Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение негистоновых ДНК-связывающих белков при помощи УФ-индуцированных сшивок ДНК-белок на интактных ядрах S. cerevisiae

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение негистоновых ДНК-связывающих белков при помощи УФ-индуцированных сшивок ДНК-белок на интактных ядрах S. cerevisiae"

' РГ6 UU 2 9 M №

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им.В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

■ ■ На правах рукописи

ПАПАЦЕНКО ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ОБНАРУЖЕНИЕ НЕГИСТОНОВЫХ ДНК-СВЯЗЫВАЩИХ БЕЛКОВ ПРИ ПОМОЩИ УФ-ИНДУЦИРОВАНННХ СШИВОК ДНК - БЕЛОК НА ИНТАКТНЫХ ЯДРАХ З.сегеу/я'ае

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в лаборатории Молекулярной Организации Хромосом Института Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта РАН; ~

Научный руководитель:

Доктор биологических наук В.Л.Карпов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Г.Габибов

кандидат биологических наук М.А.Эльдаров

Ведущая организация: Институт Молекулярной Генетики РАН

Защита состоится-

.часов, на

заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте Молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан.

/У

1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Щ20пй£ЫЫ:

В настоящее время для изучения взаимодействия негистоновых, ДНК-связывающих белков с различными регуляторными и структурными элементами ДНК на модельных и реконструированных системах используется широкий круг методов таких как футпринт, торможение в геле, транскрипция in vitro и другие. Несмотря- на значительные достижения в этой области, во многих случаях остается открытым вопрос о степени соответствия моделей, опирающихся только на эксперименты in vitro реально существующим в клетке структурам и механизмам. Подобнйе противоречия могут быть частично разрешены при помощи экспериментов in vivo. Среди наиболее распространенных "следует отметить использование репортерных плазмид и минигенов, часто совместно с плазмидами, экспрессирующими ДНК-связывакнциЗ белок, методы модификации ДНК iп vivo, геномный футпринт и ДНК-белковые сшивки.

Применение ДНК-белковых сшивок имеет определенные преимущества перед другими методами изучения ДНК-белковых контактов ¡л vivo, это практически единственный прямой метод, позволяющий ответить на вопрос: существует контакт (молекулярное взаимодействие) между данным белком и участком

последовательности ДНК или нет? КФ-индуцированные сшивки

Ч,

ДНК-белок, широко, применяются в настоящее время, а их

использование в экспериментах /л vivo удобно по ряду причин: незначительное время воздействия сшивающего агента на клетку, в течение которого не успевают активироватья защитные и репарационные системы, отсутствие прямого. химического воздействия, широкий спектр ДНК-узнавдих белков, которые могут быть сшиты с ДНК.

УФ-индуцированные сшивки ДНК-белок in vivo проводились прежде на ограниченном числе объектов, наиболее распространенным из которых являлась бактерия E.col.i, некоторое число исследований было проделано на культуре клеток Drosopbila melanogaster. В настоящей работе была сделана попытка осуществить ДНК-белковые сшивки in vivó на дрожжах S.cerevisiae - простейшей модели при изучении процессов функционирования эукариотического генома. Нами был применен метод, позволяющий фиксировать ДНК-белковые взаимодействия -в -интактных ядрах, дрожжей при- помощи УФ-облучения. Детектирование сшитых ДНК-белковых комплексов осуществлялось при помощи "гибридизации с белковыми тенями" - метода, позволяющего исследовать комплексы на уровне конкретной нуклеотидной последовательности.

Цель работы:

Целью настоящего исследования была разработка ряда методических рекомендаций, позволяющих осуществлять УО-индуцированные сшивки негистоновых белков со специфическими последовательностями ДНК в ядрах дрожжей, а также надежно детектировать свитые комплексы. Для проверки

воспроизводимости и надежности методики била выбрана простая модельная система, с известным расположением ДНК-связывакиаих белков. В качестве такой системы были выбраны рРНК гены, строение которых хорошо изучено, описаны специфические участки связывания для многих негистоновых белков, в том числе хорошо известных. Детектирование ДНК-связывающих негистоновых белков дрожжей на различных последовательностях ДНК, в составе нетранскрибируемого спейсера рибосомальных генов дрожжей посредством УФ - индуцированных сшивок, явилось конкретной экспериментальной задачей работы.

Научная новизна:

Были подобраны конкретные экспериментальные условия ультрафиолетовой фиксации.ДНК-связывающих белков дрожжей на очищенных ядрах. На примере нетранскрибируемого спейсера рРНК' генов " дрожжей было показано св*язь1вание негистоновых белков с различными функциональными участками спейсера: белок с молекулярным весом 120 кДа в области промотора 375 и экхансера, белок с молекулярным весом 30 кДа в области 375 промотора, белок с молекулярным весом 40 кДа в области инициации репликации. Сопоставление данных с литературой позволило предварительно идентифицировать некоторые белки: 120 кДа .- ЛЕВ1, 30 кДа - ТРИ Б. Соответствие результатов, полученных методом УФ-сшивок данным о белковой организации нетранскрибируемого спейсера рибосомальных геноц дрожжей,

демонстрирует адекватность разработанной методики.

"Ч

Апробация работа:

Материалы диссертации докладывались . на 10-м российско-германском симпозиуме "Структура и

функционирование генома" (Суздаль, 1993), а также на на конференции "Молекулярная биология на рубеже XXI зека." посвященной столетию со дня рождения В.А.Энгельгардта (Москва, 1994)

Публикации:

По материалам диссертации опубликованы четыре печатные работы. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Структура работа:

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов, и списка цитированной литературы. Работа изложола на 90 страницах каашнописного текста, содержит 10 рисунков и 5 таблиц.

/

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Характеристика метода УФ-индуцированных сшивок ДНК-белок на ядрах.дрожжей.

Для решения поставленной задачи был использован экспериментальный подход применявшийся для исследования ДНК-белксвых взаимодействий in vitro и in vivo . Данный метод основан на комбинации двумерного электрофореза свштых комплексов (Shick et al., 1980) и последующей гибридизации перенесенной на фильтр ДНК с мечеными пробаии ("гибридизация с белковыми тенями") (Karpov et al., 1986, Nacheva et all., 1989). Важное преимущество такой схемы заключается в потенциальной возможности детектировать широкий спектр комплексов ДНК-белковых комплексов в одной эксперименте. В .-данном контексте "гибридизация с белковыми тенями" позволяет отвечать на следующие вопросы: Связывается ли конкретный белок с функциональной последовательностью (промотором, знхансером и т.п.) изучаемого гена в его активном или неактивном состоянии (Karpov et all., 1984)? Существуют ли какие-либо еще негистоновые белки, связывающиеся с этой последовательностью in vivo? Каков их приблизительный молекулярный Bec„(Belikov et all., 1993 а)? И в некоторых' случаях: в каких сайтах последовательности локализованы ДНК-белковые контакты(Ве1ikov ét all., 1993 Ь)?

/

Ч

КЛЕТКИ

V

ЯДРА

V "ч УФ-ОБЛУЧЕНИЕ

V

ЛИЗИС ЯДЕР В ГУАНИДИН-ГИДРОХЛОРИДЕ

V

РАВНОВЕСНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

V

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ, ДИАЛИЗ

V

ФРАГНЕНТИРОВАНИЕ ДНК

V

' ЭКСТРАКЦИЯ КОМПЛЕКСОВ ФЕНОЛОМ

V

2-М ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

V

ЭЛЕКТРОПЕРЕНОС ДНК НА МЕМБРАНУ

V

ГИБРИДИЗАЦИЯ, ОТНЫВКА

V .

РАДИОАВТОГРАФИЯ

Рис. 1 Схема эксперимента.

На рис 1 приведена^схема эксперимента: выделенные ядра дрожжей подвергали облучению ультрафиолетом, а затем лизировали "в гуанидин-гидрохлориде. От белков и РНК освобождались равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия, сшитые комплексы экстрагировали фенолом из ДНК-содержащей фракции. Обогащенные ДНК-белковые комплексы разделяли двумерным электрофорезом, перенесенную на фильтр ДНК гибридизовали со специфическими пробами.

Изначальная схема (Belikov et all 1993b) предполагала УФ-сшивки на живых клетках, однако некоторые особенности дрожжевой клетки не позволили нам проводить сшивку in vivo. Так, наличие плотной клеточной стенки (хотя и не содержащей хромофоров, поглощающих при рабочей длинне волны) требует продолжительной ферментативной обработки уже облученных клеток, что может привести к активации внутриклеточных деструктивных изменений и возникновению артефактов. Обилие внутриклеточного поглощающего вещества (РНК и белки цитоплазмы) и высокое рассеивание УФ клетками также создает значительные технические трудности даже при облучении уже сферопластированных клеток, и хотя подобные опыты были поставлены, они не привели к успеху. Выделенные и очищенные ядра позволили обойти многие трудности, в частности, стало возможным, более точно определить рабочий диапазон доз и оценить степень деградации белков и ДНК под действием ультрафиолета. И хотя ядра', нельзя в полной мере рассматривать как систему ¡л vivo, однако существует значительное *шсло вполне достоверных работ, посвященных

исследованиям ДНК-белковых взаимодействий iл vivo именно на ядрах дрожжей (Fisher et all., 1993, Giniger et all., 1985, Yan et all., 1993).

При подборе оптимальной дозы облучения руководствовалась оличественным выходом сшитых комплексов и' фотодеградацией ДНК и белков (в данном случае мы имеем в виду более широкий круг поцессов чем просто разрыв фосфодиэфирных и пептидных связей). В нашем случае, при использовании ртутных ламп низкого давления спектр нельзя было считать достаточно чистым, что наложило дополнительные ограничения. На рис 2 представлена фотодеградация белков ядерной фракции после облучения различными дозами УФ. Видно, что при дозах превышающих 250 мДж/см значительно нарастает размывание пиков, соответствующих различным белкам, причем деградация крупных белков преобладает, в то время как гистоны, например, выдерживают'более высокие дозы."Этот факт можно объяснить как с точки зрения различного аминокислотного состава для разных белков так и статистически: вероятность повреждения более длинного полипептида вьше при прочих равных. Другой важный контроль дозы (рис 3) облучения отражает зависимость количественного выхода сшитых комплексов. Так, интенсивность диагонали,

соответствующей высокомолекулярному белку (REB1, см ниже)

- 2 максимальна при дозах 250-500 мДж/см , при дальнейшем

увеличении дозы диагональ размывается, наряду с появлением

высокого не специфического фона.- Следует та^же подчеркнуть,

что фотоде градация белхзв и ДНК-белкосых комплексов

2 aAvv/WIA^xw^—^

4 jv/WwAi

0.0 J/cm2 0.06 J/cm 2 0.12 I/cm2

0Л5 J/cm2 0j I/cm2 1.0 J/cm2 2.0 J/cm2 4.0 J/cm 2

Mw (кДа)

Рис. 2 Фотодеградация белков ядерной фракции при облучении У.Ф. Представлены данные сканирования геля, окрашенного кумасси R-250. Ядра выделяли и облучала как описано в разделе "Материалы и методы", разделение белков в ПААГ проводили стандартно (Ausubel et all., 1989). 1 -необлученные ядра, 2-8 - облучение возрастающими дозами ( справа). \

0.25 Л/сш2 0.5 Л/сш2

1 2 3 1 2 3

1.0 1/ст

2.0 Л/ст

1 2 3 2 3

*

Рис. 3 Зависимость количественного выхода ДНК-белковых комплексов от дозы облучения. Сшитые УФ на ядрах комплексы были выделены и подвергнуты двумерному разделению, как описано в раделе 'Материалы и методы". Перенесенную на фильтр ДНК гибридизовали с.промоторным участком рРНК генов 1 - диагональ, соответствующая 11Е&1, 2 - ТВР (см ниве), 3 -несшитая'ДНК. Вверху указаны дозы облучения.

(фотообратимые сшивки) является главной причиной ограничения

верхней границы дозы: в наших опытах мы не наблюдали

2

заметных изменений ' в ДНК даже при 2 мДж/см , что соответствует данным литературы (Hockensmith et all., 1991).

РНК, неспитые белки и липиды удаляли ультрацентрифугированием в градиенте хлористого цезия. Для полной диссоциации несшитых белков от ДНК, ядерный лизат наслаивали на градиент в растворе. гуанидингидрохлорида (MacLeod et all., 1979). Как показали модельные опыты ДНК-белковые комплексы имеют тенденцию "всплывать" поверх ДНК, что ведет к загрязнению их несшитыми белками и затрудняет фракционирование. Поэтому в дальнейшем, вместо статистического расщепления ДНК ультразвуком перед нанесением лизата на градиент использовали лишь мягкое механическое дробление. В • составе высокомолекулярных комплексов (более 10 т.п.о.) ДНК вносит значительный вклад в плавучую плотность, что позволяет собирать ДНК-белковые комплексы в составе фракций, содержащих несшитую ДНК. Недостаток такого разделения состоит в некоторой агрегации высокомолекулярной ДНК в градиенте, что можно преодолеть используя низкие концентрации фракционируемого материала.

. Для удаления несшитой ДНК бьии опробованы различные способы, но наибольшая, чистота материала с наименьшими потерями была достигнута при экстракции комплексов фенолом (Karpov et all., 1984).

Контроль при подборе оптимальных условий выделения и очистки осуществлялся напрямую и косвенно: наличие УФ-сшитых

комплексов определяли после каждой стадии, либо в состав ядерного лизата вводили радиоактивно меченые (по белку, либо по ДНК) модельные комплексы и в дальнейшем детектировали их.

2 ДНК - связывающие белки нетранскрибируемого спейсера рибосомальных генов дрожжей.

Около 140 копий рРНК генов дрожжей организованы в единственный тандем. Каждый ген содержит последовательности, кодирующие 37S рРНК предшественник и 5S рРНК. 35S рРНК впоследствии процессируется с образованием 18S 28S и 5.8S рРНК. В отличие от других организмов, между рибосомальными генами дрожжей, на текущий момент, не обнаружено структурных и функциональных различий, хотя некоторые группы интенсивно исссаедуют этот вопрос. Наибольший интерес представляет нетранскрибируемый 'спеисер, расположенный между соседними повторами (рис 4, верх). В его составе обнаружены следующие функциональные элементы: 35 S промотор (РНК-полимераза 1), который иногода рассматривают как сложную структуру, выделяя UAS (участок активации транскрипции), область инициации репликации, энхансер, распроложенный в области терминации 35S транскрипта ч активирующий транскрипцию со следующего 35 S промотора, промотор 5S рРНК (РНК-полимераза. III).

Согласно данным литературы (Mcrrow et all., 1993, Sollner-Webb et all., 1991, Reeder 1990, Scott et all., 1993, Kulkens et all., 1991), район старта (-35) 35 S

транскрипта служит местом специфического связывания общих белзов инициаторного комплекса, наиболее изученный из которых TFID (TF1ID, SL1), состоит из сложного набора субъединиц. TATA" связывающая субъединицица TFID (ТВР) непосредственно, контактирует с ДНК, ее аминокислотная последовательность известна и соответствует полипептиду с молекулярной массой около 30 кДа. В районе Sma! сайта рестрикции (-210) имеется консенсусная последовательность для связывания специфического активатора транскрипции -белка REB1(GRF2). Опытами in vitro (Chasman et all., 1990) было установлено, что REB1 имеет высокую константу связывания с .данной последовательностью, iл vivo эксперименты (Bultin et all., 1991) позволили установить, что такое связывание действительно имеет место. Ген данного белка был клонирован и его аминокислотная последовательность определена- (Quida et all 1991). Хотя большинство авторов рассматривают этот белок как слабый активатор, вопрос о его роли в активации транскрипции к настоящему моменту до конца не выяснен.

Область начала репликации у дрожжей хорошо изучена на примере ARS1 (Marahrens et all., 1992 Miller et all., 1993) и некоторых других. Найдены консенсусные последовательности для связывания ряда белков, наиболее известными из которых являются ABF1 (Rhode et all., 1992) и АСВР (Hoffman et all., 1991), есть также указания на участие в инициации репликации белков семейства МСМ и другие (Shade at ail., 1992). Для белка ABF1 в рибосомальном ARS ( около -500 от старта 35S )

не обнаружено консенсусной последовательности связывания.В отличие от ABF1, консенсусная последовательность связывания АСВР, расположенная в районе исследуемого ARS имеет высокую аффинность, Семейство МСМ представляет собой набор сходных белков,. первоначально идентифицированных как факторы транскрипции; в дальнейшем было, показано, что МСМ участвуют также в инициации репликации. .

И, наконец, третья область, представляющая интерес в данном исследовании, включает энхансер, усиливающий транскрипцию с промотора 35S рРНК гена и расположенный на 5' конце (*-2000 от 35S старта) нетранскрибируемого спейсера, в районе терминации предыдущего 35S транскрипта. Наиболее отчетливо показано связывание в энхансере вышеупомянутого белка REB1 (Morrow et all., 1993), хотя имеются данные и о связывании в этой области ABF1 (Bult in et all., 1991). Эти белки, по предположению авторов, участвуют в процессе реутилизации РНК-полимёразы из" точки терминации на 37S промотор посредством "выпетливания" ДНК нетранскрибируемого спейсера (Kulkens et all., 1992).

3 Идентификация белков, сшитых с различными участками рибосомального спейсера.

Ряд последовательных гибридизаций с различными участками нетранскрибируемого спейсера, выявил специфический набор диагоналей в каждом случае (рис 4). С целью установить приблизительный молекулярный вес белков, соответствующих

Рис. 4 Последовательная серия гибридизаций с различными участками нетранскрибируемого спейсера (внизу). Вверху представлена физическая карта, с указанием использованных гибридизационных проб. А- энхансер,.В - область начала репликации, С - район 375 промотора. 1 - белок с М* около 120 кДа, 2 - белок с около 40кДа, 3 - белок с Мт около ЗОкДа, 4 - диагональ несшитой ДНК

Таблица 1:

Найденные значения 11Г диагоналей для различных белков.. В скобках дан кажущийся ИЫ для белков с аномальной подвижностью.

лизощш Н5 цыпл. РНК-полиыераза Е.соИ

Белок а-субъед. сг-субьед. -субъед

М» (кДа) .14,3 23( 35 ) 40,0 85(70) 155, 160

0.81 0.66 0.60 0.43 С.2

Таблица 2:

Рассчитанный молекулярный вес для белков, соответствующих диагоналям. .

Диагональ N 3 2 1

М. 0.63 0.56 0.27

М»(кДа) 32±5 40±8 Л20+20

диагоналям, был проведен калибровочный эксперимент: белки с известной молекулярной массой были сшиты in vitro при помощи диметилсульфата, и подвергнуты двумерному электрофорезу. В таблице 1 приведены ■ точные данные калибровочного эксперимента. Используя полученную • зависимость были рассчитаны приблизительные молекулярные веса для обнаруженных методом свивки /л vivo белков (табл 2).

Гибридизация с область» промотора гена 37S рРНК отчетливо выявила по крайней мере две диагонали (рис 4 в). Погнашим оценкам, соответствующие белки, при электрофорезе в ПААГ-ДСН, двигаются как белки с мдлекулярной массой около 30 и 120 кДа. Белок,. соответствующий диагонали N1 близок REB1 по электрофоретической подвижности (Mw 11ЕВ1=95кДа, подвижность в ПААГ - 127кДа). и соответствует ему по месту локализации (промотор). Второй, обнаруженный методом УФ-сшивок в районе 37S рРНК промотора, белок (диагональ N3) имеет электрофоретическую подвижность около ЗОкДа, что близко к молекулярному весу ТВР. Диагональ, поставленную нами в соответствие REB1 можно также наблюдать при гибридизации с участком энхансера (рис 4 а), что служит дополнительным аргументом в пользу такого предположения.

Гибридизация с областью начала репликации (рис 4 б) выявила другой набор сшитых белков: вместо исчезнувши диагоналей белков 120 и 32кДа можно наблюдать диагональ, соответствующую белку с э/ф подвижность® около 40кДа (диагональ N2). Однако, а! этом случае нам. не удалось получить хорошего согласования с имеющимися данными: все

вышеперечисленные белки, связывающиеся с районом инициации транскрипции имеют значительно отличающийся от наших данных молекулярный вес. Возможно, обнаруженный полипептид соответствует специфическому продукту деградации (например для МСМЗ описан продукт деградации с э/ф подвижностью около 35 кДа), либо неизвестному ранее белку.

4 Область применения•УФ-сшивок и перспективы.

Как видно из полученных результатов, метод УФ-сшивок, в применении к S. cerevisiae, позволяет детектировать негистоновые белки, связывающиеся с различными последовательностями ДНК и приблизительно определять их молекулярный вес. Однако следует отметить наличие ограничений, накладываемых как использованием ультрафиолета, так и описанного методического подхода.

Круг задач, -решаемых при помощи метода ■ УФ-сшивок- можно значительно расширить, используя различные способы детектирования и изучения сшитых комплексов. На наш взгляд, один из наиболее перспективных методов состоит в аффинном обогащении сшитых комплексов по специфическим последовательностям ДНК (Shouten 1985), либо по определенным белкам с использованием антител (Lis et all., 1993) и последующего изучения таких специфических комплексов. Преимущество первого метода состоит з потенциальной возможности, не только надежно идентифицировать известные белки, но и изучать ранее неизвестные.

выводы

1 Для изучения негистоновых ДНК-связывающих белков дрожжей был применен метод ультрафиолет - индуцированных сшивок ДНК-белок на изолированных ядрах в комбинации с методом "гибридизации с белковыми тенями". Был найден рабочий диапазон доз ультрафиолетового облучения, с учетом возможной фотодеструкции белков и ДНК, определена оптимальная стратегия выделения и обогащения УФ-сшитых комплексов из ядер дрожжей, подобраны конкретные экспериментальные условия.

2 На примере нетранскрибируемого спейсера рибосомальных генов дрожжей было показано связывание ряда негистоновых белков с различными функциональными участками спейсера: промотором 37S рРНК предшественника, энхансером, активирующим транскрипцию ' с этого промотора и' областью" инициации репликации.

3 При помощи калибровочных экспериментов, удалось установить молекулярный вес обнаруженных белков: 120 кДа и 30 кДа в области промотора, 40 кДа в области инициации репликации, 120 кДа в районе энхансера. Сопоставление данных с литературой позволило идентифицировать некоторые белки: 120 кДа - REB1, 30 кДа - TFIID.

4 Детекирование ДНК-связывающих белков для рРНК генов дрожжей послужило основой для создания системы независимого контроля при картировании расположения ДНК-связывающих белков вдоль генома дрожжей, посредством метода УФ-сшивок.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1 Д.А.Папаценко, И.В.Припорова, А.В.Кукарин, 0.В.Преображенская, В.Л.Карпов, А.Д.Мирзабеков. Обнаружение негистоновых белков, связанных с регуляторными элементами генов рРНК дрожжей, методоми УФ-сшивок на интактных ядрах. Молекулярная биология, 1994, 28 (6), 1376-1382.

2 D.A. Papatsenko, S.V. Belikov, O.V. Preobrazhenskaya and V.L. Karpov, Two-dimension gels and hybridizaton for studying DNA-protein contacts by crosslinking Meth. Mol. Cell. Biol. 1995 ^ ^{.sS;

3 Karpov V.L., Belikov S.V1, Preobrazhenskaya O.V., Belgovsky A.I., Papatsenko D.A., Partolina M.P., Chkheidze A.R., Priporova I.V., Mirzabekov A.D. Mapping and positioning - DNA-binding proteins- -along- genomic ШАг Abstracts of 10-th Russian-Germac symposium, Suzdal, 1993.

4 Преображенская O.B., Папаценко I.А., Припорова И.В., Беликов С.В., Бельговский А.И., Партолина М.П., Карпов В.Л., Мирзабеков А.Д. Картирование ДНК - белковых взаимодействий в геноме эукариот. Тезисы конференции посвященной столетию со дна рождения В.А.Энгельгардта "Молекулярная биология на рубеже XXI века.", Москва, 1994.