Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эритроциты как депо и система транспорта экзогенного инсулина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чебан, Наталья Масхудовна, Ульяновск

УЛЬЯНОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЧЕБАН Наталья Масхудовна

ЭРИТРОЦИТЫ КАК ДЕПО И СИСТЕМА ТРАНСПОРТА ЭКЗОГЕННОГО ИНСУЛИНА

03.00.13 -физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.П.Генинг

Ульяновск-1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СТР.

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................4-8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Инсулин. Биологическая роль гормона в организме

1.1.1. Механизм действия инсулина.Инсулиновые рецепторы......9-16

1.1.2. Биологические эффекты инсулина.Участие инсулина

в метаболизме глюкозы..............................................16-22

1.2. Эритроинсулин и его роль в углеводном обмене................22-27

1.3. Современные методы коррекции

инсулиновой недостаточности.......................................27-30

1.4.Связывание биологически активных веществ с форменными элементами крови-эритроцитами.

1.4.1.Эритроциты как основные носители фармакологически

активной формы лекарственных препаратов..................30-34

1.4.2.Организация эритроцитарной мембраны........................34-36

1.4.3.Эритроцитарные носители в транспорте биологически

активных веществ.....................................................37-40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 .Объект исследования......................................................41

2.2. Получение эритроцитарных носителей

с экзогенным инсулином..............................................41-42

2.3. Устойчивость эритроцитарных носителей

с экзогенным инсулином................................................43

2.4. Радиоиммунологическое определение инсулина.................43-45

2.5. Цитохимический метод выявления инсулина....................46-48

2.6. Коррекция экспериментальной гипергликемии у крыс.........48-50

2.7. Кинетика эритроцитарных носителей

1 лс

с инсулином-1 при нормогликемии..............................50-51

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................52

3.1. Получение эритроцитарных носителей с

экзогенным инсулином............................................53-57

3.2. Устойчивость эритроцитарных контейнеров

с экзогенным инсулином in vitro.................................58-64

3.3. Морфологическая характеристика эритроцитарных носителей с экзогенным инсулином..........................................65-69

3.4. Фармакокинетика экзогенного инсулина,

включенного в эритроцитарные носители.....................70-80

3.5. Коррекция гипергликемии путем однократного введения экзогенного инсулина в эритроцитарных носителях........81-87

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................88-101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................103-104

ВЫВОДЫ............................................................................105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................106-128

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Изучение новых путей поддержания и регуляции уровня гликемии в крови, направленных на организацию функциональной активности организма и напрямую связанных с проблемой инсулиновой недостаточности, в последнее время получают все большее распространение и развитие. При этом особое внимание исследователей уделяется одной из форм инсулина в организме-эритроинсулину.

На сегодня уже доказана способность эритроцитов депонировать и транспортировать в организме большую часть гормона. Достигнуты значительные успехи в раскрытии наиболее тонких сторон синтеза, секреции, рецепции, интернализации и деградации инсулина в организме (JI.K. Ста-росельцева , 1970-1976; A.A. Пузырев , 1981; И.Н. Кендыш, 1985; A.C. Ефимов, Ю.В. Бездробный, 1987; P.G. Dranke, А.Р. Bevan et.al., 1996), участие различных форм гормона, в частности эритроинсулина, в метаболизме глюкозы (Л.И. Сандуляк, 1974-1984; Е.А. Халаим, 1985; С.А. Кузнецов, 1985; В. Матулявичюс, 1980).

Наряду с успехами в изучении самого гормона на протяжении многих лет совершенствуются способы коррекции гипергликемии и связанных с ней осложнений. Разработаны принципиально новые методы компенсации инсулиновой недостаточности: органная пересадка поджелудочной железы, трансплантация культур островковых клеток, применение стационарных аппаратов "искусственная поджелудочная железа", применение ручек-шприцев и дозаторов при инъекционной инсулинотерапии (A.C. Ефимов, 1986; E.H. Томилова, 1996; В.И. Шумаков, 1989). Все эти способы регуляции уровня глюкозы в крови применяются сегодня в разной степени, но такие задачи , как повышение эффективности имеющихся средств, в частности инсулиновых препаратов короткого и пролонгированного действия, физиологичность введения их в организм для предотвращения раз-

вития осложнений и максимальной возможности компенсации обменных процессов ещё не решены в настоящее время.

Поэтому важной задачей является разработка адекватного метода пролонгирования инсулиновых препаратов в организме при синдроме ин-сулиновой недостаточности и нарушении функционирования собственного эритроцитарного депо. Ряд исследований по использованию эритроцитов млекопитающих для направленного транспорта биологически активных соединений к органу-мишени (Е.Т. Гнеушев, И.А. Гнеушева, 1996; Е.Т. Гнеушев и др. 1997; Т.П. Генинг 1982-1996) позволяет предположить возможность эффективного использования этих форменных элементов для пролонгирования лекарств.

Цель настоящего исследования заключается в изучении возможности использования гомологичных эритроцитов для пролонгирования экзогенного инсулина при коррекции гипергликемии.

Для достижения этой цели были поставлены задачи :

1. Получить устойчивые эритроцитарные контейнеры с экзогенным инсулином , длительно циркулирующие в кровеносном русле.

2. Изучить фармакокинетику гормона, введенного в эритроцитарных носителях, при нормогликемии.

3. Изучить динамику коррекции гипергликемии при введении экзогенного инсулина в организм в эритроцитарных носителях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Методом гипотонического лизиса возможно получить устойчивые эритроцитарные носители с экзогенным инсулином, длительно циркулирующие в кровеносном русле и идентичные по морфологическим характеристикам интактным эритроцитам.

2. В интактном организме эритроцитарные носители с экзогенным гормоном создают депо гормона.

3. Введение эритроцитарных носителей с экзогенным инсулином при гипергликемии вызывает плавную и пролонгированную коррекцию уровня сахара в крови.

Научная новизна исследования.

- впервые методом гипотонического лизиса получены устойчивые эритроцитарные носители с экзогенным инсулином, длительно циркулирующие в кровеносном русле;

- впервые изучена фармакокинетика экзогенного инсулина, введенного в эритроцитарных носителях;

- впервые показана возможность длительной коррекции гипергликемии после однократного введения экзогенного инсулина в эритроцитарных носителях.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты исследования углубляют и развивают представления о функциональной роли эритроинсулина в поддержании и регуляции уровня глюкозы в крови.

В работе представлена система новых данных об использовании гомологичных эритроцитов для пролонгирования действия экзогенного инсулина, расширяющих и углубляющих представления о транспортной роли эритроцитов в организме.

Полученные результаты исследований служат основанием для дальнейшего изучения механизма высвобождения гормона из эритроцитарного депо, функциональных взаимоотношений между эритроцитарными носителями с инсулином, кровью и органами-

мишенями,а также процессов деградации эритроцитарных носителей в организме.

Полученные результаты дают возможность для нового подхода к проблемам медицины, в частности, при решении вопроса о наиболее эффективном и адекватном способе введения инсулиновых препаратов в организм. Использование эритроцитарных носителей с экзогенным инсулином в клинике при коррекции гипергликемических состояний позволит нивелировать до биологической совместимости побочные действия , связанные с традиционным способом введения экзогенного инсулина; обеспечит постепенный и пролонгированный терапевтический эффект гормону, предохраняя его активное начало от действия протеолитических ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции Ульяновского государственного педагогического университета им. И.Н.Ульянова (Ульяновск, 1996), на заседании Ульяновского отделения Всесоюзного общества физиологов им. академика И.П. Павлова (Ульяновск, 1996), на ежегодных научно-практических конференциях Ульяновского государственного университета (Ульяновск, 1995, 1996, 1997, 1998), на научных конференциях в г. Ярославле (1995), г. Томске (1996), г. Барнауле (1996), г. Бишкеке (1998), на конгрессах в г. Москве (1996, 1997, 1998), на III съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока в г. Новосибирске (1997) и на XVII съезде физиологов России в г. Ростове на Дону (1998).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 14 научных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик, результатов исследования, обсуждения полученных данных, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописи, содержит 7 таблиц, 19 рисунков. Список литературы включает 217 источников.

ГЛАВА I.

1.1.ИНСУЛИН. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ГОРМОНА В

ОРГАНИЗМЕ.

1.1.1. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ИНСУЛИНА.

ИНСУЛИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ.

Инсулин-полипептидный гормон поджелудочной железы. Его молекула состоит из двух полипептидных цепей: А (20-21 аминокислотный остаток) и В (29-31 аминокислотных остатков), соединенных между собой двумя дисульфидными мостиками ( Т. Бландер и др., 1979; L. Orci, 1980; A.A. Пузырёв, 1981).

Все метаболические и ферментативные эффекты инсулина : синтез ДНК, РНК и белка, гликолиз, гликогенез, липолиз, липогенез, проницаемость клеточной мембраны для ионов, Сахаров и аминокислот начинают реализовываться на уровне цитоплазматической мембраны путем связывания гормона со специфическими рецепторами (И.Н. Кендыш, 1985; A.C. Ефимов, Ю.В. Бездробный, 1987; C.R. Kahn, 1975; Р. Кан, Дж. Рот, 1979).

Инсулиновые рецепторы являются структурами на поверхности клеточных мембран, а также на внутриклеточных органелах: гладкий и грубый эндоплазматический ретикулум, клеточные ядра, митохондрии, мембраны аппарата Гольджи (А. Манева, 1980; P. Cuatrecasas, М. Hollenberg, 1976; R.E. Nodguist, G.M.A. Palmiry, 1974; S.I. Lolait, B.H. Toh, 1980).

С помощью методики прямого исследования с использованием меченого J , а также ультраструктурных и биохимических методов изучены характеристики инсулин-рецепторных взаимодействий, как локализация и число рецепторов, их функциональные свойства, кинетические и

термодинамические параметры, характерные свойства связывания, интер-нализации и внутриклеточного процессинга инсулина.

Количество рецепторов инсулина, содержащихся в плазматической мембране одной клетки, зависит от видовой принадлежности клетки. Содержание рецепторов в клетках разного типа может различаться в 300 раз. Количество же рецепторов, приходящихся на единицу поверхности клетки, характеризуется значительным сходством для клеток различных типов тканей и видов. Большинство клеток содержит от 15 до 60 инсулинсвязы-вающих центров на одном квадратном микроне поверхности мембраны (В.Н. Ginsberg, 1978; J.R. Gavin et.al., 1974).

По мнению P.de Meyts (1976) рецепторы к инсулину существуют как олигомерные структуры или кластеры. Согласно этому между рецепторами существует сильное взаимодействие по типу отрицательной коопера-тивности: связывание лиганда с рецептором индуцирует в нем конформа-ционное изменение, которое распространяется на соседние вакантные рецепторы, удаленные от первого заполненного рецептора. В случае достаточно сильных межрецепторных взаимодействий даже низкая занятость собранных в кластеры рецепторов может привести к максимальному биологическому сигналу при значительно меньшем уровне насыщения рецепторов лигандами ( Э. Фершт, 1980).

Рецепторы могут также латерально диффундировать в плоскости мембраны и образовывать кластеры, состоящие из 2-6 рецепторов ( A. Ullrich, J. Schiessinger, 1990).

Первая информация о структуре инсулинового рецептора была получена в ранних биохимических исследованиях ( Р.Кан, Дж. Рот, 1979; A.C. Ефимов, Ю.В. Бездробный, 1987; И.Н. Кендыш, 1983; В.Н. Ginsberg,1977; C.R. Kahn, М. Grettaz,1985; C.R. Kahn, 1985).

В своей нативной конформации рецептор инсулина состоит из двух а-субъединиц и двух ß-субъединиц, ковалентно связанных через дисуль-

фидные мостики и образующих а2 ß2 -гетеротетромер. Рецептор имеет молекулярный вес 350 ООО, а-субъединица-135 ООО, а Р-субъединица-95 ООО (J. Massague, P.F. Pilch, М.Р. Czech, 1981; M. Kasuga, J.A. Hedo et.al., 1982). Каждая субъединица выполняет специфическую функцию, а-субъединица содержит инсулин-связывающий домен, тогда как ß-субъединица обладает инсулин-стимулирующим белком тирозин-киназой (A. Ullrich, J. Schiessinger, 1990). а-субъединица располагается за пределами клетки и отвечает за лигандное связывание с инсулином (А. Ullrich, J.R. Bell, E.Y. Chen, étal., 1985; C.C. Yip, 1992).

