Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей функционирования генетического аппарата лимфоцитов человека и клеток лимфоидных линий на основе анализа белковых продуктов генной экспрессии

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей функционирования генетического аппарата лимфоцитов человека и клеток лимфоидных линий на основе анализа белковых продуктов генной экспрессии"

ол

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 577.122: [576. 535+577. 346+616.056.7]

ЛУКАШОВА ИННА ВЛАДИМИРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И КЛЕТОК ЛИМФОИДНЫХ ЛИНИЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ

03.00.15 "генетика" 03.00.04 "биохимия"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Раббта выполнена на кафедре генетики МБФ Российского Государственного Медицинского Университета и в лаборатории биохимической генетики Медико-генетического научного центра РАМН

Научные руководители:

* член-корреспондент РАМН, профессор Иванов В. И. доктор биологических наук, профессор Шишкин С. С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Певницкий Л.А. доктор биологических наук Ребров Л.Б.

Ведущее учреждение: Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится а^уг^лл^м 1995 г_ в »// и ч на

заседании Специализированного Совета Д.001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН (по адресу: г.Москва. 115478. ул. Москворечье, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан "_/£" 1995 г.

Ученья секретарь

Специализированного Совета. . доктор биологических наук

профессор Л.Ф. Курило

о

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Формирование дифференцированной клетки рассматривают в настоящее время как результат определенной специализации в функционировании ее генетического аппарата. Конкретным отражением такой специализации становится генетическое детерминирование синтеза целого набора белков, которые, в конечном счете, обеспечивают свойства дифференцированной клетки. Исследование этой проблемы в отношении клеток лимфоидного ряда вызывает значительный интерес в связи с многими важными функциями, выполняемыми лимфоцитами в организмах высших зукариот.

Клетки лимфоидного ряда традиционно являются одним из интенсивно используемых объектов для изучения различных генетических проблем. Они оказались достаточно удобными и для анализа кариотипа. и для оценок генетического полиморфизма, и для выявления генотоксических эффектов от воздействия различных внешнесредовых факторов (Hamaguchi 1982, 1984; Kondo 1984а. 1988b; Ankina 1991; Keppen 1992; Holmberg 1993; Спит-ковский .1992). В работах некоторых авторов применялись методы анализа белков лимфоцитов для решения отдельных генетических задач, в частности, для генетического картирования (Kondo 1985; Goldman 1991).

Новые возможности в изучении особенностей функционирования генетического аппарата в клетках лимфоидного ряда возникли благодаря прогрессу биохимической и молекулярной генетики, обосновавшей фундаментальные положения о взаимоотношениях между генами и белками, а также создавшей методологию анализа белков как продуктов генной экспрессии (Льюин 1987; Anderson, Anderson 1982. 1984; Klose 1989; Cells et al 1992).

Появление высокоразрешающего двумерного электрофореза (O'Farrell 1975), позволяющего параллельно анализировать сотни и тысячи индивидуальных продуктов генной экспрессии, стало началом для формирования комплексного подхода к изучению особенностей функционирования генетического аппарата в клетках разных типов. Этот подход, получивший название "системный", находит уже применение в изучении геномов ряда организмов и, в частности, человека (Inter.Meet. "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes" 1994).

В настоящее время несколько групп исследователей активно применяют системный подход к изучению продуктов генной экспрессии в клетках лимфоидного ряда человека (Cells et al 1989. 1990, 1991; Hamaguchi et al 1981, 1982; Hanash 1994). Поставлена и стала решаться задача построения компьютерных банков данных об этих белках. Однако, из-за методических различий и при больших количествах анализируемых признаков встречаются трудности при сопоставлении результатов. Вероятно, проведение некоторой унификации в технологии анализа дало бы возможность преодолеть выявившиеся затруднения.

Вместе с тем, значительный потенциал рассматриваемого подхода остается пока неполностью задействованным. Например, при достаточно высоком уровне разрешения сравнение белковых спектров разных клеточных линий, относящихся к лимфоидному ряду, могло бы позволить охарактеризовать как специфику диф-ференцировкк по лимфоидному типу, так и вариабельность этой дифференцировки, обеспечивающую различия между клеточными линиями. Вполне актуальными представляются также поиски новых полиморфных белков, белков-маркеров действия генотокси-ческих агентов (в частности, ионизирующих излучений) и белков, экспрессия которых изменяется при генетически обуслов-

ленных заболеваниях.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение комплекса наиболее представленных продуктов генной экспрессии в лимфоцитах периферической крови человека и клетках некоторых лимфоидных линий с использованием стратегии системного подхода, а также поиски лимфоцитарных белков, изменяющихся после воздействия на клетки малых доз ионизирующего излучения.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1. На основе метода двумерного электрофореза по О'Фар-реллу и ряда других методов охарактеризовать физико-химические свойства наиболее представленных белков лимфоцитов человека и построить усредненную схему распределения этих белков - двумерную карту.

2. Идентифицировать на двумерной карте некоторые лимфо-цитарные белки и использовать карту для выявления возможных электрофоретических вариантов белков.

3. Провести сравнительный анализ продуктов генной экспрессии (на уровне белков) в покоящихся мононуклеарах и ми-тоген-индуцированных пролиферирующих клетках.

4. Исследовать воздействие малых доз ионизирующей радиации на генную экспрессию (на уровне белков) в лимфоцитах человека и других лимфоидных клетках.

5. Изучить возможности двумерного электрофоретического анализа белков для выявления изменений генной экспрессии в мононуклеарах лиц, имеющих хромосомные аберрации.

6. Провести сравнительный анализ продуктов генной экспрессии в нескольких культивируемых лимфоидных клеточных линиях. генетический аппарат которых характеризуется специфи-

ческими особенностями.

Научная новизна работа. С помощью оригинальной модификации метода О'Фаррелла построена двумерная карта распределения 273 наиболее представленных белков лимфоцитов человека в диапазоне Мм 12,5-200 кДа и р1 4. 8-7,20. Для всех .273 полипептидных фракций определены значения молекулярной массы и изоэлектрические точки. На построенной карте идентифицировано 11 белков и выявлено несколько электрофоретических вариантов белков. Впервые представлены данные об изменениях белков лимфоцитов человека и гибридом штаммов МЬС-1 и К-48 при воздействии малых доз ионизирующего излучения. Продемонстрированы возможности использования метода двумерного электрофореза для изучения изменений генной экспрессии в лимфоцитах лиц, имеющих хромосомные аберрации. Получены также новые данные об особенностях белкового состава клеток нескольких лимфоидных линий.

Научно-практическая значимость. Предложена упрощенная и унифицированная методика для анализа двумерным электрофорезом белков в клетках лимфоидного ряда. Охарактеризован комплекс из 273 наиболее представленных белков в мононуклеарах периферической крози человека, который можно рассматривать как своеобразный "белковый портрет" этих клеток.

Построенная двумерная карта белков лимфоцитов человека открывает возможности изучать изменения белкового спектра лимфоцитов параллельно по 273 полипептиднкм Фракциям при различных физиологических и патологических состояниях.

Проведенное сравнение полипептидного состава интактных и облученных лимфоцитов позволило выявить изменения проявленности некоторых белков, характеризующие реакцию клеток на воздействия малых доз ионизирующей радиации.

Исследован состав белков лимфоцитов в семьях с делецией короткого плеча 5 хромосомы (синдром "кошачьего крика"). Для белка Е 2 обнаружена в ряду "норма-транслокация-делеция" корреляция с эффектом дозы гена, что свидетельствует в пользу предположения о локализации гена данного белка на коротком плече 5 хромосомы.

Полученные данные могут быть использованы при дальнейшем изучении белкового состава лимфоцитов человека при наследственной патологии.

Результаты работы позволяют перейти к систематическим исследованиям белков лимфоцитов крови и клеток лимфоидных линий человека с помощью метода двумерного электрофореза по О'Фаррелу.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Изучение комплекса наиболее представленных белковых продуктов генной экспрессии в монояуклеарах периферической крози человека; построение двумерной карты - схемы распределения 273 белковых фракций в координатах изоэлектрическая точка/относительная молекулярная масса.

2. Идентификация отдельных белковых фракций на двумерной карте и выявление электрсфоретических вариантов некоторых белков.

3. Показана принципиальная возможность определения изменений генной экспрессии по отдельным белкам в ответ на изменения условий культивирования клеток, воздействие малыми дозами ионизирующих излучений, а также в клетках с хромосомными аберрациями при наследственной патологии (делеция короткого плеча хромосомы 5).

4. При сравнении белковых наборов в 8 культивируемых клеточных линиях, относящихся к лимфоидному ряду и различаю-

щихся по кариотипу и происхождению, выявлены определенные особенности функционирования генетического аппарата (генной экспрессии).

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись и обсуждались на Российском научном симпозиуме "Экологические факторы и кроветворение"(Москва, 1992). III конференции "Геном человека" (Черноголовка, 1993), IV конференции " Геном человека-94" (Черноголовка, 1994), Intern.Meeting "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes" (Siena, Italy, 1994), I (III) Российском съезде медицинских генетиков (Москва. 1994), I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов. 1994), на Ученом Совете НИИ генетики человека МГНЦ РАМН (1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, заключение. список литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована 9 таблицами и 24 рисунками. Список литературы содержит 224 источника, включая 183 работы зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе использовали препарата лимфоцитов человека, которые получали фиколл-верографиновым методом из крови здоровых доноров (п = 30). Кроне того, изучались препараты лимфоцитов из крови пациентов с синдромом "кошачьего крика" и их ближайших родственников. Цитогенетическая диагностика была выполнена к.б.н. Л.Я.Левиной. Клетки 8 лимфоидных культивируемых линий были выращены на стандартных средах к.б.н. Г.Б.Раевской. Автор выражает им огромную благодарность за любезное предоставление материалов исследований и участие в данной работе.

Экстракцию белков из лимфоидных клеток и проведение двумерного электрофореза выполняли по методу О'Фаррелла (1975) с определенными модификациями (Ковалев Л.И. и др. ,1986; Tsvetkova M.N. et al., 1S91).

Детекцию белков после проведения электрофореза осуществляли окрашиванием кумасси голубым R-250 (Fairbanks G. et al.. 1971), азотнокислым серебром (Blum Н.,1984). Иммунохими-ческую детекцию белков проводили пероксидазным методом (Tow-bin Н. et а!..1979). Злектроблоттинг белков на инертную матрицу Immobilon Р выполняли полусухим методом (Matsudaira Т..1987) с некоторыми модификациями (Tsvetkova M.N. et al., 1991).

Денситометрирсвание двумерных электрофореграмм проводили на лазерном денситометре фирмы "LKB Pharmacia" (Швеция) "UltraScan XL" в комплексе с IBM РС/АТ-386 используя пакет программного обеспечения "GeiScan XL" версия 2.1 и пакета программ "GelV'iew" (Ефимочкин А.С., Россия).

При статистической обработке использовали общепринятые

методы (Урбах В.Ю. ,1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Построение схематизированного распределения полипептидных фракций лимфоцитов (двумерной карты).

Полученные электрофореграммы белков лимфоцитов человека характеризовались высокой воспроизводимостью распределения фракций. Для построения двумерной карты были проанализированы 50 электрофореграмм от 30 здоровых доноров. В наших условиях удалось обнаружить значительное число лимфоцитарных белков (ЛБ) с молекулярными массами более 150 кБа, фракционирование которых обычно затруднено (рис.1).

В итоге было определено 273 постоянно встречающиеся Фракции на электрофореграммах ЛБ, что дало возможность построить усредненную схему их взаимоположения - двумерную карту (рис.2). Все детектируемые фракции по координате молекулярной массы находились в диапазоне 12,5-200 кОа. и по координате pi 4,80-7,20.

В соответствии со стратегией системного подхода к анализу белковых продуктов генной экспрессии после построения двумерной карты была предпринята работа по идентификации на ней различных белков.

Результаты коэлектрофореза с белками миокарда человека, а также данные определения величин Мм и pi позволили установить принадлежность ряда детектируемых фракций известным белкам: фракция В 53 была определена как альбумин, пятна Е 18 и Е 19 как соответствующие изоформам актина, пятно F 15 -глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназа. а пятно I 3 - а В-кристаллин. белок, связующий жирные кислоты - фракция Н 17. А 3 - белок теплового шока (hsp), Д 4 - циклин (К 9218 по каталогу Cells); Д 8 - тропомиозин.

и

изо>

20-цу-

¿"'7 ¿0 6Г 7.1 75" рН

Рис.1. Двумерная электрофореграмма белков лимфоцитов человека. Окрашивание кумасси голубым И-250. Слева - стандарт молекулярной массы (лизат сердца мыши). Внизу обозначены пределы градиента рн. Стрелками показано направление ИЭФ (по горизонтали) и направление разделения белков по молекулярной массе в присутствии БОБ (по вертикали).

» .

ч и

I _ "¿г

, 11 ! й I

а » - -ц . I» &____^ -

—

ДгХ.

Рис.2. Двумерная карта белков лимфоцитов человека. По оси абсцисс - пределы градиента рН, по оси ординат - молекулярная масса Мм. Латинские буквы обозначают участки электрофо-реграмм. арабские цифры - номера пятен в них.

Используя моноклокальные антитела против Ca/Mg-зависит мой ДНК-эндонуклеазы ядер лимфоцитов человека при иммунобло-тинге наблюдали положительный ответ для фракций А 6 и В 40.

При сравнении злектрофореграмм белков лимфоцитов и выделенных ядер лимфоцитов к ядерным белкам можно было отнести некоторые из фракций, представленных на двумерной карте - Е 60, Е 66, Н 13 и В 62. а также фракцию Е 19 (актин).

2. Изучение межиндивидуальной вариабельности полипептидного состава белков лимфоцитов человека (электрофорети-ческие варианты) и влияния условий культивирования на белковый состав.

Построенную двумерную карту белков лимфоцитов человека предполагалось использовать для оценки функционирования генетического аппарата и протекания биологических процессов в лимфоцитах человека. Из 273 анализируемых белковых фракций были выявлены межиндивидуальные различия электрафоретических свойств и количественной представленности для 10 из них.

На рисунке з представлены варианты белков, которые отличались либо качественно, либо количественно от типичного распределения. Например, только у 25 человек из 30 доноров присутствует белковая фракция В 60 (рис.ЗБ). Вариабельность количественной представленности трех белковых фракций Е 31. Е 41 и Е 44 наглядно видно ка рис.ЗГ. В образцах от I к III при сохранении неизменяющейся фракции Е 40 наблюдается выраженное уменьшение пятна Е 31 и увеличение пятна Е 41, при этом фракция Е 44 практически полностью исчезает. Аналогично были обнаружены варианты изменений количественной представленности для фракций Е 71, Е 64 и Е 59, что отображено на рис. ЗД.

Использование лимфоцитов для решения многих эксперимен-

А

Б

В

/ О I у-■г- ■ Е31 клл'

1 п 1 с / Е 59 / Е64/«» / Е71

Е ;»' ч» У/

Рис.3. Злектрофоретические варианты полипептидных фракций: А - отсутствие-появление пятна 8 4; Б - варианты по молекулярной массе пятна В 60; В - количественные изменения пятна Е 9; Г - перераспределение белкового материала в пятнах Е 31, Е 416 Е 44; Д - фенотипы изменений белков Е 59, Е 64 и Е 71; Е - появление дополнительного пятна В 15а (варианты обозначены стрелками).

тальных задач предполагает культивирование этих клеток в различных условиях.

В частности, широко применяется культивирование лимфоцитов в средах, содержащих 5-10 % фетальной сыворотки, а также стимуляция клеток фитогемагглютинином (бласттрансфор-мация). При сравнении полученных 2ЭФ наборов ЛБ, экстрагированных из свежевыделенных лимфоцитов и клеток после культивирования в среде с Фетальной сывороткой были обнаружены изменения по некоторым из белковых пятен. Они касались, например. количественной представленности фракции В 53 (альбумин) и вероятнее всего могут являться следствием присутствия сывороточных белков в препаратах ЛБ или избирательного накопления некоторых из сывороточных белков. Эта вариабельность практически не наблюдалась при культивировании лимфоцитов в бессывороточной среде. При сравнении лимфоцитов, культивировавшихся в присутствии митогена отмечались резкие изменения по четырем белкам, которые могут являться соответственно маркерами бласттрансформации при дальнейшей их идентификации (пятна).

3. Исследование белкового состава лимфоцитов человека при воздействий малых доз ионизирующей радиации. Поиск белковых маркеров адаптивного ответа.

Имеющиеся результаты в литературе по изучению белкового состава лимфоцитов человека методом двумерного электрофореза и по анализу влияний какого-либо рода воздействий, как правило, выполнялись на бласттрансформированных лимфоцитах, характеризующихся повышенным уровнем синтеза ДНК. В данной работе исследование воздействия ионизирующей радиации проведено путем сравнения свойств лимфоцитов, полученных от двух доноров.

Для оценки бласттрансформации лимфоцитов к культивируемым клеткам вносилось в лунку 40 кБк [3К)-тимидина (2*Ю5 клеток в лунку, ФГА - 1 мкг в лунку). Контроль - клетки без ФГА.

В ходе двумерного электрсфоретического анализа удалось выявить ряд белковых фракций, проявляющих корреляцию с воздействием малых доз ионизирующей радиации. Найденные варианты представляли собой белковые пятна средней и малой интенсивности.

Таким образом, при сравнении спектра белков облученных и необлученных лимфоцитов выявляются 5 белков - Е 41, Е 36 а, Е 25, Е 23, В 18, усиливающие свою представленность, а также появляются новые белки Е 24 а, Г 3. Все изменения обнаружены в группе минорных по представленности фракций и. по-видимому, по этой причине их не удалось выявить при одномерном электрофоретическом анализе.

Ассоциированными с облучением фракциями оказались 7 пятен - 4 увеличение представленности (Е 50,Е 27. Е 29,В 31), уменьшения у 1 - Е 46, появление 2-х новых белков - в квадрате Е и Г 4а. Три варианта оказались идентичными с найденными на интактных лимфоцитах и, очевидно, являются наиболее существенными в адаптивном ответе (рис.4).

4. Особенности состава белков лимфоцитов человека при хромосомной патологии и их использование для генетического картирования.

Проведенное изучение лимфоцитарных белков и построение для них двумерной карты позволило начать исследования ЛБ у пациентов с хромосомными аберрациями в целях генетического картирования. 2ЭФ-анализ ЛБ пациента с синдромом "кошачьего крика" (деледая короткого плеча хромосомы 5), а также ЛЕ од-

- 1Л1 » ' № 2ГГ ^ у

/ ________ м * :

------- £ у ж

"•А 3 а

« * ~А . J 8

" У ' «а» д V

Рис.4. Фрагменты двумерных электрофореграмм с белками, демонстрирующими корреляцию с облучением. Культивирование в присутствии ФГА. Слева - контроль, справа - облученные лимфоциты. Стрелками обозначены пятна, проявляющие изменения.

ного из его родителей, имевшего транслокацию короткого плеча хромосомы 5, показал значительное сходство с препаратами ЛБ здоровых доноров. На этом фоне были обнаружены и некоторые различия (рис.5). Особый интерес среди них привлекли изменения Фракции Е 2 (рис.5 А). Визуально и по результатам компьютерной денситометрии изменения количества фракции Е 2 в целом соответствовали "эффекту дозы гена". Вероятно, снижение представленности Е 2 при транслокации может быть обусловлен-но уменьшением экспрессии соответствующего гена после транслокации участка хромосомы 5. Таким образом, возможно, что ген. кодирующий белок Е 2, локализуется на коротком плече хромосомы 5.

Также детектировалось появление нового белка с Мм/р1 39,0/5,30 в случае пациента с делецией.

Во второй семье с наличием ребенка с синдромом "кошачьего крика" с нормальным кариотипом родителей изменения по появившемуся белку Мм/р1 39,0/5,30 также детектировались, что можно посчитать специфичным для делеции короткого плеча хромосомы 5.

При сравнении белков лимфоцитов у матери со сбалансированной транслокацией (13:20) и у ребенка с трисомией по хромосоме 20 материнского происхождения с кариотипом 47,XX,+йег20, г(13;20) (13р20я) отмечена корреляция с появлением белка Мм/р1 32, 0/5.0.

5.Изучение белковых продуктов генной экспрессии в культивируемых клеточных линиях лимфоидной природы.

Существование стабильных культивируемых клеточных линий лимфоидной природы, различающихся по ряду свойств (по своему происхождению, по принадлежности к Т- или В-ряду, по карио-логическим характеристикам, хромосомному набору, по способ-

Рис.5. Фрагменты двумерных электрофореграмм белков лимфоцитов: А - представляющие изменения белка Е 2 ( 1 - норма, 2 -делеция, 3 - транслокация); Б - компьютерная денситометрия данных зон; В - пример появления-усиления белка с Мм/р! 39.0/5,30.

ности к продукции разных типов иммуноглобулинов, по природе клеточной трансформаций), открывает широкие возможности для изучения особенностей функционирования генетического аппарата. С одной стороны, наличие в таких разных клетках определенного общего белкового паттерна могло бы интерпретироваться. как объективная характеристика, отражающая лимфоидный тип клеточной дифференцировки. С другой стороны, вероятно, при удачном формировании панели клеточных культур для соответствующих исследований белков можно надеяться на выявление белков, связанных с некоторыми специфическими клеточными функциями.

В рамках данной работы была предпринята попытка сформировать такую панель клеточных культур лимфоидной природы, часть из которых была получена из Института цитологии РАН. Кроме того, в нее включили несколько культур из коллекции МГНЦ РАМН или выведенных в МГНЦ РАМН (таблица 1).

После проведения двумерного электрофореза при окрашивании гелей кумаеси Pv-250 удается детектировать около 300 белковых фракций при анализе экстрактов из клеток культивируемой лимфоидной линии, при этом общая картина распределения имеет определенное сходство с двумерной картой белков лимфоцитов человека.

Однако очевидно, что имеются и существенные различия, детально проанализировать которые оказалось достаточно сложно. Для примера на рис.6 представлены результаты сопоставления участка двумерной карты и соответствующей области (области тубулинов и других цитоскелетных белков по данным Cells) электрофореграмм экстракта белков из клеток P.PMI-8226. Видно, что актиновые Фракции и еще ряд мажорных белков совпадают по положению и могут рассматриваться как своеобразные

Таблица 1

Лимфоидные клеточные культуры

Обозначение Видовая Происхож- Кариология Секрета

клеточной принад- дение (хромосом- руемый

линии лежность линии ный набор) продукт

ИРМ1-1788 человек

ИРМ1-8226 человек

Namalva

человек

IM9

M0LT-4

человек

человек

MLC-1

мышь

В-лимфоциты,

трансформированные

m vitro вирусом

Эпштейна-Барр

миеломные

клетки

производные B-клеток больного лимфомой Беркита

клетки больной миеломой

клетки больного Т-клеточной острой лейкемией

клетки гибридомы. полученной слиянием клеток миело-мы и спленоцитов мыши

стабильный мужской гипо-диплоидный набор

нестабильный мужской псевдотрипло-идный набор псевдогиподип-лоидный набор, модальное число 44

стабильный женский диплоидный набор

нестабильный

гипертетра-

плоидный

набор.

модальное

число 95

псевдо-

тетраплоидный

набор

модальное

число 84-88

Ig M Ш

Х-цепь

моно-

кло-

нальные

AT ТИПЕ

Ig M Ig G (ae)

нет

моно-

кло-

наль-

ные

AT

Igß(X)

К-48 мышь __»«__ __«»__ АТ против

неидентифи-цкрозанного АГ лимфоци-

..________________тов человек

алр о^о-

ваУ?

V у Ц^

53

19 Ш , «

^ц . . . .... . т

— — у

- ё

I та

РЯ

X.

О

— о

О

ад» —

—■«яв»

-■О

Рис.6. Участок двумерной карты белков лимфоцитов человека (А) и схемы соответствующей области электрофореграмм экстракта белков из клеток ЕРМ1-8226 (Б) и ЙРМЫ788 (В).

реперные точки.

Вместе с тем, количественная представленность даже некоторых реперных фракций заметно вариирует. Кроме того, отдельные фракции лимфоцитарных белков, нанесенные на карту, не выявлялись среди белков клеток линии НРМ1-8226, а ряд белков этих клеток отсутствовал в экстрактах лимфоцитов.

Соответствующая область электрофореграмм белковых экстрактов из клеток 1?РМ1-1788 оказалась более сходной с данными для 1?РМ1~8226, чем для лимфоцитов здоровых доноров. Различия белковых составов наблюдались между всеми исследованными клеточными линиями. Однако, можно было отметить, что практически у всех лимфоидных линий, в отличие от лимфоцитов здоровых доноров, имеется характерное распределение белковых фракций в тропомиозинозой области. Кроме того, у клеточных линий, относящихся по происхождению к В-ряду. выявлялись два белка (имеющие, правда, вариирующую количественную представленность) с Мм/р1 - 56,0/5,37 и 54,4/6,09, которые отсутствовали и в лимфоцитах здоровых доноров и в клетках, относящихся к Т-ряду (МОЫ-4).

Сравнение электрофореграмм белков из клеток человеческого и мышиного происхождения позволило предположить видовую специфичность отдельных белковых фракций. Таким образом, двумерный электрофоретический анализ белков культивируемых лимфоидных клеток может ответить на различные вопросы об особенностях функционирования в них генетического аппарата. Однако, такая работа требует детального компьютерного анализа электрофореграмм и существенного расширения панели лимфоидных клеток.

В отдельной серии экспериментов была сделана попытка использовать лимфоидяые клеточные линии в качестве модельной

тест-системы для выявления эффектов от действия малых доз ионизирующего излучения.

Было проведено сравнение полипептидного состава гибридом штаммов МЬС-1 к К-48 при облучении в 2 сГ и 10 сГ и контрольных образцов, культивировавшихся в тех же условиях. Детекция белков проводилась, используя окрашивание кумасси голубым И-250 для МЬС-1 и К-48 . а для МЬС-1 также и мечение [358]-метионином (культивирование 5 ч).

Анализируемый спектр белков у штаммов МЬС-1 и К-48 был практически идентичен. Зависимость от дозы облучения наблюдалась только по нескольким фракциям для обоих штаммов и при разных способах детекции.■ изменения характеризовались появлением дополнительной Фракции рядом с актином при облучении 10 сГ, хотя менее выраженное количество видно и при облучении 2 сГр, увеличение количественной представленности белка 50 кДа. увеличение количественной представленности белка 30 кДа при дозе облучения в 10 сГ.

Хотя гибридомные клетки, несущие часть генетического материала лимфоцитов имеют довольно выраженное сходство по полипептидному.составу с лимфоидными клетками, тем не менее результаты воздействия ионизирующей радиации дают отличный спектр изменений по сравнению с лимфоцитами, что возможно обусясвленно особенностями фракционирования генетического аппарата гибридомных клеток, и, соответственно, другим механизмом адаптивного ответа.

выводы

1.Ha основе проведения двумерного электрофоретического анализа в лимфоцитах человека охарактеризован комплекс из 273 наиболее представленных белковых продуктов генной экспрессии, отражающих особенности функционирования генома в этих клетках:

а) построена двумерная карта - усредненная схема распределения 273 белковых фракций в координатах изоэлектричес-кая точка/молекулярная масса;

б) обнаружены электрофоретические варианты у 10 белковых фракций;

в) с помощью коэлектрофореза и иммуноблоттинга идентифицировано И белков, среда которых актин, изоформы тропоми-озина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеиаза и другие;

г) выявлены четыре белковых продукта, экспрессия которых резко меняется после активации лимфоцитов митогеном (фи-тогемагглютининсм).

2. Показано, что после воздействия малых доз ионизирующего излучения in vitro на лимфоциты и некоторые другие лим-фоиднье клетки, в них изменяется представленность ряда белков, что может быть следствием изменения экспрессии соответствующих генов.

3.Определены возможности применения анализа белковых продуктов генной экспрессии в лимфоцитах человека для генетического картирования и изучения нарушений синтеза белков при хромосомных аберрациях. При исследовании белкового состава лимфоцитов в семье с делецией короткого плеча хромосомы 5 (синдром "кошачьего крика") обнаружена для белка Е 2 с Мм/р1 51,0/5,70 в ряду "норма-транслокация-делеция" корреляция с эффектом дозы гена, что позволяет предположить локали-

зацив соответствующего гена на коротком плече хромосомы 5. При сравнении белков лимфоцитов у матери со сбалансированной транслокацией (13;20) и у ребенка с трисомией по хромосоме 20 материнского происхождения с кариотипом 47. XX, +der20, t(13; 20) (I3p20q) отмечена корреляция появления белка 32,0 кДа/р1 5,0 с хромосомными нарушениями.

4.Показано, что генная экспрессия в культивируемых лим-фоидных клеточных линиях (8 штаммов, различающихся по происхождению. кариотипу, и другим характеристикам) обладает специфическими особенностями, которые выявляются при анализе белкового состава клеток двумерным электрофорезом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Лукашова И.В., Ковалев Л.И. Изменения белкового состава лимфоцитов человека при воздействии малых доз ионизирующей радиации.// Тез.докладов Российского научного сим-, позиума "Экологические факторы и кроветворение". М.. 1992, с. 72-73.

2. Ковалев Л. И., Лукашова И. В., Ефимочкин А. С.. Шишкин С.С., Захаров С.Ф., Кухаренко В.Н., Левина Л.Я. Использование системного подхода к изучению белковых продуктов генной экспрессии в исследованиях генома человека. III Изучение белков в клетках пациентов с синдромом "кошачьего крика" (5р-). /У Тез.III.конф. "Геном человека". М. 1993. с. 73.

3. Ковалев Л.М., Худайдатов А.И., Ефимочкин А.С., Радько С. П., Шишкин с. е., Лукашова A.B. Анализ продуктов генной экспрессии в мышечных тканях человека с целью их идентификации и использования для поиска новых генов.// Тез. 4 конф. "Геном человека-94", М. 1994. с. 36.

4.Лукааова И.В., Ковалев Л.И.. Ефимочкин A.C., Шишкин

С.С. Изучение белков лимфоцитов человека с помощью двумерного электрофореза. // Биохимия. 1994. т.59. N 5. с.663-674.

б.Лукашова И.В., Ковалев Л.И. Сравнительное изучение особенностей генетической экспрессии в лимфоцитарных клетках человека.// Материалы 1-ого съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС). 1994. Генетика, т. 30 приложение, с. 91.

б.Лукашова И.В., Ковалев Л.И., Левина Л.Я., Антоненко В. Г., Раевская Г. Б.. Шишкин С. С. Особенности генной экспрессии в лимфоидных клетках человека.// Тезисы докладов I (III) Съезда медицинских генетиков. М. 1994.

7.Shishkin S. S.. Kovalyov L.I., Lucashova I.V., Ershova E.S., Chudaidatov A.I., Musolyamov A.Kh., Egorov Т.Д., Shilov A.G., Kucharenko V.I. Two-dimensional electrophoresis and microsequence analysis of proteins in Russian human genome project.// "2D Electrophoresis: from protein maps of genomes". 1994. p.65.