Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональный анализ лимфоцитарных белков человека FCRLA и FCRL6

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Функциональный анализ лимфоцитарных белков человека FCRLA и FCRL6"

На правах рукописи

Кулемзин Сергей Викторович

«Функциональный анализ лимфоцитарных белков человека РСЯЬА и РСЯЬб»

03.01.07 — молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МАЙ 2014

Новосибирск 2014

0055489>и

005548910

Работа выполнена в лаборатории иммуногенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Научный руководитель: Таранин Александр Владимирович доктор

биологических наук, заведующий лабораторией иммуногенетики Федерального государственного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Официальные оппоненты: Закиян Сурен Минасович доктор

биологических наук, заведующий лабораторией эпигенетики развития Федерального государственного учреждения науки Институт Цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Лактионов Павел Петрович кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной медицины Федерального государственного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение "ГНЦ Институт иммунологии" Федерального Медико-Биологического Агенства, г. Москва

Защита состоится: 18 июня 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 003.074.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (630090, Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 8/2, тел. (383)-363-90-45) Тел: +7- 952916-7858. e-mail: kokoza@mcb.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН www.mcb.nsc.ni Автореферат разослан «\(s> » апреля 2014 г. Ученый секретарь ,

диссертационного совета, и /

кандидат биологических наук ¿}h~E>Е. Б. Кокоза

Актуальность исследования

В геноме человека имеются сотни генов, экспрессия которых ограничена клетками иммунной системы. Большая часть этих генов кодирует поверхностные рецепторы. Некоторые из них непосредственно вовлечены в распознавание чужеродных патогенов, другие участвуют в межклеточных взаимодействиях при развитии иммунного ответа и в транспорте клеток. Часть специфичных для иммунной системы генов кодирует внутриклеточные белки, ответственные за трансдукцию сигналов от поверхностных рецепторов и утилизацию антигена. Несмотря на впечатляющий прогресс иммунологии и иммуногенетики в течение последних пятидесяти лет, функция многих генов, специфично экспрессирующихся в клетках иммунной системы, остается неизвестной. В практическом плане, имеющиеся пробелы в знаниях ограничивают возможности эффективно управлять иммунным ответом и лечить многие социально значимые заболевания.

Относительно недавно несколькими группами исследователей и, в том числе, лабораторией иммуногенетики, было описано семейство генов, кодирующих FcR-подобные белки лимфоцитов человека - FCRL (Fc Receptor-Like). Шесть членов этого семейства (FCRL1-FCRL6) являются трансмембранными рецепторами и экспрессируются на поверхности лимфоцитов. Еще два, FCRLA и FCRLB, являются внутриклеточными белками (Guselnikov, 2002; Mechetina, 2002; Ershova, 2005; Davis, 2007). FCRLA на высоком уровне экспрессируется в В-клетках зародышевых центров вторичных лимфоидных органов, где, как известно, происходит активация и дифференцировка В-лимфоцитов в плазматические клетки и В-клетки памяти. Сведения о функции FCRLA отсутствуют, однако профиль экспрессии, внутриклеточная локализация и гомология с Fc-рецепторами, позволяют предположить, что FCRLA участвует в процессах регуляции синтеза и созревания иммуноглобулинов.

Уникальной в рамках FCRL-семейства особенностью FCRL6 является экспрессия на цитотоксических Т- и NK-лимфоцитов человека. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) являются основными эффекторами клеточного иммунного ответа, направленного на элиминацию вирус-инфицированных или злокачественно-трансформированных клеток. Для успешного функционирования клеточного звена иммунного ответа необходима точная регуляция степени активации ЦТЛ, так как избыточная или недостаточная активность этих клеток в скором времени приводит к развитию иммунопатологий. Прецизионная регуляция активности ЦТЛ осуществляется множеством активирующих и ингибирующих рецепторов, приобретенных иммуной системой в процессе эволюции.

FCRL6 является наименее изученным трансмембранным рецептором семейства FCRL, однако структура его цитоплазматической части и предварительные данные о характере его экспрессии, указывают на то что FCRL6 является ингибирующим рецептором.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является изучение функций FCRLA в В-лимфоцитах, а также исследование функциональной активности рецептора лимфоцитов человека FCRL6 в норме и при патологии. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить клеточные компартменты, в которых локализованы наиболее распространенные изоформы FCRLA, модификацию, локализацию и характер его мембранной ассоциации.

2. Установить участки FCRLA, влияющие на его локализацию и ответственные за взаимодействие с лигандами.

3. Идентифицировать белки, с которыми FCRLA взаимодействует внутри клетки.

4. Изучить фосфорилирование FCRL6 и особенности связывания этого белка с сигнальными молекулами.

5. Проанализировать изменения экспрессии FCRL6 при хронических вирусных инфекциях (на примере ВИЧ-инфекции).

Научная новизна

Обнаружено, что FCRLA экспрессируется в виде нескольких изоформ, отличающихся последовательностью сигнального пептида и количеством доменов. Установлено, что четырехдоменные изоформы FCRLA с коротким и длинным сигнальным пептидом, а также двухдоменная изоформа с коротким сигнальным пептидом локализованы исключительно в эндоплазматическом ретикулуме. Четырехдоменная изоформа FCRLA ориентирована внутрилюменально и является мембранно-ассоциированным белком. Идентифицирован домен FCRLA, определяющий его локализацию в ЭР и показано, что свободный цистеин FCRLA не участвует в локализации FCRLA в ЭР. Выяснен механизм, который определяет локализацию двухдоменной изоформы FCRLA с коротким сигнальным пептидом в ЭР. Показано, что в клеточной линии BJAB, являющейся моделью активированных В-лимфоцитов, FCRLA взаимодействует с ц-цепью IgM, BiP и МНС II. На основании полученных нами данных, можно предположить, что FCRLA проявляет себя как специфический В-лимфоцитарный шаперон/транспортер.

Обнаружено взаимодействие сигнальных белков SHP-1, SHP-2, SHIP-1, SHIP-2, Grb2 с ITIM мотивами в цитоплазматической области FCRL6 на модели in vitro. Показана роль отдельных аминокислотных остатков тирозина в этом взаимодействии. Выявлена отрицательная корреляция между уровнем экспрессии рецептора лимфоцитов человека FCRL6 и количеством CD4+ клеток у ВИЧ-инфицированных больных.

Научно-практическая ценность

Полученные в настоящей работе данные дополняют современные представления о рецепторах В- и Т-лимфоцитов. Впервые получены сведения о внутриклеточной локализации FCRLA, взаимодействующих с ним белках и влиянии сигнального пептида FCRLA на транспорт изоформ. Обнаруженная нами положительная корреляция между уровнем экспрессии FCRL6 и степенью прогрессии СПИДа, позволяет

рассматривать FCRL6 в качестве потенциального прогностического маркера тяжести ВИЧ-инфекции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Основная изоформа белка B-лимфоцитов человека FCRLA является резидентным фактором эндоплазматического ретикулума. FCRLA вместе с BiP и ß-цепью HLA-DR входит в состав высокомолекулярного комплекса. FCRLA взаимодествует с ц-цепыо IgM.

Белок Т-лимфоцитов человека FCRL6 взаимодействует с сигнальными белками SHP-1, SHP-2, SHIP-1 и SHIP-2. Экспрессия FCRL6 коррелирует со степенью прогрессии СПИДа у больных ВИЧ-инфекцией.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на:

13-м Международном иммунологическом конгрессе, Монреаль, Канада, 2006;

2-м Европейском конгрессе иммунологов, Берлин, Германия, 2009; Отчетных сессиях аспирантов Института цитологии и генетики СО РАН в 2008 и 2009 годах.

Конференции «Фундаментальные науки — медицине», Новосибирск, 2011.

Вклад автора

Автором выполнена практически вся экспериментальная работа, описанная в диссертации, за исключением отдельных случаев создания реагентов или проведения анализов, что отражено в тексте работы. Подготовка публикаций проводилась автором совместно с A.B. Тараниным, JI. В. Мечетиной и А. М. Наякшиным.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 169 ссылок, и приложения. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 28 рисунков.

Материалы и методы

Для выполнения представленной работы был применен широкий спектр методов работы с нуклеиновыми кислотами, белками и эукариотическими клетками: Клонирование ДНК; анализ экспрессии транскриптов методом ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени; наработка и очистка рекомбинантных белков в системе Е. coli; нативный синий электрофорез белковых комплексов; масс-спекгрометрический анализ белков; иммунопреципитация и иммуноблот; аффинная хроматография; трансфекция и трансдукция эукариотических клеток; иммунофлюоресцентное окрашивание клеток; проточная цитометрия.

Результаты и обсуждение

Изучение функциональной активности изоформ ИСК/,А Анализ экспрессии изоформ РТ'ЛЬА

Ранее было обнаружено, что РСЖРА имеет несколько изоформ, отличающихся доменным составом. Поскольку, экспрессия изоформ РСКЬА в различных клетках не была исследована, необходимо было выяснить, какие изоформы РСКРА являются доминирующими, а также провести поиск новых изоформ. Для решения этой задачи мы провели серию ОТ-ПЦР с различными, РСИТА-специфическими, праймерами, использовав как матрицу мРНК из миндалины и селезенки человека. Продукты ОТ-ПЦР были клонированы и секвенированы. Нами были обнаружены два фактора, обеспечивающие многообразие изоформ РСИТА: вариации доменного состава и два различных сигнальных пептида. Изоформы РСКРА образованы пятью комбинациями доменов. Кроме того, в различных изоформах РСЯЬА было идентифицировано два разных сигнальных пептида: длинный сигнальный пептид (далее ЬБР), кодированный двумя первыми экзонами РС11ЬА, и короткий сигнальный пептид (далее 88Р), кодированный только первым экзоном. Таким образом, генерируется семь изоформ, из которых только четырехдоменная и двухдоменная содержат оба типа сигнальных пептидов, как Ь8Р так и ЯЯР. Остальные найденные нами варианты изоформ РСИРА содержат только короткий сигнальный пептид 88Р (Рис. 1А). ОТ-ПЦР с праймерами-дискриминаторами на различные экзоны РСИТА позволил определить, что в миндалине и селезенке человека

А

1 о

Ми С

ЬЭР ЭЭР ЭЭР ЬЭР ЭЭР ЭвР ЭЭР

4ё 3с1 26 2сГ 1с)

1.1 12 02 РЗ 04

ас^п

Рис. 1. Многообразие изоформ РСИ-ЬА, исследованное в настоящей работе.

(А) Схематически изображены обнаруженные изоформы и их соответствие экзон-интронной структуре РСЯЬА. (Б) Экспрессия изоформ РСЮ^А в органах человека. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в 1% агарозном геле. Ми - миндалина, С - селезенка.

доминирует четырехдоменная изоформа с коротким сигнальным пептидом (Рис. 1Б). Возможно, профиль экспрессии изоформ FCRLA меняется в зависимости от стадии B-клеточной активации/дифференцировки, поэтому целесообразным является изучение функций не только доминирующей, но и менее представленных изоформ FCRLA.

Исследование внутриклеточной локализации изоформ FCRLA. Чтобы проверить, все ли изоформы FCRLA имеют внутриклеточную локализацию, мы провели трансфекцию кДНК двухдоменных изоформ с коротким и длинным сигнальным пептидом в 293 Т клетки. Супернатанты кондиционированных сред трансфицированных клеток и их лизаты были проанализированы при помощи Вестерн-блота и ELISA. Полученные результаты показали эффективную секрецию двухдоменной изоформы с длинным сигнальным пептидом (LSP-FCRLA2d), и полное отсутствие секреции в случае других изоформ. Примечательно, что двухдоменная изоформа с коротким сигнальным пептидом не секретировалась. При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания и конфокальной микроскопии был проведен анализ внутриклеточной локализации двух- и четырехдоменных изоформ FCRLA с коротким и длинным сигнальными пептидами. В качестве маркеров клеточных компартментов использовались белки кальнексин (маркирует ЭР) и р58К (маркер аппарата Гольджи). Все проанализированные изоформы колокализуются с кальнексином, следовательно присутствуют в ЭР, и только одна изоформа LSP-FCRLA2d колокализуется также с р58К, что свидетельствует об её экспорте из ЭР в Гольджи (Рис. 2). Этот результат согласуется с данными по секреции, так как секретируемые белки в ходе своего транспорта из клетки должны миновать аппарат Гольджи. Таким образом, основная — четырехдоменная изоформа FCRLA является резидентным белком ЭР, и не транспортируется в аппарат Гольджи. Двухдоменные изоформы отличаются по локализации в зависимости от длины их сигнального пептида: изоформа с коротким сигнальным пептидом задерживается в ЭР, а изоформа с длинным сигнальным пептидом транспортируется дальше в аппарат Гольджи, после чего секретируется из клетки.

Исследование статуса гликозилирования различных изоформ FCRLA. Анализ первичной структуры FCRLA показал отсутствие сайтов N-гликозилирования и наличие потенциальных сайтов О-гликозилирования, особенно богат которыми оказался С-концевой муцин-подобный домен. Так как О-гликозилирование происходит в аппарате Гольджи, но не в ЭР, изоформы FCRLA, не транспортируемые за пределы ЭР, должны быть негликозилированными белками. Анализ профиля гликозилирования LSP-FCRLA2d и FCRLA4d при помощи дегликозилаз (N- и О- гликаназы, сиалидаза А) показал отсутствие присоединенных к FCRLA4d остатков Сахаров и наличие О-гликозилирования у секретируемой LSP-FCRLA2d изоформы.

Са1пехт РСКЬА •Совмещение

#

4. < А

./ Ч

р58к РСК1_А Совмещение

• . • * . • . . ' «

« 1 т.;.'*" * . . КьыЗ

Са1пехт Совмещение

9 _ А "'А

Л Л Л-.; У1 Л - ? '-у

р58к РСК1_А -щ' Совмещение 'Щ

• . #

■ ■ X

# ш

Рис. 2. Внутриклеточная локализация двухдоменных изоформ РСЛГА человека с различными сигнальными пептидами. Конфокальная микроскопия 293 Т клеток, трансфицированных кДНК РС11ЬА2с1 ЬвР и ввР (указано слева) иммунофлуоресцентно окрашенных на РСЯГА и маркеры ЭПР (Са1пехт) и Гольджи (р57к). РСЯГА2с) 88Р изоформа локализована в ЭПР и отсутствует в аппарате Гольджи, изоформа с длинным сигнальным пептидом успешно транспортируется в аппарат Гольджи. Белым указателем отмечена колоколизация РСКГА2с1 Ь8Р и р57к.

Сигнальный пептид отщепляется в процессе созревания большинства изоформ FCRLA.

Так как ранее мы показали, что изоформы FCRLA, задерживающиеся в ЭР, не гликозилированы in vivo, мы смогли использовать синтезированный в Е. coli рекомбинантный FCRLA4d с коротким сигнальным пептидом, как контроль молекулярной массы. Плазмиды, кодирующие FCRLA4d с коротким, либо с длинным сигнальным пептидом, трансфицировались в 293 Т клетки. Лизаты трансфицированных клеток вместе с рекомбинантным SSP-FCRLA4d анализировали вестерн-блот анализом в градиентных гелях (Рис. ЗА). Оказалось, что масса FCRLA4d из трансфицированных эукариотических клеток меньше массы рекомбинантного контроля на 2 кДа, что соответствует расчётной массе отщепляемого сигнального пептида.

На рисунке ЗБ можно видеть различную подвижность LSP и SSP изоформ FCRLA2d. Разница составляет около 2 кДа, что, как указанно выше, соответствует массе сигнального пептида. Таким образом, длинный сигнальный пептид отщепляется от двухдоменной изоформы FCRLA, тогда как короткий не отщепляется.

Рис. 3. Отщепление сигнального пептида от (А) FCRLA4d, (Б) FCRLA2d. Иммуноблот, окращенный антителами против FCRLA. 1 - FCRLA с длинным сигнальным пептидом из трансфицированных 293Т клеток; 2 - Рекомбинантный FCRLA из Е. coli (короткий неотщепленный сигнальный пептид) 3 - FCRLA с коротким сигнальным пептидом из трансфицированных 293Т клеток.

п с 0 0.1% 0.2% 1% 5 РВЯ дигиюнин диг'и'гоним ДОХ

О С О С О С О С

Рис. 4. Характер мембранной ассоциации РСЯЬА. Иммуноблот после ДСН ПААГ. Окраска антителами против РСЯЬА и калнексина.

А. Микросомы В]аЬ были обработаны карбонатным буфером рН 11,5, после этого подвергнуты ультрацентрифугированию. РСКЬА (Р), больше*! частью, остается в супернатанте (С), калнексин (К) переходит в осадок (О). (П) - микросомы без ультрацентрифугирования.

Б. Инкубация микросом В]аЬ с различными детергентами или без детергентов. После инкубации лизат центрифугировали и анализировали осадок (О) и супернатант (С). Видно, что РСЛЬА (Р) начинает переходить в растворимую фракцию уже при 0,1 % дигитонина.

Характер взаимодействия четырехдоменной изоформы РСКЬА с мембраной ЭР.

РСКЬА, согласно результатам щелочной экстракции, не является интегральным мемранным белком, а с другой стороны, при обработке микросом дигитонином, большей частью остается связанным с мембранной фракцией (Рис. 4). Из этого можно сделать вывод, что РСКЬА является мембранно-ассоциированным белком.

Анализ чувствительности РСКЬА к протеолизу в присутствии и отсутствии детергента демонстрирует что РСКЬА локализован внутри люмена ЭР.

Идентификация участка РСКЬА, определяющего его локализацию в ЭР. Приведенные выше данные позволяют утверждать, что локализация РСКЬА в ЭР обусловлена не сигнальным пептидом, который отсутствует у зрелого белка. Поскольку мы показали, что РСКЬА является резидентным мембранно-ассоциированным белком ЭР, локализованным целиком внутри люмена, его локализация внутри ЭР должна быть обусловлена контактами с другими белками. Исследование того, каким образом РСКЬА ассоциирует с интегральными белками ЭР принципиально как для функционального анализа изоформ РСКЬА. Для идентификации домена, ответственного за локализацию РСКЬА в ЭР, нами были сконструированы три плазмиды, кодирующие делеционные варианты РСКЬА с коротким сигнальным пептидом на М-конце. После трансфекции этих конструкций в 293 Т клетки проводили анализ супернатантов кондиционированных сред трансфектантов на наличие секретируемого РСКЬА (Рис. 5). Было показано, что мутантные формы, содержащие все домены кроме первого, секретировались. Таким образом, первый домен РСКЬА необходим для его локализации в ЭР.

Как упоминалось ранее, 1Ч-концевой домен РСКЬА содержит три

44

рсиидси 36 РСРИАДсЛг 27

рс1*1Ад<тз 19

Лиз М Суп Лиз Суп

РСШ-АмуЛ

Рис. 5. Секреция изформ РСЯЬА без первого домена. Иммуноблот после ДСН ПААГ. Окраска поликлональными кроличьими антителами против РСЯЬА. РСЯЬАДсП - изоформа РСЯЬА без первого 14-концевого домена, РСКЬАДс112 - без двух концевых доменов, РСЯЬАДс1123 - изоформа, представленная одним последним С-концевым доменом.

цистеиновых остатка, которые расположены в мотиве с^рус^ееззс. Второй и третий домены ТСЛЬА принадлежащие к ^-подобным доменам, содержат по два остатка цистеина, формирующих внутридоменную дисульфидную связь. С-концевой муцин-подобный домен не содержит цистеиновых остатков. Следовательно, один из трех цистеинов первого домена не формирует внутримолекулярных дисульфидных связей. Мы предположили, что цистеиновые остатки в И-концевом домене могут определять локализацию РСША в ЭР, посредством образования дисульфидных связей с заякоренными белками. Для проверки этого предположения была создана конструкция, кодирующая мутантную форму РСЯЬА с тремя аминокислотными заменами С520, С57С, С63(л, то есть, без вышеупомянутых цистеиновых остатков. При трансфекции в 293 Т клетки мутантная форма РСКЬА без трех цистеинов в первом домене не секретировалась, на основании чего можно утверждать, что мутантный РСКЬА также задерживается в ЭР. Таким образом, ни один из цистеиновых остатков ТЧ-концевого домена не участвует в задержке РСЯЬА. Следовательно, «свободный» цистеиновый остаток может играть важную роль в функционировании РСЯЬА, так как подобные группы часто вовлечены в процессы димеризации белков, участвуют в окислительно-восстановительных и иных реакциях.

Таким образом, причины задержки разных изоформ РСЯЬА в ЭР различны: четырехдоменные изоформы, которые в зрелом состоянии не содержат сигнального пептида, задерживаются в ЭР посредством 14-концевого домена, причем без участия остатков цистеинов в этом процессе. Двухдоменная изоформа с коротким сигнальным пептидом

9

задерживается в ЭР из-за невозможности отщепить сигнальный пептид -возможно, она расценивается клеточным аппаратом как дефектная и подлежит деградации. В случае двухдоменной изоформы с длинным сигнальным пептидом, его отщепление успешно происходит, и, не имея первого «заякоревающего» домена, двухдоменный FCRLA секретируется из клетки.

Определение молекулярной массы FCRLA-содержащего комплекса. Так как FCRLA является мембранно-ассоциированным белком, предполагается, что большая часть молекул FCRLA должна взаимодействовать с трансмембранными белками ЭР или заякоренными в мембране белковыми комплексами. Определение молекулярной массы и состава этого комплекса могло бы иметь значение для дальнейшей функциональной характеризации FCRLA.

Для определения молекулярной массы комплекса с участием FCRLA нами был выбран метод нативного синего электрофореза (НС ПААГ - Blue Native PAGE) с последующей концентрацией материала ДСН ПААГ во втором направлении. Характер расположения сигнала на электрофореграмме непрерывен в области от нескольких МДа до 140 кДа, с максимумом в области 170 кДа (Рис. 6). Аналогичная картина непрерывного распределения сигнала после двумерного (НС/ДСН ПААГ) электрофореза наблюдается для шаперонов типа BiP, а также транспортных адаптерных молекул, входящих в состав гетерогенных комплексов, таких как импортин-а или ВАР29/31. Подобные непрерывные полосы свидетельствуют о взаимодействии FCRLA с различными белками.

Рис. 6. Иммуноблот двумерного электрофореза, окрашеный антителами против РСИЬА. Первое измерение - ВЫ-РАОЕ в градиентном геле 3-12%, второе измерение - БОв-РАОЕ в 10% акриламидном геле. Вертикальными линиями отмечены маркеры молекулярного веса, использованные в ВМ-РАОЕ. Видно непрерывное распределение РСИЬА-содержащих комплексов.

Взаимодействие ЕСКЬЛ с иммуноглобулинами.

Поскольку, среди всего РСИЬ семейства, второй и третий домены РСЯЬА имеют наиболее высокий уровень гомологии с доменами классических Рс-рецепторов, можно было предположить, что РСКРА имеет способность к взаимодействию с иммуноглобулинами, которые продуцируются РСЯЬА+ клетками.Чтобы проверить это предположение нами была проведена реципрокная аффинная хроматография лизата микросом из клеток миндалины человека сорбентами с антителами к 1«М и РСИЬА. Было обнаружено, что РСЯТА извлекается антителами против ^М (Рис. 7), а ц-цепь 1цМ, в свою очередь, обнаруживается в элюатах с сорбента с анти-РСРЬА антителами (Рис. 7). Таким образом, некоторая часть молекул РСЯЬА взаимодейтсвует с ц-цепью ^М в эндоплазматическом ретикулуме. То, что сорбентом против 1§М извлекается небольшое количество РСГ^ЬА, можно объяснить значительным избытком ^М в ЭР, по сравнению с РСШ^А. Вследствие избытка, даже при взаимодействии всех молекул РСЯЬА с ^М, большая часть молекул ^М остается свободной, и, при аффинном извлечении из лизата, не несет РСЖЬА.

] Нам не удалось зафиксировать никакого взаимодействия между РС11ЬА и равно как и в случае если иммуноглобулины были

иммобилизованы на сорбенте, а лизат клеток с РСЯЬА инкубировался с сорбентом в различных условиях. Кроме того, мы не обнаружили взаимодействия и секретируемой двухдоменной изоформы РСЯТА с иммуноглобулинами. Таким образом, выявленное нами взаимодействие РСЯЬА с ц-цепью, вероятно, носит характер транзитного и является весьма требовательным к биохимическому окружению. Известны случаи, когда взаимодействие белков происходит в узком диапазоне рН, окислительно-восстановительном окружении, или при участии вспомогательных низкомолекулярных лигандов.

Рис. 7. Взаимодействие РСЯЬА с иммуноглобулинами. Иммунопреципитация лизатов клеток миндалины: антителами против ^М человека (1), антителами против РСКЬА (3) или с-шус (1, 4 выступал как отрицательный контроль). Видна реципрокная копреципитация РСЯЬА и ц-цепи ^М.

Поиск белков, взаимодействующих с FCRLA.

Для поиска белков, взаимодействующих с FCRLA в ЭР, нами был сконструирован химерный белок FCRLA-2xStreptag-FLAG, содержащий гибкий глицин-сериновый линкер между последовательностью FCRLA и эпитопами flag и 2xStreptag. ДНК, кодирующая такой химерный белок в составе лентивирусной кассеты, была доставлена в клетки линии BJAB, и трансгенные клетки были отобраны при помощи FACS. Из лизатов трансгенных клеток FCRLA успешно извлекали при помощи анти-flag или стрептактин-сорбента. Для очистки FCRLA-содержащих комплексов мы проводили последовательно две аффинных хроматографии на анти-flag, а затем на стрептактин-сорбенте в нативных условиях. Размер комплекса после двух хроматографий оставался таким же как в лизатах клеток, что контролировалось гель-фильтрацией с последующим Вестерн-блотом. Очищенный FCRLA-содержащий комплекс разделяли денатурирующим электрофорезом в ПААГ (Рис. 8). Затем отдельные полосы вырезали из геля и подвергали трипсинолизу. Пептиды после трипсинолиза анализировали MALDI-масспектрометрией. Основными компонентами комплекса, которые удалось идентифицировать, оказались BiP, р-цепь HLA-DR и FCRLA. Остаётся неясным, является ли присутствие BiP в комплексе с FCRLA следствием их естественного функционального взаимодействия, или мы детектируем связь BiP как шаперона с незрелым FCRLA, так как огромное количество белков проходит стадию взаимодействия с BiP в ходе их созревания.

Комплекс М

Рис. 8. Очищенный РСЯЬА-содержащий комплекс. Слева указаны компоненты комплекса, идентифицированные масс-спектрометрией. Происхождение высокомолекулярных полос (>200 кДа) установить не удалось. НС - неспецифически связавшиеся при хроматографиях белки: прохибитин и РКОМ5.

В результате проделанной нами работы было показано, что основная изоформа FCRLA представляет собой резидентный белок ЭР. Ориентирован FCRLA внутрилюменально и является мембранно-ассоциированным белком. Эти данные важны для функциональной характеристики FCRLA, так как они естественным образом ограничивают эндоплазматическим ретикулумом круг процессов с его участием. Отличительными особенностями эндоплазматического ретикулума В-клеток является, во-первых, его способность к быстрой экспансии при дифференцировке B-лимфоцитов в плазматические клетки, во-вторых, сложная система регуляции секреции и деградации иммуноглобулинов. Нами было показано, что FCRLA существует в клетке в составе высокомолекулярного комплекса. Мы обнаружили взаимодействие некоторой доли FCRLA с ц-цепью IgM. В ходе поиска белков, ассоциированных с FCRLA, мы обнаружили, что он взаимодействует с BiP и HLA-DR, однако функциональное значение подобной связи требует дополнительного анализа.

Дифференцировка B-клетки в плазматическую по времени занимает всего лишь несколько дней, однако за это время клетка успевает значительно изменить машину белкового синтеза/секреции. Для того чтобы такая перестройка не привела к гибели клетки требуется хорошо скоординированная работа многих систем, в том числе, таких как UPR и ERAD. По мере изучения этих систем описываются все новые и новые белки, осуществляющие контроль и регуляцию процессов экспансии ЭР и усиления синтеза/секреции иммуноглобулинов. Исходя из полученных нами данных, можно выдвинуть предположение, что FCRLA участвует в процессах регуляции синтеза/секреции иммуноглобулинов и контроля UPR в B-клетках и на ранних стадиях их дифференцировки в плазматические клетки. Вероятно, FCRLA не взаимодействует с IgM напрямую, так как их количество в клетке слишком отличается, однако FCRLA может выступать в роли сигнальной молекулы, опосредованно координирующей синтез/секрецию и развитие UPR.

Это предположение подкрепляется профилем экспрессии FCRLA человека, который продуцируется зрелыми B-лимфоцитами, но не плазматическими и наивными клетками. В плазматических клетках IgM интенсивно секретируется, поэтому нет необходимости в системе его активной задержки. В наивных B-лимфоцитах синтез IgM находится на очень низком уровне, что также не требует его задержки. В зрелых активированных B-лимфоцитах IgM синтезируется на значительном уровне, чтобы обеспечить возможность быстрой дифференцировки в плазматическую клетку, при этом секреция IgM за пределы лимфоцита крайне нежелательна, так как возле клеточной поверхности свободный IgM будет вступать в конкуренцию за антиген с трансмембранными рецепторами, снижая активационный сигнал. Именно в эту систему задержки и деградации секреторного IgM и может быть вовлечён FCRLA. Дополнительным фактом, свидетельствующим в пользу предположения о роли FCRLA в процессах задержки транзитных молекул ЭР, является его локализация на экстраплазматической стороне мембраны ЭР, что характерно для многих транспортёров и молекул систем задержки (ТАР, калнексин, KDEL-рецептор и проч.)

Изучение сигнальных свойств FCRL6 на модели in vitro. Изучение сигнальных свойств рецептора является необходимым и наиболее очевидным этапом его исследования. На момент начала работ по изучению функциональных свойств FCRL6 сведений об этом рецепторе практически не имелось. В цитоплазматической части FCRL6 расположены два ITIM-подобных мотива, однако связывают ли они сигнальные белки было неизвестно.

Воспользовавшись подходом "GST-PullDown", мы провели анализ связывания сигнальных молекул с цитоплазматической областью FCRL6. Для анализа влияния индивидуальных остатков тирозинов в ITIM-мотивах FCRL6 М. В. Мамонкиным и А. М. Наякшиным были сделаны конструкции, кодирующие химерные белки GST-цитоплазматическая область FCRL6, как дикого типа, так и с точечными заменами Y356F и Y371F. Рекомбинантные белки, были выделены и проинкубированы с лизатами клеток Jurkat в присутствии ингибиторов фосфатаз и протеаз. Полученные результаты позволяют судить о связывании сигнальных белков с каждым из ITIM-мотивов в отдельности, равно как и с цитоплазматической областью в целом (Рис. 9). Можно видеть, что с цитоплазматической областью FCRL6 связываются сигнальные фосфатазы SHP-1, SHP-2, SHIP-1, SHIP-2 и адаптерный белок Grb2. Белки Syk, Zap-70 и PKD2 не связываются. При этом, остаток тирозина в положении 371 является необходимым для связывания SHP-1 и SHP-2, тогда как остаток тирозина в положении 356 необходим для связывания SHIP-1. SHIP-2 связывается с цитоплазматической областью FCRL6 только в присутствии обоих остатков тирозина. Таким образом, оба ITIM-мотива в цитоплазматической части FCRL6 являются значимыми для взаимодействия с сигнальными белками.

£

+ I- _ со сэ сс о LL Y356F Y371I со LO со >

SHP-1 — -68 -48

SHP-2 . «ИМ 1 -84 -58

: : :: :

SHIP-1 — - 180

- 116

SHIP-2 i - 180

■шит -116

Grb2 — |. 36 w - 26

Syk , у, - 84

чиш -58

Zap-70 —— - 84 -58

PKD2 — - 116 -84

Рис. 9. Взаимодействие рекомбинантной цитоплазматической области FCRL6 с различными сигнальными белками. К+ положительный контроль, которым выступал лизат клеток Jurkat, GST - отрицательный контроль, FCRL6ct - FCRL6 дикого типа. Три правых полосы соответствуют белкам FCRL6 с точечными заменами, указанными сверху.

о

о

р<0.05

о

• • 0

▼ 4- ▼ • • 1 о со о

Здоровые доноры Пациенты со СПИД III IV

стадия стадия

Рис. 10. Экспрессия FCRL6 достоверно увеличивается у больных с IV стадией СПИД. Каждая точка на графике отражает уровень экспрессии FCRL6 в ПМКК донора или пациента. За единицу принят средний уровень экспрессии FCRL6 у здоровых доноров.

Экспрессия FCRL6 при ВИЧ инфекции.

Полученные нами сведения о сигнальных свойствах FCRL6 указывают на ингибирующую природу его воздействия на клетку. Ранее в лаборатории были получены данные об отсутствии экспрессии FCRL6 в in vitro активированных мононуклеарных клетках крови, и сниженной экспрессии FCRL6 в CD8+ клетках больных некоторыми аутоиммунными заболеваниями. Таким образом, экспрессия FCRL6 нехарактерна для активированных клеток. Мы предположили, что уровень экспрессии FCRL6 может быть связан с уровнем функциональной активности ЦТЛ. Чтобы проверить это предположение мы изучили экспрессию FCRL6 в лимфоцитах ВИЧ-инфицированных больных. Хроническая ВИЧ-инфекция представляет собой классический пример дисфункции иммунной системы, которая вызвана истощением вирус-специфических ЦТЛ. В настоящее время известно несколько ингибирующих рецепторов, экспрессия которых коррелирует со степенью истощенности цитотоксических клеток.

Мы провели количественный ПЦР с кДНК образцов периферических мононуклеарных клеток крови здоровых доноров и больных СПИДом (отбор крови у ВИЧ-инфицированных доноров и выделение лейкоцитов было произведено специалистами ГУ Новосибирский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями). Как видно из рисунка 10 экспрессия FCRL6 возрастает у больных СПИДом на III и, в особенности, на IV стадии развития заболевания. Более того, средняя экспрессия FCRL6 в ПМКК больных СПИДом на IV стадии достоверно (р<0.05) выше таковой у здоровых доноров и больных на III стадии развития заболевания.

В дальнейшем мы исследовали экспрессию FCRL6 на отдельных субпопуляциях лимфоцитов ВИЧ-инфицированных больных. Как следует из рисунка (Рис. 11, левая часть) в норме FCRL6 экспрессируется на 2-5% мононуклеарных клеток периферической крови. Эти клетки представлены цитотоксическими Т лимфоцитами (ЦТЛ, CD8+) и натуральными

15

Здоровый донор

00 а о

со ю

о

о

ВИЧ-инфицированный

I \ / «е_ У

32 0.5 52 1 93

■г

1 ф I Г

лк 1.5 о-, т ош 23:7 : 1 Ш**^- 15

1-1-" ги ' ......' 10 м""1 1 ......... ' 10 10 ■2 ^ Ю2 0 юг 10 Ю 10

21.5

51.3

Р"1»"Т

0 10'

■МЯР

7.8

19.4

10 Ю

О о.

• 25 0

|Ч96 1.5 11 ""1. 1 '""Ч ' '.....<. 1

О И) 10 10 10

"э-1 19.3 7.7

м

з : 'ЯР**" 19.3 11-11----Г—--—--~-

0 10 10'

РСЯ!!_6

Рис. 11. Анализ поверхностной экспрессии РСК_Ь6 на лимфоцитах человека в норме и при патологии. Доля РСЯЬ6+ клеток значительно возрастает при ВИЧ-инфекции. Заметно повышение доли РСЯЬ6+ клеток более чем на порядок среди лимфоцитов с фенотипами СЭ8+ (Т-киллеры) и СБ56+ (1ЧК-клетки). Кроме того, РСЯЬ6+ начинает коэкспрессироваться с РР-1, чего в норме не происходит.

киллерами (1ЧК-клетки, С056+). У здоровых доноров практически не обнаруживается экспрессия РСЙТб на других типах клеток, кроме того, РСЯЬ6+ клетки не коэкспрессируют РО-1. Для анализа экспрессии РСИТб у ВИЧ-инфицированных больных мы воспользовались сформированной ранее в лаборатории коллекцией образцов лимфоцитов периферической крови от пациентов с диагнозом СПИД различных стадий. Мы исследовали экспрессию ГСКЬб и фенотип РС11Ь6+ клеток у 13 первичных пациентов с вирусной нагрузкой от 50 ООО копий мРНК/мл до 9 ООО ООО копий мРНК ВИЧ на мл плазмы (на момент взятия материала). Из Рис. 11 можно видеть, что у ВИЧ-инфицированных пациентов значительно возрастает доля РСЯЬ6+ ЦТЛ клеток, достигая 10% от общего числа лимфоцитов. Количество ЫК-клеток экспрессирующих РСЯЬб также на порядок повышается достигая 5-8% от общего числа лимфоцитов и трети от всех С056+ клеток. При этом, среди субпопуяций СБ56+ клеток коэкспрессия РСЯЬб распределена неравномерно: С0561п клетки значительно чаще являются Р С Я Ь 6 - п о л ож ител ь н ы м и чем С0561о\у. Как известно, С0561п ТЧК-клетки проявляют меньшую цитотоксичность чем СЭ561о\у лимфоциты, при этом первые характеризуются более активной секрецией активирующих цитокинов. Чем обусловлен такой паттерн экспрессии РСЯЬб у МК-клеток неясно, однако известно о возниконовении дисбаланса между долей С0561и/С0561о\¥ клеток при развитии СПИДа.

Наряду с повышенной экспрессией РО-1 у ВИЧ-инфицированных больных, можно отметить коэкспрессию РЭ-1 и РСЯЬб. Р01+РС11Ь6+ клетки могут нести фенотип как С08+, так и СБ56+. При этом большая часть РСИЬ6+ клеток не экспрессирует РП> I. Интересным является тот факт, что уровни экспансии РСИТб и ГО-1 на цитотоксических клетках не имеет достоверно значимой корреляции. Таким образом, РО-1 и РСИЬб, с большой вероятностью, маркируют разные типы клеточного истощения. Известно, что одним из наиболее достоверных маркеров степени тяжести ВИЧ-инфекции является количество СЕ)4+ клеток в крови больных.

30.0

25.0

+

СО _]

ОС О

20.0

15.0

10.0

5.0

5-25%СЭ4+ 1-4%СР4 +

Здоровые

доноры ВИЧ-инфицированные

Рис. 12. Количество РСК.Ь6+ клеток связано с долей СЭ4+ лимфоцитов в крови донора. По мере развития ВИЧ-инфекции, доля СЭ4+ лимфоцитов снижается, а процент РСЯЬ6+ клеток пропорционально возрастает.

Основываясь именно на этом показателе ВОЗ рекомендует оценивать стадию СПИДа и эффективность проводимой антиретровирусной терапии (рекомендации ВОЗ по терапии СПИД, 2013). Исходя из предположения, что FCRL6 может быть маркером истощения цитотоксических клеток, мы проверили связь количества FCRL6+ клеток и доли CD4+ клеток. Корреляционный анализ методом Спирмена выявил отрицательную корреляцию между количеством CD4+ клеток и долей FCRL6+ клеток с коэффициентом -0.61 (р<0.001). Как видно из рисунка 12, прослеживается обратная зависимость между процентом CD4+ клеток в крови и экспрессией FCRL6.

Таким образом, по мере прогрессирования ВИЧ-инфекции, и, соответственно, увеличения числа истощенных цитотоксических клеток, пропорционально увеличивается и число FCRL6+ клеток. Это позволяет предпологать, что FCRL6 может являться новым маркером клеточного истощения. Особенный интерес представляет тот факт, что паттерн экспрессии FCRL6 на цитотоксических клетках в значительной степени не совпадает с таковым у PD-1. Возможно, это означает, что экспрессия FCRL6 свойственна особой субпопуляции истощенных клеток. Остается неясным, является ли повышение экспрессии FCRL6 одной из причин развития истощения ЦТЛ (как в случае с PD-1) или это только следствие функциональных изменений в клетке, вызванных сигналами от других рецепторов.

Недавно группой R. Davis было установлено, что лигандом FCRL6 является HLA-DR, молекула класса МНС II. Учитывая эти данные, можно предположить, что биологический смысл FCRL6 заключается в отрицательной регуляции активности ЦТЛ при их контакте с HLA-DR несущими клетками, такими как B-клетки и дендритные клетки. Возможно, это необходимо для того, чтобы предотвращать гиперактивацию Т-клеток при их множественных контактах с антиген-презентирующими клеткми во время хронических инфекций. Обнаруженная нами отрицательная корреляция между уровнем экспрессии FCRL6 и количеством CD4+ клеток у больных ВИЧ-инфекцией требует дополнительного изучения, и, в перспективе, может сделать FCRL6 новым прогностическим маркером тяжести СПИДа.

Выводы

1. РСЯЬА человека продуцируется в виде семи изоформ, отличающихся длиной сигнального пептида (короткий или длинный), доменным составом (от одного до четырех доменов) и локализацией (внутриклеточный или секретируемый белок).

2. Основная изоформа РСЯЬА в тканях человека состоит из 4-х доменов и имеет короткий сигнальный пептид, кодируемый одним экзоном. Эта изоформа является резидентным фактором эндоплазматического ретикулума В-лимфоцитов. Она ориентирована внутрилюменально и принадлежит к типу мембранно-ассоциированных белков ЭР.

3. Задержка 4-х доменной изоформы РСЯЬА в эндоплазматическом ретикулуме обусловлена наличием Ы-концевого домена. Изменение длины сигнального пептида не влияет на локализацию 4-х доменной изоформы. Изоформы РСЯЬА, лишенные Ы-концевого домена, секретируются при условии отщепления сигнального пептида.

4. Молекулы РСКЬА включены в состав высокомолекулярных комплексов в клетках В-лимфоцитарных линий. При помощи иммунопреципитации показано, что нативный или таг-модифицированный РСЯЬА находится в составе комплексов с тяжелой ц-цепыо 1§М, шапероном В1Р и (3-цепью молекулы МНС II класса НЬА-1Ж.

5. РСЯЬб является ингибирующим рецептором. Фосфорилированные остатки тирозина в цитоплазматическом участке РСЯЬб способны связывать внутриклеточные тирозинфосфатазы. Фосфорилированный Туг356 необходим для связывания БНИМ и 8Н1Р-2, а Туг371 - для связывания 8НР-1, 8НР-2 и 8Н1Р-2.

6. Показана отрицательная корреляция между количеством СБ4+ Т-лимфоцитов и уровнем экспрессии РСКЬб у ВИЧ-инфицированных больных.

Список публикаций по теме диссертационной работы

1. Kulemzin S.V., Zamoshnikova A.Y., Yurchenko M.Y., VitakN.Y., Najakshin A.M., Fayngerts S.A., Chikaev N.A., Reshetnikova E.S., Kashirina N.M., Peclo M.M., Rutkevich P.N., Shevelev A.Y., Yanushevskaya E.V., Baranov K.O., Mamonkin M., Vlasik T.N., Sidorenko S.P., Taranin A.V., Mechetina L.V. FCRL6 receptor: expression and associated proteins // Immunol Lett. 2011. V.134. P.174-182.

2. Santiago Т., Kulemzin S.V., Reshetnikova E.S., Chikaev N.A., Volkova O.Y., Mechetina L.V., Zhao M., Davis R.S., Taranin A.V., Najakshin A.M., Hendershot L.M., Burrows P.D. FCRLA is a resident endoplasmic reticulum protein that associates with intracellular Igs, IgM, IgG and IgA // Int Immunol. 2011. V.23. P.43-53.

3. Kulemzin S., Chikaev N., Volkova O., Reshetnikova E., Taranin A., Najakshin A., Mechetina L. Characterization of human FCRLA isoforms // Immunol Lett. 2013. V.152. P.153-158.

Тезисы:

4. Reshetnikiova E., Kulemzin S., Mechetina L., Volkova O., Chikaev N., Taranin A., Najakshin A. FCRLA is an ER-resident protein differentially expressed in T cell-dependent and T-cell independent immune responses // Eur. J. Immunol. - Proceedings of 2nd European Congress of Immunology. Berlin, Germany, September 2009.

5. Mechetina L.V., Najakshin A.M., Chikaev N.A., Volkova O.Y., Reshetnikova E.S., Kulemzin S.V., Kleijmeer M., Hendershot L.M., Burrows P.D., and Taranin A.V. FCRLA is an ER-resident protein interacting with the secreted form of IgM. // Keystone Symposia "Biology of В cells in health and disease", 2007, Abstract book, p.96.

6. Таранин A.B., Наякшин A.M., Мечетина JI.B., Волкова О.Ю., Чикаев H.A., Гусельников C.B, Баранов К.О., Решетникова Е.С., Кулемзин С.В. FcR-подобные белки // Сборник тезисов конференции "Фундаментальные науки - медицине", 2-5 сентября 2008, Новосибирск

7. Кулемзин С.В., Файнгерц С.А., Мечетина Л.В., Чикаев Н.А, Шевелев А.Я., Пекло М.М., Власик Т.Н., Карпенко Л.И., Ильичев A.A., Наякшин A.M., Таранин A.B. Экспрессия рецептора лимфоцитов человека FCRL6 в норме и при иммунопатологиях // Матер. объединенного иммунологического форума 2008. Санкт-Петербург, 2008 г. Росс, иммунологический журнал. 2008. 2(11). С. 122.

Подписано в печать 15.04.2014 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 208

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулемзин, Сергей Викторович, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Кулемзин Сергей Викторович^

04201' 455406

«Функциональный анализ лимфоцитарных белков человека

РСБ1ЬА и РСКЬб»

03.01.07 - молекулярная генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель-д.б.н. Таранин А. В.

Новосибирск 2014

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность A.B. Таранину, A.M. Наякшину, Л.В.Мечетиной, H.A. Чикаеву и всем сотрудникам лаборатории иммуногенетики за неоценимую помощь в подготовке данной работы. Также автор благодарит Е.С. Решетникову за помощь в подготовке препаратов для конфокальной микроскопии, Т.Г. Дужак за проведение масс-спектрометрического анализа, С.П. Сидоренко и М.Ю. Юрченко за помощь в проведении GST-pull down анализа.

Оглавление

Список основных сокращений 5 Введение 6

Актуальность исследования 6 Цели и задачи исследования 7 Научная новизна 7 Научно-практическая ценность 8 Апробация работы 8 Публикации 9 Вклад автора 9

Структура и объем диссертации 9

1. Обзор литературы 10

1.1 Дифференцировка и созревание В-лимфоцитов 10

1.2 Плазматические клетки и UPR (Unfolded Protein Response) 14

1.3 Механизмы транспорта белков из ЭР в аппарат Гольджи. 15

1.4 Рецепторы лейкоцитов и сигнальная трансдукция. 18

1.5 Лейкоцитарные Fc-рецепторы человека 21

1.6 FcR-подобные рецепторы человека 22

1.7 Характеристика внутриклеточного члена семейства FCRL - FCRJLA 26

1.8 Связь FcR-подобных белков с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов 28

1.8.1 Общая характеристика патологий, связанных с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов 28

1.8.2 Ингибирующие рецепторы ЦТЛ, и их роль в патогенезе 29

1.8.3 FCRL6 - новый потенциально ингибирующий рецептор 33

2. Материалы и методы 35

2.1. Материалы и реактивы 35

2.2. Биологические материалы 36

2.3. Работа с эукариотическими клетками 36

2.3.1. Культивация эукариотических клеток 36

2.3.2. Выделение периферических мононуклеарных клеток крови 36

2.3.4 Химическая трансфекция эукариотических клеток. 37

2.4. Клонирование ДНК. 37

2.5 Выделение РНК и синтез кДНК 37

2.6 Электрофорез белков 39

2.6.1. Гель-электрофорез белков (ДСН-ПААГ) (Laemmli, 1970) 39

2.6.2. Синий нативный гель-электрофорез белковых комплексов (НС ПААГ). (по Shagger, 1991) 39

2.6.3. Гель-электрофорез белков (ДСН-ПААГ) во втором измерении, после СН-ПААГ 39

2.6.4. Окрашивание гелей при помощи нитрата серебра (по Shagger, 2006) 40

2.7. Иммуноферментный анализ (ИФА) (под ред. Фримеля, 1987) 40

2.8. Иммуноблоттинг 40

2.9. Иммунофлуоресцентной окрашивание и микроскопия 41

2.10 Дегликозилирование белков 42

2.11 Выделение микросом из клеток Bjab или лейкоцитов миндалины. 42

2.12 Мутагенез, с использованием мегапраймера по (Sarkar, 1990) 43

2.13 Аффинная очистка FCRLA-содержащих комплексов при помощи моноклональных антител. 43

2.14 Выделение FCRLA-содержащих комплексов при помощи тандемной аффинной очистки. 43

2.15 Масс-спектрометрический анализ белков FCRLA-содержащего комплекса. 44

2.16 Измерениие относительного уровня экспрессии РНК FCRL6 методом RealTime PCR. 44

2.17 Анализ белков взаимодействующих с цитоплазматической частью FCRL6. 45

2.18 Анализ коэкспрессии FCRL6 с другими поверхностными маркерами методом проточной цитометрии. 46

3. Результаты и обсуждение 48

3.1 Изучение функциональной активности изоформ FCRLA 48

3.1.1 Анализ экспрессии изоформ FCRLA 48

3.1.2 Исследование внутриклеточной локализации изоформ FCRLA 51

3.1.4 Исследование статуса гликозилирования изоформ FCRLA. 54

3.1.5 Сигнальный пептид отщепляется в процессе созревания большинства изоформ FCRLA. 55

3.1.6 Характер взаимодействия четырехдоменной изоформы FCRLA с мембраной ЭР. 59

3.1.7 Идентификация участка FCRLA, определяющего его локализацию в ЭР. 60

3.1.8 Определение молекулярной массы FCRLA-содержащего комплекса. 64

3.1.9 Взаимодействие FCRLA с иммуноглобулинами. 65

3.1.10 Поиск белков, взаимодействующих с FCRLA. 67

3.1.11 Обсуждение роли FCRLA в клетке. 69

3.2 Изучение функциональных свойств рецептора лимфоцитов человека FCRL6 71

3.2.1 Сигнальные свойства FCRL6 на модели in vitro. 71

3.2.2 Экспрессия FCRL6 при ВИЧ инфекции 73 Выводы 79

Список литературы 80 Приложение 94

Список основных сокращений

ДСН....................................................................додецилсульфат натрия

ПМКК.................................................................периферические мононуклеарные

клетки крови

СП (SP)...............................................................сигнальный пептид (signal peptide)

ФСБ....................................................................фосфатный солевой буфер

ЦТЛ....................................................................цитотоксические Т-лимфоциты

ЭР.....................................................................эндоплазматический ретикулум

Bcl-6 (B-cell lymphoma 6 protein)...................белок В-клеточной лимфомы 6

BCR (B-cell receptor).........................................В-клеточный антиген-связывающий

рецептор

BiP (Binding immunoglobulin protein)...............белок, связывающий

иммуноглобулины

Blimpl (B-lymphocyte maturation promoting)....фактор ускоряющий созревание В-лимфоцитов

CD (Cluster differentiation)................................кластер дифференциации

CHOP (С/ЕВР homologous protein).................С/ЕВР гомологичный белок

FcRJFcR (Fc-receptor)........................................(лейкоцитарные) Fc-рецептор/ген

FCRL/FCRL (FcR-like).......................................FCRL рецептор/ген

HLA (Human Leukocyte Antigen).......................человеческий лейкоцитарный антиген

Ig (Immunoglobulin)............................................иммуноглобулин

IgSF (Immunoglobulin superfamily)....................надсемейство иммуноглобулинов

IL (Interleukin)......................................................интерлейкин

1TAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)......................................

тирозиновый активирующий мотив

ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)....................................................

тирозиновый ингибирующий мотив

LSP (Long Signal Peptide)...................................сигнальный пептид FCRLA,

кодированный двумя экзонами

MHC(Major histocompatibility complex)I..........главный комплекс

гистосовместимости класса I

MHC(Major histocompatibility complex)II........главный комплекс

гистосовместимости класса II

NK-клетки (Natural killer cells).....................клетки естественные киллеры

Рах5 (Paired box protein 5)...................................белок парных сайтов связывания 5

Perk (protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase).......................................

..............................................РНК-подобная киназа эндоплазматическго ретикулума

TCR (T-cell receptor)............................................Т-клеточный антиген-связывающий

рецептор

SSP (Short Signal Peptide)....................................сигнальный пептид FCRLA,

кодированный одним экзонами

ХВР1 (X-box binding protein 1)

X-box связывающий белок 1

Введение

Актуальность исследования

В геноме человека имеются сотни генов, экспрессия которых ограничена клетками иммунной системы. Большая часть этих генов кодирует поверхностные рецепторы. Некоторые из них непосредственно вовлечены в распознавание чужеродных патогенов, другие участвуют в межклеточных взаимодействиях при развитии иммунного ответа и в транспорте клеток. Часть специфичных для иммунной системы генов кодирует внутриклеточные белки, ответственные за трансдукцию сигналов от поверхностных рецепторов и утилизацию антигена. Несмотря на впечатляющий прогресс иммунологии и иммуногенетики в течение последних пятидесяти лет, функция многих генов, специфично экспрессирующихся в клетках иммунной системы, остается неизвестной. В практическом плане, имеющиеся пробелы в знаниях ограничивают возможности эффективно управлять иммунным ответом и лечить многие социально значимые заболевания.

Относительно недавно несколькими группами исследователей и, в том числе,

\

лабораторией иммуногенетики, было описано семейство генов, кодирующих FcR-подобные белки лимфоцитов человека - FCRL (Fc Receptor-Like). Шесть членов этого семейства (FCRL1-FCRL6) являются трансмембранными рецепторами и экспрессируются на поверхности лимфоцитов. Еще два, FCRLA и FCRLB, являются внутриклеточными белками (Guselnikov, 2002; Mechetina, 2002; Ershova, 2005; Davis, 2007).

FCRLA на высоком уровне экспрессируется в В-клетках зародышевых центров вторичных лимфоидных органов, где, как известно, происходит активация и дифференцировка В-лимфоцитов в плазматические клетки и В-клетки памяти. Сведения о функции FCRLA отсутствуют, однако профиль экспрессии, внутриклеточная локализация и гомология с Fc-рецепторами, позволяют предположить, что FCRLA участвует в процессах регуляции синтеза и созревания иммуноглобулинов.

Уникальной в рамках FCRL-семейства особенностью FCRL6 является экспрессия на цитотоксических Т- и NK-лимфоцитов человека. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) являются основными эффекторами клеточного иммунного ответа, направленного на элиминацию вирус-инфицированных или злокачественно-трансформированных клеток. Для успешного функционирования клеточного звена

иммунного ответа необходима точная регуляция степени активации ЦТЛ, так как избыточная или недостаточная активность этих клеток в скором времени приводит к развитию иммунопатологий. Прецизионная регуляция активности ЦТЛ осуществляется множеством активирующих и ингибирующих рецепторов, приобретенных иммуной системой в процессе эволюции.

РСЯЬб является наименее изученным трансмембранным рецептором семейства РСКЬ, однако структура его цитоплазматической части и предварительные данные о характере его экспрессии, указывают на то что РСЯЬб является ингибирующим рецептором.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является изучение функций РСКЬА в В-лимфоцитах, а также исследование функциональной активности рецептора лимфоцитов человека РСЯЬб в норме и при патологии.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить клеточные компартменты, в которых локализованы наиболее распространенные изоформы РСКЬА, модификацию, локализацию и характер его мембранной ассоциации.

2. Установить участки РСШ^А, влияющие на его локализацию и ответственные за взаимодействие с лигандами.

3. Идентифицировать белки, с которыми РСКЬА взаимодействует внутри клетки.

4. Изучить фосфорилирование РСЯЬб и особенности связывания этого белка с сигнальными молекулами.

5. Проанализировать изменения экспрессии РСЯЬб при хронических вирусных инфекциях (на примере ВИЧ-инфекции).

Научная новизна

Обнаружено, что РСЯЬА экспрессируется в виде нескольких изоформ, отличающихся последовательностью сигнального пептида и количеством доменов. Установлено, что четырехдоменные изоформы РСЫЬА с коротким и длинным сигнальным пептидом, а также двухдоменная изоформа с коротким сигнальным пептидом локализованы исключительно в эндоплазматическом ретикулуме. Четырехдоменная изоформа РСИЬА ориентирована внутрилюменально и является

мембранно-ассоциированным белком. Идентифицирован домен FCRLA, определяющий его локализацию в ЭР и показано, что свободный цистеин FCRLA не участвует в локализации FCRLA в ЭР. Выяснен механизм, который определяет локализацию двухдоменной изоформы FCRLA с коротким сигнальным пептидом в ЭР. Показано, что в клеточной линии BJAB, являющейся моделью активированных В-лимфоцитов, FCRLA взаимодействует с ц-цепыо IgM, BiP и МНС II. На основании полученных нами данных, можно предположить, что FCRLA проявляет себя как специфический В-лимфоцитарный шаперон/транспортер. Обнаружено взаимодействие сигнальных белков SHP-1, SHP-2, SHIP-1, SHIP-2, Grb2 с ITIM мотивами в цитоплазматической области FCRL6 на модели in vitro. Показана роль отдельных аминокислотных остатков тирозина в этом взаимодействии. Выявлена отрицательная корреляция между уровнем экспрессии рецептора лимфоцитов человека FCRL6 и количеством CD4+ клеток у ВИЧ-инфицированных больных.

Научно-практическая ценность

Полученные в настоящей работе данные дополняют современные представления о рецепторах В- и Т-лимфоцитов. Впервые получены сведения о внутриклеточной локализации FCRLA, взаимодействующих с ним белках и влиянии сигнального пептида FCRLA на транспорт изоформ. Обнаруженная нами положительная корреляция между уровнем экспрессии FCRL6 и степенью прогрессии СПИДа, позволяет рассматривать FCRL6 в качестве потенциального прогностического маркера тяжести ВИЧ-инфекции.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на:

13-м Международном иммунологическом конгрессе, Монреаль, Канада, 2006; Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008; 2-м Европейском конгрессе иммунологов, Берлин, Германия, 2009; Конференции «Фундаментальные науки — медицине», Новосибирск, 2011.

Публикации

По результатам работы опубликованы в соавторстве три статьи в рецензируемых журналах.

Список публикаций по теме диссертационной работы:

Kulemzin S.V., Zamoshnikova A.Y., Yurchenko M.Y., Vitak N.Y., Najakshin A.M., Fayngerts S.A., Chikaev N.A., Reshetnikova E.S., Kashirina N.M., Peclo M.M., Rutkevich P.N., Shevelev A.Y., Yanushevskaya E.V., Baranov K.O., Mamonkin M., Vlasik T.N., Sidorenko S.P., Taranin A.V., Mechetina L.V. FCRL6 receptor: expression and associated proteins // Immunol Lett. 2011. V. 134. P. 174-182.

Santiago Т., Kulemzin S.V., Reshetnikova E.S., Chikaev N.A., Volkova O.Y., Mechetina L.V., Zhao M., Davis R.S., Taranin A.V., Najakshin A.M., Hendershot L.M., Burrows P.D. FCRLA is a resident endoplasmic reticulum protein that associates with intracellular Igs, IgM, IgG and IgA // Int Immunol. 2011. V.23. P.43-53.

Kulemzin S, Chikaev N, Volkova O, Reshetnikova E, Taranin A, Najakshin A, Mechetina L. Characterization of human FCRLA isoforms // Immunol Lett. 2013. V.152. P.153-158.

Вклад автора

Автором выполнена практически вся экспериментальная работа, описанная в диссертации, за исключением отдельных случаев создания реагентов или проведения анализов, что отражено в тексте работы.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 169 ссылок, и приложения. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 28 рисунков.

Обзор литературы

Иммунный ответ принято разделять на два звена - клеточное и гуморальное. Основными эффекторами клеточного звена иммунного ответа у млекопитающих являются NK- и Т-лимфоциты. Эти клетки отвечают за элиминацию вирус-инфицированных клеток, несущих на поверхности чужеродные пептиды в комплексе с молекулами МНС I класса (CD8+ Т-клетки) или обладающих неспецифическими паттернами инфицированных клеток (NK-клетки). Гуморальный иммунный ответ объединяет в себе процессы, приводящие к генерации белковых молекул, которые специфически связывают патоген и способствуют его элиминации. В случае челюстных позвоночных, такими молекулами являются иммуноглобулины.

1.1 Дифференцировиа и созревание В-лимфоцитов

Образование про-В лимфоцитов из гематопоэтических стволовых клеток крови происходит в костном мозге. Эта ткань включает в себя, помимо клеток гематопоэтического ряда, нелимфоидные стромальные клетки, без которых невозможно развитие B-лимфоцитов. Строма осуществляет костимуляцию созревающих B-лимфоцитов как контактными, так и секретируемыми факторами, главными из которых являются SCF, SDF-l и IL-7 (Kindt, 2006). По мере продвижения от краёв костного мозга к его центральной оси B-клетки переходят из одной стадии дифференцировки в другую, постепенно приобретая свойства зрелого B-лимфоцита. На первой стадии развития B-клеток, стадии про-В лимфоцита, происходит перестройка генов тяжелых цепей иммуноглобулинов. В раннем про-В лимфоците происходит присоединение DH к JH, а в позднем VH к DJH, после чего начинает экспрессироваться ц-цепь IgM, и лимфоцит переходит в стадию большой пре-В клетки. В большой пре-В клетке вместе с ц-цепью на поверхность выходит суррогатная легкая цепь, образуя npe-BCR (В cell receptor, B-клеточный рецептор). После начала его экспресии клетка приостанавливает перестройку тяжелой цепи и приступает к перестройке легкой цепи, становясь малой пре-В клеткой (Pieper, 2013) . По мере перестройки легкой цепи на поверхности созревающего лимфоцита начинает экспрессироваться IgM, и клетку классифицируют как незрелую В-клетку. Незрелые B-клетки выходят из костного мозга в периферические лимфатические ткани, где они проходят проверку на толерантность к собственным тканям и жизнеспособность. Такие клетки становятся наивными B-лимфоцитами и начинают

экспрессировать в добавок к IgM ещё и IgD, как продукт альтернативного сплайсинга. При миграции по организму наивные B-лимфоциты проходят через наружные Т-клеточные зоны периферических лимфоидных органов и оказываются в первичных фолликулах. Затем, через лимфу, B-лимфоциты этой субпопуляции вновь возвращаются в кровь (Hardy, 2001). Попадая в лимфатический, узел В-лимфоцит быстро мигрирует через Т-клеточную зону, что обеспечивает ему возможность проконтактировать с большим количеством Т-хелперов разной специфичности и "выбрать" соответствующий. Активированная Т-клетка взаимодействует с наивным B-лимфоцитом и запускает серию процессов, направленных на активацию B-лимфоцита. Т-хелпер поляризуется относительно синапса с B-клеткой смещая, свое ядро в противоположную от зоны контакта сторону и ориентируя свой секреторный аппарат максимально близко к В-лимфоциту. Иммунологический синапс между Т- и B-клеткой обеспечивается, помимо контакта TCR с МНС II класса, взаимодействием LFA-1 (на Т-клетке) с ICAM-1 (на B-клетке), а также основной ко стимулирующей парой CD40L (на Т-клетке) и CD40 на B-клетке (Ramiscal, 2013). В просвет синапса Т хелпер секретирует большое количество TGF-ß, IL-4, IL-5, и IL-6, которые связываются с активирующими рецепторам на поверхности B-клетки. Сущес