Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеризация новых лейкоцитарных рецепторов человека FCRL1, FCRL4 и FCRL6

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеризация новых лейкоцитарных рецепторов человека FCRL1, FCRL4 и FCRL6"

На правах рукописи №

БАРАНОВ КОНСТАНТИН ОЛЕГОВИЧ

ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ НОВЫХ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ЧЕЛОВЕКА ЕСЫЛ, ГСКЬ4 И ГС11Ь6

¡0

03.01.07- молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005547716

1 5 КАП 2014

Новосибирск - 2014

005547716

Работа выполнена в лаборатории иммуногенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Научный руководитель: Таранин Александр Владимирович,

доктор биологических наук, заведующий лабораторией иммуногенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: Рыкова Елена Юрьевна,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Катохин Алексей Вадимович,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агенства, г. Москва

Защита состоится « 18» июня 2014 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д 003.074.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8/2, тел (383)-363-90-45, тел +7-952-916-7858, e-mail: kokoza@mcb.nsc.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН www.mcb.nsc.ru.

Автореферат разослан « 1i>~y> апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е. Б. Кокоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инициация, развитие и завершение иммунного ответа против чужеродных организмов у позвоночных определяются балансом разнонаправленных сигналов, получаемых клетками иммунной системы через поверхностные и внутриклеточные рецепторы. Нарушения регуляции иммунного ответа лежат в основе этиологии и патогенеза многих заболеваний, включая хронические инфекционные болезни, аллергические, аутоиммунные реакции, а также злокачественные новообразования. Выяснение роли отдельных рецепторов в сети регуляторных сигналов имеет важнейшее значение для понимания функционирования иммунной системы и создания методов коррекции иммунного ответа при иммунопатологиях (Murphy, 2011).

К настоящему времени у человека описано более десятка семейств иммунорегуляторных рецепторов. Одним из наиболее изученных является семейство лейкоцитарных Fc-рецепторов (FcR), члены которого, взаимодействуя со своими лигандами - константными областями иммуноглобулинов, выполняют ключевые функции в регуляции гуморального и клеточного иммунного ответа (Ravetch and Bolland, 2001).

В лаборатории иммуногенетики параллельно с несколькими зарубежными группами у человека и мыши было обнаружено ранее неизвестное семейство генов, родственных генам FcR и экспрессирующихся в клетках иммунной системы (Guselnikov et al., 2002; Mechetina et al., 2002; Chikaev et al., 2005). У человека в состав этого семейства входит 8 генов, шесть из которых кодируют трансмембранные поверхностные белки, получившие по новой номенклатуре (Maltais et al., 2006) наименование FCRL1-FCRL6 (FcR-like 1-6). Внеклеточные области FCRL1-FCRL6 содержат от трёх до девяти иммуноглобулин (ИГ)-подобных доменов, а цитоплазматические участки имеют разные паттерны тирозин-содержащих сигнальных мотивов. Для данного исследования были выбраны три наименее изученных членов семейства FCRL человека: FCRL1, FCRL4 и FCRL6. К моменту начала работы вся имеющаяся о них информация ограничивалась структурой гена и отдельными данными по экспрессии мРНК (Hatzivassiliou et al., 2001; Davis et al., 2002). Характер экспрессии рецепторов FCRL1, FCRL4 и FCRL6 в тканевых и клеточных компартментах, их функция, их лиганды, а также связь с заболеваниями оставались неизвестными.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлись характеризация трёх членов FCRL-семейства (FCRL1, FCRL4 и FCRL6) на белковом уровне и изучение их роли в иммунном ответе. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ экспрессии мРНК РСМЛ и РС11Ь4 в клетках и тканях человека в норме и при патологиях крови.

2. Получить моноклональные (МКА) и поликлональные антитела (ПКА) против РСЯЫ, РСЯЬ4 и РСЯЬб. Используя полученные антитела, провести анализ экспрессии и биохимических характеристик этих рецепторов.

3. Провести поиск лигандов для рецепторов РСМЛ и РС!1Ь4 методом экспрессионного клонирования.

Научная новизна. В настоящей работе с помощью полученных моноклональных и поликлональных антител впервые охарактеризованы белки нового семейства РСИЬ человека - РСВДЛ, РСКЬ4 и РСЯЬб. Установлено, что РСЯЫ - это белок с молекулярной массой 57 кДа, который экспрессируется исключительно зрелыми СБ 19+ В-клетками. Показано, что в селезёнке и миндалине человека РС1ИЛ + клетки сосредоточены в мантии вторичных лимфоидных фолликулов, а в миндалине, кроме того, в зоне лимфоидного эпителия. Установлено, что РСЯЬ4 экспрессируется на поверхности зрелых В-лимфоцитов, локализующихся в экстрафолликулярных областях вторичных лимфоидных органов и образующих небольшую субпопуляцию нециркулирующих лимфоцитов. РС11Ь6 продуцируется в виде гликопротеина с молекулярной массой 63 кДа на поверхности цитотоксических С08+ Т-клеток и С056+ ЫК-клеток в периферической крови и вторичных лимфоидных органах. Впервые обнаружены достоверные изменения уровня экспрессии гена РСКЫ при некоторых аутоиммунных и гематологических заболеваниях. Разработан новый метод выявления антител против нативных эпитопов в антисыворотках, полученных при иммунизации рекомбинантными белками и пептидами.

Научно-практическая значимость исследования. Результаты данной работы расширяют фундаментальные знания о лимфоцитах человека, механизмах дифференцировки В- и Т-клеток и управления гуморальным и клеточным иммунитетом. Полученные РСЫЛ-, РСЯЬ4- и РСЯЬб-специфичные антитела могут быть использованы в качестве инструмента для дальнейших исследований роли этих рецепторов в иммунной системе, а также могут иметь диагностический потенциал при ряде аутоиммунопатологий. Разработанный метод иммуноанализа может существенно упростить задачу получения моноклональных антител против нативных эпитопов при иммунизации антигенами, наработанными в бактериальных клетках.

Положения, выносимые на защиту. Определение профиля экспрессии гена РСКЫ в клетках и тканях человека установило

достоверные изменения его уровня при ряде патологий крови. С помощью полученных нами МКА и ПКА впервые определены паттерны экспрессии в тканях человека и биохимические характеристики белков FCRL1, FCRL4 и FCRL6. Потенциальные лиганды для FCRL1 и FCRL4 обнаружены на клетках лимфоидных фолликулов и лимфоэпителия миндалины, соответственно. Для FCRL4 кандидатом на роль такого лиганда является галектин-9.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: конференциях молодых учёных-грантодержателей биологических институтов СО РАН (Новосибирск, 2001, 2003, 2004), 14-й Международной конференции «Лимфатические ткани и зародышевые центры в иммунных реакциях» (Гронинген, Нидерланды, 2002), EURESCO конференции «В-клетки в норме и при заболеваниях» (Маратея, Италия, 2003), 12-м Международном симпозиуме «Сигналы и сигнальная трансдукция в иммунной системе» (Шопрон, Венгрия, 2003), отчетных сессиях аспирантов Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2003, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004; Санкт-Петербург, 2008), 7-й и 8-й Международной летней школе по иммунологии имени Джона Хемфри (Москва, 2005, 2007), 13-м Международном иммунологическом конгрессе (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2007), 21-й Международной конференции по геному млекопитающих (Киото, Япония, 2007), 4-й конфереции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008), 9-й Международной конференции «Дифференцировочные антигены лейкоцитов человека» (Барселона, Испания, 2010).

Вклад автора. Основная часть экспериментов была выполнена автором самостоятельно. Получение МКА и ПКА против FCRL4 было сделано совместно с Р.В. Горчаковым. Работа по конъюгированию FCRL-пептидов к белку носителю была проведена под руководством П.П. Лактионова. Бакуловирусный продуцент FCRL6 был получен совместно с Л.В. Мечетиной. Создание кДНК-библиотеки в эукариотическом экспрессирующем векторе проводилось совместно с A.M. Наякшиным.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в котором содержится 161 ссылка. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу, 43 рисунка.

Публикации. Содержание диссертации должным образом отражено в автореферате и изложено в 17 публикациях: 4 статьях (из них 3

опубликованы в изданиях Перечня ВАК), и 13 публикациях в виде тезисов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе использовали следующие методы: получение моноклональных и поликлональных антител, иммуноферментный анализ, иммуноблотгинг, иммуноцито- и гистохимический анализ с использованием флуоресцентных и ферментных меток, выделение и очистка плазмидной ДНК, основные методы клонирования ДНК, полимеразная цепная реакция, секвенирование, дот-гибридизация ДНК, создание кДНК-библиотеки и её нормализация, очистка рекомбинатных белков, транзитная и стабильная трансфекция эукариотических клеток. Кроме того, мы использовали биоинформационный подход для анализа кДНК и белковых последовательностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии мРНК FCRL1 и FCRL4 в клетках и тканях человека в норме и при патологиях

Для исследования экспрессии гена FCRL1 в тканях человека в норме и при патологиях использовали метод дот-блот гибридизации на коммерческих мембранах Multiple Tissue Expression Array (Clontech). FCRL1 экспрессируется преимущественно в органах и тканях иммунной системы: селезёнке, эмбриональной селезёнке, лимфоузлах, костном мозге, лейкоцитах периферической крови и тимусе. Слабая экспрессия FCRL1 была зарегистрирована также в органах желудочно-кишечного тракта: желудке, среднем отделе тонкой кишки, подвздошной кишке, илеоцекальной зоне кишки, а также в аппендиксе. Экспрессия FCRL1, обнаруженная в органах пищеварительной системы, обусловлена, вероятнее всего, лимфоидными клетками, которые, как известно, присутствуют в слизистой оболочке желудка и различных отделах кишечника. Из 8 проанализированных линий клеток, имеющих разное происхождение: HL-60, HeLa, SW480, А549, К-562, MOLT-4, Raji, Daudi - только линия Raji, представляющая собой В-лимфоциты, дала положительный сигнал. Таким образом, полученные нами данные показывают, что у человека ген FCRL1 экспрессируется преимущественно в органах и тканях иммунной системы, где его экспрессия связана с В-лимфоцитами. При гибридизации этой же мембраны с FCRL4-30Hfl0M сигнал не обнаружили, что, по-видимому, обусловлено очень низкой экспрессией FCRL4.

Экспрессию гена FCRL1 при аутоиммунных и гематологических заболеваниях исследовали методом дот-блот гибридизации на мембранах

4

Autoimmune Disease Profiling Array и Blood Disease Profiling Array, соответственно (рис. 1). Гибридизационный сигнал был обнаружен только в CD 19+ В-лимфоцитах, но отсутствовал в CD 14+ моноцитах, а также CD3+ Т-лимфоцитах, что подтвердило В-лимфоцитарную природу экспрессии гена FCRL1. Попарное сравнение данных, полученных для каждого аутоиммунного заболевания, с данными здоровых индивидуумов, показало, что уровень экспрессии гена FCRLJ в периферических CD 19+ В-лимфоцитах был достоверно выше у больных с рассеянным склерозом, антифосфолипидным синдромом, артериитом Такаясу и болезнью Виллебранда (рис. 1а). У больных идиопатической тромбоцитопенией наблюдалась тенденция к достоверному отличию от контрольной группы. У больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом уровень экспрессии гена был сходен с нормой. Таким образом, нами впервые были установлены достоверные отличия в уровне экспрессии FCRL1 среди больных с рядом аутоиммунными и гематологическими заболеваниями по сравнению со здоровыми донорами. Что касается полученных нами корреляций между уровнем экспрессии FCRL1 и определенным заболеванием, необходимы дальнейшие исследования функциональных свойств FCRL1 и его роли в этиологии этих заболеваний.

I

а

3 80

ТА ITP

Исследуемые группы

300

i

5 260

S 2»

U

5 160

I

I «и

CD19+- клетки

AML HD VWO CML NHL Исследуемые группы

Рис. 1. Дот-гибридизация с нормированными образцами кДНК CD 19+ клеток периферической крови при аутоиммунных заболеваниях (а) и гематологических заболеваниях (б). По оси абсцисс - исследуемые группы, по оси ординат - уровень экспрессии FCRL1 в условных единицах. ND - норма, SLE — системная красна волчанка, RA - ревматоидный артрит, MS - рассеянный склероз, vWD - болезнь Виллебранда, LA - антифосфолипидный синдром, ТА - артериите Такаясу, ITP — идиопатическая тромбоцитопения, AML - острая миелоидная лейкемия, HD -лимфома Ходжкина, CML - хроническая миелоидная лейкемия и NHL -неходжкинская лимфома.

При анализе FCRL4 в периферической крови человека в норме, при аутоиммунных и гематологических заболеваниях ни один из образцов, нанесённых на мембраны, кроме образца с контрольной ДНК FCRL4, не дал положительного сигнала. Полученные нами результаты объясняются, очевидно, двумя причинами: отсутствием экспрессии гена FCRL4 в клетках периферической крови, как в норме, так и при исследованных патологиях, и низким уровнем его экспрессии в клетке и/или ограниченностью популяции FCRL4+ клеток во вторичных лимфоидных органах. С этими объяснениями согласуются полученные нами ранее результаты ОТ-ПЦР на субпопуляциях лейкоцитов периферической крови здоровых доноров.

Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL1, FCRL4 и FCRL6

Основным инструментом для анализа экспрессии белка и его функции являются специфические антитела. С целью получения антител против FCRL1, FCRL4 и FCRL6 были созданы генетические конструкции для наработки внеклеточных областей этих белков. Использовали разные вектора и варианты химерных белков. Полученными конструкциями трансформировали Е. coli и оценивали уровень экспрессии, растворимость химерных белков, а также возможности их эффективной очистки. Отобранные по совокупности качеств варианты использовали для препаративной наработки белка. Очищенными белками иммунизировали мышей и кроликов. В результате цикла из 4-х иммунизаций были получены 4 антисыворотки кролика против рекомбинантных белков FCRL1, и по две антисыворотки кролика против белков FCRL4 и FCRL6. Кроме того, нами были получены антипептидные антисыворотки к FCRL1.

Для получения гибридом, продуцирующих специфичные МКА против FCRL1, FCRL4, и FCRL6, использовали мышей с наивысшим титром специфичных антител в крови. В результате проведенного скрининга были получены три стабильных гибридных клона, продуцирующих антитела против FCRL1 (KU, К23 и К31), один клон против FCRL4 (R311) и три клона против FCRL6 (7В2, 7А11 и 5F8). Эти клоны размножали и прививали мышам линии BALB/c для получения асцитных жидкостей, из которых в последующем были выделены соответствующие МКА. Специфичность МКА контролировали по ходу получения с помощью иммуноферментного анализа. Дальнейшую проверку полученных МКА проводили на трансфицированных клетках с помощью методов иммуноцитохимического окрашивания, проточной

цитометрии и иммуноблоттинга. МКА К23 (РСЯЫ), Я311 (РСЯЬ4) и 7В2 (РСИЬб) распознавали целевые белки в иммуноблоте, иммуноцито- и гистохимическом анализе, а также окрашивали 293Т-трансфектанты в проточной цитометрии (рис. 2, на примере РСЯЬб-специфичного МКА 7В2). Таким образом, нами были получены антитела, позволяющие выявлять РСЯЫ, РСЯЬ4, РСЯЬб как в денатурированной, так и в нативной форме.

Анализ экспрессии РСШЛ, РСИЬ4 и РСИЬб в клетках и тканях человека

Анализ экспрессии РСЯЫ в мононуклеарных клетках периферической крови и клетках миндалины человека проводили с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания клеток в суспензии и последующей проточной цитометрии. Мы обнаружили, что в миндалине человека РСЯЫ экспрессируется на поверхности исключительно В-лимфоцитов: 95%-98% РСЯЫ+ клеток миндалины коэкспрессируют а б

Рис. 2. Моноклоиальные антитела 7В2 специфично реагируют с в

иммуноблоттинге трансфицированных 293Т-клеток и спленоцитов человека (а); а также в иммуноцитохимическом окрашивании (б), иммуиофлуоресцентном окрашивании (в) и цитометрическом анализе (г) РСЯЬб-трансфектантов.

маркер В-клеток СО 19. В Т-лимфоцитах РСЯЫ не обнаружен. РСЯЫ-позитивные клетки составляли -10-15% от СЭ19+ В-лимфоцитов миндалины, что означает, что экспрессия РСЯЫ не является конститутивной для В-клетки и связана, очевидно, с определенной стадией ее развития.

Иммунопероксидазное окрашивание криосрезов миндалины человека с использованием МКА К23 показало, что РСЯЫ + клетки расположены в лимфоэпителии миндалины и в мантии вторичных лимфоидных фолликулов (рис. За). При окраске панели из криосрезов

а

в

у ■ миндалина

ЯСР^ ЛФ ^ минд

■ : -г'« у

* - — -

.7 *

ЛФ

¿-51 аГ*

' ••'- К2з

РСР1_4 - ч • Г ' - / .: V • ' . , л 1 • миндалина / / А Г ■ '■( у 7

ЛФ ; 'ч • * 1 6 1 у/.

' * г Ч 1 ЛФ 1 • \ ; '% \ \ 4 V \', с ■»-■-.

-___ * ? 4 . • ч

у > 4 Ч ' А

МКА

1УН<А К23

РСЯ>-6 ' ... "...,.». СО 8 - / V

фасная пульпа

Рис. 3. Локализация РСЯЫ-, РСЯЬ4- и РСЯЬб-экспрессирующих клеток в тканевых компартментах миндалины и селезёнки человека. (а) - РСКЫ + клетки располагаются в лимфоэпителии и в мантии вторичных лимфоидных фолликулов миндалины человека. (б) - РСИЬ1+ клетки локализуются в зоне В-клеточного фолликула периартериолярной лимфоидной муфты селезёнки человека, (в) -РСИЬ4+ клетки находятся в экстрафолликулярных областях и лимфоэпителии миндалины человека, (г) - РСЯЬ6+ клетки сосредоточены в Т-клеточной зоне периартериолярной лимфоидной муфты.

различных тканей взрослого здорового человека (всего 19 тканей; ВюсЬаш, США) значительное количество РСЯ1Л+ клеток было обнаружено в селезёнке (рис. 36), где они располагались в зоне В-клеточного фолликула периартериолярной лимфоидной муфты. Таким образом, полученные данные показали, что РСЯЫ экспрессируется субпопуляцией наивных В-лимфоцитов мантийной зоны вторичных лимфоидных фолликулов и отчасти зрелыми активированных В-лимфоцитами лимфоэпителия.

Изучение биохимических характеристик РСЯЫ проводили на 293Т-клетках, трансфицированных рС1-пео-РСШЛ. Иммуноблоттинг трансфектантов клеток с использованием РСШЛ-специфичных ПКА показал, что в этих клетках РСЯЫ продуцируется в виде мономера с молекулярной массой 57 кДа, что превышало расчетную массу на 12 кДа. Использование дегликозилирующих ферментов для обработки лизатов клеток показало, что основной вклад в увеличение молекулярной массы РСЯЫ вносит Ы-глнкозилирование.

Проточная цитофлуорометрия РСЯЬ4 в мононуклеарных клетках периферической крови и клетках миндалины человека показала, что в миндалине РСЯЬ4 маркирует небольшую субпопуляцию В-клеток и характеризуется низким уровнем экспрессии: доля РСЯЬ4+ клеток составляла от 0.9% до 2% от всех клеток или от 2 до 6% от СЭ19+ В-лимфоцитов миндалины. При окраске мононуклеаров, выделенных из 10 индивидуальных образцов периферической крови человека, количество РСЯЬ4+ клеток варьировало от 0% до 0.05% от всех лейкоцитов, что свидетельствовало, скорее, об отсутствии экспрессии. Этот результат был ожидаемым. Отсутствие сигнала на РСЯЬ4 в клетках периферической крови было нами ранее показано с помощью ОТ-ПЦР и дот-блот гибридизации.

Иммуногистохимическое исследование РСЯЬ4 на замороженных срезах миндалины человека с помощью МКА ЯЗИ, показало, что РСЯЬ4+ клетки локализуются в экстрафолликулярных областях и лимфоэпителии (рис. Зв).

Анализ экспрессии РСЯЬб в мононуклеарных клетках периферической крови и клетках селезёнки человека проводили с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток в суспензии и последующей проточной цитометрии. Исследование образцов периферической крови здоровых доноров показало, что РСЯЬб экспрессируется преимущественно на цитотоксических СЭ8+ Т-лимфоцитах и С056+ >ЛС-клетках. Именно эти две субпопуляции лимфоцитов являются основными эффекторными компонентами

клеточного иммунного ответа, обеспечивающими защиту организма от вирус-инфицированных и злокачественно-трансформированных клеток. У отдельных индивидуумов была обнаружена очень низкая экспрессия FCRL6 на CD4+ Т-клетках. Вместе с этим экспрессия FCRL6 отсутствовала на CD 19+ В-лимфоцитах. В селезёнке человека FCRL6 также экспрессировался преимущественно на CD8+ Т-клетках и CD56+ NK-клетках.

Полученные данные соответствуют нашим ОТ-ПЦР данным об экспрессии гена FCRL6 (IFGP6) (Ershova et al., 2005) и демонстрирует уникальность этого рецептора в семействе FCRL, все остальные члены которого являются В-клеточными белками. Двойное иммуно-флуоресцентное окрашивание криосрезов селезёнки с помощью МКА 7В2 показало, что FCRL6+ клетки сосредоточены в основном в Т-клеточной зоне ПАЛМ, отдельные клетки встречаются в красной пульпе. У части FCRL6+ клеток наблюдали ко-экспрессию с CD8 (рис. Зг).

Иммуноблот-анализ трансфицированных 293Т-клеток показал наличие двух полос, соответствующих 57 и 63 кДа (Рис. 2а). Вместе с этим, на спленоцитах и мононуклеарах периферической крови наблюдали одну полосу, соответствующую 63 кДа. Наличие в трансфицированных клетках дополнительной полосы в 57 кДа можно объяснить неполным гликозилированием FCRL6 в этих клетках (расчётная молекулярная масса белка FCRL6 составляет 43,5 кДа).

Поиск лигандов FCRL1 и FCRL4

Для поиска белков, взаимодействующих с членами FCRL-семейства, в качестве основной стратегии нами был выбран метод экспрессионного клонирования (рис. 4). Эта работа включала в себя следующие этапы: 1) получение растворимых FCRL-зондов, обладающих ферментативной активностью, 2) использование зондов для идентификации клеток человека, экспрессирующих потенциальные лиганды 3) конструирование кДНК-библиотеки идентифицированных клеток в эукариотическом экспрессирующем векторе, 4) трансфекция 293Т-клеток кДНК-библиотекой и отбор трансфектантов, связывающих FCRL-зонды, 5) выделение плазмиды из отобранных трансфектантов и идентификация вставки.

В качестве зондов мы использовали химерные белки, состоящие из внеклеточных областей FCRL1 и FCRL4, слитых с плацентарной щелочной фосфатазой (АР). Отличительными особенностями плацентарной АР являются высокая ферментативная активность и термостабильность. Взаимодействие АР-содержащего белка с мишенью

АР РС«и

4 ЯР 4> 6 9

Ь 1 ^ ф

III

I Наработка белка РС(?1--АР в эукариотической экспрессирующей системе

\

Очистка РСРЬ-АР зонда *

Идентификация ткани - места

синтеза лиганда для РС131-

♦

Конструирование кДНК-библиотеки »

Нормализация кДНК-библиотеки \

Разбиение кДНК-библиотеки на субпулы

I

Выделение ДНК из субпула *

Трансфекция в 293Т-клетки ♦

Инкубация РС(Ч1.- АР зонда с трансфицированными клетками

I

Добавление хромогенного субстрата для АР, отбор окрашенных клеток

и выделение из них плазмиды *

Секвенирование вставки Рис. 4. Схема поиска лигандов РСЛЬ.

может быть выявлено с помощью хромогенных субстратов щелочной фосфатазы. При этом неспецифическая фосфатазная активность может быть удалена с помощью тепловой инактивации. При наработке химерного белка в культуре трансфицированных 293Т-клеток, как правило, не требуется его дополнительная очистка. Для скрининга используется кондиционированная трансфектантами среда. Необходимо отметить, что АР является димером и это свойство способствует увеличению авидности в случае, если лиганд имеет олигомерную структуру.

Для получения молекулярных зондов на основе плацентарной щелочной фосфатазы мы клонировали последовательности кДНК, соответствующие внеклеточным областям РСЯЫ и РСЯЬ4 в эукариотический экспрессирующий вектор рАР1а§-5 в рамке с ДНК, кодирующей АР. Созданными генетическими конструкциями трансфицировали 293Т-клетки и оценивали уровень секреции химерных белков по активности АР. В качестве еще одного контроля были получены трансфектанты, продуцирующие только свободную АР. Анализ фосфатазной активности кондиционированной трансфектантами среды показал значительные различия между полученными белками, вместе с тем все полученные зонды оказались пригодными для использования в схеме экспрессионного клонирования.

Поскольку наибольший уровень экспрессии РСЯЬ был обнаружен нами в миндалине и селезёнке, логично было предположить, что клетки этих органов могут экспрессировать макромолекулы, взаимодействующие с РСЯЫ и РСЯЬ4 и являющиеся функциональными лигандами этих рецепторов. Для проверки этого предположения мы инкубировали препараты криосрезов миндалины с

кондиционированными средами, содержащими РСЯЫ-АР, РСЯЬ4-АР и свободную АР. Связывание зондов определяли с помощью хромогенного | субстрата АР. Окрашивание показало, что РСЯЬ4-АР и РСЯЫ-АР взаимодействуют с клетками, имеющими разную локализацию. РСШЛ- I АР зонд связывался главным образом фолликулярными клетками, в то время как клетки, связывающие РСЯЬ4-АР, располагались почти исключительно в лимфоэпителии селезенки, (рис. 5). Отсутствие окраски на контрольных препаратах, инкубированных со свободной АР, равно как и различный профиль связывания РСЯЫ-АР и РСЯЬ4-АР, указывали на специфичность взаимодействия.

Для проведения процедуры экспрессионного клонирования потенциального лиганда РСЯЬ4 была сконструирована кДНК-овая

а

в Рис. 5. Иммуноферментное окрашивание

; криосрезов миндалины человека с использованием РСЯЫ-АР (а), РСЯЫ-АР (б) и АР (в). Клетки, окрашенные на РС11и-лиганд, локализованы преимущественно в лимфоидных фолликулах, в меньшей степени в жстрафолликулярных областях миндалины. Клетки, окрашенные на РСЯЬ4-, лиганд, преимущественно располагаются в основном в лимфоэпителии. АР- контроль связывания фосфатазы.

библиотека миндалины. Этой библиотекой трансфицировали 293Т-клетки и окрашивали трансфектанты с помощью химерных белков РСЯЬ4-АР. В качестве контроля использовали окраску свободной АР. Окрашенные клетки отбирали с помощью микроманипулятора, лизировали и выделяли плазмидную ДНК по стандартному протоколу с последующей трансформацией электрокомпетентных клеток. Выросшие на селективной среде колонии, анализировали с помощью ПЦР на наличие вставки. Из 15 полученных нами клонов, только три (№ 4, 5 и 9) содержали вставки и были отобраны для секвенирования. Секвенирование показало, что клоны №4 и №5 кодируют белки 8МАЯСВ1 и 8АЯТ1. В силу своей внутриклеточной и внутриядерной локализации эти белки представляются менее вероятными кандидатами на роль лиганда для рецептора РСЯЬ4. Клон №9 содержал последовательность, кодирующую галектин-9. Выделяют две формы галектина-9: внутриклеточную и мембранную. Мембранная форма галектина-9 потенциально могла бы связываться с рецептором РСЯЬ4, обеспечивая рецептор-рецепторное взаимодействие В-лимфоцитов с другими типами клеток иммунной системы. И хотя нам пока не удалось напрямую продемонстрировать взаимодействие этих двух белков, галектин-9 остаётся вероятным кандидатом на роль лиганда РСЯЬ4.

/,< А?..

■ ЦЗ*

б IV

* >

> -•

Мы также предположили, что лиганд РСЯЬ4 может экспрессироваться на одной из лейкоцитарных клеточных линий. Мы протестировали одиннадцать клеточных линий человека, имеющих разное тканевое происхождение (К562 - эритроидная; МОЬТ4, ,1игка1, МТ4 - Т-лимфобластоидные; ВМВ, Ка}1, В12, БаисН, СВМ1, 1М9 - В-лимфобластоидные; НЬ60 - миелобластоидная; НеЬа - эпителиальная) на способность связывать РСЯЬ4-АР. Специфическое окрашивание было обнаружено только в случае В-клеточной лимфомы Яа^. Эта линия будет использована для дальнейшего исследования лиганда(ов) РСЯЬ4.

Разработка метода скрининга антител к эпитопам нативных белков

Одним из тестов на применимость зондов РСЯЬ-АР для поиска лигандов была проверка их способности связываться с иммобилизованными антителами против РСЯЬ, а также против расположенного на СООН-конце с-Мус эпитопа. Положительный результат этого теста позволил нам предположить, что АР-содержащие химерные белки, наработанные в эукариотических клетках (т.е. с правильным образованием дисульфидных связей и гликозилированием) могут быть использованы для разработки нового метода выявления антител против нативных эпитопов. Для того, чтобы подтвердить это предположение была проделана серия экспериментов. В качестве основы метода использовали схему прямого связывания антигена антителами, иммобилизованными на нитроцеллюлозной мембране (Рис. 6). На первом этапе в качестве универсального антитела использовали МКА против с-Мус эпитопа, входящего в состав трёх химерных РСЯЬ-белков, РСЯЬА-АР, РСЯЫ-АР и РСЯЬ4-АР. Свободный АР также содержит эпитоп с-Мус и, по сути, также является химерным. Отрицательным контролем были МКА против С02 человека. По 1 мкл серийных разведений

бхНа

:-Му(

А Р-содержаши й химерный белок

I! у I у 11

V 11 - 1 У

С\01:1 [>Ц| 114 Л Г

Рис. 6. Схема иммуноферментного анализа с использованием растворимого химерного белка, состоящего из антигенной части (Я) и ферментативной метки -термостабильной щелочной фосфатазы (АР).

супернатантов, содержащих антитела перечисленных гибридом, наносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокировки мембраны инкубировали в кондиционированных трансфектантами средах, содержащих РСИТА-АР, РСМЛ-АР, РСЯЬ4-АР и АР-белки, затем отмывали и помещали в раствор, содержащий хромогенный субстрат для АР. Положительный сигнал проявлялся в виде пятен различной интенсивности. Результаты показали, что прямой антиген-связывающий анализ с использованием АР-химерных белков позволяет выявлять иммобилизованные на нитроцеллюлозе антитела с высокой чувствительностью, достаточной для скрининга гибридом.

Возможность использования данного метода для выявления антител против нативных эпитопов проверяли, анализируя образцы супернатантов гибридом, продуцирующих МКА против РСЛЬА (клоны М101, М203, М204, Мб 16), РСШЛ и РСИ.Ь4. Эти гибридомы были отобраны на основе результатов ИФА с использованием антигенов, наработанных в бактериальной экспрессирующей системе. Далее мы проверяли способность трёх клонов МКА против РСШЛ (клоны К11, К23, К32) и один против РСЯЬ4 (11311) связывать соответствующие им молекулярные зонды. Три клона МКА, распознающих рекомбинантный РСШЛ, реагировали с белком РСМЛ-АР по-разному. Только один из них, К23, давал положительную специфическую реакцию при инкубации с РСЮЛ-АР (рис. 7). Наиболее вероятное объяснение последнего факта заключается в том, что РСШЛ и РСШЛ принадлежат к одному семейству

FCRL1-AP язи к« кгз кзг АР язи К11 кгз кз2 FCRL4-AP R311 К11 К23 К32

1 (0,5 jig/ml) « • % • ; ©

% • ©

1/4 1/8 • а ■ * * •

1/16 т

1/32 #

1/64 *

1/128

1/256 4 .

FCRL4-AP

R311

% (0,0Z pg/ml)

щ %

♦ 1/4

* 1/8

ш 1/18

* 1/32

. « 1/64

1/126

1/256

J/512

Рис. 7. Прямой антиген-связывающий анализ FCRL1-(K11, К23 и К32) и FCRL4-(R311) специфичных МКА. Афинно очищенные МКА R311, К11, К23 и К32 титровали двукратными разведениями в PBS и наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны инкубировали с FCRL1-AP, АР и FCRL4-AP.

и обладают значительным сходством (~70% идентичных остатков) в БЗ-и 04- доменах. Способность клона К23 связывать нативный эпитоп подтверждается его способностью окрашивать БСЫЛ на поверхности РС1ИЛ-293Т-трансфектантов и на поверхности В-лимфоцитов. МКА К11 показали отсутствие реакции с ЕСЯЫ-АР, что согласуется с их неспособностью реагировать с РСЛЫ на поверхности клеток. Реакция МКА К32 с РСМЛ не может считаться специфической - они, хотя и реагировали с РСИЛ-АР в разведениях до 1:16, давали перекрестную реакцию с РС11Ь4-АР.

Важнейшей характеристикой любого иммунохимического метода является его чувствительность, т.е. нижний предел концентрации выявляемого реагента. Минимальная концентрация 1§0, давшая положительную реакцию в случае очищенных МКА311, составила 40 нг/мл, что соответствует 40 пг в точке нанесения (рис. 7).

Эти результаты, а также полученные нами данные по анализу РСЯЬА-специфичных МКА и различных серий ПКА против белков РСЕ1Ь-семейства (в том числе противопептидных) показали, что АР-содержащие белки являются эффективными реагентами для выявления специфических антител против нативных эпитопов. Такие белки могут быть наработаны с помощью простой временной трансфекции 293Т-клеток. Поскольку метка является частью секретируемой молекулы, отпадает необходимость проводить очистку такого белка. 2 мл кондиционированной трансфектантами среды достаточно для одновременной обработки 4 мембран размером 50x30мм, содержащей 240 нанесенных образцов. Поскольку для анализа достаточно 1 мкл исследуемого образца, при иммуноскрининге гибридом прямой антиген-связывающий метод может быть использован параллельно со стандартным ИФА. Важно отметить, что предлагаемый метод можно использовать для оценки наличия антител против нативных эпитопов до стадии получения гибридом. При иммунизации панелью пептидных конъюгатов, легко будет выбрать тот пептид, который соответствует нативному эпитопу. Еще два достоинства данной схемы могут быть использованы независимо от того, какие антигены использовались для иммунизации. При направленном получении антител, распознающих различные функциональные домены белков, достаточно создать серию конструкций, обеспечивающих экспрессию химер, отличающихся доменным составом антигенной части. Если белок-мишень является членом семейства родственных белков, очень велика вероятность того, что полученные МКА будут реагировать с другими членами семейства, как это видно на примере МКА К32. Использование АР-содержащих

белков может существенно упростить процедуру выбора МКА,

специфично распознающих отдельные члены семейства.

ВЫВОДЫ

1. Определён профиль экспрессии гена FC/?L 1 человека в норме и при патологиях. Обнаружены достоверные изменения по сравнению с нормой уровня экспрессии гена ГСШ1 в клетках периферической крови человека при ряде аутоиммунных и гематологических заболеваний: рассеянном склерозе, антифосфолипидном синдроме, артериите Такаясу, болезни Виллебранда, острой миелоидной лейкемии и неходжкинской лимфоме. Установлено, что ген РСКЬ4 человека не экспрессируется клетками периферической крови в норме и при исследованных патологиях.

2. Получены и охарактеризованы поликлональные и моноклональные антитела, специфично выявляющие новые иммунорегуляторные рецепторы человека РСЯЫ, РСЯЬ4 и РСЯЬб. Полученные антитела применимы в широком спектре иммунохимических методов и являются эффективным инструментом исследования этих белков.

3.С помощью полученных антител установлены фенотипы и тканевая локализация экспрессирующих РСЯЫ, РС11Ь4 и РСЛЬб клеток, а также определены биохимические характеристики этих белков. Установлено, что рецептор РСЫЛ представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 57 кДа и является маркером субпопуляции зрелых В-лимфоцитов селезёнки, миндалины и периферической крови человека. Обнаружено, что белок РСИЬ4 экспрессируется на поверхности зрелых В-лимфоцитов, образующих малочисленную субпопуляцию нециркулирующих, оседлых лимфоцитов, локализующихся в экстрафолликулярных областях вторичных лимфоидных органов. Установлено, что белок РСЯЬб имеет молекулярную массу 63 кДа и экспрессируется на поверхности цитотоксических лимфоцитов в периферической крови и вторичных лимфоидных органах человека.

4. Установлено, что белок, взаимодействующий с РСЯЫ, локализован в клетках лимфоидных фолликулов и экстрафолликулярных областей, а с РСЯЬ4 — в клетках лимфоэпителия миндалины и В-клеточной линии Кар. Потенциальным кандидатом на роль лиганда РСЯЬ4 является галектин-9.

5.Разработан эффективный метод выявления антител против нативных эпитопов в антисыворотках, полученных при иммунизации пептидами

17

и рекомбинантными антигенами. Метод может быть использован для массового скрининга гибридом при производстве моноклональных антител.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Baranov К., Volkova О., Chikaev N., Mechetina L., Laktionov P., Najakshin A., Taranin A. A direct antigen-binding assay for detection of antibodies against native epitopes using alkaline phosphatase-tagged proteins // J Immunol Methods. 2008. V. 332. P. 73-81.

2. Kulemzin S.V., Zamoshnikova A.Y., Yurchenko M.Y., Vitak N.Y., Najakshin A.M., Fayngerts S.A., Chikaev N.A., Reshetnikova E.S., Kashirina N.M., Peclo M.M., Rutkevich P.N., Shevelev A.Y., Yanushevskaya E.V., Baranov K.O., Mamonkin M., Vlasik T.N., Sidorenko S.P., Taranin A.V., Mechetina L.V. FCRL6 receptor: expression and associated proteins // Immunol Lett. 2011. V. 134 P. 174182.

3. Баранов K.O., Волкова О.Ю., Мечетина JI.В., Чикаев Н.А., Решетникова Е.С., Никулина Г.М., Таранин А.В., Наякшин A.M. Экспрессия гена FCRL1 человека в норме и при аутоиммунных заболеваниях // Молекулярная биология. 2012. V. 46 №2 С. 1-8.

4. Баранов К.О., Мечетина Л.В., Чикаев Н.А., Волкова О.Ю., Таранин А.В., Наякшин A.M. Поиск лигандов рецепторов FCRL-семейства // Фундаментальные науки - медицине. Новосибирск, Россия. 2-5 сентября 2008 г. С. 99-101.

5. Алябьев Б.Ю., Гусельников С.В., Ершова С.А., Баранов К.О., Горчаков Р.В. Структурно-функциональный анализ FcR-подобных GBS/IFGP рецепторов человека и мыши // Материалы отчетной конференции молодых ученых-грантодержателей биологических институтов СО РАН посвященной М. А. Лаврентьеву. Новосибирск, Россия, 4-7 декабря, 2001, часть И, С. 9-11.

6. Taranin A.V., Volkova O.Y., Mechetina L.V., Najakshin A.V., Faizulin R.Z., Baranov K.O., Gorchakov R.V., Chikaev N.A., Guselnikov S.V., Ershova S.A. Generation and characterization of monoclonal and polyclonal antibodies against novel human B-cell antigens // Proceedings of the 14th International Conference on Lymphatic Tissues and Germinal Centers in Immune Reactions. Groningen, Netherlands. 23-27 June, 2002. P. 42.

7. Taranin A.V., Najakshin A.M., Mechetina L.V., Ershova S.A., Volkova O.Y., Chikaev N.A., Baranov K.O., Guselnikov S.V., Bykova E.A. The human and mouse FcR-like molecules: species-specific architecture and

18

cell distribution // Proceedings of the EURESCO conference "B cells in health and disease". Maratea, Italy. 10-15 May 2003.

8. Taranin A.V., Najakshin A.M., Mechetina L.V., Volkova O.Yu., Chikaev N.A., Ershova S.A., Guselnikov S.V., Baranov K.O. The newly defined human and mouse FcR-like proteins: diverse architecture and species-specificity of expresión patterns // Proceedings of the 12th Symposium on signals and signal processing in the immune system. Sopron, Hungary. 37 September, 2003, P. 37-38.

9. Ершова C.A., Баранов K.O., Гусельников C.B. Функциональный анализ рецепторов IFGP семейства // Материалы отчетной конференции молодых ученых-грантодержателей биологических институтов СО РАН посвященной М. А. Лаврентьеву. Новосибирск, Россия, 1-3 декабря, 2003, часть II, С. 155.

10. Таранин А.В., Наякшин A.M., Мечетина JI.B., Волкова О. Ю., Чикаев Н.А., Ершова С.А., Гусельников С.В., Баранов К.О. FcR-подобные белки: новое семейство маркеров В-лимфоцитов человека // Материалы Объединенного иммунологического форума. Екатеринбург, Россия. 31 мая - 4 июня 2004. Российский иммунологический журнал. Т. 9. С. 81.

И. Гусельников С.В., Ершова С.А., Баранов К.О. Функциональный анализ рецепторов IFGP семейства, экспрессирующихся в В-клетках // Материалы отчетной конференции молодых ученых-грантодержателей биологических институтов СО РАН посвященной М. А. Лаврентьеву. Новосибирск, Россия, 17-19 ноября, 2004. часть II, С. 142.

12. Taranin A.V., Najakshin A.M., Mechetina L.V., Volkova O.Y., Chikaev N.A., Ershova S.A. Baranov K.O., Guselnikov S.V. FcR-like proteins: a newly defined group of remarkably diverse molecules differentially expressed in lymphocytes // Proceeding of 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. Moscow, Russia. 5-9 September 2005. P. 7.

13. Baranov K.O., Mechetina L.V., Volkova O.Y., Chikaev N.A., Taranin A.V., Najakshin A.M. Searching for ligands of the FcR-like В cell-specific receptors // Proceedings of the 13th International Congress of Immunology. Rio de Janeiro, Brazil, 21-25 August 2007. P. 54.

14. Baranov K.O., Mechetina L.V., Volkova O.Y., Chikaev N.A., Taranin A.V., Najakshin A.M. Human В cell-specific receptors FCRL1 and FCRL4: ligand identification //Proceeding of 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. Moscow, Russia. 10-14 September 2007. P. 7.

15. Baranov К., Mechetina L., Volkova O., Chikaev N., Taranin A., Najakshin A. Human FcR-like В cell specific receptors: ligand searching // Proceedings of the 21st International Mammalian Genome Conference. Kyoto, Japan. 28 October - 1 November 2007. P. 178.

16. Баранов K.O., Волкова О.Ю., Наякшин A.M., Мечетина JI.В. Новый метод скрининга антител против нативных эпитопов редких антигенов // Материалы Объединенного иммунологического форума. Санкт-Петербург, Россия. 30 июня - 5 июля 2008. Российский иммунологический журнал. Т. 2 № 2-3 С. 14.

17. Konstantin О. Baranov, Ludmila V. Mechetina, Olga Y. Volkova, Nikolai A. Chikaev, Alexander V. Taranin, Alexander M. Najakshin. Searching for ligands of the FcR-like В cell-specific receptors // Proceedings of the 9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens. Barcelona, Spain. 11-13 March 2010.

Подписано в печать 11.04.2014 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 207

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баранов, Константин Олегович, Новосибирск

Федеральное государственное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук

На правах рукописи

ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ НОВЫХ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ЧЕЛОВЕКА ЕСКЫ, ¥СШ,4 И ¥СШ,6

03.01.07 - молекулярная генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н. Таранин А. В.

Новосибирск — 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................15

1.1. Основные принципы структурной организации лейкоцитарных рецепторов........................................................................................................15

1.1.1. Структура ИГ-домена......................................................................................................18

1.1.2. Способы закрепления лейкоцитарных поверхностных молекул на клеточной мембране............................................................................................20

1.1.3. Гликозилирование лейкоцитарных рецепторов....................................23

1.1.4. Сигнальные мотивы в цитоплазматических районах лейкоцитарных рецепторов......................................................................................................25

1.2. Fc-рецепторы млекопитающих....................................................................................28

1.2.1. Семейство лейкоцитарных FcR человека и мыши..........................29

1.2.2. Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека............................................................................................................................................................35

1.2.3. Активация и инактивация клеток FcR-комплексами человека............................................................................................................................................................37

1.3. Семейство лейкоцитарных FcR-подобных молекул - FCRL (CD307)............................................................................................................................................................41

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................50

2.1. Материалы и реактивы........................................................................................................50

2.2. Биологический материал....................................................................................................53

2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК..............................................................53

2.3.1. Выделение плазмидной ДНК......................................................................................53

2.3.2. Препаративное выделение плазмидной ДНК с помощью катионного детергента - ЦТАБ..............................................................................................54

2.3.3. Удаление примесей бактериальной геномной ДНК из раствора плазмидной ДНК при помощи кислого фенола........................54

2.4. Методы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов. 55

2.4.1. Основные методы работы с рекомбинантной ДНК..........................55

2.4.2. Приготовление и трансформация химически компетентных клеток Е. coli....................................................................................................55

2.4.3. Приготовление и электропорация электрокомпетентных клеток Е. coli..........................................................................................................................................................................................56

2.5. Полимеразная цепная реакция и олигонуклеотиды..............................57

2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК....................60

2.7. Дот-гибридизация ДНК........................................................................................................60

2.7.1. Приготовление радиоактивно меченых зондов......................................60

2.7.2. Гибридизация мембран с радиоактивно мечеными зондами 61

2.8. Получение рекомбинантных конструкций....................................................62

2.8.1. Создание рекомбинантных конструкций на основе pT7ZZ

и рТ7АВР векторов............................................................................................................................62

2.8.2. Создание рекомбинантных конструкций на основе рЕТ-21 вектора..............................................................................................................................................................63

2.8.3. Создание рекомбинантных конструкций на основе pCI-neo вектора............................................................................................................................................................65

2.8.4. Создание рекомбинантных конструкций на основе pAP-tag вектора..............................................................................................................................................................66

2.9. Очистка рекомбинатных белков..........................................................................................67

2.10. Иммунизация животных....................................................................................................69

2.10.1. Иммунизация кроликов..............................................................................................69

2.10.2. Иммунизация мышей..................................................................70

2.11. Иммуноферментный анализ........................................................................................70

2.12. Иммуноблоттинг......................................................................................................................71

2.13. Получение моноклональных антител..............................................................72

2.14. Получение антипептидных антител....................................................................74

2.14.1. Получение конъюгата белок-пептид................................................................74

2.14.2. Изготовление аффинного сорбента для очистки антител против FCRL1..........................................................................................................................................74

2.14.3. Выделение антипептидных антител из антисыворотки кролика............................................................................................................................................................75

2.15. Транзитная трансфекция эукариотических клеток..............................75

2.16. Иммуноцитохимический анализ мазков клеток........................................76

2.17. Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензий клеток..............77

2.18. Иммуногистохимический анализ............................................................................77

2.19. Ферментативное дегликозилирование................................................................78

2.20. Количественное измерение фосфатазной активности АР-содержащих белков..............................................................................................................................79

2.21. Создание кДНК-библиотеки миндалины человека в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA I/Amp и её нормализация..........................................................................................................................................79

2.22. Иммуноферментное окрашивание криосрезов миндалины человека и трансфицированных клеток при помощи АР-содержащих белков............................................................................................................................81

2.23. Метод скрининга антител к эпитопам нативных белков............82

2.24. Компьютерный анализ последовательностей..........................................83

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................84

3.1. Анализ экспрессии рецепторов человека - FCRL1, FCRL4 и

FCRL6................................................................................................................................................................84

3.1.1. FCRL1................................................................................................................................................84

3.1.1.1. Экспрессия FCRL1 в тканях человека........................................................84

3.1.1.2. Получение поликлональных и моноклональных антител kFCRLI..........................................................................................................................................................92

3.1.1.3. Анализ экспрессии белка FCRL1 в клетках и тканях человека..........................................................................................................................................................99

3.1.2. FCRL4.......................................................................... 105

3.1.2.1. Экспрессия FCRL4 в тканях человека............................ 105

3.1.2.2. Получение поликлональных и моноклональных антител

к FCRL4............................................................................. 108

3.1.2.3. Анализ экспрессии белка FCRL4 в клетках и тканях человека............................................................................. 112

3.1.3. FCRL6.......................................................................... 114

3.1.3.1. Получение поликлональных и моноклональных антител

к FCRL6............................................................................. 114

3.1.3.2. Анализ экспрессии белка FCRL6 в клетках и тканях человека............................................................................. 118

3.2. Поиск лигандов к FCRL1 и FCRL4.................................... 122

3.2.1. Получение молекулярных зондов на основе FCRL и плацентарной щелочной фосфатазы....................................... 124

3.2.2. Выявление связывающих FCRL1 и FCRL4 клеток в миндалине человека и экспрессионное клонирование потенциального лиганда FCRL4............................................. 127

3.3. Разработка метода скрининга антител к эпитопам нативных белков....................................................................................................... 133

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................... 144

ВЫВОДЫ.............................................................................. 147

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................ 149

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АР термостабильная щелочная фосфатаза

FcR Fc-рецептор

FCKL/FCRL FCRL рецептор/ген

FcR-подобный подобный Fc-рецепторам

IMDM модифицированная среда Дульбекко

ITAM иммунорецепторный тирозин активирующий мотив

ITIM иммунорецепторный тирозин ингибирующий мотив

PBS фосфатно-солевой буфер

ТМ трансмембранный

AT антитела

БСА бычий сывороточный альбумин

BKP/BCR В-клеточный антиген-связывающий рецепторный комплекс

дНТФ 2'-дезоксирибонуклеозидтрифосфат

ДСН додецилсульфат натрия

ЗЦ зародышевый центр

ИГ/Ig иммуноглобулин

ИФА иммуноферментный анализ

кДНК комплементарная ДНК

ЛФ лимфоидный фолликул

МКА моноклональные антитела

ПААГ полиакриламидный гель

ПАЛМ периартериолярная лимфоидная муфта

ПКА поликлональные антитела

ПЦР полимеразная цепная реакция

TKP/TCR Т-клеточный рецептор

ЧСА человеческий сывороточный альбумин

ЭСТ эмбриональная сыворотка телёнка

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Инициация, развитие и завершение иммунного ответа против чужеродных организмов у позвоночных определяются балансом разнонаправленных сигналов, получаемых клетками иммунной системы через поверхностные и внутриклеточные рецепторы. Нарушения регуляции иммунного ответа лежат в основе этиологии и патогенеза многих заболеваний, включая хронические инфекционные болезни, аллергические, аутоиммунные реакции, а также злокачественные новообразования. Выяснение роли отдельных рецепторов в сети регуляторных сигналов имеет важнейшее значение для понимания функционирования иммунной системы и создания методов коррекции иммунного ответа (Murphy, 2011).

По своим сигнальным функциям все иммунорегуляторные рецепторы делятся на два основных класса: ингибирующие и активирующие. Ингибирующие рецепторы экспрессируются в виде мономеров и несут в цитоплазматических доменах тирозин-содержащие ингибирующие сигнальные мотивы - ITIM (Daeron et al., 1995; Gergely et al., 1999). Активирующие рецепторы несут тирозин-содержащие активирующие мотивы ITAM - либо в своём цитоплазматическом домене, либо в сигнальной субъединице, в комплексе с которой рецептор экспрессируется на поверхности клетки (Reth, 1989; Cambier, 1995).

К настоящему времени у человека описано более десятка семейств иммунорегуляторных рецепторов. Помимо собственно антиген-распознающих рецепторов В- и Т-клеток, важную роль в регуляции иммунитета играют такие семейства как FcR, KIR, SLAM, Siglec, CEACAM, CD28, B7 и ряд других, каждое из которых содержит до нескольких десятков структурно и функционально различающихся молекул (Barclay et al., 1997, Neuberger et al., 1993; Borges and Cosman, 2000; Xu et al., 2000; Barrow and Trowsdale, 2008; Barton and Kagan, 2009; Guy and Vignali, 2009; Campbell and Purdy, 2011; Veillette and Latour, 2003). Наиболее изученным из них является семейство лейкоцитарных Fc-рецепторов (FcR), члены

которого, взаимодействуя со своими лигандами-константными областями иммуноглобулинов, являются ключевыми регуляторами гуморального и клеточного иммунного ответа (Ravetch and Bolland, 2001).

В лаборатории иммуногенетики параллельно с несколькими зарубежными группами, было обнаружено новое, ранее неизвестное семейство генов человека и мыши, структурно родственных генам лейкоцитарных Fc-рецепторов, которое было названо «Fc-receptor like», FCRL (Guselnikov et al., 2002; Mechetina et al., 2002; Chikaev et al., 2005; Maltais et al., 2006). Это семейство было идентифицировано в результате поиска в EST-базах данных последовательностей, гомологичных gp42 (Seaman et al., 1991), первый домен, которого имеет 35% гомологии с третьим доменом FcyRI. У человека в состав семейства FCRL входит 8 генов, шесть из которых кодируют трансмембранные белки, получившие по новой номенклатуре наименование FCRL1-FCRL6, и два других кодируют внутриклеточные белки FCRLA и FCRLB (Maltais et al., 2006). FCRL1-FCRL6 отличаются количеством и комбинацией внеклеточных иммуноглобулин (ИГ)-подобных доменов, а также паттернами ITAM- и ITIM-подобных сигнальных мотивов в цитоплазматических доменах (Davis et al., 2002). Для данного исследования были выбраны три наименее изученных членов семейства FCRL человека: FCRL1, FCRL4 и FCRL6. К моменту начала работы вся имеющаяся о них информация ограничивалась структурой гена и отдельными данными по экспрессии мРНК (Hatzivassiliou et al., 2001; Davis et al., 2002). Характер экспрессии рецепторов FCRL1, FCRL4 и FCRL6 в тканевых и клеточных компартментах, их функция, их лиганды, а также связь с заболеваниями оставались неизвестными. Идентификация, характеризация и изучение функции любого нового белка актуальны. Изучение рецепторов нового семейства FCRL человека представляет особый интерес. Его члены имеют консервативную структурную организацию, родственную генам FcR, разный набор сигнальных последовательностей и специфичный для иммунной системы

профиль экспрессии в органах и тканях человека. Это дает основание предполагать участие рецепторов БСКЬ в сигнальных каскадах клеток иммунной системы, регулировании дифференцировки этих клеток и модулировании иммунного ответа в норме и при патологиях.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлись характеризация трех членов РСЯЬ-семейства (РСКЕЛ, РСЛЬ4 и РСЯЬб) на белковом уровне и изучение их роли в иммунном ответе. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ экспрессии мРНК БСКЫ и РС11Ь4 в клетках и тканях человека в норме и при патологиях крови.

2. Получить моноклональные и поликлональные антитела против РСЯЫ, РС11Ь4 и РСЯЬб. Используя полученные антитела, провести анализ экспрессии и биохимических характеристик этих рецепторов.

3. Провести поиск лигандов для рецепторов РСЯЫ и РСКЬ4 методом экспрессионного клонирования.

Научная новизна. В настоящей работе с помощью полученных моноклональных и поликлональных антител белки нового семейства РС11Ь человека, РСЫЛ, РСКЬ4 и РСМД впервые охарактеризованы на белковом уровне. Установлено, что РСЫЛ - это белок с молекулярной массой 57 кДа, который экспрессируется исключительно зрелыми СИ 19+ В-клетками. Показано, что в селезёнке и миндалине человека РСМЛ+ клетки сосредоточены в мантии вторичных лимфоидных фолликулов, а в миндалине, кроме того, в зоне лимфоидного эпителия. РСЯЬб продуцируется в виде гликопротеина с молекулярной массой 63 кДа на поверхности цитотоксических СБ8+ Т-клеток и СБ56+ 1ЧК-клеток в периферической крови и вторичных лимфоидных органах. Впервые обнаружены достоверные изменения уровня экспрессии гена РСМЛ при некоторых аутоиммунных и гематологических заболеваниях. Разработан

новый метод выявления антител против нативных эпитопов в антисыворотках, полученных при иммунизации рекомбинантными белками и пептидами.

Научно-практическая значимость исследования. Результаты данной работы расширяют фундаментальные знания о лимфоцитах человека, механизмах дифференцировки В- и Т-клеток и управления гуморальным и клеточным иммунитетом. Полученные FCRL1-, FCRL4- и FCRL6-специфичные антитела могут быть использованы в качестве инструмента для дальнейших исследований роли этих рецепторов в иммунной системе, а также могут иметь диагностический потенциал при ряде аутоиммунопатологий. Новый метод иммуноанализа может существенно упростить задачу получения моноклональных антител против нативных эпитопов при иммунизации антигенами, наработанными в бактериальных клетках.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в котором содержится 161 ссылка. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу, 43 рисунка.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, статья в коллективной монографии и 13 тезисов конференций. Статьи:

1. Baranov К., Volkova О., Chikaev N., Mechetina L., Laktionov P., Najakshin A., Taranin A. A direct antigen-binding assay for detection of antibodies against native epitopes using alkaline phosphatase-tagged proteins // J Immunol Methods. 2008. V. 332. P. 73-81.

2. Баранов К.О., Мечетина Л.В., Чикаев Н.А., Волкова О.Ю., Таранин А.В., Наякшин A.M. Поиск лигандов рецепторов FCRL-семейства // Фундаментальные науки - медицине. Новосибирск, Россия. 2-5 сентября 2008 г. С. 99-101.

3. Kulemzin S.V., Zamoshnikova A.Y., Yurchenko M.Y., Vitak N.Y., Najakshin A.M., Fayngerts S.A., Chikaev N.A., Reshetnikova E.S., Kashirina N.M., Peclo M.M., Rutkevich P.N., Shevelev A.Y., Yanushevskaya E.V., Baranov K.O., Mamonkin M., Vlasik T.N., Sidorenko S.P., Taranin A.V., Mechetina L.V. FCRL6 receptor: expression and associated proteins // Immunol Lett. 2011. V. 134 P. 174-182.

4. Баранов K.O., Волкова О.Ю., Мечетина JI.B., Чикаев Н.А., Решетникова Е.С., Никулина Г.М., Таранин А.В., Наякшин A.M. Экспрессия гена FCRL1 человека в норме и при аутоиммунных заболеваниях // Молекулярная биология. 2012. V. 46 №2 С. 1-8.

Тезисы конференций:

1. Алябьев Б.Ю., Гусельников С.В., Ершова С.А., Баранов К.О., Горчаков Р.В. Структурно-функциональный анализ FcR-подобных GBS/IFGP рецепторов человека и мыши // Материалы отчетной конференции молодых ученых-грантодержателей биологических институтов СО РАН посвященной М. А. Лаврентьеву. Новосибирск, Россия, 4-7 декабря, 2001, часть II, С. 9-11.

2. Taranin A.V., Volkova O.Y., Mechetina L.V., Najakshin A.V., Faizulin R.Z., Baranov K.O., Gorchakov R.V., Chikaev N.A., Guselnikov S.V., Ershova S.A. Generation and characterization of monoc