Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа

Иванов, Сергей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа"

на правах рукописи УДК 577.2.08

Иванов Сергей Михайлович

РАЗРАЗРАБОТКА ГИДРОГЕЛЕВЫХ МИКРОЧИПОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ БЕЛКАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2007

003054044

Диссертация выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН, на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ).

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный Рубина Алла Юрьевна сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Лившиц Михаил Аронович

заведующий лабораторией физики биополимеров ИМБ РАН.

доктор химических наук, профессор, Несмеянов Владимир Андреевич

заведующий лабораторией иммунохимии ИБХ

Защита состоится « 22 » марта 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г.Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408-57-00, 408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан «__» февраля 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного советаК 212.156.03

РАН

Ведущая организация:

ФГУ «Российский кардиологический паучпо-производствепный комплекс Федерального агентства по здравоохранению п социальному развитию»

к.ф.-м.н., доцент

Брагин В.Е.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В настоящее время белковые микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Для закрепления белков на матрице (микрочипе) используются различные носители, такие как стекло, пластик, различные мембраны, золото, гидрогели и др. Трехмерные гидрогелевые микрочипы, разрабатываемые в Институте молекулярной биологии РАН, обладают существенными преимуществами по сравнению с микрочипами на основе двумерных поверхностей, в особенности для иммобилизации белков. Использование трехмерного геля в качестве носителя при иммобилизации позволяет увеличить количество иммобилизуемого зонда и достичь его равномерного распределения в объеме ячеек. Известно также, что иммобилизация белков в гидрогеле способствует их стабилизации, это справедливо и в отношении гидрогелевых микрочипов.

В данной работе предложен новый метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий значительно упростить технологическую процедуру изготовления микрочипов. В результате проведенных исследований показано, что микрочипы, полученные с помощью предлагаемого метода, обеспечивают оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков и сохранение ими исходной биологической активности. Белковые микрочипы, изготовленные методом полимеризационной иммобилизации, позволяют проводить многопараметрический анализ образца и могут найти применение как в клинической практике, так и в области научных исследований.

Целью исследования является разработка метода получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации и применение разработанных микрочипов для количественного анализа белков. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ иммобилизации белковых молекул в гидрогеле, не приводящий к потере ими биологической активности.

2. Упростить процедуру изготовления микрочипов за счет объединения полимеризации гидрогеля и иммобилизации белков в одну стадию.

3. Показать возможность проведения различных вариантов количественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах.

ДЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В представленной работе показана возможность получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе метода полимеризационной иммобилизации. На примере белка барназы исследовано влияние введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности. Проведено исследование взаимодействия белков с различными гелеобразующими мономерами. Подобраны состав компонентов полимеризационной смеси и условия проведения полимеризации, позволяющие проводить иммобилизацию белков без предварительной модификации. На примере барназы методом MALDI TOF масс-спектрального анализа показано, что иммобилизованный в гидрогеле белок сохраняет ферментативную активность и субстратную специфичность.

На примере взаимодействия барназы с её природным ингибитором барстаром продемонстрирована возможность проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. Данный тип анализа может быть полезен для проведения исследований в области протеомики.

Разработанный метод иммобилизации белков позволил создать микрочипы с иммобилизованными антителами. На полученных микрочипах была показана возможность проведения количественного иммуноанализа на примере ракового эмбрионального антигена (РЭА). Для уменьшения времени проведения и увеличения чувствительности анализа были проведены исследования кинетики образования бинарных и тройных белковых комплексов, и разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе. В результате проведенных исследований были подобраны условия проведения одностадийного сэндвич-иммуноанализа РЭА, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью определять содержание данного маркера в растворах и сыворотках крови. Чувствительность анализа составила 1 нг/мл. Предложенный в работе метод изготовления гидрогелевых микрочипов и разработанный на его основе микрочип для количественного иммуноанализа опухолеассоциированного антигена РЭА могут найти применение для лабораторных и клинических исследований.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы докладывались на XIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (9-12 февраля, 2004, Москва). Отдельные фрагменты диссертационной работы

многократно докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано пять печатных работ. Ссылки на работы даны в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, трех глав (литературного обзора, экспериментальной части и обсуждения), вывода и списка цитированной литературы.

Работа изложена на_страницах машинописного текста, содержит_рисунков и_

таблиц. Библиография включает_наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Белковые микрочипы

Основной задачей данного исследования являлась разработка метода изготовления гидрогелевых белковых микрочипов, обеспечивающего оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков. Для иммобилизации белковых молекул в гидрогеле был выбран метод фотоиндуцируемой сополимеризации. Данный метод подразумевает участие в реакции радикальной полимеризации модифицированного введением непредельной группы белка и гелеобразующих мономеров. В результате сополимеризации белок образует прочную ковалентную связь с образующейся полимерной сеткой гидрогеля. Было опробовано два способа получения сополимеризационных гелевых микрочипов.

На первом этапе работы были использован метод получения белковых гидрогелевых микрочипов включающий стадию предварительной модификации белка введением непредельной группы. На втором этапе работы была решена задача упрощения процесса иммобилизации белков в полимерном носителе. Предложенный метод также основан на фотоиндуцированной сополимеризации, однако модификация белка и полимеризация геля объединены в одну стадию, при этом иммобилизация осуществляется за счет взаимодействия белка с бифункциональными гелеобразующими мономерами.

При выборе объекта для проведения исследований учитывали следующие требования: используемый белок должен обладать биологической активностью, наличие которой после прохождения иммобилизации на микрочипе легко детектировать

(например, ферментативной активностью); выбранный белок должен иметь относительно небольшую молекулярную массу для возможности осуществления масс-спектрального анализа при проведении различных химических модификаций. В результате, в качестве объекта исследования была выбрана внеклеточная рибонуклеозид-З'-трансфераза барназа, состоящая из трех одинаковых субъединид с молекулярной массой 12,3 кДа каждая. Барназа образует прочный эквимолярный комплекс с природным ингибитором барстаром, молекулярная масса которого 10 кДа, что делает эти объекты удобными для проведения MALDITOF MS анализа.

Изготовление гелевых микрочипов

Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры и белки, подлежащие иммобилизации, наносили с помощью робота (QArray, Genetix, Великобритания) в виде регулярного массива микрокапель на стеклянный слайд, стандартное предметное стекло для микроскопии, обработанный специальным реагентом (Bind Silane) для создания на поверхности непредельной группы. Гелевые ячейки (микрокапли) располагаются на гидрофобной поверхности подложки с определенным периодом; число ячеек на микрочипе и их размер определяются задачей и условиями предполагаемого эксперимента. Для флуориметрических измерений изготавливали микрочипы с диаметром ячеек 100 мкм и периодом 300 мкм; микрочипы для MALDI TOF MS анализа изготавливали на кремниевой подложке, с диаметром гелевых ячеек 0,4 мм, на расстоянии 3 мм друг от друга. Полимеризацию проводили под действием УФ-облучения с максимумом при длине волны 350 нм в атмосфере инертного газа.

Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа

Регистрацию результатов анализа осуществляли флуориметрнчески или масс-спектрометрически. Флуоресцентные измерения проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН). Этот прибор, а также специальное программное обеспечение ImaGel (ИМБ РАН) позволяет одновременно анализировать данные со всех элементов микрочипа. Измерения для флуоресцентных красителей Texas Red и Су5 проводили, используя фильтры 595/625 нм и 650/670 нм (возбуждение/регистрация) соответственно.

Для регистрации результатов MALDI-TOF MS анализа была разработана методика прямого MS-анализа непосредственно с гелевых ячеек микрочипа (ИМБ РАН). В работе использовали масс-спектрометр КОМРАСТ-4 (Kratos Analytical, США).

Введение в молекулу барназы непредельных групп

Для иммобилизации барназы в полиакриламидном геле был выбран способ модификации, предполагающий участие в реакции аминогрупп белка. В белок вводили непредельную группу с помощью >1-гидроксисукцинимидного эфира 6-метакриламиногексановой кислоты.

Схема 1. №гидроксисукциниммидный эфир 6-метакриламиногексановой кислоты

Далее модифицированный белок и мономеры геля (такие как: акриламид, 14,Ы'-метиленбисметакриламид и др.) участвовали в реакции полимеризации гидрогеля. Максимальное количество непредельных групп, которое может быть введено в молекулу барназы равно девяти, так как в её структуре содержится восемь лизинов (т.е. 8 е-аминогрупп), а также И-концевая а-аминогруппа, и не содержится цистеинов (т.е. -8Н групп). Варьирование условий модификации (соотношения белок/реагент, рН реакционной смеси и времени реакции) позволяет вводить в белок различное количество непредельных групп. Путём подбора условий реакции в белок вводили от 1 до 9 метакрильных групп; количество введенных непредельных групп оценивали при помощи МАЫЛ ТОР масс-спектрометрии.

Оценка эффективности иммобилизации

Эффективность иммобилизации барназы качественно проверяли с помощью гель-электрофореза. Перед проведением фореза модифицированный белок подвергали предварительной химически индуцируемой сополимеризации с мономерами гидрогеля. Образцы барназы с разной степенью модификации были иммобилизованы в лунках 10% акриламидного геля, в качестве контроля использовали немодифицированный белок. Далее гель с образцами подвергали электрофорезу для удаления не иммобилизовавшегося белка из гелевых лунок. После прохождения фореза и окрашивания геля «Кумасси голубой», визуально определяли эффективность сополимеризации для каждого образца. Было обнаружено, что барназа с различным количеством метакрильных групп полностью остается в лунках, в то время как немодифицированный белок имеет хорошую электрофоретическую подвижность и практически не задерживается в лунке с гелем, т.е.

не иммобилизуется. Из картины фореза также было видно, что количество непредельных групп не влияет на эффективность иммобилизации белка в полиакриламидном геле.

Для количественной оценки эффективности иммобилизации барназы на микрочипе использовали данный белок с введенной флуоресцентной меткой. Были изготовлены микрочипы, в каждой ячейке которых была иммобилизована меченная Texas Red барназа, содержащая определенное количество метакрильных групп. С помощью флуоресцентного микроскопа получали значения интенсивности сигналов от каждой ячейки. Эти значения принимали за 100%. Затем микрочип отмывали от непрореагировавших компонентов полимеризационной смеси, в том числе белка, до постоянного значения флуоресцентных сигналов и рассчитывали эффективность иммобилизации для каждого случая. Было показано, что эффективность иммобилизации не зависит от количества введенных в белок метакрильных групп и составляет для барназы 70-75%. В качестве контроля использовали ячейки, содержащие немодифицнрованную барназу, эффективность иммобилизации которой в данных условиях составила менее 2-3%.

Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности

Для изучения влияния степени модификации белка на сохранение им биологической активности использовали взаимодействие барназы с её природным белковым ингибитором барстаром, с которым она образует прочный эквимолярный комплекс (Касс=10"14М).

Барназа, содержащая различные количества (от одной до девяти) непредельных групп, была иммобилизована в гелевых ячейках микрочипа. После проведения взаимодействия с флуоресцентно-меченым барстаром и отмывки от неспецифически связавшегося белка, были получены значения флуоресцентных сигналов для каждого случая модификации (рис. 1). Для увеличения точности эксперимента при расчетах использовали медианный сигнал от четырех одинаковых ячеек.

Было обнаружено, что биологическая активность модифицированной барназы зависит от количества метакрильных групп, введенных в молекулу белка перед иммобилизацией. Введение пяти и менее пепредельных групп (ряд 3,4) практически не влияет на способность барназы связывать барстар, в то время как введение 9 групп (ряд 2), т.е. модификация всех возможных аминогрупп барназы, приводит к полной потере активности. В качестве контроля использовали ячейки, не содержащие иммобилизованной барназы (ряд 1).

] I 2 3 я 1 35

ф * • 3 2.5 — |

• 1.5

• • 0.5

п П

• • 1 2 3 4

РаС.1 Оценка сохранения активности барназы с различной степенью модификации: (1) ячейки, не содержащие иммобилизованной барназы; (2) ячейки, содержащие барназу с 9 непредельными группами; (3) ячейки, содержащие барназу с 5 непредельными группами; (4) ячейки, содержащие барназу с 1 непредельной группой.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при модификации белка введением непредельных групп в достаточно широком диапазоне (от I до 5) не происходит потери биологической активности необходимо выбирать мягкие условия проведения реакции (борагнът буфер, рИ 9.3, 30 мин при комнатой температуре, молярное отношение белка к реагенту от 1/1 до 1/5), позволяющие вводить в белок такое количество непредельных групп, при котором иммобилизуемая молекула не тсряег своей активности

Метол пол и мер кзацнонной иммобилизации

Следующей задачей было упростить метод изготовления белковых микрочипов, исключии стадию предварительной модификации белка

При исследовании иммобилизации барназы в гелях было обнаружено, что ¡^модифицированный белок также способен в небольшой степени (2-3%) иммобилизоваться. Известно, что при синтезе полимеров методом радикальной полимеризации, независимо от способа ее инициирования (фотохимическое, термическое, радиационное или химическое), реакция протекает через стадии инициирования, роста и обрыва цепи. Такая природа радикальной полимеризации создает благоприятные условия для включения в структуру полимера различных соединений, в том числе, белков, содержащих в своей структуре амиио-, сульфгидрильную или другие активные группы. Возможны, по меньшей мерс, два пути включения; участие в реакции передачи цепи с образованием активных радикалов и участие в реакции нуклеофилъного присоединения к ненасыщенным соединениям, существующим на разных стадиях полимеризации, а

именно, к исходным мономерам, растущим ненасыщенным макрорадикалам и ненасыщенным макромолекулам.

При изготовлении сополимеризационных микрочипов, когда белки иммобилизованы за счет предварительного введения в юс структуру непредельных групп, были использованы гели на основе акриламида с рН полимеризационной смеси 7.0-7.2. Затем было проведено исследование взаимодействия барназы с различными гелеобразующими мономерами в условиях, при которых частично депротонированы Е-аминогруппы лизина. Реакцию проводили в боратном буфере при рН 9.5, температуре 22°С, время реакции 12 ч, при перемешивании. Молярное отношение белка к модифицирующим реагентам составляло 1/1000. После проведения реакции белок очищали гель-фильтрацией на спинколонке с сефадексом 0-25. Количество молекул мономера, введенных в одну молекулу белка, определяли с помощью МАЫЛ ТОР МБ анализа (табл. 1).

Таблица 1. Оценка взаимодействия барназы с различными мономерами гидрогеля.

Название мономера Количество введенных групп Структурные формулы мономеров

акриламид 9 н2 V о

метакриламид 0 I Н2 V О

1^,>Г-метш1енбисакрш1амид 5 Y^v О о

Щ^'-метиленбисметакриламид 0 Y-Y

(2-акрилоилоксиэтил)метакрилат 4 Y^Y

М-(2-акрилоилоксоэтил)-метакриламид 4.5 Y^Y

1Ч,М'-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид 1.7 Y^Y

Исходя из полученных данных, в качестве основного мономера был выбран метахриламид, не взаимодействующий в данных условиях с аминогруппами белка и, соответственно, не выводящий активные группы белка из последующей реакции сополимеризации. В качестве сшивающего бифункционального агента был выбран метиленбисакриламид. При большом избытке гелеобразующих мономеров по отношению к иммобилизуемому белку, а именно такой избыток в смеси для полимеризации, в результате алкилирования е-аминогруппы лизина в белок вводится одна из непредельных групп бифункционального агента, в то время как вторая непредельная группа остается свободной и принимает участие в формировании растущей полимерной структуры.

Состав полимеризационной смеси Т4%С2,5% (где Т% - суммарная масса всех гелеобразующих мономеров к объему геля, С% - отношение веса сшивки к суммарному весу всех гелеобразующих мономеров) был выбран таким образом, чтобы максимально повысить пористость получаемого гидрогеля.

При подобранных условиях для изготовления сополимеризационных микрочипов была получена эффективность иммобилизации белков, сравнимая с эффективностью иммобилизации, получаемой при использовании метода с предварительной модификацией белковых молекул. Было показано, что эффективность иммобилизации не зависит от размера молекулы белка, а в большей степени определяется структурой и аминокислотным составом (таблица 2).

Таблица 2. Эффективности иммобилизации различных белков

Белок Мол. масса (кДа) Эффективность иммобилизации (%)

Иммуноглобулины 150 60-70

Ь-Аспартат аминотрансфераза 90 60

Бычий сывороточный альбумин 67 65

Пероксидаза 44 55

Белок А 42 70

Р-лактоглобулин 18 60

барназа 12 70-75

Исследование ферментативпой активности иммобилизованной на микрочипе барназы

Белок барназа - внеклеточная рибонухлеозид-З'-трансфераза. Барназа специфична по отношению к рибо-О-нуклеотидам, но также способна с меньшей эффективностью расщеплять и другие рибонуклеотиды (рибо-U).

Для проверки ферментативной активности барназы, иммобилизованной на микрочипе, олигонуклеотиды состава 5'-TTGAA-(ph6o-G)-ACT-3'h 5'-TTTT-(pH6o-UU(J)-ТТТТТ-3' наносили на гелевые ячейки микрочипа индивидуально, каждый на отдельную ячейку. После инкубации (Т 22°С) микрочипа был проведен прямой MALDI TOF MS анализ продуктов реакции непосредственно с ячеек микрочипа. В качестве отрицательного контроля использовали ячейки, не содержащие иммобилизованную барназу, на которые также наносили исследуемые олигонуклеотиды. Полное расщепление рибо-О-содержащего олигонуклеотида на ячейках с иммобилизованной барназой произошло менее, чем за 1 мин (рис. 2).

[ACT]"

[5 '-TTGAArGACT]' [5'-TTGAArG]'

1000 1500 2000 2500 3000 3500 масса/заряд

Рис. 2. Масс-спектральный анализ гидролиза 5'-ТТОАА-(рибо-С)-АСТ-3' при комнатной температуре (1 мин), на микрочипе с иммобилизованной барназой: (1) спектр исходного олигонуклеотида, полученный с ячеек не содержащих барназу (контроль); (2) спектр продуктов гидролиза, полученный с ячеек с иммобилизованной барназой.

Гидролиз рибо-и-содержащего олигонуклеотида под действием иммобилизованной барназы протекал менее эффективно чем рибо-й олигонуклеотида, время прохождения реакции превышало несколько часов. При уменьшении температуры до 2°С наблюдали гидролиз рибо-й олигонуклеотида в течении 30 мин: уменьшался пик с массой,

соответствующей исходному олигонуклеотиду (m/z 2750) и увеличивался пик с массой, соответствующей 5'-TTGAA-pn6o-G фрагменту (m/z 1928) (рис.3).

[5'-TTGAArG]"

[5'-TTGAAiGACT]'

1500

3500

4000

2000 2500 3000 масса/заряд

Рис. 3. Масс-спектральный анализ гидролиза 5'-ТГОАА-(рибо-0)-АСТ-3' при температуре 2°С , время инкубации: 2 {1), 5 (2), 20 (3) и 25 (4) мин.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что иммобилизованная в гелевых элементах микрочипа барназа сохраняет не только ферментативную активность, но и субстратную специфичность.

Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах

Для прямого масс-спектрального анализа барстара были изготовлены микрочипы с иммобилизованной в различных концентрациях (от 1 до 100 мкг/мл) барназой. После инкубации микрочипов с раствором барстара и отмывки от неспецифически сорбировавшегося белка, проводили элюирование в условиях, разрушающих комплекс, образованный барстаром с иммобилизованной барназой. Микрочип обрабатывали насыщенным раствором матрицы для MALDI TOF MS анализа (sinapinic acid) в растворе 10% муравьиной кислоты в 30%-ном водном ацетонитриле, выдерживали 20 мин при комнатной температуре во влажной камере, и затем высушивали на нагревательном столике при 40°С. Далее проводили прямой масс-спектральный анализ с каждого гелевого элемента микрочипа, и идентифицировали белок по его молекулярной массе и способности связываться с иммобилизованным лигандом (рис 4).

В результате было обнаружено, что наблюдается корреляция между абсолютной интенсивностью пиков молекулярных ионов барстара и концентрацией иммобилизованной барназы. Масс-спектры с гелевых ячеек, не содержащих иммобилизованную барназу, но инкубированных с раствором барстара, не содержали пиков, соответствующих молекулярной массе барстара.

10363

масса/заряд

Рис. 4. Прямой масс-спектралъный анализ барстара на микрочипе с иммобилизованной барназой: (1) концентрация иммобилизованной барназы 100 мкг/мл (интенсивность 1=21мВ); (2) концентрация иммобилизованной барназы 10 мкг/мл (интенсивность 1=2.5 мВ); (3) концентрация иммобилизованной барназы 1 мкг/мл (интенсивность 1=1.2 мВ).

Полученные данные свидетельствуют о возможности проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. Такой анализ не требует введения флуоресцентной или другой метки в исследуемый белок, что особенно важно при анализе минорных белков в образцах, содержащих большое количество различных белков (сывороток крови, лизатов и др.). Данный тип анализа может быть полезен для проведения исследований в области протеомики.

Разработка процедуры сэндвич-иммуноапализа на белковых микрочипах (на примере РЭА)

В клинической практике и научных исследованиях количественное определение многих белков выполняется с помощью твердофазного иммуноферментного анализа

(ИФА), основанного на использовании специфических к исследуемому белку антител. Для практических целей представлялось интересным разработать процедуру проведения иммуноанализа на белковых микрочипах.

Известно, что наиболее чувствительным из возможных типов иммуноанализа является сэндвич-иммуноанализ с использованием антител, специфичных к разным эпитопам белковой молекулы. В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда (образец) содержит антиген, и на первой стадии происходит образование специфического бинарного комплекса антиген-иммобилизованное антитело. После завершения инкубации с антигеном и отмывки микрочипа от неспецифически связавшегося белка микрочип обрабатывают проявляющими флуоресцентно мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антигена. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше регистрируемый флуоресцентный сигнал. В результате получают график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих антитела, от концентрации антигена в растворе (калибровочную кривую), по которой далее определяют неизвестную концентрацию антигена в исследуемом образце.

В качестве объекта для разработки иммуноанализа на микрочипах был выбран широко используемый серологический онкомаркер - раковый эмбриональный антиген (РЭА). Уровень РЭА при развитии опухолей различной локализации повышается в крови и отражает состояние злокачественного процесса. Падение уровня РЭА является показателем эффективности проводимого лечения, а вторичный подъем свидетельствует о развитии рецидива и метастазировании. РЭА представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 175-200 кДа. Одна из существенных особенностей его молекулярной структуры - высокое (до 60 %) содержание углеводов, что определяет высокую гетерогенность его физико-химических свойств.

Чтобы осуществить иммуноанализ на микрочипе, необходимо было выбрать пару специфических моноклональных антител к различным эпитопам РЭА, и определить, какие именно антитела должны быть иммобилизованы на микрочипе, а какие - выступать в качестве проявляющих. Для работы использовали пару моноклональных антител СЕА-1 и СБА-10 (CanAg, Швеция), рекомендованную к использованию в стандартном варианте твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетах.

Были изготовлены микрочипы, содержащие ячейки с иммобилизованными антителами СЕА-1, СЕА-10 в равных концентрациях, и ячейки, не содержащие иммобилизованных белков (для контроля неспецифических взаимодействий). На микрочипе проводили кинетические измерения взаимодействия флуоресцентно меченого

красителем цианиновым-5 (Су5, АтегеИат, Великобритания) антигена РЭА (концентрация 200 нг/мл) с иммобилизованными антителами. Как видно из кинетических кривых (рис. 5), образование бинарного комплекса РЭА-Су5 с иммобилизованными антителами СЕА-1 происходит значительно быстрее (интенсивность флуоресцентного сигнала прямо пропорциональна концентрации белкового комплекса), чем с иммобилизованными антителами СЕА-10.

0 -1-1-1-1

О 10 20 30 40

время, ч

Рис.5 Кинетические кривые взаимодействия иммобилизованных антител с флуоресцентно-меченным антигеном: (1) иммобилизованы антитела СЕА-1; (2) иммобилизованы антитела СЕА-10.

Поскольку концентрации иммобилизованных антител СЕА-1 и СЕА-10 одинаковы, то из формулы [АВ] = Кая[А][В], где концентрация комплекса пропорциональна флуоресцентному сигналу, видно, что антитела СЕА-1 обладают большей аффинностью к антигену, чем антитела СЕА-10. Поэтому в качестве антител для иммобилизации были выбраны СЕА-1, а в качестве проявляющих антител были выбраны СЕА-10.

Для подтверждения правильности выбора пары антител был проведен также сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах с иммобилизованными антителами СЕА-1 и СЕА-10 в равных концентрациях. В качестве проявляющих антител использовали СЕА-10-Су5 и СЕА-1-Су5 также в равных концентрациях. Полученные калибровочные кривые подтвердили правильность выбора пары антител для проведения сэндвич-иммуноанализа РЭА (рис. 6).

концентрация РЭА, нг/мл

Рис.6. Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа РЭА: (1) пара СЕА-1/СЕА-10-Су5 (антитела для иммобилизации СЕА-1) (2) пара СЕА-10/ СЕА-1-Су5 (антитела для иммобилизации СЕА-10).

Подбор условий проведения иммуноанализа

Для оптимизации процедуры иммуноанализа было исследовано влияние температуры реакционной смеси. Микрочипы, содержащие иммобилизованные антитела СЕА-1, инкубировали с раствором РЭА (в концентрациях от 0.5 до 40 нг/мл) в течение 17 ч при различных температурах. После отмывки, микрочипы инкубировали в течение двух часов с флуоресцентно мечеными антителами СЕА-10-Су5 при температуре 20°С. В результате были получены зависимости интенсивности флуоресценции гелевых ячеек с иммобилизованными антителами от концентрации РЭА в растворе (калибровочные кривые) для различных температур (рис.7).

Рис.7. Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа РЭА на микрочипах, полученные для различных температур: (1) температура инкубации 37°С; (2) температура инкубации 23°С; (3) температура инкубации 4°С.

О 5 10 15 20 25 30 35 40

концентрация РЭА, нг/мл

Как видно из рисунка 7, при увеличении температуры инкубации с антигеном до 37°С, значения флуоресцентных сигналов от гелевых ячеек с иммобилизованными на микрочипе антителами увеличиваются. Необходимо отметить, что фоновый сигнал при всех температурах оставался постоянным. В дальнейших экспериментах для увеличения чувствительности анализа инкубацию на микрочипах проводили при температуре 37°С.

Одностадийный сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах

Для практических приложений важно, чтобы протокол проведения анализа был наиболее простым. Разработанный ранее протокол проведения сэндвич-анализа включал две стадии: инкубацию антигена с иммобилизованными на микрочипе антителами (17 ч) и связывание проявляющих флуоресцентно меченых антител с образованным на микрочипе бинарным комплексом (2 ч). После каждой стадии необходимо производить отмывку микрочипов от неспецифически сорбировавшегося белка. Для упрощения процедуры анализа объединили в одну стадию инкубацию микрочипа с антигеном и флуоресцентно мечеными антителами. Смесь каждой из концентраций антигена с проявляющими антителами инкубировали на микрочипе в течение 17 ч при 37°С. В результате было обнаружено, что такой протокол проведения анализа позволяет не только добиться результатов, сравнимых с двустадийным анализом, но и повысить чувствительность анализа (рис. 8).

концентрация РЭА, нг/мл

Рис. 8. Сравнение калибровочных кривых сэндвич-иммуноанализа РЭА: (1) одностадийный анализ; (2) двустадийный анализ.

Увеличение чувствительности анализа можно объяснить увеличением времени взаимодействия антигена с проявляющими антителами. Ранее было показано, что константа ассоциации иммобилизованных антител (СЕА-1) с антигеном существенно выше константы ассоциации РЭА с проявляющими антителами (СЕА-10). Увеличение времени взаимодействия антигена с проявляющими антителами с двух часов до семнадцати часов позволило добиться увеличения сигнала.

Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови

С использованием микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела СЕА-1, получили калибровочную кривую для РЭА в диапазоне концентраций от 0 нг/мл до 75 нг/мл. На аналогичных микрочипах по полученной калибровочной кривой провели определение концентраций РЭА в трех образцах сывороток крови. Эксперимент проводили в 5-и повторах. В качестве референсных значений использовали значения концентраций РЭА в этих же образцах, измеренные с помощью ИФА набора фирмы CanAg (Швеция).

Калибровочная кривая с нанесенными на неё величинами интенсивности флуоресцентного сигнала от образцов сывороток крови представлена на рис. 9. Для точек, соответствующих образцам сывороток крови, по оси абсцисс отложены значения концентраций, измеренных ИФА; по оси ординат отложены значения флуоресцентных сигналов, полученные на микрочипах, указаны стандартные отклонения.

концентрация РЭА, нг/мл

Рпс. 9. Сэндвич-иммуноаиализ сывороток, содержащих РЭА, А - точки, соответствующие образцам сывороток крови

Как видно из рисунка, данные, полученные на микрочнпак и с помощью ИФА, хорошо коррелируют между собой. Таким образом было показано, что методом сэндгшч-иммуноанашоа на микрочипах можно определять значение концентраций антигена в клиническом образце.

Ускорение иммуноаналнза на микроннпе с помощью мбхянического перемешивания обрата

Микрочины, используемые для анализа, должны удовлетворять двум условиям: давать возможность анализировать низкие концентрации вещества, при этом анализ должен занимать минимально возможное время.

Кинетические исследования показали, что взаимодействие антигена с иммобилизованными на микрочипе антителами происходит довольно медленно, сигнал не выходит на насыщение лаже за 40 ч (рис.5). Скорость кинетики насыщения определяется величиной константы ассоциации образуемого бинарного комплекса «иммобилизованное антитело-антиген» и скоростью диффузии антигена- Эта стадия является лимитирующей при проведении им м у но анализа на микрочипе. Для уменьшения времени диффузии и, следовательно, времени проведения анализа было выбрано механическое перемешивание образца на микрочипе. Для этого была разработана специальная камера, содержащая две микротрубочки для подвода раствора образца (рис. 10А), а также был модифицирован перистальтический насос для совершения возвратно-поступательных движений, что позволило перемешивать исследуемый образец без существенного увеличения объема.

Рве. ю. (А) - фотография камеры для перемешивания, (1>) - схематический рисунок камеры.

На микрочипе с иммобилизованными антителами СИА-1 были получены кинетические кривые реакции образования комплекса «антиген-им мобил изо ванное» шшггало с флуоресцентно меченым РЭА (С - 200 иг/мл) для диффузионно-реакционной

кинетики (без перемешивания) и кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса.

Реакционную смесь общим объемом 225 мкл, содержащую РЭА-Су5, заливали в камеру через встроенные трубки при помощи пипетки, причем 75 мкл смеси находилось в камере, а оставшиеся 150 мкл распределены между трубками. Если эксперимент проводился без перемешивания, то трубки герметично замыкались друг на друга. Флуоресцентный сигнал от каждого гелевого элемента измеряли с выдержкой 1 сек с интервалом в 60 сек в течение всего эксперимента. Для перемешивания реакционной смеси в камере встроенные трубки присоединяли к модифицированному перистальтическому насосу Minipulse 2 (Gilson, France). Перемешивания реакционной смеси достигали автоматическим переключением направления потока с прямого на обратное каждые 2 сек. Скорость потока в камере варьировали от 2 до 7 мл/мин. Все эксперименты для данной концентрации антигена и данной скорости потока проводились дважды. Результаты эксперимента представлены на рис. 11.

Как видно из рисунка, время выхода на насыщение флуоресцентного сигнала уменьшается с 90 ч (без перемешивания) до 25 ч (с перемешиванием).

О 20 40 60 80 100

время, ч

Рис. 11. Кинетика образования бинарного комплекса флуоресцентно меченного РЭА с иммобилизованными антителами: (1) с перемешиванием образца; (2) без перемешивания образца.

Кроме того, было показано, что при увеличении скорости перемешивания время выхода на насыщение также уменьшается, т.е. даже при максимально возможной скорости потока (~ 7 мл/мин) не происходит механической денатурации белкового комплекса и

вымывания антигена из ячеек микрочипа. Поэтому в дальнейшей работе использовали максимальную из доступных скоростей перемешивания образца.

Получение калибровочных кривых при проведении анализа с механическим перемешиванием образца

Разработанную систему перемешивания образца на микрочипе использовали для получения калибровочных кривых при проведении одностадийного сэндвич-иммуноанализа РЭА. В качестве контроля в этом же эксперименте были получены калибровочные кривые для одностадийного сэндвич-иммуноанализа РЭА без перемешивания инкубационной смеси. Для одновременного перемешивания нескольких образцов камеры соединяли последовательно, а исследуемые образцы разделяли воздушной пробкой, таким образом, на каждом микрочипе реакции с перемешиванием проходили в одних и тех же условиях (температура, скорость, время). На рис.12 представлены калибровочные кривые, полученные при перемешивании образца и без перемешивания. Инкубацию образцов на микрочипах проводили равное количество времени.

Рис. 12. Калибровочные кривые иммуноанализа РЭА: (1) с перемешиванием образца; (2) без перемешивания образца.

Как видно из рисунка, перемешивание образца приводит к значительному возрастанию флуоресцентных сигналов, при этом не происходит увеличения фонового сигнала. Проведенные исследования показали, что использование системы перемешивания позволяет значительно сократить время анализа без потери чувствительности.

10 20 30 40

концентрация РЭА, нг/мл

Выводы:

1. Разработан метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий проводить иммобилизацию белка без его предварительной модификации.

2. Продемонстрировано сохранение исходной биологической активности иммобилизованных на микрочипах белков на примере белка барназы и антител.

3. Продемонстрирована возможность проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах.

4. Разработана процедура одностадийного сэндвич-иммуноанализа ракового эмбрионального антигена, позволяющая с высокой чувствительностью определять содержание данного онкомаркера в растворах и сыворотках крови.

5. Разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе.

Публикации автора

1. Рубина А.Ю., Паньков C.B., Иванов С.М., Дементьева Е.И. и Мирзабеков А.Д.// Белковые микрочипы. //Доклады Академии Наук, 2001, N5, том. 381, С. 701-704.

2. A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, A.A. Stomakhin, E.L. Darii, S.V. Pan'kov, V.E. Barsky, S.M. Ivanov, E.V. Konovalova, and A.D. Mirzabekov. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. //Biotechniques 34:1008-1022 (May 2003).

3. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Стомахин A.A., Иванов С.М., Крейндлин Э.Я., Иванов Д.С., Родин Д.В., Деев С.М., Прасолов B.C. и Мирзабеков А.Д. Белковые микрочипы: анализ экспрессии рекомбинантного Барстара. //Доклады Академии Наук, 2003, N1, том. 393, С. 116-120.

4. D.A. Zubtsov, S.M. Ivanov, A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, V.R. Chechetkin, A.S. Zasedatelev. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips. //Journal ofBiotechnology 122: 16-27 (2006).

5. Иванов C.M., Рубина А.Ю. Разработка методов иммобилизации белков в гелевых микрочипах. Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимняя молодежная научная школа школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 9-12 февраля 2004г. С. 17-18.

Принято к исполнению 14/02/2007 Исполнено 15/02/2007

Заказ № 104 Тираж: 75 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Иванов, Сергей Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Изготовление микрочипов.

1.2 Иммобилизация белков.

1.2.1 Адсорбционная иммобилизация.

1.2.2 Химическая (ковалентная) иммобилизация белков.

1.2.2.1 Иммобилизация по аминогруппам белка.

1.2.2.2 Иммобилизация по сульфгидрильным группам белка.

1.2.2.3 Иммобилизация через декстрановые спейсеры.

1.2.3 Иммобилизация за счет комплексообразования.

1.2.4 Иммобилизация в пористых средах.

1.2.5 Иммобилизация белков на трехмерных гидрофильных носителях.

1.2.6 Иммобилизация на полимерных носителях.

1.2.7 Иммобилизация в полиакриламидном геле.

1.3 Применение микрочипов.

1.3.1 Аналитические микрочипы.

1.3.2 Функциональные микрочипы.

1.3.2.1 Белок-белковые взаимодействия.

1.3.2.2 Белок-липидные взаимодействия.

1.3.2.3 Белок-ДНК - взаимодействия.

1.4 Модельные белки.

1.4.1 Барназа.

1.4.2 Раково-эмбриональный антиген (РЭА).

1.5 Методы ускорения анализа на микрочипах.

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Приборы и реактивы.

2.2 Изготовление белковых микрочипов.

2.3 Окрашивание белков флуоресцентными красителями.

2.4 Флуоресцентные измерения на чипах.

2.5 Введение метакрильных групп в белок.

2.6 Оценка эффективности иммобилизации барназы на микрочипе.

2.7 Оценка сохранения биологической активности модифицированной барназы на примере взаимодействия с барстаром.

2.8 Модификация белка мономерами геля.

2.9 Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы методом МАЫЖГОР МБ.

2.10 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах.

2.11 Определение содержания рекомбинантного барстара в лизатах клеткок.

2.12 Сэндвич-иммуноанализ РЭА.

2.13 Кинетические измерения на микрочипах.

ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Белковые микрочипы.

3.2 Изготовление гелевых микрочипов.

3.3 Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа.

3.4 Введение в молекулу барназы непредельных групп.

3.5 Оценка эффективности иммобилизации.

3.6 Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности.

3.7 Метод полимеризационной иммобилизации.

3.8 Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы.

3.9 Количественный флуориметрический анализ барстара на микрочипах.

ЗЛО Определение содержания рекомбинатного барстара в лизатах клеток.

3.11 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах.

3.12 Разработка процедуры сэндвич-иммуноанализа на белковых микрочипах (на примере РЭА).

3.13 Подбор условий проведения иммуноанализа.

3.14 Одностадийный сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах.

3.15 Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови.

3.16 Ускорение иммуноанализа на микрочипе с помощью механического перемешивания образца.

3.17 Зависимость интенсивности сигнала и времени выхода на насыщение кинетической кривой от скорости перемешивания на перистальтическом насосе.

3.18 Получение калибровочных кривых при проведении анализа с механическим перемешиванием образца.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа"

В настоящее время белковые микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Для закрепления белков на матрице (микрочипе) используются различные носители, такие как стекло, пластик, мембраны, золото, и др. Для иммобилизации белковых молекул на носителях применяют различные способы: белки могут быть адсорбированы на носителе (физическая иммобилизация) или ковалентно связаны с носителем (химическая иммобилизация). В большинстве случаев, основной проблемой при создании белковых микрочипов является тот факт, что для сохранения структуры и биологических функций молекулы белков нуждаются в гидрофильном окружении, максимально приближенном к естественным условиям их функционирования. Поэтому, несмотря на большое количество разработанных способов иммобилизации и предлагаемых для изготовления микрочипов носителей, это ограничение создает большие сложности для создания устойчиво работающих и долго хранящихся двумерных белковых микрочипов.

Трехмерные гидрогелевые микрочипы, разрабатываемые в Институте молекулярной биологии РАН, обладают существенными преимуществами по сравнению с микрочипами на основе двумерных поверхностей, в особенности для иммобилизации белков. Использование трехмерного геля в качестве носителя при иммобилизации позволяет увеличить количество иммобилизуемого зонда и достичь его равномерного распределения в объеме ячеек. Известно также, что иммобилизация белков в гидрогеле способствует их стабилизации, это справедливо и в отношении гидрогелевых микрочипов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Иванов, Сергей Михайлович

выводы

5. Разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубок) благодарность моему научному руководителю Алле Юрьевне Рубиной за чуткое руководство, внимание и неоценимую помощь в подготовке материалов диссертации. Я искренне благодарен Марии Вадимовне Цыбульской и Екатерине Игоревне Дементьевой за помощь и советы. Выражаю глубокую признательность всей группе белковых микрочипов: Коноваловой Лизе, Филипповой Марине, Савватеевой Лене, Зубцовой Жанне и Зубцову Дмитрию за помощь в работе и дружеское участие. Благодарю Андрея Александровича Стомахина за помощь в получении масс-спектральных данных и их обсуждении, а также за помощь в разработке приборов для исследований. Выражаю признательность группе производства: Сергею Панькову, Маше Грачевой, Кириллу Евсееву и Эдуарду Яковлевичу Крейндлину за подготовку микрочипов для проведения экспериментов; группе математиков: Турыгину Александру, Юрасову Роману и Чечеткину Владимиру за помощь в обсуждении результатов исследований, а так же группе инженеров: Юрасову Дмитрию и Черепанову Алексею за помощь в изготовлении приборов для работы. Выражаю благодарность Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Приношу огромную благодарность моим родителям и всем моим друзьям за дружескую поддержку и участие.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Иванов, Сергей Михайлович, Москва

1. Lueking A., Horn М., Eickhov Н., Bussow К., Lehrach Н., Walter G. Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Anal. Biochem 1999, 270:103-111.

2. Macbeth G., Schreiber S.L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science 2000, 289: 1760-1763.

3. Newman J.D., Turner A.P.F. Ink-jet printing for the fabrication of amperometric glucose biosensors. Anal. Chim. Acta. 1992, 262:13-17.

4. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. High-density oligonucleotide arrays. Biosensors&Bioelectronics 1996, 11:687-690.

5. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., van Dedem G.W.K. Picoliter dispensing in wells of a micro-array by means of electrospraying. Journal of Aerosol Science 1999,30:551-552.

6. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., Schalkhammer Т., van Dedem G.W.K. Miniaturized electrospraying as a technique for the production of reproducible micrometer-sized protein spots. Anal Chem. 2001, 73:2183-2189.

7. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method for mass fabrication of mono- and multi-component microarrays of biological and biologically active substance. Anal. Chem. 1999, 71:3110-3117.

8. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method to fabricate functionally active protein films 1999. Anal. Chem., 71:1415-1420.

9. Kumar A., Whitesides G.M. Appl. Phia. Lett. 1993, 63:2002.

10. Lahiri J., Ostuni E., Whitesides G.M. Patterning ligands on reactive SAMs microcontact printing. Langmuir 1999, 15:2055-2060.

11. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug Disc. AOP, published online 17 March 2006; doi:10.1038/nrd2006.

12. Frei E, Levy A, Gowland P, Noll M. Efficient transfer of small DNA fragments from polyacrylamide gels to diazo or nitrocellulose paper and hybridization. Methods Enzymol. 1983:100:309-26.

13. Hengsakul M., Cass A.E.G. Protein patterning whis a photoactivatable derivative of biotin. Bioconjugate Chem 1996, 7: 249-254.

14. Pirrung M.C., Huang, C.Y. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. Bioconjug Chem. 1996 May-Jun;7(3):317-21

15. Van der Veen M, Norde W, Stuart MC. Electrostatic interactions in protein adsorption probed by comparing Iysozyme and succinylated Iysozyme. Colloids SurfB Biointerfaces. 2004 May l;35(l):33-40.

16. Chapman R.G., Ostuni E., Takayama Sh., Holmlin R.E., Yan L., Whitesides G.M. Surveying for surface that resist the adsorption of proteins. J. Am. Chem. Soc. 2000,122:8303-8304.

17. Norde W., Zoungana T. Surface-induced change in the structure and activity of enzymes physically immobilized at solid/liquid interface. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998, 28:133-143.

18. Wu J, Luan M, Zhao J. Trypsin immobilization by direct adsorption on metal ion chelated macroporous chitosan-silica gel beads. Int J Biol Macromol. 2006 Nov 15;39(4-5): 185-91. Epub 2006 Mar 22.

19. Haab B.B., Duhman M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific protein and antibodies in complex solutions. Genom Biology 2001, 2(2) research 0004.1-0004.13

20. Naviroj S., Culler S.R., Koenig J.L., Ishida H. Structure and adsorption characteristics of silane coupling agents on silica and e-glass fiber: dependence on pH. J. Colloid Interface Sci 1984, 97,308-317.

21. Falsey JR, Renil M, Park S, Li S, Lam KS. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays. Bioconjug Chem. 2001 May-Jun;12(3):346-53.

22. Zhang G, Zhou Y, Wu X, Yuan J, Ren S. Covalent attachment of DNA to glass supports using a new silane coupling agent and chemiluminescent detection. J Tongji Med Univ. 2000;20(2):89-91.

23. Elam JH, Nygren H, Stenberg M. Covalent coupling of polysaccharides to silicon and silicon rubber surfaces. J Biomed Mater Res. 1984 Oct;18(8):953-9.

24. Mansur HS, Orefice RL, Vasconcelos WL, Lobato ZP, Machado LJ. Biomaterial with chemically engineered surface for protein immobilization. J Mater Sci Mater Med. 2005 Apr;16(4):333-40.

25. Flemming C, Gobel H, Wand H, Gabert A, Bock W. Synthesis andproperties of immobilized enzymes. X. Covalent binding of polygalacturonase toinsoluble carriers Acta Biol Med Ger (1978) 37(2): 179-89.

26. Liao WH, Lee WC. Immobilization of enzymes on methacrylamide-based copolymers. Prep Biochem Biotechnol. 1997 Feb;27(l):39-46.

27. Гайер Г. Электронная гистохимия. Под ред. Бухвалова И.Б. "Мир" Москва,С 10-14.

28. Nuzzo R.G., Allura D.L. Adsoфtion of bifunctional organic disulfides on gold surface. J. Amer. Chem. Soc. 1983, 105: 4481-4483.

29. Brockman A.H., Orlando R. New immobilization chemistry for probe affinity mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrum. 1996, 10:1688-1692.

30. Duncan RJ, Weston PD, Wrigglesworth R. A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassay. Anal Biochem. 1983 Jul 1; 132(1 ):68-73.

31. Peeters JM, Hazendonk TG, Beuvery EC, Tesser GI. Comparison of four bifunctional reagents for coupling peptides to proteins and the effect of the three moieties on the immunogenicity of the conjugates. J Immunol Methods. 1989 Jun 2;120(l):133-43.

32. Goff DA, Carroll SF Substituted 2-iminothiolanes: reagents for the preparation of disulfide cross-linked conjugates with increased stability. Bioconjug Chem. 1990 Nov-Dec;l(6):381-6.

33. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. Acad. Press: San Diego, New York, Boston 1996.

34. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with

35. DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Dec;74(12):5350-5354;94

36. Scott JE, Hughes EW, Shuttleworth A. An 'affinity' method for preparing polypeptides enriched in the collagen-associated Ehrlich chromogen. J Biochem (Tokyo). 1983 Mar;93(3):921-5.

37. Matsuura K, Akasaka T, Hibino M, Kobayashi K. Facile synthesis of stable and lectin-recognizable DNA-carbohydrate conjugates via diazo coupling. Bioconjug Chem. 2000 Mar-Apr; 11 (2):202-11.

38. Liu XC, Scouten WH. (1996) Studies on oriented and reversible immobilization of glycoprotein using novel boronate affinity gel. J Mol Recognit., 9(5-6):462-467.

39. Lee S.H., Ruckenstein E. Adsorption of protein onto polymeric surfaces of different hydrophylicities a case study with BSA. J. Colloid and Interface Sci 1988,125:365-379.

40. Balcells M., Klee D., Fagry M., Hocker H. Quantitative assessment of protein adsorption by combination of ELISA with radioisotope-based studies. J. Colloid and Interface Sci 1988, 125:365-379.

41. Kulaev DV, Zuevsky VV, Tsybulskaya MV Use of silica matrix for immunosorbent preparation. Artif. Organs (1987), v. 11, № 6, p. 503-504.

42. Хохлова ТД, Гаркавенко ЛГ, Никитин ЮС Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах. Прикл. Биохим. Микробиол. (1991) 27(5):720-4.

43. Hong J, Xu D, Gong P, Ma H, Dong L, Yao S. Conjugation of enzyme on superparamagnetic nanogels covered with carboxyl groups. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Jan 19; Epub ahead of print.

44. Turkova J, Petkov L, Sajdok J, Kas J, Benes MJ. Carbohydrates as a tool for oriented immobilization of antigens and antibodies. J Chromatogr., 500:585593 (1990).

45. Turkova J, Blaha K, Malanikova M, Vancurova D, Svec F, Kalal J. Methacrylate gels with epoxide groups as supports for immobilization of enzymes in pH range 3-12. Biochim Biophys Acta. 1978 May 11;524(1):162-169.

46. Smalla K, Turkova J, Coupek J, Hermann P. Influence of salts on the covalent immobilization of proteins to modified copolymers of 2-hydroxyethyl methacrylate with ethylene dimethacrylate. Biotechnol Appl Biochem. 1988 Feb; 10(1):21-31.

47. Bryjak J, Trochimczuk A, Noworyta A. Effect of polymer matrix on penicillin acylase immobilization on copolymers of butyl acrylate and ethylene glycol dimethacrylate. J Chem Technol Biotechnol.1993;57(l):73-8.

48. Kasper C, Reif OW, Freitag R. Evaluation of affinity filters for protein isolation. Bioseparation (1996), 6(6):373-382.

49. Zaharieva EI, Georgiev GG, Konstantinov CI. Coated reactive carriers based on copolymers of l-vinyl-2-pyrrolidone and maleic anhydride for immobilization of enzymes. Biomaterials. 1996 Aug; 17(16): 1609-1613.

50. Liao WH, Lee WC. Immobilization of enzymes on methacrylamide-based copolymers. Prep Biochem Biotechnol. 1997 Feb;27(l):39-46.

51. Hamarat S, Uslan AH. Immobilization of urease on activated methoxypolyethyleneglycol-5000. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 1996 May;24(3):273-83.

52. Tiller J, Berlin P, Klemm D. A novel efficient enzyme-immobilization reaction on NH2 polymers by means of L-ascorbic acid. Biotechnol Appl Biochem. 1999 0ct;30 (Pt 2): 155-62.

53. Aksoy S, Tumturk H, Hasirci N. Stability of alpha-amylase immobilized on poly(methyl methacrylate-acrylic acid) microspheres. J Biotechnol. 1998 Feb 5;60(l-2):37-46.

54. Yi SJ, Yuk JS, Jung SH, Zhavnerko GK, Kim YM, Ha KS. Investigation of selective protein immobilization on charged protein array by wavelength interrogation-based SPR sensor. Mol Cells. 2003 Jun 30;15(3):333-40.

55. Krysteva MA, Shopova BI, Yotova LY, Karasavova MI. Covalent binding of enzymes to synthetic membranes containing acrylamide units, using formaldehyde. Biotechnol Appl Biochem. 1991 Feb; 13(1): 106-11

56. Allcock HR, Pucher SR, Visscher KB. Activity of urea amidohydrolase immobilized within poIydi(methoxyethoxyethoxy)phosphazene. hydrogels. Biomaterials. 1994 Jun;15(7):502-506.

57. Schnaar RL, Langer BG, Brandley BK. Reversible covalent immobilization of ligands and proteins on polyacrylamide gels. Anal Biochem. 1985 Dec; 151 (2):268-281.

58. Kennedy JF, Kalogerakis B. Immobilization of glucoamylase on gelatin by transition-metal chelation. Biochimie. 1980;62(8-9):549-561.

59. Patel MP, Braden M. Cross-linking and ring opening during polymerization of heterocyclic methacrylates and acrylates. Biomaterials. 1989 May;10(4):277-80.

60. Sipehia R, Chawla AS, Daka J, Chang TM. Immobilization of enzymes on polypropylene bead surfaces by anhydrous ammonia gaseous plasma technique. J Biomed Mater Res. 1988 May;22(5):417-22.

61. Onyezili FN. The enzyme coupling process in urease immobilization on O-alkylated nylon tubes. J Biochem Biophys Methods. 1988 Aug;16(4):255-62.

62. Roig MG, Kennedy JF, Garaita MG. Immobilization of carbohydrases on epoxide-, isocyanate-, acid chloride-, and carboxylic acid-activated plastic supports. J Biomater Sci Polym Ed. 1994;6(7):661-73.

63. Zhou SP, Wang XR, Qin SY, Lin ZX, Liu JH. Preparation andapplication of gel chip. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2003 Sep;19(5):577-80.98

64. Arenkov P. Kukhtin A. Gemmel A. Voloshuk S. Chupeeva V. Mirzabekov A. Protein microchip: use for immunoassay and enzymatic reaction. Anal. Biochem. 2000,278:123-131.

65. Haab, B. B., Dunham, M. J., and Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biol. (2001) 2, 1-13.

66. Huang, R.-P., Huang, R., Fan, Y., et al. Simultaneous detection of multiple cytokines from conditioned media and patient's sera by an antibody-based protein array system. Anal. Biochem. (2001) 294, 55-62

67. Schweitzer, B., Roberts, S., Grimwade, B., et al. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol (2002) 20, 359-365

68. Hall DA, Zhu H, Zhu X, Royce T, Gerstein M, Snyder M. Regulation of gene expression by a metabolic enzyme. Science. 2004 Oct 15;306(5695)

69. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, Mills GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet, 2002, Feb 16;359(9306):572-7

70. Anderson, NL, Anderson, NG The Human Plasma Proteome. Molecular&Cellular Proteomics lA845-867, 2002

71. Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 1995 Mar;59(l):94-123

72. Silzel JW, Cercek B, Dodson C, Tsay T, Obremski RJ. Mass-sensing, multianalyte microarray immunoassay with imaging detection. Clin Chem. 1998 Sep;44(9):2036-43

73. Mitchell P. A perspective on protein microarrays. Nature Biotechnology Vol.20 march 2002 225-229

74. Borrebaeck C.A.K. Antibodies in diagnostics from immunoassays to protein chips. Immunology today. Vol.21 No.8 (2000) 379-382

75. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий E.JI. и др. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухоле-ассоциированных маркеров. ДАН. 2004, т. 395, с. 542-547.

76. Sun Z, Fu X, Zhang L, Yang X, Liu F, Hu G. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. Anticancer Res. 2004 Mar-Apr; 24(2C):1159-65.

77. Rucker VC, Havenstrite KL, Herr AE. Antibody microarrays for native toxin detection.Anal Biochem. 2005 Apr 15;339(2):262-70

78. Hueber W, Utz PJ, Steinman L, Robinson WH Autoantibody profiling for the study and treatment of autoimmune desease. Arthritis Res. 4, 290-295.

79. Hueber W, Utz PJ, Robinson WH. Autoantibodies in early arthritis: advances in diagnosis and prognostication. Clin Exp Rheumatol. 2003 Sep-Oct;21(5 Suppl 31):S59-64.

80. Robinson WH et al. Autoantigem microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature Med., 8, 295-301 (2002).

81. Joos TO, Schrenk M, Hopfl P, Kroger K, Chowdhury U, Stoll D, Schorner D, Durr M, Herick K, Rupp S, Sohn K, Hammerle H. A microarray enzyme-linked immunosorbent assay for autoimmune diagnostics.Electrophoresis. 2000 Jul;21(13):2641-50

82. Zhu H, Hu S, Jona G, Zhu X, Kreiswirth N, Willey BM, Mazzulli T, Liu

83. G, Song Q, Chen P, Cameron M, Tyler A, Wang J, Wen J, Chen W, Compton S,

84. Snyder M. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a Coronavirus protein microarray. Proc Natl Acad Sei USA. 2006 Mar 14; 103(11 ):4011-6. Epub 2006 Mar 7.

85. Kung LA, Snyder M. Proteome chips for whole-organism assays. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Aug;7(8):617-22)

86. Salamat-Miller N, Fang J, Seidel CW, Smalter AM, Assenov Y, Albrecht M, Middaugh CR. A network-based analysis of polyanion binding proteins utilizing yeast protein arrays. Mol Cell Proteomics. 2006 Sep 18

87. Kersten B, Possling A, Blaesing F, Mirgorodskaya E, Gobom J, Seitz H. Protein microarray technology and ultraviolet crosslinking combined with mass spectrometry for the analysis of protein-DNA interactions. Anal Biochem. 2004 Aug 15;331(2):303-13

88. Hall DA, Zhu H, Zhu X, Royce T, Gerstein M, Snyder M. Regulation of gene expression by a metabolic enzyme. Science. 2004 Oct 15;306(5695)

89. Schreiber G. Fersht A.R. Interaction of barnase with its polypeptide inhibitor barstar studied by protein engineering. Biochemistry 1993, 32(19):5145-5150.

90. Schulga A, Kurbanov F, Kirpichnikov M, Protasevich I, Lobachov V, Ranjbar B, Chekhov V, Polyakov K, Engelborghs Y, Makarov A. Comparative study of binase and barnase: experience in chimeric ribonucleases. Protein Eng 1998, ll(9):775-82.

91. Протасевич И.И., Цветков Ф.О., Шульга A.A., Поляков K.M.,

92. Лобачев B.M., Кирпичников М.П., Макаров A.A. Стабилизирующий эффектбелок-белковых взаимодействий: тепловая денатурация комплексов Барназы и Биназы с Барстаром и его мутантами С40,82А. Молекулярная биология 1999,33(3):476-482.

93. Uedo N., Ishikawa Н., Narahara Н. et al. Measurement of carcinoembryonic antigen in colonic effluent as a high-risk marker for colorectal carcinoma. Cancer Detect. Prev.-2000.-Vol.24,N.3.-p.290-294.

94. Ничога В.Д., Добренький M.H., Козина H.A., Спивак А.А. Опухолевые маркеры при раке молочной железы. Тезисы докл. 68-й научн. конф. медиков Астраханской области,- Астрахань, 1987, с. 5-7.

95. Скворцов С.В., Храмченко И.М., Кушлинский Н.Е. Опухолевые маркеры в оценке степени распространенности опухолевого процесса при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта. Клин. лаб. диагн.-1999.-№ 9, с.26.

96. Скворцов С.В., Кушлинский Н.Е., Кадагидзе З.Г. и др. СА-19-9, раково-эмбриональный антиген и а-фетопротеин в сыворотке крови неонкологических больных и их клиническое значение. Бюлл.экспер.биол,-1997- т. 123, № 5, с.566-569.

97. Карпищенко А.И., Антонов В.Г., Бутенко А.Б. и др. Онкомаркеры и их диагностическое значение. Санкт-Петербург, 1999

98. Yuen P.K., Li G., Bao Y, Muller U.R., 2003. Microfluidic devices for fluidic circulation and mixing improve hybridization signal intensity on DNA arrays. Lab Chip. 3,46-50.

99. A. Rida, T. Lehnert, A.M.Gijs Microfluidic mixer using magnetic beads, 2003, 579-582.

100. M. Noerholm, H. Bruus, et al., 2004, Polymer microfluidic chip for online monitoring ofmicroarray hybridizations. Biology and Bioeng. 28-37.

101. Toegl, A., Kirchner, R., Gauer, C., Wixforth, A., 2003. Enhancing results of microarray hybridization through microagitation. J. Biomol. Techn. 14, 197204.

102. Schaupp, S.J., et. al. Active mixing during hybridization improves the accuracy and reproducibility of microarray results. 2005 Biotechniques 38: 117119.

103. Rubina AY, Pan'kov SV, Dementieva EI, Pen'kov DN, Butygin AV,

104. Vasiliskov VA, Chudinov AV, Mikheikin AL, Mikhailovich VM, Mirzabekov AD.104

105. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. Anal Biochem. 2004 Feb 1;325(1):92-106.

106. Zubtsov DA, Ivanov SM, Rubina AY, Dementieva EI, Chechetkin VR, Zasedatelev AS. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips. J Biotechnol. 2006 Mar 9; 122(1): 16-27. Epub 2005 Sep 22.

107. Probstein R F Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction ("Second Edition) (New York: Wiley, 1994

Информация о работе

Иванов, Сергей Михайлович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы