Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика образования комплекса антиген-антитело на микрочипах

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Кинетика образования комплекса антиген-антитело на микрочипах"

на правах рукописи

0034484БЫ ЗУБЦОВ Дмитрий Александрович

КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСА АНТИГЕН-АНТИЕТЕЛО НА МИКРОЧИПАХ

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 6 ОНТ 2008

Москва-2008

003448468

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии имени В А Энгельгардга РАН и на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ)

Научные руководители кандидат химических наук

А Ю Рубина

доктор физико-математических наук МА Лившиц

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук

А А Полежаев (ФИАН) доктор физико-математических наук Р В Полозов (ИТЭБ)

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Зашита диссертации состоится (I // 2008 г в / часов на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН по адресу 119991 г Москва, В-334, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан г^гс 2008г

Ученый секретарь Диссертационного совета/^ /// кандидат химических наук '/б/(/

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Биологические микрочипы становятся все более востребованным и эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биотогических исследований Микрочипы содержат упорядочснно размещенные биомолекулярные зонды, которые либо непосредственно прикреплены к поверхности носителя, такого как стекло, пластик, металл, и др (20-микрочип), либо иммобилизованы в объемне гидрогелевых ячеек, закрепленных на носителе (ЗО-микрочип) Технология изготовления трехмерных гидрогелевых микрочипов с использованием в качестве зондов ДНК-олигонуклеотидов, белков и Сахаров разработана в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардга РАН Трехмерное размещение молекулярных зондов способно обеспечить ряд преимуществ по сравнению с поверхностной иммобилизацией Для белковых микрочипов особенно важным является устранение контакта иммобилизованной белковой молекулы с гидрофобной поверхностью подложки Также важно иметь возможность многократного повышения уровней регистрируемых сигналов за счет увеличения количества зонда, приходящегося на единицу площади ячейки Вместе с тем опасения могла бы внушать ожидаемая медленность кинетики, типичная в случае олигонуклеотидных гелевых микрочипов и обусловленная механизмом «задержанной диффузии» (ХлувЬйв, МтааЬскоу 1996) Однако наше исследование показывает, что в условиях динамических концентраций антигена испотьзуемых в клинических исследованиях, использования белковых микрочипов кинетика лимитируется «внешней» диффузией в объеме, окружающем ячейку, и потому одинакова для ЗО- и 2Б-микрочнпов Выявленный кинетический механизм образования комплекса антиген-антитело делает осмысленной задачу ускорения реакций проводимых на белковых микрочипах посредством принудительного перемешивания раствора Задача ускорения реакции образования комплекса антиген-антитело мотивирована не только удобством для практического использования данного метода анализа на микрочипах, но и возможностью значительного повышения его разрешающей способности

ЦЕЛИ II ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования являлось изучение кинетики образования комплекса антиген-антитело на гидрогелевых микрочипах, получение данных об основных параметрах, влияющих на время достижения насыщения и на уровни сигналов в насыщении для оптимизации иммуноанализа на микрочипах В связи с этим были поставлены следующие задачи

1 Сравнить гидрогетевые микрочипы (30) с поверхностными микрочипами (20), оценивая основные функциональные параметры

а эффективность иммобилизации

Ь уровни сигналов в сэндвич-иммуноанализе (тройной комплекс) с времена выхода на насыщение и интенсивности сигналов в насыщении (двойной комплекс)

2 Изучить кинетику реакции антиген-антитело на гидрогелевых микрочипах и возможности ускорения реакции перемешиванием раствора

а исследовать концентрационные зависимости времени выхода на насыщение и

уровней сигналов в насыщении, Ь исследовать кинетический эффект принудительного перемешивания раствора, с сопоставить полученные данные с теорией

3 Оценить практическую значимость опробованных методов ускорения реакции антиген-антитело на микрочипах

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Исследована кинетика образования комплекса антиген-антитело на микрочипах с антителами, иммобилизованными в гелевых ячейках и на микрочипах с антителами, ковалентно пришитыми к стеклянной подложке Определены основные функциональные параметры, влияющие на время достижения насыщения и на уровни сигналов для двух типов микрочипов Проведено сравнительное исследование гидрогелевых и поверхностных белковых микрочипов Показано, что преимущество гидрогелевых белковых микрочипов перед поверхностными в уровнях сигналов может достигать нескольких порядков Обнаружено, что кинетика иммунохичических реакций на микрочипе лимитируется (внешней) диффузией исследуемых биологических объектов в растворе к ячейке микрочипа и потому одинакова для поверхностных и трехмерных гелевых микрочипов Проведенные исследования и выявтенные закономерности позволили предложить способ ускорения процедуры иммуноанализа на микрочипах, сократить время проведения анализа в 4-5 раз без потери чувствительности, что найдет применение при разработке иммунодиагностических тест-систем на основе технологии гидрогелевых микрочипов

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы докладывались на 49-й и 50-й Научных конференциях МФТИ (27 ноября 2006 г и 27 ноября 2007 г, Москва) и на научных семинарах ИМБ РАН

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам диссертации опубликовано три научные статьи

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из следующих глав введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводов и списка цитированной литературы Работа изюжена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и 2. таблицы Библиография включает /2¿наименования

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ Белковые микрочипы

Белковые микрочипы используются для исследования белок-белковых, белок-лигандных взаимодействий, для проведения ферментативных реакций, а также в аналитических цетях Высокая производительность анализа на белковых микрочипах делает перспективным их использование в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для проведения многопараметрического анализа клинических образцов

Технологии производства белковых микрочипов развиваются десятками фирм, например Biacore (Швеция), Ciphergen Вюsystems (США), Oxford GlykoSciences (Великобритания) и др Тем не менее, до сих пор не предложено удовлетворительной технологии массового производства белковых микрочипов для клинической практики

Одна из трудностей при создании белковых микрочипов состоит в том, что для сохранения структуры и биологических функций белковые молекулы нуждаются в гидрофильном окружении, максимально приближенном к естественным условиям функционирования белков Хотя разработан целый ряд способов иммобилизации белков на поверхности носителя, указанное ограничение препятствует созданию устойчиво работающих и долго хранящихся поверхностных белковых микрочипов

При изготовлении микрочипов существенна природа иммобилизуемых белков - чем однороднее структура белков, тем проще и воспроизводимее процедура их иммобилизации Моноклональные антитела, используемые в большинстве диагностических методов, в том числе в иммуноферментном и иммунофлуоресцентном анализе, обладают требуемыми свойствами Они довольно устойчивы и обладают высокой специфичностью к антигенам Микрочипы с панелями иммобилизованных моноклональных антител, позвочяющие проводить многопараметрический анализ клинических образцов, могли бы найти широкое применение в медицинской практике

Для иммобилизации белковых молекул на поверхности носителя применяют различные физические и химические методы В данной работе для получения двумерных микрочипов

поверхность стеклянных слайдов обрабатывали (3-глицидилоксипропил)-триметоксисиланом Эпоксидирование слайда дает возможность получать спейсер, отделяющий белок от носителя, это имеет значение для уменьшения потери исходной активности белка за счет стерических затруднений, возникающих в результате иммобилизации

Трехмерные белковые микрочипы изготавливали по технологии полимеризационной иммобилизации, разработанной в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН Разработанная технология гидрогелевых микрочипов достаточно универсальна и может быть применена для изготовления чипов, содержащих различные по своей природе иммобилизованные биологические зонды ДНК, РНК, белки, пептиды и пр Гидрогелевые микрочипы уже используются для диагностики цетого ряда инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний

Биочип представляет собой подложку, на которую нанесены полусферические гелевые элементы (ячейки) Каждый гелевый элемент микрочипа содержит иммобилизованный индивидуальный зонд Носителем для размещения гидрогелевых ячеек служат стеклянные пластинки, обработанные специальным агентом (Bind Silane), создающим на поверхности стекла непредельные группы На активированное таким образом стекло роботом с пиновой технологией наносятся микрокапли полимеризационной смеси, содержащей иммобилизуемые зонды и гелеобразующие мономеры В итоге получается гидрофобная поверхность с массивом регулярно расположенных ячеек Число ячеек на микрочипе определяются задачей и условиями планируемого эксперимента

Ковалентная иммобилизация молекул зонда ос>ществляется одновременно с полимеризацией геля под действием ультрафиолетового облучения (Рис 1) В ходе фотоиндуцируемой полимеризации происходит ковалентное связывание зонда с компонентами растущих полимерных цепей

Для того, чтобы участвовать в реакции фотоиндуцируемой полимеризации, биологические соединения должны содержать активные группы, способные вступать в реакции замещения или присоединения с бифункциональными гелеобразукяцими мономерами В качестве таких активных групп могут выступать, например, аминогруппы Белки не требуют дополнительной химической модификации, в то время как ДНК, олигонуклеотиды и сахара перед проведением иммобилизации необходимо модифицировать введением в их структуру аминогрупп В качестве гелеобразующих соединений в нашей работе использовали производные метакриламида иКД^-метиленбисакриламид

111

Подложка!

Попимериэационная смесь, содержащая компоненты геля и иммобилизуемые соединения_

Рисунок 1. Получение ячеек гидрогеля, содержащих молекулярный зонд, методом фотоиндуцированной сополимеризации.

Регистрация сигналов гелевых ячеек мнкрочипа

Регистрацию осуществляли флуориметрически с гелевых элементов микрочипа. Белки, используемые для детекции, содержали флуоресцентную метку. В качестве красиетелей использовали сукцинимидные эфиры СуЗ и Су5 (Amersham Biosciences, США). Флуоресцентные измерения проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН) с использованием фильтров 650/670 (Су5) нм и 535/590нм (СуЗ) (возбуждение/регистрация). Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала производили с помощью программного обеспечения ImaGelAssay (ИМБ РАН). Кинетические измерения проводили в камере, под буферным раствором, содержащим флуоресцентно-меченные белки.

микроскоп

1

_реакционная 1 смесь

гелевые ячейки

стекло — прокладка -

гелевые ячейки

..Jii'.liiu.'JJ,

„реакционная смесь

гелевые ячеики

Рисунок- 2. Схематическое изображение микрочипов под камерой с реакционным раствором. Схематическое изображение перемешивания при помоши перистальтического насоса и ультразвука.

Объекты исследования

Простата-специфический антиген (ПСА)

ПСА продуцируется клетками предстательной железы и представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 32 кДа. При поступлении в кровь ПСА связывается с ингибиторами протеаз, в результате чего в сыворотке крови он обнаруживается как в свободной форме, так и в различных связанных молекулярных формах, не обладающих специфической ферментативной активностью: преимущественно в комплексе с антихимотрипсином (АХТ) — ПСА-АХТ. Высокая клиническая значимость ПСА как диагностического маркера побудила лабораторию биочипов ИМБ создать специальный микрочип для одновременного количественного определения двух форм ПСА. Такой микрочип может найти применение для ранней дифференциальной диагностики рака предстательной железы и для соответствующего массового обследования населения.

Для проведения данного исследования был созданы поверхностные и гидрогелевые микрочипы с иммобилизованными антителами против ПСА. Использованный набор концентраций иммобилизуемых антител: 0,67 мкМ (1), 1,34 мкМ (2), 2,68 мкМ (3), 5,36 мкМ

(4).

Рисунок 3. Флуоресцентное изображение трехмерных (А) и двумерных (В) микрочипов после проведения имунноанализа. Каждая концентрация иммобилизованных антител (1-4) представлена в 4-х повторах. Сигнал для каждой концентрации иммобилизованных антител считается как медиана от четырех.

Для определения эффективности иммобилизации были сконструированы поверхностные и гидрогелевые микрочипы с иммобилизованными флуоресцентно-

меченными (Суэ) антителами. Использованный набор концентраций иммобилизуемых антител: 0,97 мкМ, 1,94 мкМ, 3,88 мкМ, 7,76 мкМ, 15,53 мкМ Инсулин

Инсулин - гормон пептидной природы с молекулярной массой 6 кДа, образующийся в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин имеет отношение ко всем видам обмена веществ в организме, и, прежде всего к обмену углеводов. Инсулин и антитела к нему составляют систему, весьма удобную для экспериментальных исследований, благодаря небольшим размерам молекулы инсулина и хорошей константе связывания (5-107ЛГ'). Был создан микрочип с иммобилизованными антителами против инсулина. Использованный набор концентраций иммобилизуемых антител: 0,2 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 4 мкМ

Фото микрочипа

Флуоресцентное изображение микрочипа

Обработка сигналов в программе 1таОе1

Рисунок 4. Фото микрочипа в проходящем свете, флуоресцентное изображение микрочипа после проведения анализа, уровни флуоресцентных сигналов после обработки в программе 1таОе1. Каждая концентрация иммобилизованных антител (1-5) представлена в 4-х повторах. Сигнал для каждой концентрации иммобилизованных антител считается как медиана от четырех.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение эффективности иммобилизации в двух системах

Для определения эффективности иммобилизации использовали микрочипы с иммобилизованными флуоресцентно-меченными (Су5) антителами. Уровень флуоресцентного сигнала после завершения сополимеризации (гидрогелевые микрочипы) или ковалентной иммобилизации (поверхностные микрочипы), до отмывки от непрореагировавших компонентов принимали за 100%. Продолжительность отмывки

подбиралась по установлению постоянного сигнала Эффективность иммобилизации оценивалась как отношение сигналов, полученных после отмывки микрочипов к исходным сигналам, то есть до отмывки

Из рисунка 5 видно, что для гидрогелевых микрочипов эффективность иммобилизации практически не меняется с увеличением концентрации иммобилизуемых антител, в то время как на поверхностных микрочипах заметно падает

Нижеследующие оценки дают объяснение падению эффективности иммобилизации на 2й микрочипах при высоких концентрациях иммобилизуемых антител

45

40

35

30

25

£ £ 20

15

10

5

0

4

\

Л

1

\ <

♦

3D

20

6( 8 10 [Ab*,mro], jjM

12 14 16

Рисунок 5 Зависимость эффективности иммобилизации флуоресцентно-меченных антител от концентрации иммобилизуемых антител 30 - гидрогелевые микрочипы, 20 -поверхностные микрочипы

Количество антител на единицу площади ячейки и среднее расстояние между антителами

Количество антител, приходящееся на единицу площади ячейки микрочипа, оценивается по количеству наносимого материала и размерам ячеек (диаметр 150 мкм) с поправкой на ограниченную эффективность иммобилизации Определенная таким образом эффективная поверхностная плотность составляет для двумерных микрочипов 1 1х10"12 - ЗЗхЮ'12 мол/см2 , а для трехмерных гидрогелевых микрочипов 1,3 х 10"12 - 21,3 х 10"'2 мол/см2 В случае гидрогелевых микрочипов такая эффективная поверхностная плотность соответствует как бы вертикальной проекции объемного распределения антител в гелевой ячейке на площадку прикрепления

