Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение ДНК-связывающих белков вируса осповакцины при помощи ДНК-белковых сшивок, индуцированных диметилсульфатом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение ДНК-связывающих белков вируса осповакцины при помощи ДНК-белковых сшивок, индуцированных диметилсульфатом"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ЧХЕИДЗЕ АЛЕКСАНДР НОЕВИЧ

УДК 576.315.42

ОБНАРУЖЕНИЕ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ПРИ ПОМОЩИ ДНК-БЕЛКОВЫХ СШИВОК, ИНДУЦИРОВАННЫХ ДИМЕТИЛСУЛЬФАТОМ

03.00.03.-молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

, Москва—1993

^ ^ Л ^ /<л у* \ у .//,)

. Ч' / 'у} к*

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук, академик РАН А. Д. Мирэабеков

доктор биологических наук В. Л. Карпов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С. В. Разин

кандидат биологических наук Л. Г. Николаев

Ведущая организация: Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН

Зашита диссертации состоится ЛЛ 1993

г. в /(7часов на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН.

и б/см^иХ

Автореферат разослан V1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук ¿^У^ и/ ---— ~ А- м- Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ключевая роль макроструктуры генома высших Фганизмов в процессах генетической регуляции клеточного метаболизма юлучила в настоящее время достаточно солидное теоретическое и |Кспериментальное обоснование. Общепринятым стало мнение, что геном :ак интегральная генетическая система может быть осмыслен только при дновременном развитии исследований всех уровней его структурной рганиэации. Наибольшая трудность исследования высших структур генома аключается в сложности изучения динамики его функционирования. Задача зучения генома как интегральной генетической системы усугубляется еще тем, что пока нет возможности использовать для исследования прощенных гомологичных систем, модулирующих функционирование генома в летке. Уже частичное решение этой проблемы явилось бы существенным кладом в развитие всей проблематики. Мы считаем, что с определенными граничениями такими моделями могли бы служить геномы некоторых рупных ДНК-содержаших вирусов. В этом плане наибольший интерес редставляют поксовирусы (Poxvlrldae) - уникальная группа НК-содержаших вирусов, которые развиваются в цитоплазме вне ависимости от клеточного генома. Наиболее известный представитель той группы вирусов - вирус осповакцины (BOB) (Vaccinia virus) -зучен достаточно подробно: установлена полная нуклеотидная оследовательность его генома, близко к завершению построение его енетической карты, дана оценка общего состояния макроструктуры ДНК в ависимости от фазы вирусного развития. Однако, многие аспекты труктурной организации генома ВОВ остаются еще неясными. Так, еще эвсем не изучен способ формирования нуклеопротеидного комплекса, в астности, не ясно, соблюдается ли нуклеосомный принцип упаковки ДНК пи же существует другой принципиально отличный механизм компактизации -1К. С одной стороны, ВОВ явно не использует клеточных гистонов для

упаковки своей ДНК, с другой - совершенно очевидно, что эта проблеме должна решаться посредством взаимодействия с одним или нескольким!* вирус-специфическими структурными белками.

Исходя из сложной структуры БОВ, было опробировано несколько методов для изучения общей структурной организации ВОВ. Методы, которые основывались на контролируемой деградации ВОВ, предложенной Easterbrook (Easterbrook К. В., 1966), хотя и даЕали некоторую информацию о упаковке ДНК в составе вируса, их недостатки совершение очевидны. В случае использования ионных детергентов и сильны* восстановительных агентов могут разрушаться многие ДНК - белковые контакты, что могло бы привести к потере некоторых белковых компонентов, а в случае использования неионных детергентов, несмотря на искусные методы очистки, нет гарантии от артефактного перераспределения других белков на ДНК.

Были предложены и другие подходы для изучения ДНК-связываюиш белков, в которых непосредственно использовались ДНК-связывающие характеристики m vitro <Као S. Y. et al 1981; Pollsky and Kates, 1976). Однако и эти методы не лишены недостатков, например, невозможность детекции ДНК-связывающих белков, присутствующих в относительно малых количествах в коре ВОВ. В связи с названными причинами представляется' особенно интересным использование новых методических подходов, связанных с фиксацией белков на ДНК при помощи ковалентной пришивки, с последующей идентификацией пришитых белков на специфических последовательностях ДНК.

Цель работы. Цель работы заключалась в использовании альтернативного метода для изучения нуклеопротеиднои организации ВОВ, основанного на ДНК-белковой фиксации. В настоящей работе была поставлена задача обнаружения и идентификация ДНК-связывающих белков внеклеточного вириона вируса осповакцины, а также задача сравнения белкового содержания различных функциональных областей ранних и

поздних генов Hind III-F фрагмента генома ВОВ. используя метод ДНК-белковых ковалентных сшивок, индуцированных диметилсульфатом.

Научная новизна и практическая ценность работы. В нашей работе для обнаружения ДНК-свяэывающих белков вируса осповакцины впервые был применен метод ДНК-белковых сшивок, индуцированных диметилсульфатом. Зтот метод в комбинации с подходом, известным под названием гибридизации с "белковыми тенями", позволяет анализировать и сравнивать белковый состав различных районов генома ВОВ. При помогай этих методов было установлено, что по крайне мере пять ДНК-связываюших белков входят в состав нуклеопротеидного комплекса ВОВ. Также было продемонстрировано, что обнаруженные белки взаимодействуют с промоторными и со структурными частями как ранних, так и поздних генов. Оказалось, что эти белки не "фазированы" т. е. располагаются случайным образом вдоль ДНК. Также показано, что во взаимодействии с упомянутыми белками принимают участие обе цепи ДНК ВОВ.

С помощью использования двумерного белкового электрофореза были определены мол. веса обнаруженных пяти ДНК-связывающих белков ВОВ. Они составляют: 16 кД, 25 кД, 27 кД, 41 кД и 54 кД, соответственно.

Использованный в работе подход идентификации ДНК-связываюших белков ВОВ имеет одно бесспорное преимущество. Этот метод позволяет, в отличие от других подходов, исследовать нативные структуры вириона без его частичного разрушения. Кроме того, с помощью этого метода можно исследовать и сравнивать белковый состав разных функциональных участков индивидуальных генов.

Сравнение особенностей макроструктуры генома ВОВ и генома высших организмов позволяют оценивать допустимые пределы использования ВОВ ■сак модели генома эукариот. Сравнение структурных и функциональных гвоиств геномов человека и ВОВ помимо своей значимости для фундаментальных исследовании может также иметь значение для <арактеризации ВОВ как эукариотического вектора и оценки потенциальной

опасности его применения в качестве поливакцины.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзном совещании "Молекулярная биология ДНК-содержаших вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины" (Киев, 1990). IV Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии" (Рига. 1990). II Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "генная и клеточная инженерия" (Пушино-на-Оке, 1991), X двустороннем Российско-Германском симпозиуме "Структура и функция генома" (Суздаль, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения. выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 9 рисунков

и 5 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РА60ТЫ 1. Характеристика использованного метода

Ранее был разработан обший подход, позволяющий определить относительное содержание белков в различных участках эукариотического хроматина. Метод был назван авторами методом гибридизации с "белковыми тенями" lKarpov ег а1., 1984) и основывается на пришивке белков к ДНК после метилирования ее диметилсульфатом и частичной апуринизации И.еу1па ег а!.. 1981: ЭШск ег а!., 1980).

Предлагаемый метод был разработан в основном для пришивки гистонов к ДНК. т. е. для таких белков, которые присутствуют в больших количествах. Однако метод может быть использован шире. В некоторых экспериментах было получено связывание с ДНК 1ас-репрессора и РНК-полимеразы. Исходя из вышесказанного, в нашем случае для идентификации пришитых белков вероятнее всего их поиск среди мажорных структурных белков ВОВ, хотя минорные структурные белки также не исключается.

В нашем случае при использовании этого метода белки пришиваются к ДНК непосредственно в очищенных, зрелых, нативных частицах ВОВ. На Рис. 1. представлена схема экспериментов по пришивке. Суспензию вирионов ВОВ в буферном растворе обрабатывали диметилсульфатом. проводили апуринизаиию и восстановление, после чего вирусные частицы лизировали и наносили на преформированныя градиент СбС1 для отделения от непришитых белков. После центрифугирования фракцию, содержащую ДНК и ДНК-белковые комплексы, собирали и диализовали против 10 мМ Трис-НС! ! рН 3,0 1. 0,1?. №-40. В некоторых случаях ДНК до обработки смесью фенол/хлороформ фрагментировали рестриктазоя. Свободную (непришитую) ДНК удаляли обработкой смесью фенол/хлороформ, и обогащенные таким образом пришитые комплексы разделяли в системе двумерного диагонального ДНК гель-электрофореза (ЭМск ег а1.. 1980). В первом направлении в денатурирующих условиях разделяются фрагменты свободной ДНК и ДНК. связанной с белками, которые уменьшают ее подвижность по сравнению с аналогичными по длине свободными фрагментами ДНК. Во втором направлении, после гидролиза белков проназой непосредственно в геле, разделяются фрагменты ДНК. Фрагменты свободной ДНК (которые не удаляются полностью при фенольнои экстракции) двигаются и в первом, и во втором направлениях в соответствии только с их размерами и образуют одну диагональ (диагональ 1. на Рис. 1.). Фрагменты, которые в первом направлении были связаны с белками, после второго направления образуют

ВИРИОНЫ*-

V

лизис

V

Метилирование,

Апуринизация,

Восстановление

Центрифугирование в фадиенте плотности СбС!

1. ДНК, ДНК-белковые комплексы

2. Непришитые белки

V

Диализ

Обогащение фенолом

V

Двумерный ДНК-овый электрофорез Перенос на нейлоновую мембрану

V

Гибридизация и экспозиция на рентгеновской пленке

Мечение белков 1125

V

Двумерный белковый электрофорез

Сушка геля и экспозиция на рентгеновской пленке

;—

7-

1-Нспришитая ДНК 1,2 и З-Непрншнтыс белки

2,3,4 н 5-"Белковые тешт" 4,5,ба,бЬ и 7-Прм1питмс белки

111 >111и11 П.1Х бел к он

Рис. 1. Схема эксперимента

Б

свою диагональ, угол наклона которой тем круче, чем больше молекулярная масса пришитого белка. Эти диагонали, являются как бы "белковыми тенями", поскольку их местоположение отражает размеры ранее пришитого к ДНК белка (диагонали 2., 3., 4., и 5. на Рис. 1. ).

После двумерного электрофореза ДНК из геля переносили

электрофоретически на нейлоновую мембрану Hybond-N и затем

32

последовательно гибридизовали с высокомеченными Р-зондами, клонированными в векторах М13 или PUC16. Последовательная гибридизация одного и того же фильтра позволяет сравнить содержание белков на различных участках генома ВОВ и оценить приблизительный мол. вес банков, пришитых к этим участкам. Молекулярные массы обнаруженных пришитых полипептидов оценивались по сравнению с положениями диагоналей, соответствующих пришитым белкам с известными мол. весами. Оценочный эксперимент с ядрами эритроцитов кур, а также с несколькими другими белками с известными мол. весами проводили одновременно с основным экспериментом.

Определение молекулярного веса пришитых белков можно проводить альтернативным способом: деградировать ДНК и освобожденный белок анализировать с помощью двумерного белкового электрофореза iMirzabekov et аЬ, 1978; Mirzabekov et al., 1989) (Рис. 1.). Для этой цели использовался тот же самый материал, что и для "ДНК-ового" двумерного

электрофореза. Стадию обогащения смесью фенол/хлороформ опускали.

125

Зелки содержащися в пришитом материале, метили I с помощью реактива Золтона/Хантера и наносили на форез 1-го направления, условия которого аналогичны условиям 1-го направления двумерного ДНК электрофореза, за исключением процентности делящего геля. Учитывая возможность эбраэования ДНК-белковых комплексов в широких пределах молекулярных ¡есов, в первом направлении использовали линейный градиентный делящий >-15% ПААГ. После завершения электрофореза полоску геля вырезали и ДНК ■идролиэовали прямо в геле по Бартону (Burton , 1967). Затем полоску

гелл приполимеризовывали в плоский блок 11-го направления. Во время П-го направления белкового электрофореза использовали 12,5%-ный ПААГ. Рядом с приполимериэованной полоской, во время второго направления, формировали ячейку, в которую наносили маркерные белки. После окончания электрофореза гель фиксировали в 10Х ТХУ, сушили и проводили радиоавтографию.

2. Исследованные районы генома ВОВ

В нашей работе мы исследовали Hind III-F (обозначения Hind III-F участка генома по Mackett & Archard, 1979) геномный участок ВОВ ¡Микрюков и др., 1983) (Рис. 2. и Рис. 3.). В свое время была показана эффективность промоторных участков Hlnd III- F фрагмента вирусного генома iGollnl., Kates J. Ft., 1984) и наличие удобного сайта интеграции (Penlcall D., Paolettl Е., 19S2). В Hlnd-F фрагменте ВОВ шт.ЛИВП выявлено 19 возможных открытых рамок трансляции (ОРТ) (см. рис. 3) (Микрюков и др., 1988). Две ОРТ картированы на границах фрагмента Hlnd-F с фрагментами Hlnd-E и Hlnd-L и поэтому соответствующие полипептиды получили название FE1 и FL1. 17 ОРТ находятся внутри F-фрагмента ВОВ шт. ЛИВП. Транскрипция генов, кодирующих белки Fl - F16 и FL1, строго однонаправлена и возможна только справа налево. В рассматриваемой области F-фрагмента ВОВ шт. ЛИВП нет четко выраженных кластеров ранней или поздней транскрипции. На протяжении всего участка генома на'блюдается смешанное расположение ранних и поздних генов.

Для сравнения белкового содержания разных функциональных участков ранних и поздних генов, мы один и тот же фильтр прогибридизовали с клонированными индивидуальными пробами. Характеристика использованных зондов, которые получены из геномного Hlnd-F фрагмента ДНК ВОВ (см. Рис 2., Рис. 3. и Рис 5.), приводится в Таблице 1.

I I PBRHF4

Рис. 2. Расположение Фрагмента Hind III-F в геномной ДНК ВОВ шт. ЛИВП. Обозначения Hlnd III-фрагментов генома как у Mackett М., Archard • L. С., 1979. Одно деление на шкале соответствует ЮОи н. п. С нижнем стороны шкалы указаны расположение сайтов рестриктази Bsp I.

fli fi6 f14 fi1f10f9 f7 f6 f4 f2 fl

□а а ™<юаа а i аса

f13 f6'

О ^иЭ

fis f8 fs f3 fei

СП <ZJ <Z] <1 о

13 12 ii 10 9 8 7 6 5 4 3 2 i

1 2 3

Рис. 3. Трансляционная карта фрагмента Hind III-F ДНК ВОВ шт. ЛИВП: 1 - поздние полипептиды: 2 - полипептиды, синтезируемые на протяжении всего инфекционного цикла; 3 - ранние полипептиды.

Таблица 1

Характеристика клонов, использованных в качестве зондов

Название плазмид * Рестриктиый фрагмент из Hind III-F геномного участка Длина вставки н.п. Характеристика соответствующего гена

pBRHF4 Hind III — Hind III 13 326

pWF/FEl Hind III — EcoR I 119 Поздний

pwf/pfipfei Xbal — EcoR I 105 Ранепоздний

pWF/Fl Xba I — Xma I 285 Ранний

pWF/F2 Ваш H I— Kpn I 284 Ранний

PWF/Pp2 Bam H I— Kpn I 263 Ранний

pWF/F4 Dra I — Sal G I 107 Ранний

pWF/P P ^ F3 F4 Dra I — Dra I 249 Ранепоздний

pWF/F5 Sal G I — Sal G I 213 Поздний

pWF/Pp5 Sal G I — Kpn I 104 Поздний

*

Буква Р в название плазмид после / знака обозначает промоторный участок соответствующего гена

3. Исследование белкового содержания Н1па 111 -Р фрагмента генома ВОВ

Целью этого исследования было обнаружение белков взаимодействующих с ДНК внутри зрелых нативных вирионов ВОВ и оценк их мол.весов. Наш подход заключался в комбинировании двух раэны протоколов - техники ДНК-белковой химической пришивки 11^1па ег а1. 1901: ЭМск е1 а1.. 1960) с техником гибридизации с "белковыми тенями |Кагроу еь а1.. 1984 ).

Ллл исследования суммарного белкового содержания кора ВОВ. нейлоновый фильтр, полученный в результате электропереноса двумерного геля, прогибридиэовали с суммарной вирусной ДНК (см. схему эксперимента). Соответствующие результаты приводятся на рис. 4. Наряду с диагональю непришитои ДНК (диагональ 1, на Рис. 4.) обнаруживается присутствие диагоналей, соответствующих пришитым полипептидам с молекулярными массами примерно 15 кД (диагональ 2, на рис. 4.). 30 кД (диагональ 3, на рис. 4.), 40 кД Iдиагональ 4, на рис. 4.) и 50 кД (диагональ 5, на Рис. 4.). Приблизительные молекулярные массы обнаруженных пришитых полипептидов оценивали в модельном эксперименте по сравнению с положениями диагоналей, соответствующих пришивке белков с известными мол. весами (соответствующий эксперимент проводился одновременно с основным). В качестве маркерных белков использовали гистон Hi, коровые гистоны. а также некоторые другие индивидуальные белки. Погрешность нашей оценки составляла +/- 10% для белков с мол. весом меньше 40 кД и +/- 15% для белков с мол. весом, превышавшим 40 кД. Гибридизация этого же фильтра с пробой pBRH 4 (Hind III-F Фрагмент) не выявила сколько-нибудь заметных различий в обшей картине двумерных "ДНК-овых" гелей, относительно той, которая получается после гибридизации с суммарной ДНК ВОВ.

Нами было использовано два протокола сшивания белков с ДНК: Зоргидридныи и цианборгидридный. Степень пришивки белков в нашем :лучае в целом не зависела от метода восстановления основания Шифа боргидридом натрия или иианборгидридом натрия). (Данные не (риводятся). Ранее при использовании этих двух разных протоколов ¡осстановления основания Шиффа в отношении гистонов были получены >аэные результаты (Nacheva et al.. 1989). В результате дальнейшего [сследования этого вопроса был сделан вывод, что при применении ¡оргидрида натрия с ДНК гистоны сшиваются в основном через гистидины, . при применении цианборгидрида натрия - большая часть сшивок

ис. 4. Двумерный ДНК электрофорез сшитых ДНК-белкоЕЫх комплексов, выделенных из внеклеточного вириона ВОВ шт. ЛИВП. ДНК из геля переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с ник-транслированной суммарной ДНК ВОВ. Диагонали соответствуют свободной ДНК (1), "белковым теням" белков с молекулярными массами 15 кД 12). 30 кД 13), 40 КД (4) И 50 КД 15).

происходит через лизины. Проанализировав эти результаты, можно сделать вывод, что в сшивании обнаруженных белков с ДНК ВОВ могут быть вовлечены как лизины, так и гистидины. Хотя, этот вопрос требует специального изучения.

Для более детального картирования месторасположения пришивающихся белков к ДНК и сравнения белкового состава и содержания на разных функциональных участках ранних и поздних генов. один и тот же фильтр был прогибридизирован с индивидуальными зондами 1см. Таблицу 1). Картина двумерного электрофореза после гибридизации с различными индивидуальними пробами показана на Рис. 5 I для примера приводятся картины двумерных ДНК электрофорезов после гибридизации с промоторными и структурными частями только для одного раннего СП ] и одного позднего ( 55] гена). Как видно из Рис. 5.. количество, примерная

интенсивность и взаиморасположение диагоналей одинаковы и точно совпадают с картиной гибридизации с суммарной ДНК 1см. Рис. 4.). Следовательно, в организации нуклеопротеидного комплекса Hind III-F фрагмента ДНК ВОВ принимает участие по крайней мере четыре полипептида, мол.веса которых оцениваются примерно в 15, 30, 40 и 50 кД. Исходя из того факта, что двумерная картина не зависит от выбранных зондов можно предположить, что белковое содержание рассматриваемых участков генома ВОВ, как промоторных, так и структурных частей ранних и поздних генов одинаковое, т. е. эти белки равномерно распределены " вдоль генома ВОВ в неклеточных зрелых зирионах.

4. Исследование цепь-специфичности ДНК-белкового взаимодействия и специфичности расположения пришитых белков на ДНК

Ранее был разработан подход для картирования контактов гистонового октамера с нуклеосомной ДНК при помощи ДНК-белковых сшивок iShlck et al.. 1980: Bavykln et al., 1938:). Метод основывался на измерении длины 5'-концевого фрагмента ДНК, пришитого к индивидуальным гистонам.

3 нашей работе для изучения "фазирования" посадки белков ВОВ на ДНК, т. е. специфичности взаимодействия белков с индивидуальными участками генома ВОВ, использовали подход, схожый с упомянутым выше. ДНК и ДНК-белковые комплексы после очистки, до удаления непришитой ДНК обрабатывались рестриктаэой Bsp 1. Далее пришитый, рестрицированный материал после обработки фенолом наносили на двумерный форез и анализировали так. как описано в разделе 3. После электропереноса и гибридизации с индивидуальными зондами обнаруживались такие же ДНК диагонали, как на Рис. 4. и Fhc . 5.. которые, несмотря на действие рестриктазы. образуются из-за случайного растепления ДНК (данные не

(512) б

В

?ис. I. Двумерный электрофорез сшитых ДНК-белковых комплексов Гибридизация с индивидуальними пробами ранного (А, И1 ) и позднего (В Р5) генов. На каждой панели слева показаны физические карты кажпог гена, также показаны использованние гибридизационние проби (а и с промоторние участки соответствующих генов. Ь и й - структурние участк соответствующих генов), сайты соответствующих рестриктаз, с помощь которых вырезаются использованные зонды 1Е, Есог I: X. ХЬа I; Б, За

ÖA: O. Sal Gl: К. Kpn I): б кавычках указаны координаты соответствующих рестриктаз от правого 1см. Рис. 2) Hlnd III сайта Hind III-F фрагмента генома ВОВ. Диагонали под номером 1 соответствуют свободной ДНК, а диагонали под номерами 2, 3, 4 и 5 - "белковым теням" белков с молекулярной масои 15 кД, 30 кД, 40 кД и 50 кД, соответственно.

приводятся). Здесь важно отметить, что обработка пришитого материала рестриктазой приводит к образованию смеси ДНК-белковых комплексов, в которых ДНК с 5'-конца расщеплена рестриктазой, а с 3'-конца - сайтом разрыва фосфодиэфирной связи за счет пришивки белка. Учитывая, что сайт расщепления растриктазой iBsp 1) в любом случае фиксирован, лимитирующим для образования дискретных фрагментов ДНК должно быть расщепление ДНК за сче.т пришивки белка. Отсутствие дискретных длин Фрагментов ДНК для всех четырех диагоналей пришитой ДНК однозначно указывает на то, что все обнаруженные нами белки располагаются на анализируемых нуклеотидных последовательностях ДНК случайно.

Для выяснения вопроса о симметричности взаимодеиствия обнаруженных пришитых • белков относительно цепей ДНК, мы прогибридизовали те же самые фильтры с комплементарными цепями индивидуальных зондов. Мы не обнаружили разницы в наборе и соотношении интенсивности диагоналей, соответствующих пришитой ДНК в зависимости от гибридизации с различными цепями одного и того же зонда 1данние не приводятся), что говорит о том. что во взаимодействии обнаруженных белков с ДНК вовлечены обе цепи ДНК на каждом исследуемом участке генома.

Исходя из того факта, что обнаруженные белки взаимодействуют со всеми исследуемыми участками генома ВОЗ и что в это взаимодействие вовлечены обе цепи ДНК ВОВ. можно утверждать, что обнаруженные белки, по видимому, являются, структурными белками ВОВ, принимающими участие в

упаковке ДНК BOB. Таким образом, хроматин внеклеточного вириона ВОВ организован в монотонную, регулярную структуру на протяжении всего генома наподобие репрессированного хроматина эукариотов, хотя не исключено, что местами могут иметься "островки", где эта регулярность нарушается. Такие "островки" могут существовать в виде собранного комплекса вирусной РНК-полимераэы и некоторых регуляторных белков (например, фактор ранней трансктипции VETF) на промоторах тех ранных генов, которые экспрессируются в первую очередь на ранней стадии инфекционного цикла. Для активации этого механизма, видимо, требуется "раздевание" вируса до кора и фосфорилирование некоторых специфических белков до начала ранней транскрипции (Moussatche & Keller, 1991).

5. Определение мол. весов пришитых белков при помоши двумерного "белкового" электрофореза

Для идентификации белков, пришитых к ДНК ВОВ, был использован двумерный белковый электрофорез (Mlrzabekov et al., 1976; Mlrzabekov et al., 1989). Для этой цели использовался тот же самый материал, что и для "ДНК-ового" двумерного электрофореза. Учитывая возможность образования ДНК-белковых комплексов в широких пределах молекулярных весов, в первом направлении использовали линейный градиентный деляшии гель (5-15S ПААГ). Для определения молекулярных весов пришитых к ДНК белков их электрофоретическую подвижность во втором направлении двумерного электрофореза сравнивали с электрофоретической подвижностью белков с известными молекулярными весами из стандартного набора фирмы "Sigma". После окончания электрофореза гель фиксировали в Ю* ТХУ, сушили и проводили радиоавтографию.

Результат такого манипулирования приводится на Рис. б. На радиоавтограмме можно увидеть как интенсивную диагональ (обозначено 5 на Рис. 6.), соответствующую положению непришитых белков, так и

?ис. 6. Авторадиограмма двумерного злектрофоретического

1 ОС

разделения сшитых ДНК-белковых комплексов ВОВ. меченых На А - 1.

2а. 21), 3 и 1 стрелками показаны позиции пришитых белков: 5 стрелка указывает положение непришитых белков. М - положения маркеров мол. зесов из стандартного набора фирмы "31^та". В - кратковременная экспозиция геля А.

горизонтально расположенные тонкие полосы [указаны стрелками 1. 2а. 2Ь. 3 и 4 на Рис. 6.). которые соответствуют пришитым белкам. Таким эбразом, обнаруживается пять пришитых белков, мол.веса которых ;оответствуют приблизительно 16 кД (1), 25 кД (2а), 27 кД (2Ь), 41 кД 13) и 54 кД (4) соответственно. 16 кД белок соответствует 2-ой

диагонали на Рис. 4. и Рис. 5., 25 кД и 27 кД белки соответствует 3-ой диагонали на Рис 4. и Рис. 5., а 41 кД и 54 кД белки - 4-ой и 5-ой диагонали, соответственно.

С помошыо двумерного ДНК-электрофореза нами было обнаружено четыре ДНК-овые диагонали, которые соответствуют пришитым к ДНК белкам, и были оценены их мол. веса (см. диагонали с 2 по 5 на Рис. 4. и Рис. 5.). С помощью двумерного белкового электрофореза вместо ожидаемых четырех пришитых белков обнаружили пять (см. Рис. 6.). Очевидно, диагонали под номером 3 на Рис. 4. и Рис. 5. представляют собой слияние двух диагоналей, которые соответствуют двум разным пришитим белкам (2а и 2Ь, на Рис. 6.). Сравнивая результаты ДНК-овых и белковых двумерных форезов, можно заметить, что мол. веса обнаруженных пришитых белков, оцененные с помощью двумерного "ДНК-ового" фореза, хорошо согласуется с результатом двумерного "белкового" электрофореза с учетом погрешности.

6. Идентификация обнаруженных пришитых белков ВОВ

Интенсивные исследования структуры генома поксвирусов, проводимые в последние несколько лет, приводят к накоплению информации о нуклеотидной последовательности вирусных генов, а следовательно, и последовательности аминокислот соответствующих белков (Ск)еЬе1 е! а1., 1990). Сравнение расшифрованных последовательностей вирусных ДНК с банками данных позволяет с определенной долей надежности идентифицировать лишь те предполагаемые вирусные белки, которые имеют гомологию с клеточными белками или белками других вирусов (и не относятся к изучаемому семейству). Однако калщое семейство вирусов имеет набор генов и кодируемых ими белков, которые являются специфичными лишь для группы этих вирусов. Обычно это структурные белки, формирующие вирион, а также белки, не входящие в состав

A. taaatateacaeateBteactctgtcTcTTTTffatgatffaaTAAATG - A9L accgaacatccatttataGaATTTagaaataTaTTTTcattTAAATG - E10R gataacgacataceaacattacttccTaTTTTactccttaeTAAATG - F7L taaaaatatagtagaattTcATTTtfftTtTTTTctatgctaTAAATG - F17R

Б. tacatcatceetafftaGaTTTfcactttaccccacgataTMATATG - A47L

taceaatatcTsTCTTaTaTTTAtaatatgctaffttaatagTAAATG - DIOR

gtaaatatatgctcataTaTTTAtagaagatatcacatatcTAAATG - E6R

actectffteaTtTTTAaaacataGtTATTacttatcactcaTAAATG - L4R

B. cTcTTTTettaattaaaaeTaTATTcaaaaaatgaettataTAAATG - A26L tactatteatatatttgTaTTTAaaaffTtGTTTgfftgaactTAAATG - I1L

Г. gatattaaaatcacGcTTTCgafftaaaaactaceaataTAAAIAATG - A3L aaecatattgtaatatctTAAAIAacTcATTTatatatTAAAAAATG - A18R

Рис- 7. Массив нуклеотмдных последовательностей промоторных 'частков выявленных генов ВОВ. А, Б, В, Г - обозначение групп генов, соторые сформированы по молекулярным массам (подробное описание в ■ексте). Нуклеотидные последовательности, гомологичные консенсусу |ромоторов поздних генов, выделены прописными буквами. Подчеркнуто 1вумя чертами - участок инициации поздней транскрипции раннепозднего ена, одной - нуклеотидная последовательность, гомологичная району вязывания фактора ранней транскрипции. Нуклеотиднне оследовательности и обозначения генов приведены по данным Goebel S. ., Johnson G. P., Perkus M. E. et al. - Virology. 1990, 179, p. 47-266.

Таблица 2

Открытые рамки трансляции вируса осповакцины, возможно, кодирующие ДНК-связывающие белки вириона

Название Длина поли- Расчетное Соответст- Содержание основ- Содержание Отношение Выявленные свойства или Литера-

генов* пепгидов значение мо- вие с данны- ных аминокислот,% кислых ами- аминокис- активности полипептидов тура

(число аминокислот)* лекулярной ми по при- нокислот,"?!; лот: основ-

массы, кДа* шивке (И диагонали) Lys Arg Glu +Asp ные/кислые

A9L 99 11,1 2 6,1 4,0 8,0 1,3

E10R 95 10,8 2 6,3 5,3 8,4 1,4 -

F7L 92 11,0 2 14,1 6,5 17,4 1,2 -(Lys-Asn) 9

F17R 101 11,3 2 6,9 9,9 8,9 1,8 Мажорный белок кора 11К, основной (9,8)**

A47L 244 28,3 3 9,0 5,3 10,7 1,3 Основной (10,0)**

D10R 248 28,9 3 6,9 6,9 12,5 1,1

E8R 273 31,9 3 6,2 4,8 9,2 1,2 Основной (9,3) **

L4R 251 28,5 3 8,0 3,6 11,9 1.0 Структурный белок VP8 [2]****

A26L 322 37,3 4 8.1 5,9 11,5 1,2 Основной (9,2) **

I1L 312 35,8 4 10,3 5.1 14,4 1.1 [3]****

A3L 644 72,6 5 4,7 4,4 9,9 0,9 Мажорный белок кора Р4Ь [4]****

A18R 493 56,7 5 7,5 5.1 9,9 1.3 Основной (9,3)**

НЗ 135 15,3 - 9,6 13,3 8,2 2,8 Эукариотические коро-

Н4 102 11,3 - 10.7 13.7 6,9 3,5 вые гистоновые белки***

hupB(HU-l) hupA(HU-2) 90 90 9,2 9,5 - 10,0 12,3 5,6 3,4 11,2 11.2 1,4 1,4 Субъединицы Н2В гисго-ноподобного белка из Н. Col!***

* Название генов, длина и молекулярные масы полипептидов приводятся по данным Goebel et al., 1990.

** Основные белки- белки, для которых р1>9,0.

*** Данные приводятся для сравнения соответствующих значений белков.

*** гч -I то«. П1 V---„1 юоо. Г31 _ и 10ОП* М1 . Рп<г| <-! 10ЯЧ

завуснси частииы. но участвующие в ее "созревании".

С целью изучения Функциональной роли выявленных белков был проведен теоретический анализ генов ВОВ. На первом этапе были локализованы ОРТ. кодирующие полипептиды с молекулярными массами 16 кД (группа А), 25 кД (группа Б), 27 кД (группа В), 41 кД (группа Г ) и 54 кД (группа Д). Так как структурные белки, взаимодействующие с ДНК, могут иметь характеристики, близкие к гистонам эукариот или гистоноподобным белкам прокариот, аминокислотные последовательности выявленных ОРТ были подвергнуты анализу на консервативность и основность. В первом случае сравнивали аминокислотные юследовательности полипептидов, расшифрованные для ВОВ штаммов Topenhagen, WR и ЛИВП, и отбирали ОРТ, не имеющие межштаммовые этличия. Бо втором - определяли относительную долю основных аминокислот каждого типа и отношение основных аминокислот к кислым, <оторое соответствовало для группы А величине >1.2, для группы Б - > ; .0, группы В - > 1.1 и группы Г - > 0.9. Данный алгоритм позволил ¡ыявить 24 ОРТ, для которых на последнем этапе проводили сравнительный шализ нуклеотидных последовательностей, предшествующих инициирующим содонам. Оказалось, что 12 последовательностей гомологичны промоторным 'часткам поздних и раннепоэдних генов ВОВ и содержат характерные ластеры: i(i!NTTTT и ТА A AT ( д). Массив нуклеотидных последовательностей фомоторных участков локализованных генов приведен на Рис. 7. Свойства ;ыявленных полипептидов суммированы в таблице 2.

Следует отметить, что в литературе отсутствуют данные об изучении енов A9L. E10R, F7L, A47L, DIOR, E8R, A26L и A16R. А результаты сследования других белков, представленных в таблице, в основном одтверждают предложенный алгоритм локализации генов ДНК - связывавших елков. Так полипептиды с молекулярными массами 11,3 кД и 72,6 кД F17R и A3L) являются мажорными сердцевинными белками fBertholet et 1., 1935: Rosel et э!.. 19S5), а полипептид, кодируемый геном L4R,

является ДНК-свяэываюшим структурным белком VP8 (Bauer et al., 1977; Yang et al., 1988). Участие белка гена I1L во взаимодействии с геномной ДНК внеклеточного вириона представляется маловероятным, так как полипептид 36 кД не входит в состав вириона и обнаруживается во Фракции плазматических мембран инфицированных клеток (Реэанкина и др., 1990). В то же время не исключено, что данный полипептид может играть например роль, белка "лоцмана" при формировании сердцевинной структуры ВОВ.

Предложенный в работе алгоритм локализации генов, кодирующих ДНК-свяэывающие белки, принципиально отличается от описанных в литературе. В настоящее время широкое распространение получили методы, основанные на сравнении аминокислотных последовательностей полипептидов. В нашем случае использование таких подходов было бы затруднено из-за возможной низкой гомологии белков ВОВ и эукариот. Следует обратить внимание на то, что предлагаемый алгоритм позволил выявить из 199 возможных генов ВОВ только 12. "Жесткие" параметры алгоритма не позволили включить в итоговую таблицу основные полипептиды мажорный белок сердцевины Р4а (AlOL), трансмембранный белок внеклеточного вириона 35К (D8L) и ДНК-лигаэу BOB (A50R) , которые также могут участвовать в связывании с вирусной ДНК. В то же время данные теоретического анализа все же не могут рассматриваться как доказательные, однако, как нам кажется, они в состоянии достоверно ограничить круг кандидатов на роль белков, непосредственно контактирующих с вирусной ДНК. Существование белков, которые не пришились к ДНК ВОВ в нашем случае, но по данним некоторых исследователей (Ole & Ichihashl, 1981) ассоцированы с кором или с боковыми тельцами, можно объяснить тем, что либо они вообще не взаимодействуют с ДНК, либо используемым методом сшивки не фиксируются контакты этого белка с вирусной ДНК. Здесь не лишним будет отметить, что использованным нами методом пришиваются к вирусному геному и

образуют сшивку "нулевой длины" только те белки, стерическое расположение которых позволяет аминогруппам лиэиновых и гистидиновых аминокислот этих белков контактировать с альдегидными группами в частично апуриниэированных молекулах ДНК ВОВ. Наконец, надо отметить, что для точной идентификации пришитых белков нужны другие характеристики этих белков.

ЕЫВОЛЫ

1. Для изучения белкового состава нуклеопротеидного комплекса вируса осповакцины был использован метод, основанный на пришивке белков к ДНК индуцированной диметилсульфатом, и на методе гибридизации с "белковыми тенями", что позволяет исследовать белковое содержание и сравнивать белковый состав на разных функциональных участках ранних и поздних генов ВОВ.

. На примере Hind III-F фрагмента ДНК ВОВ, со смешенным расположением ранних и поздних генов, транскрибирующихся вирус-специфической РНК-полимераэой, показано, что как минимум пять белков взаимодействуют с ДНК промоторных и структурных частей как ранних, так и поздних генов, и, по-видимому, участвуют в компактиэации геномной ДНК в составе зрелого вириона.

3. Обнаруженные белки случайным образом расположены относительно нуклеотидной последовательности ДНК ВОВ. Во взаимодействии с белками принимают участие обе цепи ДНК во всех изученных участках ранних и поздних, генов ВОВ.

4. Определены молекулярные веса всех обнаруженных пяти белков, которые контактируют с ДНК ВОВ. Они составляют 16 кД, 25 кД, 27 кД. 41 <Д и 54 кД, соответственно.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Приходько Г.Г., Петрунина С.И., Урманов И.Х., Василенко С.К., Чхеидзе А.Н., Карпов В.Л., Мирзабеков А.Д. - "Изучение взаимодействий ДНК-белок в инфекционных частицах вируса осповакцины". Тезисы всесоюзного совещания. 9-11 октября 1990 г., г. Киев, стр. 102.

2. Приходько Г,Г., Чхеидзе А.Н., Нетесова H.A., Карпов В.Л., Петрунина С.И., Урманов И.Х. - "Анализ продуктов трансляции мРНК, гибридизующейся с правым Hind III-F-Pst I-фрагментом ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП". Тезисы IV всесоюзной школы-семинара молодых ученых. 4-11 ноября 1990 г., г. Рига, стр. 58.

3. Приходько Г. Г., Петрунина С. И., Чешенько Н. В., Урманов И. X., Дмитриев И. П., Василенко С. К., Чхеидзе А. Н., Карпов В. Л., Мирзабеков А. Д. - "Создание рекомбинантной ДНК вируса осповакцины, содержащие эффективные промоторы для экспрессии чужеродных генов". II Всесоюзная планово-отчетная конференция по направлению "генная и клеточная инженерия". Ноябрь-декабрь 1991 г., Пущино, Москва, 1992 г., стр. 167.

4. Приходько Г.Г., Чхеидзе А.Н., Урманов И.Х., Карпов В.Л., Петрунина С.И., Василенко С.К., академик Мирзабеков А.Д. - "Идентификация ДНК-связываюших белков внеклеточного вириона вируса осповакцины". Доклады Академии Наук, 1992, том 323, N 4, стр. 789-793.