ß-субъединица инсулинового рецептора состоит из короткого внеклеточного домена и внутриклеточного домена, который содержит тирозин-специфическую белковую киназу. Протеинкиназная активность ß-субъединицы играет важную роль в действии инсулина (С.К. Chou, TJ. Dull, D.S. Russell et.al., 1987; Y. Ebina, E. Araki, M. Taira et.al., 1987; DJ. Stumpo, P.J. Blackshear, 1991). Точный механизм двух событий, происходящих по разные стороны цитоплазматической мембраны: связывание инсулина рецептором на внешней стороне а-субъединицей и стимуляция протеинкиназной активности ß-субъединицы, пока еще не ясен. Полагают, что для передачи сигнала от связывания лиганда к активизации киназ необходимо должное ковалентное взаимодействие между субъединицами, которое обеспечивается процессом олигомеризации рецепторов во время получения сигнала (A.L. Fratalli, J.L. Treadway, J.E. Pessin, 1992; S.E. Shoel-son, J. Lee et.al., 1993; J. Lee, T. O'Hare et.al., 1993; S.E. Shoelson, 1993). Активация киназ вызывает каскадное фосфорилирование тиразина в ß-субъединице (M.F. White, S.E. Shoelson, C.R. Kahn, 1988; M.E. Torqvist, M.W. Pierce, A.R. Frackelton et.al., 1987; P.A. Wilden, J.M. Backer et.al, 1990; P.A. Wilden, K. Siddle et.al., 1992; P.A. Wilden, C.R. Kahn et.al., 1992; P.G. Dranke, A.P. Bevan et.al., 1996).

Наряду с фосфорилированием тирозина в рецепторах инсулина происходит фосфорилирование серина (R.E. Lewis, G.R. Wu et.al., 1990). И хотя физиологическое значение серин-киназной (Ser-киназной) активности еще не раскрыто, предполагают, что фосфорилирование серина задерживает инсулиновый сигнал (Е.Р. Feener, J.M. Backer, G.L. King et.al., 1993)

Таким образом, инсулиновый рецептор контролируется инсулин стимулируемой тирозин-киназной системой, которая регулируется в свою очередь каскадом автофосфорилирования на остатках серина и тирозина (отрицательная регуляция). Наиболее важно то, что протеинкиназная активность рецептора необходима для передачи большинства, если не всех, инсулиновых эффектов.

В 1971 году В.Б. Розен с соавторами предположили, что рецепторы клеток обуславливают не только специфический захват полипептидных гормонов, но также осуществляют транспорт гормонов через клеточную мембрану во внутрь клетки.

Связь «рецептор-гормон» нековалентна и легко обратима. Исследователями допускается возможность чрезмембранного транспорта инсулина. При количественном анализе связывания инсулина- J 125 в клетках печени с помощью электронной микроавторадиографии обнаружено, что инкубация клеток с 5-Ю~10М инсулина в течение 5 минут при 20 0 С приводит к появлению радиоактивности по обеим сторонам плазматической мембраны. Радиоактивность во внутреннем пространстве клетки контролировалась на расстоянии 3-4 мкм (Р. Görden, J.L. Carentier et.al., 1978).

Интернализация инсулина имеет большое значение в изучении механизма действия инсулина и объясняется моделью подвижного рецептора (M.D. Hollenberg, P. Cuatrecasas, 1978; C.R. Kahn, 1985), в которой в качестве активного начала рассматривается тройной комплекс гормон- рецептор-эффектор. Согласно этой модели рецептор и эффектор являются независимыми молекулами, способными к латеральной диффузии в плоскости

мембраны. Гормональная активация клетки является результатом, по крайней мере, двух последовательных реакций, одна из которых происходит на поверхности мембраны (образование лиганд-рецепторного комплекса), а с другой-внутри нее (образование комплекса с эффектором). Убедительном доказательством модели явился анализ мутантов инсулино-вого рецептора , как естественных, так и сайт-направленных in vitro ( C.R. Kahn, M.F. White, S.E. Shoelson et.al., 1993; J.M. Kahn, M.E. White, 1988).

Совсем недавно были идентифицированы некоторые из последующих компонентов, проводящих инсулиновый сигнал. Самым важным является открытие эффектора инсулинового рецептора субстрата-1 (JRS-1), который без инактивации инсулином рецептора в большей степени фосфо-рилируется на сериновых остатках и в меньшей степени на тирозиновых остатках (Jr M.G. Myers, J.M. Backer, X.J. Sun et.al., 1992; R.J. Lechleider, S. Sugimoto et.al., 1993; S. Sugimoto, R.J. Lechleider et.al., 1993; J.M. Backer, Jr M.G. Myers, S.E. Shoelson et.al., 1992). А после стимуляции инсулином происходит существенное увеличение фосфорилирования субстрата как на тирозиновых так и на сериновых остатках (X.J. Sun et.al., 1992). По мнению �