Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Показатели Na-транспортирующей системы почечной ткани, перекисное окисление липидов и сопряженные процессы инсулинрецепторного взаимодействия при экспериментальном сахарном диабете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Показатели Na-транспортирующей системы почечной ткани, перекисное окисление липидов и сопряженные процессы инсулинрецепторного взаимодействия при экспериментальном сахарном диабете"

сг.

с=с г:

На правах рукописи ОС

сэ

£ -п сх|

Турина Алла Евгеньевна

ПОКАЗАТЕЛИ Ыа-ТРАНСПОРТИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ ПОЧЕЧНОЙ ТКАНИ, ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ

ЛИПИДОВ И СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ ИНСУЛИНРЕЦЕПТОРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ.

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре биологической химии СевероОсетинской государственной медицинской академии и в ПНИЛе патогенетических механизмов эндокринно-обменных заболеваний МЛК Российского государственного медицинского университета

Научный руководитель: член-корреспондент РАЕ, заслуженный

деятель науки и техники РСО-Алания, доктор медицинских наук, профессор - Ф.С.Дзугкоева

Научный консультант: доктор биологических наук -

Н.П.Микаелян

Официальные опоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Л.Ф.Панченко доктор медицинских наук, профессор A.A.Терентьев

Ведущая организация: Всероссийский научный эндокринологический центр

Защита состоится "_" _199 г. в_ часов на заседании

Диссертационного Совета К 084.14.05 в Российском государственном медицинском университете Адрес: 117869, Москва, ул.Островитянова 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета

Автореферат разослан "_" _199 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук,

доцент Т.Н.Клушина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Механизмы диабетической нефро-патии не являются полностью изученными и занимают важное место среди других нерешенных проблем. Литературные сведения демонстрируют не только изменения функционального состояния почек, но и мембранных механизмов нарушения активности ферментов, обеспечивающих канальцевый транспорт ионов и органических молекул.

По данным исследований ряда авторов (Дзугкоева Ф.С.,198 2, Геворкян Д.М., 1989, Rahmane Jourdheisi D.et al,1987) известно, что при инсуликзависимом сахарном диабете (ИЗСД) в состоянии декомпенсации снижается активность Na-Hacoca, в частности Na*, К'-АТФазы, которая зависит от состояния липидного микроокружения (Болдырев А.А. и соавт.,1995) ; ионных регуляторов и нуклеотидов, являющихся субстратами, гормональных активаторов и ингибиторов. В плазматических мембранах клеток печени, эритроцитов при гипоинсулинемии (аллоксановый диабет (АД), ИЗСД! отмечаются увеличение концентрации нейтральных липидов и холестерина, активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что сопровождается накоплением первичных продуктов гидроперекисей (ГП), диеновых коньюгатов (ДК) и вторичных -малонового диальдегида (МДА).

ПОЛ инициируется при сахарном диабете, на фоне снижения инсулиновой активности, образованием активных свободных радикалов кислорода, ингибированием антиокислительной ферментативной защиты (супероксипяисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы). Липопероксидаиия в мембране митохондрий может вызвать разобщение биологического окисления и окислительного фосфорилирования, а это способствует снижению энергообразования в клетке. В этих условиях замедляются процессы активного трансмембранного переноса ионов. Повышение ПОЛ в мембране клетки может вызвать увеличение ее вязкости, это, по-видимому, приводит к конформаиион-ным изменениям интегральных белков, представителем которых является Na*, К*-АТФаза. Данный процесс достаточно хорошо изучен при патологии сердечно-сосудистой системы (Меерсон Ф.3.,1982, Гуткин Д.В., Петрович Ю.А.,1982), однако, количество литератур-

ных сведений об изменении липопероксидации в почечной ткани в условиях иксуликовой недостаточности ограничено.

Сведения об инсуликрецепторном взаимодействии в клетках при ИЗСД разноречивы. Некоторые авторы отмечают повышение ин-сулинсвязывающей активности (ИСА) при ИЗСД, другие - понижение (Румянцев A.C., 1992, Pernet А., Trimbele E.R. et al,1984, Kekeni Т. et al.,1988), а третьими обнаружено, что состояние ИР при I типе сахарного диабета (СД) характеризуется гетерогенностью (в одной группе - уменьшение связывания инсулина специфическими рецепторами, а в другой - наоборот увеличение) (Ефимов A.C., Вездробный Ю.В., L987, Ефимов A.C. и соавт., 1992, Pedersen О., Beck-Nielsen, 1981). Эти изменения выявлены в эритроцитах, лейкоцитах и других клетках (Ефимов A.C., Бездробкый Ю.В., 1987, Микаелян К.П., Князев Ю.А. и соавт., 1996). В доступной нам литературе отсутствуют данные об иксулинрецепторном взаимодействии в клетках почечной ткани при ИЗСД. Комплексных исследований, посвященных изучению электролитовыделительной функции почек, активности Na*, К*-АТФазы, состояния ПОЛ, ИСА и процессов утилизации глюкозы в клетках почечной ткани при экспериментальном сахарном диабете в литературе не отмечается.

Целью исследования явилось изучение показателей электролитовыделительной функции почек, мембранных механизмов регуляции активности Ма-насоса, процессов инсулинрецепторного взаимодействия и утилизации глюкозы в клетках почечной ткани при экспериментальном сахарном диабете (аллоксановом).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи исследования:

1. Изучить комплексно показатели электролитовыделительной функции почек и изменение активности Na*, К*~АТФазы в корковом и мозговом веществе почечной ткани при аллоксановом диабете.

2. Исследовать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах и в клетках обоих слоев почечной ткани при экспериментальном сахарном диабете.

3. Выяснить особенности инсулинрецепторного взаимодействия в эритроцитах и клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани при 'инсулиновой недостаточности - экспериментальный сахарный диабет.

4. Изучить изменения утилизации глюкозы эритроцитами, клетками коркового и мозгового вещества почечной ткани при аллоксановом диабете и выявить зависимость от степени гипергликемии.

5. Выявить взаимосвязи между нарушением обмена углеводов, изменением активности Ыа*, К*-АТФазы почечной ткани, повышением интенсивности ПОЛ, состоянием инсулиновых рецепторов, процессами утилизации глюкозы в данной ткани.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование функционального состояния почек, активности биологического насоса (Ыа-насоса) почек, перекисного окисления ли-пидов, ИСА и процессов утилизации глюкозы при экспериментальном сахарном диабете. Показано, что причиной нарушения каналь-цевого транспорта натрия при аллоксановом диабете является снижение активности Ыа*, К*-АТФазы клеток почечных канальцев. Выявлена взаимосвязь между активностью Иа*, К*-АТФазы и свободнора-дикальным фосфолиполизом в почечной ткани. Показано, что нарушение инсулинрецепторкого взаимодействия в условиях ИЗСД (аллоксановый диабет), и снижение утилизации глюкозы клетками коркового и мозгового вещества почечной ткани, возможно, приводит к нарушению синтеза АТФ и понижению активности Ыа*, К'-АТФазы.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные расширяют, углубляют теоретические знания о мембранных механизмах регуляции активности ферментов, обеспечивающих активный транспорт ионов натрия в канальцах почек. Результаты наших исследований проливают свет на нарушение мембранных механизмов нефропатии при ИЗСД.

Полученные данные имеют научно-практическое значение, так как изменение ПОЛ в эритроцитах отражают биохимическую ситуацию в клетках почечной ткани, что может быть использовано с целью своевременной диагностики нарушения функционального состояния почек у больных ИЗСД. Исследование утилизации глюкозы эритроцитами может свидетельствовать о состоянии данного процесса в клетках почечной ткани.

Материалы работы возможно использовать в лабораторной диагностике, научно-исследовательской работе и учебном процессе в биохимии, физиологии почек, эндокринологии, патологической фи-

экологии эндокринной системы.

Внедрение. Научные результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах биологической химии, патологической физиологии и факультетской терапии с курсом эндокринологии Се-веро-Осетинской государственной медицинской академии, используется в научно-исследовательской работе кафедры биологической химии СОГМА.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на III Всероссийском съезде эндокринологов России (Москва, 1996!, на II международном симпозиуме студентов-медиков (Греция, г.Салоники, 1996), на итоговой VI научной сессии СевероОсетинского государственного медицинского института (г.Владикавказ, 1997).

Об-ьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы. Иллюстрирована 17 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 24 8 источников, из них 145 отечественных и 103 иностранных.

Содержание работы Материалы и методы исследования Исследования проводились на 237 крысах-самцах линии ЩэЬаг одной возрастной группы ((0-14 месяцев), массой 180-220 г интактных (116 животных) и с аллоксановым диабетом (121 животное) . В хроническом опыте исследовано 100 крыс, а в остром -137. Всего проведено 4177 исследований.

Экспериментальный сахарный диабет вызывали путем введения аллоксана животным, голодавшим в течении 24-48 часов, но имевшим свободный доступ к воде, однократно, внутрибрюшинно в виде свежеприготовленного 5% водного раствора в дозе 15 мг на 100 г массы тела, которая является диабетогенной.

Через 4 8-72 часа ( то есть через 2-3 суток) после введения аллоксана у крыс натощак определялся уровень глюкозы крови глюкозооксидазным методом. Исследования на животных проводились гю прошествии остротоксического периода действия аллоксана,

в одно и то же время года (весной и осенью) и суток.

Экспериментальные исследования проводились в хроническом и остром опытах.

В хронических опытах исследовались водо- и электролитовыделительная функция почек, а в острых опытах - определялись изменение активности Na*,К*-АТФазы в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани, ПОЛ, ИСА, процессы утилизации глюкозы эритроцитами и клетками почечной ткани, причем подопытные животные по уровню гипергликемии были разделены на 3 группы:

I группа - диабет легкой степени тяжести (глюкоза крови до 10 ммоль/л)

II группа - диабет средней степени тяжести (глюкоза крови от 10 ммоль/л до 20 ммоль/л)

III группа - диабет тяжелой степени (глюкоза крови свыше 20 ммоль/л)

В хронической стадии аллоксанового диабета у экспериментальных животных исследовался в динамике спонтанный 6-часовой диурез, концентрация креатинина, натрия и калия в крови и моче; расчетным путем определялись величина клубочковой ультрафильтрации (КФ) , экскреция воды и электролитов, их канальцевая реаб сорбция и фильтрационный заряд (использовали расчетные формулы Наточина Ю.В., 197 4).

