Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Циркулирующие внеклеточные нуклеиновые кислоты в крови здоровых доноров и онкологических больных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Циркулирующие внеклеточные нуклеиновые кислоты в крови здоровых доноров и онкологических больных"

На правах рукописи

ТАМКОВИЧ СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ В КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

03.00.04 биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени*^^^^^

кандидата биологических наук

Новосибирск, 2005 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.б.н. Лактионов Павел Петрович

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Чердынцева Надежда Викторовна к.б.н. Синицына Ольга Ивановна

Ведущая организация: Институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится « 2р » ф^-О^-Л-'-Ях 2006 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии л фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан « 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.х.н. Фёдорова О.С. лУ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы было установлено, что вне клеток, и прежде всего в плазме крови животных и человека в норме и при патологиях, присутствуют эндогенные внеклеточные дезокси- и рибонуклеиновые кислоты. Поскольку в составе циркулирующих нуклеиновых кислот крови онкологических больных вне зависимости от локализации опухоли присутствуют онкоспецифические последовательности, а в крови беременных циркулируют нуклеиновые кислоты плода, внеклеточные нуклеиновые кислоты находят применение в качестве неинвазивного материала для медицинской диагностики.

Биологическая роль циркулирующих нуклеиновых кислот в настоящее время не ясна, однако исследование процессов, обеспечивающих появление и циркуляцию внеклеточных нуклеиновых кисаот в крови, и изучение биологических эффектов, вызываемых внеклеточными нуклеиновыми кислотами, позволит получить новые данные о биологической значимости феномена циркулирующих нуклеиновых кислот и механизмах патогенеза рака и аутоиммунных заболеваний.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась: 1). Разработка количественных методов анализа внеклеточных нуклеиновых кислот; 2). Исследование особенностей циркуляции дезоксирибонуклеиновых и рибонуклеиновых кислот в крови здоровых доноров и онкологических больных; 3). Исследование факторов, влияющих на циркуляцию в крови внеклеточных нуклеиновых кислот.

Научная новизна и практическая ценность работы. Для

исследования концентраций циркулирующих нуклеиновых кислот крови разработан эффективный метод выделения нуклеиновых кислот из биологических жидкостей при помощи сорбции нуклеиновых кислот на модифицированном мелкодисперсном стекле, пригодный для определения концентрации выделенных нуклеиновых кислот при помощи флуоресцентных красителей - Hoechst 32258 и SYBR Green П.

Впервые показано, что в крови здоровых доноров основную часть внеклеточных нуклеиновых кислот составляют нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью форменных элементов крови. При помощи флуоресцентного анализа установлено, что в крови больных злокачественными опухолями молочной железы отсутствуют

циркулирующие нуклеиновые кис.

£вязаыные_.с поверхностью

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ i

БИБЛИОТЕКА { ]

форменных элементов крови, а концентрация внеклеточной ДНК в плазме достоверно отличается от таковой у здоровых доноров. В крови больных с доброкачественными опухолями молочной железы концентрация связанных с поверхностью клеток крови нуклеиновых кислот не отличается от таковой у здоровых доноров. Для определения ирогеазной и дезоксирибонуклеазной активности крови разработаны два иммуноферментных анализа. С их помощью было впервые показано, чго увеличение протеазной активности в крови сопровождаем уменьшением концентрации нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью форменных элементов крови, а уменьшение дезоксирибонуклеазной активности крови приводит к увеличению концентрации циркулирующих дезоксирибонуклеиновых кислот в пла*ме крови. Таким образом, протеазная и дезоксирибонуклеазпая активность крови влияют на концентрацию и распределение циркулирующих нуклеиновых кислот в кровотоке.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации получено 4 Российских naieirra, опубликовано 7 cía-гей и 30 тезисов. Результаты работы были представлены на конференциях "Radioisotopes and their applications" (Узбекистан, 2002), "Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids" и "Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии" (Россия, 2003), ''Circulating nucleic acids in plasma and serum and serum proteomics" (США, 2003), "29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies" (Польша, 2004), ''Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии" (Россия, 2004), "Петровские чтения - 2005", "Ь>ио1ехноло1ия и онкология", "Новые технологии в онкологической практике", "The international conference on chemical biology" и "Фундаментальные науки - медицине" (Россия, 2005), International summer school for postdoctoral scientists and advanced students '"Chemistry meets Biology" (Греция, 2005), 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference (Болгария, 2005), "Circulating nucleic acids in plasma and serum and serum proteomics" (Ашлия, 2005).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изтожения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 156 станицах, содержит 15 рисунков и 13 таблиц. Библиография включает 240 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка метода выделения внеклеточных нуклеиновых кислот

Наиболее перспективными методами определения концентраций внеклеточных нуклеиновых кислот являются флуоресцентные методы, основанные на использовании флуоресцентных красителей, специфичных для ДНК или РНК. Для определения концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот флуоресцентным методом были оттестированы различные методы выделения нуклеиновых кислот.

Поскольку по данным ряда авторов циркулирующая ДНК плазмы крови может быть фрагментирована, эффективность выделения ДНК оценивали по введенной в образец плазмы крови радиоактивно меченой ДНК (200 - 500 п.н.). Эффективность удаления примесей, влияющих на флуоресценцию образца, оценивали по флуоресценции образцов выделенных ДНК с интеркалирующим красителем Hoechst 33258 (табл.

V-

Таблица I. Выделение экзогенной 32Р-меченой ДНК

% выделенной ДНК/усл.ед. флуоресценции Hocchst Способ пробоподготовки

добавленная ДНК, мкг/мл

1 5 50

40±Л/ 76 41+7/ 86 50±13/ 90 выделение ДНК из плазмы фенольным методом

87+4/ 115 83 ±3/ 120 82+4/ 118 метод выделения ДНК после осаждения комплексов белков с SDS (1)

76±4/ 78 74+5/ 81 74±4/ 80 (1), с последующей обработкой 4М КСЮ4

77±8/ 104 82±6/ 109 77±6/ 111 (П, с последующей обработкой смесью хлороформ:изоамиловый спирт

70±5/ 75 77±4/ 385 78+4/ 3908 выделение ДНК из плазмы сорбцией на мелкодисперсном стекле (Sigma, S-5631)

96±3/ 100 96±2/ 500 98±2/ ! выделение ДКК из плазмы сорбцией 5019 1 на модифицированном стекле

В таблице для % выделенной ДНК указан доверительный интервал для Р < 0,05.

Наиболее оптиматьным был метод выделения ДНК из плазмы крови сорбцией на стеклянные частицы (Sigma, S-5631). Для увеличения выхода ДНК на основе метода сорбции на мелкодисперсном стекле был разработан и зама гентован метод выделения нуклеиновых кислот на модифицированном мелкодисперсном стекле, позволяющий увеличить эффективность выделения ДНК из плазмы крови и довести ее до 9698 % (табл. 1).

При сравнении эффективности выделения РНК из мембранно-цптозольной фракции эукариогических клеток разработанным методом и методом выделения РНК экстракцией белков смесью фенол хлороформ, с последующим спиртовым переосаждением (1), меюдом гомогенной экстракции фенол гуанидиновой смесью (2), показано, что выделение РНК сорбцией на модифицированном стекле (3) также является оптимальным (табл. 2).

Для определения концентрации внеклеточной ДНК был использован флуоресцентный краситель Hoechst 31258. Калибровочная кривая флуоресценции комптексов этого красителя с ДНК была линейна в диапазоне 10-1000 нг/мл. Чувствительность флуоресцентного анализа составила Юнг/мл, достоверность - 95 %, коэффициент вариации -менее 5 %. Концентрацию внекиеточной РНК опредепяли в присутствии Д11К при помощи флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и SYBR Green II. Достоверность анализа РНК составила 90% в диапазоне концентраций нуклеиновых кислот от 10 до 1000 нг/мл, коэффициентом вариации составил 10 %.

Таблица 2. Сравнение различных методов выделения РНК

| _ [ Эффективность выделения

'§ § i S 5" ! Эн Р* о « 1 « | 1 32Р-меченая тРНК и I1 02 U ! (100 н.), % л 1 J 1 05' 3 1 РНК, выделенная из 106 клеток линии А431, (мкг)

1 | 2 25 1 26

2 2.5 | 7 13

3 1 0.3 ! 86 32

Внеклеточные нуклеиновые кислоты в плазме и связанные с поверхностью клеток крови здоровых доноров

Ранее было показано, что в присутствии двухвалентных катионов металлов ДНК может эффективно связываться с поверхностью липосом и клеточных мембран. Кроме того, известно, что на цитоплазматических мембранах форменных элементов крови экспонированы белки, связывающие нуклеиновые кислоты.

Для элюции внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью форменных элементов крови через ионные мостики, клетки крови отмывали 0.01 М фосфатным буфером, 0.15 М ЫаС1, (рН 7.5), содержащим 5 мМ ЭДТА (ФБ-ЭДТА элюат). Для отделения нуклеопротеиновых комплексов ог клеточной поверхности клетки обрабатывали 0.125 % раствором трипсина в условиях, не приводящих к лизису клегок (трипсиновый элюаг).

Образцы крови здоровых доноров были получены из Центральной Клинической Больницы Советского района г. Новосибирска и 333 Оба(евойскового Военного Госпиталя Концентрацию внеклеточных нуклеиновых кислот в образцах крови определяли в двух независимых экспериментах, используя для выделения нуклеиновых кислот в каждом эксперименте по 1 мл плазмы, 2 мл ФБ-ЭДТА элюата и 0.5 мл грипсинового элюата. Половину выделенных внеклеточных нуклеиновых кислот использовали для определения концентрации ДНК, половину - для определения концентрации РНК. Поскольку в образцах крови было различное соотношение плазмы и форменных элементов крови, для унификации данных концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот пересчитаны на 1 мл исходной крови. С учетом объемов плазмы и элюагов, минимальный уровень детекции внеклеточных нуклеиновых кислот в крови составлял для плазмы 8 нг/мл крови, для ФБ-ЭДТА элюата 40 нг/мл крови и 20 нг/мл крови для трипсинового элюата.

