioorg Khim. -2006. -Vol. 32. -P. 511-519.

37. Anthony R.M., Brown T.J., French G.L. Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array // J Clin Microbiol. 2000. -Vol.38.-P. 781-788.

38. Anti-tuberculosis drug resistance in the world. // The WHO/IUATLD Global Project on Antituberculosis Drug Resistance Surveillance., 4th global report. 2008.

39. Araus-Ruiz P., Norder H., Visona K.A., et al. Genotype F prevails in HBV infected patients of hispanic origin in Central America and may carry the precore stop mutant // J Med Virol. -1997. —Vol. 51. -P. 305-312.

40. Arauz-Ruiz P., Norder H., Robertson B.H., Magnius L.O. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis В virus revealed in Central America// J. Gen. Virol. -2002. -Vol. 83. -P. 2059-2073.

41. Arbique J.C., Poyart C., Trieu-Cuot P. et al. Accuracy of phenotypic and genotypic testing for identification of Streptococcus pneumoniae and description of Streptococcus pseudopneumoniae sp // J Clin Microbiol. 2004. -Vol. 42. -P. 4686-4696.

42. Arlet G., Philippon A. PCR-based approaches for the detection of bacterial resistance. // G. D. Ehrlich and S. J. Greenberg. PCR-based diagnostics in infectious diseases / Blackwell Scientific Publications. Oxford, United Kingdom. 1994. - P. 665-687.

43. Ayer V., Tewodros W., Manoharan A., et al. Tetracycline resistance in group a streptococci: emergence on a global scale and influence on multiple-drug resistance // Antimicrob Agents Chemother. -2007.-Vol. 51.-P. 1865-1868.

44. Backman M., Ruden A.K., Bygdeman S.M., et al. Gonococcal serovar distribution in Stockholm with special reference to multipule infections and infected partners //'Acta Pathol Microbiol Immunol Scand. -1985. Vol. 93. - P. 225 - 232.

45. Balsalobre L., Ferrandiz M.J., Linares J. et al. Viridans group streptococci are donors in horizontal transfer of topoisomerase iv genes to streptococcus pneumoniae // Antimicrob Agents Chemother. -2003. Vol. 47. - P. 2072-2081.

46. Balsalobre L., Hernandez-Madrid A., Llull D. et al. Molecular characterization of disease-associated streptococci of the mitis group that are optochin susceptible // J Clin Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 4163-4171.

47. Banerjee A., Dubnau E., Quemard A., et al. InhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis. // Science. 1994. - Vol. 263. — P. 227-230.

48. Banerjee A., Sugantino M., Sacchettini J.C., Jacobs W.R.Jr. The mabA gene from the inhA ope-ron of Mycobacterium tuberculosis encodes a 3-ketoacyl reductase that fails to confer isoniazid resistance // Microbiology. 1998. - Vol. 144. -P. 2697-2707.

49. Barun M., Kurepina N.E., Bifani P.J. and Kreiswirth B.N. Molecular Epidemiology of Tuberculosis: Current Insights // Clinical Microbiology Reviews. 2006. - Vol. 19. - P. 658-685.

50. Baiimert T.F., Rogers S.A., Hasegawa K., Liang T.J. Two Core Promotor Mutations Identified in a Hepatitis В Virus Strain Associated with Fulminant,Hepatitis Result in Enhanced Viral Replication // J Clin Invest. 1996. - Vol. 98. - P. 2268-2276.

51. Beavis R.C., Chait B.T. Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins // Rapid Commun Mass Spectrom. -1989. -Vol. 3. -P.432-435.

52. Beavis R.C., Chaudhary Т., Chait B.T. a-cyano-4-hydroxycinnamic acid as a matrix for matrix-assisted laser desorption mass spectrometry // Org. Mass Spectrom. 1992. - Vol. 27. - P. 156-158.

53. Behr Т., Koob C., Schedl M. et al. A nested array of rRNA targeted probes for the detection and identification of enterococci by reverse hybridization // Syst Appl Mycrobiol. 2000. - Vol. 23. - P. 563572.

54. Belland R.J., Morrison S.G., Ison C., Huang W.M. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in analogous regions of gyrA and parC in fluoroquinolone-resistant isolates // Mol Microbiol. 1994. — Vol. 14.-P. 371-380.

55. Ben L.M. van Baar. Characterisation of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray mass spectrometry // FEMS Microbiology Reviews. 2000. - Vol. 24. - P. 193-219.

56. Bennett J.S., Jolley K.A., Sparling P.F., et al. Species Status of Neisseria gonorrhoeae: Evolutionary and Epidemiological Inferences from MLST// BMC Biol. 2007. - Vol. 5. - P. 35

57. Bergey D.H. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed. // Lippincott Williams & Wilkins.-1994.-ISBN.

58. Berlin K., Ballhause M. and Cardon K. Improved bisulfite conversion of DNA // 2005 Patent PCT/WO/2005/038051.

59. Bernardini G., Braconi D., Santucci A. The analysis of Neisseria meningitidis proteomes: reference maps and their applications // Proteomics. 2007. -Vol. 7. -P. 2933-2946.

60. Bernardini G., Braconi D., Martelli P., Santucci A. Postgenomics of Neisseria meningitidis for vaccines development// Expert Review of Proteomics. -2007. Vol. 4. - P. 667-677.

61. Bifani P.J., Mathema В., Kurepina N.E. and Kreiswirth B.N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains// Trend Microbiol. -2002. -Vol. 10. -P. 45 52.

62. Bilek N., Martin I.M., Bell G. et al. Concordance between Neisseria gonorrhoeae genotypes recovered from known sexual contacts // J Clin Microbiol. -2007. -Vol. 45. -P. 3564-3567.

63. Bjellqvist В., Ek K., Righetti P.G. et al. Isoelectric focusing in immobilized,pH gradients: Principle, methodology and some applications Hi Biochem Biophys Methods. 1982. - Vol. 6. - P. 317-339.

64. Blumberg B.S., Sutnick A.I., London W.T. Australia antigen and hepatitis-// JAMA. 1969. -Vol. 207.-P. 1895-1896.

65. Bos M.P., Tommassen J. Biogenesis of the Gram-negative bacterial outer membrane // Current Opinion in Microbiology.-2004.-Vol. 7.-P. 610-616.

66. Boslego J.W., Tramont E.C., Takafuji E.T. et al. Effect of spectinomycin use on the prevalence of spectinomycin-resistant and penicillinase-producing Neisseria4 gonorrhoeae // N Engl J Med. 1987. -Vol. 317.-P. 272-278.

67. Bottger E.C. and Springer B. Tuberculosis: drug resistance, fitness, and strategies for global control//Eur J Pediatr. 2008. - Vol. 167.-P. 141-148.

68. Bouchara J.P., Hsieh H.Y., Croquefer S. et al. Development of an oligonucleotide array for direct detection of fungi in sputum samples from patients with cystic fibrosis // J CliniMicrobiol. — 2009. Vol. 47.-P. 142-152.

69. Bozdogan В., Appelbaum P.C., Kelly L.M. et al. Activity of telithromycin and seven other agents against 1034 pediatric Streptococcus pneumoniae isolates from ten central and eastern European centers// Clin Microbiol Infect 2003. - Vol. 9. - P. 653-661.

70. Brennan P.J. The envelope of mycobacteria. // Ann Rev Biochera. 1995. - Vol. 64. - P. 29-63.236

71. Brown S.D., Farrell D.J. Antibacterial susceptibility among Streptococcus pneumoniae isolated from paediatric and adult patients as part of the PROTEKT US study in 2001-2002. // J. Antimicrob Chemother. 2004. - Vol. 54. - P. i23-i29.

72. Brunham R.C., Plummer F., Slaney L. et al. Correlation of auxotype and protein I type with expression of disease due to Neisseria gonorrhoeae // J Infect Dis. -1985. Vol. 152. - P. 339 - 343.

73. Bukh J., Purcell R.H. and Miller R.H. Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis С virus // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. - Vol. 89. -P. 4942-4946.

74. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the core gene of the 14 hepatitis С virus genotypes. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. - Vol. 91. - P. 8239-8243.

75. Bumann D., Jungblut P.R., Meyer T.F. Helicobacter pylori vaccine development based on combined subproteome analysis// Proteomics 2004. - Vol. 4. - P. 2843-2853.

76. Bygdeman S.M., Mardh P.A., Sandstrom E.G. Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae to rifampi-cin and thiamphenicol: correlation with protein I antigenic determinants // Sex Transm Dis. 1984. - Vol. 11.-P. 366-370.

77. Cannon J.G., Buchanan T.M., Sparling P.F. Confirmation of association of protein I serotype of Neisseria gonorrhoeae with ability to cause disseminated infection // Infect Immun. -1983. Vol. 40. - P. 816-819.

78. Carapito R., Chesnel L., Vernet T. and Zapun A. Pneumococcal D-Lactam Resistance Due to a Conformational Change in Penicillin-binding Protein 2x. // J Biol Chem. 2006. - Vol. 281. - P. 17711777.

79. Carvalho M.G.S., Steigerwalt A.G., Thompson T. et al. Confirmation of nontypeable Streptococcus pneumoniae-like organisms isolated from outbreaks of epidemic conjunctivitis as Streptococcus pneumoniae. //J Clin Microbiol. -2003. Vol.41. - P. 4415-4417.

80. Castanheira M., Gales A.C., Mendes R.E., et al. Antimicrobial susceptibility of Streptococcus pneumoniae in Latin America: results from five years of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program // Clin Microbiol Infect 2004. - Vol. 10. - P. 645-651.

81. Chan H.L., Wong M.L., Hui A.Y. et al. Hepatitis В virus genotype С takes a more aggressive disease course than hepatitis В virus genotype В in hepatitis В e antigen-positive patients Hi Clin Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 1277-1279.

82. Chan S.W., McOmish F., Holmes E.C. et al. Analysis of a new hepatitis С virus type and its phy-logenetic relationship to existing variants //J Gen Virol. 1992. - Vol. 73. - P. 1131-1141.

83. Chandler L.J., Reisner B.S., Woods G.L. and Jafri A.K. Comparison of four methods for identifying Streptococcus pneumoniae // Diagn Microbiol Infect Dis. -2000. Vol. 37. P. 285-287.

84. Chee M., Yang R., Hubbell E., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays // Science. 1996. - Vol. 274, - P. 610-614.

85. Chen С. C., Teng L. J., Kaiung S., Chang Т. C. Identification of clinically relevant viridans streptococci by an oligonucleotide array //J Clin Microbiol. -2005. -Vol. 43. -P. 1515-1521.

86. Cheng V.C., Yew W.W., Yuen K.Y. Molecular diagnostics in tuberculosis. // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005. - Vol. 24. - P. 711-720.

87. Chi F., Nolte O., Bergmann C., lp M., Hakenbeck R. Crossing the barrier: Evolution and spread of a major class of mosaic pbp2x in Streptococcus pneumoniae, S. mitis and S. oralis. // Int J Med Microbiol. 2007. - Vol. 297. - P. 503-512.

88. Cho J.C., Tiedje J. M. Quantitative detection of mycrobial genes by using DNA // Appl Environ Mycrobiol. 2000. - Vol. 66. - P. 1425-1430.

89. Choo Q.L., Kuo G., Weiner J. et al. Isolation of cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B hepatitis genome // Science. 1989. - Vol. 244. - P. 359-362.

90. Chopra I., Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance // Microbiol Mol Biol Rev. -2001. -Vol. 65. -P. 232-260.

91. Chouchane S., Lippai 1. and Magliozzo R.S. Catalaseperoxidase (Mycobacterium'tuberculosis KatG) catalysis and isoniazid activation // Biochemistry 2000. - Vol. 39. - P. 9975-9983.

92. Chung G.T., Yoo J.S., Oh II.B. et al. Complete Genome Sequence of Neisseria gonorrhoeae NCCP11945 // J Bacteriol. -2008. -Vol. 190. -P. 6035-6036.

93. Claudio P., A. Olivieri, L. Benacchio, C. Scarparo. Current Perspectives on Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Complex: the Automated Nonradiometric Systems // J Clin Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 20-28.

94. Cole J.N., Henningham A., Gillen C.M. et al. Human pathogenic streptococcal proteomics and vaccine development // Proteomics Clin. Appl. 2008. - V. 2. - P. 387^110.

95. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. 1998. -Vol. 393. - P. 537-544.

96. Connell S.R., Tracz D.M., Nierhaus K.H., Taylor D.E. Ribosomal protection proteins and their mechanism of tetracycline resistance // Antimicrob Agents Chemother. —2003. —Vol. 47. —P. 3675-3681.

97. Cooksey R.C., Morlock G.P., Mcqueen A. et al. Characterization of streptomycin resistance mechanisms among Mycobacterium tuberculosis isolates from New York City // Antimicrob Agents Chemother 1996. - Vol. 40. - P. 1186-1188.

98. Corkill J.E., Percival A., Lind M. Reduced uptake of ciprofloxacin in a resistant strain of Neisseria gonorrhoeae and transformation of resistance to other strains // J Antimicrob Chemother. 1991. -Vol. 28.-P. 601-604.

99. Courvalin P. Genotypic approach to the study of bacterial resistance to antibiotics // Antimicrob Agents Chemother. 1991.-Vol. 35.-P. 1019-1023.

100. Criswell D., Tobiason V.L., Lodmell J.S., Samuels D.S. Mutations conferring aminoglycoside and spectinomycin resistance in Borrelia burgdorferi // Antimicrob Agents Chemother. 2006. - Vol. 50. .p. 445-452.

101. Csonka L.N. Physiological and Genetic Responses of Bacteria to Osmotic Stress// Microbiological Reviews. 1989. - Vol. 53. - P. 121-147.

102. Currie G.J. and Yates J.R. Analysis of oligodeoxynucleotides by negative-ion matrix-assisted la-ser-desorption mass-spectrometiy //J Am Soc Mass Spectrom. 1993. - Vol. 4. - P. 955-963.

103. Cynamon M.H., Klemens S.P. Antimycobacterial activity of a series of pyrazinoic acid esters // J Med Chem. 1992. - Vol. 35. - P. 1212-1215.

104. Davidson F., Simmonds P., Ferguson J.C., et al. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis С virus using RFLP of sequences amplified from the 5' non-coding region // J Gen Virol. 1995. -Vol. 76.-P. 1197-1204.

105. De Barber A.E., Mdluli K., Bosman M. et al. Ethionamide activation and sensitivity in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis // Proc Natl Acad Sci USA. 2000.- - Vol. 97. - P. 9677-9682.

106. De Castillo M.C., de Saab O.A., de Nader O.M., de Ruiz Holgado A.P. In vitro comparison of disk diffusion and agar dilution antibiotic susceptibility test methods for Neisseria gonorrhoeae // Mem Inst Oswaldo Cruz. 1998: -Vol. 93. - P. 517-522.

107. De Jongh M., Dangor Y., Ison C., Hoosen A. Neisseria gonorrhoeae multi-antigen sequence typing (NG-MAST) of ciprofloxacin resistant isolates of Pretoria, South Africa // J Clin Pathol. 2008. -Vol. 61.-P. 686-687.

108. Deguchi Т., Yasuda M., Asano M:, et al. DNA gyrase mutations in fluoro-quinolone-resistant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae // Antimicrob Agents Chemother. 1995. - Vol. 39. - P.' 561563.

109. Dillon J.R:, Li H., Yeung K.H., Aman T.A. A PCR assay for discriminating Neisseria gonorrhoeae P-lactamase-producing plasmids // Mol Cell Probes. 1999. - Vol. 13. - P. 89-92.

110. Distler A.M. and Allison J. 5-MethoxysaIicylic acid and spermine: a new matrix for the matrix-assisted laser, desorption/ionization mass spectrometry analysis of oligonucleotides // J Am. Soc. Mass Spectrom. 2001. - Vol. 12. - P. 456-462.

111. Dowson C.G., Jephcott A.E., Gough K.R., Spratt B.G. Penicillin-binding protein 2 genes of non-beta-lactamase-producing, penicillin-resistant strains of Neisseria'gonorrhoeae // Mol Microbiol. 1989. -Vol. 3.-P. 35-41.

112. Drlica K. and Malik M. Fluoroquinolones: action.and resistance // Curr Top Med Chem. 2003. -Vol. 3.-P. 249-282.

113. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevsky V. et al. Drug-Resistant Tuberculosis, Clinical Virulence, and the Dominance of the Beijing Strain Family in Russia // JAMA. 2005. -Vol. 293. -P. 2726-2731.

114. Drummelsmith J., Winstall E., Bergeron M.G. et al. Comparative proteomics analyses reveal a potential biomarker for the detection of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains // J Proteome Res. 2007. - Vol. 6. - P. 4690-4702.

115. Ecker J.A., Massire C., Hall T.A. et al. Identification of Acinetobacter Species and Genotyping of Acinetobacter baumannii by Multilocus PCR and Mass Spectrometry // J Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44.-P. 2921-2932.

116. Ecker D.J., Sampath R., Blyn L.B. et al. Rapid identification and strain-typing of respiratory pa- j thogens for epidemic surveillance // Proc Natl Acad Sci USA. -2005. -Vol. 102. -P. 8012-8017.

117. Edwards J.R., Ruparel H., Ju J. Mass-spectrometry DNA sequencing (review) // Mutation Research.-2005. Vol. 573.-P. 3-12.

118. Edwards S. Balanitis and balanoposthitis: a review. // Genitourinary Medicine. — 1996. — Vol. 72. -P. 155-159.

119. Elliott B. Mass Spectrometry Analysis of Oligonucleotide Syntheses // Integrated DNA Technologies. — 2005. — Technical bulletin.

120. Enomoto N., Kurosaki M., Tanaka Y. et al. Fluctuation of hepatitis С virus quasispecies in persistent infection and interferon treatment revealed by single-strand conformation polymorphism analysis // J Gen. Virol. 1994. -Vol. 75. - P. 1361-1369.

121. EUCAST. http://www.escmid.org/sites/indexf.aspx?par=2.4

122. Facklam R. What happed to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes // Clin. Microbiol. Rev. -2002. Vol. 15. - P. 613-630.

123. Facklam R., Pigott N. Description of phenotypic characteristics to aid in the identification of Streptococcus pneumonia // A. Totollan. Pathogenic streptococci: present and future. / Lancer Publications, St. Petersburg, 1994.

124. Farrell D.J., Douthwaite S., Morrissey I. et al. Macrolide Resistance by Ribosomal Mutation in Clinical Isolates of Streptococcus pneumoniae from the PROTEKT 1999-2000 Study // Antimicrob Agents Chemother. -2003. Vol. 47. - P. 1777-1783.

125. Farrell D.J., Morrissey I., Bakker S., et al. Molecular Epidemiology of Multiresistant Streptococcus pneumoniae with Both erm(B)- and'mef(A)-Mediated Macrolide Resistance // J Clin Microbiol. -2004. Vol. 42. - P. 764-768.

126. Farrell D.J. Evaluation of AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR Using cppB Nested PCR and 16S rRNA PCR // J Clin Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 386-390.

127. Feavers 1.М., Fox A.J., Gray S. et al. Antigenic diversity of meningococcal outer membrane protein PorA has implications for epidemiological analysis and vaccine design // Clin Diagn Lab Immunol. -1996.-Vol.3.-P. 444-450.

128. Fei Z., Ono Т., Smith L.M. MALDI-TOF mass spectrometric typing of single nucleotide polymorphisms with mass-tagged ddNTPs // Nucleic Acids Research. -1998. -Vol. 26. -P. 2827-2828.

129. Felmingham D., Canton R., Jenkins S.G. Regional trends in beta-lactam, macrolide, fluoroquinolone and telithromycin resistance among Streptococcus pneumoniae isolates 2001-2004. // J Infect. -2007.-Vol. 55.-P. 111-118.

130. Fenselau C., Demirev P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectr Rev. -2001. Vol. 20. - P. 157-171.

131. Ferrandiz M.J., Fenoll A., Linares J., De La Campa A.G. Horizontal transfer of parC and gyrA in fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Streptococcus pneumoniae // Antimicrob Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 840-847.

132. Francois P, Huyghe A, Charbonnier Y et al. Use of an automated multiple-locus, variable-number tandem repeat-based method for rapid and high-throughput genotyping of Staphylococcus aureus isolates. U J Clin Microbiol -2005. Vol. 43. - P. 3346-3355.

133. Friedrichs C., Rodloff A.C., Chhatwal G.S. et al. Rapid identification of viridans streptococci by mass spectrometric discrimination // J Clin Microbiol. — 2007. — Vol. 45. — P. 2392-2397.

134. Frothingham R., Meeker-O'Connell W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats II Microbiol. -1998. -Vol. 144. -P. 11891196.

135. Fu D.J., Tang K., Braun A. et al. Sequencing exons 5 to 8 of the p53 gene by MALDI-TOF mass spectrometry //Nat Biotechnol. 1998. - Vol. 16. - P. 381-384.

136. Fu Y., Xu S., Pan C. et al. A matrix of 3,4-diaminobenzophenone for the analysis of oligonucleotides by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Nucleic Acids Research 2006,- Vol. 34. - P. e94.

137. Fudyk T.C., Maclean I.W., Simonsen J.N. et al. Genetic Diversity and Mosaicism at the por Locus of Neisseria gonorrhoeae // J Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P.5591-5599.