Концентрация натрия, калия в моче и плазме крови определяли методом пламенной фотометрии (Mosher К.,1949; Нифонтова М.В.,1961; Крохалев A.A.,1961; ВольпеМ.М., Титова Р.И.,1965), а содержание креатинина - спектрофотометрически (Grisler и Costelunoro, 1970).

В острых опытах животных забивали декага^ацией. Забирали образцы крови и почечной ткани - корковое и мозговое вещество. Отделяли эритроциты от плазмы крови. В плазме определяли концентрацию креатинина, натрия, калия. А выделенные эритроциты отмывали троекратным центрифугированием в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащем ТРИСНС1, рН=7.3 при 1500 об/мин в течение 10 мин., в них определяли перекисное окисление липидов (ПОЛ) по данным изменения концентрации малонового диаль-дегида (МДА) колориметрическим методом с тиобарбитуровой

кислотой по методу Osacawa, 1980. Извлекали почки при t=+4°C , выделяли корковое и мозговое вещество, гомогенизировали, определяли активность Na*, К'-АТФазы по методу SCOU, 1951, то есть по приросту фосфора неорганического в пробе при добавлении АТФ с последующей инкубацией. Удельную активность фермента рассчитывали на мг белка за час (мкмоль Рн/мг белка/час). Белок в пробах определяли по методу ЛОУРИ, 1951. Так же в гомоге-натах коркового и мозгового вещества почечной ткани исследовали концентрацию МДА (вышеуказанным методом).

Параллельно in vitro определяли связывание меченного 1251-инсулина ( производство фирмы "Amersham") с инсулиновыми рецепторами эритроцитов и клеток коркового и мозгового вещества почечной ткани (по методу J.Roth,1983). В данных тканях исследовали чувствительность клеток к инсулину по степени утилизации глюкозы. 0 количестве глюкозы, потребленной клетками, судили по разнице между количеством глюкозы в среде до и после инкубации .

Статистический анализ данных проводили с помощь программы для персонального компьютера, разработанной на кафедре медицинской и биологической кибернетики РГМУ, с использованием статистических критериев не зависящих от характера распределения -точного метода Фишера, критерия хи-квадрата, t-критерия Стьюде-нта. Значимость коэффициентов корреляции определялась с использованием z-преобразования Фишера по критерию Стьюдента (t-критерий).

я

Результаты исследования и их обсуждение _I.Функциональное состояние почек и изменение активности Ыа*, К*-АТФазы почечной ткани при экспериментальном сахарном диабете.

В физиологических условиях почка постоянно поддерживает гомеостаз воды и электролитов. Однако в условиях недостаточности инсулина нарушается гомеостатическая функция почек, что приводит к изменению постоянства воды и электролитов в организме аллоксандиабетических крыс. Степень поражения зависит от тяжести заболевания.

В результате проведенных исследований обнаружено, что в хронической стадии аллоксанового диабета уже при уровне гипергликемии до 10 ммоль/л (легкая форма АД) отмечается статистически достоверное (р<0.001) увеличение спонтанного мочеотделения с 0.14+0.016 мл/час/100 г веса в контрольной группе до 0.32+0.06 мл/час/100 г веса в опытной, вследствие снижения относительной канальцевой реабсорбции воды (р<0.001). Клубочковая фильтрация обнаруживает тенденцию к снижению (табл.1).

При АД средней степени тяжести ( глюкоза крови от 10 до 20 ммоль/л) наблюдается увеличение диуреза в 1.9- раза, то есть его величина возрастает до 0.27+0.03 мл/час/100 г веса по сравнению с контрольной группой (р<0.001), при статистически достоверном снижении канальцевой реабсорбции воды (р<0.001) и не изменившемся уровне клубочковой фильтрации (табл.1).

Наряду с изменением водовыделительной функции почек происходит нарушение ее электролитовыделительной функции. Параллельно с повышением мочеотделения выявлено увеличение экскреции с мочой натрия и калия при АД легкой и прц средней степени тяжести. Так при легкой форме АД экскрециянатрия статистически достоверно возрастает с 8.57±0.81 мкмоль/час/100г веса в контрольной группе до 29.67+10.18 мкмоль/час/100 г веса (р<0.001), а калия с 8.13+0.84 мкмоль/час/100 г веса в контроле до 9.65+1.07 мкмоль/час/100 г веса в опыте. При АД средней степени тяжести наблюдается увеличение экскреции натрия до 12.25+1.77 мкмоль/час/100 г веса (р<0.001), а выделение калия с мочой имеет тенденцию к повышению до 8.Э1+1.19 мкмоль/час/100 г (р>0.05). Параллельно выявлена тенденция к

Таблица № 1

ПОКАЗАТЕЛИ ВОДО- И ЭЛЕКТРОЛИТОВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПОЧЕК У КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ

ГРУППЫ Диурез Клубочковая Канальцевая Ек Е"з F3 Реаб-

животных фильтрация реабсорбиия мкмоль/ мкмоль/ Na К сорб-

мл/час/ мл/час/100г воды,% час/100 г час/100 г мкмоль/ мкмоль/ иия Na

100 г час/100 г час/100 г %

Контрольная М 0, 14 27, 11 99, 39 8, 57 8,13 3738,6 127,36 99, 76

группа ±т 0,016 1,47 0, 03 0, 81 0, 84 199, 6 7,39 0, 02

п 136 135 135 130 98 124 120 98

I группа М 0, 32 24, 36 98, 66 29, 67 9, 65 3355,8 121, 2 99,18 -

(легкая ±т 0, 06 3, 41 0,18 10,1В 1,07 467, 6 16, 66 0,28

степень п 20 20 20 7 7 20 20 7

тяжести АД) Р < > 0,05 < 0,001 < 0,001 > 0,05 > 0, 05 > 0,05 <0,001

0, 001

II группа м 0, 27 28, 56 98, 69 12, 25 8,81 3567,6 125, 3 99,360

(средняя ±т 0, 03 4,26 0, 13 . 1, 77 1,19 562, 7 25, 14 0, 05

степень п 109 109 109 81 79 105 105 61

тяжести АД) Р < > 0,05 < 0,001 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0, 05 <0,001

0,001 . .......

Примечание:р - достоверность результатов в опытной группе ( у крыс с АД)сравнительно с данными контрольной группы.

снижению фильтрационного заряда натрия при легкой форме диабета с 3738.6+199.6 мкмоль/час/100г веса до 3355.8+467.6

мкмоль/час/100 г веса, а при средней - до 3567.6+562.7 мкмоль/час/100 г веса 1р>0.05) и фильтрационного заряда калия соответственно с 127.36+36 мкмоль/час/100 г веса (р>0.05) в контроле до 121.2 + 18.66 мкмоль/час/100 г веса (р>0.05) и 125.3+25.14 мкмоль/час/100 г веса (р>0.05) при АД легкой и средней степени тяжести (табл.1).

Увеличение экскреции натрия происходит вследствие угнетения процессов канальцевой реабсорбции натрия в почках - уровень относительной канальцевой реабсорбции данного катиона снижается с 99.76+0.02% в контроле до 99.18+0.28% при АД легкой (р<0.001) и до 99.36+0.05% при средней степени тяжести (табл.1).

Параллельно наблюдается изменение концентрации этих катионов в плазме крови. При АД легкой степени тяжести выявлена тенденция к увеличению уровня натрия и калия соответственно с 142.88+0.75 ммоль/л до 145.28+1.47 ммоль/л (р>0.05); с 4.96+0.07 ммоль/л до 5.19+0.15 ммоль/л (р>0.05). При АД средней степени тяжести в результате повышения экскреции натрия отмечается гипонатриемия, концентрация катиона снижается до 132.93+0.83 ммоль/л (р<0.001), а калия - остается увеличенной до 5.32+0.09 ммоль/л, (р<0.001) по сравнению с контрольной группой. Это происходит в результате перераспределения калия между эритроцитами и плазмой крови.

Таким образом, в обеих группах при АД у крыс выявлено статистически достоверное увеличение спонтанного диуреза при неизмененном или незначительно сниженном уровне клубочковой фильтрации и статистически достоверном понижении канальцевой реабсорбции воды. При этом страдают процессы экскреции с мочой одновалентных ионов натрия и калия. Повышение экскреции натрия происходит вследствие снижения процессов реабсорбции данного катиона в почечных канальцах.

Известно, что реабсорбция натрия в почечных канальцах является активным процессом и в нем принимает участие олигомер-ный мембранный фермент, локализованный в базолатеральной мембране - Ыа', К*-АТФаза,составная часть Ыа-насоса. Инсулин в норме

оказывает прямое антидиуретическое действие, стимулируя реаб-сорбшда Воды и активный транспорт натрия в проксимальных канальцах и дистальном отделе нефрона, повышая активность энзима - Ыа*, К*-АТФазы. В условиях инсулиновой недостаточности нами выявлено статистически достоверное снижение активности Ыа*, к'-АТФазы как в корковом, так и в мозговом веществе почечной ткани, причем, наиболее значительное в мозговом веществе. Так в мозговом веществе активность Ыа*, К'-АТФазы уменьшается на 46.1%, а в корковом - на 31.8% по сравнению с контрольной группой (табл.2). Более значительное снижение активности фермента в мозговом веществе почечной ткани обусловлено особенностями функционирования дистального нефрона и расположением здесь толстого восходящего отдела петли Генле, в котором функционирует Ыа-насос.

Снижение активности Ыа4, К'-АТФазы может быть обусловлено уменьшением внутриклеточной концентрации основного энергетического субстрата АТФ, а также изменением конформации самого энзима в результате нарушения состояния фосфолипидов мембран канальцев почек, то есть изменения липидного микроокружения фермента .

Таким образом, выявленное нами уменьшение реабсорбции натрия в почечных канальцах связано со снижением активности АТФазы.

Перекисное окисление липидов при АД.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - универсальный свобо-днорадикальный процесс, протекающий в мембранах и играющий существенную роль в патогенезе ряда патологических синдромов при различных заболеваниях, в том числе при ИЗСД. В физиологических условиях процессы ПОЛ играют важную роль в структурно-функциональной модификации биологических мембран и изменении их физико-химических свойств и проницаемости. Так же они оказывают действие на встроенные в нее белковые комплексы. Поскольку активность Ма*, К'-АТФазы зависит от состояния липидного микроокружения, то мы для выяснения характера его изменения и выявле-

ния нарушения липид-белковых взаимоотношений в условиях инсули-новой недостаточности исследовали процессы ПОЛ в мембранах клеток коркового и мозгового вещества почечной ткани и эритроцитах, наиболее доступной модели тканевых клеток.

Анализ полученных результатов показал, что в эритроцитах при АД наблюдается статистически достоверное (р<0.001) увеличение активности процессов липопероксидации, отмечается повышение концентрации МДА на 25.9% по отношению к контрольной группе (табл.2).

В клетках почечной ткани выявлены аналогичные изменения: происходит увеличение концентрации МДА как в корковом, так и в мозговом веществе, причем наиболее значительное накопление конечного продукта переокисления наблюдается в корковом веществе, метаболизм в котором осуществляется по аэробному пути. Данные свидетельствуют о том, что в мозговом веществе отмечается увеличение процессов липопероксидации на 39.9%, а в корковом - на 62.2% (р<0.001) (табл.2). Это, по-видимому, происходит вследствие изменения оксигенации клеток и уменьшения антиокислительной защиты. В условиях, возникающей при СД гипоксии, наблюдается снижение аэробных окислительных процессов в тканях, а также переключение энергетических процессов с углеводного на липидный обмен и затрудняется утилизации свободных жирных кислот (СЖК) при аноксии. Они накапливаются в большом количестве, оказывают детергентное действие и активируют процессы ПОЛ в мембранах, приводя к повреждению клеточной мембраны и снижению АТФ в клетке. Увеличение процессов липопероксидации при АД вызывает также дезинтеграцию липопротеиновых комплексов, усиливает их гидрофильность и приводит к нарушению проницаемости мембраны, и изменению конформаиии мембраносвязан-ного фермента Иа', К*-АТФазы

Исследования подтвердили взаимосвязь между повышением концентрации МДА в клетках почечной ткани и снижением активности Иа-насоса. Наряду с этим отмечаются однонаправленные изменения процессов липопероксидации в эритроцитах и клетках почечной ткани, что может быть использовано в клинике для выяснения сос-

Таблица N2.

АКТИВНОСТЬ №*,К+-АТФазы, СОДЕРЖАНИЕ МАЛОНОВОГО ДИ-АЛЬДЕГИДА И ИНСУЛ1ШСВЯЗЫВАГОЩАЯ АКТИВНОСТЬ ИНСУЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ЭРИТРОЦИТОВ, КЛЕТОК МОЗГОВОГО И КОРКОВОГО ВЕЩЕСТВА ПОЧЕЧНОЙ ТКАНИ ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ СРЕДНЕЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ.

ИССЛЕДУЕМЫЕ Статист. ГРУППЫ ЖИВОТНЫХ

ВЕЛИЧИНЫ показа-

тели контрольная с аллоксановым

диабетом

1. Активность Ыа+,К*-АТФазы мозго- М 8,426 4.543

вого вешества почечной ткани + ш 0.59 0.8572

(мкмоль Рн/мг белка/час) и 25 25

Р . <0.002

2. Активность Ыа*,К+-АТФазы кор- М 4.839 3.3

кового вешества почечной ткани ±т 0.5 0.27

(мкмоль Рн/мг белка/час) п 25 25

Р <0.001

3. Концентрация МДА в эритроцитах М 0.687 0.865

(нмоль/кл) ±П1 0.045 0.047

п 10 10

Р <0.0!

4. Концентрация МДА в клетках моз- М 2.4325 3.4019

гового вешества почечной тканн ± т 0.435 0.2795

(нмоль/мг белка) п 8 8

Р <0.05

5. Концентрация МДА в клетках кор- М 2.3014 3.7329

кового вещества почечной ткани ± т 0.11 0.3047

(нмоль/мг белка) п 16 16

Р <0.001

б. ИСА ИР эритроцитов (%) М 18.38 10.72

± т 1.32 1.076

п 18 18

Р <0.001

7. ИСА ИР клеток мозгового веще- М 14.56 10.22

ства почечной ткани (%) + т 0.689 0.913

п 18 22

Р <0.001

8. ИСА ИР клеток коркового вещест- М 14.36 10.336

ва почечной тканн (%) ± т 0.689 0.9942

п 18 22

Р <0.001

ПРИМЕЧАНИЕ: 2 - достоверность результатов опытной группы по отношению к контрольной. МДА - малоновы» диальдегид

ИСА ИР - инсулинсвязывагощая активность нисулнновых рецепторов

тояния ПОЛ в почечной ткани по данным изменения липопероксида-ции в эритроцитах.

Таким образом, при проведении исследования выявлено повышение процессов ПОЛ в эритроцитах и клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани, что приводит к изменению конфор-мации К*-АТФазы и снижению ее активности.

3.Инсулинсвязывающая активность и процессы утилизации при аллоксановом диабете.

Выявленное снижение активности Ма\К*-АТФазы почечных канальцев, возможно, происходит не только вследствие нарушения липидного микроокружения энзима, но может быть связано с изменением инсулинрецепторного взаимодействия, в результате чего наблюдается уменьшение потребления глюкозы и наработки АТФ в клетках почечной ткани. Для решения данного вопроса нами изучалось состояние инсулинрецепторного взаимодействия в эритроцитах, как наиболее доступной модели тканевых клеток, и в клетках почечной ткани при АД различной степени тяжести.

Данные показали, что в эритроцитах при АД различной степени тяжести отмечается статистически достоверное (р<0.001) снижение процессов инсулинрецепторного взаимодействия, причем при легкой степени ИСА эритроцитов уменьшается на 55%, при средней - на 41.68%, а при тяжелой - на 54.6% (табл.2). То есть выявлено понижение % связывания 1251-инсулина во всех трех группах, наиболее значительно при легкой и тяжелой форме АД, при среднетяжелой форме СД, наблюдается незначительное увеличение % связывания по сравнению с другими группами, возможно из-за включения компенсаторных механизмов. Снижение параметров инсулинрецепторного взаимодействия может быть объяснено несколькими факторами: с одной стороны - блокадой инсулино-вых рецепторов (ИР) продуктами нарушенного метаболизма, а с другой - нарушением состояния мембраны самого эритроцита, то есть вследствие изменения качественного состава фосфолипидов мембраны, в которую встроен белковый комплекс - инсулиновый рецептор. Это, подтвердилось данными наших■исследований, показавшими повышение процессов липопероксидации и, следовательно, нарушение состояние фосфолипидов мембран.

В клетках почечной ткани наблюдаются аналогичные изменения. Отмечается понижение ИСА как в клетках коркового, так и мозгового вещества при АД различной степени тяжести, но наиболее значительно - в мозговом веществе(табл.2). ИСА в клетках мозгового вещества снижается при легкой степени тяжести на 33.7% (р<0.001), при средней степени - 29.8%(р<0.001) , а при тяжелой - на 21.9% (р<0.001), а в корковом - соответственно на 16.8% (в I группе), на 27.3% (во II группе), на 14.36% (в III группе) (р<0.001). Однако при АД средней степени тяжести в клетках мозгового вещества почечной ткани имеются группы с повышенной ИСА (у 31.8% животных наблюдается увеличение ИСА на 41.6%) и с пониженным связыванием 1251-инсулина ( у 68.2% животных отмечается уменьшение ИСА на 33.3%).

На основании полученных данных можно заключить, что снижение инсулинрецепторного взаимодействия связано с нарушением качественного состава липидной фазы клеточной мембраны, происходящим в результате усиления процессов ПОЛ. Активация липопе-роксидации ведет к повышению микровязкости мембран и ухудшению доступности рецептора для гормона, то есть происходят изменения на рецепторном уровне. Нарушается транспорт и утилизация глюкозы клетками, следовательно, снижается энергообразование и наработка АТФ, что является причиной уменьшения активности Na*, К*-АТФазы. Для подтверждения данной гипотезы мы предприняли попытку исследовать процессы утилизации глюкозы эритроцитами и клетками коркового и мозгового вещества почечной ткани в условиях инсулиновой недостаточности.

Результаты показали, что в эритроцитах при аллоксановом диабете легкой степени тяжести имеет место тенденция к понижению как базального, так и стимулируемого инсулином потребления глюкозы (р>0.05). При средней степени тяжести, так же наблюдается тенденция к уменьшению как базального, так и стимулируемого инсулином потребления глюкозы эритроцитами, но по сравнению с I группой оно снижается в меньшей степени, по-видимому, вследствие включения компенсаторных механизмов. Но поскольку стимулируемое инсулином потребление глюкозы угнетается в большей степени, то можно предполагать, что имеется тенденция к развитию инсулпнорезистентности. При тяжелой степени ал-

локсанового диабета глюкоза полностью не утилизируется, выявлено уменьшение как базального, так и стимулируемого инсулином потребления глюкозы, это дает основание полагать, что чувствительность клеток к инсулину резко снижается (рис.1).

Изменения утилизации глюкозы в тканях показали, что в клетках мозгового вещества почечной ткани при легкой степени тяжести аллоксанового диабета отмечается тенденция к снижению как базального, так и стимулируемого инсулином потребления глюкозы (р<0.05), а при средней степени тяжести СД выявлено статистически достоверное понижение утилизации глюкозы. Еще более значительные изменения наблюдаются при тяжелой степени АД, при которой базальное потребление глюкозы снижается на 76% (р<0.001), а стимулируемое инсулином - на 81.3% (р<0.001), причем больше страдает стимулируемое инсулином потребление глюкозы, то есть реакция клеток мозгового вещества почечной ткани к действию инсулина ослабевает (рис.1).

Аналогичные изменения выявлены и при изучении утилизации глюкозы клетками коркового вещества почечной ткани: снижение потребления глюкозы в I группе базального - на 23.2%, стимулируемого инсулином - на 24.1%, во II группе - соответственно на 26.75% и 33% (р<0.001), а в III группе - базального - на 91.3%, а стимулируемого инсулином - на 96.8% (р<0.001).

Таким образом, отмечается торможение утилизации глюкозы как эритроцитами, так и клетками коркового и мозгового вещества почечной ткани, что, по-видимому, приводит к нарушению образования АТФ и снижению активности Na*, К*-АТФазы (рис.1).

Основной задачей нашего исследования явилось изучение зависимости активности Na+, К*-АТФазы почечной ткани от состояния инсулинрецепторного взаимодействия при аллоксановом диабете. Изучив корреляционные взаимоотношения между данными показателями мы выявили прямую корреляционную взаимосвязь, то есть в клетках мозгового вещества при средней степени тяжести аллоксанового диабета отмечается статистически достоверные корреляционные изменения между показателями активности энзима и инсулинс-вязывающей активностью (г=+0.5, р<0.05). Кроме этого обнаружена

Потребление ютзкойы г^шрсадетаии

нмоль/кл/час

■ без инсулина О с инсулином

I - контрольная группа

XI - диабет легкой степени

XII - диабет средней степени XV - диабет тяжелой степени

Рисунок 1

Потребление глюкозы клетками мозгового вещества почечной ткани

мкмоль/мг белка/ час

I II Ш IV

Шбез инсулина Пс инсулином

Потребление глюхоэы клетками коркового вещества почечной ткани

мкмоль/мг бел^а/ час

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

II

0,001

Ш IV

■ без инсулина Ос инсулином

однонаправленность в изменении ИСА ИР эритроцитов и клеток коркового и мозгового вещества почечной ткани.

В условиях инсулиновой недостаточности наблюдается отрицательная корреляционная взаимосвязь между уровнем гипергликемии базальным и стимулируемым инсулином (г=-0.62, р<0.05) потреблением глюкозы эритроцитами. Аналогичные корреляционные взаимосвязи выявлены в клетках мозгового вещества почечной ткани (соответственно г=-0.52, р<0.01; г=-0.52, р<0.05) и в клетках коркового вещества (г=-0.4б, р<0.05; г=-0.52, р<;0.05). Таким образом, гипергликемия приводит к нарушению процессов утилизации глюкозы эритроцитами и клетками обоих слоев почечной ткани .

Исследования корреляционных взаимосвязей показали отрицательные корреляционные взаимоотношения между ИСА эритроцитов и потреблением глюкозы как базальным, так и стимулируемым инсулином (г=-0.78, р<0.001; г=-0.86, р<0.001); между ИСА эритроцитов и процессами утилизации глюкозы клетками мозгового вещества почечной ткани стимулируемого инсулином и базального (г=-0.43, р<0.05; г=-0.39; р<0.05). Это свидетельствует о

том, что имеющее место снижение инсулинрецепторного взаимодействия и процессов утилизации глюкозы, возможно, происходит вследствие уменьшения не только количества ИР функционирующих нормально на фоне инсулиновой недостаточности, но и изменения реактивности существующих рецепторов.

При изучении корреляционных взаимосвязей между процессами утилизации глюкозы эритроцитами и клетками коркового и мозгового вещества почечной ткани нами выявлена положительная корреляция, что подтверждает однонаправленность изменений в данных тканях.

Следовательно, нарушение инсулинрецепторного взаимодействия и утилизации глюкозы клетками почечной ткани способствуют снижению энергообеспечения и угнетению активности Иа*, К*-АТФазы в условиях инсулиновой недостаточности.

Вывода.

1. При экспериментальном сахарном диабете отмечается повышение экскреции воды и электролитов (Ыа*,К*), вследствие снижения уровня канальцевой реабсорбции воды, натрия и калия.

2. При аллоксановом диабете снижается активность Ыа*, К*-АТФазы в корковом и мозговом веществе почечной ткани и ингибируется активный транспорт натрия и калия.

3. В условиях дефицита инсулина активируются процессы липопе-роксидации в эритроцитах и клетках обоих слоев почечной ткани, изменяющие липид-белковые взаимодействия и снижающие активность мембранносвязанного фермента Ыа-насоса, Ыа*, К*-АТФазы почечных канальцев .

4. При аллоксановом диабете различной степени тяжести отмечается снижение инсулинсвязывающей активности и уменьшение процессов утилизации глюкозы базального и стимулируемого, как в эритроцитах, так в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани.

5. Ослабление инсулинрецепторного взаимодействия при аллоксановом диабете приводит к угнетению потребления глюкозы эритроцитами и клетками почечной ткани, вследствие изменения количества инсулино-вых рецепторов и их сродства, что, по-видимому, способствует снижению синтеза АТФ и угнетению активности Ыа-насоса - Иа*, К*-АТФазы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Полученные данные расширяют, углубляют теоретические знания о мембранных механизмах регуляции активности ферментов, обеспечивающих активный транспорт ионов натрия в канальцах почек. Результаты наших исследований проливают свет на нарушение мембранных механизмов нефропатии при ИЗСД.

2. По концентрации МДА в эритроцитах можно судить об активности данного процесса в клетках почечной ткани, что возможно использовать с целью своевременной диагностики нарушения функционального состояния почек у больных ИЗСД.

3. Исследование инсулинсвязывающей активности и утилизации глюкозы эритроцитами, может свидетельствовать о состоянии данных процессов в клетках почечной ткани, позволяет судить о степени повреждения процессов метаболизма почечной ткани и нарушении функционального состояния почек.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Богнова Е., Турина А. Изменение активности натриевого насоса /Na,К-ЛТФазы/ почечной ткани под влиянием инсулина// Материалы докл. LUI студ. науч. конф. Тбилисского Ордена Трудового Красного Знамени госмединститута.- Тбилиси, 1990.- С.33.

2. Дзугкоева Ф.С., Туаева Е.К., Турина Л.Е. К вопросу о. взаимоотношениях ренин-альдостероновой и калликреин-кининовой систем при диабетической нефропатии//Тез. докл. 1-го съезда нефрологов России.- Казань, 1994.- С.71-72.

3. Турина А.Е. К вопросу об изменении регуляции активности Иа,К-АТФазы при экспериментальном сахарном диабете//Материалы докладов конференции молодых ученых Северного Кавказа по физиологии посвященной 80-летию РТУ "Физиологические исследования молодых ученых Северо-Кавказского региона",- Ростов-на-Дону, 1995,- С.91-92.

4. Дзугкоева Ф.С., Туаева Е.К., Турина А.Е. Гуморальная регуляция активности Na-K-АТФазы микросомальной фракции почечной ткани.//Материалы симпозиума "Физиология почки, водно-солевого обмена", посвященного 100-летию А.Г.Гинешшского.-Новосибирск, 1995.- С.30.

5. Дзугкоева Ф.С., Туаева Е.К., Турина А.Е. Реактивность натриевого насоса при сахарном диабете на фоне экзогенного инсулина// Актуальные проблемы клинической и теоретической медицины .Сб. науч . тр . - Владикавказ, 1996,- С.187-188.

6. Дзугкоева Ф.С., Турина А.Е., Туаева Е.К. Функциональная активность Ыа-К-АТФазы при аллоксановом диабете//Актуальные проблемы клинической и теоретической медицины. Сб.науч.тр.-Владикавказ, 1996- С.189-191.

7. Активность Na-K-АТФазы почечной ткани при экспериментальном сахарном диабете/ Ф.С.Дзугкоева, Е.К.Туаева, А.Е.Турина, H.П.Микаелян// Тез. докл. III Всеросс. съезда эндокринологов "Актуальные проблемы эндокринологии",- М.,1996,- С.16-17.

8. Инсулинрецепторные взаимодействия и ЭПР-спектроскопия при экспериментальном сахарном диабете/ H.П.Микаелян, А.Г.Максина, Ю.А.Князев, А.Е.Турина// Тез. докл. III Всеросс. съезда эндокринологов "Актуальные проблемы эндокринологии".- М.,1996,-С. 20.

9. Особенности структурных изменений мембран хрусталиковых волокон при аллоксановом диабете/ А.Г.Максина, H.П.Микаелян, Ю.А.Князев, А.Е.Турина, Б.А.Дайняк// Тез.докл. XII Всеросс. съезда эндокринологов "Актуальные проблемы эндокринологии".-М.,1996,- С.19.

10. Дзугкоева Ф.С., Турина А.Е. Регуляция активности Na,К-АТФа-эы почечной ткани при экспериментальном сахарном диабете. Ин-форм. письмо.- Владикавказ, 1996,- 13 с.

11. Poteraeva R., Gurina A., Dzugkoeva F. Regulation of Ha-K-ATPase activity in alloxan diabetes// Volume of abstracts of the 2nd European médical students" symposium.- Thessaloniki, 1996.- P.26 (N 79).

12. Дзугкоева Ф.С., Турина A.E., Микаелян H.П. Процессы липопе-роксидации'и активность Ыз, К-АТФазы почечной ткани при экспериментальном сахарном диабете // Тез. докл. VI науч. сессии СОГМА.- Владикавказ, 1997,- С.104.

13. Дзугкоева Ф.С., Турина А.Е., Микаелян Н.П. Реактивность ин~ сулиновых рецепторов при экспериментальном сахарном диабете// Тез. докл. VI науч. сессии СОГМА.- Владикавказ, 1997,- С.105. 14 . Инсулинреиепторное взаимодействие и ЭПР-спектроскопия при экспериментальном сахарном диабете/ Н.П.Микаелян, Ю.А.Князев, А.Г.Максина, Б.А.Дайняк, А.Е.Турина, Э.П.Микаелян, Ф.С.Дзугкоева// Пробл.эндокринологии.- 1997.- Т.43, M 3.- С.48-50.

15. Дзугкоева Ф.С., Турина А.Е., Микаелян Н.П. К механизму регуляции канальцевой реабсорбции натрия при аллоксановом диабете// Тез. докл. V Всеросс. науч. конф. "Фармакология водно-солевого обмена и почек".- Чебоксары, 1997,- С.28-29.

Издательский центр Северо-Осетинской государственной медицинской академии Подписано в печать 17.09.1997г. Заказ N'565. Тираж 100 экз.