Концентрация внеклеточной ДНК в плазме здоровых доноров детектировалась в 70 % образцов, составляя у мужчин 16 ± 7 нг/мл крови, а у женщин 15 ±13 нг/мл крови (для Р = 0.95, табл. 3). Внеклеточная РНК в плазме была обнаружена в трети образцов и составила 36 нг/мл крови у женщин и 126 нг/мл крови у мужчин {табл. 4). Несмотря на то, что в некоторых образцах нуклеиновые кислоты по данным флуоресцентного анализа не обнаруживались, методом ПЦР анализа наличие ДНК и РНК было подтверждено во всех образцах.

Таблица 3. Циркулирующие ДНК н крови здоровых доноров и больных с опухолями молочной желеш*

ди:п ноз

Внеклс ючная

днк*

в плазме

Норма

М

Ж

167 -1 1! (73%)"

15Е13' 14 (70й о)"

Фиброаденома I 204(16-765)" ' молочной | 19 (86%)"

Связанные с поверхностью клеток внеклеточные ДНК _.Суммарные сви шниые

внеклсючныс ДНК крови

ФБ-ОДТА мша!

Эритроциты

железы

Рак молочном железы

259 (10-1296)° 31 (94%)"

248 (70-780 Г 8 (53%)"

57 (40-100)° 13 (65%)"

349 (51-902)" 9(41%)"

Лсикошп м

83(40-120)° 3 (9%)"

682 (70-2030)° 10 (67%)"

88 (40-320)° 11 (55%)"

166 (40-470)° И (50%)"

Трниешювый »лют

Эри гродигы

0 (0%)"

92 (20-460)5 15(100%)"

296 (30-870)° 17 (85%У

289 (20-622)й 10(45%)"

0(0%)"

Лейкоциты [

246(50-1890/ 14(95%)"

88 (20-320)1 57 (85%)"

163 (20-952)" 17(77%)"

79(20-138/' | 2 (6%)" |

1030 (210-2250)° 15 (100%)"

430 (80-900)° 21) (100%)"

328 (20-1470)" 18(82%)"

82 (20-138)" 5 (15%)"

* Копнет рация цирк) .ирукндей ДНК рреди явлена ма щ/чл крови "Довершсльний ингорлан для Р'- 0.05 Ч'реднее шаченис (диапазон) ш 'мл "Встречаемость

Таблица 4. Циркулирующие РНК в крови здоровых доноров и больных с опухолями молочной желет *

Внеклеточная Св>чанные с поверхностью клеток внекпеточные РНК* Суммарные связанные

диагноз РНК* ФБ-ОДТА элюат Трипсшгавыи элюат внеклеючиые РНК

в плазме Оршроцигы Лейкоциш Эритроциты Лейкоциты крови

Норма М 126(120-140)а 5 (33%)6 186 (40-380)а 12 (80%)* 422(100-1340)" 9 (60%)" 169(20-810)' 12(80%)° 227 (50-990)" 13 (87%/ 770 (90-2280)" 15 (100%/

Ж 36(14-60)" 7 (35%)° 97 (40-220)" 1 (35%/ 81 (40 140)" 10 (50%/ 57 (20-90)' 3 (15%/ 48 (20-100)" 4 (20%)° 100 (30-440)' 11 (45%/

Фиброаденома молочной железы 34(15-45)" 3 <27%/ 130а 1 (9%/ 70 (50-90)" 2(18%/ 22(10-30)'" 3 (27%)" 46 (20-80)" 5 (45%)" 81 (30-220)" 7 (64%/

Рак молочной желе ;ы 1 121 (30-290)" 5 (25%/' О1 0 (0%/ 0' 0 (0%/ 0' 0 (0%/ 140" 1 (5%)° 140' 1 (5%/

* Концентрации циркулирующей РНК нреде!авлена на ш-ии кринн ' Сроднее значение (диашпон) нг/мл '' Встречаемость

Было обнаружено, что в крови здоровых доноров основная часть (более 90 %) внеклеточных нуклеиновых кислот связана с поверхностью форменных элементов крови {табл. 3,4). При этом даже если в плазме внеклеточные нуклеиновые кислоты не были выявлены, значительное количество нуклеиновых кислот было обнаружено на поверхности клеток крови.

В целом, общая концентрация связанных с поверхностью клеток нуклеиновых кислот была значительно выше у мужчин. Суммарная концентрация связанных дезокси- и рибонуклеиновых кислот в крови у мужчин составляла в среднем 1800 нг/мл, а у женщин 530 нг/мл крови. Средняя концентрация ДНК, связанной с клетками крови мужчин (1030 нг/мл) примерно 2.5 раза выше, чем у женщин (430 нг/мл) (табл. 3), а концентрация внеклеточной связанной РНК достоверно отличается о г концентрации РНК связанной с поверхностью клеток крови у здоровых женщин (770 и 100 нг/мл соответственно, Р< 0.001 при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни) (табл. 4).

Исходя из представленных данных о корреляции концентрации циркулирующих нуклеиновых кислот на поверхности клеток с полом, становится ясно, что при исследовании уровня внеклеточных нуклеиновых кислот при различных патологиях необходимо учитывать пол пациента.

Особенности циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот у больных с доброкачественными и злокачественными опухолями молочной железы

Для исследования особенностей циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот в крови онкологических больных был выбраны опухоли молочной железы, поскольку рак молочной железы занимает первое место среди всех онкологических заболеваний женщин.

Были исслечованы образцы крови первично обратившихся больных Маммологического отделения Новосибирского областного онкологического диспансера со злокачественными и доброкачественными (фиброаденома) опухолями молочной железы. У больных с фиброаденомой молочной железы распределение связанных с поверхностью клеток крови внеклеточных нуклеиновых кислот аналогично здоровым донорам {табл. 3,4). Концентрация внеклеточной ДНК в плазме крови превышает норму у 82 % больных, и в среднем составляет 204 нг/мл крови, достоверно отличаясь от концентрации ДНК в плазме здоровых доноров (Р < 0.01 при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни) {табл. 3). Внеклеточная РНК в

плазме крови была обнаружена в плазме крояи 3-х пациентов из 11 (27 %) в средней концентрации 34 нг/мл крови (табл. 4).

У 85 % больных раком молочной железы концентрация внеклеточной ДНК в плазме по сравнению с нормой является достоверно повышенной (Р < 0 001 при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни) и в среднем не превышает 259 нг/мл крови (табл. 3). Встречаемость и концентрации внеклеточной РНК в плазме крови раковых больных близки к здоровым донорам: у 25 % больных раком груди обнаружена внеклеточная РНК (табл. 4). Также как и в более ранних исследованиях нами не было выявлено зависимости в концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы от тяжести заболевания (коэффициент корреляции < 0).

* В крови больных раком молочной железы внеклеточные нуклеиновые

кислоты, связанные с поверхностью форменных элементов крови,

4 обнаружены лишь в 20 % образцов, причем в небольших концентрациях

(табл. 3,4).

Таким образом, при раке молочной железы значительно изменяется соотношение между циркулирующими нуклеиновыми кислотами в плазме крови и внеклеточными нуклеиновыми кислотами, связанными с клеточной поверхностью форменных элементов крови. Отсутствие внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью клеточных элементов крови у больных уже на ранних стадиях развития опухоли позволяет надеяться на разработку ранней скрининговой диагностики рака молочной железы, основанной на измерении соотношения свободно циркулирующих и связанных с поверхностью форменных элементов крови внеклеточных нуклеиновых кислот крови. Очевидно, что для точной онкодиагноетики необходим анализ онкоспецифических последовательное гей ДИК, включающий анализ метилирования генов онкогенеза, анализ онкоспецифических мутаций в протоонкогенах или исследование микросателлигной ДНК.

л Обнаружение значительного количества связанных с поверхностью

форменных элементов крови циркулирующих нуклеиновых кислот позволяет использовать их в качестве исходного материала для выявления онкоспецифических последовательностей в нуле циркулирующих нуклеиновых кислот.

Исследование факторов, влияющих на длительность циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот

Деюксириболуклеазная активность и циркулирующая ДНК крови Для оценки уровня дезокс и р ибо ну к л еаз ной активности крови нами был разработан анализ, основанный на гидролизе ДНК фрагмента длиной 974 п.н„ модифицированного остатками флуоресцеина и биотина, для введения которых были использованы модифицированные по 5-ому положению одного из тимидинов биотинином (прямой) и флуоресцеином (обратный) праймеры, используемые для получения ПЦР фрагмента гена 18 Я рибосомальной РНК (рис. /). Было показано, что остаток биотина в полученном ампликоне эффективно связывается с авидином, сорбированным на 96-луночные иммунологические планшеты, а антитела против флуоресцеина связываются с остатком фл>оресцеина в составе ДНК. Для построения капибровочной кривой фрагменты ДНК инкубировали с авидином, заранее сорбированным на планшет, и затем добавляли разведения ДНКазы 1 (1000 ед. акт/мл) от 10"2 до Ю"5. Негидролизованные фрагменты ДНК выявляли при помощи

специфических антител против флуоресцеина с иммунопероксидазной детекцией иммунных комплексов.

последующей

Рис. 1. Схема иммунофермептного анашза

для определения дезоксирибонуклеазной активности крови

Ыуклеазный гидролиз

Чувствительность иммуноаналитической системы составляет 0.004 ед.акт. ДНКазы 1/мл образца. Воспроизводимость метода составила не менее 95 %. Рабочий диапазон иммуноаналитической

системы находился в пределах от 0.2 до 2.3 опт.ед. Коэффициент вариации в каждой точке составил менее 4 % (рис.2).

Было показано, что в плазме крови здоровых женщин ДНКазная активность составляет 0,13 ±0,13 ед. акт/мл, а у мужчин -0,15 ± 0,14 ед. акт/мл крови.

В крови больных раком молочной железы на фоне повышенной концентрации ДНК в плазме наблюдается достоверное понижение активности дезоксирибонуклеаз в крови по сравнению со щоровыми донорами (Р < 0.05). Влияние дезоксирибонуклеазой активности плазмы крови на концентрацию внеклеточной ДНК оценивали при помощи определения коэффициента корреляционного отношения, который составил 0,68 ± 0,62 при Р < 0,05, что демонстрирует зависимость концентрации циркулирующей ДНК от активности дезоксирибонуклеаз крови.

0,004 ед.акт/мл 95 % 4%

Рис. 2. Калибровочная кривая для определения дезоксирибонутеаяюй активности методом иммуноферментного анализа

Протеазная активность и циркулирующая ДНК крови Для оценки уровня активности протеаз крови нами был разработан анализ, основанный на использовании отличающихся по гидрофильное™ биотинилированных пептидов из структуры мембранного белка человека рецептора С034 и антител против этих пептидов. Было показано, введенный в пептиды остаток биотина эффективно связывается с авидином и пептиды доступны для протеаз и связывания с антителами (рис. 5).

Чувстви гельность Воспроизводимость Коэффициент вариации

0,1 0,01 0,001 единицы активности ДНКазы I

0,0001

Протеазную активность образцов плазмы крови и ФБ-ЭДТА '.штатов определяли по калибровочным кривым для различных разведений нрогеиназы К. Для построения калибровочной кривой пептиды инкубировали с авидином. заранее сорбированным на планшет, и затем добавтяли разведения протеиназы К (34 ед. акт./мл) от 10'2 до 10"8. Негидролизованные пептиды выявляли при помощи специфических антител против пептидов с последующей иммунопероксидазной детекцией иммунных комплексов {рис. 4).

Обработка протеазачи

&

/КАв

илк

'90

Рис. 3. Схема иммунофермептного анализа для определения протеазной активности в крови

единицы активности протеиназы К

Рис. 4. Калибровочные кривые для определения протеазной активности методом иммупоферментного анализа против пептидов СП34-1 и СВ34-2.

Чувствительность такого анализа составила 5*10"7ед. акт. протеиназы К. Рабочий диапазон иммуноаналитической системы находился в пределах от 0.3 до 2.3 опт.ед. Коэффициент вариации в каждой точке составил менее 6 %.

Исследование протеазпой активности крови с использованием в качестве субстрата гидрофильного пептида CD-34-1 не выявило достоверных отличий протеазной активности крови здоровых доноров от протеазной активности крови больных с опухолями молочной железы, апти-С034-1 протеазная активность не коррелировала с концентрацией внеклеточной ДНК в крови.

Влияние анти-С034-2 протеазной активности плазмы кроЕИ здоровых доноров на концентрацию внеклеточной ДНК оценивали при помощи определения коэффициента корреляционного отношения, который составил 0,54 ± 0,53 при Р < 0,05. У больных раком молочной железы обнаруживается достоверное повышение данной активности в крови по сравнению с больными доброкачественными опухолями молочной железы (Р < 0,05 при сравнении выборок по критерию Маина-Уитни). При сравнении анти-С034-2 протеазной активности в элюатах с поверхности клеток крови здоровых доноров и больных раком молочной железы было обнаружено увеличение протеолитической активности в крови на фоне уменьшения количества связанных с поверхностью форменных элементов крови циркулирующих нуклеиновых кислот. Таким образом, активность протеаз в крови влияет на перераспределение нуклеиновых кислот в крови при развитии патологии.

Выводы:

1. Разработан метод выделения внеклеточных нуклеиновых кислот при помощи сорбции нуклеиновых кислот на модифицированном мелкодисперсном стекле, пригодный для измерения их концентрации при помощи флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и SYBR Green И. Эффективность выделения ДНК из плазмы крови длиной 200-500 п.н. составляет не менее 96 %, эффективность выделения РНК длиной 96 н. составляет не менее 85 %.

2. При помощи комбинации методов - выделения нуклеиновых кислот

на модифицированном стекле и определения концентрации ДНК и РНК при помощи флуоресцентных красителей - исследовано распределение внеклеточных нуклеиновых кислот в крови

здоровых доноров. Показано, что основную часть внеклеточных нуклеиновых кислот крови составляют нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью форменных 'элементов.

3. Исследованы особенности циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот в крови больных с опухолями молочной железы. Показано, что по данным флуоресцентного анализа в крови больных зпокачественными опухолями молочной железы, отсутствуют циркулирующие нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью форменных элементов крови, а концентрация внеклеточной ДНК в плазме достоверно отличается от таковой у здоровых доноров. В крови больных с доброкачественными опухолями молочной железы концентрация связанных с поверхностью клеток крови нуклеиновых кислот не отличается от таковой у здоровых доноров. Полученные данные свидетельствуют о возможности ранней неинвазивной дифференциальной диагностики опухолей молочной железы, основанной на измерении концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот.

4. Разработана система иммуноферментного анализа, пригодная для изучения протеазной активности в крови. Показано, что при увеличении протеазной активности в крови уменьшается концентрация нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью форменных элементов крови. Таким образом, протеазная активность крови влияет на перераспределение внеклеточных нуклеиновых кислот.

5. Разработана система иммуноферментного анализа, пригодная для изучения дезоксирибонуклеазной активности в крови. Показано, что при уменьшении дезоксирибонуклеазной активности в крови увеличивается концентрация циркулирующих дезоксирибонуклеиновых кислот. Таким образом, дезоксирибонуклеазная активность влияет на концентрацию внеклеточной ДНК в крови.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах: Статьи:

1. P.P. Laktionov, S.N. Tamkoviсh, E.Yu. Rykova, O.E. Bryzgunova, A.V. Slarikov, N.P. Kuznetsova, V.V. Vlassov. Free and cell surface bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients. Ann. N. Y. Acad Sci. 2004, V. 1022, P. 221-227.

2. S.N. Tamkovich, P.P. Laktionov, E.Yu. Rykova, V.V. Vlassov. Simple and rapid procedure suitable for quantitative isolation of low and high molecular weight extracellular nucleic acids. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. "2004, V. 23, P. 873-877.

3. P.P. Laktionov, S.N. Tamkovich, E Yu. Rykova, O.E. Bryzgunova, A V. ' Starikov, N.P. Kuznetsova, S.V. Sumarokov, S.A. Kolomiets, N.V.

Sevostianova, V.V. Vlassov. Extracellular circulating nucleic acids in human plasma in health and disease. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004, V. 23, P. 879-883.

4. Тамкович С.П., Лактионов II.П., Рыкова Е.Ю., Стариков А.В., Скворцова Т.Э., Кузнецова Н.П., Пермякова В.И., Власов В.В. Уровень внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме крови здоровых доноров и больных с опухолями молочной железы. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005, Т. 139, С. 462-464.

5. S.N. Tamkovich. O.E. Bryzgunova, E.Yu. Rykova, V.I. Permyakova, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors. Clin. Chem. 2005, V. 51. P. 1317-1319.

6. Тамкович C.H., Лактионов П.П , Брызгунова О.Е., Стариков А.В., Рыкова Е.Ю., Кузнецова Н.П., Пермякова В.И., Власов В.В. Уровень внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью форменных элементов крови в диагностике рака молочной железы. Молекулярная медицина. 2005, Т. 2, С. 46-50.

7. Тамкович С.Н., Брызгунова О.Е., Рыкова ЕЮ.. Колесникова Е.В., Шелестюк П.И., Лактионов 11.11., Власов В.В. Циркулирующие нуклеиновые кислоты в крови больных раком желудка и толстой кишки Биомедицинская химия, 2005, Т. 51. С. 321-328.

«• Патенты:

1. Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислог. Патент на изобретение № 2232768.

2. Лактионов П.П., Тамкович С.Н.. Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ выделения рибонуклеиновых кислот. Патент на изобретение № 2232810.

3. Лактионов ГШ., Тамкович С.Н . Рыкова Е.Ю., Морозкин Е.С, Власов В.В. Способ ранней диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. Патент на изобретение № 2251696.

4. Лактионов П.П., Скворцова Т.Э., Тамкович С.Н., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ ранней диагностики заболеваний, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клетки. Патент на изобретение № 2249820.

Подписано к печати 28 декабря 2005г. Тираж 100 экз. Заказ № 1723. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Щ- -5 9b

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тамкович, Светлана Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот 9 крови

1.1.1. Методологические подходы к исследованию концентрации 9 циркулирующей ДНК в плазме крови в норме и при патологии

1.1.2. Форма циркуляции и особенности строения внеклеточных

• дезоксирибонуклеиновых кислот крови

1.1.3. Методологические подходы к исследованию концентрации 27 циркулирующей РНК в плазме крови в норме и при патологии

1.1.4. Форма циркуляции и особенности строения внеклеточных 30 рибонуклеиновых кислот крови

1.1.5. Факторы, влияющие на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови

1.1.5.1. Влияние нуклеаз на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови

1.1.5.2. Влияние протеаз на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови 36 щ 1.2. Механизмы, приводящие к появлению в крови циркулирующих нуклеиновых кислот

1.2.1. Апоптоз и некроз как - возможные источники появления внеклеточных 42 нуклеиновых кислот в крови

1.2.2. Активная секреция нуклеиновых кислот во внеклеточную среду

1.3. Биологическая роль внеклеточных нуклеиновых кислот в крови

1.4. Использование внеклеточных нуклеиновых кислот крови в практической медицине

I ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и препараты

2.1.2. Лабораторные животные

2.1.3. Образцы крови 59 ^ 2.1.4. Оборудование

2.2. Методы

2.2.1. Приготовление Р меченых фрагментов ДНК

2.2.2. Методы выделения ДНК из плазмы крови

2.2.2.1. Выделение ДНК методом фенольпой очистки

2.2.2.2.Метод выделения ДНК после осаждения комплексов белков с SDS

2.2.2.3. Метод выделения ДНК осаждением комплексов белков с SDS и 62 осаждения полисахаридов обработкой перхлоратом натрия

2.2.2.4. Метод выделения ДНК осаждением комплексов белков с SDS и осаждения 62 полисахаридов обработкой перхлоратом натрия, с последующей экстракцией липидов смесью хлороформ : изоамиловый спирт

2.2.2.5. Метод сорбции ДНК на стеклянные частицы

2.2.2.6. Метод сорбции ДНК на модифицированном стекле

2.2.3. Культивирование клеток

2.2.4. Методы выделения РНК из мембранно-цитозольной фракции клеток 64 линии А

2.2.4.1. Метод фенольпой экстракции

2.2.4.2. Фенол-гуанидиновый метод

2.2.4.3. Выделение РНК при помощи модифицированнго стекла

2.2.5. Оценка эффективности выделения РНК длиной 96 н. при помощи сорбции 66 на модифицированном стекле

2.2.6. Приготовление растворов ДНК и РНК для построения калибровочных 66 кривых

2. 2.7. Взятие крови и приготовление элюатов с поверхности эритроцитов и лейкоцитов

2.2.8. Определение концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме 68 крови и клеточных элюатах

2.2.9. Исследование размера внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме и 69 элюатах с поверхностей клеток крови

2.2.10. Изготовление конъюгатов и иммунизация животных

2.2.11. Изготовление сорбентов и выделение антител методом аффинной 71 хроматографии

2.2.12. Выделение специфических антител

2.2.13. Изготовление конъюгатов антител с пероксидазой хрена

2.2.14. Определение протеазной активности при помощи иммуноферментного 75 анализа

2.2.15. Приготовление модифицированного субстрата для определения 76 дезоксирибонуклеазной активности

2.2.16. Определение нуклеазной активности при помощи иммуноферментного 78 анализа

2.2.17. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка методов выделения и определения концентраций 80 циркулирующих нуклеиновых кислот

3.2. Определение концентрации ДНК и РНК при помощи флуоресцентных 88 красителей Hoechst 33258 и SYBR Green II

3.3. Влияние метода сбора крови и хранения образцов на концентрацию 93 внеклеточных нуклеиновых кислот

3.4. Свободные и связанные с поверхностью клеток внеклеточные нуклеиновые 97 кислоты в крови здоровых доноров

3.5. Особенности циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот у больных 102 с доброкачественными и злокачественными опухолями молочной железы

3.6. Исследование размера внеклеточных нуклеиновых кислот крови

3.7. Исследование факторов, влияющих на длительность циркуляции 113 внеклеточных нуклеиновых кислот

3.7.1. Исследование нуклеазной активности плазмы крови и ФБ-ЭДТА элюатов 113 здоровых доноров и больных с опухолями молочной железы

3.7.2. Определение протеазпой активности плазмы крови и ФБ-ЭДТА элюатах 119 здоровых доноров и больных с опухолями молочной железы

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Циркулирующие внеклеточные нуклеиновые кислоты в крови здоровых доноров и онкологических больных"

До недавнего времени считалось, что в организме эукариот дезоксирибонуклеиновые кислоты локализованы исключительно в клеточных структурах: преимущественно в ядрах клеток и, частично, в митохондриях, где они отвечают за хранение, воспроизводство и экспрессию генетической информации. Вне клеток нуклеиновые кислоты были обнаружены только при таких заболеваниях как системная красная волчанка [3] или в случае массированного воздействия ионизирующего излучения [4]. При этом внеклеточные нуклеиновые кислоты считались биологически инертным материалом, а появление антител против ДНК у аутоиммунных больных [5] рассматривалось как исключение из правил. Однако постепенно накапливались данные о биологической активности нуклеиновых кислот. Было показано, что нуклеиновые кислоты могут взаимодействовать с поверхностными белками клеток [6] и белками крови [7], причем такое взаимодействие может быть как сиквенс неспецифичным [7], так и зависящим от последовательности оснований [8]. Было обнаружено иммуномодулирующее действие неметилированных CpG богатых фрагментов ДНК [9,10], и некоторых структур, образуемых дезоксирибонуклеиновыми кислотами (триплексы, палиндромы) [11]. Иммуномодулирующие свойства ДНК и ее способность сиквенсспецифично взаимодействовать с молекулами белков уже пытаются использовать в практической деятельности для стимуляции субпопуляций лейкоцитов [12] и создания медицинских противосвертывающих препаратов на основе аптомеров [13].

В последние годы было установлено, что вне клеток, и прежде всего в плазме крови животных и человека в норме и при патологиях, обнаруживаются эндогенные внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты [14]. Показано, что при онкологических заболеваниях в крови больных появляются онкоспецифические ДНК [15, 16], [17], характеристические ДНК обнаруживаются в кровотоке и при других заболеваниях, связанных с трансформацией клеток [18]. Более того, в крови беременных обнаруживаются циркулирующие нуклеиновые кислоты плода [19]. Очевидно, что внеклеточные ДНК крови могут быть использованы для разработки методов медицинской диагностики, что и продемонстрировано в ряде исследований [20,21].

Долгое время считалось, что в плазме крови рибонуклеиновые кислоты не могут долго циркулировать в связи с высоким уровнем рибонуклеазной активности [22].

Отдельные данные об их возможной рециркуляции в составе комплексов с белками рассматривались скорее как исключение из правил [23]. Однако в последнее время при * помощи метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией обнаружено значительное количество мРНК онкогенов в пуле внеклеточных рибонуклеиновых кислот. Например, при раке молочной железы в сыворотке обнаруживается мРНК цитокератина 19 и мРНК маммоглобина, которые в сыворотке здоровых доноров не детектируются [24], а в крови здоровых доноров выявлены мРНК генов домашнего хозяйства [25]. В настоящее время концентрация внеклеточной РНК в норме и при патологических состояниях не исследована. Одной из причин этого, по-видимому, может являться общеизвестный факт их нестабильности и отсутствие щ простых скрининговых методов селективного определения концентрации рибонуклеиновых кислот.

Механизмы, приводящие к появлению и обеспечивающие долговременную циркуляцию внеклеточных нуклеиновых кислот, равно как и их биологические функции в настоящее время мало исследованы. По данным одних авторов основными процессами, приводящими к появлению циркулирующих нуклеиновых кислот являются апоптоз и некроз [15]. По данным других авторов, клетки могут активно секретировать нуклеиновые кислоты и этот процесс также вносит вклад в появление Ф внеклеточных нуклеиновых кислот в кровотоке [9, 26]. Патогенетические процессы, приводящие к повышению уровня внеклеточных нуклеиновых кислот в крови при заболеваниях практически не исследованы, однако получены предварительные данные о наличии корреляций между концентрацией внеклеточной ДНК крови и развитием таких заболеваний как рак молочной железы [20], рак легкого [21], рак желудочно-кишечного тракта [14], системная красная волчанка [3]. Очевидно, что исследование процессов, обеспечивающих появление и циркуляцию внеклеточных нуклеиновых кислот, а также понимание их физиологической роли позволит получить новые данные о механизмах патогенеза рака и других заболеваний, сопровождающихся изменением уровня циркулирующих в крови нуклеиновых кислот.

Для выяснения биологической роли и диагностической ценности определения концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот необходимо детальное исследование особенностей циркуляции нуклеиновых кислот в крови, факторов, влияющих на их концентрацию в крови, а также достоверное выявление корреляций в изменении концентраций внеклеточных нуклеиновых кислот крови с развитием патологий. Для f такого исследования необходимы высокопроизводительные, чувствительные и точные методы определения концентраций внеклеточных нуклеиновых кислот, а также методы, позволяющие исследовать влияние внеклеточных нуклеаз и протеаз на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови.

Целью настоящей работы являлась: 1). Разработка количественных методов анализа внеклеточных нуклеиновых кислот; 2). Исследование особенностей циркуляции дезоксирибонуклеиновых и рибонуклеиновых кислот в крови здоровых доноров и онкологических больных; 3). Исследование факторов, влияющих на циркуляцию в крови внеклеточных нуклеиновых кислот.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тамкович, Светлана Николаевна

Выводы:

1. Разработан метод выделения внеклеточных нуклеиновых кислот при помощи сорбции нуклеиновых кислот на модифицированном мелкодисперсном стекле, пригодный для измерения их концентрации при помощи флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и SYBR Green И. Эффективность выделения ДНК из плазмы крови длиной 200-500 п.н. составляет не менее 96 %, эффективность выделения РНК длиной 96 н. составляет не менее 85 %.

2. При помощи комбинации методов - выделения нуклеиновых кислот на модифицированном стекле и определения концентрации ДНК и РНК при помощи флуоресцентных красителей - исследовано распределение внеклеточных нуклеиновых кислот в крови здоровых доноров. Показано, что основную часть внеклеточных нуклеиновых кислот крови составляют нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью форменных элементов.

3. Исследованы особенности циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот в крови больных с опухолями молочной железы. Показано, что по данным флуоресцентного анализа в крови больных злокачественными опухолями молочной железы, отсутствуют циркулирующие нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью форменных элементов крови, а концентрация внеклеточной ДНК в плазме достоверно отличается от таковой у здоровых доноров. В крови больных с доброкачественными опухолями молочной железы концентрация связанных с поверхностью клеток крови нуклеиновых кислот не отличается от таковой у здоровых доноров. Полученные данные свидетельствуют о возможности ранней неинвазивной дифференциальной диагностики опухолей молочной железы, основанной на измерении концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот.

4. Разработана система иммуноферментного анализа, пригодная для изучения протеазной активности в крови. Показано, что при увеличении протеазной активности в крови уменьшается концентрация нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью форменных элементов крови. Таким образом, протеазная активность крови влияет на перераспределение внеклеточных нуклеиновых кислот.

Разработана система иммуноферментного анализа, пригодная для изучения дезоксирибонуклеазной активности в крови. Показано, что при уменьшении дезоксирибонуклеазной активности в крови увеличивается концентрация циркулирующих дезоксирибонуклеиновых кислот. Таким образом, дезоксирибонуклеазная активность влияет на концентрацию внеклеточной ДНК в крови.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тамкович, Светлана Николаевна, Новосибирск

1. Чиссов, В.И., Дарьялова, C.JI. (2000) Избранные лекции по клинической онкологии, Москва.

2. Garcia-Olmo, D., Garcia-Olmo, D.C., Ontanon, J., Martinez, E. (2000) Horizontal transfer of DNA and the "genometastasis hypothesis". Blood 95, 724-5.

3. Raptis, L., Menard, H.A. (1980) Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 66,1391-9.

4. Vasilyeva, I.N. (2001) Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation. Ann N YAcad Sci 945, 221-8.

5. Власов, A.B. (1998) Рибонуклеазы человека. Биохимия 63,1349-60.

6. Laktionov, P.P., Dazard, J.E., Vives, E., Rykova, E.Y., Piette, J., Vlassov, V.V., Lebleu, B. (1999) Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes. Nucleic Acids Res 27,2315-24.

7. Власов, B.B., Паутова, JI.B., Рыкова, E., Якубов, JI.A. (1993) Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. Биохимия 58,1247-51.

8. Griffoni, С., Spisni, Е., Orlandi, М., Santi, S., Riccio, М., Tomasi, V. (1999) А 38 kDa nuclear protein is involved in the retention of an antisense oligonucleotide directed against cytosolic phospholipase A2. Nucleosides Nucleotides 18,1673-6.

9. Kolodny, G.M., Culp, L.A., Rosenthal, L.J. (1972) Secretion of RNA by normal and transformed cells. Exp Cell Res 73, 65-72.

10. Krieg, A.M., Yi, A.K., Matson, S., Waldschmidt, T.J., Bishop, G.A., Teasdale, R., Koretzky, G.A., Klinman, D.M. (1995) CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature Ъ14, 546-9.

11. Bendigs, S., Salzer, U., Lipford, G.B., Wagner, H., Heeg, K. (1999) CpG-oligodeoxynucleotides co-stimulate primary T cells in the absence of antigen-presenting cells. Eur J Immunol 29, 1209-18.

12. Griffin, L.C., Tidmarsh, G.F., Bock, L.C., Toole, J.J., Leung, L.L. (1993) In vivo anticoagulant properties of a novel nucleotide-based thrombin inhibitor and demonstration of regional anticoagulation in extracorporeal circuits. Blood 81,3271-6.

13. Shapiro, В., Chakrabarty, M., Cohn, E.M., Leon, S.A. (1983) Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease. Cancer 51, 2116-20.

14. Palmisano, W.A., Divine, K.K., Saccomanno, G., Gilliland, F.D., Baylin, S.B., Herman, J.G., Belinsky, S.A. (2000) Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res 60, 5954-8.

15. Sanchez-Cespedes, M., Esteller, M., Wu, L., Nawroz-Danish, H., Yoo, G.H., Koch, W.M., Jen, J., Herman, J.G., Sidransky, D. (2000) Gene promoter hypermethylation in tumors and serum of head and neck cancer patients. Cancer Res 60, 892-5.

16. Sozzi, G., Conte, D., Mariani, L., Lo Vullo, S., Roz, L., Lombardo, C., Pierotti, M.A., Tavecchio, L. (2001) Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Cancer Res 61, 4675-8.

17. Kamm, R.C., Smith, A.G. (1972) Ribonuclease activity in human plasma. Clin Biochem 5, 198-200.

18. Wieczorek, A.J., Rhyner, C., Block, L.H. (1985) Isolation and characterization of an RNA-proteolipid complex associated with the malignant state in humans. Proc Natl Acad Sci US AS2, 3455-9.

19. Ng, E.K., Tsui, N.B., Lam, N.Y., Chiu, R.W., Yu, S.C., Wong, S.C., Lo, E.S., Rainer, Т.Н., Johnson, P.J., Lo, Y.M. (2002) Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals. Clin Chem 48,1212-7.

20. Anker, P., Stroun, M., Maurice, P.A. (1975) Spontaneous release of DNA by human blood lymphoctyes as shown in an in vitro system. Cancer Res 35, 2375-82.

21. Шевчук, Н.А. (2001) Время-разрешённый иммунофлюоресцентный анализ на ДНК и исследование содержания ДНК в сыворотке человека. Вопросы Медицинской Химии 47, 439-48.

22. Rainer, Т.Н., Lo, Y.M., Chan, L.Y., Lam, N.Y., Lit, L.C., Cocks, R.A. (2001) Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann N YAcad Sci 945,211-20.

23. Choi, J.J., Reich, C.F., 3rd, Pisetsky, D.S. (2005) The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. Immunology 115,55-62.

24. Stroun, M., Anker, P., Maurice, P., Lyautey, J., Lederrey, C., Beljanski, M. (1989) Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. Oncology 46, 318-22.

25. Deligezer, U., Yaman, F., Erten, N., Dalay, N. (2003) Frequent copresence of methylated DNA and fragmented nucleosomal DNA in plasma of lymphoma patients. Clin Chim Acta 335, 89-94.

26. Wu, T.L., Zhang, D., Chia, J.H., Tsao, K.H., Sun, C.F., Wu, J.T. (2002) Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range. Clin Chim Acta 321, 77-87.

27. Spence, M. (1996) Handbook of fluorescent probes and research chemicals.

28. Wong, T.S., Kwong, D.L., Sham, J.S., Wei, W.I., Kwong, Y.L., Yuen, A.P. (2004) Quantitative plasma hypermethylated DNA markers of undifferentiated nasopharyngeal carcinoma. Clin Cancer Res 10,2401-6.

29. Allen, D., Butt, A., Cahill, D., Wheeler, M., Popert, R., Swaminathan, R. (2004) Role of cell-free plasma DNA as a diagnostic marker for prostate cancer. Ann N Y Acad Sci 1022, 76-80.

30. Lo, Y.M., Zhang, J., Leung, T.N., Lau, Т.К., Chang, A.M., Hjelm, N.M. (1999) Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 64,218-24.

31. Steinman, C.R., Ackad, A. (1977) Appearance of circulating DNA during hemodialysis. Am J Med 62, 693-7.

32. Masopust, J. (1977) Rudiments of immunochemical test methods. Praha: Chemapol.

33. Чард, Д. (1981) Радиоиммунологические методы. (Мир, ed), Москва 246.

34. Stollar, B.D. (1980) The experimental induction of antibodies to nucleic acids. Methods Enzymol 70, 70-85.

35. Jung, M., Klotzek, S., Lewandowski, M., Fleischhacker, M., Jung, K. (2003) Changes in concentration of DNA in serum and plasma during storage of blood samples. Clin Chem 49,1028-9.

36. Swinkels, D.W., Wiegerinck, E., Steegers, E.A., de Kok, J.B. (2003) Effects of blood-processing protocols on cell-free DNA quantification in plasma. Clin Chem 49, 525-6.

37. Steinman, C.R. (1975) Free DNA in serum and plasma from normal adults. J Clin Invest 56, 512-5.

38. Белохвостое, A.C., Зеленкова, H.K. (1978) Некоторые особенности циркуляции нуклеинового фактора из асцитной жидкости при опухолях. Молекулярная биология 12, 1256-63.

39. Грикурова, Н.К., Белохвостов, А.С., Сетц, И.Ф. (1983) Высокомолекулярные формы ДНК в сыворотке крови с гепатомой Зайдела. Вопросы онкологии 29, 703.

40. Белохвостов, А.С., Зеленкова, Н.К. (1979) Устойчивость к панкреатической дезоксирибонуклеазе ДНК иммунодепрессивного фактора асцитной жидкости. Биохимия 44, 711-4.

41. Herrmann, М. (1989) Molecular and cellular mechanisms of human hypersensitivity and autoimmunity. Alan R. Liss Inc.

42. Van Helden, P.D. (1985) Potential Z-DNA-forming elements in serum DNA from human systemic lupus erythematosus. J Immunol 134, 177-9.

43. Li, J.Z., Steinman, C.R. (1989) Plasma DNA in systemic lupus erythematosus. Characterization of cloned base sequences. Arthritis Rheum 32, 726-33.

44. Gauthier, V.J., Tyler, L.N., Mannik, M. (1996) Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. J Immunol 156,1151-6.

45. Halicka, H.D., Bedner, E., Darzynkiewicz, Z. (2000) Segregation of RNA and separate packaging of DNA and RNA in apoptotic bodies during apoptosis. Exp Cell Res 260,248-56.

46. Holdenrieder, S., Stieber, P., Bodenmuller, H., Busch, M., Fertig, G., Furst, H., Schalhorn, A., Schmeller, N., Untch, M., Seidel, D. (2001) Nucleosomes in serum of patients with benign and malignant diseases. Int J Cancer 95,114-20.

47. Rumore, P., Muralidhar, В., Lin, M., Lai, C., Steinman, C.R. (1992) Haemodialysis as a model for studying endogenous plasma DNA: oligonucleosome-like structure and clearance. Clin Exp Immunol 90, 56-62.

48. Pepys, M.B., Butler, P.J. (1987) Serum amyloid P component is the major calcium-dependent specific DNA binding protein of the serum. Biochem Biophys Res Commun 148, 308-13.

49. Паутова, Л.В., Рыкова, E., Лактионов, П.П., Власов, B.B. (1996) Исследование взаимодействия полиреактивных антител с нуклеиновыми кислотами с помощью алкилирующих производных олигонуклеотидов. Молекулярная биология 30, 941-50.

50. Van Schravendijk, M.R., Dwek, R.A. (1982) Interaction of Clq with DNA. Mol Immunol 19, 1179-87.

51. Hoch, S.O. (1982) DNA-binding domains of fibronectin probed using Western blots. Biochem Biophys Res Commun 106,1353-8.

52. Лактионов, П.П., Рыкова, E., Крепкий, Д.В., Брыксин, A.B., Власов, B.B. (1997) Взаимодействие олигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей. Биохимия 62, 613-8.

53. Zou, S., Magura, С.Е., Hurley, W.L. (1992) Heparin-binding properties of lactoferrin and lysozyme. Comp Biochem Physiol В 103, 889-95.

54. Беляев, Н.Д., Будкер, В.Г., Горохова, О.Е., Соколов, А.В. (1988) Mg2+-3aBHCHMoe взаимодействие ДНК с эукариотическими клетками. Молекулярная биология 22, 1667-72.

55. Budker, V.G., Godovikov, A.A., Naumova, L.P., Slepneva, I.А. (1980) Interaction of polynucleotides with natural and model membranes. Nucleic Acids Res 8, 2499-515.

56. Bennett, R.M., Kotzin, B.L., Merritt, M.J. (1987) DNA receptor dysfunction in systemic lupus erythematosus and kindred disorders. Induction by anti-DNA antibodies, antihistone antibodies, and antireceptor antibodies. J Exp Med 166, 85063.

57. Krieg, A.M., Gmelig-Meyling, F., Gourley, M.F., Kisch, W.J., Chrisey, L.A., Steinberg, A.D. (1991) Uptake of oligodeoxyribonucleotides by lymphoid cells is heterogeneous and inducible. Antisense Res Dev 1,161-71.

58. Лактионов, П.П., Рыкова, E., Власов, В.В. (1997) Участие поверхностных иммуноглобулинов в активации лимфоцитов под действием плазмидной ДНК. Молекулярная биология 31, 506-514.

59. Geselowitz, D.A., Neckers, L.M. (1995) Bovine serum albumin is a major oligonucleotide-binding protein found on the surface of cultured cells. Antisense Res Dev 5,213-7.

60. Dorsch, C.A. (1981) Binding of single-strand DNA to human platelets. Thromb Res 24, 119-29.

61. Fiedel, B.A., Schoenberger, J.S., Gewurz, H. (1979) Modulation of platelet activation by native DNA. J Immunol 123,2479-83.

62. Huss, R. (1988) A 42 kD erythrocyte surface membrane protein with binding capacity to polynucleotides shows functional lack in systemic lupus erythematosus. Immunobiology 178,141-142.

63. Gasparro, F.P., Dall'Amico, R., O'Malley, M., Heald, P.W., Edelson, R.L. (1990) Cell membrane DNA: a new target for psoralen photoadduct formation. Photochem Photobiol 52, 315-21.

64. Emlen, W., Mannik, M. (1978) Kinetics and mechanisms for removal of circulating single-stranded DNA in mice. J Exp Med 147, 684-99.

65. Sisco, K.L. (2001) Is RNA in serum bound to nucleoprotein complexes? Clin Chem 47, 1744-5.

66. Блинов, M.H., Луганова, И.С., Владимирова, А.Д. (1981) О фактарах нуклеиновой природы в крови человека. Вопросы медицинской химии 27, 600-3.76.

67. Meybaum, В. (1968) Chemistry and biochemistry of nucleic acids. 80-81.

68. Fleck, A., Munro, H.N. (1962) The precision of ultraviolet absorption measurements in the Schmidt-Thannhauser procedure for nucleic acid estimation. Biochim Biophys Acta 55, 571-83.

69. Schmidt, G. (1968) Chemistry and biochemistry of nucleic acids. 80-81.

70. Hamilton, T.C., Smith, A.G., Griffin, C.A., Henderson, R.J., Jr. (1979) Ribonucleic acid in plasma from normal adults and multiple myeloma patients. Clin Chem 25, 1774-9.

71. Fleischhacker, M., Beinert, Т., Ermitsch, M., Seferi, D., Possinger, K., Engelmann, C., Jandrig, B. (2001) Detection of amplifiable messenger RNA in the serum of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci 945,179-88.

72. Hasselmann, D.O., Rappl, G., Tilgen, W., Reinhold, U. (2001) Extracellular tyrosinase mRNA within apoptotic bodies is protected from degradation in human serum. Clin Chem 47,1488-9.

73. Li, D., Butt, A., Clarke, S., Swaminathana, R. (2004) Real-time quantitative PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of thyroid cancer patients and healthy subjects. Ann N YAcad Sci 1022, 147-51.

74. Hamaoui, K., Butt, A., Powrie, J., Swaminathan, R. (2004) Real-time quantitative PCR measurement of circulatory rhodopsin mRNA in healthy subjects and patients with diabetic retinopathy. Ann N YAcad Sci 1022,152-6.

75. Rosi, A., Guidoni, L., Luciani, A.M., Mariutti, G., Viti, V. (1988) RNA-lipid complexes released from the plasma membrane of human colon carcinoma cells. Cancer Lett 39,153-60.

76. Inversen, P. (1993) In vivo studies with phosphorothioate oligonucleotides: rationale for systemic therapy in antisense research and applications. (C. Press, ed) 461-469.

77. Moore, S. (1981) The enzymes. Academic press, New York 271-287.

78. Sierakowska, H., Shugar, D. (1977) Mammalian nucleolytic enzymes. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 20, 59-130.

79. Love, J.D., Hewitt, R.R. (1979) The relationship between human serum and human pancreatic DNase I. J Biol Chem 254,12588-94.

80. Shimada, O., Suzuki, S., Tosaka-Shimada, H., Ishikawa, H. (1998) Detection of deoxyribonuclease I in a hormone-secretory pathway of pituitary cells in humans and rats. Cell Struct Funct 23,49-56.

81. Nadano, D., Yasuda, Т., Kishi, K. (1993) Measurement of deoxyribonuclease I activity in human tissues and body fluids by a single radial enzyme-diffusion method. Clin Chem 39,448-52.

82. Yasuda, Т., Takeshita, H., Nakazato, E., Nakajima, Т., Hosomi, O., Nakashima, Y., Kishi, K. (1998) Activity measurement for deoxyribonucleases I and II with picogram sensitivity based on DNA/SYBR Green I fluorescence. Anal Biochem 255,274-6.

83. Шапот, B.C. (1968) Нуклеазы. Медицина, Москва.

84. Bemari, G. (1971) The Enzymes. Academic press, New York.

85. Абашева, Г., Губко, А.А., П., П.Г., Прасмыцкий, O.T. (1994) Активность нуклеаз при множественной травме. Вопросы медицинской химии 40, 30-1.

86. Patel, P.S., Patel, B.P., Rawal, R.M., Raval, G.N., Patel, M.M., Patel, J.B., Jha, F.P., Patel, D.D. (2000) Evaluation of serum alkaline DNase activity in treatment monitoring of head and neck cancer patients. Tumour Biol 21, 82-9.

87. Raval, G.N., Parekh, L.J., Patel, M.M., Patel, P.S., Rawal, R.M., Balar, D.B., Patel, D.D. (1997) Role of sialic acid and alkaline DNase in breast cancer. Int J Biol Markers 12, 61-7.

88. Scully, C., Spandidos, D.A., Ward Booth, P., McGregor, I.A., Boyle, P. (1981) Serum alkaline deoxyribonuclease in oral cancer and premalignant lesions. Biomedicine 35, 179-80.

89. Economidou-Karaoglou, A., Opsomer, M., Lans, M., Taper, H.S., Deckers, C., Roberfroid, M.B. (1990) Predictive value of serum alkaline DNase activity variations in treatment of head and neck cancer. Acta Oncol 29,163-6.

90. Ramandanis, G., Agnantis, N., Garas, J., Spandidos, D.A. (1982) Correlation between serum and tissue deoxyribonuclease levels in breast cancer patients. Anticancer Res 2,213.8.

91. Beintema, J J., Blank, A., Schieven, G.L., Dekker, C.A., Sorrentino, S., Libonati, M. (1988) Differences in glycosylation pattern of human secretory ribonucleases. BiochemJ 255, 501-5.

92. Beintema, J.J., Wietzes, P., Weickmann, J.L., Glitz, D.G. (1984) The amino acid sequence of human pancreatic ribonuclease. Anal Biochem 136,48-64.

93. Fett, J.W., Strydom, D.J., Lobb, R.R., Alderman, E.M., Bethune, J.L., Riordan, J.F., Vallee, B.L. (1985) Isolation and characterization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemistry 24, 5480-6.

94. Saxena, S.K., Rybak, S.M., Davey, R.T., Jr., Youle, R.J., Ackerman, E.J. (1992) Angiogenin is a cytotoxic, tRNA-specific ribonuclease in the RNase A superfamily. J Biol Chem 267,21982-6.

95. Shapiro, R., Riordan, J.F., Vallee, B.L. (1986) Characteristic ribonucleolytic activity of human angiogenin. Biochemistry 25, 3527-32.

96. Maor, D., Mardiney, M.R., Jr. (1978) Alteration of human serum ribonuclease activity in malignancy. CRC Crit Rev Clin Lab Sci 10, 89-111.

97. Kemmer, T.P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M.L., Ditschuneit, H. (1991) ^ Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. Int J Pancreatol 8,23.33.

98. Naskalski, J.W. (1989) Determination of ribonuclease activity in serum of patients with pancreatic necrosis. An attempt of extending the enzyme diagnosis of acute pancreatitis. Z Med Lab Diagn 30,425-30.

99. Fujimori, С., Yamagishi, H., Mizukuro, Т., Tanaka, Т., Hashimoto, I. (1983) Study of mechanisms of increasing serum RNase., Gan To Kagaku Ryoho 10, 792-8.

100. Drake, W.P., Pokorney, D.R., Ruckdeschel, J.C., Levy, C.C., Mardiney, M.R., Jr. (1975) A white blood cell RNase assay for the possible monitoring of malignancy. J Natl Cancer Inst 54, 1475-8.

101. Akagi, K., Yamanaka, M., Murai, K., Niho, Y., Omae, T. (1978) Serum acid ribonuclease in myelogenous leukemia. Cancer Res 38, 2168-73.

102. Goding, J.W., Terkeltaub, R., Maurice, M., Deterre, P., Sali, A., Belli, S.I. (1998) Ecto-phosphodiesterase/pyrophosphatase of lymphocytes and non-lymphoid cells: structure and function of the PC-1 family. Immunol Rev 161, 11-26.

103. Kanyshkova, T.G., Babina, S.E., Semenov, D.V., Isaeva, N., Vlassov, A.V., Neustroev, K.N., Kul'minskaya, A.A., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. (2003) Multiple enzymic activities of human milk lactoferrin. Eur J Biochem 270, 3353-61.

104. Furmanski, P., Li, Z.P., Fortuna, M.B., Swamy, C.V., Das, M.R. (1989) Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity. J Exp Med 170, 415-29.

105. Shuster, A.M., Gololobov, G.V., Kvashuk, O.A., Bogomolova, A.E., Smirnov, I.V., Gabibov, A.G. (1992) DNA hydrolyzing autoantibodies. Science 256, 665-7.

106. Baranovskii, A.G., Ershova, N.A., Buneva, V.N., Kanyshkova, T.G., Mogelnitskii,

107. A.S., Doronin, B.M., Boiko, A.N., Gusev, E.I., Favorova, O.O., Nevinsky, G.A. (2001) Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis. Immunol Lett 76,163-7.

108. Власов, A.B., Андриевская, O.A., Канышкова, Т.Г., Барановский, А.Г., Наумов,

109. B.А., Бреусов, А.А., Жьеже, Р., Бунева, В.Н., Невинский, Г.А. (1997) РНК-гидролизующие антитела из крови больных системной красной волчанкой. Биохимия 62, 474-9.

110. Gololobov, G.V., Mikhalap, S.V., Starov, A.V., Kolesnikov, A.F., Gabibov, A.G.1994) DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl Biochem Biotechnol 47, 305-14; discussion 314-5.

111. Невинский, Г.А., Канышкова, Т.Г., Бунева, B.H. (2000) Природные аталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии. Биохимия 65,1245-55.

112. Nevinsky, G.A., Buneva, V.N. (2002) Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies. J Immunol Methods 269, 235-49.

113. Sinha, A.A., Wilson, M.J., Gleason, D.F., Reddy, P.K., Sameni, M., Sloane, B.F.1995) Immunohistochemical localization of cathepsin В in neoplastic human prostate. Prostate 26, 171-8.

114. Barrett, A.J., Kirschke, H. (1981) Cathepsin B, Cathepsin H, and cathepsin L. Methods Enzymol 80 Pt C, 535-61.

115. Wiederanders, В., Kirschke, H. (1989) The processing of a cathepsin L precursor in vitro. Arch Biochem Biophys 272, 516-21.

116. Niedbala, M.J., Picarella, M.S. (1992) Tumor necrosis factor induction of endothelial cell urokinase-type plasminogen activator mediated proteolysis of extracellular matrix and its antagonism by gamma-interferon. Blood 79, 678-87.

117. H. (1991) MCF7 mammary cancer cells respond to bFGF and internalize it following its release from extracellular matrix: a permissive role of cathepsin D. Exp Cell Res 194,252-9.

118. Клишко, E.B., Кондакова, И.В., Чойнозов, E.J1. (2003) Матриксные металлопротеиназы в онкогенезе. Сибирский онкологический журнал 2, 63-70.

119. Nishimura, Y., Kato, К. (1987) Intracellular transport and processing of lysosomal cathepsin H. Biochem Biophys Res Commun 148, 329-34.

120. Nishimura, Y., Furuno, K., Kato, K. (1988) Biosynthesis and processing of lysosomal cathepsin L in primary cultures of rat hepatocytes. Arch Biochem Biophys 263, 10716.

121. Kobayashi, Y., Staquet, M.J., Dezutter-Dambuyant, C., Schmitt, D. (1995) In vitro migration capacity of epidermal Langerhans cells. Adv Exp Med Biol 378, 169-71.

122. Nomura, H., Sato, H., Seiki, M., Mai, M., Okada, Y. (1995) Expression of membrane-type matrix metalloproteinase in human gastric carcinomas. Cancer Res 55, 3263-6.

123. Baramova, E.N., Bajou, K., Remade, A., L'Hoir, C., bCrell, H.W., Weidle, U.H., Noel, A., Foidart, J.M. (1997) Involvement of PA/plasmin system in the processing of pro-MMP-9 and in the second step of pro-MMP-2 activation. FEBS Lett 405,157-62.

124. Festuccia, C., Guerra, F., D'Ascenzo, S., Giunciuglio, D., Albini, A., Bologna, M. (1998) In vitro regulation of pericellular proteolysis in prostatic tumor cells treated with bombesin. Int J Cancer 75, 418-31.

125. Mach, L., Schwihla, H., Stuwe, K., Rowan, A.D., Mort, J.S., Glossl, J. (1993) Activation of procathepsin В in human hepatoma cells: the conversion into the mature enzyme relies on the action of cathepsin В itself. BiochemJ293 (Pt 2), 437-42.

126. Zucker, S., Lysik, R.M., Zarrabi, M.H., Moll, U. (1993) M(r) 92,000 type IV collagenase is increased in plasma of patients with colon cancer and breast cancer. Cancer Res 53,140-6.

127. Grondahl-Hansen, J., Bach, F., Munkholm-Larsen, P. (1990) Tissue-type plasminogen activator in plasma from breast cancer patients determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Br J Cancer 61,412-4.

128. Emlen, W., Rifai, A., Magilavy, D., Mannik, M. (1988) Hepatic binding of DNA is mediated by a receptor on nonparenchymal cells. Am J Pathol 133, 54-60.

129. Pawlotsky, J.M., Bastie, A., Lonjon, I., Remire, J., Darthuy, F., Soussy, C.J., Dhumeaux, D. (1997) What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples? J Virol Methods 65, 245-53.

130. Steinman, C.R. (1979) Circulating DNA in systemic lupus erythematosus. Association with central nervous system involvement and systemic vasculitis. Am J Med 67, 42935.

131. Webb, S J., Harrison, D.J., Wyllie, A.H. (1997) Apoptosis: an overview of the process and its relevance in disease. Adv Pharmacol 41,1-34.

132. Rudin, C.M., Thompson, C.B. (1997) Apoptosis and disease: regulation and clinical relevance of programmed cell death. Annu Rev Med 48,267-81.

133. Nagata, S. (2000) Apoptotic DNA fragmentation. Exp Cell Res 256, 12-8.

134. Liu, X., Li, P., Widlak, P., Zou, H., Luo, X., Garrard, W.T., Wang, X. (1998) The 40-kDa subunit of DNA fragmentation factor induces DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis. Proc Natl Acad Sci U SA 95, 8461-6.

135. Diaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. (1997) Activation of the IFN-inducible enzyme RNase L causes apoptosis of animal cells. Virology 236, 354-63.

136. Castelli, J.C., Hassel, В.A., Maran, A., Paranjape, J., Hewitt, J.A., Li, X.L., Hsu, Y.T., Silverman, R.H., Youle, RJ. (1998) The role of 2'-5' oligoadenylate-activated ribonuclease L in apoptosis. Cell Death Differ 5,313-20.

137. Houge, G., Robaye, В., Eikhom, T.S., Golstein, J., Mellgren, G., Gjertsen, B.T., Lanotte, M., Doskeland, S.O. (1995) Fine mapping of 28S rRNA sites specifically cleaved in cells undergoing apoptosis. Mol Cell Biol 15,2051-62.

138. Biggiogera, M., Bottone, M.G., Pellicciari, C. (1998) Nuclear RNA is extruded from apoptotic cells.JHistochem Cytochem 46, 999-1005.

139. Biggiogera, M., Bottone, M.G., Martin, Т.Е., Uchiumi, Т., Pellicciari (1997) Still immunodetectable nuclear RNPs are extruded from the cytoplasm of spontaneously apoptotic thymocytes. Exp Cell Res 234, 512-20.

140. Goessl, C., Heicappell, R., Munker, R., Anker, P., Stroun, M., Krause, H., Muller, M., Miller, K. (1998) Microsatellite analysis of plasma DNA from patients with clear cell renal carcinoma. Cancer Res 58,4728-32.

141. Rogers, J.C., Boldt, D., Kornfeld, S., Skinner, A., Valeri, C.R. (1972) Excretion of deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen. Proc Natl Acad Sci USA 69,1685-9.

142. Giacona, M.B., Ruben, G.C., Iczkowski, K.A., Roos, T.B., Porter, D.M., Sorenson, G.D. (1998) Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls. Pancreas 17, 89-97.

143. Stroun, M., Anker, P., Beljanski, M., Henri, J., Lederrey, C., Ojha, M., Maurice, P.A. (1978) Presence of RNA in the nucleoprotein complex spontaneously released by human lymphocytes and frog auricles in culture. Cancer Res 38, 3546-54.

144. Stroun, M., Lyautey, J., Lederrey, C., Olson-Sand, A., Anker, P. (2001) About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. Clin Chim Acta 313, 139-42.

145. Plescia, O.J., Braun, W., Palczuk, N.C. (1964) Production of Antibodies to Denatured Deoxyribonucleic Acid (DNA). Proc Natl Acad Sci USA 52, 279-85.

146. Seaman, E., Van Vunakis, H., Levine, L. (1972) Serologic estimation of thymine dimers in the deoxyribonucleic acid of bacterial and mammalian cells following irradiation with ultraviolet light and postirradiation repair. J Biol Chem 247, 5709-15.

147. Gruenewald, R., Stollar, B.D. (1973) The role of antigenic determinants in the control of IgM and IgG antibody responses to denatured DNA. J Immunol 111,106-13.

148. Zamchuk, L.A., Braude, N.A., Goldfarb, D.M. (1976) Immunogenic properties of bacteriophage SPOl and T4 DNA photooxidized in the presence of methylene blue, irradiated with ultra-violet light or containing 5-bromdesoxyuridine. Immunochemistry 13,81-5.

149. Frappier, L., Price, G.B., Martin, R.G., Zannis-Hadjopoulos, M. (1989) Characterization of the binding specificity of two anticruciform DNA monoclonal antibodies. J Biol Chem 264, 334-41.

150. Krieg, A.M., Love-Homan, L., Yi, A.K., Harty, J.T. (1998) CpG DNA induces sustained IL-12 expression in vivo and resistance to Listeria monocytogenes challenge. J Immunol 161, 2428-34.

151. Liang, H., Nishioka, Y., Reich, C.F., Pisetsky, D.S., Lipsky, P.E. (1996) Activation of human В cells by phosphorothioate oligodeoxynucleotides. J Clin Invest 98, 111 9-29.

152. Finter, N. (1973) Interferons and interferon inducers. North-Holland, Amsterdam.

153. Pancer, L.B., Milazzo, M.F., Morris, V.L., Singhal, S.K., Bell, D.A. (1981) Immunogenicity and characterization of supernatant DNA released by murine spleen cells. J Immunol 127, 98-104.

154. Anker, P., Jachertz, D., Stroun, M., Brogger, R., Lederrey, C., Henri, J., Maurice, P.A. (1980) The role of extracellular DNA in the transfer of information from T to В human lymphocytes in the course of an immune response. JImmunogenet 7,475-81.

155. Anker, P., Jachertz, D., Stroun, M., Brogger, R., Lederrey, C., Maurice, P.A. (1979) Transfer of genetic information from T to В human lymphocytes during an immune response to herpes simplex virus. CR Seances Acad Sci D 289, 217-20.

156. Popova, T. (1991) Immunomodulatory action of low-molecular RNA excreted to the medium by tumour cells. Experimental oncology 13,44-47.

157. Lucas, W.J., Yoo, B.C., Kragler, F. (2001) RNA as a long-distance information macromolecule in plants. Nat RevMol Cell Biol 2, 849-57.

158. Ambros, V., Lee, R.C., Lavanway, A., Williams, P.T., Jewell, D. (2003) MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans. CurrBiol 13, 807-18.

159. Sempere, L.F., Sokol, N.S., Dubrovsky, E.B., Berger, E.M., Ambros, V. (2003) Temporal regulation of microRNA expression in Drosophila melanogaster mediated by hormonal signals and broad-Complex gene activity. Dev Biol 259,9-18.

160. Moss, E.G., Tang, L. (2003) Conservation of the heterochronic regulator Lin-28, its developmental expression and microRNA complementary sites. Dev Biol 258,432-42.

161. Johnson, S.M., Grosshans, H., Shingara, J., Byrom, M., Jarvis, R., Cheng, A., Labourier, E., Reinert, K.L., Brown, D., Slack, F.J. (2005) RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 120, 635-47.

162. Kolodny, G.M. (1971) Evidence for transfer of macromolecular RNA between mammalian cells in culture. Exp Cell Res 65, 313-24.

163. Винтер, В.Г., Аглиуллина, Д.Г., Андреева, И.Н. (1978) Специфичность действия РНК, выделяемой клетками карциномы Эрлиха, на перевиваемость и рост гомологичной опухоли. Вопросы Онкологии 24, 38-41.

164. Holmgren, L., Szeles, A., Rajnavolgyi, Е., Folkman, J., Klein, G., Ernberg, I., Falk, K.I. (1999) Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood 93, 3956-63.

165. Bergsmedh, A., Szeles, A., Henriksson, M., Bratt, A., Folkman, M.J., Spetz, A.L., Holmgren, L. (2001) Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies. Proc Natl Acad Sci US A 98, 6407-11.

166. Garcia-Olmo, D., Garcia-Olmo, D.C., Ontanon, J., Martinez, E., Vallejo, M. (1999) Tumor DNA circulating in the plasma might play a role in metastasis. The hypothesis of the genometastasis. Histol Histopathol 14, 1159-64.

167. Lo, Y.M., Leung, S.F., Chan, L.Y., Chan, A.T., Lo, K.W., Johnson, P.J., Huang, D.P. (2000) Kinetics of plasma Epstein-Barr virus DNA during radiation therapy for nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res 60, 2351-5.

168. Lam, N.Y., Rainer, Т.Н., Chan, L.Y., Joynt, G.M., Lo, Y.M. (2003) Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. Clin Chem 49,1286-91.

169. Anker, P., Mulcahy, H., Stroun, M. (2003) Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? Int J Cancer 103,149-52.

170. Holdenrieder, S., Stieber, P. (2004) Therapy control in oncology by circulating nucleosomes. Ann N YAcad Sci 1022,211-6.

171. Goessl, C., Krause, H., Muller, M., Heicappell, R., Schrader, M., Sachsinger, J., Miller, K. (2000) Fluorescent methylation-specific polymerase chain reaction for DNA-based detection of prostate cancer in bodily fluids. Cancer Res 60, 5941-5.

172. Sozzi, G., Musso, K., Ratcliffe, C., Goldstraw, P., Pierotti, M.A., Pastorino, U. (1999) Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients: a prospect for early diagnosis. Clin Cancer Res 5, 2689-92.

173. Chen, X.Q., Stroun, M., Magnenat, J.L., Nicod, L.P., Kurt, A.M., Lyautey, J., Lederrey, C., Anker, P. (1996) Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med 2, 1033-5.

174. Morozkin, E.S., Laktionov, P.P., Rykova, E.Y., Vlassov, V.V. (2004) Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells. Ann N Y Acad Sci 1022, 244-9.

175. Vasioukhin, V., Anker, P., Maurice, P., Lyautey, J., Lederrey, C., Stroun, M. (1994) Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. Br J Haematol 86, 7749.

176. Sorenson, G.D., Pribish, D.M., Valone, F.H., Memoli, V.A., Bzik, D.J., Yao, S.L. (1994) Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 3, 67-71.

177. Kopreski, M.S., Benko, F.A., Kwee, C., Leitzel, K.E., Eskander, E., Lipton, A., Gocke, C.D. (1997) Detection of mutant K-ras DNA in plasma or serum of patients with colorectal cancer. Br J Cancer 16,1293-9.

178. Mao, L., Lee, D.J., Tockman, M.S., Erozan, Y.S., Askin, F., Sidransky, D. (1994) Microsatellite alterations as clonal markers for the detection of human cancer. Proc Natl Acad Sci USA 91, 9871-5.

179. Lichtenstein, A.V., Kisseljova, N.P. (2001) DNA methylation and carcinogenesis. Biochemistry (Mosc) 66, 235-55.

180. Wong, I.H., Lo, Y.M., Zhang, J., Liew, C.T., Ng, M.H., Wong, N. Lai, P.B., Lau, W.Y., Hjelm, N.M., Johnson, P.J. (1999) Detection of aberrant pl6 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients. Cancer Res 59,71-3.

181. Bunn, P.J., Jr. (2003) Early detection of lung cancer using serum RNA or DNA markers: ready for "prime time" or for validation? J Clin Oncol 21,3891-3.

182. Kopreski, M.S., Benko, F.A., Kwak, L.W., Gocke, C.D. (1999) Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma. Clin Cancer Res 5,1961-5.

183. Ke, L.D., Chen, Z., Yung, W.K. (2000) A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol Cell Probes 14,127-35.

184. Gilkeson, G.S., Grudier, J.P., Karounos, D.G., Pisetsky, D.S. (1989) Induction of anti-double stranded DNA antibodies in normal mice by immunization with bacterial DNA. J Immunol 142,1482-6.

185. Маниатис, Т. (1984) Молекулярное клонирование, Москва.

186. Beld, М., Sol, С., Goudsmit, J., Boom, R. (1996) Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. Nucleic Acids Res 24, 2618-9.

187. Лактионов, П., Тамкович, CH., Симонов, ПА., Рыкова, ЕЮ., Власов, ВВ. (2004) Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот. Россия.

188. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (1992) Short protocols in molecular biology. Wiley.

189. Фрешни, P. (1989) Культура животных клеток. Методы. Мир, Москва.

190. Chomczynski, P., Mackey, К. (1998) Cell Biology: A laboratory handbook, Second Edition. Academic Press.

191. Лактионов, П., Тамкович, CH., Симонов, ПА., Рыкова, ЕЮ., Власов, ВВ. (2004) Способ выделения рибонуклеиновых кислот. Россия.

192. Morozkin, E.S., Laktionov, P.P., Rykova, E.Y., Vlassov, V.V. (2003) Fluorometric quantification of RNA and DNA in solutions containing both nucleic acids. Anal Biochem 322,48-50.

193. Фримель, X. (1979) Иммунологические методы, Москва.

194. Турчинский, М., Шибаев, ВН. (1970) Органическая химия нуклеиновых кислот. Химия, Москва.

195. Плохинский, Н. (1961) Биометрия. Сибирсое отделение АН СССР.

196. Bremnes, R.M., Sirera, R., Camps, С. (2005) Circulating tumour-derived DNA and RNA markers in blood: a tool for early detection, diagnostics, and follow-up? Lung Cancer 49, 1-12.

197. Hahn, S., Zhong, X.Y., Burk, M.R., Troeger, C., Kang, A., Holzgreve, W. (2001) Both maternal and fetal cell-free DNA in plasma fluctuate. Ann N YAcad Sci 945, 141-4.

198. Labarca, C., Paigen, K. (1980) A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. Anal Biochem 102, 344-52.

199. Schmidt, D.M., Ernst, J.D. (1995) A fluorometric assay for the quantification of RNA in solution with nanogram sensitivity. Anal Biochem 232, 144-6.

200. Haugland, R. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Molecular Probes, Ins.

201. Rykova, E., Pautova, L.V., Yakubov, L.A., Karamyshev, V.N., Vlassov, V.V. (1994) Serum immunoglobulins interact with oligonucleotides. FEBSLett 344,96-8.

202. Барановский, А.Г., Бунева, B.H., Невинский, Г.A. (2004) Дезоксирибонуклеазы человека. Биохимия 69, 587-601.

203. Zhu, G., Chang, Y., Zuo, J., Dong, X., Zhang, M., Hu, G., Fang, F. (2001) Fudenine, a C-terminal truncated rat homologue of mouse prominin, is blood glucose-regulated and can up-regulate the expression of GAPDH. Biochem Biophys Res Commun 281, 951-6.

204. Заридзе, Д.Г. (2002) Эпидемиология, механизмы канцерогенеза и профилактики рака. Архивы патологии 64, 53-61.

205. Rudolph-Owen, L.A., Matrisian, L.M. (1998) Matrix metalloproteinases in remodeling of the normal and neoplastic mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia 3, 177-89.

206. Schmitt, M., Goretzki, L., Janicke, F., Calvete, J., Eulitz, M., Kobayashi, H., Chucholowski, N., Graeff, H. (1991) Biological and clinical relevance of the urokinase-type plasminogen activator (uPA) in breast cancer. Biomed Biochim Acta 50, 731-41.

207. Matrisian, L.M., Sledge, G.W., Jr., Mohla, S. (2003) Extracellular proteolysis and cancer: meeting summary and future directions. Cancer Res 63, 6105-9.

208. Granelli-Pipemo, A., Reich, E. (1978) A study of proteases and protease-inhibitor complexes in biological fluids. J Exp Med 148, 223-34.

209. Neurath H., S.G.W. (1950) Crystalline proteolitic enzymes. Chemical review 46, 69.