Из графиков видно (рис 6), что на поверхностных микрочипах при увеличении концентрации иммобилизуемых антител достигается предельное значение плотности антител на единицу площади ячейки Оценка средних расстояний между антителами (рис 7), связанными на поверхности <11игГ ]~ 9,4 - 5,5 им показывает, что предел плотности посадки на поверхности, видимо, соответствует заполненному мономолекулярному слою антител (Считается, что размеры молекул моноклональных антител ~ 7-1 Онм) Между тем в случае гелевого ЗО-микрочипа среднее расстояние между молекулами антител <1^ =[АЬ,]~ 178,5 - 70,8 им гораздо больше молекулярных размеров

250 20,0 ' 15,0 10 0

: 60 0,0

30

л

* * « #

■ *

*

■ *

о,о

4,0 ^ 8,0 12,0 [АЬ"/,„„,1, рМ

16,0

4,0 8 0 12,0

[АЬ*и1т], рМ

16,0

Рисунок 6 ЗЭ - зависимость эффективной поверхностной плотности антител от концентрации иммобилизуемых антител на гидрогелевых микрочипах, 20 - зависимость эффективной поверхностной плотности антител от концентрации иммобилизуемых антител на поверхностных микрочипах

2000 160,0 . 120,0 Г 80 0 40 0 0,0

зэ

0,0

4,0 8,0 12,0 [АЬ',„„„] ММ

10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0

20

16,0

0,0

4,0 8,0 12,0

[АЬ",т„], ИМ

16 0

Рисунок 7. Зависимости среднего расстояния между иммобилизованными антителами от концентрации иммобилизуемых антител ЗИ - гидрогелевые микрочипы, 20 -поверхностные микрочипы

Следует подчеркнуть, что в описываемых сравнительных исследованиях мы намеренно использовали для иммобилизации на 30- и Ю-микрочипах одинаковые количества антител на ячейку Для реальных приложений в гелевые ячейки ЗО-микрочипов можно поместить гораздо большие кочичества антител

Сравнение поверхностных и гидрогелевых микрочинов по уровням сигналов в сэндвич-ич муноанализе

Для сравнения уровней сигнала в сэндвич-иммуноанализе на 20- и ЗО-микрочипах были использованы микрочипы с иммобилизованными антителами против ПСА Были получены калибровочные кривые для каждого значения концентрации иммобилизуемых антител в сэндвич-иммуноанализе на двух видах микрочипов Калибровочная кривая - основной инструмент при проведении количественного иммуноанализа Она представляет собой зависимость интенсивности сигнала от концентрации антигена в растворе Этот график служит для определения неизвестной концентрации антигена в исследуемом образце

0,6 1,0 15

[ПСА], нМ

05 1,0 15

[ПСА]. НМ

Рисунок 8 Калибровочные кривые интенсивность сигнала в зависимости от концентрации антигена Концентрации иммобилизуемых антител против ПСА соответственно равны 0,67 мкМ (1), 1,34 мкМ (2), 2,68 мкМ (3), 5,36 мкМ (4)

Как видно из рисунка 8, на форму калибровочной кривой влияет также концентрация иммобилизованных антител В таблице 1 представлены уровни сигнала при максимальном значении концентрации ПСА в растворе, а также их отношения для двух видов микрочипов в зависимости от концентрации иммобилизуемых антител

При малых концентрациях антител преимущество гидрогелевых микрочипов обусловлено отсутствием денатурации белков благодаря исключению контактов с гидрофобной поверхностью подложки При увеличении концентрации иммобилизуемых антител разницу в уровнях сигналов увеличивает также и падение эффективности иммобилизации на поверхностных микрочипах

Для реальных приложений иммуноанализа на микрочипах возможность увеличения

количества антител, иммобилизованных в каждой ячейке, играет весьма важную роль Дело не только в повышении уровней сигналов Связанное с этим увеличение угла наклона калибровочной кривой означает повышение чувствительности метода Чувствительность определяется дискриминацией между «нулевым» сигналом, то есть сигнатом в отсутствии антигена в образце, и значимым сигнатом (значимым сигналом считается значение сигнала, вдвое превышающее значение сигнала в отсутствии антшена) для данной концентрации иммобилизованных антител Из рисунков видно, что на гидрогелевом микрочипе такая дискриминация значительно эффективнее

Таблица I Значенне уровней сигналов при максимальном значении концентрации ПСА в растворе Отношение уровней сигналов полученных на гидрогелевых микрочипах к сигналам полученным на поверхностных микрочипах

Л» 4 3 2 1

|ЛЬии],цМ 0 67 1 34 2 68 5 36

/т 1 31 2 38 4 55 7 16

0 32 0 55 081 0 99

J]^) Мт 41 43 56 72

Кинетика реакции антиген-антитело на микрочипах

Исследовалась кинетика связывания флуоресцентно-меченного антигена (ПСА) в концентрации 25нМ, с иммобилизованными антителами против ПСА в случае двумерных и трехмерных микрочипов

2И

0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

г

1000 1500 2000 2500 3000 *, МИН

600

1000 1500 2000 2500 3000 1,МИН

Рисунок 9 Зависимости сигнала от времени, полученные в резучьтате взаимодействия иммобилизованных антител с фтуоресцентно-меченным антигеном (ПСА), концентрация которого составляла 25нМ Концентрации иммобилизуемых антител к ПСА соответственно равны 1,34 мкМ (1), 2,68 мкМ (2), 5,36 мкМ (3)

В кинетических экспериментах измерения меняющихся флуоресцентных сигналов от ячеек микрочипа производятся без удаления из камеры раствора меченного антигена

Оказалось, что при таких измерениях сквозь флуоресцирующий раствор в случае двумерного микрочипа сигналы от ячеек с наинизшей концентрацией иммобилизованных антител почти не отличаются от фонового сигнала даже при использованной довольно высокой концентрации антигена Поэтому мы отказались от сравнения кинетических данных, относящихся к наинизшей концентрации иммобилизуемых антител (рис 9)

Сравнение уровней сигналов в насыщении и характерного времени реакции (как времени достижения 90%-ного уровня сигнала) для двух видов микрочипов представлено на рисунке 10

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 ОД 0,0

20

1600 1400 1200 х 1000 I 800 ** 600 400 200 О

30 20

0,0

0,1 ОД 0,3 [АЬ'лш»], ЦМ

0,4

0,0

0,1 0,2 0,3

[АЬ'шт!, ум

0,4

0,5

Рисунок 10 А. Равновесные уровни сигналов в зависимости от концентрации иммобилизуемых антител Б Время достижения насыщения в зависимости от концентрации иммобилизуемых антител ЗЭ - гидрогелевый микрочип, 20 - поверхностный микрочип

Проигрышность 20- в сравнении с ЗО-микрочипами по уровням сигналов как и в случае сэндвич-иммуиоанализа, видимо, следует приписать частичной денатурации антител из-за контактов с гидрофобной поверхностью и пониженной эффективности иммобилизации

Равенство характерных времен реакции образования комплекса антиген-антитело на Ю-и ЗО-микрочипах заставляет сделать вывод о том, что лимитирующей стадией реакции является диффузия антигена в растворе Стадия собственно связывания антигена 2Э- и 30-ячейках, занимает меньшее время, чем диффузионная «доставка» материала к ячейке

Теоретическое описание кинетики связывания антигена из раствора с антителами, иммобилизованными в ячейках микрочипа

Для описания кинетики связывания флуоресцентно-меченного антигена из раствора с антителами, иммобилизованными в ячейках микрочипа, мы адаптировали разработанную ранее (ЬпъЫй, МогаЬекоу 1996, »Яогокт й а1 2003) кинетическую теорию гибридизации на олигонуклеотидных микрочипах Время достижения равновесия и интенсивность сигнала в равновесии выражаются через параметры задачи следующими соотношениями

Здесь - концентрация антигена, [АЬ\ - концентрация иммобилизуемых антител,

- (равновесная) константа ассоциации, г0 - характерное время диффузии антигена, Л - «аппаратная константа», связывающая интенсивность сигнала с концентрацией комплекса, [С]_ - концентрация комплекса антиген-антитело в равновесии

В случае гидрогспевого микрочипа диффузионное характерное время т0 может определяться не точько «внешней» диффузией аитигена к ячейке, но и «задержанной диффузией» внутри гелевой ячейки Теоретически соотношение этих факторов зависит от соотношения коэффициентов диффузии вне и внутри ячейки и от размеров и формы ячейки Приведенные выше экспериментальные факты (а также теоретические оценки) свидететьствуют о том, что в рассматриваемых условиях лимитирующей явтяется «внешняя» диффузия, одинаковая для гелевых и для поверхностных микрочипов

Эффект принудительного перемешивания раствора

Кинетика, лимитируемая диффузией антигена к ячейкам микрочипа, может быть ускорена принудительным перемешиванием раствора в реакционной камере Возможности такой оптимизации кинетики мы исследовали, присоединив к камере перистальтический насос Использовали гидрогелевый микрочип с антителами к инсулину Следили за ходом связывания флуоресцентно-меченного инсулина в режиме свободной диффузии и при перемешивании раствора с помощью перистальтического насоса

Интенсивность прокачивания жидкости перистальтическим насосом во всех экспериментах была одинакова (6 мл/мин)

I мин Г, мин

Рисунок 11. Кинетические кривые для диффузионно-реакционной кинетики (А) и кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса (Б) Концентрация флуоресцентно-меченного инсулина в растворе нМ Концентрации иммобилизованных антител

0,2 мкМ (1), 0,5 мкМ (2), 1 мкМ (3), 2 мкМ (4), 4 мкМ (5)

Концентрационные зависимости уровней сигналов и характерных времен

Рис 12 представляет наблюдаемые зависимости уровней сигналов в насыщении от концентраций иммобилизованных антител при различных концентрациях антигена (инсулина) в растворе Экспериментальные данные (обозначены маркерами) очень хорошо укладываются в предсказанную теорией линейную зависимость

А Б

00 05 10 15 20 2,5 30 35 40 [АЬ|], ЦМ

00 05 10 15 2.0 2.5 30 36 4,0 [АЬ ,1, ЦМ

Рисунок 12 Зависимость интенсивности сигнала в насыщении от концентрации иммобилизованных антител для диффузионно-реакционной кинетики (А) и кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса (Б) Концентрации антигена в растворе были соответственно равны 5 нМ (1), 17 нМ (2), 50 нМ (3), 84 нМ (4), 168 нМ (5) Маркерами отмечены экспериментальные данные, сплошные линии соответствуют теоретически предсказанной зависимости

Рисунок 13 представляет зависимость уровней сигналов в насыщении от концентрации антигена в растворе Наблюдаемые нелинейные зависимости хорошо соответствуют предсказываемым теорией, как в случае диффузионно-реакционной кинетики, так и в случае кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса.

А Б

5,0

40

4>

О 30

1 2.0

s

1,0

00

ГП

/

1 —Л

Щ --- -а И* —

5,0

6 40

4>

о 3,0 «

А | 2,0

3 10 2

1 ОО

Ч У х--1 л— —А

& ——' •в— — м

2 3 4 5

3

3 4 5

Рисунок 13 Зависимость интенсивности сигнала в насыщении от концентрации флуоресцентно-меченного антигена в растворе для диффузионно-реакционной кинетики (А) и кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса (Б) Концентрации иммобилизованных антител были соответственно равны 0,2 мкМ (1), 0,5 мкМ (2), 1 мкМ (3),

2 мкМ (4), 4 чкМ (5) Маркерами отмечены экспериментальные данные, линии соответствуют теоретически предсказанной зависимости

Концентрационные зависимости характерного времени реакции представлены на рис 14,

15

А Б

[АЬ,],цМ ИЬ,] ДОЛ

Рис}нок 14 Зависимость времени достижения насыщении от концентрации иммобилизованных антитет для диффузионно-реакционной кинетики (А) и для кинетики, ускоренной при помощи перистальтическою насоса (Б) Концентрации антигена в растворе 168 нМ (1), 84 чМ (2), 50 нМ (3), 17 нМ (4), 5 нМ (5) Маркерами отмечены экспериментальные данные, сплошные линии соответствуют теоретически предсказанной линейной зависимости

А Б

Рисунок 15. Зависимость времени достижения насыщении от концентрации флуоресцентно-меченного антигена в растворе для диффузионно-реакционной кинетики (А) и для кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса (Б) Концентрации иммобилизованных антител 0,2 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 4 мкМ Маркерами отмечены экспериментальные данные, сплошные линии соответствуют теоретически предсказанной зависимости

Наблюдаемые концентрационные зависимости очень хорошо соответствуют предсказанным теоретически Принудительное перемешивание по-существу не меняет концентрационную зависимость времени достижения равновесия Меняется лишь

коэффициент Диффузионное характерное время г0 заменяется на характерное время транспорта, ускоренного насосом, г;,, которое в 4 5 раза меньше

Наблюдаемое существенное сокращение характерного времени реакции (в 4,5 раза) означает, что перемешивание раствора обеспечивает преодоление лимитирующей стадии диффузионно-реакционной кинетики - стадии транспорта материала к месту связывания

Влияние интенсивности перемешивания

Экспериментальное исследование, результаты которого представлены на рисунке 16, показало, что интенсивность перемешивания (скорость прокачивания раствора) влияет на время достижения равновесия, но не на равновесные уровни сигнала.

20

1,5

05

00

3 4 V, мл/мин

2 3 4 V мл/мин

Рисунок 16. Зависимость отношения интенсивности сигнала от скорости перемешивания (А) Зависимость характеристического времени от скорости перемешивания (Б)

Перспективность применения перемешивания

Экспериментальное исследование эффектов принудительного перемешивания раствора с помощью перистальтического насоса в реакции антиген-антитело на гидрогелевых микрочипах дало обнадеживающий результат 4 5-кратное ускорение Вместе с тем перемешивающее устройство на основе перистальтического насоса обладает рядом весьма неудобных особенностей, делающих его малоперспективным для широкого практического использования оно громоздко, требует специальной реакционной камеры, нуждается в большом количестве исследуемого раствора В качестве альтернативы мы исследовали компактное устройство - генератор ультразвуковых волн особой конфигурации, выпускаемый фирмой Ас1уа1уИх

Для сравнения эффективности двух систем перемешивания был использован микрочип с иммобилизованными антителами против ПСА Были исследованы три варианта кинетики реакции антиген-антитело на микрочипах в условиях свободной диффузии, с

использованием перемешивания перистальтическим насосом и с перемешиванием ультразвуком Результаты представлены на Рис 17

мин

Рисунок 17 Кинетические кривые для диффузионно-реакционной кинетики (А), кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса (Б) и кинетики, ускоренной при помощи ультразвука (В) Концентрация флуоресцентно-меченного антигена в растворе 17 нМ Концентрация иммобилизованных антител 5,36 мкМ

Как видно из графиков, два способа перемешивания реакционной смеси прибтизительно одинаково эффективны в ускорении реакции на микрочипе Время достижения насыщения при перемешивании с помощью перистальтического насоса сокращается в 4 5 раза, а при использовании прибора фирмы А<1уа1уТ1Х - в 4 раза При столь незначительной разнице в эффективности ускорения, эксплуатационные достоинства прибора Ас1уа1уЬх делают его явно предпочтительным

Мы проверили эффективность применения ультразвукового перемешивающего устройства А<1уа1у11х не только в условиях прямого иммуноанализа, но также и в условиях сэндвич-иммуноанализа При выполнении этой задачи был использован микрочип для ранней и дифференциальной диагностики рака предстательной железы Кинетические

измерения проводили в стандартных условиях одностадийного сэндвич-иммуноанализа на микрочипах

Из графиков рисунке 18 видно, что перемешивание ультразвуком сокращает время насыщения сигнала от тройного комплекса при одностадийном сэндвич-иммуноанализе приблизительно в 4 раза, т е так же эффективно, как и при прямом иммуноанализе, когда флуоресцентно-меченный антиген образует бинарный комплекс с иммобилизованными антителами

Ультразвуковое перемешивающее устройство АсН^уйх представляется перспективным для ускорения процедур диагностики на микрочипах

А Б

Рисунок 18 Кинетические кривые для диффузионно-реакционной кинетики сэндвич-иммуноанализа (А) и кинетики, ускоренной при помощи ультразвука (Б) Концентрация флуоресцентно-меченного антигена в растворе 17 нМ Концентрация иммобилизованных антител 5,36 мкМ

выводы

1 Экспериментально установлены преимущества белковых микрочипов, использующих объемную иммобилизацию в гелевых ячейках, по отношению к микрочипам с поверхностной иммобичизацией Иммобилизация в геле позволяет с сохранением нативности белка получать на порядки более высокие плотности молекул в расчете ча единицу площади и иметь соответственно более высокие уровни сигналов

2 В типичных усчовиях иммуноанализа на микрочипах кинетика лимитируется «внешней» диффузией антигена к ячейкам микрочипа и потому одинакова на 30 и 2В микрочипах Наблюдаемые прямая зависимость времени реакции от количества иммобнтизуемых антител и обратная зависимость от концентрации антигена соответствуют теоретически ожидаемым

3 Принудительное перемешивание образца на микрочипе позволяет ускорить реакцию, т е сократить время анализа в 4-4 5 раза, что весьма важно для практического применения микрочипов

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 D A Zubtsov, Е N Savvateeva, A Yu Rubma, S V Pan'kov, E V Konovalova, О V Moiseeva, V R Chechetkin, A S Zasedatelev Comparison of surface and hydrogel-based protein microchips //Analytical Biochemistry 368(2) 205-13 (2007)

2 DA Zubtsov, S M Ivanov, A Yu Rubina, E I Dementieva, V R Chechetkin, A S Zasedatelev Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips //Journal of Biotechnology 122 16-27(2006)

3 VI Dyukova, EI Dementieva, D A Zubtsov, О E Galanina, N V Bovm, A Yu Rubma Hydrogel glycan microarrays //Analytical Biochemistry 347 94-105(2005)

Зубцов Дмитрий Александрович

Кинетика образования комплекса антиген-антитею на микрочипах

Подписано в печать 02 10 2008 Формат 60x84 'А« Печать <х}ххтная. Усппсч л ! 0 Уч иддл. 10Тираж 100экз Заказ№912

Государственное образовательное \-чрсждснне высшего профессионального образования Московский физико-технический институт {гос} дарственный университет) Отдел автоматкзированиыч шдатстъеких систем "ФИЗТЕХ ПОЛИГРАФ i4!700 Моек обл г До тгопрт'дньш Институтский пер 9

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Зубцов, Дмитрий Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика микрочипов.

1.2. Применение белковых микрочипов.

1.3. Изготовление микрочипов.

1.3.1. Методы иммобилизации белков на микрочипах.

1.3.1.1. Физическая иммобилизация.

1.3.1.2. Химическая иммобилизация.

1.3.1.3. Иммобилизация за счет комплексообразования.

1.3.1.4. Иммобилизация в пористых средах.

1.3.1.5. Иммобилизация белков на трехмерных гидрофильных носителях.

1.3.2. Методы нанесения молекулярных зондов.

1.3.2.1. Микроконтактный метод.

1.3.2.2. Микроструйный метод.

1.3.2.3. Ближнее электронапыление.

1.3.2.4. Дальнее электронапыление.

1.3.2.5. Микроконтактная печать.;.

1.4. Микрочипы на основе гидрогелей.

1.5. Сравнение двумерных и трехмерных микрочипов.

1.6. Изучение кинетики на гидрогелевых микрочипах.

1.7. Методы ускорения анализа на микрочипах.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Приборы и реактивы.

2.2. Изготовление микрочипов.

2.3. Введение флуоресцентных меток в молекулу белка.

2.4. Определение эффективности иммобилизации.

2.5. Прямой анализ на микрочипах.

2.6. Сэндвич-анализ ПСА на микрочипах.

2.7. Флуоресцентные измерения на чипах.

2.8. Кинетические измерения на микрочипе.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнение эффективности иммобилизации в двух системах.

3.2. Сравнение поверхностных и гидрогелевых микрочипов по уровням сигналов в сэндвич-иммуноанализе.

3.3. Кинетика реакции антиген-антитело на микрочипах.

3.4. Теоретическое описание кинетики связывания антигена из раствора с антителами, иммобилизованными в ячейках микрочипа.

3.4.1. Кинетика и время насыщения.

3.4.2. Ускорение транспорта антигена при помощи перистальтического насоса и эффект экранирования.

3.5. Эффект принудительного перемешивания раствора.

3.6. Концентрационные зависимости уровней сигналов и характерных времен.

3.7. Влияние интенсивности перемешивания.

3.8. Перспективность применения перемешивания.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетика образования комплекса антиген-антитело на микрочипах"

Биологические микрочипы становятся все более востребованным эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Микрочипы содержат упорядоченно размещенные биомолекулярные зонды, которые либо химически прикрепляют к поверхности носителя, такого как стекло, пластик, металл, полимерная мембрана (2В-микрочип), либо иммобилизуют в объемных гидрогелевых ячейках, закрепленных на носителе (3D-микрочип). Технология изготовления трехмерных гидрогелевых микрочипов с использованием в качестве зондов ДНК-олигонуклеотидов, белков и Сахаров разработана в Институте молекулярной биологии РАН. Трехмерное размещение молекулярных зондов способно обеспечить ряд преимуществ по сравнению с поверхностной иммобилизацией. Для белковых микрочипов особенно важным является устранение контакта иммобилизованной белковой молекулы с гидрофобной поверхностью подложки. Также важно иметь возможность многократного повышения уровней сигналов за счет увеличения количества зонда, приходящегося на единицу площади ячейки. Вместе с тем опасения могла бы внушать ожидаемая медленность кинетики, типичная в случае олигонуклеотидных гелевых микрочипов и обусловленная механизмом «задержанной диффузии» [1]. Однако наше исследование показывает, что в стандартных условиях использования белковых микрочипов кинетика лимитируется «внешней» диффузией в объеме, окружающем ячейку, и потому одинакова для 3D- и 20-микрочипов. Выявленный кинетический механизм делает осмысленной задачу ускорения реакций на белковых микрочипах посредством принудительного перемешивания раствора. Задача ускорения реакции мотивирована не только удобством практического использования метода, но и возможностью значительного повышения разрешающей способности анализа.

Целью исследования является изучение кинетики образования комплекса антиген-антитело на гидрогелевых микрочипах, получение данных об основных параметрах, влияющих на время достижения насыщения и на уровни сигналов в насыщении для оптимизации иммуноанализа на микрочипах. Для достижения выбранной цели потребовалось сравнить гидрогелевые микрочипы с поверхностными микрочипами, оценивая основные функциональные параметры: эффективность иммобилизации; уровни сигналов в сэндвич-иммуноанализе (тройной комплекс); время выхода и интенсивности сигналов в насыщении (двойной комплекс). Также изучить кинетику реакции антиген-антитело на гидрогелевых микрочипах и возможность ускорения реакции перемешиванием раствора. Оценить практическую значимость опробованных методов ускорения реакции антиген-антитело на микрочипах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зубцов, Дмитрий Александрович

выводы

1. Экспериментально установлены преимущества белковых микрочипов, использующих объемную иммобилизацию в гелевых ячейках, по отношению к микрочипам с поверхностной иммобилизацией. Иммобилизация в геле позволяет с сохранением нативности белка получать на порядки более высокие плотности молекул в расчете на единицу площади и иметь соответственно более высокие уровни сигналов.

2. В типичных условиях иммуноанализа на микрочипах кинетика лимитируется «внешней» диффузией антигена к ячейкам микрочипа и потому одинакова на 3D и 2D микрочипах. Наблюдаемые прямая зависимость времени реакции от количества иммобилизуемых антител и обратная зависимость от концентрации антигена соответствуют теоретически ожидаемым.

3. Принудительное перемешивание образца на микрочипе позволяет ускорить реакцию, т.е. сократить время анализа в 4-4.5 раза, что весьма важно для практического применения микрочипов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубокую благодарность моим научным руководителям Рубиной Алле Юрьевне и Лившицу Михаилу Ароновичу и за доброжелательное руководство, всестороннюю помощь и внимание к работе. Я искренне признателен Зубцовой Жанне за помощь в разрешении некоторых теоретических аспектов, поддержку и участие. Марии Вадимовне Цыбульской, Екатерине Игоревне Дементьевой, Елене Савватеевой, Марине Филлиповой и Сергею Иванову за помощь в работе и дружеское участие. Также выражаю признательность Сергею Панькову, Кириллу Евсееву, Валентине Владимировне Чупеевой и Эдуарду Яковлевичу Крейндлину за подготовку микрочипов для проведения экспериментов; Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Зубцов, Дмитрий Александрович, Москва

1. Livshits, М.А., Mirzabekov A.D. Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucleotides II Biophys. J. (1996) 71, 2795-2801.

2. Kramer S., Joos Т.О., Templin M.F. Protein microarrays II Curr Protoc Protein Sci. 2005 Mar; 23:23.5.

3. Gamby J., Abid J.P, Tribollet В., Girault H.H. Nanomosaic Network for the Detection of Proteins Without Direct Electrical Contact II Small. 2008 Apr 17.

4. Yang S.T., Zhang X., Wen Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays И Curr Opin Drug Discov Devel. 2008 Jan; 11(1): 111-27.

5. Mitchell P. A perspective on protein microarrays II Nature Biotechnology Vol.20 march 2002 225-229

6. Templin M.F., Dieter Stoll, Monika Schrenk, Petra C.Traub, Christian F.Vohringer and Thomas O.Joos, Protein microarray technology H TRENDS in Biotechnology Vol.20 No.4 April 2002 160-166

7. MacBeath G. Protein microarrays and proteomics II Nature genetics supplement Vol.32 december 2002 526-532.

8. Lai S.P., Richard I.Cristopherson and Sristobal G.dos Remedios. Antibody arrays: an embryonic but rapidly growing technology 11 Drug Discovery Today Vol.7, No. 18 (Suppl.), 2002 143-149.

9. Abbot A. Betting on tomorrow's chips II Nature Vol 415 lOjanuary 2002 112114.

10. Mirzabekov A. D. and Alexander Kolchinsky. Emerging array-based technologies in proteomics И Current Opinion in Chemical Biology 2001, 6: 70-75.

11. Rubina A.Yu., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E., Ivanov S.M., Konovalova E.V., A.D. Mirzabekov.

12. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications //BioTechniques. 34, 2003, 1008-1022.

13. Rubina A. Yu., Dyutova, E. I. Dementieva, A. A. Stomakhin, V. A. Nesmeyanov, E. V. Grishin, A. S. Zasedatelev Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips // Anal. Biochem. 340 (2005) 317-329

14. Rubina AY, Kolchinsky A, Makarov AA, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics И Proteomics. 2008 Feb; 8 (4): 817-31

15. Angenendt P, Glokler J, Murphy D, Lehrach H, Cahill DJ Toward optimized microarrays: a comparison of current microarray support material II Anal. Biochem. 309, 2002, 253-260.

16. Service R.F. Searching for Recipes for protein chips II Science 294, (2001) 2080-2082

17. Beier M, J.D. Hoheisel. Versatile derivatization of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips II Nucleic Acids Res.27 (1999) 19701977

18. Kodadek T. Protein microarrays: prospects and problems И Chemistry & Biology 8 (2001) 105-115.

19. Uetz P, Giot L, Cadney G, Mansfield ТА, Judson RS, Knight JR, Lockshon D, Narayan V, Srinivasan M, Pochart P. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces serevisiae II Nature 2000, 403: 623-627

20. Heng Zhu, Klemic JF, Chang S, Berton P, Casamayor A, Klemic KG, Smith D, Gerstein M, Reed MA, Snyder M. Analysis of yeast protein kinases using protein chips II Nat Genet 2000, 26: 283-289.

21. Moreno-Bondi Maria Cruz, Jean Pierre Alarie and Tuan Vo-Dinh. Multi-analyte analysis system using an antibody-based biochip II Analytical and Bioanalytical Chemistry October 2002

22. Haab B.B., Duhman M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific protein and antibodies in complex solutions И Genom Biology 2001, 2(2) research 0004.1-0004.13.

23. Heng Zhu, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M. Global analysis of protein activities using proteome chips //Science 293 (2001)2101-5.

24. Wiesner A. Detection of tumor markers with ProteinChip technology II Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(l):45-67

25. Belov L, de la Vega O, dos Remedios CG, Mulligan SP, Christopherson

26. RI. Immunophenotyping ofleukemias using a cluster of differentiation antibody microarray //Cancer Res. 2001 Jun 1;61(11):4483-9

27. Seong, S., Choi, C., 2003. Current status of protein chip development in terms of fabrication and application И Proteomics 3, 2176-2189.

28. Chang YJ , Hu CY, Yin LT, Chang CH, Su HJ. Dividable membrane with multi-reaction wells for microarray biochips И J Biosci Bioeng. 2008 Jul;106(l):59-64.

29. Uzawa H, Ito H, Neri P, Mori H, Nishida Y. Glycochips from polyanionic glycopolymers as tools for detecting Shiga toxins //Chembiochem. 2007 Nov 23;8(17):2117-24

30. Delehanty JB, Ligler FS. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria И Anal Chem. 2002 Nov l;74(21):5681-7.

31. Heyries KA, Loughran MG, Hoffmann D, Homsy A, Blum LJ, Marquette CA. Microfluidic biochip for chemiluminescent detection of allergen-specific antibodies //Biosens Bioelectron. 2008 Jul 15;23(12):1812-8. Epub 2008 Mar 7

32. Harwanegg С, Hutter S, Hiller R. Allergen microarrays for the diagnosis of specific IgE against components of cow's milk and hen's egg in a multiplex biochip-based immunoassay II Methods Mol Biol. 2007;385:145-57

33. Avseenko NV, Morozova TY, Ataullakhanov FI, Morozov VN. Immunoassay with multicomponent protein microarrays fabricated by electrospray deposition И Anal Chem. 2002 Mar l;74(5):927-33

34. Chen CS, Zhu H. Protein microarrays II Biotechniques. 2006 Apr;40(4):423, 425, 427

35. Kingsmore SF Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays И Nat Rev Drug Discov. 2006 Apr;5(4):310-20

36. Elam JH, Nygren H, Stenberg M. Covalent coupling of polysaccharides to silicon and silicon rubber surfaces II J Biomed Mater Res. 1984 Oct;18(8):953-9.

37. Mansur HS, Orefice RL, Vasconcelos WL, Lobato ZP, Machado LJ.

38. Biomaterial with chemically engineered surface for protein immobilization IIJ Mater Sci Mater Med. 2005 Apr;16(4):333-40.

39. Angenendt P. Progress in protein and antibody microarray technology II Drug Discov Today. 2005 Apr 1;10(7):503-11

40. Flemming C, Gobel H, Wand H, Gabert A, Bock W. Synthesis and properties of immobilized enzymes. X. Covalent binding of polygalacturonase to insoluble carriers II Acta Biol Med Ger (1978) 37(2): 179-89.

41. Brockman A.H., Orlando R. New immobilization chemistry for probe affinity mass spectrometry II Rapid. Commun. Mass Spectrum. 1996, 10:1688-1692

42. Liao WH, Lee WC. Immobilization of enzymes on methacrylamide-based copolymers II Prep Biochem Biotechnol. 1997 Feb;27(l):39-46.

43. Nuzzo R.G., Allura D.L. Adsorption of bifunctional organic disulfides on gold surface //J. Amer. Chem. Soc. 1983, 105: 4481-4483.

44. Rusmini F, Zhong Z, Feijen J. Protein immobilization strategies for protein biochips II Biomacromolecules. 2007 Jun;8(6): 1775-89. Epub 2007 Apr 20

45. Frei E, Levy A, Gowland P, Noll M. Efficient transfer of small DNA fragments from polyacrylamide gels to diazo or nitrocellulose paper and hybridization И Methods Enzymol. 1983;100:309-26

46. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques // Acad. Press: San Diego, New York, Boston 1996.

47. Alwine JC, Kemp D J, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes И Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Dec;74(12):5350-5354.

48. Scott JE, Hughes EW, Shuttleworth A. An 'affinity' method for preparing polypeptides enriched in the collagen-associated Ehrlich chromogen II J Biochem (Tokyo). 1983 Mar;93(3):921-5.

49. Matsuura K, Akasaka T, Hibino M, Kobayashi K. Facile synthesis of stable and lectin-recognizable DNA-carbohydrate conjugates via diazo coupling II Bioconjug Chem. 2000 Mar-Apr; 11(2):202-11.

50. Liu XC, Scouten WH. (1996) Studies on oriented and reversible immobilization of glycoprotein using novel boronate affinity gel II J Mol Recognit., 9(5-6):462-467.

51. Pirrung M.C., Huang, C.Y. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. II Bioconjug Chem. 1996 May-Jun;7(3):317-21.

52. Clark EA, Golub TR, Lander ES, Hynes RO. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC II Nature. 2000 Aug 3;406(6795):466-7.

53. Lee S.H., Ruckenstein E. Adsorption of protein onto polymeric surfaces of different hydrophylicities — a case study with BSA II J. Colloid and Interface Sci 1988, 125:365-379.

54. Duncan RJ, Weston PD, Wrigglesworth R. A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassay II Anal Biochem. 1983 Jul l;132(l):68-73.

55. Peeters JM, Hazendonk TG, Beuvery EC, Tesser GI. Comparison of four bifunctional reagents for coupling peptides to proteins and the effect of the three moieties on the immunogenicity of the conjugates II J Immunol Methods. 1989 Jun 2;120(l):133-43.

56. Goff DA, Carroll SF. Substituted 2-iminothiolanes: reagents for the preparation of disulfide cross-linked conjugates with increased stability. II Bioconjug Chem. 1990 Nov-Dec;l(6):381-6.

57. Patel MP, Braden M. Cross-linking and ring opening during polymerization of heterocyclic methacrylates and acrylates И Biomaterials. 1989 May; 10(4):277-80.

58. Balcells M., Klee D., Fagry M., Hocker H. Quantitative assessment of protein adsorption by combination of ELISA with radioisotope-based studies //J. Colloid and Interface Sci 1988, 125:365-379.

59. Falsey JR, Renil M, Park S, Li S, Lam KS. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays II Bioconjug Chem. 2001 May-Jun;12(3):346-53.

60. Zhang G, Zhou Y, Wu X, Yuan J, Ren S. Covalent attachment of DNA to glass supports using a new silane coupling agent and chemiluminescent detection // J Tongji Med Univ. 2000;20(2):89-91.

61. Kulaev DV, Zuevsky W, Tsybulskaya MV Use of silica matrix for immunosorbent preparation И Artif. Organs (1987), v. 11, № 6, p. 503-504.

62. Хохлова ТД, Гаркавенко ЛГ, Никитин ЮС Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах II Прикл. Биохим. Микробиол. (1991) 27(5):720-4.

63. Hong J, Xu D, Gong P, Ma H, Dong L, Yao S. Conjugation of enzyme on superparamagnetic nanogels covered with carboxyl groups II J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Jan 19; Epub ahead of print

64. Turkova J, Petkov L, Sajdok J, Kas J, Benes MJ. Carbohydrates as a tool for oriented immobilization of antigens and antibodies II J Chromatogr., 500:585-593 (1990).

65. Lueking A., Horn M., Eickhov H., Bussow K., Lehrach H., Walter G.

66. Protein microarrays for gene expression and antibody screening И Anal. Biochem 1999, 270:103-111.

67. Macbeth G., Schreiber S.L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination II Science 2000, 289: 1760-1763, Scena, 1998

68. Newman J.D., Turner A.P.F. Ink-jet printing for the fabrication of amperometric glucose biosensors II Anal. Chim. Acta. 1992, 262:13-17.

69. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. High-density oligonucleotide arrays //Biosensors&Bioelectronics 1996, 11:687-69

70. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., van Dedem G.W.K. Picoliter dispensing in wells of a micro-array by means of electrospraying // Journal of Aerosol Science 1999, 30:551-552

71. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., Schalkhammer Т., van Dedem G.W.K. Miniaturized electrospraying as a technique for the production of reproducible micrometer-sized protein spots // Anal Chem. 2001, 73:2183-2189

72. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method for mass fabrication of mono- and multi-component microarrays of biological and biologically active substance II Anal. Chem. 1999, 71:3110-3117.

73. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method to fabricate functionally active protein films II Anal. Chem., 1999 71:14151420.

74. Kumar A., Whitesides G.M. Patterned Condensation Figures as Optical Diffraction Gratings //Appl. Phia. Lett. 1993, 63:2002.

75. Lahiri J., Ostuni E., Whitesides G.M. Patterning ligands on reactive SAMs microcontactprinting И Langmuir 1999, 15:2055-2060.

76. Arenkov P., Alexander Kukhtin, Anne Gemmel, Sergey Voloshchuk, Valentina Chupeeva and Andrei Mirzabekov. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions II Analytical Biochemistry 278 (2000) 123-131.

77. Rubina A, Pan'kov SV, Ivanov SM, Dement'eva EI, Mirzabekov AD. Protein microchips //Dokl Biochem Biophys. 2001 Nov-Dec;381:419-22

78. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гелях при формировании микрочипа // Патент N 2175972, 20 ноября 2001 (Б.И. 2001, N 25).

79. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В. Способ полимеризаъ^ионной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления II Патент РФ N 2216547.

80. V.A. Vasiliskov, E.N. Timofeev, S.A. Surzhikov, A.L. Drobyshev, V.V. Shick, and A.D. Mirzabekov. Fabrication of microarray of gel-ommobilized compounds on a chip by co-polymerization И BioTechniques 1999 27:592606.

81. Drobyshev, A., Mologina, N., Shick, V., Pobedimskaya, D., Yershov, G. & Mirzabekov, A. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification ofbeta-thalassemia mutations II Gene 188, (1997) 45-52.

82. Strizhkov B.N., Drobyshev, A.L., Mikhailovich, V.M., & Mirzabekov, A.D. PCR amplification on a microarray of gel-immobilized oligonucleotides:

83. Detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations II BioTechniques 29 No4 (2000) 844-857

84. Krylov A.; Zasedateleva, O.; Prokopenko D.; Rouviere-Yaniv, J.; Mirzabekov A. Massive parallel analysis of the binding specificity of HU protein with ss and ds DNA on generic oligonucleotide microchips II Nucl. Acids Res. 29 2001 2654-2660

85. Timofeev, E. & Mirzabekov, A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4,096-hexanucleotide microarray //Nucl. Acids Res. 29 (12) (2000) 2626-2634

86. Dubiley S., Kirillov, Eu., & Mirzabekov, A. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers II Nucl. Acids Res. 27, el9

87. Tillib S., Strizhkov В., & Mirzabekov A. Integration of multiple PCR amplification and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip //Analyt. Biochem. 292 (2001) 155-160.

88. Gryadunov D., Mikhailovich V., Noskov A., Lapa S., Sobolev A., Pan'kov S., Rubina A., Zasedatelev A., & Mirzabekov A. Detection of Bacillusanthracis using multiplex PCR on the oligonucleotide biochip II Dokl. Biochem. Biophys. 381 (2001) 384-386

89. Nasedkina Т.; Domer, P.; Zharinov, V.; Hoberg, J.; Lysov, Yu.; Mirzabekov, A. Identification of chromosomal translocation in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays II Haematologica 87 (4) (2002) 363-372

90. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., E.JI. Дарий, С.М., Дюкова В.И., ЗаседателевА.С., Мирзабеков А.Д. 2004. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров II Докл. Акад. Наук. 395,542-547.

91. Dyukova VI, Dementieva EI, Zubtsov DA, Galanina OE, Bovin NV, Rubina AY. Hydrogel glycan microarrays // Anal Biochem. 2005 Dec 1;347(1):94-105. Epub 2005 Sep 27

92. Kusnezow W, Syagailo YV, Goychuk I, Hoheisel JD, Wild DG. Antibody microarrays: the crucial impact of mass transport on assay kinetics and sensitivity II Expert Rev Mol Diagn. 2006 Jan;6(l): 111-24

93. Williams, J.C., Jr., Mark, L.A., Eichholtz, S. Partition and permeation of dextran in polyacrylamide gel II Biophys. J. 75, (1998) 493-502.

94. Pluen, A., Netti, P.A., Jain, R.K., Berk, D.A. Diffusion of macromolecules in agarose gels: comparison of linear and globular configurations II Biophys. J. (1999) 77, 542-552.

95. Ramanujan, S., Pluen, A., McKee, T.D., Brown, E.B., Boucher, Y., Jain, R.K. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium II Biophys. J. (2002) 83, 1650-1660

96. Sorokin, N.V., Chechetkin, V.R., Livshits, M.A., Vasiliskov, V.A., Turygin, A.Y., Mirzabekov, A.D. Kinetics of hybridization on the oligonucleotide microchips with gel pads II J. Biomol. Struct. Dynamics (2003)21,279-288.

97. Bhanot, G., Louzoun, Y., Zhu, J., DeLisi, C. The importance of thermodynamic equilibrium for high throughput gene expression arrays I I Biophys. J. (2003) 84, 124-135.

98. Gadgil, C., Yeckel, A., Derby, J.J., Hu, W.-S. A diffusion-reaction model for DNA microarray assays II Journal of Biotechnology (2004)114, 31-45.

99. Kusnezow W, Syagailo YV, Ruffer S, Klenin K, Sebald W, Hoheisel JD, Gauer C, Goychuk I. Kinetics of antigen binding to antibody microspots: strong limitation by mass transport to the surface //Proteomics. 2006 Feb;6(3):794-803

100. Yuen P.K., Li G., Bao Y, Muller U.R. Microfluidic devices for fluidic circulation and mixing improve hybridization signal intensity on DNA arrays И Lab Chip. (2003) 3, 46-50

101. Rida A, Gijs MA. Manipulation of self-assembled structures of magnetic beads for microfluidic mixing and assaying II Anal Chem. 2004 Nov l;76(21):6239-46.

102. M. Noerholm, H. Bruus. Polymer microfluidic chip for online monitoring ofmicroarray hybridizations И Biology and Bioeng. (2004) 28-37

103. S.J.Schaupp, et. all Active mixing during hybridization improves the accuracy and reproducibility of microarray results II Biotechniques (2005) 38: 117-11

104. Wiegel, W.F. Fluid Flow Through Porous Macromolecular Systems II Springer-Verlag, Berlin. 1980

105. Heleg-Shabtai V, Gratziany N, Liron Z. On-chip integrated hydrolysis, fluorescent labeling, and electrophoretic separation utilizedfor acetylcholinesterase assay II Anal Chim Acta. 2006 Jul 7;571(2):228-34. Epub 2006 May 9

106. Fu LM, Yang RJ, Lin CH, Chien YS A novel microfluidic mixer utilizing electrokinetic driving forces under low switching frequency //Electrophoresis. 2005 May;26(9): 1814-24

107. Oddy, M.H., Santiago, J.G., Mikkelsen, J.C. Electrokinetic instability micromixing II Anal. Chem. (2001) 73, 5822-5832.

108. Chatrathi MP, Collins GE, Wang J. Microchip-based electrochemical enzyme immunoassays ,// Methods Mol Biol. 2007;385:215-24.

109. Toegl, A., Kirchner, R., Gauer, C., Wixforth, A. Enhancing results of microarray hybridization through microagitation II J. Biomol. Techn. (2003) 14, 197-204.

110. Sahirai, M., Flow and Transport in Porous Media and Fractured Rock II VCH, Weinheim. 1995

111. Fatin-Rouge N, Starchev K, Buffle J. Size effects on diffusion processes within agarose gels II Biophys J. 2004 May;86(5):2710-9.