138. Galimand M., Gerbaund G., Courvalin P. Spectinomycin resistance in Neisseria spp. due to mutations in 16S rRNA// Antimicrob Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 1365-1366.

139. Gangadharam P.R., Pratt P.F., Perumal V.K., Iseman M.D. The effects of exposure time, drug concentration, and temperature on the activity of ethambutol versus Mycobacterium tuberculosis// Am Rev Respir Dis. 1990. - Vol. 141. - P. 1478-1482.

140. Gill M. J., Simjee S., Al-Hattawi K., et al. Gonococcal resistance to p-lactams and tetracycline involves mutation in loop 3 of porin encoded at the penB locus. // Antimicrob Agents Chemother. 1998. -Vol. 42.-P. 2799-2803.

141. Gillespie D., Spiegelman S. A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane // J Molecular Biology. 1965. - Vol.12. - P.829-842.

142. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections. Overview and estimates // WHO. 2007. - P: 43.

143. Glynn J.R., Whiteley J., Bifani P.J. et al. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review // Emerg Infect Dis. -2002. -Vol.8. -P.843-849.

144. Gohlke R.S. Time-of-flight mass spectrometry and gas-liquid partition chromatography // Anal Chem. —1959. -Vol. 31.-P. 535-541.

145. Gohlke R.S., McLafferty F.W. Early gas chromatography/mass spectrometry // J Am Soc. Mass Spectrom. -1993. -Vol. 4. -P. 367-371.

146. Gonzalez-Peralta R.P., Liu W.Z., Davis G.L. et al. Modulation of hepatitis С virus quasispecies heterogeneity by interferon-alpha and ribavirin therapy // J Viral Hepat. -1997. -Vol. 4. -P. 99-106.

147. Gonzalez-Peralta R.P., Qian K.P., She J.Y et al. Clinical implications of viral quasispecies heterogeneity in chronic hepatitis С // J Med Virol. 1996. -Vol. 49. - P. 242-247.

148. Goswami M., Jawali N. Glutathione-mediated augmentation of 6-Iactam antibacterial activity against Escherichia coli // J Antimicrob Chemother. -2007. -Vol. 60. -P. 184-185.

149. Goswami M., Mangoli S.H. and Jawali N. Effects of glutathione and ascorbic acid on streptomycin sensitivity of Escherichia coli // Antimicrob Agents Chemother. -2007. -Vol. 51. -P. 1119-1122.

150. Goswami M., Mangoli S.H., Jawali N. Involvement of reactive oxygen species in the action of ciprofloxacin against Escherichia coli // Antimicrob Agents Chemother. -2006. -Vol. 50. -P. 949-954.

151. Gould R.G. Glutathione as an essential growth factor for certain strains of Neisseria Gonorrhoeae //J Biological Chemistry. -1944. -P. 143 150.

152. Grissa I., Bouchon P., Pourcel C., Vergnaud G. On-line resources for bacterial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing // Biochimie. -2008. -Vol. 90. -P. 660-668.

153. Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S. et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis // Clin Microb Infect. -2005. -Vol.11.-P. 531-539.

154. Haag A.M., Taylor S.N., Johnston K.H, Cole R.B. Rapid identification and speciation of Haemophilus bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // J Mass Spectrom. -1998. -Vol. 33. -P. 750-756.

155. Hafner R., Cohn J.A., Wright D.J. et al. Early bactericidal activity of isoniazid in pulmonary tuberculosis // Am J Respir Crit Care Med. -1997. -Vol. 156. -P. 918-923.

156. Hagman K.E., Pan W., Spratt B.G. et al. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to antimicrobial hydrophobic agents is modulated by the mtrRCDE efflux system // Microbiology. -1995. -Vol. 141. -P. 611-622.

157. Hail M.E., Elliott B. and Anderson A. High-throughput analysis of oligonucleotides using automated electrospray ionization mass spectrometry // Am Biotech Lab. -2004. —Vol. 22. -P. 12-14.

158. Hartmer R., Storm N., Boecker S. et al. RNase T1 mediated base-specific cleavage and MALDI-TOF MS for high-throughput comparative sequence analysis // Nucleic Acids Research. -2003. -Vol.31. -P. e47.

159. Hayashi J., Ohmiya M., Kishihara Y. et al. A statistical analysis of predictive factors of response to human lymphoblastoid interferon in patients with chronic hepatitis С // Am J Gastroenter. -1994. -Vol. 89.-P.2151-2156.

160. Hayashi J., Kishihara Y., Yoshimura E. et al. Relationship of genotype to level of hepatitis С vi-raemia determined by competitive polymerase chain reaction // J Infect. -1995. —Vol. 30. -P. 235-239.

161. Hazbon M.H., Brimacombe M., Bobadilla del Valle M. Population Genetics Study of Isoniazid Resistance Mutations and Evolution of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. -2006. -Vol. 50. -P. 2640-2649.

162. Heym В., Stavropoulos E., llonore N. et al. Effects of Overexpression of the Alkyl Hydroperoxide Reductase AhpC on the Virulence and Isoniazid Resistance of Mycobacterium tuberculosis // lnflm-mun.-1997. -Vol. 65.-P. 1395-1401.

163. Hill C., Cotter P.D., Sleator R.D., Gahan C.G.M. Bacterial stress response in Listeria monocytogenes: jumping the hurdles imposed by minimal processing // International Dairy Journal. -2002. -Vol.12.-P.273-283.

164. Hill C. S. Gen-Probe Transcription-Mediated Amplification: System Principles // Gen-Probe Incorporated. — 1996.

165. Hiller K., Schobert M., Hundertmark C. et al. JVirGel: calculation of virtual two-dimensional protein gels //Nucleic Acids Res. -2003. -Vol. 31. -P. 3862-3865.

166. Hobbs M.M., Alcorn T.M., Davis R.H. et al. Molecular typing of Neisseria gonorrhoeae causing repeated infections: evolution of porin during passage within a coMMunity // J Infect Dis. -1999. -Vol. 179.-P. 371-381.

167. Hodinka R.L. The clinical utility of viral quantitation using molecular methods// Clin Diagn Virol.-1998.-Vol. 10.-P. 25-47.

168. Hofstadle S.A., Cummins L.L. Method for rapid purification of nucleic acid for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture // Partent Application Publication. 2005. №: US 2005/0164215 Al.

169. Hofstadle S.A., Sampath R., Blyn L.B. et al. TIGER: the universal biosensor // International Journal of Mass Spectrometry. 2005. -Vol. 242. -P. 23^11.

170. Holland J.J., De La Torre J.C., Steinhauer D.A. RNA virus populations as quasispecies // Curr Top Microbiol Immunol. 1992. -Vol. 176. - P. 1-20.

171. Honisch C., Chen Y., Mortimer C. et al. Automated comparative sequence analysis by base-specific cleavage and mass spectrometry for nucleic acid-based microbial typing // Proc Natl Acad Sci U S A. -2007.-Vol. 104.-P. 10649-10654.

172. Ilina E.N., Malakhova M.V., Generozov E.V. et al. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization -Time of Flight (Mass Spectrometry) for Hepatitis С Virus Genotyping // J Clin Microbiol. -2005. -Vol. 43.-P.2810-2815.

173. Inoue M., Farrell D.J., Kaneko K. et al. Antimicrobial susceptibility of respiratory tract pathogens in Japan during PROTEKT years 1-5 (1999-2004) // Microb Drug Resist. -2008. -Vol. 14. -P. 109-17.

174. Inoue M., Lee N.Y., Hong S.W. et al. PROTEKT 1999-2000: a multicentre study of the antibiotic susceptibility of respiratory tract pathogens in Hong Kong, Japan and South Korea // lnt J Antimicrob Agents. -2004. -Vol. 23. -P. 44-51.

175. Interim recommendations for the surveillance of drug resistance in tuberculosis. // WHO document. 2007.

176. Ito M., Deguchi Т., Mizutani K.S. et al. Emergence and spread of Neisseria gonorrhoeae clinical isolates harboring mosaic-like structure of penicillin-binding protein 2 in central Japan // Antimicrob Agents Chemother.-2005.-Vol. 49.-P. 137-143.

177. Ito Т., Mukaigawa J., Zuo J. et al. Cultivation of hepatitis С virus in primary hepatocyte culture from patients with chronic hepatitis С results in release of high titre infectious virus // J Gen Virol. — 1996.-Vol. 77.-P. 1043-1054.

178. Jacoby G.A., Walsh K.E., Mills D.M. et al. qnrB, Another Plasmid-Mediated Gene for Quinolone Resistance // Antimicrob Agents Chemother. 2006. -Vol. 50. - P. 1178-1182.

179. Janoir C., Zeller V., Kitzis M.D. et al. High-level fluoroquinolone-resistance in Streptococcus pneumoniae requires mutations in parC and gyrA // Antimicrob Agents Chemother. 1996. - Vol. 40. -P. 2760-2764.

180. Jiao W., Mokrousov I., Sun G. et al. Evaluation of New Variable-Number Tandem-Repeat Systems for Typing Mycobacterium tuberculosis with Beijing Genotype Isolates from Beijing, China // J Clin Microbiol. 2008. -Vol. 46. -P. 1045-1049.

181. Jolley K. A., Feil E.J., Chan M.S., Maiden M.C. Sequence type analysis and recombinational tests (START) // Bioinform. 2001. -Vol. 17. - P. 1230-1231.

182. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology //J Clin Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 907-914.

183. Kao J.H., Chen P.J., Lai M.Y., Chen D.S. Hepatitis В genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis В // Gastroenterology. 2000. - Vol. 118. - P. 554-559.

184. Kao J.H., Wu N.H., Chen P.J. et al. Hepatitis В genotypes and'the response to interferon therapy // J Hepatol. 2000. - Vol. 33. - P. 998-1002.

185. Karas M.", Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10000 daltons H Anal Chem. 1988. - Vol. 60. - P. 2299- 2301.

186. Kawamura Y., Whiley R-.A., Shu S.-E. et al. Genetic approaches to the identification of the mitis group within the genus Streptococcus // Microbiology. 1999. - Vo. 145. - P. 2605-2613.

187. Kearns A.M., Wheeler J., Freeman R. et al. Pneumolysin detection identifies atypical isolates of Streptococcus pneumoniae // J Clin Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 1309-1310.

188. Kehrenberg C., Schwarz S. Mutations in 16S rRNA and ribosomal protein S5 associated with high-level spectinomycin resistance in Pasteurella multocida // Antimicrob Agents Chemother. 2007. -Vol. 51.-P. 2244-2246.

189. Kelley C.L., Rouse D.A., Morris S.L. Analysis of ahpC Gene Mutations in Isoniazid-Resistant Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. 1997. -Vol. 41. - P. 2057-2058.

190. Keys C.J., Dare D.J., Sutton H. et al. Compilation of a MALDI-TOF mass spectral database for the rapid screening and characterisation of bacteria implicated in human infectious diseases // Infect Genet Evol. 2004. - Vol.- 4. - P: 221-242.

191. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y., Kidd A.H. Genetic variability in hepatitis В viruses // J Gen Virol. 2002. - Vol! 83. - P. 1267-1280.

192. Kim H. J., Park S. H., Lee Т. H. et al. Microarray detection of food-borne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics // Biosens Bioelectron. 2008. -Vol. 24. - P. 238-246.

193. Kim S.J. Drug-susceptibility testing in tuberculosis: methods and reliability of results // Eur Res-pir J. 2005. - Vol. 25. - P. 564-569.

194. Kinter M., Sherman N.E. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry / New York: Wiley-Interscience; 2000.

195. Kirpekar F., Nordhoff E., Kristiansen K. et al. 7-Deaza purine bases offer a higher ion stability in the analysis of DNA by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry // Rapid Commun Mass Spectrom. 1995. - Vol. 9. - P. 525 - 531.

196. Kirpekar F., Nordhoff E., Kristiansen K. et al. Matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of enzymatically synthesized RNA up to 150 kDa // Nucleic Acids Res. 1994. - Vol. 22. -P. 3866-3870.

197. Kirpekar F., Nordhoff E., Larsen L.K. et al. DNA sequence analysis by MALDI mass spectrometry // Nucleic Acids Research. 1998. -Vol. 26. - P. 2554-2559.

198. Kirschberg O., Schuttler C., Repp R., Schaefer S. A multiplex-PCR to identify hepatitis В virus genotypes A-F // J Clin Virol. 2004. -Vol. 29. - P. 39-43.

199. Kirthi N, Roy-Chaudhuri B, Kelley T, Culver GM. A novel single amino acid change in small subunit ribosomal protein S5 has profound effects on translational fidelity. // RNA. 2006. - Vol. 12. -P. 2080-2091.

200. Knapp J.S., Tam M.R., Nowinski R.C. et al. Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with use of monoclonal antibodies to gonococcal outer membrane protein I // J Infect Dis. 1984. — Vol. 150.-P. 44-48.

201. Koh Т.Н., Sng L.-H., Babini G.S. et al. Hall Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae in Singapore Producing IMP-1 b-Lactamase and Lacking an Outer Membrane Protein // Antimicrob Agents Chemother. -2001. -Vol. 45. -P. 1939-1940.

202. Kremer K., Glynn J.R., Lillebaek T. et al. Definition of the Beijing/W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers // J Clin Microbiol. -2004. -Vol. 42. -P. 4040-4049.

203. Kumar M.P., Vairamani M., Raju R.P. et al. Rapid discrimination between strains of beta haemo-lytic streptococci by intact cell mass spectrometry // Indian J Med Res. 2004. - Vol. 119. - P. 283-288.

204. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief Bioinform. -2004. Vol. 5. - P.150-163.

205. Lapierre P., Huletsky A., Fortin V. et al. Real-Time PCR Assay for Detection of Fluoroquinolone Resistance Associated with grlA Mutations in Staphylococcus aureus // J Clin Microbiol. 2003. - Vol. 41.-P. 3246-3251.

206. Larsen M.H., Vilcheze C., Kremer L. et al. Overexpression of inhA, but'not kasA, confers resistance to isoniazid and ethionamide in Mycobacterium smegmatis, M. bovis BCG and M. tuberculosis // Molec Microbiol. 2002. -Vol 46. - P. 453-466.

207. Laszlo A., Gill P., Handzel V. et al. Conventional and radiometric drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex// J Clin Microbiol. 1983. -Vol. 18. -P. 1335-1339.

208. Lavender С., Globan M., Sievers A. et al. Molecular Characterization of Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates Collected in Australia // Antimicrob Agents Chemother. 2005. -Vol. 49. - P.4068—4074.

209. Lay J.O.Jr. MALDI-TOF Mass Spectrometry of Bacteria // Mass Spectr Rev. 2001. - Vol. 20. -P. 172-194.

210. Le Fleche P., Fabre M., Denoeud F. et al. High resolution, on-line identification of strains from the Mycobacterium tuberculosis complex based on tandem repeat typing // BMC Microbiol. 2002. -Vol. 2. -P. 37-49.

211. Le Fleche P., Hauck Y., Onteniente L. et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis // BMC Microbiology. 2001. -Vol. 1.-P.2.

212. Le Guillou-Guillemette H., Vallet S., Gaudy-Graffin C. et al. Genetic diversity of the hepatitis С virus: impact and issues in the antiviral therapy // World J Gastroenterol. 2007. -Vol. 13. -P. 24162426.

213. Lee J.H., Stripf Т., Roth W.K., Zeuzem S. Non-isotopic detection of hepatitis С virus quasispe-cies by single strand conformation polymorphism // J Med Virol. 1997. -Vol. 53. - P. 245-251.

214. Lee A.S.G., Teo A.S.M. and Wong S.Y. Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates // Antimicrob Agents Chemother. 2001.- Vol. 45. - P. 2157-2159.

215. Lee A.S., Othman S.N., Ho Y.M'. and Wong S.Y. Novel mutations within the embB gene in ethambutol-susceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - Vol. 48. - P. 4447-4449.

216. Lee H.Y., Myoung H.J., Bang H.E. et al. Mutations in the embB locus among Korean clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis resistant to ethambutol // Yonsei Med J. 2002. — Vol. 43. - P. 59-64.

217. Lefmann M., Honisch C., Bocker S. et al. Novel mass spectrometry-based tool for genotypic identification of mycobacteria // J Clin Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 339-346.

218. Lei В., Wei C.J. and Tu S.C. Action mechanism of antitubercular isoniazid. Activation by Mycobacterium tuberculosis KatG, isolation, and characterization of InhA inhibitor // J Biol Chem. 20002. — Vol. 75. - P. 2520-2526.

219. Levin M.E, Hatfull G.F. Mycobacterium smegmatis RNA polymerase: DNA supercoiling, action of rifampicin and mechanism of rifampicin resistance // Mol Microbiol. 1993. - Vol. 8. - P. 277-285.

220. Li Z., Yokoi S., Kawamura Y. et al. Rapid detection of quinolone resistance-associated gyrA mutations in Neisseria gonorrhoeae with a LightCycler // J Infect Chemother. 2002. - Vol. 8. - P. 145150.

221. Liang T.J., Hasegawa K., Rimon N. et al. A hepatitis В virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis //New England Journal of Medicine. 1991. -Vol. 324. - P. 1705-1709.

222. Liao M., Helgeson S., Gu W.-M. et al. Comparison of Neisseria gonorrhoeae Multiantigen Sequence Typing and porB Sequence Analysis for Identification of Clusters of N. gonorrhoeae Isolates // J Clin Microbiol. 2009. -Vol. 47. - P. 489 - 491.

223. Lindbiick E., Islam S., Unemo M. et al. Transformation of ciprofloxacin-resistant Neisseria gonorrhoeae gyrA, parE and porBlb genes // lnt J Antimicrob Agents. 2006. - Vol. 28. - P. 206-211.

224. Lindenbach B.D., Evans M.J., Syder A.J. et al. Rice complete replication of hepatitis С virus in cell culture // Science. 2005. - Vol. 309. - P. 623-626.

225. Lindh M., Gonzalez J.E., Norkrans G., Horal P.' Genotyping of hepatitis В virus by restriction pattern analysis of a pre-S amplicon // J Virol Methods. 1998. - Vol. 72. - P. 163-174.

226. Lindh M., Hannoun C., Dhillon A.P. et al. Core promoter mutations and genotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis В virus carriers // J Infect Dis. 1999. - Vol. 179.-P. 775-782.

227. Lindroos K., Liljedahl U., Raitio M., Syvanen A.C. Minisequencing on oligonucleotide microar-rays: comparison of immobilisation chemistries // Nucleic Acids Res. 2001. -Vol. 29 - P. e69.

228. Little D.P., Thannhauser T.W., McLafferty F.W. Verification of 50- to 100-mer DNA and RNA sequences with high-resolution mass spectrometry // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. - Vol. 92. - P. 2318-2322.

229. Luna V.A., Cousin S., Whittington W.L.Jr. and Roberts M.C. Identification of the conjugativemef gene in clinical Acinetobacter junii and Neisseria gonorrhoeae isolates // Antimicrob Agents Chermother. 2000. - Vol. 44. - P. 2503-2506.

230. Lunel F., Cresta P., Vitour D. et al. Comperetive evolution of hepatitis С virus RNA quantitation by branched DNA, NASBA and monitor assay// Hepatology. -1999. -Vol. 29. P. 528-535.

231. Lynn E.C., Chung M.C., Tsai W.C., Han C.C. Identification of Enterobacteriaceae-Bacteria by Direct Matrix-assisted Laser Desorption/ionization Mass Spectrometric Analysis of Whole Cells // Rapid Comm Mass Spectrom. 1999. - Vol. 13. - P. 2022-2027. ■ 7

232. Mager D.L., Ximenez-Fyvie L.A., Haffajee A.D. and Socransky S.S. Distribution of selected bacterial species on intraoral surfaces // J Clin Periodontal. 2003. - Vol. 30. - P. 644-654.

233. Maggi F., Fornai C., Vatteroni M.L. et al. Differences in hepatitis С virus quasispecies composition between liver, peripheral blood mononuclear cells and plasma // J Gen Virol. — 1997. -Vol. 78. P. 1521-1525.

234. Magnius L.O. and Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis В virus as reflected by sequence variability of the S-gene // Intervirology. -1995. -Vol. 38. -P. 24-34.

235. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. Vol. 95.-P. 3140-3145.

236. Maier Т., Klepel S., Renner U., and Kostrzewa M. Fast and reliable MALDI-TOF MS-based microorganism identification II Nature Methods, Nature Publishing Group. Application notes. — 2006.

237. Markiewicz Z., Tomasz A. Variation in pcnicillin-binding proteins of penicillin-resistant clinical isolates of pneumococci // J Clin Microbiol. 1989. -Vol. 27.- P. 405-410.

238. Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V. et al. Determination of hepatitis С virus genotypes in the United States by cleavase fragment length polymorphism analysis // J Clin Microbiol. 1997. - Vol. 35.-P. 3156-3162.

239. Martin C.J. Maiden Population genomics: diversity and virulence in the Neisseria // Curr Opin Microbiol. 2008. - Vol. 11. - P. 467-471.

240. Martin I., Foreman E., Hall V. et al. Non-cultural detection and molecular genotyping of Neisseria gonorrhoeae from a piece of clothing // J Med Microbiol. 2007. -Vol. 56. - P. 487-490.

241. Martin 1., Ison C., Aanensen D. et al. Rapid sequence-based identification of gonococcal transmission clusters in a large metropolitan area // J Infect Dis. 2004. -Vol. 189. - P. 1497-1505.

242. Marttila H.J., Soini H., Huovinen P. and Viljanen M.K. katG Mutations in Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates Recovered from Finnish Patients II Antimicrob Agents Chemother.- 1996. -Vol. 40.-P. 2187-2189.

243. Masip L., Veeravalli K., Georgiou G. The Many Faces of Glutathione in Bacteria // Antioxid Redox Signal. 2006. -Vol. 8. - P. 753-762.

244. Maurer P., Koch B. and Hakenbeck R. Penicillin-binding Protein 2x of Streptococcus pneumoniae: Three New Mutational Pathways for Remodelling an Essential Enzyme into a Resistance Determinant//J Mol Biol.-2008.-Vol. 376.-P. 1403-1416.

245. Mazars E., Lesjean S., Banuls A.-L. et al. High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology // Proc Natl Acad Sci USA.-2001.-Vol. 98.-P. 1901-1906.

246. McAvin J.C., Reilly P.A. and Lohman K.L. Sensitive and specific method for rapid identification of Streptococcus pneumoniae using real-time fluorescence PCR // J Clin Microbiol. 2001. - Vol. 39. -P.3446-3451.

247. McCammon M.T., Gillette J.S., Thomas D.P. Detection of rpoB mutations associated with rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis using denaturing gradient gel electrophoresis // Antimicrob. Agents Chemother. -2005. -Vol. 49. -P. 2200-2209.

248. McLuckey S.A., Habibi-Goudarzi S. Ion Trap Tandem Mass Spectrometry Applied to Small Multiply Charged Oligonucleotides with a Modified Base // J Am Sot Mass Spectrom. 1994. - Vol. 5. - P. 740-747.

249. Mikusova K., Slayden R.A., Besra G.S. and Brennan P.J. Biogenesis of the mycobacterial cell wall and the site of action of ethambutol 11 Antimicrob Agents Chemother. 1995. - Vol. 39. - P. 24842489.

250. Miller L.P, Crawford J.T, Shinnick T.M. The rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. 1994. - Vol. 38. - P. 805-811.

251. Mizokami M., NakanoT., Orito E. et al. Hepatitis В virus genotype assignment using restriction fragment length polymorphism patterns // FEBS Lett. 1999. - Vol. 450. - P. 66-71.

252. Moazed D., Noller H.F. Interaction of antibiotics with functional sites in 16S ribosomal RNA // Nature. 1987. - Vol. 327. - P. 389-394.

253. Mokrousov I., Bhanu N.V. and Schouls L.M. Multicenter evaluation of reverse line blot assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J Microbiol Methods. -2004. Vol. 57. - P. 323-335.

254. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeschenko E. et al. Detection of ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by multiplex Allele-Specific PCR assay targeting embB306 mutations // J Clin Microb. -2002. -Vol. 40. -P. 1617-1720.

255. Moonan P.K., Bayona M., Quitugua T.N. et al. Using GIS technology to identify areas of tuberculosis transmission and incidence // International Journal of Health Geographies. 2004. - Vol. 3. - P. 23.

256. Morozov V.M., Pisareva M.M., Groudinin M.P. Homologous recombination between different genotypes of hepatitis В virus // GENE. 2000. - Vol. 260. - P. 55-65.

257. Morrison K.E., Lake D., Crook J. et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis // J Clin Microbiol. -2000. Vol. 38. - P. 434-437.

258. Morrissey I., George J. Activities of Fluoroquinolones against Streptococcus pneumoniae Type II Topoisomerases Purified as Recombinant Proteins // Antimicrob Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. -P. 2579-2585.

259. Morse S.A., Johnson S.R., Biddle J.W. and Roberts M.C. High-level tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeae is result of acquisition of streptococcal tetM determinant // Antimicrob Agents Chemother. 1986. - Vol. 30. - P. 664-670.

260. Mouz N., Di Guilmi A.M., Gordon E. et al. Mutations in the active site of penicillin-binding protein PBP2x from Streptococcus pneumoniae. Role in the specificity for p-lactam antibiotics // J Biol Chem. 1999,-Vol. 274.-P. 19175-19180.

261. Mullis K., Faloona F., Scharf S. et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. 1986II Biotechnology. 1992. -Vol. 24. - P. 17-27.

262. Mundy L.S., Janoff E.N., Schwebke K.E. et al. Ambiguity in the identification of Streptococcus pneumoniae. Optochin, bile solubility, Quellung, and the AccuProbe DNA probe tests // Am J Clin Pathol. 1998. - Vol. 109. - P. 55-61.

263. Munoz R., Fenoll A., Vicioso D., Casal J. Optochin-resistant variants of Streptococcus pneumonia// Diagn Microbiol Infect Dis. 1990. - Vol. 13. - P. 63-66.

264. Naito H., Hayashi S., Abe K. The entire nucleotide sequence of two hepatitis G virus isolates belonging to a novel genotype: isolation in Myanmar and Vietnam // J Gen Virol. 2000. -Vol. 81. - P. 189-194.

265. Navas S., Martin J., Quiroga J.A. et al. Genetic diversity and tissue compartmentalization of the hepatitis С virus genome in blood mononuclear cells, liver, and serum from chronic hepatitis С patients // J Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 1640-1646.

266. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9. 1999. - Vol. 19. -N. 1.

267. Ndiweni D. and Klugman K.P. Altered PBP 2A and Its Role in the Development of Penicillin, Cefotaxime, and Ceftriaxone Resistance in a Clinical Isolate of Streptococcus pneumoniae II Antimicrob Agents Chemother. 2005. - Vol. 49. - P. 2002-2007.

268. Ng L.K., Martin I., Liu G., Bryden L. Mutation in 23S rRNA Associated with Macrolide Resistance in Neisseria gonorrhoeae // Antimicrob Agents Chemother. 2002. - Vol. 46. - P. 3020-3025.

269. Nicholas R.A., Zhao S., Tomberg J., Unemo M., Davies C. Genetics of intermediate resistance to expanded-spectrum cephalosporins in Neisseria gonorrhoeae P054 II 16th International Pathogenic Neisseria Conference.- 2008. Abstract book.

270. Nikaido H. Multiple antibiotic resistanse and efflux // Current opinion of microbiology. 1998. -Vol. 1.- P. 516-523.

271. Nikolayevsky V., Brown Т., Balabanova Y. et al. Detection of Mutations Associated with Isoniazid and Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from Samara Region, Russian Federation // JCM. 2004. -Vol. 42. - P. 4498-4502.

272. Nordhoff E., Cramer R., Karas M. et al. Ion stability of nucleic acids in infrared matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry //Nucleic Acids Res. 1993. -Vol. 21.- P. 3347-3357.

273. Nordhoff E., Luebbert C., Thiele G. et al. Rapid determination of short DNA sequences by the use of MALDI-MS // Nucleic Acids Research. 2000. - Vol. 28. - P. 86-92.

274. Nordor H., Courouce A.M., Magnius L.O. Molecular basis of hepatitis В virus serotype variations within the four major subtypes//J General Virology. 1992. -Vol. 73. - P. 3141-3145.

275. Nordor H., Couroucee A.M. and Magnius L.O. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis В virus, four of which represent two new genotypes // Virology. 1994. - Vol. 198. - P. 489-503.

276. Null A.P., Hannis J.C. and Muddiman D.C. Genotyping of simple and compound short tandem repeat loci using electrospray ionization fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry // Anal Chem. 2001. - Vol. 73. - P. 4514-4521.

277. O'Neill A.M., Gillespie S.H. and Whiting G. C. Detection of penicillin susceptibility in Streptococcus pneumoniae by pbp2b PCR-restriction fragment length polymorphism analysis // J Clin Microbiol. 1999. -Vol.37.-P. 157-160.

278. Obregon V., Garcia P., Garcia E. Et al. Molecular peculiarities of the lytA gene isolated from clinical pneumococcal strains that are bile insoluble // J Clin Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 25452554.

279. O'Farrell P.Z., Goodman H.M. and O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins // Cell. 1977. - Vol. 12. - P. 1133-1142.

280. O'Farrell P.H., O'Farrell P.Z. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoretic fractionation // Methods in Cell Biol. 1977. - Vol." 16. - P. 407.

281. Ohno H., Koga H., Kohno S. et al. Relationship between rifampin MICs for and rpoB mutations of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Japan // Antimicrob Agents Chemother. 1996. - Vol. 40.-P. 1053-1056.

282. Okamoto H., Kojima M., Sakamoto M. et al. The entire nucleotide sequence and classification of a hepatitis С virus isolate of a novel genotype from an Indonesian patient with chronic liver disease // J Gen Virol. 1994. - Vol. 75. - P. 629-635.

283. Okamoto H., Sugiyama Y., Okada S. et al. Typing hepatitis С virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sources // J Gen Virol. -1992.-Vol. 73.-P. 673-679.

284. Okuda M., Hino К., Korenaga M. et al. Differences in hypervariable region 1 quasispecies of hepatitis С virus in human serum, peripheral blood mononuclear cells, and liver // Hepatology. 1999. -Vol. 29.-P. 217-222.

285. Olsen В., Hadad R., Fredlund H., Unemo M. The Neisseria gonorrhoeae population in Sweden during 2005-phenotypes, genotypes and antibiotic resistance // АРМ IS. -2008. Vol. 116. - P. 181-189.

286. Pagliero E., Chesnel L., Hopkins J. et al. Biochemical characterization of Streptococcus pneumoniae penicillin-binding protein 2b and its implication in beta-lactam resistance // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - Vol. 48. - P. 1848-1855.

287. Pagotto F., Aman Т., Ng L.-K. et al. Sequence analysis of the family of penicillinase-producing plasmids of Neisseria gonorrhoeae based on DNA sequencing // Plasmid. 2000. - Vol. 43. - P. 24-34.

288. Palmer H.M., Young H., Graham C. and Dave J. Prediction of antibiotic resistance using Neisseria gonorrhoeae multi-antigen sequence typing // Sex. Transm. Inf. 2008. - Vol. 84 - P. 280-284.

289. Palmer H.M., Leeming J.P., Turner A. A multiplex polymerase chain reaction to differentiate p-lactamase plasmids of Neisseria gonorrhoeae // J Antimicrob Chemoter. 2000. -Vol. 45. - P. 777-782.

290. Pan X.S., Fisher L.M. Streptococcus pneumoniae DNA gyrase and topoisomerase IV: overex-pression, purification, and differential inhibition by fluoroquinolones // Antimicrob Agents Chemother. -1999.-Vol. 43.-P. 1129-1136.

291. Pan C., Xu S., Zhou II. et al. Recent developments in methods and technology for analysis of biological samples by MALDI-TOF-MS // Anal Bioanal Chem. -2007. -Vol. 387. -P. 193-204.

292. Paris M. and Jones M.G.K. Microsatellite genotyping by primer extension and MALDI-ToF mass spectrometry // Plant Molecular Biology Reporter. 2002. - Vol. 20. - P. 259-263.

293. Parsons L.M., Salfinger M., Clobridge A. Phenotypic and Molecular Characterization of Mycobacterium tuberculosis Isolates Resistant to both Isoniazid and Ethambutol// Antimicrob Agents Chemother. 2005. -Vol. 49. -P. 2218-2225.

294. Payungporn S., Tangkijvanich P., Jantaradsamee P. et al. Simultaneous quantitation and genotyping of hepatitis В virus by real-time PCR and melting curve analysis // Journal of Virological Methods. -2004. — Vol. 120.-P. 131-140.

295. Persing D.H., Relman D.A., Tenover F.C. Genotypic detection of antimicrobial resistance // D. H. Persing. PCR protocols for emerging infectious diseases / ASM Press, Washington, D.C., 1996.

296. Pestova E., Millichap J.J., Noskin G.A., Peterson L.R. Intracellular targets of moxifloxacin: a comparison with other fluoroquinolones // J Antimicrob Chemother. 2000. -Vol. 45. - P. 583-590.

297. Phillips G., Barker R. and Brogan O. Optochin-resistant Streptococcus pneumoniae // Lancet. -1988. — P. П281.

298. Piddock L.J.V. Clinically Relevant Chromosomally Encoded Multidrug Resistance Efflux Pumps in Bacteria // Clinical Microbiology Reviews. 2006. - Vol. 19. - P. 382-402.

299. Piddock L.J.V., Johnson M.M., Simjee S., Pumbwe L. Expression of efflux pump gene pmrA in fluoroquinolone-resistant and -susceptible clinical isolates of Streptococcus pneumoniae // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2002. -Vol. 46. - P. 808-812.

300. Piersimoni C., Olivieri A., Benacchio L. and Scarparo C. Current Perspectives on Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Complex: the Automated Nonradiometric Systems // JCM. 2006. -Vol. 44. - P. 20-28.

301. Pignone M., Greth K.M., Cooper J. et al. Identification of Mycobacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry // J Clin Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 1963-1970.

302. Pikis A., Campos J.M., Rodriguez W.J. and Keith J.M. Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae: mechanism, significance and clinical implications // J Infect Dis. 2001. -Vol. 184. - P. 582-590.

303. Pitarch A., Abian J., Carrascal M., et al. Proteomics-based identification of novel Candida albicans antigens for diagnosis of systemic candidiasis in patients with underlying hematological malignancies // Proteomics. 2004. - Vol. 4. - P. 3084-3106.

304. Plinke C., Riisch-Gerdes S., Niemann S. Significance of mutations in embB codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates// Antimicrob Agents Chemother. 2006. -Vol. 50. -P. 1900-1902.

305. Poh C.L., Lau Q.C., Chow V.T. Differentiation of Neisseria gonorrhoeae IB-3 and IB-7 serovars by direct sequencing of protein IB gene and pulsed-field gel electrophoresis // J. Med. Microbiol. 1995. -Vol 43.-P. 201-207.

306. Poole K. Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-negative bacteria // Antimicrob Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 2233-2241.

307. Posada G.D., Crandall K.A., Nguyen M. et al. Population Genetics of the porB Gene of Neisseria gonorrhoeae: Different Dynamics in Different Homology // Mol. Biol. Evol. 2000. -Vol. 17. - P. 423 -436.

308. Poynten M., Andresen D.N., Gottlieb T. Laboratory cross-contamination of Mycobacterium tuberculosis: an investigation and analysis of causes and consequences // Intern Med J. 2002. -Vol. 32. -P. 511-512.

309. Purcell R. The hepatitis С virus: Overview // Hepatology. 1997. -Vol. 26. - Suppl 1. - P. 1 ISMS

310. Ragoussis J, Elvidge GP, Kaur K, Colella S. Matrix-assisted laser desorption/ionisation, time-of-flight mass spectrometry in genomics research // PLoS Genet. -2006. Vol. 2. - P. el00.

311. Ramaswamy S.V., Reich R., Dou S.-J., et al. Graviss Single Nucleotide Polymorphisms in Genes Associated with Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. -2003. -Vol. 47. P. 1241-1250.

312. Ramaswamy S.V., Amin A.G., Goksel S. et al. Molecular genetic analysis of nucleotide polymorphisms associated with ethambutol resistance in human isolates of Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 326-336.

313. Ray K., BalaM., Kumari S. and Narain J.P. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae in selected World Health Organization Southeast Asia Region countries: an overview // Sex Transm Dis. -2005. -Vol. 32. P. 178-84.

314. Ray S.C., Wang Y.M., Laeyendecker O. et al. Acute hepatitis С virus structural gene sequences as predictors of persistent viremia: hypervariable region 1 as a decoy // J Virol. 1999. -Vol. 73. - P. 2938-2946.

315. Reinert R.R., Ringelstein A., van der Linden M. et al. Molecular Epidemiology of Macrolide-Resistant Streptococcus pneumoniae Isolates in Europe // J Clin Microbiology. 2005. -Vol. 43. - P. 1294-1300.

316. Reinert R.R., Wild A., Appelbaum P. et al. Ribosomal mutations conferring resistance to macro-lides in Streptococcus pneumoniae clinical strains isolated in Germany. // Antimicrob Agents Chemother. 2003. -Vol. 47. - P. 2319-2322.

317. Rengarajan J., Sassetti C.M., Naroditskaya V., et al. The folate pathway is a target for resistance to the drug para-aminosalicylic acid (PAS) in mycobacteria // Mol Microbiol. 2004. -Vol. 53. - P. 275282.

318. Richter S.S., Heilmann K.P., Dohrn C.L. et al. Changing Epidemiology of Antimicrobial-Resistant Streptococcus pneumonia in the United States, 2004-2005 // Clinical infectious diseases. -2009. -Vol. 48. P. e23-33.

319. Richter S.S., Heilmann K.P., Beekmann S.E. et al. The molecular epidemiology of streptococcus pneumoniae with quinolone resistance mutations // Clinical Infectious Diseases. 2005. — Vol. 40. — P. 225-235.

320. Richter S.S., Heilmann K.P., Dohrn C.L. et al. Accuracy of Phenotypic Methods for Identification of Streptococcus pneumoniae Isolates Included in Surveillance Programs // J Clin Microbiol. 2008. — Vol.46. P. 2184-2188.

321. Rinder H., Mieskes K.T., Tortoli, E. et al. Detection of embB codon 306 mutations in ethambutol resistant Mycobacterium tuberculosis directly from sputum samples: a low-cost, rapid approach // Mol. Cell. Probes. 2001. - Vol. 15. - P. 37^12.

322. Riska P.F., Jacobs W.R.Jr., Alland D. Molecular determinants of drug resistance in tuberculosis // lnt J Tuberc Lung Dis. 2000. - Vol. 4. - P. 4-10.

323. Roberts M.C., Chung W.O., Roe D. et al. Erythromycin-resistant Neisseria gonorrhoeae and oral commensal Neisseria spp. carry known rRNA methylase genes // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. -Vol.43.-P. 1367-1372.

324. Robertson, J.A. and Stemke G.W. Expanded serotyping scheme for Ureaplasma urealyticum strains isolated from humans // J Clin Microbiol. 1982. - Vol. 15. - P. 873-878.

325. Roepstorff P., Fohlman J. Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra ofpeptides//Biomed. Mass Spectrom. 1984.-Vol. 11.-P. 601.

326. Roskey M.T., Juhasz P., Smirnov I.P. et al. DNA sequencing by delayed extraction-matrix-assisted laser desorption/ionizaton time of fight mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. -Vol. 93.-P. 4724-4729.

327. Ross P., Belgrader P. Analysis of short tandem repeat polymorphisms in human DNA by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry //Anal Chem. 1997. -Vol. 69. — P. 3966-3972.

328. Ross P., Hall L., Smirnov I., and Haff L. High level multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry // Nature Biotechnology. 1998. - Vol. 16. - P. 1347-1351.

329. Rothberg J.M. and Leamon J.H. The development and impact of 454 sequencing // Nature Biotechnology. 2008. - Vol. 26, - P. 1117- 1124.

330. Rouquette-Loughlin C., Dunham S.A., Kuhn M. et al. The NorM Efflux Pump of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis Recognizes Antimicrobial Cationic Compounds // J Bacteriol. — 2003.-Vol. 185.-P. 1101-1106.

331. Ruddy M., McHugh T.D., Dale J.W. et al. Estimation of the Rate of Unrecognized Cross-Contamination with Mycobacterium tuberculosis in London Microbiology Laboratories// J Clin.Microbiol. 2002. -Vol. 40. -P. 4100-4104.

332. Ruiru S., Zhang J., Li C. et al. Detection of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from China as determined by denaturing HPLC analysis and DNA sequencing // Mi-crob Infect. 2007. -Vol. 9. -P. 1538-1544.

333. Ryzhov V. and Fenselau C. Characterization of the Protein Subset Desorbed by MALDI from Whole Bacterial Cells // Anal Chem. 2001. -Vol. 73. - P. 746-750.

334. Sandstrom E.G., Knapp J.S., Reller L.B. et al. Serogrouping of Neisseria gonorrhoeae: correlation of serogroup with disseminated gonococcal infection // Sex Transm Dis. -1984; -Vol. 11. P. 77 - 80.

335. Sandstrom E. and Danielsson D. Serology of Neisseria gonorrhoeae. Classification by co-agglutination // Acta Pathol Microbiol Scand Sect. B. 1980. - Vol. 88. - P. 27-38.

336. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.RI DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Academ. Sci. USA. 1977. - Vol.74. - P. 5463-5467.

337. Sarandopoulos S. and Davies J.K. Genetic Organization and Evolution of the Cryptic Plasmid of Neisseria gonorrhoeae // Plasmid. 1993. -Vol. 29. - P. 206-221.

338. Sauer S. The essence of DNA sample preparation for MALDI mass spectrometry // J Biochem Biophys Methods. 2007. -Vol. 70. - P. 311-318.

339. Sauer S., Lehrach H. and Reinhardt R. MALDI mass spectrometry analysis of single nucleotide polymorphisms by photocleavage and charge-tagging // Nucleic Acids Research. 2003. - Vol. 31. - P. 63.

340. Sauer, S. Typing of single nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry: Principles and diagnostic applications // Clinica Chimica Acta. 2006. - Vol. 363. - P. 95 - 105.

341. Schatz P., Dietrich D. and Schuste M. Rapid analysis of CpG methylation patterns using RNase T1 cleavage and MALDI-TOF // Nucleic Acids Research. 2004. -Vol. 32. - P. e 167.

342. Schatz P., Distler J., Berlin K.and Schuster M. Novel method for high throughput DNA methylation marker evaluation using PNA-probe library hybridization and MALDI-TOF detection // Nucleic Acids Research. 2006. - Vol. 34. - P. 59.

343. Schena, M., Shalon D., Davis R.W. & Brown P.O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray // Science. 1995. - Vol. 270. - P. 467-470.

344. Scorpio A., Lindholm-Levy P., Heifets L. et al. Characterization of pncA mutations in pyrazina-mide-resistant Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. 1997. -Vol. 41. - P. 540543.

345. Seib K.L., Wu H.J., Kidd S.P. et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment // Microbiol Mol Biol Rev. 2006. - Vol. 70(2). - P. 344361.

346. Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H. et al. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematic // Appl Environ Microbiol. -1986. -Vol. 51. -P. 873-884.

347. Shafer W.M., Veal W.L., Lee E.-H. et al. Genetic organization and regulation of antimicrobial efflux systems possessed by Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis // J Mol Microbiol Bio-technol. 2001. - Vol. 3. - P. 219-224.

348. Shafer W.M. and Folster J.P. Towards an Understanding of Chromosomally Mediated Penicillin Resistance in Neisseria gonorrhoeae: Evidence for a Porin-Efflux Pump Collaboration // J Bacteriol. -2006. Vol. 188. - P. 2297-2299.

349. Shen X., Shen G., Wu J., et al. Association between embB Codon 306 Mutations and Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis// Antimicrob Agents Chemother. -2007. -Vol. 51. -P. 2618-2620.

350. Shen R., Fan J.B., Campbell D. et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays // Mutation Research. 2005. - Vol. 573. - P. 70-82.

351. Shi R., Zhang J., Otomo K. et al. Lack of Correlation between embB Mutation and Ethambutol MIC in Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates from China// Antimicrob Agents Chemother. -2007. -Vol. 51. -P. 4515^517.

352. Shimizu Y., Hijikata M., Iwamoto A. et al. Neutralizing antibodies against hepatitis С virus and the emergence of neutralization escape mutant viruses Hi Virology. 1994. -Vol. 68. - P. 1494-1500.

353. Shindo M., Hamada K., Koya S. et al. The clinical significance of changes in genetic heterogeneity of the hypervariable region 1 in chronic hepatitis С with interferon therapy // Hepatology. 1996. -Vol. 24.-P. 1018-1023.

354. Shoeb H. A., Bowman Jr. B. U., Ottolenghi A. C., et al. Evidence for the generation of active oxygen by isoniazid treatment of extracts of Mycobacterium tuberculosis H37Ra // Antimicrob Agents Chemother. 1985. - Vol. 27. - P.408-412.

355. Siedner M.J., Pandori M., Castro L. et al. Klausner Real-Time PCR Assay for Detection of Qui-nolone-Resistant Neisseria gonorrhoeae in Urine Samples // J'Clin Microbiol. 2007. - Vol. 45. — P. 1250-1254.

356. Simmonds P., Alberti A., Alter H.J. et al. A proposed system for the nomenclature of hepatitis С viral genotypes//Hepatology. 1994.-Vol. 19.-P. 1321-1324.

357. Simpson E. H. Measurement of diversity//Nature (London). 1949. -Vol. 163. - P. 688.

358. Skuce R.A., McCorry T.P., McCarroll J.F. et al. Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTRPCR targets // Microbiol. 2002. -Vol. 148. -P. 519-528.

359. Song Y., Dai E., Wang J. Genotyping of hepatitis В virus (HBV) by oligonucleotides microarray // Molecular and Cellular Probes. 2006. - Vol. 20. - P. 121-127.

360. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis Hi Mol. Biol. 1975. -Vol. 98. - P.503-517.

361. Sox Т. E., Mohammed W., Blackman E. et al. Conjugative plasmids in Neisseria gonorrhoeae // J. Bacterid. 1978. - Vol. 134. - P. 278 - 286.

362. Sreevatsan S., Stochbauer K.E., Pan X. et al. Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis: critical role of embB mutations // Antimicrob Agents Chemother. 1997. -Vol. 41. - P. 1677-1681.

363. Sreevatsan S., Pan X., Stockbauer K. et al. Characterization of rpsL and rrs mutations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse geographical localities // Antimicrob Agents Chemother. 1996. - Vol. 40. - P. 1024.-1026.

364. Srivastava S., Garg A, Ayyagari A., Nyati K.K., Dhole T.N., Dwivedi S.K. Nucleotide Polymorphism Associated with Ethambutol Resistance in Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis // Current Microbiol. 2006. -Vol. 53. -P. 401-405.

365. Stanssens P., Zabeau M., Meersseman G. et al. High-throughput MALDI-TOF discovery of genomic sequence polymorphisms // Genome Res.-2004. Vol. 14.-P. 126-133.

366. Storm N., Darnhofer-Patel В., van den Boom D., Rodi C.P. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping // Methods Mol Biol. 2003. - Vol. 212. - P. 241-262.

367. Strupat K., Karas M., Hillenkamp F. 2,5-Dihidroxybenzoic acid: a new matrix for laser desorp-tion-ionization mass spectrometry // Int J Mass Spectrom. Ion Processes. 1991. - Vol. 111. - P. 89-102.

368. Sturenburg E., Storm N., Sobottka I. et al. Detection and Genotyping of SHV p-Lactamase Variants by Mass Spectrometry after Base-Specific Cleavage of In Vitro-Generated RNA Transcripts // J Clin Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 909-915.

369. Stuyver L., Rossau R., Wyseur A., et al. Typing of hepatitis С virus isolates and characterization of new subtype using a line probe assay // J. Gen. Virol. 1993. -Vol. 74. - P. 1093-1102.

370. Stuyver L., Gendt S.D., Geyt C.V. et al. A new genotype of hepatitis В virus: complete genome and phylogenetic relatedness // J Gen. Virol. 2000. - Vol. 81. - P. 67-74.

371. Supply P., Allix C., Lesjean S. et al. Proposal for Standardization of Optimized Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem Repeat Typing of Mycobacterium tuberculosis // J Clin Microbiol. 2006. -Vol. 44. -P. 4498-4510.

372. Supply P., Mazars E., Lesjean S. et al. Variable human minisatellite-like region in the Micobac-trium tuberculosis genome // Mol Microbiol. 2000. - Vol. 36. - P. 762-771.

373. Suresh N., Arora J., Pant H. et al. Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis DNA from Archival Ziehl-Neelsen-stained sputum smears // J Microbiol Meth. -2007. -Vol. 68. -P. 291-295.

374. Suriano R., Levi M., Pirri G. et al. Surface behavior and molecular recognition in DNA microar-rays from N,N-dimethylacryIamide terpolymers with activated esters as linking groups // Macromol Bios-ci. 2006. - Vol. 6. - P. 719-729.

375. Takiff H.E., Salazar L., Guerrero C. et al. Cloning and nucleotide sequence of Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes and detection of quinolone resistance mutations // Antimicrob Agents Chemother. 1994. - Vol. 38. - P. 773-780.

376. Tam M.R., Buchanan T.M., Sandstrom E.G. et al. Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with monoclonal antibodies // Infect. Immun. 1982. — Vol. 36. - P. 1042 - 1053.

377. Tanaka M., Fukuda H., Hirai K. et al. Reduced uptake and accumulation of norfloxacin in resistant strains of Neisseria gonorrhoeae isolated in Japan // Genitourin Med. 1994. - Vol. 70. - P. 253-255.

378. Tanaka К., Waki H., Ido Y. et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 1988. -Vol. 2. -P. 151-153.

379. Tang K., Fu D.J., Julien D. et al. Chip-based genotyping by mass spectrometry // Proc Natl Acad Sci USA.-1999.-Vol. 96.-P. 10016-10020.

380. Taniguchi H., Aramaki H., Nikaido Y. et al. Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis // FEMS Microbiol Lett. 1996. -Vol. 144. - P. 103-108.

381. Taniguchi H., Chang В., Abe C. et al. Molecular analysis of kanamycin and viomycin resistance in Mycobacterium smegmatis by use of a conjugation system // J Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 47954801.

382. Taranenko N.J., Tang K., Allman S.L. et al. 3-Aminopicolinic acid as a matrix for laser desorp-tion mass spectrometry for biopolymers // Rapid Commun Mass Spectrom. 1994. - Vol. 8. - P. 1001 — 1006.

383. Taranenko N.J., Allman S.L., Golovlev V.V. et al. Sequencing DNA using mass spectrometry for ladder detection // Nucleic Acids Research. 1998. - Vol. 26. - P. 2488-2490.

384. Taranenko N.J., Hurt R., Zhou J.Z. et al. Laser desorption mass spectrometry for microbial DNA analysis//J Microbial Methods. -2002. Vol. 48.-P. 101-106.

385. Tavakoli-Tabasi S., Hamill R. J., Greenberg S. B. Anaerobic Balanoposthitis: Two Cases and Review of the Literature // Anaerobe. 2000. -Vol. 6. - P. 11-14.

386. Telenti A., Honore N., Bernasconi C. et al. Genotypic assessment of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis: A blind study at reference laboratory level // J Clin Microbiol. -1997.-Vol. 35. -P. 719-723.

387. Telenti A., Imboden P., Marchesi F. et al. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 647-650.

388. Telenti A., Phillipp W., Sreevatsan S. et al. The emb operon, a unique gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol // Nat Med. 1997. -Vol. 3. — P. 567-570.

389. Tenover B. F. C., Kirby W. and Crick. Antimicrobial susceptibility testing in the molecular era // ASM News. 1992. -Vol. 58. - P. 669-672.

390. Tinsley C.R., Nassif X. Analysis of the genetic differences between Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae: Two closely related bacteria expressing two different pathogenicities // Microbiology. 1996. -Vol. 93. - P. 11109-111 14.

391. Toikka P., Nikkari S., Ruuskanen O. et al. Pneumolysin PCR-based diagnosis of invasive pneumococcal infection in children // J Clin Microbiol. 1999. -Vol. 37. - P. 633-637.

392. Tost J., Gut I.G. Genotyping single nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry in clinical applications // Clinical Biochemistry. 2005. - Vol. 38. - P. 335- 350.

393. Tost J., Schatz P., Schuster M. et al. Analysis and accurate quantification of CpG methylation by MALDI mass spectrometry //Nucleic Acids Res. -2003. -Vol. 31. P. e50.

394. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A. et al. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia // J Clin Microbiol. 2002. -Vol. 40.-P. 1930-1937.

395. Tracevska Т., Jansone I., Nodieva A. et al. Characterisation of rpsL, rrs and embB mutations associated with streptomycin and ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis // Research in Microbiology. 2004. - Vol. 155. - P.830-834.

396. Trees D.L., Sandul A.L., Whittington W.L., Knapp J.S. Identification of novel mutation patterns in the parC gene of ciprofloxacin-resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae // Antimicrob Agents Chemother. 1998. -Vol. 42. - P. 2103-2105.

397. Turner A., Gough K.R. and Leeming J.P. Molecular epidemiology of tetM genes in Neisseria gonorrhoeae // Sex Transm Infect. 1999. - Vol. 75. - P. 60-66.

398. Unemo M., Palmer H.M., Blackmore T. et al. Global transmission of prolyliminopeptidase-negative Neisseria gonorrhoeae strains: implications for changes in diagnostic strategies //Sex Transm Infect. 2007. -Vol. 83. - P. 47-51.

399. Unemo M., Vorobieva V., Firsova N. et al. Neisseria gonorrhoeae population in Arkhangelsk, Russia: phenotypic and genotypic heterogeneity // Clin Microbiol Infect. 2007. - Vol. 13. - P. 873-878.

400. Urdea M.S. Synthesis and characterization of branched DNA for the direct and quantitative detection of CMV, HBV, HCV and HIV // Clin Chem. 1993. - Vol. 39. - P. 725-726.

401. Van Baar В L. Characterisation of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray mass spectrometry // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - Vol.24. - P. 193-219.

402. Van Belkum A., Tassios P.T., Dijkshoorn L. et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology // Clin Microbiol Infect. 2007. -Vol. 13. -P. 1.

403. Van Embden J.D., Cave M.D., Crawford J. T. et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology // J Clin Microbiol. -1993.-Vol. 31. -P. 406-409.

404. Van Ert M.N., Hofstadler S.A., Jiang Y. et al. Mass spectrometry provides accurate characterization of two genetic marker types in Bacillus anthracis // Biotechnique. 2004. -Vol. 37. - P. 642-644, 646, 648.

405. Van Putten J.P.M., Duensing T.D., Carlson J. Gonococcal invasion of epithelial cells driven by the P.1A porin // Abstr. in Inter, pathogenic Neisseria conference / Edited by X.Nassif, M.J. Quentin-Millet, M.K.Taha. Paris, 1998. P. 35.

406. Veal W.L., Nicholas R.A., Shafer W.M. Overexpression of the MtrC-MtrD-MtrE Efflux Pump Due to an mtrR Mutation Is Required for Chromosomally Mediated Penicillin Resistance in Neisseria gonorrhoeae//J Bacleriol. 2002. - Vol. 184.-P. 5619-5624.

407. Vernel-Pauillac F., Merien F. A novel real-time duplex PCR assay for detecting penA and ponA genotypes in Neisseria gonorrhoeae: comparison with phenotypes determined by the E-test // Clinical Chemistry. 2006. - Vol. 52. - P. 2294-2296.

408. Vilcheze C., Wang F., Arai M. et al. Transfer of a point mutation in Mycobacterium tuberculosis inhA resolves the target of isoniazid // Nature Medicine. 2006. - Vol. 12. - P. 1027-1029.

409. Viscidi R.P., Demma J.C., Gu J., Zenilman J. Comparison of sequencing of the por gene and typing of the opa gene for discrimination of Neisseria gonorrhoeae strains from sexual contacts // J Clin Microbiol. 2000. - Vol: 38. - P. 4430-4438.

410. Viscidi R.P., Demma J.C. Genetic diversity of Neisseria gonorrhoeae housekeeping genes // J Clin Microbiol. 2003. -Vol. 41 - P. 197-204.

411. Wada Т., Maeda S., Hase A. and Kobayashi K. Evaluation of variable numbers of tandem repeat as molecular epidemiological markers of Mycobacterium tuberculosis in Japan // J Med Microbiol. -2007. -Vol. 56. -P. 1052-1057.

412. Wade M.M., Zhang Y. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Front Biosci. 2004. - Vol. 1. - P. 975-994.

413. Wai C.T., Chu C.J., Hussain M., Lok A.S. HBV genotype В is associated with better response to interferon therapy in HBeAg(+) chronic hepatitis than genotype С // Hepatology. 2002. - Vol. 36. - P. 1425-1430.

414. Wang R.F., Bystricka D., Lenz O. et al. DNA microarray: parallel detection of potato viruses // Acta Virologica. 2003. - Vol. 47. - P. 41-43.

415. Wang, B.H: and Biemann K. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of chemically modified oligonucleotides // Anal Chem. -1994. -Vol. 66. P. 1918-1924.

416. Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium // Electrophoresis. 1995. - Vol. 16. - P. 1090-1094.

417. Wei C.J., Lei В., Musser J.M., Tu S.C. Isoniazid activation defects in recombinant Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (KatG) mutants evident in InhA inhibitor production // Antimicrob. agents chemother. 2003. -Vol. 47. - P. 670-675.

418. Wenzel Т., Elssner Т., Fahr K. et al. GenoSNIP: SNP genotyping by MALDI-TOF MS using photocleavable oligonucleotides // Nucleosides Nucleic Acids. 2003. -Vol. 22. - P. 1579-1581.

419. Whiley D.M., Limnios E.A., Ray S. et al. Further questions regarding the role of mosaic penA sequences in conferring reduced susceptibility to ceftriaxone in Neisseria gonorrhoeae // Antimicrob Agents Chemother. 2007. - Vol. 51. - P. 802-803.

420. Whiley R.A. and Beighton D. Current classification of the oral streptococci // Oral Microbiol Immunol. 1998.-Vol. 13.-P. 195-216.

421. Willems A.V., Deforce D.L., Lambert W.E. et al. Rapid characterization of oligonucleotides by capillary liquid chromatography-nano electrospray quadrupole time-of-flight mass spectrometry // J Chromatography A. -2004. Vol. 1052. - P. 93-101.

422. Wilson J. J., Polyak S. J., Day T. D., Gretch D. R. Characterization of simple and complex hepatitis С virus quasispecies by heteroduplex gel shift analysis: correlation with nucleotide sequencing // J Gen Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 1763-1771.

423. Wilson К. H., Wilson W. J., Radosevich J. L. et al. High-density microarray of small-subunit ribosomal DNA probes // Appl Environ Microbiol. 2002. -Vol. 68. - P. 2535-2541.

424. Wilson Т. M. and Collins D. M. AhpC, a gene involved in isoniazid resistance of the Mycobacterium tuberculosis complex//Mol. Microbiol. 1996.-Vol. 19.-P. 1025-1034.

425. Wirmer J., Westhof E. Molecular contacts between antibiotics and the 30S ribosomal particle // Methods Enzymol. 2006. - Vol. 415. - P. 180-202.

426. Wolk D.M., Shepley D., Sloane D. et al. TIGER PCR Mass-Spectrometry and Rep-PCR characterization of community-acquired oxacillin-resistant staphylococcus aureus isolates // K-l 187 in Abstracts book of 46th ICAAC, San Francisco. 2006. - P. 339.

427. Wolrath H., Forsum U., Larsson P. G., Boren H. Analysis of bacterial vaginosis-related amines in vaginal fluid by gas chromatography and mass spectrometry // J Clin Microbiol. 2001. — Vol. 39. — P. 4026-4031.

428. Woo P. C. Y., Lau S. K. P., Teng J. L. L. et al. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories // Clin Microbiol Infect. 2008. - Vol. 14. - P. 908-934.

429. Wood J.M. Bacterial Osmosensing transporters // Methods in Enzymology. 2007. -Vol. 428. — P. 77-107.

430. Wu K.J., Steding A., Becker C.H. Matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry of oligonucleotides using 3-hydroxypicolinic acid as an ultraviolet-sensitive matrix // Rapid Commun Mass Spectrom. 1993. - Vol. 7. - P. 142 - 146.

431. Yamashita M., Fenn J.B. Negative ion production with the electrospray ion source // J Phys Chem. 1984. - Vol. 88. - P. 4671-4675.

432. Yang Y., Liao M., Gu W.M. et al. Antimicrobial susceptibility and molecular determinants of quinolone resistance in Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai // J Antimicrob Chemother. 2007. -Vol. 59.-P. 803-804.

433. Yang Y., Liao M., Gu W.M. et al. Clusters of circulating Neisseria gonorrhoeae strains and association with antimicrobial resistance in Shanghai // J Antimicrob Chemother. 2008. - Vol. 61. - P. 478487.

434. Yazdankhah S.P., Kesanopoulos K., Tzanakaki G. et al. Variable-Number Tandem Repeat Analysis of Meningococcal Isolates Belonging to the Sequence Type 162 Complex // J Clin Microbiol. -2005. Vol. 43. - P. 4865-4867.

435. Yoo J.S., Seong W.K., Kim T.S. et al. Comparative proteome analysis of the outer membrane proteins of in vitro-induced multi-drug resistant Neisseria gonorrhoeae // Microbiol Immunol. 2007. -Vol. 51.-P. 1171-1177.

436. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Nakamura S. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli // Antimicrob Agents Chemother. 1990. - Vol. 34. - P. 1271-1272.

437. You Y., Fu C., Zeng X. et al. A novel DNA microarray for rapid diagnosis of enteropathogenic bacteria in stool specimens of patients with diarrhea // J Microbiol Methods. 2008. - Vol. 75. - P. 566571.

438. Zapun A., Contreras-Martel C., Vernet T. Penicillin-binding proteins and b-lactam resistance // FEMS Microbiol Rev. 2008. - Vol. 32. - P. 361-385.

439. Zein N.N., Persing D.H. Hepatitis С genotypes: current trends and future implications // Mayo Clin Proc. 1996. -Vol. 71. - P. 458-464.

440. Zhang M., Yue J., Yang Y.P. et al. Detection of Mutations Associated with Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from China // J Clin Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 5477-5482.

441. Zhang Y., Angelo S., Hiroshi N., Zhonghe S. Role of Acid pH and Deficient Efflux of Pyrazinoic Acid in Unique Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Pyrazinamide // J Bacterid. 1999. -Vol. 181.-P. 2044-2049.

442. Zhang Y. and Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review // Int J Tuberc Lung Dis.-2003.-Vol. 7.-P. 6-21.

443. Zhang Y., Heym В., Allen B. et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis //Nature. 1992. -Vol. 358. - P. 591-593.

444. Zhang Y., Permar S. and Sun Z. Conditions that may affect the results of Mycobacterium tuberculosis susceptibility testing to pyrazinamide //J Med Microbiol. 2002. - Vol. 51. - P. 42-49.

445. Zhao J. R., Bai Y. J., Wang Y. Development of a pyrosequencing approach for rapid screening of rifampin, isoniazid and ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis // Int J Tuberc Lung Dis. -2005. -Vol. 9. -P. 328-332.

Информация о работе

Ильина, Елена Николаевна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы