Характеристика молекулярной патологии в увеальных меланомах

Манохина, Ирина Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика молекулярной патологии в увеальных меланомах
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика молекулярной патологии в увеальных меланомах"

На правах рукописи

МАНОХИНА Ирина Константиновна

ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПАТОЛОГИИ В УВЕАЛЬНЫХ

МЕЛАНОМАХ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2009 год

003470401

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека НИИ Молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Залетаев Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Шахтарин Владимир Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Журков Вячеслав Серафимович

Ведущая организация: НИИ канцерогенеза ГУ Российский онкологический

научный центр им. H.H. Блохина РАМН

А 2009 г. в

löo

Защита состоится « С » 2009 г. в /е., часов на заседании

Диссертацитонного Совета Д.001.016.01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан «О » 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.001.016.01, доктор медицинских наук, профессор

Зинченко P.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Увеальная меланома (УМ) является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью у взрослых, заболеваемость увеальной меланомой составляет 7-8 человек на 1 млн. населения в год в России, США и странах Западной Европы. УМ возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов сосудистой оболочки глазного яблока. Современные методы диагностики и лечения УМ направлены на повышение выживаемости пациентов и сохранение глаза как косметического и функционального органа.

Метастазы развиваются у значительной части пациентов с УМ. В частности, смертность в связи с увеальной меланомой достигает 53% в течение пятилетнего периода именно вследствие метастатической болезни. Несмотря на использование новейших достижений в области диагностики и лечения, этот показатель остается по-прежнему чрезвычайно высоким. Выявлены некоторые характерные клинические и гистологические факторы, совокупность которых позволяет условно разделить увеальные меланомы на более «спокойные», с невысоким риском метастазирования, и «агрессивные», для которых риск развития метастазов считается повышенным. Однако необходимость создания диагностической системы маркеров увеальной меланомы очевидна. Поиск и характеристика молекулярных маркеров диагностики и прогноза является, на сегодняшний день, одной из важнейших задач онкологии. Создание эффективных диагностических протоколов позволит в дальнейшем оценить прогноз заболевания и предпринять адекватные меры для выявления и лечения метастатической болезни у пациентов с увеальной меланомой. Необходимым этапом создания системы молекулярных маркеров УМ является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных увеальных меланомах.

Настоящая работа посвящена изучению структурных и функциональных генетических нарушений в увеальных меланомах, а также оценке диагностической значимости этих изменений как потенциальных маркеров УМ.

Актуальность работы определяется следующими факторами:

1). Увеальная меланома является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью у взрослых, составляющей 12% от меланом всех локализаций, однако молекулярные механизмы ее патогенеза к настоящему моменту изучены недостаточно.

характерных молекулярных нарушений в увеальных меланомах может быть ассоциирован с опухолевой прогрессией и развитием метастазов.

3). Молекулярные методы диагностики увеалыюй меланомы в настоящее время в отечественной лабораторной практике не используются, хотя успешно применяются в медицинских центрах за рубежом.

Целью настоящей работы является анализ молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием увеальной меланомы и изучение потенциала их использования в клинической практике для расширения возможностей диагностики, а также прогнозирования течения заболевания.

Задачи исследования:

1. Исследовать аллельное состояние микросателлитных маркеров в локусах генов-супрессоров опухолевого роста и хромосомных районах, наиболее часто делетируемых в злокачественных опухолях.

2. Определить статус метилирования промоторных районов ряда генов-супрессоров опухолевого роста.

3. На образцах УМ провести анализ молекулярных нарушений в генах и хромосомных районах, наиболее часто повреждаемых при меланоме кожи.

4. Определить ассоциации молекулярно-генетических нарушений с клинико-патологическими данными.

5. Оценить возможность использования тонкоигольной аспирационной биопсии для скрининга молекулярных нарушений.

Научная новизна. Настоящая работа является первым широкомасштабным молекулярно-генетическим исследованием увеальных меланом на территории Российской Федерации и направлена на поиск молекулярных маркеров увеальных меланом с перспективой создания комплексной системы диагностических и прогностических маркеров, позволяющих врачу сделать правильный выбор в отношении тактики лечения и дальнейшего наблюдения пациентов.

Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование, включающее определение не только ранее описанных молекулярных нарушений, но и изучение состояния генов и сигнальных каскадов, связанных с регуляцией клеточного цикла, клеточной прогрессией и дифференцировкой.

Выявлено наличие характерных для увеальной меланомы генетических и эпигенетических нарушений (потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), делеции 1р и 8р, метилирование НАЯБРЫ). В исследовании обнаружены ассоциации моносомии 3 с характеристиками агрессивного течения меланомы,

такими как эпителиоидный клеточный тип, цилиарная локализация и пигментация опухоли. Аллельные делении 1р не могут рассматриваться как патогномоничное нарушение в увеальных меланомах, однако определена их достоверная ассоциация с экстрасклеральной инвазией опухоли, снижающей выживаемость пациентов. Метилирование гена ИАБЗР/А является неслучайным изменением, обнаруженным в увеальных меланомах: его отсутствие подтверждено в условно-нормальной хориоидее тех же пациентов. Также определена его ассоциация с отсутствием аллельных потерь по маркерам ЛАББР]А в хромосоме 3.

Установлено, что основной спектр молекулярных нарушений, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной меланоме.

Практическая значимость. Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 107 пациентов с диагнозом первичная увеальная меланома. Обнаружение моносомии 3 способствует дифференциальной диагностике УМ, так как это нарушение является специфическим, не характерным для другой онкопатологии. Определена ассоциация структурных и количественных нарушений в хромосоме 3 и 1р36 с клинико-морфологическими характеристиками и факторами прогрессии опухоли, что позволит использовать анализ этих нарушений в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях УМ. Показано, что тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа пациентов с увеальной меланомой. Результаты, полученные в представленной работе, легли в основу разработки системы молекулярных маркеров УМ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому. Внедрение таких систем расширяет возможности диагностики, в том числе дифференциальной, а также позволяет определить риск метастазирования опухоли и выбрать тактику терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Моносомия 3 является специфическим хромосомным нарушением, выявляемым не менее чем в 45% увеальных меланом и определяющим агрессивное течение заболевания. Для УМ также характерны аллельные делеции в локусах 1р36 и 8р22.

2. Метилирование ЛЛЗЗТ-Ы определяется преимущественно в меланомах, не имеющих моносомии 3 и не характерно для условно-нормальной хориоидеи.

3. Молекулярный патогенез УМ и меланомы кожи различен. Для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация T1796А гена BRAF, аллельные делеции в локусе PTEN, а также потеря гетерозиготности и гиперметилирование промоторов генов пути регуляции CDKN2A —* RB1.

4. Разработаны системы ДНК-маркеров для выявления молекулярных нарушений в образцах увеальной меланомы, полученных в результате резекции опухоли и тонкоигольной биопсии.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Все исследования проведены лично автором. В ходе работы был проведен сбор материала для исследования, разработаны модификации методов выявления аллельных делеций, протоколов проведения анализа эпигенетических нарушений промоторных областей генов-супрессоров; проведен поиск мутаций, молекулярно-генетичсское исследование потери гетерозиготности и статуса метилирования исследуемых генов в образцах опухолей и нормальных тканей.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007 г. (Ницца, Франция) и 2008 г. (Барселона, Испания), конгрессе Международного общества онкоофтальмологов в 2007 г. (Сиена, Италия), Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии в дифференциальной диагностике и лечении внутриглазных опухолей» в 2007 г. (Москва), конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 году (Москва).

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику. На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика выявления специфических молекулярных маркеров увеальной меланомы» и «Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме» (поданы заявки на регистрацию новых медицинских технологий). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 153 ссылки. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа была проведена на образцах крови и операционном материале (парные образцы) 107 пациентов с диагнозом перинная увеальная меланома, предоставленных отделением офтальмоонкологии и радиологии МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца (зав. отд.: проф. C.B. Саакян). Для всех образцов УМ фиксировались следующие клинико-патологические параметры: возраст и пол пациента, вовлеченность отделов увеального тракта, диаметр основания опухоли, ее толщина, клеточный тип, склеральная инвазия, степень пигментации. Также были получены 17 образцов биопсии (6 опухолей) с соответствующими образцами периферической крови.

При хирургическом удалении поврежденного опухолью глаза (операция энуклеации) биопсийный материал опухоли и относительно неповрежденной хориоидеи, а также образцы периферической крови (консервант: 0.5М раствор ЭДТА) сохраняли при -20°С. Для исследования образцов ТИАБ материал собирали с цитологических препаратов.

Геномную ДНК из образцов опухолей, условно нормальной хориоидеи и периферической крови выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. При выделении ДНК из цитологических препаратов собранный со стекла материал обрабатывали лизирующим буфером, содержащим протеиназу К и полученный лизат использовали в качестве матрицы для постановки ПЦР.

Потерю гетерозиготности (ПГ) в хромосомных районах 1р36, 1р31.3, 3р25.3, 3р21.3, Зр14.2, 3ql2, 3q26.3, 3q28, 8р22, 9(р21.2-р21.3), 10(q23.2-q23.3), 13ql4 идентифицировали с использованием высокополиморфных маркеров D1S243, D1S2145, D1S1635, D1S407, D1S3669, D1S438, D3S1038, D3S1317, D3S1568, D3S966, D3S1300, D3S1234, D3S2459, 3q26.31J6xTG, D3S3520, D3S2398, D8S1731, D9S942, D9S2136, D9S169, D10S1765, RBlint2, RBlint20. Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови.

Для выявления стандартной мутации Т1796А (V600E) гена BBAF использован метод специфической амплификации мутантного аллеля ARMS (Amplification Refractory Mutation System) и выбрана схема полугнездной ПЦР, в которой два праймера (BRAF15F и BRAF15R) отжигаются на интронньк последовательностях, фланкирующих 15 экзон BRAF, а третий (внутренний, BRAF15m) соответствует мутантному варианту Т1796А.

Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей генов применяли метод метил-чувствительной полимеразной цепной реакции. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК из клеток УМ, предварительно гидролизованную рестриктазами Hpall (для генов CDKN2A, RASSFIA, RBI, MLH1) или Hha\ (для генов FI ИТ и VHL).

Программное обеспечение: выявление микросателлитных районов, подбор маркеров, определение генов, расположенных в делегированных регионах проводили с использованием баз данных UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), Ensembl Genome Databases (http://www.ensembl.org), BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), NCBI UniSTS

(http://ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=unists); конструирование олигонуклеотид-ных праймеров и подбор условий для ПЦР проводили с использованием программы РптегЗ Input 0.4.0 (http://frodo.wi.mit.edu).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Пациентов делили на группы по клиническим критериям и сравнивали в этих группах частоты аллельных потерь по каждому локусу с помощью точного критерия Фишера и критерия % - квадрат. Сравнение средних величин внутри каждой из групп, разделенных по наличию определенных хромосомных аберраций, проводили при помощи критерия Манна-Уитни. Двусторонний /><0.05 рассматривали как статистически достоверный.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В представленную работу вошли результаты молекулярно-генетического обследования пациентов с первичной увеальной меланомой. Во всех случаях заболевание носило спорадический характер. Диагноз увеальная меланома был подтвержден гистологически в отделении патологической анатомии и гистологии глаза НИИ глазных болезней имени Гельмгольца. Работу выполняли на образцах периферической крови и операционном материале (УМ + условно-нормальная хориоидея) 107 пациентов и на образцах периферической крови и биопсийных образцах (цитологические препараты) шести пациентов.

Анализ потери гетерозиготности в УМ

Хромосома 3. Расположение микросателлитных маркеров вдоль хромосомы 3 представлено на рисунке 1. Системы из двух полиморфных микросателлитных маркеров показали высокую информативность. Если гетерозиготность отдельных маркеров составляла 39-82%, то система из двух маркеров имела информативность 80-94%.

Рисунок 1. Расположение микросателлитных маркеров вдоль хромосомы 3. Линиями обозначены наименьшие области перекрывания делеций (SRO) по результатам исследований различных авторов. (Tschentscher et al., 2001, Parella et al., 2003, Cross et al., 2006).

Потеря гетерозиготности по маркерам хромосомы 3 определена в 51 (47,6%) из 107 исследованных меланом, из них 48 (45%) имели ПГ по всем информативным локусам хромосомы 3, что, в свете информации о характерных молекулярных нарушениях УМ, рассматривалось как «функциональная моносомия 3» (потеря одной копии хромосомы 3 или изодисомия).

Свидетельство наличия структурных нарушений в хромосоме 3, определявшихся как потеря гетерозиготности по одному или нескольким маркерам при сохранении гетерозиготности по остальным, было выявлено только в трех опухолях. В одном случае потеря гетерозиготности определялась по всем микросателлитным маркерам, расположенным в Зр, а в двух других случаях потеря гетерозиготности имела место только для маркеров, расположенных в локусе FHIT (D3S1234 и D3S1300). Оба маркера, использованных в работе, локализовались внутригенно по отношению к FH1T, супрессорная активность которого была подтверждена в исследованиях in vivo и in vitro (Pekarsky et al., 2002).

Выявленный участок потери гетерозиготности локализуется в области перекрывания делеций 3р13-3р14.2, описанной в одной из работ (Tschentscher et al., 2001). В этом локусе расположены также несколько транскрипционных факторов, включая MITF, который принимает участие в дифференцировке

VHL RASSF1Á FH1T

TNFSF10

меланоцитов нервного гребня и клеток пигментного эпителия сетчатки и может, наряду с FHIT, рассматриваться как ген-кандидат в патогенезе УМ.

Короткое плечо хромосомы 1. Расположение микросателлитных маркеров вдоль 1р представлено на рисунке 2. Информативность маркеров составила соответственно DLS438 - 57%, D1S3669 - 73,1%, D1S407 - 76,9%, DJS1635 - 60%, D1S2145 - 77,8%, D1S243 - 81,7%. Потеря гетерозиготности по маркерам, локализованным на коротком плече хромосомы 1, определена в 32 (29,9%) образцах.

В 25 (23,4%) образцах ПГ была определена по всем информативным маркерам 1р36. Для этих образцов маркер D1S438 (1р31.3) также выявил ПГ в 11/25 случаев (в 1/25 случаев маркер был гетерозиготен и в 13/25 был не информативен), то есть, скорее всего, большинство выявленных нарушений представляют собой крупные хромосомные потери, захватывающие большую часть 1р.

Рисунок 2. Расположение микросателлитных маркеров короткого плеча хромосомы 1. Линиями обозначены SRO по результатам исследований различных авторов. (Hausler et al., 2005, Kilic et al., 2005).

Наибольшие частоты аллельных потерь определены для маркеров, расположенных в наиболее дистальных из изучаемых локусов (D1S2145 (1р36.31) и DIS243 (1р36.33)). В области 1(р36.22-р36.31) локализуются некоторые гены-су прессоры опухолевого роста, например TNFR2 (tumor necrosis factor receptor 2) и APITD1 (apoptosis-inducing, TAF9-like domain 1), а в локусах l(p36.31-pter) -CDC2L1 (cell division cycle 2-like 1) и TP73 (tumor protein p73). К настоящему моменту нет достоверных данных, которые подтверждали или опровергали бы возможность участия большинства из этих генов в патогенезе увеальных меланом.

В двух образцах меланом ПГ определена только по маркеру DJS438, расположенному в локусе 1р31.3, наиболее центромерно по отношению к другим маркерам.

Рисунок 3. Пример микросателлитного анализа для образцов увеальной меланомы с использованием нескольких микросателлитных маркеров.

ПГ - потеря гетерозиготности по указанному маркеру, гет. -маркер гетерозиготен (потери гетерозиготности нет), гом. -маркер гомозиготен (не информативен).

8р22. Частота аллельных делеций в локусе 8р22 составила 35,9%. Использованный в работе микросателлитный маркер D8S1731 локализуется на 160 т.п.н. дистальнее гена-супрессора TUSC3 (N33). Гетерозиготность маркера составила 0,673. Hughes et al. (2005) заявляли о наличии делеций в локусе 8р23.3-pl 1.23 в меланомах с моносомией 3. Onken et al. (2008) указывают на минимальный делегируемый участок 8р12-р22, и ген-супрессор LZTS1 (8р21), делеции которого ассоциируются с повышенными инвазивными свойствами и миграцией клеток увеальной меланомы.

Сигнальный каскад CDKN2A —> RB1. Микросателлитные маркеры, использованные в работе (RBint2, RBint20), локализовались внутри гена RB1. Аллельных потерь в локусе 13ql4 (RBI) не обнаружено, информативность системы маркеров составила 100%.

Микросателлитные маркеры 9р21 (D9S2136, D9S942) располагались во фланкирующих участках гена CDKN2A, а также в одном из соседних с CDKN2A локусов (D9S169). Информативность системы маркеров D9S2J36, D9S942 составила 95,3%, маркер D9S169 был информативен в 77,5% случаев. ПГ по всем маркерам 9р21.2-р21.3 была выявлена в двух образцах. В одном образце ПГ была выявлена только по маркеру D9S942 (D9S2J36 гомозиготен, D9S169 гетерозиготен). ПГ в локусе 9р21.2, при сохранении гетерозиготности маркеров D9S942 и D9S2136, фланкирующих ген CDKN2A была выявлена в двух образцах. На основании полученных результатов можно считать, что аллельные делеции в генах пути регуляции CDKN2A —* RB1 не являются основным механизмом в патогенезе увеальной меланомы.

Ш198 UK99 ЩЦ00 ЦИ101

, ЛЧР) /ПС

UibiQjj

ПГ гет. гет. ret

ШЩЩ. ..... DIS438

Ш тШШ0 ■ -

ПГ гех гет. ret

D3S3520

ret ПГ гом. гет.

iff !S94a 16xTG_3p26.31

ret ПГ ГОМ. гом.

- p щ i iliiiiS ' - Л' : ' : ■ i: i ■ <$SD10S17S5

ГОМ. rat ret ret

S3 .. .. ... - - ийиЯИ IJD9S942

Тта. гет. т. m

FTEN является геном-супрессором канцерогенеза с широким спектром регуляторной активности. Район 10q23 является вторьм по частоте локусом, подверженным перестройкам в меланомах кожи, а также часто повреждается в ряде других злокачественных опухолей. Информативность маркера D10S1765 составила 63,5%, аллельных потерь в локусе PTEN выявлено не было (0/68).

Анализ метилирования в УМ

Хромосома 3. Метилирование промоторной области RASSF1A было определено в 26 (24,3%) образцов (рис. 4). Метилирование RASSF1A не обнаружено в ткани условно нормальной хориоидеи. RASSF1A располагается в локусе р21.3 хромосомы 3, наиболее часто повреждаемой в клегках увеальной меланомы, спектр его супрессорного действия чрезвычайно широк и включает регуляцию клеточного цикла в фазе G,/S (Song et al., 2004).

Рисунок 4. Анализ метилирования методом метил-чувствительной полимеразной цепной реакции, (а) Наличие ПЦР-продукта с длиной 347 п.н. свидетельствует о метилировании промоторной области гена RASSF1A в образце, (б) внутренний контроль ПЦР, «+», положительный контроль - продукты ПЦР с негидролизованной ДНК, «-», отрицательный контроль - отсутствие ДНК, pUC/MspI-маркер молекулярной массы.

50 51 52 53 54 55 + - pUC/Mspl

(а)

(б)

Анализ метилирования не выявил изменений для генов FHIT, VHL и MLH1, также локализованных в хромосоме 3.

Сигнальный каскад CDKN2A-+RB1. В качестве причины инактивации CDKN2A кроме ПГ рассматривалась возможность гиперметилирования его промоторной области. В нашем исследовании метилирование CDKN2A выявлено только в 5 образцах (4,7%) и не было обнаружено ни одного случая гиперметилирования промоторной области RB1.

Поиск мутаций

Поиск активирующей мутации гена BRAF проводился с помощью аллель-специфичной ПЦР и не выявил искомую мутацию ни в одном случае (0/60). В

одной из работ отмечалось, что мутация может присутствовать в отдельных клетках УМ наряду с неповрежденным геном в 20-40% опухолей (Janssen et al., 2008). Вследствие этого можно предположить, что мутация BRAF все же не является важным элементом патогенеза УМ, а может возникать на поздних этапах канцерогенеза в отдельных клонах опухолевых клеток.

Профиль молекулярной патологии в исследованных образцах УМ

Молекулярные нарушения, выявленные в выборке из 107 увеальных меланом, представлены в таблице 1.

__Таблш{а 1.

Хромосома Локус Микроса-теллитные маркеры Аллельные потери Ген-кацдидат Метилирование про-моторной обл. гена

ПГ по всем инф. маркерам ПГ в отдельных локусах

1 1р36.33 1р36.31 1р36.22 1р36.21 1р36.12 D3S243, D1S2145 D1S1635, D1S407, D1S3669 25/107 (23,4%) 5/102* -

1р31.3 D1S438 2/61*

3 3р25.3 D3S1038, D3S1317 48/107 (45%) 1/107 VHL 0/107

3р21.3 D3S1568, D3S966 RASSF1A 26/107 (24,3%)

Зр14.2 D3SI300, D3S1234 2/100* FHIT 0/107

3ql2 D3S2459 -

3q26.3 D3S3520 3q26 16xTG TNFSF10

3q28 D3S2398

8 8р22 D8S1731 23/64* (35,9%) -

9 9р21.3 9р21.2 D9S942, D9S2136, D9S169 2/107 1/102* CDKN2A 5/106 (4,7%)

2/83*

10 10q23.2-q23.3 D10S1765 0/68* PTEN -

13 13ql4 RBlint20, RBlint2 0/107 RB1 0/107

* Только информативные маркеры или системы из двух маркеров в указанном локусе

Для изучения ассоциации между различными молекулярными нарушениями в увеальной меланоме был использован точный критерий Фишера.

Было определено, что опухоли с ПГ по всем информативным локусам (в т.ч. 3р21.3) хромосомы 3 редко демонстрируют метилирование промоторной области гена ЯЛББРЗА (ОР = 0.16 (0.05-0.44 для 95% доверительного интервала). Из 107 изучаемых опухолей 46 имели только моносомию 3 (или делецию Зр), 23 - только метилирование КАББРМ и только 3 опухоли характеризовались наличием обоих нарушений. То есть можно предположить, что гиперметилирование промоторной области Ане является вторым «ударом» в классической «двухударной теории канцерогенеза», предложенной Кнадсеном, а представляет собой скорее альтернативный механизм инактивации гена в увеальных меланомах. В целом, инактивация МБЗРЫ путем ПГ или метилирования промоторной области гена было выявлено в 67,3% (72/107) опухолей. Высокая частота инактивации ЯАЗБРЫ позволяет рассматривать её как одно из важных нарушений в патогенезе УМ.

Мы не выявили ассоциации между моносомией 3 и перестройками в коротком плече хромосомы 1 и 8. Подобные ассоциации были обнаружены й а1. (2004) и представлены как часть теории «эволюции кариотипов меланом». Согласно этой теории, меланома кожи и увеальная меланома имеют сходную последовательность хромосомных нарушений, представляющую собой два пути, один их которых характеризуется потерей хромосомы 3, за которой следует делеция 1р, а другой связан с появлением избыточного хромосомного материала 6р.

Анализ ассоциаций молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах с клинико-патологическими факторами и факторами прогноза.

Ассоциации между клинико-патологическими характеристиками и молекулярными нарушениями представлены в таблице 2.

Хромосома 3. Моносомия хромосомы 3 выявила ассоциацию с наличием в опухоли эпителиоидных клеток (смешанноклеточные и эпителиоидноклеточные увеальные меланомы) (р<0,0001), а также локализацией меланомы в цилиарном теле (р=0,001). Также была выявлена ассоциация моносомии 3 с пигментацией опухоли (р=0,018). Ассоциаций с другими клиническими факторами (возраст и пол пациентов, наличие обширного отслоения сетчатки и геморрагий на поверхности опухоли) не обнаружено.

Клинико-патологические факторы ПГ по всем маркерам 1р + - р Моносомия 3 + - р метилирование + - р ПГ в +

Клеточный состав (нал. Да эпителиоидных клеток) Нет •« 5 0,4« Ш 34 °>000 12 50 0 33 14 31 ' 14 21 9 20

Средняя толщина | (мм) 9,31 9,62 0,931 9,77 9,40 0,432 9,60 9,35 0,866 9,29 9,4:

Средний диаметр . . основания t 0 123 16,6 15,6 16,5 15,4 0,152 16,5 15,7 0,247 15,3 15,<

Вовлечение цилиарного Да тела Нет 10 26 15 48 0,81 27 13 21 43 °'001 7 33 0 249 19 48 8 13 15 28

Пигментация % Слаб 9 Я 20 Ъ7 °'018 12 37 10 14 44 ',и 12 13 11 28

Экстрасклеральная Да инвазия Нет £ »•»" 10 10 0 80 38 46 °'80 5 16 21 65 *'и 2 7 21 34

Геморрагии ^ 7 19 17 53 °'795 10 19 0 185 37 35 0,185 9 21 0311 15 59 7 12 15 28

Отслойка сетчатки За Нет Ц 0,787 14 9 °'8° 21 59 0 421 4 21 17 30 6 10

Возраст | (лет) 49,3 50,2 0,894 54,7 51,2 0,093 53,8 52,3 0,78 53,6 51,<

п м Пол ж 9 30 0 814 16 44 и'И14 18 22 30 34 13 29 0 25 13 52 10 21 13 20

Представлено отсутствие (-) или наличие (+) хромосомного нарушения в клинических группах. Стаи значимые ассоциации (р<0.05) выделены жирным шрифтом. t Расчет р проводился с использованием критерия Манна - Уитни.

$ Группа слабо пигментированные включала в себя опухоли, определенные как "беспигментные" пигментированные"; группа густо пигментированные включала меланомы, определен« "пигментированные", "густо пигментированные" и "неравномерно пигментированные". * значение р, рассчитанное для любых ПГ в 1рЗб

Остается открытым вопрос о том, насколько ранним событием является потеря копии хромосомы 3 в ряду последовательных генетических нарушений при опухолевой трансформации меланоцита. В связи с тем, что большую часть представленной выборки из 107 УМ составляли опухоли стадии Т3-Т4, количество опухолей в каждой из групп по общепринятой классификации в зависимости от диаметра основания опухоли (Albert et al., 2003) оказалось неравномерным. В имеющейся выборке моносомия 3 выявлялась в опухолях из разных групп с одинаковой частотой (табл. 3,р=0,956).

Таблица 3.

Диаметр основания опухоли Нет ПГ по маркерам хр. 3 ПГ по маркерам хр. 3 (моносомия 3)

d <10mm 3/5 (60,0 %) 2/5 (40,0 %)

10<d< 15mm 19/33 (57,6%) 14/33 (42,4 %)

d>15mm 33/60 (55,0 %) 27/60(45,0%)

При использовании критерия Манна-Уитни зависимости между наличием моносомии 3 и размером опухоли также выявлено не было (р=0,152).

Хромосома 1. С помощью критерия Манна-Уитни была выявлена ассоциация аллельных потерь в 1р36 с размером опухоли. (р=0,012).

Достоверная ассоциация была обнаружена между экстрасклеральной инвазией меланомы и ПГ по всем информативным маркерам 1р36 (р=0,012). Экстрасклеральная инвазия считается характерным признаком агрессивности увеальной меланомы, и ассоциация ее с нарушениями в хромосоме 1 подтверждает ранее выдвинутую гипотезу о связи нарушений в 1р с опухолевой прогрессией (Albert et al., 2003).

Спектр молекулярной патологии в УМ и меланоме кожи

Несмотря на многочисленные доводы «за» общий патогенез увеальной меланомы и меланомы кожи (Hoglund et al., 2001, Landreville et al., 2008), анализ молекулярной патологии в УМ не выявляет тех же генетических и эпигенетических нарушений, которые характерны, в основном, для меланомы кожи.

В таблице 4 представлены ключевые каскады регуляции, повреждаемые в меланомах кожи, и сопоставлены частоты искомых молекулярных повреждений при обоих патологических состояниях.

Сигнальный Ген Повреждение Меланома Увеальная меланома

каскад кожи Данные Результаты

других нашей

авторов работы

ВЯАР Мутация УбООЕ до 70% 0,20% 0

МЕК-ЕКК ЫШ Мутация йПЯ 20% 0 -

РВК-АКТ РТЕМ Делеции 10я23 20-40% 0-10%, 75% 0

СОКЮА- СВКЫ2А Делеции до 60% 0-32% 2,8%

СЖ4-ПВ Метилирование до 10% 0-7%, 34% 4,7%

ЯВ1 Делеции 50-75% до 21% 0

Метилирование 40% - 0

рЗЗ-АЯР АКР Мутации > 40% 0 -

Таким образом, основной спектр молекулярных нарушений, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной меланоме. Естественно, что в процессе канцерогенеза различных опухолей происходит повреждение одних и тех же сигнальных каскадов, однако к настоящему моменту можно предполагать, что ключевые моменты патогенеза для этих опухолей не идентичны. Предполагается, что различия в популяциях меланоцитов кожи и увеального тракта появляются еще в период эмбрионального развития в процессе миграции предшественников меланоцитов кожи в эпителий, а меланоцитов увеального тракта - глубоко в мезодермальные ткани (Ве1таг-Ьорег й а1., 2008). Возможно, изучение путей дифференцировки этих двух клеточных популяций поможет понять причины различий в патогенезе двух опухолей.

Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики увеальной меланомы

Проблемы дифференциальной диагностики увеальной меланомы связаны с многообразием ее проявлений. С учетом полиморфности симптомов меланому приходится дифференцировать от большого количества заболеваний как опухолевой, так и неопухолевой природы. Однако полиморфизм клеток и их атипия усложняют морфологическую диагностику УМ. В этих случаях генетическое исследование может быть важным дополнением к используемым в настоящее время методам.

Для оценки состояния хромосомы 3 предлагается использовать панель из десяти микросателлитных маркеров, локализованных на обоих плечах хромосомы 3. При использовании метода для верификации диагноза УМ при выявлении

потери гетерозиготности по всем информативным маркерам (моносомия 3) делают заключение о наличии специфического молекулярного нарушения, характерного для увеальной меланомы. Однако, при получении любых других результатов, диагноз УМ не может быть отвергнут.

Клиническая чувствительность метода составляет 45-55%, так как моносомия 3 присутствует, согласно данным представленного исследования, а также данным литературы при применении различных методов (микросателлитный анализ, анализ SNP, FISH, CGH, CISH, SKY) в 45-55% увеальных меланом. Клиническая специфичность метода чрезвычайно высока в связи с тем, что, в отличие от множества других опухолей, для которых характерна потеря только короткого плеча хромосомы 3 или структурные нарушения Зр, наиболее распространенным нарушением в увеальных меланомах считается потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия 3). В связи с этим получение ложноположительных результатов маловероятно. В 10 исследованных образцах, где диагноз УМ был отвергнут при гистологическом анализе, моносомия 3 выявлена не была.

Один из образцов основной выборки в первоначальном гистологическом заключении рассматривался как метастаз, однако микросателлитный анализ выявил ПГ по маркерам хромосомы 3. При последующем гистологическом исследовании диагноз УМ был подтвержден.

Аналитическая чувствительность системы (наличие как минимум одного информативного маркера на каждом плече хромосомы 3) составляет 99,5%. Аналитическая специфичность оценивалась при использовании образцов условно-нормальной хориоидеи, где ПГ выявлена не была.

Количественные и структурные нарушения хромосом 3 и 1р36 имеют статистически достоверную ассоциацию с неблагоприятными факторами прогноза. Анализ аллельных делеций хромосом 3 и 1р36 позволит сориентировать врача в дифференциальном диагнозе и прогнозе заболевания и оценить риск возникновения осложнений и метастазирования увеальной меланомы.

В случае выявления моносомии 3 (определяется в 45-55% УМ) или делеций 1р36 делают вывод о высоком риске метастазирования первичной опухоли, что должно быть учтено при проведении скрининговых исследований. По-видимому, ассоциация моносомии 3 с развитием метастазов УМ превышаем таковую для любых других клинических или гистологических факторов. При выявлении характерных структурных нарушений в хромосоме 3 (делении в локусах Зр25,

3(р14.2-р13) и 3(я24^26), 3-5% УМ) рекомендуется также предполагать агрессивный характер течения меланомы.

Аналитическая чувствительность системы маркеров 1р36 (018243, 0182145, 0181635, 018407, В183669) составляет 99,9%. Аналитическая специфичность также оценивалась при использовании образцов условно-нормальной хориоидеи, где ПГ выявлена не была. Высокая клиническая чувствительность и специфичность определяется наличием статистически достоверных ассоциаций с агрессивными характеристиками опухоли (напр. склеральная инвазия).

Диагностика молекулярных маркеров УМ в биоптатах

Из шести УМ методом тонкоигольгой биопсии было получено 17 препаратов, в которых с помощью цитологического анализа были выявлены атипичные клетки. Этот материал был затем собран со стекол и использован для получения ДНК. Из 17 образцов биопсии, количество материала оказалось достаточным для анализа не менее чем 15 микросатсллитных маркеров в 14 случаях (78,5%).

Потеря гетерозиготности по всем информативным маркерам хромосомы 3 определена в трех из шести исследованных меланом, ПГ по маркерам 1р36 определена в одной из шести исследованных меланом.

Благодаря высокой чувствительности и надежности описанных методов возможно проведение молекулярных исследований образцов опухоли и ТИАБ, что может быть особенно важным в случаях неоднозначных результатов цитологического и биохимического исследования. В одном из образцов опухоли с дифференциальным диагнозом метастаз (локализация первичной опухоли неизвестна) / первичная УМ (эпителиоидноклеточньт тип) была выявлена ПГ по всем информативным маркерам хромосомы 3, что дало больше оснований для диагноза УМ.

В одной из опухолей была выявлена гетерогенность по состоянию микросателлитных маркеров хромосомы 3. В 4 из 6 биопсийных образцов эпителиоидноклеточной УМ наблюдалась потеря гетерозиготности по маркерам 0181038, Зд23.1_16хТО и 0382398 при сохранении гетерозиготности по остальными информативным маркерам, а в двух образцах аллельных потерь выявлено не было. Этот факт свидетельствует о том, что отсутствие структурных нарушений в материале из биопсийного образца не всегда можно рассматривать как признак отсутствия структурных изменений во всей опухоли, однако большее количество материала может дать более ясную картину.

Так как метод радиотерапии применяется в настоящее время чаще, чем энуклеация, ТИАБ представляет собой эффективный способ проведения генетического анализа для всех пациентов с увеальной меланомой. Для пациентов, которым была впоследствии проведена энуклеация, возможно проведение повторного генетического анализа, для сбора дальнейшей информации о гетерогенности опухоли и чувствительности теста. В целом, результаты работы свидетельствуют о том, что ТИАБ представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа пациентов с увеальной меланомой

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ потери гетерозиготности хромосомных районов 1р36, 1р31.3, 3р25.3, 3р21.3, Зр14.2, 3ql2, 3q26.3, 3q28, 8р22, 9(р21.2-р21.3), 10(q23.2-q23.3), 13ql4. Наиболее частым специфическим изменением, выявленным в клетках увеальной меланомы, является ПГ по всем информативным маркерам хромосомы 3, определенная как моносомия 3 (45%). Выявлено наличие аллельных потерь в хромосомных локусах 1р36 (29,9%) и 8р22 (35,9%).

2. Проведен анализ метилирования генов CDKN2A, RBI, RASSF1A, MLH1, FHITu VHL. Показано, что метилирование промоторной области RASSF1A определяется в 24,3% образцов УМ, а в условно нормальной хориоидее тех же пациентов метилирование отсутствует.

3. Показано, что для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация Т1796А гена BRAF, аллельные делеции в локусе PTEN, а также ПГ и гиперметилирование промоторных районов генов пути регуляции CDKN2A —* RB1.

4. Обнаружены статистически достоверные ассоциации моносомии 3 с агрессивными характеристиками опухоли, такими как эпителиоидный клеточный тип (р<0,0001), цилиарная локализация (р=0,001) и пигментация (р=0,018). Определена достоверная ассоциация аллельных делеций 1р36 с экстрасклеральной инвазией опухоли (р=0,012), снижающей выживаемость пациентов, а также с увеличенным размером опухоли (р=0,012). Также определена ассоциация метилирования гена RASSF1A с отсутствием аллельных потерь по маркерам RASSF1A в хромосоме 3.

5. Разработана система диагностических маркеров увеальной меланомы, основанная на анализе молекулярно-генетических нарушений в образцах опухоли.

Подтверждено, что ТИАБ представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа пациентов с увеальной меланомой, позволяющий провести микросателлитный анализ не менее чем по 15 маркерам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В настоящей работе получены данные о характерных генетических и эпигенетических нарушениях при УМ, выявлены ассоциации структурных и численных хромосомных нарушений с прогрессией первичной опухоли. Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными литературы позволили предложить практические рекомендации по использованию результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике.

1. Определение потери гетерозиготности по маркерам хромосомы 3 и 1р36 в материале первичной опухоли целесообразно проводить наряду с патоморфологическим исследованием для дифференциальной диагностики и оценки прогноза УМ.

2. Материал, полученный с помощью ТИАБ, может быть использован для комплексного исследования, включающего не только морфологический, но и молекулярно-генетический анализ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Манохина, И.К. Статус метилирования про моторных областей некоторых генов-супрессоров онкогенеза в увеальных меланомах / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, C.B. Саакян, Д.В. Залетаев // Молекулярная медицина. -2009. - №2, -С. 27-31

2. Манохина, И.К. Анализ аллельных потерь в увеальных меланомах / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, C.B. Саакян, Д.В. Залетаев // Медицинская генетика. - 2008. -Том 7, №6 (72). - С.19-23

3. Залетаев, Д.В. Эпигенетические маркеры в диагностике онкозаболеваний / Д.В. Залетаев, М.В. Немцова, В.В. Стрельников, О.В. Бабенко, Е.М. Пальцева, В.В. Землякова, Е.Б. Кузнецова, Т.В. Кекеева, Д.С. Михайленко, И.К. Манохина И Молекулярная медицина. - 2008. - №4. - С.46-51

4. Системы ДНК-маркеров в диагностике онкозаболеваний / под. ред. М.А. Пальцева. М.: МЕДИЦИНА, 2009. - в печати

5. Manokhina, I.K. Status of some tumor-suppressor loci in uveal melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // European Journal of Human Genetics. - 2009. - Vol. 17. - Suppl. 2. - в печати

6. Manokhina, I.K. Analysis of the molecular genetic changes in uveal melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // European Journal of Human Genetics. - 2008. - Vol. 16. - Suppl. 2. - p.237

7. Манохина, И.К. Анализ молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, С.В. Саакян, Д.В. Залетаев // Сбрник тезисов к V Конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины." - 2008. - С. 266

8. Манохина, И.К. Генетические аспекты увеальной меланомы: хромосомные нарушения и идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, С.В. Саакян, Д.В. Залетаев // Современные технологии в дифференциальной диагностике и лечении внутриглазных новообразований: сб. науч. тр. - Москва, 2007. - С. 93-97

9. Manokhina, I.K. Identification of tumor-suppressor loci that may contribute to the pathogenesis of uveal melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // European Journal of Human Genetics.- 2007. - Vol. 15. - Suppl. 1, p. 173

10.Manokhina, I.K. Status Of Some Tumor-Suppressor Genes In Uveal Melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // Abstracts for International Society of Ocular Oncology Meeting. - 2007, - p.314

11.Saakyan, S.V. Correlation Between Clinical-Morphological And Genetic Parameters In Uveal Melanoma / S.V. Saakyan, N.V. Skliarova, G.V. Zaharova, I.K. Manokhina, D.V. Zaletayev // Abstracts for International Society of Ocular Oncology Meeting. -2007,-p. 210

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И АББРЕВИАТУРЫ ГЕНОВ ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота п.н. - пар нуклеотидов ПГ - потеря гетерозиготности ПЦР - полимеразная цепная реакция ТИАБ - тонкоигольная аспирационная биопсия УМ - увеальная меланома SRO - наименьшие области перекрывания делеций RASSF1A - Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1 VHL - von Hippel-Lindau tumor suppressor FHIT- fragile histidine triad gene

MLH1 - mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2

CDKN2A - cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, pl6, inhibits CDK4)

RBI - retinoblastoma 1

В RAF- v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog В1

Подписано в печать:

06.05.2009

Заказ № 2000 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Манохина, Ирина Константиновна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика увеальной меланомы

1.1.1 Клиническая характеристика заболевания

1.1.2 Клинико-патологические особенности и их прогностическая значимость

1.2 Хромосомные нарушения и идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез

1.2.1 Увеальная меланома и меланома кожи

1.2.2 Хромосомные перестройки в УМ

1.2.2.1 Потеря хромосомного материала в увеальных меланомах

1.2.2.2 Определение избыточного хромосомного материала в УМ

1.2.3 Идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез

1.2.3.1 Анализ потери гетерозиготности в УМ

1.2.3.2 Поиск мутаций

1.2.3.3 Анализ метилирования в УМ

1.2.3.4 Изучение профиля экспрессии генов

1.3 Ассоциации молекулярных нарушений с клинико-патологическими факторами

1.4 Разработка ДНК-диагностических протоколов

1.4.1 Определение циркулирующих опухолевых клеток в общем кровотоке

1.4.2 Молекулярно-генетическое исследование операционного материала

1.4.3 Техника тонкоигольной аспирационной биопсии 45 РЕЗЮМЕ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клинический материал

2.2 Забор крови и операционного материала

2.3 Выделение геномной ДНК

2.4 Анализ аллельного дисбаланса

2.5 Аллель-специфическая амплификация мутантиого аллеля В11АГ

2.6 Анализ метилирования методом метил-чувствительной ПЦР

2.7 Электрофорез в ПААГ

2.8 Ультратонкое окрашивание нитратом серебра

2.9 Программное обеспечение

2.10 Статистическая обработка

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Спектр молекулярных нарушений в увеальных меланомах

3.1.1 Анализ потери гетерозиготности в УМ

3.1.2 Анализ метилирования в УМ

3.1.3 Поиск мутаций

3.1.4 Профиль молекулярной патологии в исследованных образцах УМ

3.2 Анализ ассоциаций молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах с клинико-патологическими факторами и факторами прогноза

3.3 Спектр молекулярной патологии в УМ и меланоме кожи

3.4 Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики увеальной меланомы

3.5 Диагностика молекулярных маркеров УМ в биоптатах 82 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86 ВЫВОДЫ 88 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 89 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АА - акриламид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР

ОР - относительный риск п.н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - потеря гетерозиготности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТИАБ - тонкоигольная аспирационная биопсия

УМ — увеальная меланома

ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

APS - аммония персульфат

CGH - сравнительная геномная гибридизация

CISH - хромосомная гибридизация in situ

DHPLC - denaturing high-performance liquid chromatography

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

SKY - спектральное кариотипирование

SRO - Smallest overlapping regions, наименьшие области перекрывания делеций ТВЕ - трис-боратный буфер: 89 шМ трис-борат, 89 шМ борная кислота, 2 шМ ЭДТА TEMED - тетраметилэтилендиамин

Аббревиатуры генов и их белковых продуктов, а также сокращения распространенных единиц измерения даны в соответствии с общепринятыми номенклатурами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика молекулярной патологии в увеальных меланомах"

Увеальная меланома (УМ) является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью у взрослых, заболеваемость увеальной меланомой составляет 7-8 человек на 1 млн. населения в год в России, США и странах Западной Европы. УМ возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов сосудистой оболочки глазного яблока. Современные методы диагностики и лечения УМ направлены на повышение выживаемости пациентов и сохранение глаза как косметического и функционального органа.

Метастазы развиваются у значительной части пациентов с УМ. В частности, смертность в связи с увеальной меланомой достигает 53% в течение пятилетнего периода именно вследствие метастатической болезни. Несмотря на использование новейших достижений в области диагностики и лечения, этот показатель остается по-прежнему чрезвычайно высоким. Выявлены некоторые характерные клинические и гистологические факторы, совокупность которых позволяет условно разделить увеальные меланомы на более «спокойные», с невысоким риском метастазирования, и «агрессивные», для которых риск развития метастазов считается повышенным. Однако необходимость создания диагностической системы маркеров увеальной меланомы очевидна. Поиск и характеристика молекулярных маркеров диагностики и прогноза является, на сегодняшний день, одной из важнейших задач онкологии. Создание эффективных диагностических протоколов позволит в дальнейшем оценить прогноз заболевания и предпринять адекватные меры для выявления и лечения метастатической болезни у пациентов с увеальной меланомой. Необходимым этапом создания систем маркеров УМ является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных увеальных меланомах.

Актуальность работы определяется следующими факторами:

1). Увеальная меланома является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью, составляющей 12% от меланом всех локализаций, однако молекулярные механизмы ее патогенеза к настоящему моменту изучены недостаточно.

2). Эффективное лечение увеальной меланомы связано не только со своевременной диагностикой и лечением первичной опухоли, но также ранним выявлением и лечением метастатической болезни. Есть предположения, что ряд характерных молекулярных нарушений в увеальных меланомах может быть ассоциирован с опухолевой прогрессией и развитием метастазов.

Цель п задачи исследования

В соответствии с поставленной целью предполагается решить следующие задачи:

2. Определить статус метилирования промоторных районов ряда генов-супрессоров опухолевого роста.

3. В увеальных меланомах провести анализ молекулярных нарушений в генах и хромосомных районах, наиболее часто повреждаемых в меланомах кожи.

4. Определить ассоциации молекулярно-генетических нарушений с клинико-патологическими данными.

Научная новизна

Настоящая работа является первым широкомасштабным молекулярно-генетическим исследованием увеальных меланом на территории Российской Федерации и направлена на поиск молекулярных маркеров увеальных меланом с перспективой создания комплексной системы диагностических и прогностических маркеров, позволяющих врачу сделать правильный выбор в отношении тактики лечения и дальнейшего наблюдения пациентов.

Выявлено наличие характерных для увеальной меланомы генетических и эпигенетических нарушении (потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), делеции 1р и 8р, метилирование ЯАЗЗРЫ). В исследовании обнаружены ассоциации моносомии 3 с характеристиками агрессивного течения меланомы, такими как эпителиоидный клеточный тип, цилиарная локализация и пигментация опухоли. Аллельные делеции 1р не могут рассматриваться как патогномоничное нарушение в увеальных меланомах, однако определена их достоверная ассоциация с экстрасклеральной инвазией опухоли, снижающей выживаемость пациентов. Метилирование гена КАББПА является неслучайным изменением, обнаруженным в увеальных меланомах: его отсутствие подтверждено в условно-нормальной хорнондее тех же пациентов. Также определена его ассоциация с отсутствием аллельных потерь по маркерам ЯА88Р1А в хромосоме 3.

Установлено, что основной спектр молекулярных нарушении, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной меланоме.

Практическая значимость

Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 107 пациентов с диагнозом первичная увеальная меланома. Обнаружение моносомии 3 способствует дифференциальной диагностике УМ, так как это нарушение является специфическим, не характерным для другой онкопатолопш. Определена ассоциация структурных и количественных нарушений в хромосоме 3 н 1р36 с клинико-морфологическими характеристиками и факторами прогрессии опухоли, что позволит использовать анализ этих нарушений в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях УМ. Показано, что тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа пациентов с увеальной меланомой. Результаты, получепиые в представленной работе, легли в основу разработки системы молекулярных маркеров УМ в дополнение к применяемым диагностическим методам — гистологическому и биохимическому. Внедрение таких систем расширяет возможности диагностики, в том числе дифференциальной, а также позволяет определить риск метастазирования опухоли и выбрать тактику терапии.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007 г. (Ницца, Франция) и 2008 г. (Барселона, Испания), на конгрессе Международного общества онкоофтальмологов в 2007 г. (Сиена, Италия), Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии в дифференциальной диагностике и лечении внутриглазных опухолей» в 2007 г. (Москва), конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 году (Москва).

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику

На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика выявления специфических молекулярных маркеров увеальной меланомы» и «Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме» (Поданы заявки на регистрацию новых медицинских технологий). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в МНИИ Глазных Болезней им. Гельмгольца.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 153 ссылки. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками.

Положения, выносимые на защиту

2. Метилирование КАББПА определяется преимущественно в меланомах, не имеющих моносомии 3 и не характерно для условно-нормальной хориоидеи.

3. Молекулярный патогенез УМ и меланомы кожи различен. Для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация Т1796А гена ВЯАГ, аллельные делеции в локусе РТЕЫ, а также потеря гетерозиготности и гиперметилирование промоторов генов пути регуляции СВШ2А^ЯВ1.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Манохина, Ирина Константиновна

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ потери гетерозиготности хромосомных районов 1рЗб, 1р31.3, 3р25.3, 3р21.3, Зр14.2, 3ql2, 3q26.3, 3q28, 8р22, 9р(21.2-р21.3), 10(q23.2-q23.3), 13ql4. Наиболее частым специфическим изменением, выявленным в клетках увеальной меланомы, является потеря гетерозиготности по всем информативным маркерам хромосомы 3, определенная нами как моносомия 3 (45%). Выявлено наличие аллельных потерь в хромосомных локусах 1р (29,9%) и 8р22 (35,9%).

2. Проведен анализ метилирования генов CDKN2A, RBI, RASSF1A, MLH1, FHIT и VHL. Показано, что метилирование промоторной области RASSF1A определяется в 24,3% образцов УМ, а в условно нормальной хориоидее тех же пациентов метилирование отсутствует.

4. Обнаружены статистически достоверные ассоциации моносомии 3 с агрессивными характеристиками опухоли, такими как эпителиоидный клеточный тип (р<0,0001), цилиарная локализация (/7=0,001) и пигментация (¿>=0,018). Определена достоверная ассоциация аллельных делеций 1рЗб с экстрасклеральной инвазией опухоли (р=0,012), снижающей выживаемость пациентов, а также с увеличенным размером опухоли (р=0,012). Также определена ассоциация метилирования гена RASSF1A с отсутствием аллельных потерь по маркерам RASSF1A в хромосоме 3.

5. Разработана система диагностических маркеров увеальной меланомы, основанная па анализе молекулярно-генетических нарушений в образцах опухоли. Подтверждено, что ТИАБ представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа для пациентов с увеальной меланомой, позволяющий провести микросателлнтный анализ не менее чем по 15 маркерам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В настоящей работе получены данные о характерных генетических и эпигенетических нарушениях при УМ, выявлены ассоциации структурных и численных хромосомных нарушений с прогрессией первичной опухоли. Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными литературы позволили предложить практические рекомендации по использованию результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Манохина, Ирина Константиновна, Москва

1. Бабенко О.В, Саакян С.В, Бровкина А.Ф, Козлова В.М, Стрельников В.В, Залетаев Д.В, Немцова М.В. Спектр и частота структурной патологии гена RB1 при ретинобластоме // Молекулярная биология, 2002. - Том 36, № 4. - с.623-9.

2. Бровкина А.Ф, Жильцова М.Г, Каплина A.B. Тонкоигольная аспирационная биопсия в диагностике опухолей органа зрения. Пособие для врачей. М. 2000.

3. Васильев Е.В, Румянцев П.О, Саенко В.А, Ильин A.A., Полякова Е.Ю, Немцова М.В, Залетаев Д.В. Молекулярный анализ структурных нарушений генома папиллярных карцином щитовидной железы. Молекулярная биология. 2004. - Том. 38, №4.-С. 642-53.

4. Гришина Е.Е, Федотова О.Ф, Житенев В.П. Анализ офтальмоонкологической патологии у взрослого населения Москвы по данным МОКБ // Опухоли и опухолеподобные заболевания органа зрения. М, Медицина, 1998, стр. 28-31.

5. Залетаев Д.В, Немцова М.В, Стрельников В.В. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // Молекулярная Биология.-2002. Том 38, №2.-С. 213-223.

6. Залетаев Д.В, Немцова М.В, Бабенко О.В. Система генетических и эпигенетических маркеров в ДНК-диагностике злокачественных новообразований. В кн.: Введение в молекулярную медицину, (под ред. Пальцева М.А.). М, Медицина, 2004, С. 35-93.

7. Землякова В, Жевлова А, Стрельников В. и др. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы. Молекулярная Биология. 2003. Том 37, №4, стр. 696-703.

8. Кекеева Т.В, Жевлова А, Подистов Ю и др. Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста и микросателлитная нестабильность в предраковых состояниях шейки матки // Молекулярная биология. 2006. Том 40, С: 224-230.

9. Михайленко Д.С., Курынин Р.В., Попов A.M. и др. Инактивация гена VHL при спорадическом светлоклеточном раке почки. Молекулярная Биология. 2008. - Том 42, №1, стр. 71-77.

10. Саакян С.В., Бровкина А.Ф. Опухоли сосудистой оболочки глаза. В кн.: Офтальмоонкология: Руководство для врачей (под ред. Бровкиноп А.Ф.) // М., Медицина, 2002, -с. 235-298.

11. Саакян С.В. Достижения и перспективы онкоофтальмологии. Сборник научных трудов «Современные технологии в дифферециальной диагностике и лечении внутриглазных опухолей», М. 2007. - С. 1-17.

12. Склярова Н. В. Флюоресцентная ангиография в диагностике беспигментных меланом хориоидеи // Автореферат диссертации на соискаие ученой степени кандидата медиинских наук, Москва, 2004

13. Aalto Y, Eriksson L, Seregard S, Larsson O, ICnuutila S. Concomitant loss of chromosome 3 and whole arm losses and gains of chromosome 1, 6, or 8 in metastasizing primary uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001. Vol. 42, № 2. - P. 313-7.

14. Abdel-Rahman MH, Yang Y, Zhou XP, Craig EL, Davidorf FH, Eng C. High frequency of submicroscopic hemizygous deletion is a major mechanism of loss of expression of PTEN in uveal melanoma // J Clin Oncol. 2006. - Vol. 24, № 2. - P.288-95.

15. Albert D.M., Polans A, Ocular Oncology, 1st edition // Informa Health Care 2003. ISBN-10: 0824740165,492 pages

16. Bakalian S, Marshall JC, Logan P, Faingold D, Maloney S, Di Cesare S, Martins C, Fernandes BF, Burnier MN Jr. Molecular pathways mediating liver metastasis in patients with uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2008. - Vol.14, № 4. - P. 951-6.

17. Baylin SB, Belinsky SA, Herman JG. Aberrant mcthylation of gene promoters in cancer-concepts, misconcepts, and promise // J Natl Cancer Inst. 2000. - Vol.92, № 18. - P. 1460-1.

18. Becher R, Korn WM, Prescher G.Use of fluorescence in situ hybridization and comparative genomic hybridization in the cytogenetic analysis of testicular germ cell tumors and uveal melanomas // Cancer Genet Cytogenet. 1997. - Vol. 93, № 1. - P. 22-8.

19. Bell DJ, Wilson MW.Choroidal melanoma: natural history and management options // Cancer Control. 2004. - Vol. 11, № 5. - P. 296-303.

20. Belmar-Lopez C, Mancheno-Corvo P, Saornil MA, Baril P, Vassaux G, Quintanilla M, Martm-Duque P. Uveal vs. cutaneous melanoma. Origins and causes of the differences 11 Clin Transl Oncol. 2008. - Vol. 10, № 3. - P. 137-42.

21. Blasi MA, Roccella F, Balestrazzi E, Del Porto G, De Felice N, Roccella M, Rota R, Grammatico P. 3pl3 region: a possible location of a tumor suppressor gene involved in uveal melanoma // Cancer Genet Cytogenet. 1999. - Vol. 108, № 1. - P. 81-3.

22. Brantley MA Jr, Harbour JW. Deregulation of the Rb and p53 pathways in uveal melanoma // Am J Pathol. 2000. - Vol. 157, № 6. - P. 1795-801.

23. Chan CC, Collins D, Chew EY. Molecular pathology of eyes with Von Hippel-Lindau (VHL) disease//Retina.-2007.-Vol. 27, №1.- P. 1-7.

24. Chin L, Garraway LA, Fisher DE. Malignant melanoma: genetics and therapeutics in the genomic era // Genes Dev. 2006. - Vol. 20, № 16. - P. 2149-82.

25. Choi CH, Lee KM, Choi JJ, Kim TJ, Kim WY, Lee JW, Lee SJ, Lee JH, Bae DS, Kim BG. Hypermethylation and loss of heterozygosity of tumor suppressor genes on chromosome 3p in cervical cancer // Cancer Lett. 2007. - Vol. 255, № 1. - P. 26-33.

26. Coupland SE, Campbell I, Damato B. Routes of extraocular extension of uveal melanoma: risk factors and influence on survival probability // Ophthalmology. 2008. - Vol. 115, № 10. -P. 1778-85.

27. Coupland SE, Sidiki S, Clark BJ, McClaren IC, Kyle P, Lee WR. Metastatic choroidal melanoma to the contralateral orbit 40 years after enucleation // Arch Ophthalmol. 1996. -Vol. 114,№6.-P. 751-6.

28. Croce CM, Sozzi G, Huebner K. Role of FHIT in human cancer // J Clin Oncol 1999, 17:1618-1624.

29. Cross NA, Ganesh A, Parpia M, Murray AK, Rennie IG, Sisley K. Multiple locations on chromosome 3 are the targets of specific deletions in uveal melanoma. // Eye. 2006. - Vol. -20, № 4. - P.476-81.

30. Cross NA, Murray AK, Rennie IG, Ganesh A, Sisley K. Instability of microsatellites is an infrequent event in uveal melanoma // Melanoma Res. 2003. - Vol. 13, № 5. - P. 435-40.

31. Damato B, Duke C, Coupland SE, Hiscott P, Smith PA, Campbell I, Douglas A, Howard P. Cytogenetics of uveal melanoma: a 7-year clinical experience // Ophthalmology 2007. -Vol. 114, № 10. - P.1925-31.

32. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al., Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature. 2002. - Vol. 417, № 6892. - P. 949-54.

33. Diener-West M, Hawkins BS, Markowitz JA, Schachat AP. A review of mortality from choroidal melanoma. II. A meta-analysis of 5-year mortality rates following enucleation, 1966 through 1988 // Arch Ophthalmol. 1992. - Vol. 110, № 2. - P. 245-50.

34. Donninger H, Vos MD, Clark GJ. The RASSF1A tumor suppressor // J Cell Sci. 2007. -Vol. 120(Pt 18).-P. 3163-72.

35. Edmunds SC, Cree IA, Di Nicolantonio F, Hungerford JL, Hurren JS, Kelsell DP. Absence of BRAF gene mutations in uveal melanomas in contrast to cutaneous melanomas // Br J Cancer. 2003. - Vol. 88, № 9. - P. 1403-5.

36. Edmunds SC, Kelsell DP, Hungerford JL, Cree IA.Mutational analysis of selected genes in the TGFbeta, Wnt, pRb, and p53 pathways in primary uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sei. 2002. - Vol. 43, № 9. - P. 2845-51.

37. Egan KM, Seddon JM, Glynn RJ, Gragoudas ES, Albert DM. Epidemiologic aspects of uveal melanoma // Surv Ophthalmol. 1988. - Vol. 32, № 4. - P. 239- 51.

38. Ehlers JP, Harbour JW. Molecular pathobiology of uveal melanoma // Int Ophthalmol Clin. -2006. Vol. 46, № 1. - P. 167-80.

39. Ehlers JP, Harbour JW. NBS1 expression as a prognostic marker in uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2005. - Vol. 11, № 5. - P. 1849-53.

40. Ehlers JP, Worley L, Onken MD, Harbour JW. DDEF1 is located in an amplified region of chromosome 8q and is overexpressed in uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2005. - Vol. 11,№ 10.-P. 3609-13.

41. Ehlers JP, Worley L, Onken MD, Harbour JW.Integrative genomic analysis of aneuploidy in uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2008. - Vol. 14, № 1. - P. 115-22.

42. Ellison AR, Lofmg J, Bitter GA. Human MutL homolog (.MLH1) function in DNA mismatch repair: a prospective screen for missense mutations in the ATPase domain // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32, №18. -P. 5321-5338.

43. Fernandes BF, Beifort RN, Di Cesare S, Burnier MN Jr. Circulating uveal melanoma cells: should we test for them? // Can J Ophthalmol. 2008. - Vol. 43, № 2. - P. 155-8.

44. Folberg R, Maniotis AJ. Vasculogenic mimicry. APMIS. 2004. - Vol. 112, № 7-8. - P. 50825.

45. Gambrelle J, Labialle S, Dayan G, Gayet L, Barakat S, Grange JD, Baggetto LG. Toward monosomy 3 as the main prognosis factor of uveal melanoma: current cytogenetic data // J Fr Ophtalmol. 2004. - Vol. 27(9 Pt 1). - P. 1061-7.

46. Gamis C, Buys TP, Lam WL. Genetic alteration and gene expression modulation during cancer progression. Mol Cancer. 2004. - Vol. 3 -P. 9.

47. Glatz K. Molecular heterogeneity of malignant melanomas // Pathologe. 2007. - Vol. 28, № 6. - P. 474-8.

48. Gündiiz K, Shields JA, Shields CL, Sato T, Mastrangelo MJ. Surgical removal of solitary hepatic metastasis from choroidal melanoma // Am J Ophthalmol. 1998. - Vol. 125, № 3. -P. 407-9.

49. Harbour JW. Molecular prognostic testing in uveal melanoma: has it finally come of age? // Arch Ophthalmol. 2007. - Vol. 125, № 8. - P. 1122-3.

50. Häusler T, Stang A, Anastassiou G, Jockel KH, Mrzyk S, Horsthemke B, Lohmann DR, Zeschnigk M. Loss of heterozygosity of lp in uveal melanomas with monosomy 3 // Int J Cancer. 2005. - Vol. 116, № 6. - P.909-13.

51. Hearle N, Damato BE, Humphreys J, Wixey J, Green H, Stone J, Easton DF, Houlston RS. Contribution of germline mutations in BRCA2, P16(INK4A), P14(ARF) and PI5 to uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sei. 2003. - Vol. 44, №2. - P. 458-62.

52. Henriquez F, Janssen C, Kemp EG, Roberts F. The T1799A BRAF mutation is present in iris melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sei. 2007. - Vol. 48, № 11. - P. 4897-900.

53. Hesson LB, Cooper WN, Latif F.The role of RASSFJA methylation in cancer // Dis Markers. 2007. - Vol. 23, № 1-2. - P. 73-87.

54. Honavar SG, Singh AD, Shields CL, Shields JA, Eagle Jr RC. Iris melanoma in a patient with neurofibromatosis. Surv Ophthalmol 2000. Vol. 45, № 3. - P. 231-6.

55. Houlston RS, Damato BE. Genetic predisposition to ocular melanoma // Eye 1999. Vol. 13(Pt 1). - P. 43- 6.

56. Hovland PG, Trempe C. Genomic investigations of posterior uveal melanoma // Semin Ophthalmol. 2005. - Vol. 20, № 4. - P. 231-8.

57. J. Sambrook. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. - P. 9.17-9.19

58. Janssen CS, Sibbett R, Henriquez FL, McKay IC, Kemp EG, Roberts F. The T1799A point mutation is present in posterior uveal melanoma // Br J Cancer. 2008. - Vol. 99, № 10. - P. 1673-7.

59. Kilic E, Briiggenwirth HT, Meier M, Naus NC, Beverloo HB, Meijerink JP, Luyten GP, de Klein A. Increased expression of p73Deltaex2 transcript in uveal melanoma with loss of chromosome lp // Melanoma Res. 2008. - Vol. 18, № 3. - P. - 208-13.

60. Kilic E, van Gils W, Lodder E, Beverloo HB, van Til ME, Mooy CM, Paridaens D, de Klein A, Luyten GP. Clinical and cytogenetic analyses in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006. - Vol. 47, № 9. - P. 3703-7.

61. Kumar R, Smeds J, Lundh Rozell B, Hemminki K. Loss of heterozygosity at chromosome 9p21 {INK4-pl4ARF locus): homozygous deletions and mutations in the pi 6 and pl4ARF genes in sporadic primary melanomas // Melanoma Res. 1999. - Vol. 9, № 2. - P.138-47.

62. Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, et al. Allele loss and promoter hypermethylation of VHL, RARbetci, RASSF1A, and FHIT tumor suppressor genes on chromosome 3p in esophageal squamous cell carcinoma // Cancer Res 2003. Vol. 63, № 13. - P. 3724—8.

63. Lamperska K, Mackiewicz K, ICaczmarek A, Kwiatkowska E, Starzycka M, Romanowska B, Heizman J, Stachura J, Mackiewicz A. Expression of pi 6 in sporadic primary uveal melanoma // Acta Biochim Pol. 2002. - Vol. 49, № 2. - P. 377-85.

64. Landreville S, Agapova OA, Harbour JW. Emerging insights into the molecular pathogenesis of uveal melanoma // Future Oncol. 2008. - Vol. 4, № 5. - P. 629-36.

65. Lee WH, Bookstein R, Hong F, Young LJ, Shew JY, Lee EY. Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence // Science. 1987. - Vol. 235, № 4794. - P. 1394-9.

66. Loercher AE, Harbour JW. Molecular genetics of uveal melanoma // Curr Eye Res. 2003. -Vol. 27, № 2. - P. 69-74.

67. Lomas J, Martin-Duque P, Pons M, Quintanilla M.The genetics of malignant melanoma // Front Biosci. 2008. - Vol. 13. P. 5071-93.

68. Maat W, Kilic E, Luyten GP, de Klein A, Jager MJ, Gruis NA, Van der Velden PA. Pyrophosphorolysis detects B-RAF mutations in primary uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008. - Vol. 49, № 1. - P. 23-7.

69. Maat W, van der Velden PA, Out-Luiting C, Plug M, Dirks-Mulder A, Jager MJ, Gruis NA. Epigenetic inactivation of RASSFla in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. -2007. Vol. 48, № 2. - P. 486-90.

70. McLean IW, Foster WD, Zimmerman LE, Gamel JW Modifications of Callender's classification of uveal melanoma at the Armed Forces Institute of Pathology // Am J Ophthalmol. 1983. - Vol. 96, № 4. - P. 502-9.

71. McLean IW, Foster WD, Zimmerman LE. Uveal melanoma: location, size, cell type, and enucleation as risk factors in metastasis // Hum Pathol. 1982. - Vol. 13, № 2. - P. 123-32.

72. Meir T, Dror R, Yu X, Qian J, Simon I, Pe'er J, Chowers I. Molecular characteristics of liver metastases from uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007. - Vol. 48, № 11. - P. 4890-6.

73. Meir T, Zeschnigk M, Masshofer L, Pe'er J, Chowers I. The spatial distribution of monosomy 3 and network vasculogenic mimicry patterns in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007. - Vol. 48, № 5. - P. - 1918-22.

74. Melnikov AA, Ronald B. Gartenhaus, Anait S. Levenson, Natalia A. Motchoulskaia, and Victor V. Levenson (Chernokhvostov) MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33, № 10. - P. e93.

75. Mensink HW, Kiliç E, Vaarwater J, Douben H, Paridaens D, de Klein A. Molecular cytogenetic analysis of archival uveal melanoma with known clinical outcome // Cancer Genet Cytogenet. 2008. - Vol. 181, № 2. - P. 108-11.

76. Mensink HW, Vaarwater J, Kiliç E, Naus NC, Mooy N, Luyten G, Biliggenwirth HT, Paridaens D, de Klein A. Chromosome 3 intratumor heterogeneity in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009. - Vol. 50, № 2. - P. 500-4.

77. Merbs SL, Sidransky D. Analysis of pi 6 (CDKN2/MTS-1/INK4A) alterations in primary sporadic uveal melanoma. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999. - Vol. 40, № 3. - P.779-83

78. Merhavi E, Cohen Y, Avraham BC, Frenkel S, Chowers I, Pe'er J, Goldenberg-Cohen N. Promoter methylation status of multiple genes in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007. - Vol. 48, № 10. - P. 4403-6.

79. Midena E, Bonaldi L, Parrozzani R, Radin PP, Boccassini B, Vujosevic S. In vivo monosomy 3 detection of posterior uveal melanoma: 3-year follow-up // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2008. - Vol. 246, № 4. - P.609-14.

80. Mikhaïlenko DS, Kurynin RB, Popov AM, Kariakin OB, Enikeev ME, Aliaev IuG, Nemtsova MV, Zaletaev DV. Inactivation of the VHL gene in sporadic clear cell renal cancer // Mol Biol (Mosk). 2008. - Vol. 42, № 1, - P. 71-7.

81. Miller AJ, Mihm MC Jr. Melanoma. // N Engl J Med. 2006. - Vol. 355, № 1. - P.51-65.

82. Moulin AP, Clément G, Bosman FT, Zografos L, Benhattar J. Methylation of CpG island promoters in uveal melanoma // Br J Ophthalmol. 2008. - Vol. 92, № 2. - P. 281-5.

83. Mouriaux F, Maurage CA, Labalette P, Sablonniere B, Malecaze F, Darbon JM. Cyclin-dependent kinase inhibitory protein expression in human choroidal melanoma tumors // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000. - Vol. 41, № 10. - P. 2837-43.

84. Mouriaux F, Saule S, Desjardins L, Mascarelli F. Normal and malignant choroidal melanocytes: from cell to clinical approach. // J Fr Ophtalmol. 2005. - Vol. 28, № 7. -P.781-93.

85. Mudhar HS, Parsons MA, Sisley IC, Rundle P, Singh A, Rennie IG.A critical appraisal of the prognostic and predictive factors for uveal malignant melanoma // Histopathology. 2004. -Vol. 45, №1.-P. 1-12.

86. Onken MD, Ehlers JP, Worley LA, Makita J, Yokota Y, Harbour JW. Functional gene expression analysis uncovers phenotypic switch in aggressive uveal melanomas // Cancer Res. 2006. - Vol. 66, № 9. - P. 4602-9.

87. Onken MD, Worley LA, Ehlers JP, Harbour JW.Gene expression profiling in uveal melanoma reveals two molecular classes and predicts metastatic death // Cancer Res. 2004. -Vol. 64, № 20. - P. 7205-9.

88. Onken MD, Worley LA, Harbour JW. A metastasis modifier locus on human chromosome 8p in uveal melanoma identified by integrative genomic analysis // Clin Cancer Res. 2008. - Vol. 14, № 12. - P. 3737-45.

89. Parris CN, Harris JD, Griffin DK, Cuthbert AP, Silver AJR, Newbold RF. Functional evidence of novel tumor suppressor genes for cutaneous malignant melanoma // Cancer Res.1999.-Vol. 59.-P.516-520.

90. Pekarsky Y, Palamarchuk A, Huebner K, Croce CM, FHIT as tumor suppressor: mechanisms and therapeutic opportunities. //Cancer Biol Tlier. 2002. - Vol. 1, № 3. -P.232-6.

91. Pfeifer GP, Dammann R.Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors // Biochemistry (Mosc). 2005. - Vol. 70, № 5. - P. 576-83.

92. Poetsch M, Dittberner T, Woenckhaus C. Can different genetic changes characterize histogenetic subtypes and biologic behavior in sporadic malignant melanoma of the skin? // Cell Mol Life Sci. 2003. - Vol. 60, № 9. - P. 1923-32.

93. Ponder BAJ. Inherited cancer syndromes. Book: Genes and cancer. (Carney D, Sikora K, editor) New York, John Wiley and Sons. 1990. p. 99- 106.

94. Raoof N, Rennie IG, Salvi SM, Sisley K, Caine A, Mudhar HS. What is the significance of vortex vein invasion in uveal melanoma? // Eye. 2008. - Vol. 23, № 3. P. 549-555

95. Rastetter M, Schagdarsurengin U, Lahtz C, Fiedler E, Marsch WCh, Dammann R, Helmbold P. Frequent intra-tumoural heterogeneity of promoter hypermethylation in malignant melanoma // Histol Histopathol. 2007. - Vol. 22, № 9. - P. 1005-15.

96. Riquelme E, Tang M, Baez S, Diaz A, Pruyas M, Wistuba II, Corvalan A. Frequent epigenetic inactivation of chromosome 3p candidate tumor suppressor genes in gallbladder carcinoma // Cancer Lett. 2007. - Vol. 250, № 1. - P. 100-6.

97. Sandberg AA, Chen Z. Cytogenetics and molecular genetics of human cancer // Am J Med Genet. 2002. - Vol. 115, № 3. - P. 111-2.

98. Sandinha MT, Farquharson MA, Roberts F. Identification of monosomy 3 in choroidal melanoma by chromosome in situ hybridisation // Br J Ophthalmol. 2004. - Vol. 88, № 12. -P. 1527-32.

99. Scholes AG, Damato BE, Nunn J, Hiscott P, Grierson I, Field JK. Monosomy 3 in uveal melanoma: correlation with clinical and histologic predictors of survival // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003. - Vol. 44, № 3. - P. 1008-11.

100. Schuster R, Bechrakis NE, Stroux A et al. Circulating tumor cells as prognostic factor for distant metastases and survival in patients with primary uveal melanoma // Clin Cancer Res.2007.-Vol. 13, №4.-P. 1171-8.

101. Shields CL.The hunt for the secrets of uveal melanoma // Clin Experiment Ophthalmol.2008. Vol. 36, № 3. - P. 277-80.

102. Singh AD, Damato B, Howard P, Harbour JW.Uveal melanoma: genetic aspects // Ophthalmol Clin North Am. 2005. - Vol. 18, № 1. - P. 85-97.

103. Singh AD, Shields CL, De Potter P, Shields JA, Trock B, Cater J, Pastore D. Familial uveal melanoma. Clinical observations on 56 patients // Arch Ophthalmol. 1996. - Vol. 114, № 4. - P. 392-9.

104. Singh AD, Shields CL, Shields JA.Prognostic factors in uveal melanoma // Melanoma Res. 2001. - Vol. 11, № 3. - P. 255-63.

105. Siprashvili Z, Sozzi G, Barnes LD, McCue P, Robinson AK, Eryomin V, Sard L, Tagliabue E, Greco A, Fusetti L, Schwartz G, Pierotti MA, Croce CM, Huebner K.

106. Replacement of Fhit in cancer cells suppresses tumorigenicity // Proc Natl Acad Sci USA — 1997. Vol. 94. - P. 13771-13776.

107. Sisley IC, Parsons MA, Garnham J, Potter AM, Curtis D, Rees RC, Rennie IG. Association of specific chromosome alterations with tumour phenotype in posterior uveal melanoma // Br J Cancer. 2000 Jan. - Vol. 82, № 2. - P. 330-8.

108. Smiraglia DJ, Plass C. The development of CpG island methylation biomarkers using restriction landmark genomic scanning // Ann N Y Acad Sci -2003. Vol.983. - P.l 10-119.

109. Smith DI, McAvoy S, Zhu Y, Perez DS. Large common fragile site genes and cancer // Semin Cancer Biol. 2007. - Vol. 17, № 1. - P. 31-41.

110. Speicher MR, Prescher G, du Manoir S, Jauch A, Horsthemke B, Bornfeld N, Becher R, Cremer T. Chromosomal gains and losses in uveal melanomas detected by comparative genomic hybridization // Cancer Res. 1994. - Vol. 54, № 14. - P. 3817-23.

111. Spugnardi M, Tommasi S, Dammann R, Pfeifer GP, Hoon DS. Epigenetic inactivation of RAS association domain family protein 1 (RASSF1A) in malignant cutaneous melanoma // Cancer Res. 2003. - Vol. 63, № 7. - P. 1639-43.

112. Thorburn A. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) pathway signaling // J Thorac Oncol. 2007. - Vol. 2, № 6. - P. 461-5.

113. Tsai T, O'Brien JM.The future promise and the current reality of genetic prognostication inpatients with uveal melanoma//Arch Ophthalmol. 2008. - Vol. 126, № 3. - P. 413-5.

114. Virgili G, Gatta G, Ciccolallo L, et al. EUROCARE Working Group. Incidence of uveal melanoma in Europe // Ophthalmology. 2007. - Vol. 114, № 12. - P. 2309-15.

115. Virgili G, Gatta G, Ciccolallo L, et al. EUROCARE Working Group. Survival in patients with uveal melanoma in Europe // Arch Ophthalmol. 2008. - Vol. 126, № 10. - P. 1413-8.

116. White VA, McNeil BK, Horsman DE. Acquired homozygosity (isodisomy) of chromosome 3 in uveal melanoma // Canccr Genet Cytogenet. 1998. - Vol. 102, № 1. - P. 40-5.

117. Wistuba II, Ashfaq R, Maitra A, Alvarez H, Riquelme E, Gazdar AF. Fragile liistidine triad gene abnormalities in the pathogenesis of gallbladder carcinoma // Am J Pathol. 2002. -Vol. 160, №6.-P. 2073-9.

118. Yang Q, Nakamura M, Nakamura Y, et al. Two-hit inactivation of FHIT by loss of heterozygosity and hypermethylation in breast cancer // Clin Cancer Res. 2002. - Vol. 8, №9. - P.2890-3.

119. Ye H, Pungpravat N, Huang BL, et al. Genomic assessments of the frequent loss of heterozygosity region on 8p21.3-p22 in head and neck squamous cell carcinoma // Cancer Genet Cytogenet. 2007. - Vol. 176, № 2. - P. 100-6.

120. Zabarovsky ER, Lerman MI, Minna JD. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers // Oncogene. 2002. - Vol. 21, № 45. -P. 6915-35.

121. Zochbauer-Muller S, Fong KM, Maitra A, et al. 5' CpG Island Methylation of the FHIT Gene Is Correlated with Loss of Gene Expression in Lung and Breast Cancer // Cancer Res 2001. Vol. 61:3581-5.

122. Zuidervaart W, van Nieuwpoort F, Stark M, et al. Activation of the MAPK pathway is a common event in uveal melanomas although it rarely occurs through mutation of BRAF or RAS // Br J Cancer. 2005. - Vol. 92, № 11. - P. 2032-8.

Информация о работе

Манохина, Ирина Константиновна
кандидата медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Характеристика молекулярной патологии в увеальных меланомах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы