Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей

Туаева, Наталья Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей"

ТУАЕВА НАТАЛЬЯ ОЛЕГОВНА

ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК И ЕЕ УЧАСТИЕ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2007

003054050

Работа выполнена в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Казанского государственного университета имени В.И. Ульянова-Ленина.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор ¡Винтер Виктор Георгиевич! доктор биологических наук Абрамова Зинаида Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик АН РТ

Зубаиров Дилявер Мирзабдуллович

доктор ветеринарных наук, профессор Фаизов Тагир Хадиевич

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта, г. Москва

Защита состоится 22 Февраля 2007 года в « 13°° » часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 209.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан января 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук

Абрамова З.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В современной биологической науке важное место отводится изучению молекул, участвующих в межклеточных коммуникациях. Одними из таких молекул может являться внеклеточная ДНК (вкДНК). По некоторым данным, вкДНК может осуществлять передачу генетических функций «по горизонтали» (Adams, 1985; Владимиров, 1998), выполнять метаболическую функцию как предшественник коферментов и кофакторов (Беседнова, 1999), стимулировать иммунный ответ (Pisetsky, 2001; Krieg, 2002) и обеспечивать оптимальные условия гемодинамики (Ганнушкина, 1998). Существуют убедительные доказательства участия вкДНК в патогенезе аутоиммунных заболеваний у взрослых лиц (Wiktorowich, 1987; Lorenz, 2000). Однако данные, представленные в источниках литературы немногочисленны, нуждаются в дополнениях и систематизации.

Ведутся исследования по использованию вкДНК плазмы крови в качестве прогностического и диагностического критерия при онкологических (Anker, 2001; Gonzalez, 2000; Esteller, 2001; Bremnes, 2005), неврологических (Ганнушкина, 1998; Вознюк, 2000; Rainer, 2003; Holdenrieder, 2005), аутоиммунных (Tan, 1996; Herrmann, 1998; Nezlin, 1999) заболеваниях, при выявлении генетически детерминированных патологий плода (Papasavva, 2005) и мониторинге беременности у женщин группы риска по преэклампсии (Zhou, 2005; Farina, 2005). Возможность использования вкДНК в медицине обусловлена изменениями ее концентрации, изменениями в структуре и размерах молекул вкДНК плазмы крови, появлением различных мутаций.

Необходимо отметить, что количественная и качественная характеристики вкДНК остаются практически не изученными у детей. В доступных нам источниках литературы обнаружена одна работа (Wu, 2002), в которой затрагивается вопрос возрастной динамики концентрации вкДНК плазмы крови, и две работы, в которых рассматривается половой диморфизм данного параметра (Wu, 2002; Jung, 2004). Исследований, касающихся вкДНК в плазме крови новорожденных, обнаружить не удалось.

Пренатальный и неонатальный периоды характеризуются высокой скоростью преобразования различных органов и систем. Даже при благоприятных обстоятельствах рождения и периода адаптации организм ребенка испытывает метаболический стресс (Володин, 1999). Несмотря на высокие репаративные возможности организма в раннем постнатальном онтогенезе, многие патологические процессы новорожденных оставляют глубокий след и проявляются в последующие возрастные этапы. Осложнения, возникающие в перинатальном периоде, могут приводить к широкому спектру последствий - от легкой задержки психомоторного развития, до детского церебрального паралича или летального исхода. При этом отмечается, что иногда незначительные на первый взгляд отклонения, как, например, легкая асфиксия или недоношенность, могут сказаться в будущем более серьезными нарушениями, чем более грубые, например, родовая травма (Ратнер, 1995). Это

определяет необходимость поиска новых, «скрытых» маркеров повреждения нервной и иммунной систем в раннем неонатальном периоде. Не исключено, что количественные и структурные особенности вкДНК отражают изменения, происходящие в организме новорожденного при перинатальной патологии.

Таким образом, разносторонняя характеристика вкДНК (ее количество, размер, происхождение) у новорожденных детей в норме и при патологии может иметь как фундаментальное, так и практическое значение для медико-биологической науки, обеспечивая теоретическую и методологическую основу для нового подхода к ранней диагностике нарушений иммунитета.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилась характеристика внеклеточной ДНК плазмы крови как участника иммунного ответа у новорожденных детей в раннем неонатальном периоде.

Задачи

В соответствии с основной целью исследования были поставлены следующие задачи:

о Провести сравнительный количественный анализ вкДНК плазмы крови у новорожденных детей в норме и при перинатальной патологии.

о Исследовать содержание апоптотических и активированных клеток в популяции лимфоцитов периферической крови во взаимосвязи с концентрацией вкДНК, для подтверждения возможности лимфоцитарного происхождения вкДНК.

о Охарактеризовать вкДНК плазмы крови новорожденных детей по размеру молекул и по содержанию некоторых мобильных генетических элементов (МГЭ), относящихся к семействам LINE1 и Alu, в норме и при перинатальной патологии.

о Определить уровень содержания антител (AT) к нативной и денатурированной ДНК (нДНК и дДНК) у новорожденных детей в норме и при перинатальной патологии и провести корреляционный анализ между концентрацией вкДНК и содержанием AT к н- и дДНК для выявления возможного участия вкДНК в иммунном ответе.

Научная новизна

Впервые изучены концентрация вкДНК плазмы крови и содержание AT, реагирующих с нативной и денатурированной ДНК у новорожденных детей.

Выяснено, что перинатальная патология сопровождается нарушением апоптоза лимфоцитов в сторону его усиления. На основании анализа корреляционной связи между содержанием апоптотических / активированных лимфоцитов и концентрацией вкДНК установлено, что вкДНК плазмы крови новорожденных детей может происходить как из апоптотических, так и из активированных клеток, циркулирующих непосредственно в периферической крови.

Показано, что в случаях патологии вкДНК представлена, в основном, фрагментами низкой молекулярной массы, содержит LINE-элементы и инвертированные Alu-повторы.

Обнаружена взаимосвязь концентрации вкДНК и содержания AT к обоим типам ДНК при некоторых заболеваниях в неонатальном периоде. Выявленная взаимосвязь носит разнонаправленный характер в зависимости от типа патологии и гестационного возраста ребенка, что может иметь существенное значение для ранней, доклинической диагностики и прогноза нарушений иммунитета в раннем неонатальном периоде и последующих возрастных этапах. В случае положительной связи предполагается наличие аутоиммунного ответа на вкДНК уже в раннем неонатальном периоде.

Научно-практическая значимость работы

Разработана теоретическая и методологическая база для нового подхода в доклинической диагностике патологии иммунной системы на основе анализа нарушения апоптоза иммунокомпетентных клеток у новорожденных детей. Результаты работы в дальнейшем могут быть использованы в медицине (иммунологии и педиатрии) для оценки состояния новорожденных и прогнозирования развития иммунологических осложнений.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в

исследование

Работа в течение 2001 - 2005 гг. выполнялась в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ гос. регистрации 01.200300073), с 2006 по 2010 гг. проводится в соответствии с планом НИР № 01.200609657. Исследования поддержаны грантом НИОКР АН РТ (03-3.3-76/2006Г). Научные положения диссертации и выводы базируются на собственных результатах исследований автора. Изучение состояния популяции лимфоцитов выполнялось на базе каф. детских болезней КГМУ, совместно с иммунологической лабораторией РЦПБ СПИД.

Положения, выносимые на защиту

1. Концентрация вкДНК у недоношенных новорожденных детей и у новорожденных с перинатальной патологией повышена по сравнению с данным показателем в контрольной группе.

2. ВкДНК плазмы крови происходит из активированных и апоптотических лимфоцитов.

3. ВкДНК плазмы крови новорожденных детей в норме представлена высокомолекулярными фрагментами ДНК, а при патологии — фрагментами деградированной ДНК. В составе последовательностей вкДНК содержатся МГЭ, относящиеся к семействам LINE1 и Alu, содержание которых различно в норме и при патологии.

4. Между концентрацией вкДНК и уровнем содержания AT к ДНК существует взаимозависимость, свидетельствующая о возможности влияния вкДНК на уровень содержания AT.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на ежегодных научно-практических конференциях Казанского государственного университета (2004 — 2006 гг.), на ежегодной региональной конференции «Педиатрия и детская хирургия в приволжском федеральном округе» (Казань, 22 - 23 ноября 2005 и 2006 г.г.); на Научно-практической конференции молодых ученых (КГМА, Казань, 2006); на международном конгрессе "Иммунитет и болезни: от теории к терапии" (Москва, 3-8 октября 2005); на международных конференциях: «Дни науки 2005» (Днепропетровск, 2005), «Circulating Nucleic Acids in Plasma or Serum - IV» (London, UK, 2005) и «Bioscience 2006 - bioscience for the 21st century», (23 - 27 July, Glasgow, UK, 2006).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 работы в центральных изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и |6 таблиц; состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, включающего 235 ссылок, из которых 91 на отечественные, 144 на зарубежные работы.

Благодарности за помощь в работе

Данная работа посвящается научному руководителю, доктору биологических наук, профессору В.Г. Винтеру. Автор выражает искреннюю благодарность за всестороннюю помощь в работе научному руководителю д.б.н. Абрамовой 3 И., зав. кафедрой биохимии, проф. Ишмухаметовой Д Г., инженеру каф. биохимии Гаврилову B.C., зав. кафедрой детских болезней КГМУ, проф. Софронову В.В., зав. каф. биохимии КГМУ, д.м.н. Мустафину И.Г., зав. отделением патологии новорожденных городской клинической больницы № 4 Емикеевой В.А., а так же всему коллективу кафедры биохимии Казанского государственного университета и коллективу лаборатории КЛД Федерального научно - клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии г. Москвы и лично д.м.н., проф. Белохвостову A.C. за помощь в освоении методов ПЦР и в организации ПЦР-лаборатории.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовались образцы плазмы и лимфоциты периферической крови новорожденных детей (п = 277) и их матерей, полученные в период с 2003 по 2006 годы. Контингент новорожденных детей был представлен доношенными и недоношенными новорожденными различных сроков гестации (табл. 1).

Таблица 1. Группы новорожденных, взятые в исследование в зависимости от гестационного возраста____

Группа Гестационный возраст Масса тела (г) n i

Доношенные 38 - 40 недель 2550 -4700 по 1

Недоношенные I степени 35 - 37 недель 2145 -2960 -54

Недоношенные 11 степени 32 - 34 недели 1560 - 2220 • ' 59 !

Недоношенные III степени < 31 недели 980- 1800 г , 53 1

Перинатальная патология у доношенных и недоношенных новорожденных детей была представлена заболеваниями: внутриутробная инфекция (ВУИ), перинатальная патология ЦНС (ПП ЦНС), задержка внутриутробного развития (ЗВУР), респираторный дистресс-синдром (РДС), проявляющийся в виде пневмопатии (Табл. 2).

Таблица 2. Характеристика подгрупп новорожденных, взятых в исследование

Группа Подгруппа Масса тела п

Доношенные ПП ЦНС 2550 - 4700 31

ВУИ 9

ЗВУР 14

РДС 10

Недоношенные ПП ЦНС 2145-2960 21

I степени ВУИ 8

ЗВУР 13

РДС 14

Без тяжелых осложнений 9

Недоношенные ПП ЦНС 1560-2220 8

II степени ВУИ 10

ЗВУР 16

РДС 20

Без тяжелых осложнений 5

Недоношенные ПП ЦНС 980- 1800 11

III степени ВУИ 16

ЗВУР 17

РДС 13

Без тяжелых осложнений 6

Контрольную группу составили доношенные новорожденные дети (п = 26), без патологии, с массой тела при рождении 3000 - 3880 г, с оценкой по шкале Апгар 8-10 баллов.

Кровь в объеме 1 мл брали с помощью катетера, самотеком из локтевой вены в вакуумные пробирки с напыленной ЭДТА- Nao. Кровь центрифугировали при 41|С последовательно при 1,5 тыс. оборотов в минуту (об/мин) - 10 минут, при 3 тыс. об/мин - 15 минут, при 5 тыс. об/мин - 15 минут.

Определение концентрации вкДНК. Плазму крови депротеинизировали по стандартной методике (Маниатис, 1984), с использованием протеиназы К («Serva», Германия), фенола и хлороформа. Концентрацию вкДНК в депротеинизированных образцах определяли спектрофлуориметрическим методом с использованием интеркалирующего красителя Hoechst 33342 («Sigma», Германия) на люминесцентном спектрофотометре MPF-4 («Hitachi», Япония).

Исследование состояния популяции лимфоцитов периферической крови новорожденных детей. Согласно методике цитофотометрии (Olson, 1974; Козинец, 1986), готовили мазки периферической крови, фиксировали клетки метанолом, окрашивали по Фельгену и определяли площадь ядра, плотность упаковки хроматина и уровень содержания ДНК в ядре клетки с помощью микроскопа «Люмам ПМ-11», соединенного через интерфейс И2 с ПК. Измерения проводили в проходящем свете с фильтром 3E11-3 (с полосой пропускания 480 - 560 нм) и объективом МИ-90. Использовали следующие параметры измерения: размер зонда - 0,05 мм с проекцией на объект - 0,56 мкм и шаг сканирования - 0,5 мкм в гомогенном режиме. Полученные данные подвергали математическому анализу для определения процента клеток с морфологическими проявлениями апоптоза (сжатое ядро, конденсированный хроматин и сниженное содержание ДНК в ядре) и активированных лимфоцитов (увеличенное ядро и повышенное содержание ДНК в ядре).

Результаты были дополнены методом проточной цитометрии с использованием пропидиума йодида на цитофлуориметре FacsCalibur («Becton Dickinson», США). Данным методом определяли процент гиподиплоидных (апоптотических), диплоидных и тетраплоидных (пролиферирующих) лимфоцитов.

Размер фрагментов вкДНК определяли по электрофоретической подвижности фрагментов вкДНК, выделенных из суммарного пула образцов плазмы крови новорожденных детей в норме (5 мл) и при патологии неонатального периода (5 мл) в 0,7% агарозном геле.

Наличие МГЭ в плазме крови определяли методом ПЦР с помощью праймеров:

• На З'-концевой участок LINE: 5'-ctgaatgggttccttcag-3' и

5' -gaattaacccttgaccctag-3';

• На 5'-концевой участок LINE: 5'-agaaaggtggcttcgagagg-3' и

5'-catggactctgtcctcggcg-3' (Владимиров, 2002);

• Непарный праймер Тс65 (Nelson, 1998):

5 '-aagtcgcggccgcttgcagtgagccgagat-3'.

Последовательности праймеров, взятые из источников литературы, были проверены через базу данных BLAST (NCBI).

Продукты амплификации визуализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле с окраской бромистым этидием. Количество амплификатов определяли денситометрией негативов с помощью компьютерной программы Scionlmage 4.02.Beta.

Содержание AT к ДНК, относящихся к классу IgG, в плазме крови новорожденных детей и их матерей оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на 96-луночных планшетах Linbro («Flow», США). В качестве стандарта использовали пул образцов плазмы крови здоровых мужчин 20 - 25 лет (25 человек), содержание AT к ДНК у которых находилось в пределах доверительного интервала, определенного нами для данной группы. Положительным контролем при постановке анализа служила сыворотка крови женщины, страдающей системной красной волчанкой (СКВ).

Для выявления популяции AT к нативной ДНК (нДНК), в качестве антигена (АГ) использовали коммерческий препарат нативной ДНК эритроцитов цыплят.

Для выявления популяции AT к денатурированной ДНК (дДНК), ДНК эритроцитов денатурировали кипячением с lxSSC (0,0015М NaCl, 0,00075М цитрат Na) и добавляли 35% формальдегид, содержащий 0,001М ЭДТА. Степень денатурации определяли по величине гиперхромного эффекта.

В ИФА использовали антитела к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой (CH1/HRP к IgG человека, «Сорбент ЛТД», Москва). В качестве индикаторного красителя использовали ортофенилендиамин. Интенсивность цветной реакции измеряли на приборе Multiscan ("Flow", Англия) при длине волны 492 нм.

Статистический анализ. В каждой выборке определяли величину асимметрии и эксцесса для оценки характера распределения данных. Так как распределение признака в большинстве выборок отличалось от нормального, для характеристики каждой выборки использовали такие показатели как медиана и перцентили (2,5; 25; 75; 97,5). Для сравнения данных применяли дисперсионный анализ, используя критерии Манна-Уитни, Ван-дер-Вардена и Краскела-Уоллиса, предусмотренные для сравнения ранжированных значений (Лакин, 1990; Акберова, 2004), с поправкой Бонферрони (Акберова, 2004) для исключения эффекта множественных сравнений. Взаимосвязь между параметрами оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена (Лакин, 1990). Статистическая обработка выполнена с помощью пакета программ Excel Office 2000.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Концентрация вкДНК. На первом этапе исследования установлены нижняя и верхняя границы нормы для концентрации вкДНК плазмы крови (рис. 1) в контрольной группе относительно здоровых новорожденных детей (определены как 2,5 и 97,5 перцентили, соответственно). Индивидуальные показатели концентрации вкДНК в контрольной группе варьировали от 9,18 до 55,51 нг/мл со средним значением 22,51 нг/мл (медиана).

ЮО0 ♦ ДНК

90 0 ——2 5 лбрценкль

50 0 5 перцектипь

70.0 ■ —1—медиана

и I 60.0 *

X у* 3 50 .0 40.0 30.0 20.0 » • ♦ .

--^-

Рис. 1. 1I сказатели концентрации вкДНК в контрольной группе (пояснен Я я в тексте).

Проведено исследование концентрации вкДНК плазмы крови у недоношенных новорожденных детей различного гестационного возраста без тяжелых осложнений перинатального периода (рис. 2).

05ез ос лож ■ П5Т0ЛСГ/Я

33-40

зь - 37 32 - 34

недеды

29-31

Рис. 2. Концентрация ВкДНК у

новорожденных детей различного гестационного возраста. Светлый столбик на

I истограмме показатель в

контрольной груши?. Числами обозначены средМие значения (медиана).

Результаты показали, что у недоношенных детей без тяжелых осложнений и у доношенных и недоношенных детей при перинатальной патологии концентрация вкДНК повышена по сравнению с концентрацией вкДНК в контрольной группе. Максимальные показатели наблюдались у недоношенных детей 32 - 34 недель гестацнИ (рис. 2).

При отдельном рассмотрении каждого заболевания установлено, что концентрация вкДНК во всех подгруппах детей достоверно выше, чем в контрольной группе от носитель!го здоровых доношенных детей. Максимальные показатели концентрации вкД! 1К при всех исследованных заболеваниях наблюдались в гестационный период 32 — 34 недели (рис. 3). Подъем показателей концентрации вкДНК в данный I естацйбнный период свидетельствует о тога, что концентрация (5 к ДНК плазмы крови зависит как от патологии, так и от степени недоношенности.

35 -37 32-34

недели

29-31

Рис. 3. Показатели концентрации вкДНК у новорожденных при

различных заболеваниях.

Причины появления вкДНК в плазме крови новорожденных детей. По данным литературы, вкДНК может экскретироваться активированными лимфоцитами (Rogers et al., 1972; Янева, 1990) или являться результатом их апоптотической гибели (Stroun et al., 1987). Кроме того, лимфоцит, отражая стереотипные изменения, происходящие в клетках разных локусов организма (Нарциссов, 1986), является наиболее доступным объектом для исследования. Поэтому для решения поставленной задачи было исследовано состояние популяции лимфоцитов периферической крови детей 6 раннем неонатальном периоде.

Результаты исследования выявили среди популяции лимфоцитов контрольной группы в среднем 2,5 % активированных (пролиферирующих) и 2,9 % клеток с морфологическими проявлениями апоптоза (рис. 4а).

У недоношенных новорожденных всех трех гестационных периодов без тяжелых осложнений обнаружено значительное повышение доли апоптотических лимфоцитов (рис. 4а). Увеличение количества апоптотических клеток было еще более выражено при перинатальной патологии (рис. 46) и достигало максимальных значений в гестационном периоде 32 - 34 недели.

Наряду с апоптотическими клетками, в популяции лимфоцитов периферической крови выявлены лимфоциты с признаками активации. Максимальное количество активированных лимфоцитов наблюдалось у недоношенных 32 - 34 недель гестации с патологией (рис. 46).

Корреляционный анализ связи количества активированных, апоптотических клеток и концентрации вкДНК выявил корреляцию средней степени между активированными клетками и концентрацией вкДНК плазмы крови у доношенных новорожденных. У недоношенных детей 35 - 37 и 32 - 34 недель гестации наблюдалась прямо пропорциональная зависимость концентрации вкДНК от содержания активированных и апоптотических клеток.

У новорожденных 29 - 31 недели ге стации выявлена взаимосвязь концентрации вкДНК только с а поглоти чески ми клетками (табл. 3).

!'ис. Содержание

агюптотических (темные столбики) )<

активированных (светлые столбики) клеток в

ПОДУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ

периферической крови новорожденных детей: а -бе? тяжелых осложнений, б при ветганатальноЙ

ЦИТОЛОГИи

Таблица Коэффициенты корреляции между показателями концентрации вкДПК и активированными (г[)/апоптогическими (г;) лимфоцитами___

Гестационный возраст (нслсли) П Г2

38 - 40 0,400 (Р<0,05) 0.257 (Р>0.0э)

35-37 0,570 (Р<0.(Щ 0,60« (Р<0.05)

32-34 0,707 (Р<0,01) 0,619 (Р<0.05)

29-31 0,081 (Р>0.05) 0,880 (Р<0,01)

Полученные результаты показали, что недоношенность и перинатальная патология сопровождаются нарушением апоптоза в сторону его усиления, и позволили сделать вывод о том, что вкДПК и кровотоке новорожденных лег ей может происходить как из активированных, так и из апоптотических клеток.

Характерис гика вкД1 ÍK. Существование двух различных путей появления вкДНК в кровотоке ставит вопрос о различии сиойсти такой ДНК. Л i un Hi длин фрагментов вкДНК у новорожденных в норме и при патологии показал (рис, 5), что у здоровых детей вкДНК плазмы представлена высокомолекулярной фракцией (>21 i.ii.ii.), тогда как при патологии снижается содержание вые оком ол е кул я рЙО й фракции и появляются низко молекулярные фрагменты (3 - 5 т.п.н.).

! 2 ... 3 .jlii^t-w.

Рис. 5. Электрофоре грамма подвижности фрагмент^!! вкДНК н

0.7.% атарозном т еле

1. ДНК фагалямбда

2. вкДНК. выделенная из плазмы ¡крови новорожденных с патологией

3. вкДНК. выделенная из плазмы 5148 крови здоровых детей

4. маркер длин фрагментов ДНК 4473 ~ ДНК фата лямбда. И30 фраг.иет(тмрованлая Hind JJf и HíoR!

2027

afils ^яНжЯинЕ яШ&ш

EPBl^ÍÍJI

К 21225

Следует отметить, что деградированная ДНК при патологии представлена более длинными фрагментами, чем апопготическая ДНК (обычно имеющая размеры, крат ные размерам ДНК нуклеоеомы - 200 п.п.). В качестве рабочей гипотезы, требующей дальнейшего исследования, можно предположить, что наряду с усилением а по птоза, происходит его нарушение на этапе деградации СV /Ме: -завиеимой нуклеазой. отвечающей за межнуклеосоммую деградацию Д] 1К.

Особый интерес представляло наличие в плазме крови МГЭ семейства 1.1КГ.-э/1ементы существуют в плазме крови в 2-х формах: полной и укороченной с 5'-конца (Владимиров, 2002). Длина полной формы 1ЛМН составляет более 3000 п.п., поэтому в работе амплифицировали 3" и 5'-концевые фрагменты ИКЕ-ДНК (по 100 п.н.). О содержании полных форм l.INI7.-элементов в плазме крови судили по выявлению 3' и 5'-концевых участков в равных пропорциях. Укороченные формы ЦМН-ЭЛементоз определяли по преобладанию З'-конценых участков в одном и юм же образце.

В данном исследовании ЫЫЕ-элементы выявлены как у относительно здоровых новорожденных детей, так и у новорожденных с патологией (рис. 6). ВкДНК относительно здоровых детей содержит полные формы ИЗ^Е-элементов (т.е. амгщрфицировались и 3'-. и 5'- фрагменты последовательности ИЫЕ).

Увеличения относительного содержания ЫКЕ-элементов (относительно общего содержания вкДНК) у больных новорожденных по сравнению со здоровыми обнаружено не было, но изменялось соотношение полных и

jшроченных форм. 1ак, при IГ11 ЦНС фтмечалрсь наличие укороченных UM-.-элементов > 66.7 % новорожденных, при РДС ■ \ 6Ü %.

Абсолютное увеличение LtNE-элементов может являться одной из причин усиления апоиточа лимфоцитов, за счет способности лих фрагментов ДМК проникать в клетки и вызывать программированною клеточную гибель, что было показано при лучевой патологии (Владимиров, ] 998 ). Увеличение содержания укороченных форм свидетельств}«! об усилении процессов неравной рекомбинации между 1,INЕолементами. что разленивается кик показатель генетическою стресса (Владимиров, 2002).

\ - г 4 5 £

Рис. 6 Примеры к.].тморфиша l.INl-VvicMeiucw в илачме крови новорожденных летен. выявленною методом i!! IP:

а: ! - >'-кон некой участок I [М-. \ новорожденного с HII ЦНС'

3 - .V-KOHiicBtiii участок 1.IM. > новорожденного с ! III ЦНС

4, 6 - 5 >конценой \ часток UNI: у новорожденного с РДС

1 З'-кЭДНевоЙ > чае I ок LINI - > новорожденно! о с РДС

2 отрицательным контроль

5 Маркер длин фрагментов Д! IK" 100 12000 иль («Invitrogct»». I SЛ i: fi; 1 - 5'-концевой; час ток I IN Ivy н оворожл^ нно го с III i ЦНС

2 - 3'-концевой участок 1.1 М: у новорожден] ки ос III [ ЦНС

3- 5'-кон новой участок I 1N1 > i.iopoeoj о новорожденно] о

4 5'-концевой участок I INI v здорового новорожденного

5 отрицательный контроль

6 Маркер длин фрагментов Д1!!< 100 !200(1 н.н. Mmiirogen». I SA)

Другой тип последовательностей - инвертированный А)и-гювторы (интер-Alu) были амплифиаррованы на матрице ДНК. выделенной из плазмы крови новорожденных детей, с помощью непарного нраймера Гс65. предложенного Nelson для идеитифнкаиии человеческой Д1 (К в гибридах человеческих лимфоблаетов и клеток грынов i Nelson. 1998).

Фрагменты вк,Ц[ IK. фланкированные имтер-Alu (рис. 7), амплифииировйдась и 30% образцов плазмы Крови, взязых от относительно здоровых новорожденных и в 90% случаев при перинатальной патологии, 13 том числе: при ПП ЦНС - у 303 %: при ЗВУР - у 100 %: при СДР - у 100 %: при ВУИ - у 50 % новорожлендах.

При лснситомсгрии негативов выявлено увеличение абсолютного количества ицтер-Alu В плазме крови новорожденных с патологией tío сравнению с Тс 6 5 - п о л ожител ьн ьш и образцами плазмы относительно здоровых летей. При некоторых заболеваниях (РДС при 11 степени недоношенности и ВУИ) увеличение количества шпор-Al и повторов достигало 300 % от уровня нормы.

Увеличение Содержания AI о-лекторов в составе вкДНК плазмы крови ранее документировано лля аутоиммунных заболеваний (Li, Stein ma п. 1989). Следует отметить, что антитела-абчимы, реагирующие с нДНК у больных аутоиммунными заболеваниями. обладают специфичностью к CpG-обогащенным участкам ДНК (Piseisky. 2001; "Iran. 2003). lie исключено, что выявленные Alu обладаю! иммуностимулирующими свойствами, так как еодержат большое количество с р Ср - д и i j у ю i е от и до e (Pavlicek ci al., 2001; Pisetsky. 2001).

Рис. 7, Интер-Alu павторы и н.чалме крови новорожденных детей, выявлеШше 1ÍJ )Р;

а: I ■ Маркер длин фрагментов Д1 IK IОС) 12000и.в Mnviiroijcn». L'SA) 2, 3 - положителыйЯ зеакння с Тс65 у чдоррвого новорожденною 4 ■■ положительная реакция с Тс65 у новорожденной с ЗВУР б: 1 - Маркер длин фрагментов ЛИК 100 12ООН п.Н: («Ins'jtroger»^ L'SA) 2 - положительная реакция с ТсбЗ у новорожденною с НУ И ,t. 4 - положительная реакция с Тс65 \ новорожденных с ПП ЦНС

Взаимосвязь концентрации вкЛ8 <К с содержанием Л "Г к ДНК у новорожденных. На данном этапе работы были определены средние показатели содержания АТ к н- и дДНК в контрольной группе, вставившие, соответственно 1,23 и 1,02 отн. ед., и Гранины нормы содержания АТ к ДНК в контрольной группе, которые определены как 2,5 и 97.5 перцентили (рис. 8).

2.50

2,00 -

1.50

1.00

0.50

Г- 2 25

-I- 0.58 АТ к нД1 НС

2 05

0.00

Ркс. Й. Уровни содержания Л'Г к |[- и дДИК ) новорождеййых детей контрольной группы. Нижняя метйа погрешности - 2.5 лерцеитиль, нижняя - 97.5 перцентиль. Треугольником обозначена медиана?

При исследовании содержания АТ к ДНК у недоношенных новорожденных без тяжелых осложнений, не выявлено характерной для ^О зависимости их содержания от гестационного возраста (рис. 9). Так, у новорожденных 35 - 37 и 29 - 31 недель гестации содержание АТ к нД1 (К было достоверно ниже нормы, тогда как у новорожденных 32 34 недель юстиции уровень АТ к нДНК превышал аналогичный показатель в контрольной группе почти в 2 раза, В случае АТ к дДНК минимальные, достоверно более низкие значения наблюдались у новорожденных 29 - 31 педели гестации.

При перинатальной патологии у новорожденных 38 - 40 недель гестации уровень содержания АТ к нДНК снижен по сравнению с нормой. В остальные геста цн о иные периоды достоверных отличий от уровня нормы не выявлено. В гестационные периоды 35 - 37 и 29 - 31 недель уровни содержания АТ к нДНК при патологии превышали аналогичные показатели у недоношенных новорожденных без осложнений.

Уровни содержания АТ к дД11К у новорожденных с перинатальной патологией не отличались от та копы х показателей у новорожденных соответствующих гестационных возрастов без тяжелых осложнений.

Показатели АТ к ДНК у новорожденных варьируют в широких пределах. Отсутствие зависимости уровня содержания АТ к ДНК от гестационного возраста позволило нам предположить, что пул АТ к ДНК может формироваться не только за счет транс плацентарного перехода материнских антител (содержание которых зависит ог гестационного возраста). I ]е исключено, что иммунная система ребенка способна продуцировать АТ к ДНК

в ответ на появление в кровотоке вкДНК. Это определило необходимость исследовать факторы, влияющие на содержание АТ к ДНК у новорожденных. Для решения поставленной задачи был проведен корреляционный анализ, устанавливающий взаимосвязь содержания ЛТ к ДНК у новорожденных с аналогичным показателем у их матерей, с массой тела детей при рождении и с концентрацией вкДНК.

АТ к нЦНК

38-40 35-37

32 - 34 29 - 31

недега

3.50

О.ОО

АТ кдДНК

□ без ос/так ■ патология

за- 40

35-37

32-34

169 0.59

29-31

Рис. 9. Уровни содержании ЛТ к нДНК и дДНК > новорожденных детей различного гестацийвяого возраста без осложнений и при перинатальной

патологии. Светлый

столбик - показатели А Г в контрольной группе

относительно здоровых новорожденных .тетей.

Результаты показали, что у относительно здоровых новорожденных (табл. 4) уровень содержания АТ к нДНК практически в равной мере зависит как от содержания АТ к нДПК у матери, так и от массы тела ребенка при рождении. Уровень содержания АТ к дДНК коррелирует с материнским уровнем ЛТ к дДНК. Взаимосвязи с концентрацией вкДНК не обнаружено.

В группах недоношенных новорожденных без тяжелых осложнений (табл. 5) корреляционный анализ показал, что лишь у Детей 35 - 37 недель

гестации сохраняется средняя степень корреляции (Р > 0,05) с материнским уровнем АТ к нДНК. При других гестаиионных периодах эта взаимосвязь пропадает. В то же время более значительным становится влияние вкДНК -наблюдаются корреляции средней степени (Р > 0,05) при гестационном возрасте 35 - 37 и 32 - 34 недели.

Таблица 4. Коэффициенты корреляции между содержанием АТ к ДНК у ребенка и у матери (п): между содержанием АТ к ДНК и массой тела при рождении (г2); между содержанием АТ к ДНК и концентрацией вкДНК в плазме крови (гз) у новорожденных

Подкласс АТ к ДНК Г1 Г2 Гз

АТ к нДНК 0,506* 0,643* 0.145

АТ к дДНК 0,638 * 0.376 0.116

* - Р < 0.05

Таблица 5. Коэффициенты корреляции между содержанием АТ к ДНК у ребенка и у матери (Г]); между содержанием АТ к ДНК и массой тела при рождении (г2): между содержанием АТ к ДНК и концентрацией вкДНК в плазме крови (гз) у недоношенных новорожденных без тяжелых осложнений перинатального периода

Подкласс АТ Гестационный Г1 Г2 Гз

к ДНК возраст(недели)

АТ к нДНК 35-37 0.410 0,257 0,371

32-34 - - 0.350

29-31 - - 0.291

АТ к дДНК 35-37 - - -

32-34 - - 0,452

29-31 - - -

В общих гестационных группах новорожденных с перинатальной патологией не выявлено значимой взаимосвязи между исследуемыми параметрами, что определило необходимость анализа корреляции при каждом заболевании (табл. 6). Выяснено, что в некоторых случаях содержание АТ к н-или дДНК определяется материнским уровнем АТ й/или массой тела ребенка при рождении. Наряду с этим, становится все более значимой взаимосвязь между уровнем содержания АТ к обоим типам ДНК и концентрацией вкДНК.

Необходимо отметить, что при одних и тех же заболеваниях, но в различные гестационные периоды связи между двумя исследуемыми параметрами носили разнонаправленный характер: у новорожденных 38 - 42 и 32 - 34 недели в большинстве случаев корреляция носила характер обратной зависимости, а у новорожденных 35 - 37 и 29 - 31 недель гестации - прямой.

Не претендуя на объяснение каждого конкретного заболевания (это требует отдельных клинических исследований), позволим себе сделать общее предположение, что снижение содержания АТ к ДНК при возрастании концентрации вкДНК можно объяснить расходованием имеющихся в кровотоке новорожденного АТ данного класса, вероятно, перешедших к нему от матери,

на формирование иммунных комплексов с вкДНК, неактивных в реакции ИФА. С этой точки зрения, непосредственный интерес представляет исследование содержания иммунных комплексов в плазме крови новорожденных детей, что будет выполнено в ходе дальнейшей работы.

Таблица 6 Коэффициенты корреляции между содержанием ЛТ к ДНК V ребенка и у матери (гО: между содержанием АТ к ДНК и массой тела при рождении (гг). между содержанием АТ к ДНК и концентрацией вкДНК в плазме крови (г3) у новорожденных с

Подкласс Гестационный |

АТ к ДНК возраст Патология Г| Г2 гз

(недели)

38-40 ПП ЦНС 0.500 -0.245 -0,643*

ЗВУР - 0.736* -0,778*

ВУИ 0.881* 0.509 -

РДС -0.569 - -0.486

35-37 ПП ЦНС - - -

ЗВУР - - 0,670*

ВУИ 0,780* 0,307 0,800*

§ РДС - 0,381 -

32-34 ППЦНС 0.280 0.254 -0,508*

< ЗВУР - -0.552 -0,682*

ВУИ - 0,579 -

РДС 0,309 - -0,342*

1 29-31 ППЦНС -- 0,724*

ЗВУР -0,407 0^48

ВУИ . 0,874* '' -

рдс 0,250 0,347 0,301

38-40 ППЦНС - - -0.486

ЗВУР - 0.809* -0,920*

ВУИ - 0.561 0,300

рдс 0.515 - -

35-37 ПП ЦНС - - -0.383

ЗВУР - 0,759* 0,700*

v/ ВУИ -0,708 0,579 -

1 РДС -0,434 - 0,338

32-34 ПП ЦНС 0.378 0.254 0,746*

< ЗВУР - -0.552 -

ВУИ - 0.579 -

рдс 0.309 - -

29-31 ППЦНС 0,459 - 0,259

ЗВУР - -0,714* 0,371

ВУИ - - -

РДС - 0,470 0,606*

* - Р < 0.05

Прямую зависимость между показателями концентрации вкДНК и содержания АТ к ДНК можно объяснить выработкой собственных АТ, то есть, аутоиммунным ответом на вкДНК в раннем неонатальном периоде.

Полученный результат позволяет сделать вывод, что вкДНК может изменять уровень содержания АТ к ДНК, повышая или снижая его. Причем это влияние разнонаправлено в зависимости от типа патологии и гестационного возраста и может быть использовано в дальнейшем для оценки состояния иммунной системы новорожденного ребенка в раннем неонатальном периоде и прогноза развития патологии иммунной системы в последующие возрастные этапы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные результаты и данные литературы, мы предположили, что вкДНК апоптотического происхождения может являться важным участником иммунного ответа, приводящим к срыву иммунологической адаптации у недоношенных новорожденных и у новорожденных с перинатальной патологией. Негативное влияние вкДНК может быть реализовано следующим образом. При появлении на свет новорожденного ребенка, большая часть лимфоцитов которого не имеют на своей поверхности (Володин, 1999), поток чужеродных АГ приводит к их активации, которая заканчивается активационно-индуцированным апоптозом (Талаев, 1997; Хаитов, 2000). У недоношенного ребенка, особенно при комбинированном, экзо- и эндогенном, воздействии на ДНК иммунокомпетентных клеток ДНК-тропными агентами (ДНК-вирусы или гипоксия), происходят наиболее тяжелые формы нарушения репликации ДНК (Караулов, 1991), что ведет к активации апоптоза и выходу в кровоток большого количества апоптотических продуктов (Но1с1еппес1ег, 2004). Вышедшие в кровоток апоптотические тельца элиминируются фагоцитами. В случае дефекта в фагоцитарной системе или при «перегрузке» фагоцитарного звена умирающими клетками, апоптотические тельца могут образовывать иммунные комплексы с АТ к ДНК, полученными ребенком от матери, активируя таким образом систему комплемента и В-лимфоциты. Активированные лимфоциты, в свою очередь, могут экскретировать вкДНК или вырабатывать АТ, реагирующие с нативной и денатурированной ДНК, которые, возможно обладают каталитическими свойствами. Не исключено, что именно дальнейшая активация лимфоцитов и активационно-индуцированный апоптоз способствуют прогрессированию заболевания, обуславливая нейтропению (Володин, 1999), апоптоз макрофагов ^вейку, 2004) и выработку провоспалительных цитокинов (Таболин, 1997), повреждающих гематоэнцефалический барьер и приводящих к патологии ЦНС. В этом плане следует особенно выделить группу недоношенных-новорожденных детей 32 -34 недель гестации, у которых наблюдались максимальные показатели концентрации вкДНК, содержания апоптотических и активированных лимфоцитов. По данным литературы и жизненному опыту неонатологов, именно в этом гестационном возрасте отмечается наибольшая частота перивентрикулярных кровоизлияний (Зубарева, 2006), обуславливающая патологию ЦНС и смертность новорожденных этого гестационного периода.

Дальнейшее комплексное исследование концентрации внеклеточной ДНК, содержания и свойств AT к ДНК, количества иммунных комплексов, состояния лимфоцитов и фагоциарного звена у новорожденных детей во взаимосвязи с клиническими параметрами расширит представление о причинах иммунологических заболеваний и увеличит эффективность их лечения.

ВЫВОДЫ

1. В плазме крови новорожденных детей в норме и при патологии присутствует внеклеточная ДНК, концентрация которой значительно увеличена у недоношенных новорожденных и у новорожденных с перинатальной патологией и максимальна у новорожденных с гестационным сроком 32 - 34 недели

2. В популяции лимфоцитов относительно здоровых новорожденных детей обнаружены лимфоциты с признаками апоптоза и активации (2,9 и 2,5 %, соответственно). У новорожденных различных гестационных возрастов без осложнений и при перинатальной патологии наблюдается нарушение апоптоза лимфоцитов в сторону его усиления, достигающее максимальных значений у новорожденных с перинатальной патологией 32 - 34 недель гестации.

3. Прямая корреляция между интенсивностью апоптотической гибели лимфоцитов/ их активацией и концентрацией внеклеточной ДНК плазмы крови указывает на лимфоцитарное происхождение вкДНК.

4. В плазме крови новорожденных с перинатальной патологией присутствуют низкомолекулярные фрагменты ДНК, среди которых содержатся LINE-элементы и инвертированные Alu-повторы, обогащенные CpG-динуклеотидами.

5. Уровни содержания антител к нативной и денатурированной ДНК у новорожденных в норме составляют, соответственно, 1,23 и 1,02 отн. ед. и определяются содержанием AT к ДНК у матери и массой тела ребенка при рождении. У недоношенных новорожденных с перинатальной патологией выявлены взаимосвязи содержания AT к ДНК и концентрации внеклеточной ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Tuaeva N.O. The free-cell DNA in blood plasma of newborn babies -with perinatal CNS damage / N.O. Tuaeva. V.G Vinter. A.S. Belokchvostov // Clin. Chem. -2005. - V. 51. № 10.

P. 21.

2 Tuaeva N.O., Relationship between Cell-free DNA and Antibodies against DNA in Bloodstream of Newborns / N.O. Tuaeva. V.V. Sofronov. V.A. Kmikeeva. D.M. Mustafma. D.I. Sheguro\a The // BioScience2006 - bioscience for the 21st century. 23 - 27 July - SF.CC. Glasgow. UK. 2006 - Book Abstracts. - P. 9. 3. Сидорова H.I£ Внеклеточная ДНК плазмы крови > новорожденных детей с перинатальной патологией ЦНС / E.F. Сидорова. Н.О. Т> аева. 3 И Абрамова. В. Г. Винтер. С Э Гавор-

Кваши. В.В. Софронов. В А. Емикеева Н 1 Международный симпозиум. Сборник статей ученых Казанского университета (на русском и французском языках). - Казань: Казанский гослдарственный университет им. Ульянова-Ленина. 2005. - 568 с 4. Софронов В.В. Количественные параметры ядерной и внеклеточной ДНК } новорожденных с клиническими проявлениями нар) шения адаптации в раннем неонатальном периоде / В.В. Софронов. Н.О. Туаевя. ¡B Г. ВинтеД. В А. Емикеева. Д.И. Шегурова. Е.В. Маврина И Вопр. совр педиатрии. - 2006. - № 6. - С. 26 - 29 " Софронов В В. Характеристика ядерной и внеклеточной ДНК у новорожденных в зависимости от гестационного возраста / В В. Софронов. Н.О. Туаева. [В.Г.Винтф. В.А. Емикеева. Д.И. Шегурова // Российский педиатрический журнал. - 2006. - № 6. - С. 13 -15.

6. Туаева Н.О. Антитела к ДНК у недоношенных новорожденных детей / Н.О. Туаева, Д.М. Мустафина. В.А. Емикеева // Материалы международного конгресса "Иммунитет и болезни: от теории к терапии" 3-8 октября 2005. - с. 14.

7. Туаева Н.О. Аутоантитела к нативной ДНК у новорожденных детей группы риска / Н.О. Туаева, В.В. Софронов. В.Г Винтер. Д.М. Мустафина, В.А Емикеева. Е.В. Маврина // Материалы Международной научно-практической конференции «Дни науки 2005». Том 20. Медицина. - Днепропетровск: Наука i осв1та. - 2005. - С. 58 - 59.

8. Туаева Н.О. Взаимосвязь концентрации внеклеточной ДНК и содержания антител к нативной ДНК у новорожденных детей с пневмопатией / Н.О. Туаева. В.В. Софронов. В.А. Емикеева. З.И Абрамова. К.В. Туточкина. Д В. Мустафина. fe Г.Винтер'// Казанский медицинский журнал - 2006. - № 4. - С. 254 - 257.

9. Туаева Н.О. Внеклеточная ДНК плазмы крови при патологии новорожденных / Н.О. Туаева. Д.М. Мустафина, В.А. Емикеева // Научно-практическая конференция молодых ученых // Тезисы докладов. - Казань, 2006. - С. 25 - 26.

10. Туаева Н.О. Концентрация и фракционный состав внеклеточной ДНК плазмы крови у новорожденных детей с перинатальной патологией ЦНС / Н.О. Туаева, В.Г. Винтер. В.В Софронов. В.А. Емикеева // Ученые записки Казанского государственного университета Естественные науки.-2005 -Т 147 - С. 196-200.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IgG (D) - иммуноглобулины класса G (или D)

LINE - long interspersed nuclear element - длинные диспергированные ядерные элементы

АГ - антш ен

AT - антитело

вкДНК - внеклеточная ДНК

ВУИ - внутриутробная инфекция

дДНК - денатурированная ДНК

ЗВУР - задержка внутриутробного развития

Интер-Alu - инвертированные Alu-повторы

МГЭ - мобильные генетические элементы

нДНК - нативная ДНК

отн. еа - относительные единицы

ПП ЦНС - перинатальная патология ЦНС

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РДС - респираторный дистресс-синдром

СКВ - системная красная волчанка

Тин.- тысячи пар нуклеотидов

e-mail. NatahaTuaevaa'ksu ru Факс: -"-7(843)2387121

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжски.и межрегиональным территориальным управлением МЛТР РФ. Подписано в печать 18.01.2007г. Усл. п.л 1,3. ЗаказМК-6315. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Туаева, Наталья Олеговна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ФЕНОМЕН ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК: ПРОИСХОЖДЕНИЕ, СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

1.1.1. Причины появления вкДНК в кровотоке

1.1.2. Структурная организация и размеры молекул вкДНК плазмы крови в норме и при различных заболеваниях

1.1.3. Биологическая роль вкДНК в норме и при некоторых заболеваниях

1.1.4. Концентрация вкДНК в плазме крови в норме и при различных патологических состояниях

1.2. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК

1.2.1. ВкДНК как диагностический и прогностический критерий

1.2.2. Необходимость изучения вкДНК плазмы крови у новорожденных детей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей"

Актуальность проблемы

1998). Существуют убедительные доказательства участия вкДНК в патогенезе аутоиммунных заболеваний у взрослых лиц (Wiktorowich, 1987; Lorenz, 2000). Однако данные, представленные в источниках литературы немногочисленны, нуждаются в дополнениях и систематизации.

1999) заболеваниях, при выявлении генетически детерминированных патологий плода (Papasavva, 2005) и мониторинге беременности у женщин группы риска по преэклампсии (Zhou, 2005; Farina, 2005). Возможность использования вкДНК в медицине обусловлена изменениями ее концентрации, изменениями в структуре и размерах молекул вкДНК плазмы крови, появлением различных мутаций.

2002), в которой затрагивается вопрос возрастной динамики концентрации вкДНК плазмы крови, и две работы, в которых рассматривается половой диморфизм данного параметра (Wu, 2002; Jung, 2004). Исследований, касающихся вкДНК в плазме крови новорожденных, обнаружить не удалось.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилась характеристика внеклеточной ДНК плазмы крови как участника иммунного ответа у новорожденных детей в раннем неонатальном периоде. Задачи

В соответствии с основной целью исследования были поставлены следующие задачи: о Провести сравнительный количественный анализ вкДНК плазмы крови у новорожденных детей в норме и при перинатальной патологии, о Исследовать содержание апоптотических и активированных клеток в популяции лимфоцитов периферической крови во взаимосвязи с концентрацией вкДНК, для подтверждения возможности лимфоцитарного происхождения вкДНК. о Охарактеризовать вкДНК плазмы крови новорожденных детей по размеру молекул и по содержанию некоторых мобильных генетических элементов (МГЭ), относящихся к семействам LINE1 и Alu, в норме и при перинатальной патологии, о Определить уровень содержания антител (AT) к нативной и денатурированной ДНК (нДНК и дДНК) у новорожденных детей в норме и при перинатальной патологии и провести корреляционный анализ между концентрацией вкДНК и содержанием AT к н- и дДНК для выявления возможного участия вкДНК в иммунном ответе. Научная новизна

Научно-практическая значимость работы

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследование

Положения, выносимые на защиту

2. ВкДНК плазмы крови происходит в результате процессов активации и апоптоза лимфоцитов.

3. ВкДНК плазмы крови новорожденных детей в норме представлена высокомолекулярными фрагментами ДНК, а при патологии - фрагментами деградированной ДНК. В составе последовательностей вкДНК содержатся МГЭ, относящиеся к семействам LINE и Alu, соотношение которых различно в норме и при патологии.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на ежегодных научно-практических конференциях Казанского государственного университета (2004 - 2006 гг.), на ежегодной региональной конференции «Педиатрия и детская хирургия в приволжском федеральном округе» (Казань, 22 - 23 ноября 2005 и 2006 г.г.); на Научно-практической конференции молодых ученых (КГМА, Казань, 2006); на международном конгрессе "Иммунитет и болезни: от теории к терапии" (Москва, 3-8 октября 2005); на международных конференциях: «Дни науки 2005»

Днепропетровск, 2005), «Circulating Nucleic Acids in Plasma or Serum - IV» (London, UK, 2005) и «Bioscience 2006 - bioscience for the 21st century», (23 - 27 July, Glasgow, UK, 2006).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 работы в центральных изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включает J9 рисунков и \6 таблиц; состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, включающего 235 ссылок, из которых 91 - на отечественные, J44 - на зарубежные работы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Туаева, Наталья Олеговна

выводы

2. В популяции лимфоцитов относительно здоровых новорожденных детей обнаружены лимфоциты с признаками апоптоза и активации (2,9% и 2,5%, соответственно). У новорожденных различных гестационных возрастов без осложнений и при перинатальной патологии наблюдается нарушение апоптоза лимфоцитов в сторону его усиления, достигающее максимальных значений у новорожденных с перинатальной патологией 32 - 34 недель гестации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные результаты и данные литературы, мы предположили, что вкДНК апоптотического происхождения может являться важным участником иммунного ответа, приводящим к срыву иммунологической адаптации у недоношенных новорожденных и у новорожденных с перинатальной патологией. Негативное влияние вкДНК может быть реализовано следующим образом. При появлении на свет новорожденного ребенка, большая часть лимфоцитов которого не имеют на своей поверхности IgD (Володин, 1999), поток чужеродных АГ приводит к их активации, которая заканчивается активационно-индуцированным апоптозом (Талаев, 1997; Хаитов, 2000). У недоношенного ребенка, особенно при комбинированном, экзо- и эндогенном, воздействии на ДНК иммунокомпетентных клеток ДНК-тропными агентами (ДНК-вирусы или гипоксия), происходят наиболее тяжелые формы нарушения репликации ДНК (Караулов, 1991), что ведет к активации апоптоза и выходу в кровоток большого количества апоптотических продуктов (Holdenrieder, 2004). Вышедшие в кровоток апоптотические тельца элиминируются фагоцитами. В случае дефекта в фагоцитарной системе или при «перегрузке» фагоцитарного звена умирающими клетками, апоптотические тельца могут образовывать иммунные комплексы с AT к ДНК, полученными ребенком от матери, активируя, таким образом, систему комплемента и В-лимфоциты. Активированные лимфоциты, в свою очередь, могут экскретировать вкДНК или вырабатывать AT, реагирующие с нативной и денатурированной ДНК, которые, возможно обладают каталитическими свойствами. Не исключено, что именно дальнейшая активация лимфоцитов и активационно-индуцированный апоптоз способствуют прогрессированию заболевания, обуславливая нейтропению (Володин, 1999), апоптоз макрофагов (Pisetsky, 2004), выработку провоспалительных цитокинов (Таболин, 1997) и повышение активности лейкоцитарной эластазы (Щербакова, 2003), повреждающих гематоэнцефалический барьер и приводящих к патологии ЦНС. В этом плане следует особенно выделить группу недоношенных новорожденных детей 32 - 34 недель гестации, у которых наблюдались максимальные показатели концентрации вкДНК, содержания апоптотических и активированных лимфоцитов. По данным литературы и жизненному опыту неонатологов, именно в этом гестационном возрасте отмечается наибольшая частота перивентрикулярных кровоизлияний (Зубарева, 2006), обуславливающая патологию ЦНС и смертность новорожденных этого гестационного периода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Туаева, Наталья Олеговна, Казань

1. Акберова Н.И. Сравнение данных: 11 Непараметрические критерии / Н.И. Акберова. Каз.: КГУ, 2004. - 50 с.

2. Акоев Ю.С. Состояние специфических факторов защиты у маловесных детей / Ю.С. Акоев, Т.Б. Сенцова // Медицинский научный и научно-методический журнал. 2001. - № 4. - С. 72-75.

3. Ашмарин И.П. Гипотеза об антителах как новейших регуляторах физиологических функций, созданных эволюцией / И.П. Ашмарин, И.С. Фрейдлин // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1989. - Вып. 15. - С. 176-181.

4. Бабич B.C. Взаимодействие некоторых транскрипционных факторов РНК-полимеразы II с Alu-повторами и его биологическая роль: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Бабич B.C. М., 2000.-21 с.

5. Барановский А.Г. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита / А.Г. Барановский,

6. B.Г. Матюшин, А.В. Власов, В.Г. Забара, В.А. Наумов, Р.Жьеже, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. 1997. - Т. 62, вып. 12. - С. 1590 -1599.

7. C.С. Шерлина // Радиац. биол. Радиоэкол. 1987. - Вып. 4. - С. 505 -509.

8. Белохвостов А.С. Некоторые аспекты нуклеинового фактора из асцитной жидкости при опухолях/ А.С. Белохвостов, Н.К. Зеленкова // Мол. биол. 1978-Т. 12, вып. 6-С. 1256- 1263.

9. Белохвостов А.С. Устойчивость к панкреатической дезоксирибонуклеазе ДНК иммунодепрессивного фактора асцитной жидкости/ А.С. Белохвостов, Н.К. Зеленкова // Биохимия. 1979. - Т. 44, Вып. 4-С. 711-717.

10. Белохвостов А.С. Роль молекулярно-генетических исследований в диагностике солидных опухолей/ А.С. Белохвостов, А.А. Новик // Вопр. онкол. 1999. - Т. 45. - № 6. - С. 599 - 605.

11. Белохвостов А.С. Экстрахромосомные ДНК в клетках млекопитающих // Успехи соврем, биол. 1997. - Т. 177, Вып. 4. - С.433 - 441.

12. Беседнова Н.Н. Иммунотропные свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб / Н.Н. Беседнова, Ю.И. Касьяненко, J1.M. Эпштейн, А.К. Гажа // Антибиот. и химиотер. 1999. - № 10. - С. 13-15.

13. Блинов И.Н. О факторах нуклеиновой природы в плазме крови человека / И.Н. Блинов, И.С. Луганова, А.Д. Владимирова // Вопр. мед. хим. -1981.-Т. 27.-С. 600-603.

14. Боголепова И.Н. Онтогенез мозга человека / И.Н. Боголепова // Педиатрия. 1997. - № 5. - С. 27 - 30.

15. Васильева И.Н. Внеклеточная низкомолекулярная ДНК крови животных как прогностический признак облучения: автореф. дис. .канд. мед. наук / Васильева И.Н. Спб., 1994. - 20 с.

16. Васюхин В.И. ДНК, выходящая из лимфоцитов человека, содержит последовательности, гомологичные иммуноглобулиновому гену к II В.И. Васюхин, Л.А. Липская, А.Г. Цветков, О.И. Подгорная // Мол. биол. 1991. - Т. 25, вып. 2. - С. 405 - 412.

17. Вельтищев Ю.Е. Становление иммунной системы / Ю.Е. Вельтищев // Врач.-1991.-№ 12.-С. 9-12.

18. Винтер В.Г. Нейтральная ДНКаза хроматина печени крыс при развитии опухоли у животных и участие РНК в регуляции ее активности / В.Г. Винтер, Ф.К. Алимова, H.J1. Зоткина, Д.Г. Аглиуллина // Экспер. онкол.- 1983. Т. 5. - № 3. - С. 29-32.

19. Винтер В.Г. Применение атомно-силовой микроскопии для исследования ДНК-гидролизующей активности антител к ДНК / В.Г. Винтер, Т.А. Невзорова, О.А. Коновалова, М.Х. Салахов // Доклады АН.- 2005. Т. 405. - № 3. - С. 409 - 411.

20. Владимиров В.Г. Внеклеточная ДНК крови после облучения / В.Г. Владимиров, Л.И. Тищенко, Е.А. Суркова, И.Н. Васильева // Радиац. биол. Радиоэкол. 1993. - Т. 33., вып. 3(6). - С. 854 - 860.

21. Владимиров В.Г. Содержание внеклеточной ДНК в крови облученных крыс / В.Г. Владимиров, А.С. Белохвостов, С.С. Шерлина, И.Н. Васильева, A.M. Воскресенский // Бюл. экспер. биол. 1992. - Т. 113.-№2.-С. 188-1 91.

22. Владимиров В.Г. Внеклеточная ДНК и ее значение для современной медицины / В.Г. Владимиров, И.Н Васильева, Л.А. Шарова // Клин. мед. и патофизиол. 1998. -№ 1-2. - С. 112 - 119.

23. Владимиров В.Г., Козяков В.П. Шерлина С.С. // Индукция изменения содержания генетических LlNE-элементов в плазме крови при воздействии на организм алкилирующих агентов. // Актуальные проблемы и перспективы военной медицины. 2002. - С. 43 - 47.

24. Володин Н.Н. Особенности иммунологической адаптации у новорожденных детей в норме, при респираторном дистресс-синдроме и при пневмонии бактериальной этиологии / Н.Н. Володин, М.В.

25. Дегтярева, Д.Н. Дегтярев // Int. J. on Immunorehabilitation. 1999. - № 1. -С. 82-91.

26. Ганнушкина И.В. Гемодинамический эффект плазмы крови / И.В. Ганнушкина, M.J1. Фараго, И.Н. Антелава, М.В. Баранчикова, Н.Н. Вейко//ВестникРАМН, 1998,-№ 15.-С. 16-22.

27. Голубкова А.А. Иммунологическая компетентность детей с пре- и перинатальным повреждением нервной системы и вакцинопрофилактика: автореф. дис.д. мед. наук / Голубкова А.А. -Екатеринбург, 1999. 56 с.

28. Грикурова Н.К. Высокомолекулярная форма ДНК в сыворотке крови крыс с гепатомой Зайделла/ Н.К. Грикурова, А.С. Белохвостое, И.Ф. Сеиц // Вопр. онкол. 1983. - Т. 29, №4. - С. 70 - 73.

29. Дегтярева М.В. Роль интерлейкина 1 и фактора некроза опухолей у новорожденных детей в норме и при паологии / М.В. Дегтярева, Д.Н. Дегтярев, Н.Н. Володин, J1.B. Ковальчук // Педиатрия 1996. - № 1. - С. 93 - 97.

30. Зубарева Е.А. Комплексная ультразвуковая оценка перинатальных цереброваскулярных нарушений у детей первого года жизни / Е.А. Зубарева: автореф. дисс.д. мед. наук: 14.00.09, 14.00.19 / Зубарева Елена Анатольевна. М., 2006.

31. Ивановская Т.Е. Патология тимуса у детей / Т.Е. Ивановская, О.В. Зайратьянц, Л.В. Леонова, И.Н. Волощук. СПб.: СОТИС. - 1996. - 271 с.

32. Казаков В.И. Внеклеточная ДНК в крови беременных женщин / В.И. Казаков, В.М. Божков, В.А. Линде, М.А. Репина, В.М. Михайлов // Цитология. 1995. - Т. 37, № 3. - С. 232 - 235.

33. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / B.C. Камышников. М.: МЕДпресс-информ, 2004. - 920 с.

34. Караулов А.В., Москалева Е.Ю., Радзевич А.Е. и др. Структура ДНК лимфоцитов периферической крови человека и их способность к репарации ДНК при иммунизации и некоторых заболеваниях // Иммунология. 1991. - №2. - С. 15-17.

35. Клюшник Т.П. Динамика уровня аутоантител к фактору роста нервов у детей с дисгинезиями мозга / Т.П. Клюшник, С.Ю. Ишханова, С.А. Краснолобова, P.P. Лидерман // Журн. неврол. и психиатр. 2002. - Т. 102, №5.-С. 49-52.

36. Клюшник Т.П. Корреляция между уровнем аутоантител к фактору роста нервов и клиническими особенностями шизофрении у детей / Т.П. Клюшник, И.Л. Туркова, Е.В. Даниловская // Журн. неврол. и психиатр. 1999.-Т. 99, № 1.-С. 49-51.

37. Козак В.В. Сравнительная характеристика ДНК и связанных с ней белков плазмы крови в норме и лейкозе /В.В. Козак, Г.З. Негрей, В.А Шляхвенко // Гематол. и трансфузиол. 1987. - Т 32, № 4. - С. 31 - 34.

38. Коликова Ю.О. Аутоантитела к ДНК: половой диморфизм и возрастная динамика их содержания в сыворотке крови здоровых лиц. / Ю.О. Коликова, П.В. Фурманова, Д.Г. Ишмухаметова, В.Г. Винтер // Иммунология. -2003. -№ 4.-С. 250-251.

39. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высш. школа, - 1990. - 352 с.

40. Леках И.В. Скрытые натуральные антитела вызывают апоптоз лимфоцитов / И.В. Леках, И.А. Замулаева, А.С. Саенко, A.M. Поверенный // Иммунология. 2000. - № 4. - С. 39 - 41.

41. Мазурин А.В. Пропедевтика детских болезней / А.В. Мазурин, И.М. Воронцов. Спб: «Издательство Фолиант». - 2001. - 928 с.

42. Мамонтова Т.В. Новые аспекты апоптоза мононуклеарных клеток в патогенезе атопической бронхиальной астмы / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев // Аллергология. 2005. - № 4. - С. 15 - 23.

43. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, -1984. -480 с.

44. Мюльберг А.А. Возможная роль а-субфракции гистона HI в организации структурного элемента хроматина выявляемого Ca-Mg -эндонуклеазой / А.А. Мюльберг, Л.И. Тищенко, Н.В. Лемина, В.Л. Алексеев./ Биохимия 1983. - Т. 48, № 4. - С. 592 - 600.

45. Невзорова, Т.А. Особенности ДНК-гидролизующей активности антител при системной красной волчанке / Т.А. Невзорова, Д.А. Темников, В.Г. Винтер//Биохимия.-2003.-Т. 68, №12. С. 1616 - 1623.

46. Нестерова И.В. Диагностика и коррекция дефектов нейтрофильных гранулоцитов у новорожденных с перинатальной патологией ЦНС /

47. И.В. Нестерова, J1.A. Никулин, J1.H. Кокова // Педиатрия. 1996. - № 4. -С. 17-20.

48. Никонова М.Ф. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию / М.Ф. Никонова, М.М. Литвина, М.И. Варфоломеева, А.А. Ярилина, А.А. Ярилин // Иммунология. -1999.-№ 2.-С. 20-23.

49. Плеханов Л.А. Перинатальная патология ЦНС при цервикальных вертебромиелогенных расстройствах у детей: автореферат дис.д. мед. наук / Плеханов Леонид Александрович. Екатеринбург, 2006. - 51 с.

50. Ратнер А.Ю. Неврология новорожденных. Казань: КГУ,1995. - С. 10 -21.

51. Рыкова Е.Ю. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему / Е.Ю. Рыкова, П.П. Лактионов, В.В. Власов // Успехи соврем, биол. -2001.-Т. 121, № 2. С. 160-171.

52. Сальников К. В. Экстрахромосомная ДНК в клетках млекопитающих // Цитология. Т. 32, № 11.-С. 1061 - 1071.

53. Саттарова Л.И. Оптимизация иммуноферментной тест-системы для определения антител к ДНК / Л.И. Саттарова, Л.А. Гафиатуллина, Д.Г. Аглиуллина, В.Г. Винтер // Биотехнология. 1994. - № 11 - 12. -С. 38 -41.

54. Сидорова Е.В. Антигензависимые неспецифические иммуноглобулины. Природа и возможные механизмы образования // Успехи соврем, биол.- 1993.-Т. 113.-С. 675-701.

55. Софронов В.В. Параметры функциональных систем при формировании здоровья новорожденных и детей первого года жизни: автореф. дис.д. мед. наук: 14.00.09 / Софронов Валерий Викторович. М., 1999.

56. Старцева Н.М. Резервы снижения перинатальной заболеваемости и смертности детей с задержкой развития плода при недоношенной беременности: автореф. дис.д. мед. наук: 14.00.01. / Старцева Надежда Михайловна. М., 2006. - 62 с.

57. Сухова Т.И. Свойства свободных ДНК, обнаруживаемых в клеточных ядрах / Т.И. Сухова, О.И. Сердюк, Р.П. Алехина, В.П. Шелехов, B.J1. Моисеев, C.J1. Арсенин, Г.Б. Раевская, А.В. Лихтенштейн // Мол. биол.- 1996. Т. 30, вып. 3. - С. 552 - 563.

58. Таболин В.А. Актуальные вопросы перинатальной иммунологии / В.А. Таболин, Н.Н. Володин, М.В. Дегтярева, Д.Н. Дегтярев, К.К. Бахтикян // Int. J. on Immunorehabilitation. 1997. - № 6 - С. 112 - 122.

59. Талаев В.Ю. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов части новорожденных к активационному апоптозу / Талаев В.Ю. // II съезд иммунологов России: Тез. докл., 6-10 сентября, 1999. Russian Journal of Immunology. - 1999. - Vol. 4, Supl. 1 - P. 32.

60. Талаев В.Ю. Пролиферация мононуклеарных клеток крови недоношенных детей первых двух месяцев жизни при активации Т-лимфоцитов антителами к CD3 / В.Ю. Талаев, И.Е. Лебедева, Е.Б. Талаева, А.В. Чуднер // Иммунология. 1999. - № 5. - С. 52 - 53.

61. Тамкович С.Н. Уровень внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью форменных элементов крови, в диагностике рака молочной железы / С.Н. Тамкович, П.П. Лактионов, О.Е. Брызгунова // Мол. мед. 2005. - № 2. - С. 46.

62. Таточенко В.К. Рецидивирующий бронхит и частая респираторная заболеваемость у детей / В.К. Таточенко // Врач. 1995. - № 6. - С. 12 -14.

63. Федоров Н. А. Структура ДНК и трансформация клеток / Н.А. Федоров. -М.: Медицина, 1983.- 160 с.

64. Федоров Н.А. Определение ДНК в плазме крови человека / Н.А. Федоров, Л.С. Янева, С О.И. Скотникова, В.И. Панков // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1986. - Т. 52, № 9 - С. 281 - 283.

65. Хаитов P.M. Диснуклеотидоз и иммунологические расстройства / P.M. Хаитов, A.M. Земсков, В.М. Земсков // Иммунология. 1996. - № 3. - С. 7-10.

66. Хаитов P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. М.: Медицина, 2000. - 432 с.

67. Шевчук Н.А. Времяразрешенный иммунофлуоресцентный анализ на ДНК и исследование содержания ДНК в сыворотке человека // Вопр. мед. хим. 2001. - Т. 47, вып. 4. - С. 2 - 5.

68. Шерлина С.С. Механизмы действия сверхмалых доз / С.С. Шерлина, А.С. Белохвостов // Второй междунар. симп.: тез. докл. М., 1995. - С. 80.

69. Щербакова И.В. Иммунный статус детей с нарушениями психомоторного развития / И.В. Щербакова, Л.Г. Хачатрян, С.А. Краснолобова, P.P. Лидерман, Т.П. Клюшник // Журн. неврол. и психиатр. 2003. - Т. 103, № 6. - С. 43 - 46.

70. Янева И.С. Выделение, идентификация и электрофоретические свойства ДНК, секретируемой лимфоцитами человека / И.С. Янева, Н.А.

71. Федоров, Т.В. Боровкова, М.Г. Севастьянова // Биохимия. 1990. - Т. 55, вып. 4.-С. 745-753.

72. Ярилин А.А. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки в клинико-иммунологическом обследовании больных / А.А. Ярилин, М.Ф. Никонова, А.А. Ярилина // Мед. иммунол. 2000. - Т. 2, № 1. - С. 7-16.

73. Яцык Г.В. Характеристика гуморального иммунитета у здоровых новорожденных детей / Г.В. Яцык, Э.Р. Хан, Т.Б. Сенцова // Педиатрия.- 1996. № 1.-С.6-7.

74. Adams D. Studies on the cytosolic DNA of chick embryo fibroblasts and its uptake by recipient cultured cells / D. Adams, A. Mcintosh // Int. J. Biochem.- 1985.-Vol. 17, №10.-P. 1041 1052.

75. Adams D. The problem of cytoplasmic DNA: its extrusion/uptake by cultured cells and its possible role in cell cell information transfer / D. Adams // Int. J. Biochem. - 1985. - Vol. 17, № 11. - P. 1133 - 1142.

76. Anker P. Circulating nucleic acids in plasma or serum / P. Anker, J. Lyautey, C. Lederrey, M. Stroun // Clinica Chimica Acta. 2001. - Vol. 313. - P. 143- 146.

77. Anker P. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients / P. Anker, H. Mulcahy, X.Q. Chen, M. Stroun // Cancer and Metastasis Reviews. 1999. - Vol. 18. - P. 65 - 73.

78. Anker P. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes in the course of as shown in an in vitro system / P. Anker, M. Stroun, P. A. Mourice // Cancer Res. 1975. - Vol. 35, № 9. - P.2375 - 2382.

79. Batzer M. A. Alu repeats and human genomic diversity / M.A. Batzer, P.L. Deininger // Nature Reviews Genetics. 2002. - Vol. 3. - P. 370 - 379.

80. Bennett R.N. DNA receptor dysfunction in systemic lupus erythematosus and kindred disorders / R.N. Bennet, B.L. Kotsin, M.J. Merritt // Journal of experimental medicine. 1987. - Vol. 166.-P. 850-863.

81. Berczi J. Prolactin, pregnancy and autoimmune disease / J. Berczi // J. Rheumatol. 1993. - Vol. 20. - P. 1095-1100.

82. Bhakoo O.N. Perinatal risk factors in neonatal bacterial sepsis / O.N. Bhakoo, M. Singh // Ind. J. Pediatr. 1988. - Vol. 55. - № 6. - P. 941 - 946.

83. Bianchi D.W. Circulating fetal DNA: its origin and diagnostic potential -a review / D.W Bianchi // Placenta. Supplement A, Trophoblast Research. -2004.-Vol. 18.-P. 93- 101.

84. Bot A. Immune response of neonates elicited by somatic transgene vaccination with naced DNA / A. Bot, S. Antoni, C. Bona // Frontiers of Bioscience. 1997. - Vol. 2. - P. 173 - 178.

85. Bremnes R.Y. Circulating tumor-derived DNA and RNA markers in blood: a tool for early detection, diagnostics, and follow-up? / R.M. Bremnes, R. Sirera, C. Camps // Lung Cancer. 2005. - P. 41 - 51.

86. Burlingame R.W. Anti-chromatin (anti-nucleosome) autoantibodies / R.W. Burlingame, R. Carvera // Autoimmunity reviews. 2002. - № 1. - P. 321 -328.

87. Burwinkel B. Unequal Homologous Recombination Between LINE-1 Elements as a Mutational Mechanism in Human Genetic Disease / B. Burwinkel, Manfred W. Kilimann // J. Mol. Biol. 1998. - № 277. - P. 513 -517.

88. Buskila D. Autoantibody Profile in the Sera of Women with Hyperprolactinemia / D. Buskila, H. Gur, H-C.Lin, I. Alosachie, J.V.W.

89. Terryberry, В. Shen, N. Barka, J. B. Peter, Y. Shoenfeld // Journal of Autoimmunity. 1995.-Vol. 8. - P.415 -424.

90. Chan L.Y. Serial analysis of fetal DNA concentrations in maternal plasma in late pregnancy / L.Y. Chan, T.N. Leung, K.C. Chang, H.-L. Tai, Т.К. Lau,

91. E.M. Wong // Clin. Chem. 2003. - Vol. 49. - P. 678 - 680.

92. Chang C.P.-Y. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction / C.P.-Y. Chang, R.-H. Chia, T.-L. Wu, K.-C. Tsao, C.

93. F. Sun, J.T. Wu // Clin. Chem. Acta. 2003. - Vol. 327. - P. 95 - 101.

94. Chen C.P. Fetal DNA analyzed in plasma from a mother's three consecutive pregnancies to detect paternally inherited aneuploidy / C.P. Chen, S.R. Chen, W. Wang // Clin. Chem. 2001. - Vol. 47. - P. 937 - 939.

95. Chen K. Molecular characterization of cell-free Epstein Barr viral DNA in nasopharyngeal carcinoma and lymphoma patients / K. Chen // Clin. Chem. -2003.-Vol. 49, № 11.-P. 26.

96. Chen X. Q. Microsatellite Alteration in Plasma DNA of Small Cell Lung Cancer Patients / X. Q. Chen, M. Stroun, J. L., Magnenat, N. P. Laurent, A. M.Kurt, J. Lyautey, C. Lederrey, P. Anker // Nature Medicine. -1996. -Vol. 2, №9.-P. 1033- 1035.

97. Cohen J. Glucocorticoid activation of a calcium-dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death / J. Cohen, R.C. Duke // J. Immunol. -1984.-Vol. 132. P.38 - 42.

98. Cox R.A. Comparison of serum DNA, native DNA-binding and deoxyribonuclease levels in ten animal species and man / R. A. Cox, M. Gokcen // Life Sci. 1976. -Vol. 19, № 10. - P. 1609 - 1614.

99. Dennin R. H. DNA of free and complex origin in human plasma: concentration and length distribution // Klin. Wochenschr. 1979. - Vol. 57, №9.-P. 451 -456.

100. Dewannieux M. LINE-mediated retrotransposition of marked Alu sequences / M. Dewannieux, C. Esnault, T. Heidmann // Nature Genet. -2003.-№35.-p. 41 48.

101. Distelhorst C. W. Selective release of excreted DNA sequences from phytogemagglutinin stimulated human peripheral blood lymphocytes / R. H. Dennin, K. Cramer, J. C. Rogers, // J. Clin. Invest. - 1978. - Vol. 62, № 5. -P. 1204-1217.

102. Esteller M. A gene hypermethylation profile of human cancer / M. Esteller, P. G. Corn, S.B. Baylin, J.G. Herman // Cancer Res. 2001. - Vol. 15.-P. 3225 -3229.

103. Fadok V. A. The phagocytosis of apoptotic cells / V. A. Fadok, G. Chimini // Immunology. 2001. - Vol. 13. - P. 365 - 372.

104. Farina A. Evaluation of cell-free DNA as a second-trimester maternal serum marker of Down syndrome pregnancy / A. Farina, E. S. LeShan, G. M. Lambert-Messerlian, J. A. Canick, T. Lee, L. M. Neveux // Clin.chem. -2003.-Vol. 49.-P. 239-242.

105. Feng Q. Human LI retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition / Feng, Q., J.V. Moran, H.H. Kazazian, J.D. Boeke // Cell 1996. - № 87. - P.905-916.

106. Fournie G. J. Plasma DNA as a marker of cancerous cell death. Investigation in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearinghuman tumour. / G.J Fournie, J.P. Courtin, F. Laval // Cancer Let 1995. -Vol. 2.-P. 221 -227.

107. Gabor J. Changes in nucleic acid concentrations in blood plasma of rats in relation to radiation and chemical injury / J. Gabor, H. Konekna, A, Molcanova // Bratislab. Lek. Listy. 1983. - Vol. 80, № 6. - P. 669 - 676.

108. Gebhard W. Simple DNA sequences and dispersed repetitive elements in the vicinity of mouse immunoglobulin к light chain genes / W. Gebhard // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 170, № 4. - P. 567 - 573.

109. Geiger S. Prognostic impact of nucleosomal DNA fragments In patients with acute cerebral stroke / S. Geiger, S. Holdenrieder, P. Stieber, G.F. Hamann, R. Bruening, J. Ma, D. Nagell, and D. Seide // Clin. chem. 2005. - Vol. 51. -№ 10.-P.33.

110. Geske F.J. The role of the macrophage in apoptosis: hunter, gatherer and regulator / F.J. Geske, J. Monks, L. Lehman, V.A. Fadok // Int. J. of Hematol. 2002. - Vol. 76. - P. 16 - 26.

111. Goessl G. DNA alteration in body fluids as molecular tumor markers for urological malignances / G. Goessl // European Urology. 2002. - Vol. 41. -P. 668 - 676.

112. Grishok A. Extracellular NA as a possible messengers in regulatory information transfer from immune system to non-lymphoid tissues / A. Grishok // Med. Hypotheses. 1995. - Vol. 44, № 6. - P. 435 - 438.

113. Hahn S. Fetal cells and cell-free DNA in maternal blood: new insight into pre-eclampsia / S Hahn, W. Holzgreve // Hum. Reprod. Update. 2002. -Vol. 8.-P. 501 -508.

114. Hayashi J.I. Effects of normal human fibroblast mitochondrial DNA on segregation of HeLa TG mitochondrial DNA on tumorogenecity HeLa TG cells / J.I. Hayashi, H. Werbin, J.W. Shay // Cancer Rec. 1986. - Vol. 46. -P. 4001 -4006.

115. Hirt B. Selective extraction of polyoma DNA form infected mouse cell-cultures / B. Hirt // J. Mol. Biol. 1967. - Vol. 26. - P. 365 - 369.

116. Holdenrieder S. Apoptotic markers in cancer / S. Holdenrieder, P. Stieber // Clin. Biochem. 2004. - Vol. 37. - P. 605 - 617.

117. Holmes S. E. A new retrotransposable human LI element from the LRE2 locus on chromosome lq produces a chimaeric insertion // S.E. Holmes, B. A. Dombroski, C.M. Krebs, C.D. Boehm, H.H. Kazazian // Nature Genet. -1994.-№ 7.-P. 143 148.

118. Holzgreve W. Disturbed feto-maternal cell traffic in preeclampsia / W. Holzgreve, F. Ghezzi, E. DiNaro, D. Ganshirt, E. Maymon, S. Hahn // Obstet. Ginecol. 1998. - Vol. 91. - P. 668 - 672.

119. Honda H. Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of fetal DNA in maternal serum / H. Honda, N. Miharu, Y. Ohashy, O. Samura, M. Kinutani, Т. Hara // Hum. Genet. 2002. - Vol. 110. - P. 75 - 79.

120. Hung P. P. Hybridization of Dane particle DNA with the free plasma DNA of hepatitis carriers / P.P. Hung, J.C. Mao, C.M. Ling, L.R. Overby // Nature. 1975. - Vol. 253, № 5492. - P. 571 - 572.

121. Hupperts B. Apoptosis in the Trophoblast Role of Apopotsis in Placenta Morphogenesis / B. Hupperts, J.C.P. Kingdom // J. Soc. Ginecol. Investig. -2004.-Vol. 11 - P. 353-362.

122. Israel B. Cytoplasmic suppression of malignancy / B. Israel, W.I. Shaeffer // In vitro cell develop, boil. 1987. - Vol. 23. - P. 627 - 632.

123. Jurka J. Evolutionary impact of human Alu repetitive elements / J. Jurka // Current Opinion in Genetics and Development. 2004. - Vol. 14, № 6. - P. 603-608.

124. Kajikawa M. LINEs mobilize SINEs in the eel through a shared 30 sequence / M. Kajikawa, N. Okada // Cell. 2002. - № 111. - P. 433 - 444.

125. Kamm R. C. Nucleic acid concentrations in normal human plasma / R.C. Kamm, A.G. Smith // Clin. Chem. 1972. - Vol. 1973. - P. 3 - 12.

126. Kasianov A. Antibodies against ssDNA in persons of various age / V.A. Kasianov, L. Cebecauer, V. Balas // Mechanisms of Ageing and Development. 1984. - Vol. 28. - P. 289 - 295.

127. Katzir N. "Retroposon" insertion into the cellular oncogene c-myc in canine transmissible venereal tumor / N. Katzir, G. Rechavi, J.B. Cohen, T. Unger, F. Simoni, S. Segal, D. Cohen, D. Givol // Proc. Natl Acad. Sci. USA 1985.-№82.-P. 1054- 1058.

128. Kim Dennis D. Y. Widespread RNA Editing of Embedded Alu Elements in the Human Transcriptome / D.Y. Kim Dennis, T.Y. Thomas, T.W. Kim, Y. Kobayashi , Тага С. Matise, S. Buyske, A. Gabriel // Genome Research -2004.-Vol. 14, №9.-P. 1719- 1725.

129. Kingsmore S. F. Glycine receptor b-subunit gene mutation in spastic mouse associated with LINE-1 element insertion / S.F. Kingsmore, B. Giros, D. Suh, M. Bieniarz, M.G. Caron, M.F. Seldin // Nature Genet. 1994. - №7. -P. 136- 142.

130. Kiyama R. Pulse-labeled small closed circular DNA in cultured mouse and human cells / R. Kiyama, M. Oishi // Plasmid. 1987. - Vol. 17. - P. 215-222.

131. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation / .M. Krieg, A.K. Yi, S. Matson, T.J. Waldschmidt, G.A. Bishop, R. Teasdale, G.A. Koretzky, D.M. Klinman // Nature. 2002. - Vol. 347. - P. 546 - 594.

132. Lam N. Y. L. Circulating plasma |3-globin gene concentrations in patients with acute hemorrhagic stroke / N.Y.L. Lam, Т.Н. Rainer, K.S. Wong, W. Lam, E. Yuen, C. Metreweli, Y.M.D. Lo // Clin. Chem. 2003. - V. 49, № 11.-P. 15.

133. Lam N.Y.L. EDTA Is a Better Anticoagulant than Heparin or Citrate for Delayed Blood Processing for Plasma DNA Analysis / N.Y.L. Lam, Т.Н. Rainer, R.W.K. Chiu, Y.M. D.Lo // Clin. Chem. 2004. - Vol. 50, №. 1. - P. 256-257.

134. Lam N. Y. L. The changes of the plasma DNA levels after trauma/ N.Y.L. Lam, Т.Н. Rainer, L.Y.S. Chan, G. Joynt, M.D.Y. Lo//Clin. Chem. 2003. -Vol. 49, № 11.-P. 15.

135. Lawn J. E. 4 million neonatal deaths: When? Where? Why? / J.E. Lawn, S. Cousens, J. Zupan // Lancet. 2005. - Vol. 356, № 2. - P. 891 - 900.

136. Lee T-H. Quantitatinon of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma / T.

137. H. Lee, L. Montalvo, V. Chrebtov // Transfusion. 2001. - Vol. 41. - P. 276 -282.

138. Leon S.A. A comparison of DNA and DNA binding protein levels in malignant disease/ S.A. Leon, B. Shapiro, P. Servi, R.G. Parsons // Eur. J. Cancer. - 1981. - Vol. 17, № 5. - P. 533 - 538.

139. Leon S.A. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy / S.A. Leon, B. Shapiro, D.M. Sklaroy, M.J. Yaros // Cancer Res. -1977. Vol. 37, № 3. - P. 646 - 650.

140. Lerner R.A. Membrane-Associated DNA in the Cytoplasm of Diploid Human Lymphocytes / R.A. Lerner, W. Meinke D.A. Goldstein // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1971. - Vol. 68, №. 6. - P. 1212 - 1216.

141. Leung T.N. Maternal plasma fetal DNA as a marker for preterm labour / T.N. Leung, J. Zhang, Т.К. Lau, N.M. Njelm, Y.M.D. Lo // Lancet. 1999. -Vol. 352.-P. 1904-1905.

142. Li J.Z. Plasma DNA in systemic lupus erythematosus/ J.Z. Li, C.R. Steinman // Arthritis and rheumatism 1989. - Vol. 32, № 6. - P. 726 - 733.

143. Lo Y.M.D. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients / Y.M.D. Lo, Т.Н. Rainer, L.Y.S. Chan, N.M. Hjelm, R.A. Cocks // Clin. Chem. 2000. - Vol. 43, № 3. - P. 319 - 323.

144. Lo Y.M.D. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia / Y.M.D. Lo, M.S. Tein, I.L Sargent, J. Zhang, Т.К. Lau // Clin. Chem. 1999. - Vol. 45. - P. 184 - 188.

145. Lo Y.M.D. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis / Y.M.D. Lo, M.S. Tein, Т.К. Lau, C.J. Haines, T.N. Leung, P.M. Poon // Am. J. Hum. Genet. -1998.-Vol. 62.-P. 768-775.

146. Loke S.L. Characterization of oligonucleotide transport into living cells / S.L. Loke, C.A. Stein, X.H. Zhang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1989. Vol. 86, № 10. - P. 3474 - 3478.

147. Lorenz H-M. Role of apoptosis in autoimmunity / H.-M. Lorenz, M. Herrmann T. Winkler. // Apoptosis. 2000. - Vol. 5, № 5. - P. 443-449.

148. Lui Y.Y.N. Does centrifugation cause the ex vivo release of DNA from blood cells? / Y.Y.N. Lui, K.-W. Chik, Y.M.D. Lo. // Clin. Chem. 2002. -Vol. 48, № 11. - P. 2074 - 2076.

149. Maebo A. Plasma DNA level as a tumor marker in primary lung cancer / A. Maebo//Jap. J. Thoracic Dis. 1990. - Vol. 28. - P. 1085- 1091.

150. Mandel P. Les acids nucleiques du plasma sanguine chez Homme/ P. Mandel, P. Metais // CR Acad Sci Paris. 1948. - № 142. - P. 241 - 243.

151. Mark A. Batser. Alu repeats and human genomic diversity / M.A. Batzer, L. Prescott Deininger // Nature Reviews Genetics. 2002. - № 3. - 370 -379.

152. Mathias S.L. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. / S.L. Mathias, A.F. Scott, H.H.Jr. Kazazian, J.D. Boeke, A. Gabriel // Science. 1991. -№ 254. - P. 1808-1812.

153. Mills C.F. Some aspects of trace element nutrition in man / C.F. Mills // Nutrition.-1972. № 26. - P. 357 - 360.

154. Nelson K.B. Neonatal cytokines and coagulation factors in children with cerebral palsy / K.B. Nelson // Annals of neurology 1998. - № 44. - P. 665.

155. Nezlin R. DNA levels in immune complexes circulating in mice with induced systemic lupus erythematosus / R. Nezlin, M. Dayan, H. Zinger, E. Mozes // Immunological Let. 1999. - Vol. 67. - P. 85 - 90.

156. Okada S. Enhancement of ribonucleic acid synthesis by chromium (III) in mouse liver / S. Okada, M. Suzuki, H. Ohba // J. Inogr. Biochem. 1983. -Vol. 106.-P. 432-434.

157. Olson G.B. Differentiation of murine thoracic duct lymphocytes into T and В subpopulations by computer cell-scanning techniques / G.B. Olson, R.E. Anderson, P.H. Bartels // Cell. Immunol. 1974. - Vol. 13. - P. 347 -355.

158. Papasavva T. Non-invasive prenatal diagnostic assay for the detection of 3-thalassaemia / T. Papasavva, G. Kalakoutis, I. Kalikas, E. Neokli, S. Papacharalambous, A. Kyrri M. Kleanthous // Clin. chem. 2005. - Vol. 51, № 10.-P. 20.

159. Pertmer T.M. Studies on antibody response following neonatal immunization with influenza hemagglutinin DNA or protein / T.M. Pertmer, H.L. Robinson // Virology. 1999. - Vol. 257. - P. 406 - 414.

160. Pisetsky D.S. The role of CpG sequences in the induction of anti-DNA antibodies / D.S. Pisetsky, K.S. Wenk, C.F. Reich // Clin. Immunology. -2001.-Vol. 100, №2.-P. 157- 163.

161. Pisetsky D.S. The immune response to cell death in SLE / D.S. Pisetsky // Autoimmunity Reviews. 2004. - Vol. 3. - P. 500 - 504.

162. Rainer Т.Н. Prognostic use of circulating plasma nucleic acid concentration in patients with acute stroke / Т.Н. Rainer, L.K. Wong, W. Lam // Clin. Chem. 2003. - Vol. 49. - P. 562 - 569.

163. Raptis L. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with system lupus erythematosus / L. Raptis, H.A. Menard. // J. Clin. Insect.- 1980. -Vol. 66.-P. 1391- 1399.

164. Reichlin M. Characterization of anti-dsDNA antibodies: cross-react with SnRnp polypeptides and cell-binding abilities / M. Reichlin, B. Hahn, E. Koren //The Immunologist. 1995. - Vol. 3, № 3. - P. 84 - 88.

165. Rogers J.C. Characterization of DNA excreted from phytogemagglutinin-stimulated lymphocytes / J.C. Rogers // J. Exp. Med. 1976. - Vol. 143. -P. 1249- 1264.

166. Rogers J.C. Excretion of deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen/ J.C. Rogers, D. Boldt, S. Kornfeld // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. - Vol. 69, № 7. - P. 1685 - 1689.

167. Rogers J.C. Identification of an intracellular precursor to DNA excreted by human lymphocytes / J.C. Rogers // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1976. - Vol. 73, № 9. - P. 3211 -3215.

168. Ruiz I.C. Autonomously replicating episomes contain mdr-1 genes in a multigrug-resistant human cell line / I.C. Ruiz, K. Choi, D.D. Von Hoff, J.B. Roninson, G.M. Wahl // Mol. Cell. Biol. 1989. - Vol. 9. - P. 109 -116.

169. Rumore P. Haemodialysis as a model for studying endogenous plasma DNA: oligonucleosome structure and clearance / P. Rumore, B.

170. Muralidhar, M. Lin. // Clin. Exp. Immunol. 1992. - Vol. 90, № 1. - P. 56-62.

171. Schneider T. Isolation and specific enrichment procedures for serum or plasma derived DNA with MagNA Pure / T. Schneider, B. Kurreck, C. Markert-Hahn, D. Block, J. Kleiber, H. Stockinger // Clin. Chem. 2003. -Vol. 49, № 11.-P. 1.

172. Sekizawa A. Cell-free fetal DNA in the blood plasma of pregnant women with severe fetal growth restriction / A. Sekisawa, M. Jimbo, H. Saito, m. Ivasaki, R. Matsuoka, T. Okai, A. Farina // Am. J. Obstet. Ginecol. -2003.-V. 188.-P. 480-484.

173. Sellins K.S. Gene induction by y-irradiation leads to DNA fragmentation in lymphocytes / K.S. Sellins, J.J. Cohen // J. Immunol. 1987. - Vol. 139.-P. 3199-3206.

174. Shapiro B. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease / B. Shapiro, M. Chakrabarty, E. M. Cohn // Cancer. 1983 - Vol. 51. - P. 2116 - 2120.

175. Shay J.W. Cytoplasmic suppression of tumor progression in reconstituted cells / J.W. Shay, L. Yinoug, H. Werbin // Somat. Cell. Mol. Genet. -1988.-Vol. 14.-P. 345 -350.

176. Shubaeva N.O. Cell free DNA concentration and the number of Active ribosomal genes in the genomes of Rheumatoid arthritis patients / N.O. Shubaeva, N.N. Veiko, N.A. Lyapunova // Clin. chem. 2005. - Vol. 51. -№ 10.-P. 34.

177. Sick H. Gedanken uber dia Entwicklung der Immunitat des Kindes und ihre Beeinflussung durch umwett und Medizin / H. Sick // Padiatrie-Padol. 1988. - Bd. 23. - № 8. - P. 87 - 91.

178. Slavikova M., Zveni v jaderku lymfocytu hypotrofykuch novorozencu / M. Slavikova, I. Miler // Ces. Pediatr. 1989. - Vol. 44, №1. - P. 54 -55.

179. Steinman Ch.R. Free DNA in serum and plasma from normal adults/ Ch.R. Steinman //J. Clin. Invest. 1975. - Vol. 56, № 2 - P. 512 - 515.

180. Stroun M. About the possible origin and mechanism of circulating DNA. Apoptosis and active DNA release/ M. Stroun, J. Lyautey, C. Lederrey, A. Olson-Sand, P. Anker // Clinica Chimica Acta. 2001. - № 313. - P. 139-142.

181. Stroun M. Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients / M. Stroun, P. Anker, J. Lyautey // Tur. J. Cancer Clin. Oncol. 1987.-Vol. 23, №6-P. 707-712.

182. Stroun M. Neoplastic Characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients / M. Stroun, P. Anker, P. Maurice, J. Lyautey, C. Ledderey, M. Beljanski // Oncology. 1989. - Vol. 46. - P. 318 - 322.

183. Taback В., Quantitation of DNA in the serum and plasma of patients / B. Taback, D.S.B. Hoon //. Clin. Chem. 2003. - Vol. 49, № 11. - P. 3.

184. Tan E.M. Deoxyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus/ E.M. Tan, P.H. Schur, R.H. Carr, H.G. Kunkel // J. Clin. Invest. 1996. - № 45. - P. 1732-1740.

185. Thijssen M.A. Difference between free circulating plasma and serum DNA in patients with colorectal liver metastases / M.A. Thijssen, D.W. Swinkels, T.J. Ruers, J.B. de Kok // Anticancer Res. 2002. - Vol. 22. -P. 421 -425.

186. Tran T.T. Specificity and immunochemical properties of anti-DNA antibodies induced in normal mice by immunization with mammalian

187. DNA with a CpG oligonucleotide as adjuvant / T.T. Tran, C.F. Reich III, M. Alam, D.S. Pisetsky // Clin. Immunol. 2003. - Vol. 109. - P. 278 -287.

188. Tsangaris G.Th. Proteomic analysis of amniotic fluid samples in pregnancies with down's syndrome / G.Th. Tsangaris, P. Karamessinis, A. Kolialexi, A. Antsaklis, M. Fountoulakis, A. Mavrou // Clin. chem. -2005.-V. 51.-№ 10.-P. 24.

189. Van der Schoot C.E. Non-invasive antenatal RHD typing / C.E. Van der Schoot, A.A. Soussan, J. Koelewijn, G. Bonsel, L.G.C. Paget-Christiaens, M. de Haas // Transfusion Clinique et Biologique. 2006. - Vol. 13. - P. 53 -57.

190. Van Helden P.D. Potential Z-DNA-forming elements in serum DNA from human systemic lupus erythematosus / P.D. Van Helden // J. Immunol. -1985.-Vol. 134, № 1.-P. 177- 179.

191. Vasilyeva I.N. Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation / I.N. Vasilyeva // Annals of the New-York Academy of Sciences. 2001. - Vol. 945. - P. 221 - 228.

192. Von Hoff D.D. Amplified human myc oncogenes localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules / D.D. Von Hoff, D.R. Needham-Van Devanter, J. Yncel., B.E. Windle, G.M. Wahl // Proc. Nat. Acad. Sci USA. 1988. - Vol. 85. - P. 2483 - 2490.

193. Walker S.E. Prolactine: an immune-stimulating peptide that regulates other immune modulating hormones / S.E. Walker // Lupus. 1993. -Vol. 2.-P. 67-69.

194. Wang Y. Anti-DNA antibodies exhibit different binding motif preferences for single stranded or double stranded DNA / Y. Wang, J. Mi, X. Cao // Immunology Letters. 2000. - Vol. 73. - P.29 - 34.

195. Wijeratne S. Cell-free plasma DNA as a prognostic marker in intensive treatment unit patients /S. Wijerantne, A. Butt, S. Burns, K. Sherwood, O. Boyd, R. Swaminathan // Clin. Chem. 2003 - Vol. 49, №. 11. - P. 15.

196. Wiktorowich K. Extracellular DNA and its immunomodulatory function in RA and SLE / K. Wiktorowich, K. Szyfter, M. Furmaniuk, M. Gorny, J. Morkowski, W. Samborski, P. Tabaczewski, S. Mackiewicz // Immunologia Polska. -1987. -Vol. 2, № 1. P.33 - 43.

197. Wu T-L. Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range / T-L. Wu, D. Zhang, J-H. Chia, K-0 Tsao, C-F. Sun, J.T. Wu // Clinica Chimica Acta. 2002. - Vol. 321. -P. 77-87.

198. Yadin O. Natural autoantibodies in the serum of healthy women a five-year follow-up / O. Yadin, B. Sarov, L. Naggan, H. Slor, Y. Shoenfeld // Clin. exp. Immunol. - 1989. - Vol. 75. - P. 402 - 406.

199. Yakubov L.A. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: Involvement of specific receptors? / L.A. Yakubov, E.A. Deeva, V.F.

200. Zaritova, E.M. Ivanova, A.S. Ryte, L.V. Yurchenko, V.V. Vlassov // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 6454 - 6548.

201. Yanase K. Receptor-mediated cellular entry of nuclear localizing anti-DNA via myosin 1 / K. Yanase // J. Clin. Invest. 1994. - Vol. 100, № 1. -P. 52-60.

202. Ziegler A. Circulating DNA: a new diagnostic gold mine? / A. Ziegler, U. Zangemeister-Wittke, R.A. Stahel // Cancer Treatment reviews. -2002.-Vol. 28.-P. 255 -271.

Информация о работе

Туаева, Наталья Олеговна
кандидата биологических наук
Казань, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Туаева, Наталья Олеговна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Туаева, Наталья Олеговна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Туаева, Наталья Олеговна, Казань

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия