Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность клеток эндотелия

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность клеток эндотелия"

На правах рукописи

005533247 /'•.!'

N

/ і

Алексеева Анна Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

1 9 СЕН т

005533247

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

Тарасова Ольга Сергеевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Писарев Владимир Митрофанович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского" Российской Академии медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярных механизмов критических состояний.

Ведущая организация:

Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»),

Защита состоится «07» октября 2013 г. в _ часов на заседании

Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, Д.1.

Автореферат разослан « К » сентября 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Циркулирующая внеклеточная ДНК (вкДНК) присутствует в кровотоке и других биологических жидкостях как здоровых, так и больных людей. ВкДНК активно взаимодействует с клетками организма (Gahan P. et al., 2010). В настоящее время неясно, какие именно внутриклеточные процессы протекают под действием фрагментов вкДНК в эндотелии, и как состав этой ДНК влияет на активацию того или иного внутриклеточного каскада в клетке.

Исследования в этой области проводятся на различных культурах клеток, оцениваются характеристики вкДНК, циркулирующей в крови здоровых людей, больных сердечно-сосудистыми и аутоиммунными заболеваниями, больных раком (Pisetsky D.S. et al., 2011). В области механизмов действия вкДНК в клетках эндотелия известно немногое. Показано, что ДНК влияет на эндотелиоциты путем взаимодействия с двумя типами рецепторов (известные TLR9 и гипотетические, X), которые для передачи сигнала используют один и тот же белок - адаптер MyD88 (Костюк C.B. и др., 2010). Имеются данные о том, что ДНК и гистоны, входящие в состав циркулирующей ДНК, активируют другие рецепторы группы TLR, вызывая продукцию интерлейкинов и иммунный ответ (Cherepanova A.V. et al., 2011).0днако все эти данные не дают ясного понимания механизма взаимодействия клеток эндотелия с вкДНК и необходимо дальнейшее изучение вопроса. Эти исследования важны для понимания механизмов системного повреждения сердечнососудистой системы у пациентов с различными заболеваниями, в развитие которых может быть вовлечена вкДНК.

В настоящей работе впервые оценено, какие именно характеристики вкДНК стимулируют стрессовый ответ и адаптивную реакцию в клетках эндотелия.

Цель исследования. Охарактеризовать ответ эндотелиальной клетки на изменение таких свойств внеклеточной ДНК, как концентрация, GC- состав и уровень окислительной модификации.

Задачи исследования.

1. Сформировать рабочую выборку образцов ДНК из различных источников. Охарактеризовать их свойства (GC-состав и уровень окисления оснований);

2. Определить локализацию в клетках эндотелия культуры HUVEC образцов экзогенной ДНК с различными свойствами;

3. Исследовать влияние образцов ДНК с различными свойствами на следующие показатели состояния эндотелиальной клетки (HUVEC): уровень активных форм кислорода (АФК) и NO; разрывы в ДНК хроматина; пролиферативная активность клеток; показатели гибели клеток; изменения цитоскелета; активация транскрипционного фактора NF-kB.

Научная новизна. Впервые обнаружено, что клетки эндотелия быстро реагируют на изменение свойств вкДНК. Ранний ответ клеток заключается в синтезе

большого количества АФК и возникновении одно- и двунитевых разрывов ДНК хроматина ядер, что приводит к остановке клеточного деления. Впервые показано, что окисленная и CG-богатая ДНК, так же как и ДНК людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями, действует на клетки эндотелия через Т1Л19-рецепторы, и, возможно, через другие ДНК-узнающие сенсоры. Действие вкДНК на эндотелиальные клетки сопровождается активацией стрессового сигнального каскада с вовлечением транскрипционного фактора NF-kB. Впервые обнаружено, что при изменении свойств вкДНК в клетках эндотелия наблюдается формирование стресс-фибрилл актина. Впервые высказано предположение, что свойства циркулирующей ДНК могут являться мишенью для терапии при профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные позволяют по-новому осознать роль циркулирующей ДНК в развитии некоторых заболеваний и в адаптивном ответе организма на неблагоприятные условия. Представляется возможным разработать направления ранней диагностики заболеваний, основываясь на описанных в данной работе эффектах, проявляющихся в клетках эндотелия в ответ на действие различных фрагментов вкДНК. Окисленные фрагменты ДНК, циркулирующие в большой концентрации в кровотоке людей с сердечно-сосудистыми, аутоиммунными, раковыми заболеваниями, могут послужить в качестве мишени для терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Изменение концентрации, GC-состава и уровня окисления внеклеточной ДНК индуцирует в клетках эндотелия HUVEC увеличение экспрессии гена NOX4 и синтез активных форм кислорода (АФК). Это сопровождается блокированием деления клеток в Gl-, S- и G2/M - фазах клеточного цикла.

2. Окислительный стресс, вызванный действием внеклеточной ДНК, стимулирует в клетках эндотелия образование одно- и двунитевых разрывов ДНК HUVEC, что приводит к нестабильности генома, признаками которой являются образование микроядер, фрагментация хроматина и выпячивание ядерной мембраны. На фоне деструктивных процессов включаются репаративные механизмы, направленные на снижение апоптотической активности.

3. В ответ на изменение концентрации, GC-состава и уровень окисления внеклеточной ДНК в клетках эндотелия происходит стимуляция транскрипционного фактора NF-kB. Способность образцов вкДНК активировать NF-kB уменьшается в ряду: GC-ДНК > геномная ДНК > окисленная геномная ДНК.

4. Внеклеточная ДНК влияет на экспрессию гена eNOS на уровне мРНК eNOS, белка eNOS и продукта NO в клетках эндотелия. Кроме того, GC-ДНК и окисленная ДНК стимулируют в HUVEC структурные изменения клеточного матрикса: наблюдается синтез стресс-волокон полимерного актина и меняется экспрессия мРНК генов молекул адгезии (ICAM1, РЕСАМ1, SELE и VCAM1).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на VII международной конференции «Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum» (Мадрид, 2010); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); на XIII международной конференции «The Leiden International Medical Student Conference» (Лейден, 2011); на XIX и XX международных конференциях «International Student Congress of (Bio)Medical Sciences» (Гронинген, 2012, 2013). Диссертационная работа прошла апробацию на семинаре Федерального государственного бюджетного

учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, протокол № 9 от 26.07.2013.

Личный вклад автора. Соискателем проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Соискатель лично принимал участие в планировании экспериментов, самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, а также из клеток культуры эндотелия. Подбор необходимых условий в методиках, осуществление подготовки и выполнения основных экспериментов автором выполнены самостоятельно. Соискатель провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 307 источников, из них 7 отечественных и 300 зарубежных авторов. Работа изложена на 184 листах машинописи. Текст содержит 50 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использованы культуры клеток эндотелия, выделенные из 7 образцов нормальной пуповины здоровых рожениц. Взятие биоматериала осуществлено с соблюдением необходимых правил асептики и антисептики. Выделение клеток проведено в стерильных условиях согласно адаптированной стандартной методике (Crampton S.P. et al., 2007). Далее клетки культивировали в СО2-инкубаторе (5% СО2, 95% воздуха) при 37°С в стерильных условиях. Эксперименты проведены на нормальных эндотелиальных клетках 2-4 пассажей.

Получение модельных фрагментов ДНК: в качестве источника CpG-богатой ДНК использованы CpG - богатый фрагмент транскрибируемой области рибосомного повтора человека (ТОрДНК, участок от -515 до 5321 в соответствии с HSU13369, GeneBank), встроенный в вектор pBR322 (p(rDNA)), длина пробы около 11 т.п.н. В качестве AT - обогащенной ДНК человека использован фрагмент 1,77 сателлита III (p(satlll)) (участок lql2, хромосомы 1) в векторе pBR322, длина пробы 5485 п.н. ДНК Е. coli выделены из штамма MG 1655 методом фенольной экстракции и гидролизованы эндонуклеазой до фрагментов 5-10 т.п.н., сопоставимых по длине с двумя другими пробами. Для получения вкДНК облученных клеток, клетки облучены на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия), доза облучения составляла 10 сГр. ВкДНК облученных и интактных клеток выделяли из среды культивирования стандартным методом экстракции органическими растворителями. Образцы окисленной ДНК (геномной и p(rDNA)) получены следующим образом: к раствору ДНК (100нг/мл) добавляли 2% Н2О2 в присутствии 1 мкМ Fe2+ и 10 мкМ ЭДТА («ПанЭко», Россия) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте (модель слабо окисленной ДНК) или при УФ облучении (312 нм, модель сильно окисленной ДНК). Образцы ДНК осаждали 2

объемами этанола в присутствии 2М ацетата аммония, промывали 2 раза 75% этанолом и растворяли в воде. Концентрацию определяли, регистрируя УФ-спектры.

Пробы вкДНК для опытов на клетках HUVEC 30 здоровых молодых людей (2535 лет) и 24 пациентов (55-75 лет) с сердечно-сосудистыми заболеваниями (острый инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия в острой стадии) обоих полов выделяли из плазмы крови стандартным методом экстракции органическими растворителями.

Для анализа содержания рибосомного повтора в составе вкДНК применили метод нерадиоактивной количественной гибридизации, ранее разработанный в лаборатории ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Вейко H.H. и др., 2003).

Все модельные пробы ДНК подвергали одинаковой дополнительной очистке от липополисахаридов: последовательно проводили обработку тритоном Х-114 и гельфильтрацию на носителе HW-85. Концентрацию вкДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) с использованием красителей Hoechst 33528 или PicoGreen («Invitrogen», США). Для анализа действия вкДНК на интактные клетки эндотелия в среду культивирования последних добавляли различные фрагменты вкДНК в концентрации 50-250 нг/мл и инкубировали в течение 0,5-72 ч при 37°С.

Для анализа взаимодействия различных образцов ДНК с эндотелиальными клетками использованы зонды, содержащие флуоресцентную метку Spectrum Green или Red: (1) меченая геномная ДНК (^HKGrcen/Red); (2) плазмиды p(rDNA)°reen и pBR322GrMn; (3) окисленная ДНК (гДНК0гесп/Кеа0х). Этот образец получили путем отжига смеси денатурированных образцов гДНКох и гДНКс,гееп1,е11 (зонды синтезированы сотрудниками лаборатории пренатальной диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН).

Количество активных форм кислорода в пробе определено цитофлуориметрически при помощи красителя: 2',7'- дихлордигидрофлуо-ресцеина диацетат DCFH-DA («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) в концентрации 5 мМ, (LeBel С.Р. et al., 1992). Клетки анализированы в пробирках FACS CyFlow Cube («Partee», Германия) на проточном цитофлуориметре Partee CyFlow® ML («Partee», Германия). Локализация мест выработки АФК определена с помощью того же красителя на флуоресцентном микроскопе.

Количество окиси азота (II) определено с помощью флуоресцентного красителя CuFl («Strem», США) (Lim М.Н., 2007) методом проточной цитофлуориметрии согласно стандартной методике (Lim М.Н. et al., 2006), локализация и интенсивность синтеза окиси азота в культуре клеток эндотелия HUVEC определена с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме того, велась количественная детекция окиси азота в среде культивирования с использованием флуориметра «Perkin Elmer LS55» (США), при Хвозб =495нм, с эмиссией >.=526, в режиме «time-drive». Количество нитритов и нитратов, как показателя интенсивности окисления окиси азота, определено методом Грисса.

Цитохимическое окрашивание F-актина цитоскелета произведено с помощью окраски родамином-фаллоидином по стандартной методике (Wieland Т. et al., 1983). После фиксации клеток к последним добавлен комплекс родамин-фаллоидина («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) в концентрации 0.4 U/ml (в растворе фосфатно-солевого буфера («ПанЭко», Россия), 0,02% тритон Х-100 («Sigma», США).

Для определения наличия и локализации белков TLR9, AIM2, ¡NOS, eNOS, peNOS, NOX4, K¡-67, PCNA, p65(NF-kB) в клетках эндотелия использован непрямой иммуноцитохимичесий метод. После добавления фрагментов вкДНК среда культивирования удаляли, клетки фиксировали раствором формальдегида. Затем проводили последовательную инкубацию с первичными и вторичными антителами («Santa Cruz Biotechnology», США), меченными ФИТЦем /фикоэритрином («Sigma», США) согласно стандартной методике (Larsson L.I., 1993). После окраски клеток на покровные стекла добавлен 20% раствор глицерина и 20 мкМ DABCO (1,4-диазо-бицикло (2,2,2) - октан) («Sigma», США) для предотвращения выцветания красителя. Препараты накрывали покровными стеклами и анализировали под микроскопом.

Определение содержания одно- и двунитевых разрывов осуществлено с использованием методики ДНК комет (single cell gel electrophoresis) по стандартному протоколу (Collins A.R. et al., 2008). После 2 часовой обработки в лизирующем буфере [2,5 моль/л NaCl, 0,1 моль/л EDTA (pH 10,0), 10 ммоль/л Tris (pH 9,6), 1% N-лаурилсаркозинат, 10% DMSO, 1% Triton Х-100] при 25°С препараты помещены в электрофорезную камеру в щелочной буфер [0,3 моль/л NaOH, 1 ммоль/л EDTA (pH 10,0)] на 20 мин при 15°С, а затем подвергнуты электрофорезу при 300 тА на 20 мин при той же температуре. Дале препараты зафиксированы, окрашены 10% раствором бромистого этидия («ПанЭко», Россия) и анализированы при помощи флуоресцентного микроскопа (на увеличении х40 раз) и программного оборудования CASPlab.

Детекция двуцепочечных разрывов ядерной ДНК методом иммунофлуоресценции заключалась в окраске клеток специфичными антителами к гистону у-Н2АХ согласно стандартной методике (Kuo L.J., Yang L.X., 2008) с выявлением гамма-фокусов и последующем получении и анализе изображений с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Vert и ПО к нему («Carl Zeiss Microscopy», Германия). Количество и особенности гиподиплондных клеток, наличие микроядер и апоптотических телец в популяции клеток эндотелия определены методом проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии (окраска клеток пропидий йодидом), обработка проведена с использованием программного обеспечения PhotoShop CS3.

Оценка уровня экспрессии генов TLR9, AIM2, RIG1, STING1, NOX4, SOD1, CCND1, CDKN2A, CDKN1A, RBI, ТР53, MDM2, BRCA1, BCL2, BCL2Al(Bfl-l/Al), BCL2L1 (BCL-X), BIRC2(c-IAPI), BIRC3 (c-IAP2), ICAM1, PECAM1, SELE, VCAM1, eNOS, iNOS, NFKB1JL-6, TNF-a, M4K4F, TIR, MyD88 и ACTB методом ПЦР в реальном времени. РНК, выделена из клеток при помощи набора YellowSolve («Клоноген», Россия) и RNAeasy mini kit («Qiagen Sciences», США), по инструкциям производителей. Концентрация РНК определена флуориметрически с использованием РНК-связывающего красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent («MoBiTec», Германия), лвозб=487 нм, Хфлу=524 нм. Обратная транскрипция осуществлена с помощью реактивов фирмы «Силекс» (Россия) по стандартной методике. Амплификация проведена при помощи прибора с програмным обеспечением StepOnePlus («Applied Byosystems», США). Использованы праймеры фирмы «Силекс» (Россия), последовательности взяты из PrimerBank, предварительно проверенные на способность образовывать димеры и шпильковые структуры. Экспрессия анализирована в нескольких независимых опытах с помощью программного обеспечения прибора; ошибка составляла 2%.

Статистическую обработку результатов проведена с использованием стандартного пакета программ MS Excel, Statgraphics и Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика циркулирующей ДНК плазмы человека в норме, при патологии и внешнем воздействии (ионизирующее излучение)

В составе вкДНК плазмы крови здоровых людей накапливается маркерная последовательность - транскрибируемая область рибосомного повтора, которая значительно обогащена GC - парами (Рис. 1). Ее содержание на 1 нг вкДНК в несколько раз выше, чем содержание в геноме (1,72 ± 0,2 пг/нг гДНК, N=256). Образцы вкДНК больных атеросклерозом и артериальной гипертензией содержат увеличенное в несколько раз, по сравнению с вкДНК здоровых людей, содержание рДНК. В циркулирующей ДНК облученных по роду работы людей также увеличено содержание маркера GC-ДНК.

Таким образом, в норме, при сосудистой патологии и при повреждающем внешнем воздействии в составе циркулирующей ДНК накапливаются GC-ДНК. Особенно много GC-ДНК накапливается в составе вкДНК при хроническом воздействии источника внутреннего излучения трития, которое индуцирует повышенную гибель клеток. Одновременно с увеличением GC-nap в составе вкДНК увеличивается содержание окисленных последовательностей, и, прежде всего, содержание окисленного гуанозина (8-окси-дезоксирибогуанозина), поскольку гуанозин наиболее легко окисляется. Имеются многочисленные свидетельства того, что уровень окисления клеточной ДНК, а значит и циркулирующей ДНК, намного выше при сердечно-сосудистых и онкологических заболеваниях (Kostuyk S.V. et al., 2013).

и

_1

2 56 3 64 4 30

Патология

Ионизирующее излучение

1 - гДНК 2-вкДНК ЗД

3 - вкДНК (АГ)

4 - вкДНК (атеросклероз)

5 - вкДНК (бета-излучение трития)

6 - вкДНК (гамма-излучение)

Рис.1. Содержание маркерной GC- богатой последовательности (рибосомный повтор, транскрибируемая область) в составе циркулирующей ДНК в норме, при сосудистой патологии и при внешнем воздействии (ионизирующее излучение).

Примечание: Источники ДНК: (1) геномная ДНК клеток крови, проанализирована ранее (Вейко H.H. и др., 2003); (3,4) вкДНК больных артериальной гипертензией и атеросклерозом получена из коллекции Коноровой И.Л., Центр Неврологии РАМН;

(2,5,6) вкДНК соответственно здоровых людей, работающих с источниками бета излучения трития и гамма-излучения. ДНК получены из коллекции образцов вкДНК Саровского ядерного центра от Корзеневой И.Б. в рамках выполнения государственного контракта № 14.512.11.0090 (МОН РФ, 2013 г.).

2. Локализация образцов вкДНК с различными характеристиками в HUVEC

Известно, что нормальные клетки в клеточной культуре и в организме связывают значительные количества внеклеточной/циркулирующей ДНК (Rykova E.Ju. et al., 2012). Для оценки локализации фрагментов вкДНК, взаимодействующих с клетками HUVEC, использованы флуоресцентные зонды, содержащие флуоресцентную метку Spectrum Green (Рис.2).

и ^ЯиВ ІаЯШк шшшш

А

Рис. 2. Локализация неокисленных (а, б) и окисленных (в, г) меченых образцов гДНК в клетках HUVEC.

Примечание: (а, в) - видимый свет; (б) - окраска ядер клеток DAPI и локализация зонда гДНК0"™ (Хвозб 495 нм); (г) - локализация зонда гДНК0гееп"0Х в клетках. Условия: концентрация зондов 50 нг/мл; время культивирования в присутствии зондов - 30 мин. Увеличение х 100.

Неокисленные образцы ДНК (гДНК°гееп, p(rDNA)Green и pBR322Gree") взаимодействуют преимущественно с клеточной поверхностью, лишь в ~3% клеток ДНК проникает вглубь цитоплазмы. Окисленный образец гДНК°гее1ьОХ, наряду с локализацией на клеточной поверхности, гораздо чаще проникает внутрь клетки (-30% клеток). Увеличение концентрации вкДНК в 2-10 раз сопровождается значительным увеличением связывания ДНК с клеткой.

3 . Экспрессия ДНК-сенсоров TLR9, AIM2 и RIG1 в HUVEC

При действии на HUVEC фрагментов ДНК в клетках активируются, как TLR-зависимый, так и TLR-независимый сигнальные пути. Высокие концентрации большинства фрагментов ДНК, а в случае вкДНК больных ССЗ, и низкие концентрации, активируют экспрессию мРНК TLR9 рецепторов (Рис. 2).

Бактериальная ДНК увеличивает экспрессию TLR9 в HUVEC в 1,3-2,8 раза. Модельные образцы p(rDNA) и p(satlll) в концентрации 50 нг/мл стимулируют увеличение количества мРНК7ХЯ9 в 2 раза. Образец вкДНК, выделенный из плазмы крови больного ОИМ (1) с низким содержанием GC-ДНК не влияет на количество mPHK7U?9, но образцы 2-6 с высоким содержанием маркерных GC-ДНК (Булычева Т.И. и др., 2008) стимулируют увеличение количества мРНКГ£Л9 в 2-2,5 раза. Геномная ДНК в меньшей степени влияет на количество мРНК7ХЯ9; p(rDNA) и p(satlll) в концентрации 5 нг/мл снижают уровень мРНК7Ц?9 более чем в 2 раза.

TLR9

Щ 4

p(rDNA) p(sallll) e.coli вкДНК гДНК гднк« p<rt>NAf*

Рис. 3. Экспрессия мРНК ТЬЯ9 в НЦУЕС при действии на клетки проб вкДНК по отношению к контролю (К).

Примечание: Обозначение модельных проб: 5 нг/мл (серые столбики); 10 нг/мл - темно-серые; 50 нг/мл - черные. Образцы вкДНК больных ССЗ, 5 нг/мл (красные столбики) Время инкубации с вкДНК - Зчаса. Ось У: количество мРНК Т1Л9 относительно контрольного гена (ТВР). Данные 4-х опытов (БО), (*) - р<0,05.

Для подтверждения результатов ПЦР-анализа мРНК7ХЯ9 оценена экспрессия белка ТЫ19 в НиУЕС (Рис. 4). Метод флуоресцентной микроскопии позволил выявить в контрольных НиУЕС немногочисленные клетки, экспрессирующие много ТЬЯ9. Большинство клеток не окрашено или слабо окрашено, часть клеток не содержит ТЬЯ9. В присутствии р(ФМА) количество сильноокрашенных клеток возрастает.

к p(rDNA) б в

Рис. 4. Экспрессия белка TLR9 в HXJVEC в контроле (а) и при действии p(rDNA),концентрация вкДНК 50 нг/мкл, время инкубации 3 часа (б, в).

Примечание: Для визуализации белка TLR9 клетки обработаны антителами, к TLR9, меченными фикоэритрином. (в) Средние значения интенсивности флуоресценции одной клетки (приводится среднее для 100 клеток и стандартное отклонение). Увеличение х 48 раз.

Фрагменты вкДНК, действующие на клетки эндотелия, также активируют в них TLR-независимый путь, о чем свидетельствует изменение экспрессии мРНК таких ДНК-сенсоров, как AIM2 и RIG1 (Рис. 5).

Ч I ¡41 ■ I д.,

ПИ IIII

3 14 4« -г 3 24 49 V

р(г01ЧА) рВК322

тА1М2 Ш61

3 24 4Я 72 3 24 4Я ?2

гДНК гДНКох

Рис. 5. Относительные изменения содержания мРНКА/М2 и мРНК 11Ю-1 в НЦУЕС при действии модельных образцов ДНК (50 нг / мл).

Примечание: Время действия указано по оси X. Экспрессию определяли относительно контрольного гена (ТВР). Приводятся данные 4-х опытов, указано ЭО, (*) р<0,05. Контрольный уровень — зеленая линия.

Экспрессия мРНКЛ/М? под действием всех образцов ДНК увеличивается в 1,52,5 раза в первые 24 часа после инкубации клеток с фрагментами ДНК. К 48 часам эффект практически не наблюдается. Увеличение количества мРНКЛГС/ в 1,5-2 раза в течение 24 часов имеет место только в случае гДНК. Окисление гДНК уменьшает длительность периода увеличения уровня мРНКЛГО/ до 3-х часов. Образцы ОС-ДНК не влияют на уровень экспрессии мРНККЛ?/.

4. Увеличение экспрессии генов ^-кВ пути

При действии на клетку бактериальной ДНК активируются рецепторы 1X119, что приводит к активации транскрипционного фактора ОТ-кВ и транслокации его активной формы в ядро клетки (Шгат^ви У., 2013). ЫР-кВ регулирует транскрипцию генов провоспалительных цитокинов и других белков клеточного стресса (Рис. 6).

Образцы вкДНК вызывают в НиУЕС увеличение экспрессии генов основных молекул сигнального каскада, связанного с №-КВ, а также генов провоспалительных цитокинов ТОТ-а и 1Ь6, которые контролируются ЫБ-КВ.

Все неокисленные образцы ДНК стимулируют увеличение количества РНК перечисленных генов. Наиболее сильным стимулятором является образец ДНК, содержащий фрагмент рибосомного повтора человека - через 3 часа уровень мРНК генов возрастает в 3 и более раза. Далее происходит снижение количества мРНК. Два других образца (гДНК и рВ11322) действуют медленнее - максимум экспрессии мРНК генов наблюдается через 24 часа культивирования.

рВЯ322

p(rDNA)

гДНК

гДНКс

ТЫРа 116

рВР322

р(гРМ)

гДНК

— V Время,

гДНК х часы

Рис. 6. Изменение экспрессии мРНК ЫРКВ1, М4К4Р, Т1Я, МуИ88 (верхний ряд столбиков), 7даЪ и 1Ь6 (нижний ряд) в клетках в присутствии проб ДНК (50 нг/мл, время инкубации с ДНК 3-72 часа).

Примечание: По оси У: количество мРНК относительно контрольного образца клеток (без ДНК). Приводятся данные 4-х опытов, указано БП, (*) -р<0,05. Контрольный уровень (принятый за 1) - зеленая линия).

Окисленный образец гДНК слабо стимулирует экспрессию лишь некоторых из анализируемых генов в течение непродолжительного времени. Количество мРНК двух цитокинов ТОТа и 1Ь6 возрастает в 1,5 - 2,7 раза в присутствии всех образцов ДНК, что подтверждает активацию ОТ-кВ.

5. Изменение количества белка р65 (№-кВ) и его локализации в НиУЕС

Конечным этапом активации транскрипционного фактора ОТ-кВ является его диссоциация с белком ингибитором 1-карра-В и транслокация активной формы, в состав которой входит субъединица р65, из цитоплазмы в ядро клеток (АсШ М. е1 а1., 2010). Метод флуоресцентной микроскопии позволил оценить количество и локализацию белка р65 в клетках эндотелия, при инкубации их с фрагментами вкДНК (Рис.7)

В контрольных клетках содержится немного белка р65, и он локализован в цитоплазме. Геномная ДНК и бактериальный вектор стимулируют увеличение количества р65 в цитоплазме клеток, где он находится в составе отдельных гранул. Плазмида р(гОЫА) вызывает увеличение количества р65 в клетках, причем практически весь белок локализован в клеточном ядре.

Количество р65 значительно увеличивается при культивировании НиУЕС с образцами окисленной ДНК. Р65 накапливается преимущественно в цитоплазме клеток, что говорит о его неактивном состоянии.

• щ £ Е^НЯ » > \v > W ' • ' " M •• • „ ® * »? на»

* ш % шп -' тУ _ f ! J« 4 V;- ■'•

* 1 V. t.'* * ■Щ; ** Г"|'Ш1 '' • ч*

Рис.7. Анализ локализации фактора NF-kB в HUVEC, которые инкубировали 2 часа в присутствии 50 нг/мл модельных образцов ДНК и образцов циркулирующей ДНК, выделенных из плазмы крови больных ОИМ (нижний ряд).

Примечание: Использовали антитела к белку р65, меченые флуоресцеином. Увеличение *64 раза.

Образец вкДНК0ИМ| вызывает в клетках такое же распределение р65, как и неокисленный образец гДНК: слабое увеличение окрашивания цитоплазмы клеток. Образцы вкДНК0ИМ2 и вкДНК0ИМЗ действуют, как окисленная гДНК, т.к. содержат высокий процент окисленных оснований (примерно 400 на миллион нуклеозидов, по данным анализа, выполненного Глебовой К.В.). ВкДНК0ИШ и вкДНКоимз увеличивают уровень р65 и стимулируют его накопление в цитоплазме и ядрышке.

6. ВкДНК стимулирует синтез АФК в HUVEC

Активация NF-kB в клетках, как правило, связана с индукцией в клетке окислительного стресса. В связи с этим оценен уровень АФК в HUVEC при действии образцов вкДНК на клетки. Для этой цели применили реагент H2DCFH-DA, который в клетках взаимодействует с АФК в форме деацетилированного производного DCF. Проанализировано 26 различных модельных образцов ДНК, содержащих GC-богатые и/или окисленные фрагменты ДНК, и образцы циркулирующей ДНК, выделенных из плазмы крови здоровых доноров (ЗД) и больных острым инфарктом миокарда (ОИМ). Для детекции АФК использовали планшетный (96-луночный) ридер (Рис.8).

4 2.5

О)

х н

О 2,0 LL.

и

О 1.5

л А I й i i

9 10 11 12 13

IS 16 17 18 19 20 21 22 23 24 цДНК больных OHM

1 гДНК

2 p(rDNA)

3 ДНК е.соК

4 p(Satlll)

5 ДНКох1

6 ДНКох2

25 вкДНК HUVEC

26 вкДНК HUVEC ЮсГр

27 ЮсГр

28 40мкМ Н202

Рис.8. Анализ изменения количества АФК в HUVEC с использованием реагента H2DCFH-DA и планшетного флуоресцентного ридера.

Примечание: Каждый образец ДНК наносили в 8 лунок планшета. Приводятся средние значения сигнала относительно контрольных клеток. Условия: концентрация указанных на рис. образцов ДНК - 20 нг/мл, время инкубации 1 час.

Образцы p(rDNA), p(SatHI) и е.coli ДНК стимулируют увеличение сигнала DCF в культуре клеток на 40-70%. гДНК, вкДНК среды культивирования нормальных HUVEC и циркулирующая вкДНК здоровых людей в наименьшей степени стимулируют увеличение количества АФК (не более чем на 20%). Из 10 образцов циркулирующей вкДНК больных ОИМ 7 образцов вызывали увеличение количества АФК на 25 - 150%. Окисленные образцы ДНК (модельные гДНКОХ1 и гДНКОХ2, вкДНК среды облученных клеток) стимулировали накопление АФК в клетках в гораздо большей степени, чем неокисленные (соответственно гДНК или вкДНК среды контрольных клеток). Уровень АФК, наблюдаемый при действии GC-ДНК и циркулирующей вкДНК больных ОИМ, сопоставим с уровнем АФК, который индуцируют в клетках HUVEC малые дозы (ЮсГр) ионизирующего излучения. Некоторые образцы окисленной ДНК и образцы циркулирующей вкДНК больных ОИМ вызывают эффект, сравнимый с действием Н202 в концентрации 40мкМ.

Таким образом, практически все изученные образцы ДНК при введении в среду культивирования HUVEC в концентрации, примерно в 2 раза превышающей концентрацию собственной ДНК, стимулируют увеличение уровня АФК. Наибольшей активностью обладают модельные GC-ДНК и окисленные ДНК. Для образца вкДНК №24, который вызывал наибольший эффект определено содержание маркера окисления, которое составило 410 8-oxodG на миллион нуклеозидов ДНК. Этот образец вызывал такое же увеличение уровня АФК (более, чем в 2 раза), что и модельный образец гДНК0Х1, окисленной in vitro с использованием Н202 до уровня 400 8-oxodG/106 нуклеозидов.

Одним из основных продуцентов АФК в эндотелиальной клетке является 4 изоформа фермента НАДФН-оксидазы (NOX4). На рис.9 приведены данные изменения количества MPHKNOX4 в клетках при изменении свойств вкДНК среды культивирования.

Г" 1 " 1 г 2 3 ' 4 ' 5

1 к нг/мл

2 ГДНК 20

3 г ДНК 50

4 гДНКох1 20

5 г ДНК0*1 50

6 гДНК0*1 250

7 г ДНК0*2 20

8 9 10 '11 12 13 14

8 р(гОЫА) 50

9 р(г ОМА )°* 50

10 р(гОМА)0* 250

11 екДНК НиУЕС 20

12 вкДНК Юс Гр 20

13 иДНК ЗД

14 иДНК (ЗИМ

20 20

15 10с Гр

Рис.9. Изменение количества мРШШОХ4 в клетках при изменении свойств вкДНК. Примечание: Условия - 3 часа, тип и концентрации образцов ДНК указаны на рисунке. Для сравнения брали клетки, облученные ионизирующим излучением в дозе 10 сГр (через 1 час после облучения - красный столбик). Приводятся данные 4-х опытов, указано 50, (*) р<0,05. Контрольный уровень относительной экспрессии (принятый за 1) - зеленая линия.

Геномная ДНК, вкДНК Н1Л/ЕС и циркулирующая вкДНК здорового донора достоверно не изменяют количество мРНКN0X4. Плазмида р(Ф1ЧА), окисленные гДНК и р(гЭКА), вкДНК среды облученных клеток и циркулирующая вкДНК больного ОИМ увеличивают уровень мРНКМ№?, примерно, в той же степени, что и стандартный индуктор окислительного стресса - малая доза ионизирующего излучения. Интересно отметить, что малые концентрации окисленной гДНК действуют намного эффективнее, чем большие концентрации. Обнаружена высокая положительная корреляция между увеличением количества мРНЮУСУй и количеством детектируемых в клетках активных форм кислорода (линейная регрессия, к=0,92; р<0.001). Этот факт говорит в пользу того, что ОС-ДНК и окисленные фрагменты ДНК индуцируют образование АФК, в первую очередь, стимулируя экспрессию гена N0X4.

Данные об увеличении экспрессии N0X4 на уровне белкового продукта гена при изменении уровня окисления ДНК подтверждены методом иммунофлуоресценции (Рис.10).

Контроль гДИК гднк0Х

Л • 1 *

Д § % * %

* ■>Ш

Рис.10. Локализация белка N0X4 (антитела - ФИТЦ) в НЦУЕС.

Примечание: Ядра дополнительно окрашены ОАР1 (голубой). Клетки культивировали в присутствии указанных образцов ДНК, введенных на 1 час в среду культивирования в концентрации 50 нг/мл. (увеличениех 100).

Белок локализован в НиУЕС в цитоплазме и вблизи клеточной мембраны. В присутствии вкДНКох наблюдается увеличение числа клеток с высоким содержанием N0X4. Экспрессия белка усиливается как на поверхности клеток, так и в участках цитоплазмы, сближенных с ядром, где происходит увеличение количества АФК, детектируемое окраской ВСБ.

Для оценки характера клеточного ответа на действие вС-богатых и окисленных ДНК и вызванный ими окислительный стресс измерена экспрессия гена 50£)/. ОС-богатая р(гОЫА), а также окисленная гДНК в концентрации 50 нг/мл, через 1 час инкубации вызывают увеличение количества мРНК 500/ в 1,5 - 2,5 раза. Неокисленная гДНК не влияет на уровень мРНК50£>7. Через 3 часа инкубации с неокисленными фрагментами ДНК количество мРНК!ЮШ снижается в 3 раза. Окисленная гДНК стимулирует дальнейшее увеличение количества мРНК^О/РЛ Полученные данные говорят об активации не только окислительных процессов, связанных с выработкой АФК, но и с включением механизмов защиты от чрезмерного окисления.

7.0бразование разрывов ядерной ДНК в клетках НЦУЕС при изменении свойств циркулирующей вкДНК

Резкое увеличение количества АФК в клетках, особенно вблизи ядра, может приводить к повреждению ДНК в ядре клетки. Мы исследовали эту возможность методом ДНК-комет (рис.11-1,2). В течение 30 мин с момента добавления 5 или 50 нг/мл ДНК в среду культивирования количество разрывов хроматина значительно увеличивается, причем не обнаруживается существенной разницы между образцами гДНК, ОС- ДНК и гДНКох (Рис. 11- 2). Уже через час количество разрывов в ядерной ДНК в присутствии пробы гДНК значительно снижается и приближается к контрольному уровню, в то время как в присутствии ОС- ДНК (кривые 2) и гДНКох (кривые 3) количество разрывов продолжает увеличиваться по сравнению с контролем. Через 3 часа культивирования количество разрывов хроматина в присутствии всех образцов ДНК практически совпадает с контрольным уровнем.

Рис.11 (1) Примеры анализа разрывов хроматина НЦУЕС методом комет в щелочном варианте. Ядерная ДНК окрашена бромистым этидием. Время инкубации с перекисью водорода и фрагментами ДНК - 30 мин. Увеличение х100.

(2) Кумулятивные гистограммы характеристик комет (% ДНК в хвосте кометы). Условия: 50 нг/мл гДНК (кривые 1), р(гОКА) (кривые 2) и гДНКох (кривые 3), время действия указано на рис. Для сравнения на верхних рисунках приведены данные, отражающие действие ДНК в концентрации 5 нг/мл (кривые коричневого цвета).

Для визуализации двуцепочечных разрывов (ДР) применили метод, основанный на флуоресцентной детекции фосфорилированного белка Н2АХ в сайте образования разрыва. В культуре Н11УЕС можно выделить несколько субпопуляций клеток с различным уровнем ДР в ядерной ДНК (Рис. 12).

При добавлении в среду культивирования окисленных или ОС- богатых фрагментов вкДНК, мы наблюдали признаки нестабильности генома (образование микроядер, выпячивание ядерной мембраны), которые являются следствием увеличения количества разрывов ДНК. Максимальный эффект наблюдался в случае действия на клетки окисленных образцов гДНК и ОС-ДНК.

О

ш

X 14

X 0.3

0,5 ч 1 ч 3 ч

*

I

К

гДНК гДНКох р(гРЫА) р(ЮМА)

ох

Рис. 12. (а) Основные типы ДР ДНК, которые встречаются в НиУЕС. Фиксированные клетки окрашены мечеными флуоресцеином антителами к фосфорилированной форме гиетона Н2АХ. Примечание: Ядра окрашены ПАР1. (а) - большинство ядер не содержат ДР(0); ядро содержит 1-2 ДР(1); ядро содержит несколько ДР (3); (ядра с множественными ДР(3) (х 100). (б) Анализ ДР ДНК в НиУЕС методом проточной цитометрии. Условия: 50 нг/мл ДНК, 1 час; (б) медиана интенсивности сигнала клеток основной фракции, включающей типы ядер (0) и (1). Под действием различных фрагментов вкДНК в первые полчаса увеличивается количество ДР, однако, через 3 часа инкубации количество разрывов не отличается от контрольного уровня или снижается.

Синтез АФК и образование ДР в клетках при изменении свойств вкДНК стимулируют в НЦУЕС ответ, который включает признаки адаптивного ответа (Рис. 13).

Наблюдалось увеличение экспрессии генов, отвечающих за репарацию ДНК (ВЯСА1 и РСЫА) и генов, активность которых направлена на снижение уровня апоптоза клеток.

№ 1, час Антиапоптотические гены

ВС12 ВС1.2А1 (ВП-1/А1) ВСЬ2и (ва-х) втс2 (С-1АР2) В/КСЗ (С-1АР1)

1 3 1,3 ±0,2 1,9 + 0,3 1,2 ±0,2 1,6 ±0,4 1,7 ±0,4

24 1,4 ±0,2 2,5 ±0,3 1,5 ±0,3 2,1 ±0,3 1,6 ±0,3

48 1,6 ±0,3 1,5 ±0,3 3,0 + 0,4 1,7 ±0,4 1,4 ±0,2

72 1,3 ±0,3 1,6 ±0,3 1,6 ±0,3 1,2 ±0,3 1,1 ±0,2

2 3 3,2 ± 0,3 3,3 ± 0,2 1,8 + 0,2 2,6 ± 0,2 1,9 ±0,3

24 1,9 ±0,3 2,7 ± 0,5 1,6 ±0,3 1,3 ±0,3 1,7 + 0,2

48 1,8 ±0,2 1,9 ±0,2 1,8 ±0,2 1,7 ±0,3 1,0 ±0,2

72 1,4 ±0,2 1,3 ±0,3 1,4 ±0,3 1,0 ±0,2 0,9 ± 0,3

3 3 1,3 ±0,3 2,0 ± 0,3 1,0 ±0,2 0,9 ± 0,3 1,4 ±0,2

24 2,4 + 0,3 2,1 ±0,3 1,6 ±0,3 1,9 ±0,4 1,7 ±0,3

48 1,1 ±0,3 2,6 ± 0,4 2,9 ± 0,5 2,7 ± 0,4 1,3 ±0,2

72 0,9 ± 0,3 2,4 ± 0,4 1,7 ±0,3 0,9 ± 0,3 0,9 ± 0,3

4 3 1,9 ±0,3 1,5 ±0,3 1,1 ±0,3 2,2 ± 0,2 2,3 ± 0,1

24 2,5 ± 0,4 1,9 ±0,3 1,3 ±0,3 1,3 ±0,3 2,0 ± 0,4

48 2,3 ± 0,4 2,0 ± 0,4 2,0 ± 0,4 2,0 ± 0,4 1,1 ±0,2

72 1,1 ±0,3 1,4 ±0,3 2,2 ± 0,3 0,9 ± 0,3 0,9 ±0,3

Рис. 13. Изменение экспрессии генов, отвечающих за выживаемость клеток. Приводятся значения относительно внутреннего контроля (ген ТВР). Концентрация вкДНК — 50 нг/мл. Примечания: Красным цветом выделены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05, критерий Мана-Уитни). 1 - рВЯ322; 2 - рО^ЖА); 3 - гДНК; 4 - гДНКох.

Данные для антиапоптотических генов приведены на рис.13. Количество мРНК ВСЬ2 и ВШСЗ достоверно увеличивается под действием p(rDNA), гДНК и гДНКох в 1,8 - 3,2 и 1,7 - 2,3 раза соответственно в первые 3-48 часов. Количество мРНК ВСЬ2А1, ВСЬ2Ь1, ВШС2 увеличивается при действии всех использованных в опыте модельных проб.

8.Измеиеиие свойств вкДНК влияет на пролиферацию клеток НиУЕС.

Окислительный стресс, вызывающий образование разрывов ДНК, например, при действии радиации, сопровождается остановкой клеточного деления на всех стадиях клеточного цикла. Мы исследовали влияние различных образцов ДНК на количество пролиферирующих клеток в культуре. Для анализа методом проточной цитометрии использованы меченные флуоресцеином антитела к маркеру пролиферации белку Ю-67 (Рис. 14).

При действии модельных образцов ДНК в концентрации 50 нг/мл на клетки уровень экспрессии Кь67 снижается уже через 30 минут в 1,7-2,5 раза и продолжает снижаться с течением времени. При длительной культивации эффект сохраняется.

<3

CD

vo

K-: *

I

0,5ч

~ 1 ч

|2м

: *

гднк

гДНК?Х p(rDNA) p(rDNAfX

Рис. 14. Анализ изменений количества маркера пролиферации Кл-67 в клетках, культивируемых в присутствии различных образцов ДНК (50 нг/мл). Метод проточной цитометрии.

Примечание: Приводятся средние значения интенсивности сигнала клеток. Время культивирования указано на рисунке. (*) -р<0,05.

9.ВкДНК влияет на уровень NO в HUVEC

Одной из основных функции эндотелия для регуляции сосудистого кровотока является выработка им окиси азота. С помощью нового флуоресцентного красителя CuFL (Lim М. et al., 2007), связывающегося преимущественно с NO, оценили уровень NO в клетках эндотелия при действии различных образцов вкДНК (Рис. 15). GC-ДНК в низких концентрациях стимулируют синтез NO в HUVEC. Из трех образцов GC-ДНК наибольшим эффектом обладает образец, содержащий фрагмент рибосомного повтора. Увеличение концентрации GC-ДНК сопровождается уменьшением эффекта. Образцы окисленной ДНК (гДНК0Х1, гДНКох2, вкДНК среды облученных клеток (вкДНК10сГР)) снижают количество NO в клетках в 2-3 раза, в отличие от неокисленных образцов гДНК или вкДНКк. Аналогично действуют малые дозы рентгеновского излучения (ЮсГр).

Образцы вкДНК ЗД (здоровых молодых доноров) стимулирует в различной степени увеличение количества NO. ВкДНК больных артериальной гипертензией и ИБС (вкДНК ССЗ) снижает уровень NO в клетках HUVEC.

В эндотелиальных клетках основной фермент, отвечающий за синтез NO при нормальных условиях - эндотелиальная NO-синтаза (eNOS). В работе проведен анализ экспрессии eNOS на уровне мРНК и белка в клетках при действии на них различных фрагментов вкДНК (рис. 16).

GC-ДНК увеличивает количество MPHKeM?S, окисленные образцы (гДНКОХ1, гДНК0Х2, вкДНК10сГр) снижают уровень мРНКеМЭЗ (рис. 16а). Изменения в количестве NO положительно коррелируют с изменениями в количестве uPHKeNOS. По-видимому, eNOS - это основная NO-синтаза, на которую влияет изменение свойств вкДНК.

Lno.PL' отнед'

1 Контроль

2 р(гОМА) 0,01

3 (нг/мл) 0,1

5 6

6 10

7 60

8 ДНК е. СОН 6

9 (нг/мл) 10

10 60

11 р(8аИ11) 6

12 (нг/мл) 10

13 60

14 гДНК 20

15 гДНКох! 20

16 гДНКох 2 20

17 вкДНКК 20

18 вкДНК'ОсГр 20

11111111111111|

Н202 10 сГр 40мкМ

в к ДНК ССЗ вкДНК ЗД

5 нг/мл 5 нг/мл

Рис. 15. Флуоресцентное определение количества N0 в НЦУЕС с использованием планшетного ридера.

Примечание: Клетки культивировали в присутствии образцов ДНК, указанных в таблице на рисунке. Время: 2 часа. Концентрации указаны в таблице.

При длительном культивировании эндотелиальных клеток с окисленными образцами ДНК мы наблюдали стабильное снижение количества белка еЬЮЗ в клетках. Неокисленная гДНК в этих же условиях стимулировала увеличение количества белка (рис.166). Как показал метод проточной цитометрии, в НиУЕС 15 % клеток содержат малые количества белка е>Ю8. Культивирование с неокисленной ДНК практически не влияет на содержание клеток с низким уровнем экспрессии еМОЗ. Культивирование же с окисленными формами ДНК в 1,5-2 раза увеличивает количество клеток этой фракции.

О" 2

1,5

с

о

0,5

О

ГДНК«2

к - 0.81 р- 0,004

О

г

1Е

* - р< 0,05

1.6

гДНК гДНКох! гДНКох2

О 0.4 0.8 1.2 РНК еЛЮ5, отн. ед.

Рис. 16. (а) Зависимость количества N0 в НЦУЕС от количества мРНК еИОБ и (б) влияние гДНК и гДНК0Х на количество е>Ю8 (данные проточной цитометрии). Примечание: время инкубации с фрагментами 3 часа (а) и 48 часов (б), концентрация добавленных фрагментов вкДНК 50 нг/мл.

10. ВкДНК влияет на экспрессию актина и F-актина в HUVEC

Активность eNOS, которая в клетке непосредственно связана с различными формами актина, зависит в большой степени от цитоскелета. Одним из компонентов цитоскелета, отвечающих на стрессовый сигнал, является актиновый цитоскелет.

Образцы GC-ДНК, вкДНК|0сгр, вкДНКох и вкДНК больных ОИМ в 2,2-7,9 раза увеличивают экспрессию актина на уровне транскрипции (рис. 17В). В случае действия на клетки GC-ДНК и окисленных форм гДНК наблюдается образование стресс -волокон F-актина (рис.17Б). GC-ДНК, вкДНК10сГр, вкДНКох, наряду с облучением, в 1,5-2 раза увеличивают количество полимерного актина в клетках.

ВкДНК необработанных клеток (ДНКк) и гДНК не изменяют состояние F-актина. Так как образование стресс-волокон актина коррелирует с уменьшением активности eNOS (Su Y. et al., 2007), оно может являться второй (после снижения уровня мРНК eNOS) причиной уменьшения количества NO при действии окисленных образцов ДНК.

В работе также проанализированы изменения в количестве РНК генов молекул адгезии (ICAM1, РЕСАМ1, SELE и VCAM1), которые влияют на состояние цитоскелета. Практически все исследуемые образцы ДНК в той или иной степени стимулируют увеличение количества мРНК молекул адгезии. Наибольшей активностью обладают образцы окисленной ДНК.

А вкДНКК Б ui

1 - контроль

2 - pBR322

3 - p(rONA)

4 - гДНК

5 - гДНК0*

6 - вкДНК*

7 - вкДНК10сГР

8 - 10сГр

1 - контроль

2 -рВЯ322

3 - р(гО№)

4 - гДНК

5 - гДНК0Х

6 -вкДНК ад

7 -вкДНКоим

вкДНКил - - - • •

Рис. 17. Анализ изменения экспрессии и уровня полимеризации актина. Примечание: (А) - определение полимерного актина (фаллоидин-родамин). (Б) - определение уровня окраски Б-актина с использованием планшетного ридера. (В) - определение количества мРНК АСТВ методом реал ПЦР.

Концентрация добавленной вкДНК 50 нг/мл ДНК, время инкубации с фрагментами 3 часа.

11. Заключение

Изменение свойств циркулирующей ДНК крови, в частности, при сердечнососудистых заболеваниях описано в литературе (АгпаНсЬ Р. е1 а1., 2010). В первые часы после развития ОИМ, в несколько раз увеличивается концентрация вкДНК (Уе1ко N. е1 а1., 2008). Показано, что чем выше концентрация вкДНК у больного, тем хуже прогноз выживаемости (Huanga С. е1 а1., 2012). У больных ОИМ и ИБС повышено содержание маркерных ОС-ДНК (Булычева Н. и др., 2008). Содержание ОС-ДНК увеличено в вкДНК больных артериальной гипертензией и атеросклерозом, а также у лиц, работающих с источниками ионизирующей радиации (рис.1). Поскольку при ССЗ в организме имеет место окислительный стресс, который увеличивает уровень окисления клеточной ДНК, то и уровень окисления вкДНК значительно возрастает (КовШук Б. е1

al., 2013). Таким образом, к основным свойствам вкДНК, которые изменяются при патологии, можно отнести: (1) концентрацию вкДНК, (2) содержание в вкДНК GC-ДНК и (3) окислительную модификацию оснований вкДНК.

Для анализа ответа клеток эндотелия на изменение перечисленных свойств вкДНК использована модель: в среду культивируемых эндотелиальных клеток HUVEC добавляли различные количества образцов ДНК, которые имели различный GC-состав и отличались по содержанию маркера окисления - 8-oxodG. Эта схема моделирует процессы в организме, при которых очень резко изменяются свойства циркулирующей внеклеточной ДНК.

В ответ на изменение свойств вкДНК в клетках возрастает активность транскрипционного фактора NF-kB, который, как известно, играет негативную роль в эндотелии, активируя синтез провоспалительных цитокинов, например TNFa и IL6 (Zhang X. et al., 2011). Наличие в составе вкДНК окисленных оснований снижает уровень активации NF-kB, который стимулируется изменением общей концентрации вкДНК и увеличением содержания GC-ДНК.

Изменение свойств вкДНК в среде культивирования в эндотелии повышает уровень экспрессии гена NOX4, который кодирует фермент, ответственный в эндотелии за синтез супероксиданиона. В результате в клетке в областях цитоплазмы, сближенных с ядерной мембраной, значительно возрастает концентрация активных форм кислорода. Сильнее всего уровень АФК возрастает в присутствии окисленных и GC-богатых фрагментов вкДНК. Таким образом, циркулирующая вкДНК больных ОИМ, которая содержит много GC-ДНК и 8-oxodG, может стимулировать дополнительный окислительный стресс в эндотелии. Циркулирующая вкДНК может являться одной из причин окислительного стресса, который длительно поддерживается в организме больных ОИМ. Полученные данные позволяют рассмотреть окисленную циркулирующую ДНК в качестве возможного объекта для терапии острых состояний, которые сопровождаются высоким уровнем окислительного стресса.

Высокий уровень АФК, индуцируемый изменением свойств вкДНК, вызывает блокирование пролиферации и транзиторное появление в ядре эндотелиальной клетки заметного количества одно - и двунитевых разрывов ДНК, в основном, в областях, близких к ядерной мембране. Разрывам хроматина сопутствуют признаки нестабильности генома - образование микроядер и фрагментация хроматина в некоторых клетках.

Изменение свойств вкДНК стимулирует в эндотелиальных клетках развитие адаптивного ответа, который защищает их от негативных последствий резкого увеличения уровня АФК и возникновения большого числа разрывов ДНК. Длительное культивирование клеток в присутствии различных образцов ДНК стимулирует репарацию, за счет которой в 2-3 раза снижается количество разрывов в ДНК хроматина. Значительно увеличивается экспрессия мРНК генов, ответственных за репарацию одно- и двунитевых разрывов ДНК (PCNA, BRCA1) и антиапоптотических генов (BCL2, BCL2A I, BCL2L1, BIRC2, BIRC3), что приводит к повышению выживаемости и снижению уровня апоптоза клеток.

Свойства внеклеточной ДНК, контактирующей с эндотелием, существенно влияют на количество молекул оксида азота (NO) в эндотелиальной клетке, основной синтез которого осуществляется ферментом eNOS. В низких концентрациях GC-богатые последовательности генома увеличивают уровень NO, в то время как окисление внеклеточной ДНК сопровождается блокированием синтеза NO. Этот факт обусловлен значительным снижением экспрессии гена eNOS на уровне мРНК и белка. Молекула окиси азота - это один из основных факторов эндотелия, который регулирует

тонус сосудов. Снижение уровня N0 в присутствии окисленной ДНК потенциально может приводить к развитию артериальной гипертензии.

При изменении свойств вкДНК значительно изменяется состояние клеточного матрикса. GC- богатые и окисленные образцы ДНК стимулируют в эндотелиальных клетках синтез стресс-волокон полимерного актина и увеличение экспрессии мРНК генов молекул адгезии (ICAM1, РЕСАМ1, SELE и VCAM1). Изменение адгезивных свойств эндотелиальных клеток, характеризующееся увеличением экспрессии молекул адгезии говорит о включении иммунного ответа эндотелия на внешнее воздействие. В данном случае, можно предположить следующий порядок событий: фрагменты вкДНК активируют NF-kB зависимый путь, приводящий к выбросу провоспалительных цитокинов. Они, в свою очередь, активируют экспрессию молекул адгезии, направленную на развитие воспалительной реакции. Подобный механизм характерен для воспалительных процессов при атеросклерозе и других ССЗ, а также при действии на сосуды малых и средних доз радиации (Galkina Е., Ley К., 2007; Halle М. et al., 2010).

Если учитывать блокирование пролиферативных процессов в клетках эндотелия, с одной стороны, и репаративные процессы с другой стороны, то при совмещении этих факторов можно построить модель хронического воспалительного процесса, сопровождающегося выделением цитокинов и экспрессией молекул адгезии, привлекающих и активирующих в сосудах клетки иммунной системы. Ключевую роль в этом процессе играет взаимодействие эндотелия с фрагментами циркулирующей ДНК, которая вызывает в клетках вторичные системные процессы, усугубляющие первопричину патологии. Для иллюстрации этого механизма можно предложить схему, приведенную на рис. 18. Таким образом, внеклеточная ДНК, свойства которой изменяются при патологии, может значительно изменять физиологическую активность клеток эндотелия, и должна рассматриваться в качестве потенциальной мишени для терапии заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией.

Рис.18. Схема, иллюстрирующая механизм возникновения ответа эндотелиальных клеток на воздействие окисленных и/или ОС- богатых фрагментов циркулирующей вкДНК.

ВЫВОДЫ

1. Изменение концентрации, GC-состава и уровня окисления внеклеточной ДНК индуцирует в клетках эндотелия HUVEC увеличение экспрессии гена NOX4 и синтез активных форм кислорода (АФК). Способность модельных образцов ДНК стимулировать синтез АФК в клетках эндотелия изменяется в ряду: Окисленная геномная ДНК > GC-ДНК > геномная ДНК. Циркулирующая ДНК больных сердечнососудистыми заболеваниями стимулирует синтез АФК в гораздо большей степени, чем циркулирующая ДНК здоровых людей.

2. Повышенный уровень АФК вызывает образование одно- и двунитевых разрывов ДНК HUVEC, что сопровождается блокированием деления клеток в Gl-, S- и G2/M -фазах клеточного цикла. Возрастает экспрессия генов CCND1, CDKN2A, CDKN1A, RB1, ТР53, MDM2, контролирующих переход Gl—»S. Разрывы ДНК индуцируют нестабильность генома, признаками которой являются микроядра, фрагментация хроматина и выпячивание ядерной мембраны.

3. Образование разрывов ДНК стимулирует увеличение экспрессии генов, ответственных за репарацию одно- и двунитевых разрывов ДНК (PCNA, BRCA1) и антиапоптотических генов (BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BIRC2, BIRC3), что приводит к повышению выживаемости клеток и снижению уровня апоптоза.

4. Клеточный ответ на изменение концентрации, GC-состава и уровня окисления вкДНК включает активацию транскрипционного фактора NF-kB. Способность образцов вкДНК активировать NF-kB уменьшается в ряду: GC-ДНК > геномная ДНК > окисленная геномная ДНК

5. Свойства внеклеточной ДНК влияют на экспрессию гена eNOS на уровне мРНКeNOS, белка eNOS и продукта NO. В низких концентрациях GC-ДНК значительно увеличивает уровень NO, окисленная ДНК блокирует синтез N0.

6. GC-ДНК и окисленная ДНК стимулируют в эндотелиальных клетках изменения клеточного матрикса. Наблюдается синтез стресс-волокон полимерного актина и увеличение экспрессии генов молекул адгезии (1СAMI, РЕСАМ1, SELE и VCAM1).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Костюк C.B., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Ермаков A.B., Ефремова Л.В., Конорова И.Л., Вейко H.H. Внеклеточная ДНК влияет на функциональную активность клеток эндотелия // Медицинская генетика, 2010. Вып. 1. С. 38-46.

2. Баскова И.П., Алексеева А.Ю., Костюк C.B., Неверова М.Е., Смирнова Т.Д., Вейко H.H. Применение нового реагента Cu-FL для анализа стимуляции синтеза N0 секретом слюнных клеток медицинской пиявки в эндотелии человека (HUVEC) и кардиомиоцитах крысы // Биомедицинская химия, 2012. Т. 58. Вып. 1. С. 65-76.

3. Костюк C.B., Смирнова Т.Д., Ефремова Л.В., Конькова М.С., Алексеева АЛО., Каменева Л.В., Вейко H.H. Увеличение экспрессии iNOS в эндотелиальных клетках человека при длительном культивировании с фрагментами внеклеточной ДНК // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010. Т. 149. №9. С. 151-156.

4. Ефремова Л.В., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Костюк C.B., Ершова Е.С., Смирнова Т.Д., Конорова И.Л., Вейко H.H.. Внеклеточная ДНК влияет на количество окиси азота в эндотелиальных клетках человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т.149 №9. С. 156-162.

Публикации в других изданиях:

5. Алексеева А.Ю., Ермаков А.В., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Еголина Н.А., Вейко Н.Н. Внеклеточная ДНК облученных клеток - фактор стресс-сигнализации, изменяющий функциональную активность эндотелия // Сборник материалов VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010. С.6.

6. Malinovskaya Е.М., Kostyuk S.V., Ermakov A.V., Kon'kova M.S., Smirnova T.D., Kameneva L.V., Efremova L.V., Alekseeva A.Yu., Lyubchenko L.N., Veiko N.N. Fragments of Cell-free DNA (cfDNA) Enhance Transcription Activity in Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) and Inhibit Their in vitro Differentiation // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V., 2011. Chapter 27. P. 199-205.

7. Alekseeva A.Yu., Bulicheva N.V., Kostyuk S.V., Smirnova T.D., Veiko N.N. Cell Free DNA (cfDNA) Influences Nitric Oxide and ros Levels in Human Endothelial Cells II Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V., 2011. Chapter 30. P. 219-223

8. Alekseeva A.Yu., Veiko N.N., Kostyuk S.V. Possible Role of Extracellular Human DNA in Development of Vascular Endothelial Dysfunction // Abstract book of Leiden International Medical Student Conference (LIMSC) , Leiden, 2011. P. 269.

9. Alekseeva A.Yu., Kostyuk S.V., Smirnova T.D., Baranova A., Roginko O.A., Kuzmin V. A., Veiko N.N. Role of extracellular DNA oxydative modification in radiation induced bystander effects in human endotheliocytes // CNAPS VII. Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. Abstracts, Madrid, 2011. P.20.

10. Kostyuk S.V., Ermakov A.V., Alekseeva A.Y., Smirnova T.D., Glebova K.V., Efremova L.V., Baranova A.V., Veiko N.N. Role of extracellular DNA oxidative modification in radiation induced bystander effects in human endotheliocytes // Mutation Research, 2012. V. 3(729). P. 52-60.

11. Alekseeva A.Yu., Veiko N.N., Kostyuk S.V. Influence of cfDNA fragments on cellular pathways in endothelium and their significance in patients with myocardial infarction // Book of abstracts 19th International Student Congress of (Bio)Medical Sciences (ISCOMS), Groningen, 2012. P. 308.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; вкДНК - внеклеточная ДНК;

вкДНКк- фрагменты вкДНК, выделенные из среды интактных клеток; вкДНКк<|0сГр) - фрагменты вкДНК, выделенные из среды облучённых клеток; г ДНК - геномная ДНК; вкДНК0"- окисленная in vitro ДНК;

GC-ДНК - ДНК, обогащенная GC парами азотистых оснований;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

ЭС - эффект свидетеля;

ДР - двуцепочечные разрывы;

ЗД - здоровые испытуемые;

ОИМ - острый инфаркт миокарда;

ЯОР - ядрышковый организатор;

MyD88 - миелоидный фактор дифференцировки;

TLR9 - "toll-like" receptor 9;

TNF-a - фактор некроза опухоли альфа; eNOS - эндотелиальная NO-синтаза; iNOS - индуцибельная NO-синтаза; SOD - супероксиддисмутаза; NOX - НАДФН-оксидаза.

Данное исследование поддержано грантом РФФИ для молодых ученых (№12-0432211 мол_а ) и Госконтрактом МОИ РФ № 14.512.11.0090 (27 июня, 2013), зарегистрированным под № 2013-1.2-14-512-0042.

Подписано в печать 04.09.2013 г. Печать трафаретная

Условных печатных листов формат 60*90/16 - 1, Заказ № 10060 Тираж: 100 экз.

Типография «ЗипрппЬ) тел.: 8 (495) 626-42-43 119334, Москва, Ленинский пр-т. Д.37А www.sanprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеева, Анна Юрьевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ФГБУ Медико-генетический научный центр

ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.02.07 — Генетика

Научный руководитель: доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................6

1.1. Актуальность проблемы....................................................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Клеточные сигнальные пути в эндотелии..............10

2.1. Роль эндотелия в физиологических функциях организма...........................10

2.1.1. Барьерная роль эндотелия сосудов..............................................................10

2.1.2 Роль молекул ОТ-кВ и Т1Л1 в осуществлении эндотелием барьерной функции..................................................................................11

2.1.3 Роль актинового цитоскелета в осуществлении эндотелием барьерной функции.................................................................................13

2.1.4. Влияние окислительного стресса на барьерную функцию эндотелия ..16

2.2. Адгезивные свойства эндотелия.....................................................................16

2.2.1. Роль молекулы адгезии РЕСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия.......17

2.2.2. Роль молекулы адгезии 1САМ-1 в физиологии клеток эндотелия...........21

2.2.3. Роль молекулы адгезии УСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия.........24

2.2.4. Роль селектинов (в частности, Е-селектина)

в физиологии клеток эндотелия.....................................................................26

2.3. Регуляторная функция эндотелия...................................................................29

2.3.1. Синтез и метаболизм N0..............................................................................29

2.3.2. Роль эндотелиальной >Ю-синтазы в физиологии эндотелия....................32

2.3.3. Роль индуцибельной ЫО-синтазы в физиологии эндотелия....................33

2.3.4. Особенности выработки N0 и экспрессии ¡N08 и еЫОБ

в клетках культуры эндотелия НЦУЕС........................................................35

2.3.5. Образование в эндотелии активных форм кислорода и окислительный стресс ...................................................................................................35

2.3.6. Апоптотические процессы в клетках эндотелия.

Ключевые белки и регуляторы....................................................38

2.3.7. Основные клеточные сигнальные пути, активирующиеся при действии окислительного стресса..................................................................................39

2.4. Причины и роль дисфункции эндотелия в сердечно-сосудистых, аутоиммунных и других заболеваниях.........................................................40

2.5. Действие на клетки фрагментов вкДНК разного состава............................41

2.5.1. Содержание циркулирующей ДНК в крови людей

в норме и при патологии ............................................................41

2.5.2 Структурные особенности вкДНК................................................................43

2.5.3. Микроокружение циркулирующей ДНК....................................................45

2.5.4. ДНК-узнающие рецепторы и их лиганды. Участие ТЪЯ-путей в работе клеток эндотелия в норме и при патологии..................................................48

2.6. Заключение по данным литературы...............................................................50

3. Материалы и методы...........................................................................................52

3.1. Цитологические методы. Объект исследования...........................................52

3.1.1. Выделение и культивирование клеток эндотелия.....................................52

3.1.2 Добавление к эндотелию фрагментов ДНК.................................................52

3.1.3. Облучение, обработка и инкубирование эндотелия..................................53

3.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода...................................................53

3.1.5. Культивирование эндотелия для выявления эффекта свидетеля.............53

3.1.6. Получение клеточных лизатов.....................................................................54

3.2. Цитохимические методы.................................................................................54

3.2.1 Иммуноцитохимическое определение актина............................................54

3.2.2 Иммуноцитохимическое определение белков ТЬЯ9, А1М2,

¡N08, еШБ, реШЭ, N0X4, Кь67, РСЫА, р65(ЫР-кВ)..............................55

3.2.3. Анализ изображений.....................................................................................55

3.2.4. Определение количества АФК методом проточной цитометрии............56

3.2.5. Определение содержания окиси азота в клетках методом проточной цитометрии ...........................................................................56

3.3. Получение и последующее определение свойств внеклеточной ДНК.......57

3.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК

из среды инкубации эндотелия/ сыворотки крови.......................................57

3.3.2 Получение модельных фрагментов ДНК.....................................................58

3.4. Биохимические методы....................................................................................58

3.4.1. Выделение РНК из эндотелия,

определение ее концентрации и хранение .............................................58

3.4.2. Выделение геномной ДНК из эндотелия,

определение ее концентрации и хранение ......................................59

3.4.3. Окисление фрагментов ДНК........................................................................60

3.4.4 Определение относительного содержания

8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) во вкДНК....................................60

3.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде

методом Грисса......................................................................................... 61

3.4.6 Определение количества метаболитов окиси азота в среде с помощью реагента CuFL..................................................................................................62

3.4.7. Методика ДНК комет (single cell gel electrophoresis) для определения содержания одно- и двунитевых разрывов в клетках HUVEC...................62

3.4.8. Детекция двуцепочечных разрывов ядерной ДНК методом иммунофлуоресценции...................................................................................63

3.5. Молекулярные методы.....................................................................................64

3.5.1 Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени.....64

3.6. Статистическая обработка...............................................................................66

4. Результаты и обсуждение...................................................................................68

4.1. Общая схема эксперимента.............................................................................68

4.2. Характеристика образцов ДНК.......................................................................68

4.2.1. Лиганды и ингибиторы TLR9......................................................................69

4.2.2. Окисленные формы ДНК..............................................................................71

4.2.3. Характеристика циркулирующей ДНК плазмы человека в норме, при патологии и внешнем воздействии (ионизирующее излучение)...............72

4.3. Локализация образцов экзогенной ДНК с различными свойствами

в клетках HUVEC............................................................................................74

4.4. Влияние GC-ДНК и ДНК0Х на экспрессию TLR9........................................76

4.4.1. Изменения количества мРНК TLR9............................................................76

4.4.2. Изменения количества белка TLR9.............................................................79

4.5. Влияние GC-ДНК и ДНКох на экспрессию других ДНК-сенсоров............82

4.6. Изменение уровня АФК в HUVEC при действии

различных образцов ДНК ..........................................................85

4.6.1. Детекция количества АФК в HUVEC различными методами..................85

4.6.2. Свойства вкДНК влияют на количество АФК в HUVEC.........................88

4.7. Свойства вкДНК влияют на количество мРНК NOX4 в HUVEC................93

4.8. Свойства вкДНК влияют на количество мРНК SOD1 в HUVEC................97

4.9. Изменение свойств вкДНК стимулирует образование разрывов геномной ДНК в клетках HUVEC.................................................................98

4.9.1. Анализ разрывов ДНК ядер HUVEC методом комет................................98

4.9.2.Анализ разрывов ДНК ядер методом иммунофлуоресценции................101

4.10.Изменение свойств вкДНК приводит к нестабильности генома..............105

4.11. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию клеток HUVEC.. 109

4.12. Изменение свойств вкДНК влияет на уровень гибели клеток HUVEC.. 115

4.13. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в HUVEC 117

4.14. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина.........................125

4.15. Изменение адгезивных свойств HUVEC при изменении свойств вкДНК127

4.16. Активация транскрипционного фактора NF-kB

при изменении свойств вкДНК....................................................................130

4.16.1. Изменение количества мРНК основных генов пути, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, при изменении свойств вкДНК среды культивирования HUVEC.............................................................................130

4.16.2. Изменение количества белка р65 и локализации его в клетках при изменении свойств вкДНК...........................................................................132

5. Заключение.........................................................................................................137

6. Выводы...............................................................................................................141

Список сокращений и условных обозначений...................................................143

Список литературы................................................................................................144

1. ВВЕДЕНИЕ 1.1. Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) до сих пор являются одними из самых распространенных в мире. Патология сосудистой системы активно изучается, тем не менее, остается много вопросов относительно того, какие факторы могут приводить к развитию этих заболеваний. Еще более актуальной задачей является поиск способов ранней диагностики заболевания на той стадии, когда нарушения минимальны, и их проще исправить. В рамках поиска новых мишеней для терапии рассматриваются различные биомолекулы, которые могут влиять на развитие сосудистой патологии.

Известно, что эндотелий сосудов в первую очередь реагирует на физиологические изменения в организме, которые могут наблюдаться как в пределах нормы, так и носить патологический характер. Большинство ССЗ сопряжено с дисфункцией эндотелия, изменением организации структуры клеточного слоя, биохимии эндотелиоцитов, формированием бляшек при атеросклерозе и тромбовых сгустков при нарушении процессов свертывания-антисвертывания. В ответ на изменение условий микроокружения и состава кровотока эндотелий может осуществлять активацию механизмов окислительного стресса, реорганизацию цитоскелета, изменение его адгезивных свойств.

Внеклеточная или циркулирующая ДНК присутствует в организме в составе крови и в последние годы широко используется в качестве маркера ряда заболеваний и состояний организма человека. На данный момент в литературе много публикаций, направленных на изучение свойств внеклеточной ДНК (вкДНК) человека в норме и при патологии. Однако до сих пор мало изучены биологические эффекты этой ДНК. Практически нет работ, которые бы рассматривали вкДНК в качестве фактора, влияющего на функционирование сосудистого эндотелия.

Вместе с тем, при патологии и в результате негативного влияния на организм внешней среды количество, вС-состав и уровень окисления циркулирующей ДНК значительно изменяется (Егшакоу е1 а1., 2013). Следует предположить, что в таком случае должен меняться и характер ответа клеток эндотелия.

Кроме того, остается до конца невыясненным механизм узнавания вкДНК клетками эндотелия, а также характер влияния вкДНК на развитие окислительного стресса, геномные и генные процессы в клетках культуры эндотелия. Именно на разрешение этих вопросов нацелено настоящее исследование.

Цель проведенного исследования - охарактеризовать общий ответ эндотелиальной клетки на изменение таких свойств внеклеточной ДНК, как концентрация, вС- состав и уровень окислительной модификации.

Задачи исследования

(1) Сформировать из различных источников рабочую выборку образцов ДНК. Охарактеризовать их свойства (вС- состав и уровень окисления оснований);

(2) Определить локализацию в клетках эндотелия культуры НЦУЕС образцов экзогенной ДНК с различными свойствами в клетках эндотелия;

(3) Исследовать влияние образцов ДНК с различными свойствами на следующие показатели состояния эндотелиальной клетки (НЦУЕС):

- уровень активных форм кислорода и азота;

- наличие разрывов в ДНК хроматина;

- пролиферативная активность клеток;

- показатели гибели клеток;

- изменения цитоскелета;

- активация транскрипционного фактора №-кВ.

Научная новизна

Впервые был исследован механизм действия фрагментов вкДНК с различными свойствами на эндотелиальные клетки. Показано, что клетки эндотелия очень быстро реагируют на изменение свойств вкДНК. Ранний ответ клеток — это синтез большого количества активных форм кислорода и возникновение одно- и двунитевых разрывов ДНК хроматина ядер, что приводит к остановке клеточного деления. Окисленная и СО-богатая ДНК, так же как и ДНК людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями, действует на клетки эндотелия как через ТЫ19-рецепторы, так и, возможно, через другие ДНК-узнающие сенсоры. Далее сигнал передается через ряд внутриклеточных посредников и приводит к активации стрессового внутриклеточного каскада с вовлечением транскрипционного фактора МР-кВ. Впервые показано, что при изменении свойств вкДНК наблюдается формирование стресс-фибрилл актина в клетках эндотелия и увеличивается экспрессия молекул адгезии. Впервые высказано предположение, что свойства циркулирующей ДНК могут являться мишенью для терапии при профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные позволяют по-новому осознать роль циркулирующей ДНК в развитии некоторых заболеваний и адаптивного ответа организма, развивающегося при его попадании в неблагоприятные условия. В результате, представляется возможным разработать направления ранней диагностики заболеваний, основываясь на описанных в данной работе эффектах, проявляющихся в клетках эндотелия в ответ на действие различных фрагментов вкДНК. Окисленные фрагменты ДНК, циркулирующие в большой концентрации в кровотоке людей с сердечно-сосудистыми, аутоиммунными, раковыми заболеваниями, могут послужить в качестве мишени для терапии. В результате, удастся нивелировать вторичные системные эффекты, вызванные развитием окислительного стресса в клетках, взаимодействующих с циркулирующей вкДНК.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изменение концентрации, вС-состава и уровня окисления внеклеточной ДНК индуцирует в клетках эндотелия НЦУЕС увеличение экспрессии гена N0X4 и синтез активных форм кислорода (АФК). Это сопровождается блокированием деления клеток в 01-, Б- и в2/М - фазах клеточного цикла.

2. Окислительный стресс, вызванный действием внеклеточной ДНК, стимулирует в клетках эндотелия образование одно- и двунитевых разрывов ДНК НЦУЕС, что приводит к нестабильности генома, признаками которой являются образование микроядер, фрагментация хроматина и выпячивание ядерной мембраны. На фоне деструктивных процессов включаются репаративные механизмы, направленные на снижение апоптотической активности.

3. В ответ на изменение концентрации, вС-состава и уровень окисления внеклеточной ДНК в клетках эндотелия происходит стимуляция транскрипционного фактора ММсВ. Способность образцов вкДНК активировать №-кВ уменьшается в ряду: ОС-ДНК > геномная ДНК > окисленная геномная ДНК.

4. Внеклеточная ДНК влияет на экспрессию гена еИОЗ на уровне мРНК еИОБ, белка еМЗБ и продукта N0 в клетках эндотелия. Кроме того, ОС-ДНК и окисленная ДНК стимулируют в НЦУЕС структурные изменения клеточного матрикса: наблюдается синтез стресс-волокон полимерного актина и меняется экспрессия мРНК генов молекул адгезии (1САМ1, РЕСАМ1, БЕЬЕ и УСАМТ).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Клеточные сигнальные пути в эндотелии

2.1. Роль эндотелия в физиологических функциях организма Эндотелий - это клеточный монослой, покрывающий изнутри сосуды (артерии, вены, капилляры), находящийся на границе между кровью и другими тканями. Эндотелий обладает несколькими функциями, основными из которых являются барьерная и регуляторная. Некоторые авторы называют эндотелий сепаратным органом, регулирующим кровообращение в ответ на какие-либо физические или химические сигналы путем выработки широкого спектра факторов (Mehta et al., 2006).

2.1.1. Барьерная роль эндотелия сосудов Эндотелий способен реагировать в течение нескольких секунд на действие провоспалительных цитокинов, тромбина и других вазоактивных соединений. В результате, в клетках меняется концентрация кальция, и запускаются процессы фосфорилирования, что приводит к изменению активности ряда ферментов, реорганизации цитоскелета. Кроме того, происходит перераспределение и вовлечение в процессы активации эндотелия везикул с прекурсорами белков к плазматической мембране с последующим выбросом эффекторных молекул. (Bogatcheva et al., 2008).

В ответ на механическое воздействие, изменение температуры, действие кининов, простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов, гидроксиэйкозаноидов, эндотелина, ацетилхолина и др. эндотелий модулирует тонус сосудов. Основными эффекторными молекулами, участвующими в этом процессе, являются оксид азота (NO или EDRF), цитокины, факторы свертывания, монооксид углерода и эндотелии (Rath et al., 2009). Кроме того, меняются адгезивные свойства эндотелия, что важно для реализации различных процессов, происходящих с участием других клеток - например, клеток иммунной системы, процессов свертывания или же механизмов адаптивного иммунного ответа. Запускаются или усиливаются механизмы экспрессии белков клеточной адгезии РЕСАМ, VCAM-1, ICAM-1, Е-селектина и др. (Dáñese et al., 2007).

Активация эндотелия проявляется в вовлечении множест