Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биологических микрочипов

Наседкина, Татьяна Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биологических микрочипов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биологических микрочипов"

На правах рукописи

НАСЕДКИНА Татьяна Васильевна

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ У ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ

03.00.03 - Молекулярная биология 03.00.15 - Генетика

003400251

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2009

003480251

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Олег Леонидович Поляновский

доктор биологических наук, профессор Ольга Олеговна Фаворова

доктор биологических наук, профессор, Федор Львович Киселев

член-корреспондент РАМН

Ведущая организация:

ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится «12 » ноября 2009 г. в 11.00 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу 119991 г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

РАН.

Автореферат разослан« 9 » октября

2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Секвенирование генома человека и пост-геномный анализ открыли новую эру в биомедицинских исследованиях. Все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека. Это диагностика наследственных заболеваний, анализ генетических изменений в опухолевых клетках при уточнении диагноза и выборе терапии в онкологии. Получила развитие персонализированная медицина, которая изучает генетические особенности человека, его предрасположенность к различным заболеваниям и разрабатывает профилактические меры для их предупреждения. При лечении заболеваний с помощью современных лекарственных средств остро встает вопрос о переносимости лекарственных препаратов и предупреждении развития побочных реакций, что также может определяться генетическими характеристиками пациента. Этими проблемами занимается фармакогенетика, как одно из направлений персонализированной медицины. Также все чаще приходится прибегать к генетическому анализу при решении задач в области криминалистики и судебной медицины. Широкое использование молекулярно-генетических методов в практике невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить одновременный анализ множества генетических изменений. Одним из наиболее перспективных подходов являются биологические микрочипы.

Биологические микрочипы (biological microarrays) как метод анализа генома, широко используют в самых разных областях молекулярной биологии, генетики, биомедицины, онкологии. Различные технологические платформы, применяемые при создании биологических микрочипов, описаны в многочисленных статьях и подробных обзорах (Lee and Saeed, 2007; Hardiman, 2006). Одной из наиболее известных является технология Affymetrix GeneChip (Santa Clara, США). Микрочипы Affymetrix содержат до 10б индивидуальных элементов (зондов) и используются для параллельного анализа более 200 000 полиморфных ДНК маркеров. Особенностью этого типа микрочипов является синтез олигонуклеотидных зондов прямо на поверхности кварцевых стекол с использованием метода фотолитографии. Также используют микрочипы, в которых на твердой подложке иммобилизованы предварительно синтезированные или выделенные фрагменты ДНК. Микрочипы, содержащие большое количество элементов, относятся к так называемым микрочипам высокой плотности и применяются, как правило, в исследовательских целях. Выявление ограниченного набора генетических маркеров, являющихся мишенью в диагностике, делает обоснованным переход к микрочипам низкой плотности, содержащим десятки или сотни элементов. Как правило, в этих случаях используют микроскопические стекла с нанесенными и ковалентно пришитыми зондами. Особенностью технологии гидрогелевых биочипов является трехмерная структура ячеек геля, в которых иммобилизованы зонды (фрагменты ДНК или белки). Технология гидрогелевых биочипов развивается в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН с 1989 г. и является одной из наиболее востребованных платформ для разработки биочипов диагностической направленности.

В настоящем исследовании разработаны и апробированы следующие биочипы: JIK-биочип для выявления и идентификации хромосомных транслокаций; ТЛ-биочип для определения Т-клеточной клональности; РМЖ-биочип для определения мутаций в генах BRCAI/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственной формой рака молочной железы; ПФ-биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации; ПФ-биочип (NAT2) для определения полиморфизма в гене NAT2; ПФ-биочип (Кардио) для определения полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой

системы и ИЛ-биочип для генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека.

Важность анализа транслокаций при лейкозах связана с тем, что это заболевание занимает ведущее место среди онкологических заболеваний у детей. Всего лишь 20 лет назад выживаемость при детских лейкозах составляла 5-10%, тогда как в настоящее время она составляет 60-80% (по данным 5-летней оценки). Такой успех в лечении достигнут благодаря использованию наиболее эффективных комбинаций различных цитостатических препаратов, а также рационализации терапии, основанной на углубленной диагностике заболевания, в том числе и с использованием молекулярно-гснетических методов (Алейникова, 2002; Карачунский и др., 2007). В настоящей работе при создании биочипа были выбраны 13 наиболее клинически значимых и часто встречающихся при лейкозах транслокаций: i(9;22)BCR/ABL р190 и р210, t(12;21 )TEL/AML, t(l;19 )Е2А/РВХ, t(\S;\l)PML/RARA, t(8;21 )AML/ETO, invl6 CBFB/MYH, t(4;l\)MLL/AF4 и другие транслокации с участием гена MLL. Каждая из этих транслокаций определяет вариант лейкоза с определенными клиническими характеристиками, характером течения заболевания, прогнозом и важна для выбора стратегии лечения (Pui et al., 2003).

Определение Т-клеточной клональности имеет значение при диагностике Т-клеточных лимфом. Традиционные методы диагностики: цитология, гистология, иммунофенотипирование и иммуногистохимия во многих случаях не позволяют провести дифференциальный диагноз между опухолевой и реактивной Т-клеточной пролиферацией (Spagnolo et al., 2004). Методы молекулярной диагностики Т-клеточной клональности основаны на наличии одинаково перестроенных генов вариабельного региона Т-клеточных рецепторов (TCR) в опухолевых Т-лимфоцитах. Появление клона Т-лимфоцитов при опухоли сопровождается появлением и развитием популяции клеток с одинаковой перестройкой генов TCR, что может быть зарегистрировано по гибридизации с соответствующими зондами на биочипе.

Наличие мутаций в высоко пенентрантных генах-супрессорах BRCA1 и BRCA2 ассоциируется с повышенным риском развития рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ) у женщин (Miki et al., 1994; Wooster et al., 1995). Эта модель уже является объектом генетического тестирования в странах Западной Европы и в Америке. Было показано, что в России распространен ряд терминальных мутаций (germ-line founder mutations), анализ которых позволяет эффективно выявлять лиц с высокой предрасположенностью к развитию заболевания (Gayther et al., 1997, Loginova et al., 2003; Sokolenko et al., 2007). Эти работы выполнены на выборках пациентов с определенными клиническими характеристиками. Поэтому представляло интерес проведение масштабных исследований для получения более полной картины о частоте различных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке и для выявления доли наследственных форм в общей структуре заболеваемости.

индивидуальность каждого пациента. Так, наследственная недостаточность фермента тиопурин-8-метилтрансферазы (ТРМТ), обусловленная инактивирующими однонуклеотидными заменами в гене ТРМТ, приводит к плохой переносимости лекарственных препаратов тиопуринового ряда (6-меркаптопурин, 6-тиогуанин и азатиоприн) (Lennard et al., 1992). Стандартные дозы этих лекарств высоко токсичны для больных с недостаточностью фермента, причем токсический эффект может быть фатальным (Lennard et al, 1987). В состав биочипа для определения индивидуальной переносимости лекарств также включены гены основных ферментов системы биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2, участвующие в метаболизме широкого спектра лекарственных препаратов. Имеются данные, что полиморфизм в генах системы биотрансформации вносит вклад в формирование некоторых онкологических заболеваний, например, таких как лимфомы и лейкозы, а также влияет на частоту и особенности развития рецидивов при лейкозах у детей (Skibola et al., 1999; Krajinovic et al., 2000; Krajinovic et al., 2002; Gemmati et al., 2004). Исследование частоты аллелей указанных генов в российской популяции у больных и здоровых доноров позволяет выявить генетические факторы риска развития этих заболеваний или рецидива заболевания.

Дальнейшее развитие этот подход к анализу полиморфизма генома при многофакторных заболеваниях получил при создании ПФ-биочипа (Кардио), предназначенного для анализа полиморфизма некоторых генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, участвующих в регуляции кровяного давления. Показано, что такие заболевания, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца и др. могут возникать вследствие неблагоприятного сочетанного эффекта многих (нескольких) аллелей полиморфных генов (Naber and Siffert, 2004). Именно поэтому, разработка подхода для одновременного анализа полиморфизма ряда генов имеет большое значение также и в изучении сердечно-сосудистой патологии.

ИЛ-биочип разработан для применения в другой области современной медицины - судебно-генетической экспертизы. Задачи идентификации личности встают не только при поиске преступника, оставившего следы на месте преступления, но и при опознании: тел погибших при природных или техногенных катастрофах, при террористических актах. В настоящее время основными методами анализа при идентификации личности остаются серологический анализ крови, и молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генома, известных как тандемные повторы с изменяющимся числом копий, в частности микросателлитов или STR (shot tandem repeats) (Gill, et al., 1985). Однако серологический анализ часто не эффективен при исследовании малых количеств биологических следов, а также деградированных образцов. STR-анализ требует пока еще дорогого импортного оборудования. Поэтому актуальна разработка новых недорогих подходов, обеспечивающих скрининг большого количества образцов, но в тоже время обладающих высокой специфичностью и чувствительностью.

Таким образом, биочипы могут служить удобным инструментом при анализе различных генетических изменений, включая как точечные мутации, так и некоторые хромосомные перестройки. Изучение генетических изменений человека в норме и при различных заболеваниях и разработка биочипов различной диагностической направленности для наиболее актуальных областей медицины позволяют поднять на высокотехнологичный уровень, как современную клиническую диагностику, так и биомедицинские исследования в целом.

Цель исследования:

Целью диссертационной работы является разработка метода многопараметрического анализа различных генетических изменений у человека на основе технологии гидрогелевых биочипов для проведения эффективных молекулярно-биологических и биомедицинских исследований, а также решения задач медицинской диагностики.

Задачи работы:

1. Выбрать наиболее клинически значимые хромосомные перестройки при лейкозах у детей и разработать биочип для их выявления и идентификации. Определить частоту встречаемости хромосомных перестроек у детей, жителей России, больных различными формами лейкозов, и создать на основе биочипа диагностическую тест-систему.

2. Разработать метод анализа структурных перестроек локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора с использованием биочипа и апробировать его для определения Т-клеточной клональности при диагностике Т-клеточных лимфом.

3. Разработать метод диагностики точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ и РЯ, и определить частоты данных мутаций у пациентов с РМЖ и/или РЯ, жителей европейской части России.

4. Разработать методические подходы к определению генетической предрасположенности к многофакторным заболеваниям на примере биочипа для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации и биочипа для анализа полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы.

5. Определить частоты аллелей/генотипов генов системы биотрансформации у здоровых жителей европейской части России и у больных лейкозами и лимфомами. Создать на основе биочипа диагностическую тест-систему.

6. Определить частоты аллелей, приводящих к дефициту ферментной активности ТРМТ, у жителей европейской части России. Изучить значение полиморфизма гена ТРМТ при лечении детей, больных лейкозами, препаратами тиопуринового ряда (6-меркаптопурин).

7. Разработать методические походы к генетической идентификации личности по анализу однонуклеотидного полиморфизма на примере локусов HLA-DQA1, ABO и AMEL. Определить частоты аллелей генов HLA-DQA1 и ABO и оценить возможности практического применения метода.

Научная новизна результатов

Разработаны методические подходы к выявлению различных изменений в геноме человека (хромосомных перестроек и точечных мутаций) на основе технологии гидрогелевых биочипов. Создан метод диагностики 13 транслокаций при острых и хронических лейкозах с использованием гибридизации на олигонуклеотидном биочипе. Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей, больных лейкозом. Разработан метод определения Т-клеточной клональности на основе гибридизации на биочипе. Показана возможность применения этого подхода в клинической диагностике Т-клеточных лимфом.

Разработан метод диагностики семи наиболее распространенных точечных мутаций в генах BRCAI/2 и СНЕК2 (185delAG, 300T>G, 4153delA и 5382¡nsC в гене BRCAI, 695insT и 6174delT в гене BRCA2, и llOOdelC в гене СНЕК2). Определены частоты этих мутаций у пациентов с РМЖ, РЯ и первично-множественными

злокачественными новообразованиями (ПМЗН), жителей европейской части России, что представляет интерес для клинической онкологии.

Разработан биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации. Определены частоты полиморфных вариантов генов CYPJA1 (48870А, 4889A>G, 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A, 2637delA), GSTT1 (деления), GSTM1 (делеция), MTHFR (677С>Т, 1298А>С), MTRR (66A>G), NQOl (609С>Т), CYP2C9 (4300Т, 1075С>Т), CYP2C19 (681G>A) и NAT2 (341Т>С, 481С>Т, 590G>A, 857G>A) у здоровых жителей европейской части России, а также у взрослых, больных НХЛ и В-XJUI. Показано, что полиморфные варианты гена CYPIA1 (4887А, 4889G, 6235С) и «нулевой» GSTM1 генотип чаще встречаются у больных НХЛ и B-XJIJI, чем у здоровых индивидов и, таким образом, могут рассматриваться как факторы риска развития этих заболеваний.

Проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTMI, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей, больных острыми лейкозами, и здоровых индивидов. Впервые показано, что генотип NAT2 341T/T,481C/C,590G/G (NAT2*4/*4), независимо, а также в сочетании с «нулевым» GSTT1 генотипом, «нулевым» GSTM1 генотипом и двойным «нулевым» GSTTHGSTM1 генотипом встречается чаще у больных лейкозами, чем у здоровых доноров и, таким образом, может рассматриваться, как фактор риска развития лейкозов у детей. Также обнаружено, что генотип MTRR 66G/G встречается реже у девочек, больных острыми лейкозами, по сравнению с группой здоровых доноров женского пола и, таким образом, может рассматриваться как фактор, предотвращающий развитие лейкозов у девочек.

Определены частоты аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTMI, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 nNAT2y детей с первично диагностированным острым лейкозом и в рецидиве заболевания. Показана ассоциация генотипа CYP1A1*1/*2A и «ненулевого» GSTT1 генотипа с развитием рецидива OJ1JI. При анализе частот аллелей гена NAT2 впервые обнаружено, что у пациентов с рецидивом OJIJI чаще встречается генотип NAT2 341С/-, 481T/-.590G/G.857G/G, тогда как у пациентов с рецидивом ОНЛЛ - генотип 341Т/Т,481С/С,590А/- (по сравнению с пациентами с первично диагностированным ОЛЛ и ОНЛЛ, соответственно).

Разработан ПФ-биочип (NAT2) для анализа полного спектра полиморфных замен-в гене NAT2 и впервые у представителей российской популяции проведен детальный анализ полиморфизма гена NAT2.

Впервые на большой выборке определены частоты аллелей и генотипов гена ТРМТ у здоровых доноров и детей с онкогематологическими заболеваниями, жителей европейской части России. Проведено сравнение этих данных с частотами аллелей и генотипов, полученными для других популяций. Показано, что самым частым аллелем, связанным с дефицитом ферментной активности, является ТРМТ*ЗА (85,7% от всех исследованных аллелей), а более редкими аллелями ТРМТ*ЗС (9,5%) и ТРМТ*2 (4,8%). Это согласуется с ранее полученными данными для популяций Европы и белого населения Америки.

Разработан и апробирован биочип для определения полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы, участвующих в регуляции кровяного давления - ПФ-биочип (Кардио).

Разработан биочип для генетической идентификации личности (ИЛ-биочип), позволяющий анализировать 9 аллелей гена HLA-DQA1, 5 аллелей ABO и 2 аллеля гена AMEL. Определены частоты аллелей HLA-DQA! и ABO у жителей европейской части России.

Практическая значимость работы

Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/4756-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. JIK-Биочип используется в гематологических клиниках для уточнения диагноза, определения прогноза заболевания и выбора терапии. РМЖ-биочип позволяет быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и также используется в онкологической практике. Выявление носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 помогает выбрать эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкологического заболевания. У здоровых носителей это позволяет выбрать тактику проведения мониторинга за состоянием здоровья и профилактику онкозаболеваний.

Диагностическая тест-система ПФ-биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г.). ПФ-биочип используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга РАМН и в ГУ Научном центре здоровья детей РАМН для определения индивидуальной чувствительности к некоторым лекарственным препаратам, в том числе тиопуринам, а также риска развития ряда многофакторных заболеваний и составления генетического паспорта. ПФ-биочип (Кардио), определяющий полиморфизм в генах ренин-ангиотензиновой системы, также используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН для анализа генетической предрасположенности к развитию осложнений при беременности у женщин.

Разработанный ИЛ-биочип позволяет проводить идентификацию биологических следов, содержащих ДНК со средней вероятностью идентификации 99,6%. При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно-медицинской практике при экспертизах, позволяющих сузить круг подозреваемых или при опознании тел погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови ABO (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида, что является важной информацией для следователя при поиске преступника.

Личный вклад автора

Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на Российских симпозиумах с международным участием "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний" (Москва, 2002, 2007, 2008, 2009), 14-й Всемирной конференции по семейным формам РМЖ и РЯ (Мадрид, 2003), Европейских конференциях по генетике человека (Бирмингем, 2003; Мюнхен, 2004; Прага, 2005; Амстердам, 2006; Ницца, 2007; Барселона, 2008), 6-ой Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), конференции Европейского совета по медицинской онкологии (Будапешт, 2005), 7-ой Международной конференции молодых онкологов "Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии" (Киев, Украина, 2006), Международной конференции "Генетика в России и мире", посвященной 40-летию ИОГен РАН (Москва, 2006), 3-ей Международной конференции "Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине" (Новосибирск,

2006), 11-ом Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва,

2007), Международной конференции по геному человека (Хельсинки, 2006), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006), 10-м

Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006), Международном симпозиуме "Advanced Microarray Technologies" (Барселона, 2008). Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН, в ГНЦ РАМН, РОНД им.Н.Н.Блохина РАМН, МНИОИ им. П.А.Герцена Росздрава, ФНКЦ ДГОИ Росздрава.

Публикации

По теме диссертации, помимо тезисов конференций, опубликовано 34 статьи в рецензируемых журналах, одна глава в зарубежном сборнике и два патента. 13 статей опубликованы в зарубежных журналах, 21 статья - в отечественных.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 276 страницах машинописного текста, содержит 47 таблиц и 58 рисунков. Диссертация содержит разделы "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение" и "Выводы". Список литературы включает 470_ ссылок.

Благодарности

Автор выражает признательность всем соавторам и коллегам, принимавшим участие в исследованиях. Особенно хочется поблагодарить всех сотрудников Лаборатории биологических микрочипов, за поддержку и неоценимую помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

Образцы биологического материала представляли собой костный мозг, образцы опухолевой ткани, периферическую кровь или слюну. Весь материал был собран с. соблюдением процедуры информированного согласия. В случае использования биологического материала пациентов до 18 лет информированное согласие об участии в -исследовании было получено у родителей (опекунов) каждого пациента. При.-, проведении популяционных исследований этническая принадлежность индивида-: устанавливалась на основании данных анкетирования с учетом родословной в трех поколениях.

Анализ последовательностей, дизайн и синтез праймеров и зондов

Выбор последовательностей проводили с использованием Интернет-ресурсов NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и Ensembl (www.ensembl.org). Дизайн праймеров и зондов осуществляли с использованием программы Oligo 6.

Праймеры и олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Для иммобилизации по 3'-концу олигонуклеотидов вводили спейсер со свободной аминогруппой, используя 3'-Ammo-Modifier С7 CPG 500 (Glen Research, США).

Изготовление биочипов

Биочипы изготовлены методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов акриламидного геля (www.biochip.ru). Для нанесения капель геля на подложку из пластика использовали робот Affymetrix GMS 417 Arrayer (Affymetrix, США). Размер ячеек биочипа после полимеризации составлял 150 мкм.

Зонды наносили на поверхность микрочипа в определенной последовательности, таким образом, микрочип представлял собой упорядоченную матрицу, в которой заранее определен каждый элемент (рис. 1).

Рис. 1. Биочип с трехмерными голевыми ячейками. А - общий вид; Б -схематичное изображение, показывающее расположение и размеры ячеек. Гелевые ячейки полусферической формы химически пришиты к твердой поверхности, в каждой ячейке иммобилизованы молекулы зонда одного типа.

Выделение ДНК и РНК

РНК выделяли из лейкоцитов костного мозга больных лейкозом экстракцией кислым фенолом или с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). ДНК из лейкоцитов периферической крови или костного мозга выделяли с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя или согласно методике, приведенной в руководстве (Sambrook et а/., 1989). Для выделения ДНК из образцов слюны использовали набор реагентов для выделения Oragene™ DNA Self-Collection Kit (DNA Genotek, Канада) в соответствии с инструкцией, приложенной к набору.

Обратная транскрипция

РНК (2 мкг), выделенную из клеток больных лейкозами, инкубировали при 70'С в течение 5 мин со смесью праймеров, специфичных к анализируемым транслокациям и гену тирозинкиназы ABL, постоянно экспрессирующемуся во всех клетках. Обратную транскрипцию проводили с использованием фермента обратной транскриптазы MMLV. Полученную кДНК использовали как матрицу в мультиплексной ПЦР, проходящей с участием нескольких пар праймеров в одной пробирке.

Проведение полимеразной цепной реакции

Использовали вариант мультиплексной «гнездной» ПЦР в два этапа. В ПЦР-смесь стандартного состава (Силекс, Россия) добавляли праймеры, специфичные к исследуемым генам в количестве 10-25 пкмоль на одну пробирку. В одной мультиплексной смеси присутствовало до 5-6 пар праймеров. Всю смесь нагревали при 94°С в течение 3 мин, затем проводили 20-40 циклов амплификации по следующей схеме: 94°С, 30 с; 60°С, 30 с; 72С1С, 1 мин. В 25 мкл ПЦР-смеси второго этапа вносили 1-2 мкл продукта первого этапа ПЦР. Состав ПЦР-смеси и условия ПЦР были те же, с той разницей, что на втором этапе один из праймеров в каждой паре присутствовал в меньшей концентрации, так, чтобы реакция проходила асимметрично.

Флуоресцентное течение ПЦР-нродукта

Флуоресцентное мечение проводили на втором этапе ПЦР двумя способами. В первом случае использовали праймер, содержащий на 5'-конце краситель пентаметинового ряда (Су-5). При этом праймер, содержащий флуоресцентную метку, добавляли в ПЦР-смесь в более высокой концентрации (5-20 раз), чем немеченый праймер, таким образом, чтобы преимущественно нарабатывалась одна меченая цепь.

При другом подходе оба праймера на втором этапе были немечеными, но концентрация одного из них была в 5-20 раз больше, так чтобы нарабатывалась преимущественно одна цепь ДНК, при этом флуоресцентную метку содержал один из дезоксинуклеотидтрифосфатов, встраивающихся в de novo синтезируемую ДНК-цепь, а именно, Су5-дУТФ.

Гибридизация на биочипе

Для гибридизации меченого продукта на биочипе использовали смесь с общим объемом 30-35 мкл, которая состояла из 6xSSPE (Promega, США), 10-25% формамида (Sigma, США) и флуоресцентно меченного амплификата.

Рис. 2. Схема аллель-специфичной гибридизации на биочипе. В процессе гибридизации происходит специфическое взаимодействие молекул-зондов и молекулы-мишени по принципу комплементарности. Для того, чтобы выявить возникающие в ходе гибридизации стабильные структуры и определить, с каким зондом произошло взаимодействие, молекулы-мишени предварительно метят флуоресцентным красителем. Таким образом, картина гибридизации представляет собой картину распределения флуоресцентных сигналов, наиболее ярких в точках специфического связывания зонда и мишени.

Гибридизационную смесь полностью денатурировали в теченне 5 минут при 95 С, быстро охлаждали во льду, наносили на биочип под крышку гибридизациоиной камеры и инкубировали в течение 10-12 часов при 37°С. Использовали также гибридизационную смесь, содержащую 1,0-1,5 М раствор гуанидин-изотиоцианата. Схема аллель-специфичной гибридизации в ячейках биочипа приведена на рис. 2.

После завершения инкубации гибридизационную смесь удаляли. Биочип отмывали в 1х8БРЕ буфере (Ргоп^а, США) в течение 10 мин при комнатной температуре. Поверхность биочипа высушивали сжатым воздухом и проводили регистрацию флуоресцентных сигналов.

Анализ изображения

Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного прибором с зарядовой связью (ПЗС) и программным обеспечением Imageware (ИМБ РАН, Россия). На изображение биочипа накладывали сетку из окружностей, соответствующих размеру ячеек. В качестве исходных данных использовали нормированные сигналы флуоресценции Jm = (Im -Iô)!(Bm - Io), где Im - интенсивность сигнала на единицу площади внутри соответствующей ячейки, Бт - интенсивность сигнала на единицу площади вне ячеек, отражающая распределение освещенности микрочипа, Iо - темновой ток ПЗС матрицы, а m - номер ячейки чипа. Алгоритм дальнейшей обработки сигналов зависел от конкретной исследовательской задачи.

Секвенирование

Прямое секвенирование проводили на базе Центра коллективного пользования «Геном» ИМБ РАН с помощью набора реактивов BigDye Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США).

Статистический анализ данных

Для проверки соответствия распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга использовали стандартный метод %2 (Вейр, 1995). При сравнении частот аллелей и генотипов и оценке связи аллелей генов с риском развития заболевания использовали двусторонний точный тест Фишера (программа GraphPad InStat).

Оценку относительного риска развития заболевания при определенном генотипе в ретроспективных исследованиях случай-контроль (OR - odds ratio, отношение шансов) рассчитывали по формуле: OR = a/b деленное на c/d, где а = til, b = N-ni, с = n2, d = N2 - п2; N1 и N2- численность выборки, ni и п2 - числа особей с изучаемым признаком в этих двух выборках. В приведенных в данной работе расчетах значение OR указано с 95%-ным доверительным интервалом. Критический уровень значимости для отвержения нулевой гипотезы принимали равным 0,05. Бессобытийную выживаемость у больных лейкозом рассчитывали в соответствии с методом Kaplan-Meier.

Характеристика диагностического метода

Для характеристики разработанных методических подходов использовали следующие понятия: аналитическая чувствительность метода (минимальное количество биологического материала, необходимое для проведения теста), точность метода (доля правильных результатов теста, в сумме истинно положительных и истинно отрицательных результатов теста, в общем количестве результатов теста), специфичность метода (доля истинно отрицательных результатов, выявленных в данном тесте, среди всех отрицательных результатов теста) и чувствительность метода (доля истинно положительных результатов, выявленных в данном тесте, среди всех положительных результатов теста) (Реброва, 2006).

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Анализ генетических изменений при онкологических заболеваниях с использованием биочипов

Наиболее общим фундаментальным свойством опухолевых клеток следует считать нестабильность генома, что проявляется как на хромосомном уровне, так и на уровне отдельных генов. В опухолевых клетках обнаруживается большое количество структурных перестроек, прежде всего транслокаций и делеций, количество которых заметно возрастает по мере прогрессирования злокачественного роста. Не меньшую

роль могут играть мутации в генах, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, дифференцировку, процессы репарации. Поэтому важна разработка методов, позволяющих эффективно проводить молекулярно-генетический анализ определенного типа опухоли и ДНК-диагностику для конкретного пациента.

1.1 Выявление н идентификация хромосомных транслокаций методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе

Специфические хромосомные перестройки, приводящие к образованию химерных или слившихся генов, являются независимыми диагностическими и прогностическими маркерами при лейкозах, которые используют для определения прогноза и выбора стратегии лечения. Хромосомные аберрации встречаются примерно в 40-50% случаев острых нелимфобластных лейкозов (ОНЛЛ) и 30-40% случаев острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). При анализе хромосомных аберраций традиционно используют цитогенетический метод, однако он трудоемок и не всегда надежен. Также распространен метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), однако он является достаточно дорогим и неудобен при анализе нескольких транслокаций одновременно. В методе обратной транскрипции с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с праймерами на отдельные транслокации мишенью является химерная мРНК, экспрессирующаяся в опухолевых клетках, несущих транслокации. Метод ОТ-ПЦР более чувствителен, чем микроскопические методы определения аберраций, однако при одновременном анализе на наличие нескольких перестроек является затратным по времени и по количеству анализируемого материала. Для быстрой и эффективной диагностики лейкозов разработан метод, основанный на гибридизации с биологическим микрочипом, позволяющий анализировать большое количество химерных транскриптов одновременно. Основой анализа является комбинированный подход, включающий обратную транскрипцию РНК пациента с последующей мультиплексной амплификацией продуктов химерных генов и гибридизацию амплифицированных фрагментов на биочипе.

1.1.1 Выбор транслокаций для анализа на биочипе

При выборе хромосомных перестроек для включения в анализ на биочипе, учитывали данные о частоте встречаемости этих перестроек у больных лейкозом детей,,, а также их клиническое значение. Так при ОЛЛ были выбраны хромосомные транслокации t(U\2\)TEL/AMLl, t(9;22)pl90BCR/ABL, t(l;l9)E2A/PBX1\ при ОНЛЛ -t(8;21 )AMLl/ETO, t(15;17)PML/RARA и инверсия im(\(>)CBFB/MYHl 1. Также были включены наиболее часто встречающиеся транслокации с участием гена MIL: t(4;ll) MLL/AF4, t(9;l 1) MLL/AF9, t(ll;19) MLL/ENL, t(ll;19) MLL/ELL, t(6;ll) MLL/AF6, t(10;ll) MLL/AF10. Транслокации с участием гена MLL встречаются у детей до года в 70-80% случаев ОЛЛ и 50-60% случаев ОНЛЛ и являются важным фактором прогноза и выбора терапии. При хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ) патогномоничным признаком является наличие транслокации t(9;22)p210BCR/ABL.

Поскольку места разрыва в генах при образовании транслокаций могут происходить в разных точках, одна и та же транслокация может давать начало нескольким вариантам химерных транскриптов. Наиболее ярким примером является транслокация t(9;22)BCR/ABL, когда разные варианты транскриптов определяют разные формы заболевания (рис. 3).

Был проведен скрининг более 500 образцов РНК, выделенных из костного мозга пациентов, больных лейкозом, методом ОТ-ПЦР по протоколу, разработанному Палисгардом и др. (Pallisgaard et al, 1998) и создана коллекция контрольных образцов, несущих какую-либо из перечисленных выше транслокаций. Коллекция контрольных образцов была использована при разработке и тестировании биочипов.

Химерный ген ВСИАВЬ

е1

е13е14

е19 а2

ЯГ/,

наш □□□□по

Ген ВСЯ, хромосома 22

РНК еТЙ^ 'беток рЙО ВС!Ч/АВ1-

ген АВ[хромосома

иди

РНК е14-а2, белок р210 ВСШАВ1_ •

а2

РНКе13-а2, белок р210 ВСЯ/АВ1_

. ЬЗ

РНК е1 а2, белок р190 ВСРУАВ1_ —^--^ <-

Рис. 3. Схематичное изображение транслокации 1(9',22)ВСЯ/АВЬ. Вариант е1а2 приводит к образованию химерного белка ВСЯ/АВЬ тирозин-киназы р 190 (м.в. 190 кД), который характерен для ОЛЛ; варианты е13а2 (Ь3а2) и е14а2 (Ь2а2) приводят к появлению белка р210, характерного для ХМЛ; вариант е19а2 дает белковый продукт р230. Стрелками схематично показано расположение праймеров, участвующих в ПЦР, отрезками - расположение олигонуклеотидных зондов.

1.1.2 Выбор последовательностей праймеров и зондов для анализа химерных генов на биочипе

При подборе последовательностей праймеров и олигонуклеотидных зондов для анализа транслокаций исходили из следующих положений:

• Для каждого варианта химерного транскрипта один праймер должен располагаться внутри одного гена, участвующего в образовании транслокации, другой праймер - внутри второго гена так, чтобы продукт амплификации мог образовываться только при наличии транслокации.

• Праймеры должны обладать высокой специфичностью по отношению к данному химерному транскрипту и давать ПЦР продукт 2-го этапа длиной 150-300 п.о. (для быстрой диффузии в гель).

Для каждой транслокации были подобраны несколько олигонуклеотидных зондов: один зонд находился внутри одного из генов и являлся общим для всех вариантов химерного транскрипта с участием этого гена, другие зонды были специфичны к последовательностям в месте слияния генов. Таким образом, с помощью набора зондов можно определить транслокацию и вариант химерного транскрипта.

Несколько другой принцип использован при подборе зондов для анализа МЫ-транслокаций. Как правило, в образовании транслокации участвует 5'-конец гена МЫ и 3'-конец одного из так называемых генов-партнеров. В большинстве случаев ген МЫ в процессе транслокации претерпевает разрыв в 4 интронах - между 8 и 9 экзонами, между 9 и 10 экзонами, между 10 и 11 экзонами и между 11 и 12 экзонами (рис.4). То есть мРНК с ЛСХ-транслокацией представляет собой участок мРНК гена МЫ, обрывающийся после 8-11 экзонов, к которому примыкает участок мРНК гена-партнера, продолжая транскрипционную единицу. Так как многие гены-партнеры имеют также

несколько участков, по которым происходят перестройки (от 2 до 4), то возможно около 50 возможных комбинаций МЫ - ген-партнер. Поэтому для анализа М£Х-транслокаций мы использовали зонды, расположенные в экзонах генов, участвующих в транслокациях.

BCR

1 с1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

□ □□ I II I □ П 11 IDCZZ3D

Рис. 4. Схематичное изображение гена MLL. При образовании транслокации разрывы происходят в районе BCR (breakpoint region) в интронах между 8 и 12 экзонами. Отрезками обозначены олигонуклеотидные зонды, расположенные в экзонах гена MLL.

Схема биочипа для анализа 13 хромосомных перестроек представлена на рис. 5.

1(8;21) AML1/ETO t(8;21) AML1/ETO ABL ABL t(9;22) BCR/ABL Ь3а2 t(9;22) BCR/ABL Ь3а2

t(8;21) ETO t(8;21) ETO invl6 CBFB/MYH invl6 CBFB/MYH t(l;19) E2A/PBX1 t(l;19) E2A/PBX1 t(9;22) BCR/ABL Ь2а2 t(9;22) BCR/ABL Ь2а2

t(15;17) PML/RARA ВсгЗ t{15;17) PML/RARA ВсгЗ invl6 CBFB/MYH invl6 CBFB/MYH t(l;W) PBX1 t(l;19) PBX1 t(9;22) BCR/ABL ela2 t(9;22) BCR/ABL ela2

((15,-17) PML/RARA Bcrl f(!5;J7) PML/RARA Bcrl invl6 CBFB/MYH invl6 CBFB/MYH l(12;21) TEL/AML1 J2 t(12;21) TEL/AML1 J2 t(9;22) ABL t(9;22) ABL

t(15;17) RARA t(15;17) RARA invl6 CBFB invl6 CBFB t(12;21) TEL/AML1 J1 t(12;21) TEL/AML1 J1 AF 103 exon AF 103 exon

AF 6 exon AF 6 exon ENL exon ENL exon t(12;21) TEL t(l2:2!) TEL AF 10 2 exon AF 10_2 exon

AF' 1J exon 4 AF 4_2 exon 4 ELL 2 exon 2 ELL 2 exon 2 AF 9_2 exon AF 9_2 AF 10 J exon AF 10_2 exon

AF exon 5 AF4_1 exon S ELL 1 exon 3 ELL 1 exon 3 AF9_1 exon AF9J exon AF 10.1 exon AF 10_1 exon

MLL exon 8 MLL exon 8 MLL exon 9 MLL exon 9 MLL exon 10 MLL exon 10 .MLL exon 11 MLL exon 11

M M

Рис. 5. Схема расположения олигонуклеотидных зондов на ЛК-Биочипе. Каждая ячейка продублирована. М - ячейка, маркированная флуоресцентным красителем.

1.1.3 Разработка процедуры анализа транслокаций.

Метод выявления транслокаций при помощи олигонуклеотидного биочипа включает следующие этапы: выделение РНК из лейкоцитов костного мозга или

периферической крови; обратную транскрипцию с праймерами длиной 12-15 нуклсотидных оснований, специфичных к генам, вовлеченным в транслокации; двухэтапную мультиплексную ПЦР; введение флуоресцентной метки в виде Cy5-dUTP на втором этапе ПЦР; гибридизацию на олигонуклеотидном биочипе и анализ изображения.

Примеры гибридизационных картин представлены на рис. 6. В верхнем ряду биочипа расположены зонды, комплементарные участкам гена ABL, экспрессируюшегося во всех клетках. Ген ABL служит положительным контролем выделения РНК и прохождения обратной транскрипции.

О О Ш о О

о о о о о oö о оо о о о о о о О О 0° С ООО

0 0 с о о о оооооооо сооосооо с ооосо оо о о со

Report (Лейкемия-Биочип-MLL) 03.07.2007 10:57:00

••* »00

« • ООО q о о QOOOOOOO

00000000 оооооооо 00 оооо оо оооооооо оооооооо

о о о о о о ------ ®

00 I % о о оооооооо оооооооо оооооооо оооооооо •• о о о о о о о ооооооо оооооооо

• • "ОООО ® *

Рис. 6. Примеры картин гибридизации. А - образец, не содержащий транслокаций, светятся только ячейки с зондами к гену ABL; Б - образец с транслокацией t(S;2\)AML/ETO; В - образец с транслокацией t(6;l 1 )MLL/AF6.

Методом последовательных разведений определена аналитическая чувствительность метода, она составила 1 клетку, несущую транслокацию, на 103-104 нормальных клеток. При тестировании ЛК-биочипа на контрольных образцах точность метода составила не менее 98%.

1.1.4 Скрининг клинических образцов и определение частоты встречаемости транслокаций у больных лейкозом детей

Образцы костного мозга или периферической крови были получены от пациентов в возрасте от 0 до 18 лет, проходивших лечение в онкогематологических отделениях Российской детской клинической больницы (РДКБ) Росздрава (Москва), Морозовской городской детской клинической больницы (Москва), Московского областного онкологического диспансера (Балашиха) и других городских и областных больниц в период с 2000 по 2008 год. Диагноз устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов. Всего в исследование было включено 1200 детей, жителей различных регионов России (рис. 7).

ОЛЛ ОНЛЛ

•О; 19) 1(4;11)

2.4% (2.4%)

t(9;22)p190 \ 11q23

(4.6%) \ (1.2%)

t(12;21)

12.8% - 1 щт

Транслокации не

обнаружены

(75.6%)

t(6;11) t(11;19)ELL (2%) ,(1,2%) t(9;11) (10.5%)

t(10;11) . . (1,2%) \

Inv (16) (4%)

Транслокации не обнаружены (63.6%)

900 пациентов с ОЛЛ (24.4%) 300 пациентов с ОНЛЛ (36.4%) Рис. 7. Частоты встречаемости транслокаций при ОЛЛ и ОНЛЛ у детей.

Как видно из диаграммы на рис.7 при ОЛЛ анализируемые хромосомные перестройки встречаются у 24.4 % пациентов. При ОНЛЛ - у 36,4%. Наиболее частой транслокацией при ОЛЛ является t(12;21 )TEL/AML (12,8%). При ОНЛЛ наиболее частыми являются транслокации t(8;21 )AML/ETO (9,5%), t{\S\\l)PML/RARA (8,0%) и t(9;l\)MLL/AF9 (10.5%). Все случаи обнаружения химерного транскрипта с использованием биочипов были независимо подтверждены методом ОТ-ПЦР с индивидуальными праймерами. Полученные нами данные по частоте встречаемости транслокаций у детей, больных лейкозом, в РФ близки к литературным данным по другим странам (Hunger et al„ 1998; Rubnitz et а!., 2002).

Было исследовано клиническое значение транслокаций при ОЛЛ. Результаты терапии в группе пациентов с наличием t(\2:2\)TEL/AMLI оказались значительно выше, чем в группе детей без транслокаций (бессобытийная выживаемость 91,3% у пациентов с t(12;21) против 82% у пациентов без транслокаций). Напротив, у детей с t(4;l 1 )MLL/AF4 или 1(9,22) В С R/ABL эффективность терапии оказалась достоверно ниже, чем в группе сравнения, бессобытийная выживаемость составила 57% против 83%. Полученные нами результаты полностью согласуются с данными других исследователей и свидетельствуют о важной роли транслокаций в определении прогноза (Исаева у др., 2004).

Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована Федеральной службой Роездравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике. В настоящее время тест-система ЛК-Биочип используется для анализа клинических образцов из РДКБ (Москва) и 17 региональных гематологических центров РФ.

Резюме. Разработан метод выявления и идентификации хромосомных аберраций при лейкозах. Мишенью для анализа является мРНК в лейкемических клетках. После выделения РНК и постановки обратной транскрипции, проводят двухэтапную ПЦР и гибридизацию на олигонуклеотидном биочипе. На основе этого подхода создана и сертифицирована для применения в клинике диагностистическая тест-система ЛК-Биочип. Метод апробирован на клинических образцах 1200 пациентов. Хромосомные транслокации обнаружены у 24,4% пациентов с ОЛЛ, 36,4% пациентов с ОНЛЛ. В настоящее время этот подход используется для определения транслокаций при лейкозах в гематологических отделениях РДКБ и других детских больниц. Точность метода составила не менее 98%.

1.2 Определение Т-клеточной клональности методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе

Т-клеточные лимфомы встречаются в 15-20% случаев всех лимфоидных опухолей. Диагностика Т-клеточных опухолей традиционно основывалась на сочетании клинических данных, гистологического анализа и иммунофенотипирования. Однако, во многих случаях для постановки точного диагноза необходимо определение Т-клеточной клональности молекулярными методами. В основе этих методов лежит анализ перестроенных локусов Т-клеточных рецепторов в популяции Т-лимфоцитов (рис. 8).

VI 2345 50 67891011 111111111111

фирЛ ¿ргзг \ С1 \ / С2

-НН-

перестройка

Сплайсинг, мРНК транскрипция

Трансляция Белок

VI .¿2.^4

VI Л с

сриэ

Рис. 8. Схема перестройки локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора в результате сайт-специфической рекомбинации при созревании Т-лимфоцитов.

Т-клеточная клональность принято оценивать с помощью Саузерн-блот гибридизации или полимеразной цепной реакции с последующим анализом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (РСЯ-ЗвСР). Обнаружение моноклональности методом Саузерн-блот гибридизации не нашло широкого применения в клинической практике, так как данный метод требует больших временных затрат, большого количества ДНК, и обычно включает в себя использование радиоизотопов. Метод РСЯ-вБСР является более простым, дешевым и быстрым, не требует работы с радиоактивными веществами. Однако данный анализ включает

проведение электрофореза высокого разрешения, что является достаточно трудоемким. Также может быть использован метод ПЦР в реальном времени (Yang, 2005), но этот подход не получил широкого распространения. Нами предложен новый метод на основе мультиплексной ПЦР и гибридизации на олигонуклеотидном биочипе для анализа перестроенных фрагментов локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора (TCRy). В данном случае с помощью биочипа можно анализировать все возможные комбинации V-и J-генов, возникающие в ходе перестройки.

В работе использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови, а также измельченной свежей или замороженной ткани лимфатических узлов. Процедура анализа включала выделение ДНК, двухэтапную мультиплексную ПЦР, введение метки на втором этапе ПЦР с помощью флуоресцентно меченого праймера, гибридизацию на биочипе. На обоих этапах ПЦР проводили по 20 циклов так, чтобы реакция не выходила на плато. Это позволило проводить анализ соотношения различных вариантов перестроенных генов в популяции Т-лимфоцитов, что необходимо для отличия поликлональности от моноклональности.

12 уз v4 vs 17 vs

Jy v-/9-11

• ее • в

• 1 # Л/2 Jpl Jf • %2 •

• w ш vn Ш ф щ

• • ®

■6 1с 4

э со о

•п V3 V4 vs V? Vß J1/2 Jpl Jp Jp2 Vit vw vn

TCR-y гены

Рис. 9. Определение Т-клеточной клональности на биочипе. А - поликлональный образец, Б - образец больного Т-клеточной лимфомой, несущий биаллельную перестройку V8-.Il/2 и У11-Л/2. Слева - картины гибридизации, справа - диаграммы распределения флуоресцентных сигналов в ячейках биочипа, прямая линия соответствует пороговому значению (П).

При анализе изображения использован следующий алгоритм. Из массива нормированных сигналов флуоресценции {,/,„} исключали А'сигналов с максимальными значениями, где N выбиралось равным максимальному числу перфектных дуплексов при

наличии моноклональной перестройки TCRy в изучаемом образце. Оставшиеся (после удаления выбросов) сигналы использовали для вычисления значении среднего фонового сигнала <J>, его дисперсии а и порогового значения для сигналов П = <J> + 4 а. Далее считали, что сигналы J„„ значения которых превышают П, соответствуют перфектным дуплексам. По найденным таким образом числу и положениям перфектных дуплексов определяли наличие и конкретный тип перестройки локуса TCRy. В качестве референс-метода использовали метод PCR-SSCP.

Биочип содержит олигонуклеотидные зонды на все V и J-гены, участвующие в перестройках у-цепи TCR (рис.9). Метод выявляет только перестроенные у-цепи; в не перестроенной у-цепи V и J-гены удалены друг от друга на значительное расстояние, что делает амплификацию невозможной. В поликлональной популяции Т-лимфоцитов различные комбинации V-J встречаются приблизительно с равной частотой, соответственно амплифицированные фрагменты, представляющие различные комбинации, нарабатываются с одинаковой эффективностью. В результате флуоресцентные сигналы в ячейках биочипа, содержащих зонды на разные V- и J-гены, имеют приблизительно одинаковую интенсивность (рис. 9, А). Все они не превышают выбранного значения П, равного <J> + 4 ¡т.

При преобладании в образце клеток, несущих в результате перестройки определенную V-J комбинацию, с первых циклов ПЦР начинают нарабатываться однотипные фрагменты ДНК. Таким образом, амплифицированный продукт преимущественно представлен данной комбинацией V-J сегментов, далее этот продукт специфично гибридизуется с соответствующими зондами на биочипе (рис.9, Б). Это приводит к появлению сигналов, превышающих выбранное значение П интенсивности флуоресценции. В данном случае можно говорить о преобладании в образце клона Т-лимфоцитов, содержащих биаллельную перестройку: V8-J1/2 в одной хромосоме и VII-J1/2 в другой хромосоме.

Метод апробирован на 49 образцах больных лимфомой и 47 образцах здоровых доноров. Результаты анализа на биочипе полностью совпали с результатами, полученными PCR-SSCP методом, таким образом, точность метода с использованием биочипов относительно PCR-SSCP метода составила 100%. Аналитическая чувствительность метода определена при последовательных разведениях ДНК опухолевого клона (клеточная линия Jurkat) в ДНК поликлонального образца. Выявление соответствующей перестройки и определение образца как моноклонального оказалось возможным при концентрации опухолевых клеток 5-10%. Ранее показано, что чувствительность PCR-SSCP метода составляет 88%, а специфичность - 92% (Сидорова, 2004). В целом, по литературным данным частота выявления Т-клеточной клональности при доказанных опухолях составляет в зависимости от метода 66-96% (Cozzio and French, 2008).

Также нами определены частоты, с которыми различные Vy и Jy гены вступают в клональные перестройки TCR-y локуса. Наиболее часто в перестройки вовлечены Vy гены семейства 1, а именно, Vyl-8 (62%), реже всего в перестройках участвует Vyll (3,5 %). Из Jy генов наиболее часто в перестройки вовлекаются гены Jy I и Jy2 (наш метод их не различает), частота случаев составляет 81,6% от всех перестроек с участием Jy генов. Этот факт находит отражение при анализе поликлональных образцов, в большинстве случаев сигнал от Jyl/2 зонда заметно превышает сигналы от Jpl, Jp и Jp2 зондов (рис.9, А)

Резюме. Разработан метод определения Т-клеточной клональности по анализу перестроек V и J генов локуса Т-клеточного рецептора с помощью TJI-биочипа. В поликлональной популяции Т-лимфоцитов различные комбинации V-J встречаются с приблизительно равной частотой. При преобладании в образце клеток, несущих в

результате перестройки определенную V-J комбинацию, с первых циклов ПЦР начинают нарабатываться однотипные фрагменты ДНК, что и выявляется в результате гибридизации на биочипе. Метод позволяет осуществлять дифференциальную диагностику реактивной и опухолевой Т-клеточной пролиферации при наличии 5-10% опухолевых клеток в образце. Чувствительность и специфичность метода составляют около 90%.

1.3 Анализ мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственной формой рака молочной железы и рака яичников

Наследственные мутации генов BRCA1 и BRCA2 обусловливают до 70-80% риска развития рака молочной железы (РМЖ) на протяжении всей жизни (в возрасте до 70 лет), а также от 10 до 30 % риска развития рака яичников (РЯ). На данный момент описано свыше 1400 различных наследственных мутаций в гене BRCAJ и 1200 мутаций в гене BRCA2. Для каждой популяции имеется свой спектр и частота мутаций BRCA1/2 генов (Breast Cancer Information Core - BIC date base online, http://www.nhgri.nih.gov). Существуют мутации, свойственные только определенным этническим группам. В частности, в популяции евреев Ашкенази найдены две преобладающие мутации в гене BRCA1 - 185delAG и 5382insC, и мутация 6174delT в гене BRCA2, встречающиеся с суммарной частотой примерно 2,6% в общей популяции (Roa et al„ 1996). На основе данных о спектре мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 в популяциях соседних и этнически близких стран (Латвии, Литвы, Польши, Белоруссии), а также по результатам исследований, проведенных в России, были выбраны семь наиболее частых мутаций в данных генах (185delAG, 300T>G, 4153delA, 5382insC в гене BRCA1\695insT и 6174delT в гене BRCA2; HOOdelC в гене СНЕК2) и полиморфизм 4158A>G в гене BRCA1 для дальнейшего их анализа на биочипе. Известно, что эти мутации (за исключением полиморфизма 4158A>G) приводят к частичной или полной потере активности белковых продуктов данных генов, участвующих, прежде всего, в процессах репарации ДНК. Потеря белками их функций приводит к нарушениям внутриклеточных процессов и, как следствие, к возникновению опухоли.

1.3.1 Разработка РМЖ-биочипа и процедуры генотипирования для анализа мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2

Для каждой нуклеотидной позиции, в которой может произойти одна из-выбранных нами мутаций, подобрана пара дискиминирующих олигонуклеотидных зондов: один зонд представляет собой участок последовательности дикого типа длиной от 15 до 20 и.о., другой - соответствующую мутантную последовательность. Ячейки на биочипе дублированы для повышения надежности процедуры анализа изображения. В двух верхних рядах биочипа размещены зонды, соответствующие последовательностям дикого типа, в двух нижних - мутантным последовательностям. Анализируемый нуклеотид (несколько нуклеотидов) расположен в центральной части зонда. Примеры последовательностей зондов для определения мутации 5382insC приведены в таблице 1.

Табл. 1. Пара олигонуклеотидных зондов для определения мутации 5382insC

5382insC WT AGA GAA ТСС CAG GAC AGA А

MUT GAG ААТ ССС CAG GAC AGA

Анализ мутаций на биочипе включал следующие этапы: выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови или клеток буккального эпителия, содержащихся в образцах слюны; проведение двухэтапной ПЦР; введение флуоресцентной метки в продукт ПЦР второго этапа с помощью флуоресцентно меченого праймера; гибридизация меченого продукта ПЦР на биочипе; анализ изображения. Схема биочипа и картины гибридизации представлены на рис. 10.

1 2 3 4 5 6 7 8

ШАв зоот 4ША 4158А 5382 695А 6174Т 1100С

185Ав зоот 4153А 4158А 5382 695А 6174Т 1100С

ШсЫАС зоов 4153(1е1А 4158в 5382т$С 695шзТ 6174с1е1Т 1100ае1С

ШсИАв ЗООС 153с1е1А 4158С 5382т!С 695тБТ 6174(1е!Т 1100йе1С

185 300 4153 4158 5382 695 6174 1100 йе|АС Т>С (1е1А А>в ¡п^С ¡гаТ (1е1Т (1е1С

Рис. 10. А - схема РМЖ-биочипа для анализа мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 (ячейки серого цвета соответствуют последовательностям дикого типа; ячейки белого цвета - мутантным последовательностям). Примеры картин гибридизации (слева), полученных для образца ДНК, не содержащего исследуемых мутаций (Б), и несущего мутацию 300Т>С в гене ВЯСА1 (В), а также диаграммы значений нормированных сигналов флуоресценции ячеек биочипа (справа).

Для определения точности метода с помощью РМЖ-биочипа было протестировано 37 контрольных образцов ДНК с известным генотипом, предоставленных Биомедицинским центром Латвийского университета (Рига). Результаты гибридизации на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами (ЭЭСР и прямое секвенирование). Контрольные образцы с мутациями в гене ВЯСА2 были выявлены при тестировании пациентов с помощью РМЖ-биочипа, результаты подтверждены секвенированием. Точность метода при тестировании контрольных образцов составила 100%. Аналитическая чувствительность была определена методом последовательных разведений. Минимальное количество ДНК, необходимое для однозначной идентификации мутаций, составляет около 500 пкг.

1.3.2 Анализ частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 в группах больных РМЖ, РЯ и ПМЗН

Пациенты с онкологическими заболеваниями (с диагнозом РМЖ, РЯ, ПМЗН) для исследования на наличие мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 были отобраны в период с 2004 по 2006 гг. в Российском онкологическом научном центре РАМН им. H.H. Блохина (Москва). Диагноз устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов. Выборка была смешанной по возрасту и семейной истории заболевания.

Частота мутации (%)

-Л

■TU

J......Tili

■ РМЖ (п=385)

□ РЯ (11=68)

□ ПМЗН (и=33)

_г1......_ll......■

is5mag 300t>g 41s3dcla 4i58a>(i 53s2insc 69smst 6174delt 1100mc

brca1 brcal brcal brcal brcal 1irca2 brca2 chek2

РМЖ 0,3 0,3 0.6 1,3 3,4 0,3 0,3 1.3

РЯ 1,5 0 0 0 10,3 0 0 0

ПМЗН 3 9,1 3 0 18,2 0 0 6,1

Рис. 11. Частоты мутаций в генах ВЯСА1/2 и С.НЕК2 у больных РМЖ, РЯ и ПМЗН (с поражениями МЖ и яичников).

В соответствии в диагнозом и клиническими особенностями пациенты были разделены на три группы. В первую группу входили женщины с диагнозом РМЖ (п=385, возраст от 23 до 85 лет, средний возраст - 53 года), во вторую - женщины с диагнозом РЯ (п=68, возраст от 31 до 76 лет, средний возраст - 55 лет). Третья группа состояла из женшин с диагнозом ПМЗН с поражением МЖ и яичников (п=33, возраст от 27 до 79 лет, средний возраст - 50 лет). Все пациенты были жителями европейской части России.

Из 385 пациентов с диагнозом РМЖ у 18 пациентов (4,6%) были обнаружены мутации в гене ВЯСА1, у 5 пациентов (1,3%) - полиморфизм 4158А>6, у 2 пациентов (0,5%) - мутации в гене ВЯСА2 и у 5 пациентов (1,3%) - вариант 1100с1е!С в гене СНЕК2. Из 68 больных РЯ у 8 (11,8%) были обнаружены мутации в гене ВЯС.А1\ исследуемых мутаций в гене ВЯСА2 и варианта 1100<1е1С в гене СНЕК2 обнаружено не было. В группе пациентов с диагнозом ПМЗН у 11 пациентов (33,3%) были обнаружены мутации в гене ВЯСА1, и у 2 пациентов (6,1%) была обнаружена мутация 1100ёе1С в

гене СНЕК2; исследуемых мутаций в гене BRCA2 найдено не было. Частоты каждой конкретной мутации в трех группах пациентов показаны на рис. 11.

Наибольшая частота четырех исследуемых мутаций в гене BRCA1 (185delAG, 300T>G, 4153delA, и 5382insC) найдена у больных ПМЗН с поражением МЖ и яичников. Из 11 пациентов-носителей мутаций в гене BRCA1 у 8 (72,7%) был сочетанный РМЖ и РЯ. Это позволяет сделать вывод о том, что одновременное поражение МЖ и яичников может служить маркером наличия у пациента мутаций в гене BRCA1 и, следовательно, наследственной формы злокачественных новообразований.

Россия

_Россия iSokolenko et al„ 2007)_n=857**

~~1-1

' n=822

gjl 1-1 n=2012 Польша(Gorskieia/., 2005)

вГп^ООО

Ц.; ..:.1 „ ...y .......,,...—1-1 11 412 Ашкенази (Warnereta/., 1999)

: -I-1 n=500 Венгрия (van derLooijeta/., 2000)

I v - ,■.......□-1 n=800 Германия (Backeeta/., 1999)

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Частота мутации

(%)

Рис. 12. Частота мутации 5382insC в гене BRCA1 у больных РМЖ и здоровых лиц в различных странах. Обозначения: (*) - настоящее исследование, (**) - выборка больных с билатеральным РМЖ, серый цвет - выборка больных РМЖ, черный цвет -популяционная выборка, п - число пациентов в выборке).

Полиморфизм 4158A>G в гене BRCA1 был обнаружен при изучении больных с диагнозом РМЖ и РЯ в Латвии (Tichomirova et al., 2005). В нашем исследовании этот полиморфизм был обнаружен только в выборке пациентов с диагнозом РМЖ у пяти человек (1,3%). У всех этих пациентов отсутствовала семейная история заболевания РМЖ. Таким образом, данных в пользу ассоциации полиморфизма 4158A>G с наследственными формами РМЖ и РЯ получено не было, хотя для окончательного ответа требуется широкомасштабное исследование популяции здоровых доноров.

Наиболее часто встречающейся мутацией в гене BRCA1 во всех трех группах пациентов была мутация 5382insC (в группах пациентов с РМЖ, РЯ и ПМЗН ее доля от всех остальных изучаемых нами мутаций в гене BRCA1 составила 56, 87 и 55%, соответственно). На рис. 12 показаны частоты данной мутации в России и в других странах у больных РМЖ (смешанные по возрасту и семейной истории заболевания выборки) в сравнении с общими популяционными выборками. Показательно, что в России данная мутация встречается чаще, чем в других популяциях, при этом ее частота в общей популяции жителей России, по-видимому, крайне низка (Sokolenko et al, 2007). Исходя из того, что мутация 5382insC в гене BRC.A1 является мажорной во всех трех группах пациентов, она в первую очередь должна быть включена в список мутаций для генетического тестирования. Следует отметить, что наиболее широкий спектр мутаций выявлен у пациентов с РМЖ. Так, все мутации, представленные на биочипе, хотя бы по одному разу были обнаружены у пациентов с РМЖ. Более узкий спектр мутаций при РЯ

может отражать специфику заболевания, но также быть связанным с меньшим размером выборки.

Отдельно следует сказать о мутации 110(Ме1С в гене СНЕК2. Ген СНЕК2 относится к низко пенетрантным генам (у носителей данной мутации риск возникновения РМЖ в два раза выше) (Меуеге-НеуЬоег е1 а!., 2002). В нашем исследовании эта мутация была обнаружена у 5 пациентов (1,3%) с диагнозом РМЖ. В другом исследовании российских ученых ее частота в смешанной выборке пациентов с диагнозом РМЖ составила 2,1% (СЬектагеуа е/ а!., 2006). В группе больных РЯ эта мутация нами не обнаружена.

1.3.3 Клиническое значение мутаций в генах ВИСЛ1/2 и СНЕК2

Статистически значимые расхождения в среднем возрасте для пациентов-носителей мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 и пациентов без мутаций были найдены для больных РМЖ и ПМЗН (р= 0,0006 и 0,0003, соответственно) (табл.2).

У большинства больных РМЖ и ПМЗН, носителей мутаций в гене В11СА1, заболевание возникло в возрасте до 40 лет включительно (53% и 64% соответственно). Это согласуется с данными других исследований, где показано, что ранний возраст манифестации заболевания является характерным признаком его наследственной формы (Могшгие/о/., 1997).

Табл. 2. Сравнение среднего возраста пациентов-носителей мутаций и пациентов, у которых исследуемые мутации обнаружены не были.

Пациенты Средний возраст, лет

РМЖ РЯ ПМЗН

Носители мутаций 44,9±13,2 48,3±10,0 41,6±4,9

Без мутаций 53,7±11,8 56,1±10,9 55,1±12,7

Р 0,0006 0,0518 0,0003

Среди 38 пациентов-носителей мутаций в генах BRCA1/2 семейный анамнез был доступен только у 28 человек. Из них у 26 (93%) носителей мутаций в гене BRCA1/2 был выявлен онкологически отягощенный семейный анамнез (один или более родственников первой степени родства имеет РМЖ и/или РЯ или другую локализацию опухоли в анамнезе). У двух пациентов (7%) семейная история заболевания отсутствовала. Это можно объяснить неполной пенетрантностью мутаций в гене BRCA1, наличие которых обуславливает от 60 до 80% риска возникновения РМЖ до 70 лет (Ford et al., 1994). В случае мутации 1100delC в гене СНЕК2 только одна пациентка (14%) из семи носителей была из семьи с отягощенным анамнезом (у матери пациентки был выявлен РМЖ), у остальных шести (86%) - онкологически отягощенный анамнез выявлен не был. Это соответствует ранее полученным данным о низкой пенетрантности мутации 1100delC в гене СНЕК2 по отношению к развитию РМЖ.

Родословная онкологически отягощенной семьи, где у пробанда с помощью анализа на РМЖ-биочипе была выявлена мутация 5382insC в гене BRCA1, показана на рис. 13.

Рис. 13. Родословная пациентки В.

Таким образом, доля наследственных форм РМЖ и РЯ в общей структуре заболевания у российских пациентов составляет более 6%, что делает обоснованным проведение генетического тестирования среди пациентов для выявления наследственных форм этих заболеваний. При этом особое внимание следует уделять пациентам, имеющим сочетанный РМЖ и РЯ, поскольку по нашим данным у этих больных наблюдалась самая высокая частота мутаций в гене ВЯСА1. Также генетическое тестирование показано пациентам с манифестацией заболевания в раннем возрасте (до 40 лет) и наличием семейной истории заболевания. Обнаружение мутаций, ассоциированных с наследственной формой РМЖ или РЯ, у пациента имеет значение для выбора стратегии лечения, так как при этих формах высока вероятность возникновения билатерального рака. Обнаружение мутации в доклинической стадии позволяет принимать профилактические меры, предупреждающие развитие заболевания (профилактическая мастэктомия и овариэктомия, прием тамоксифена), или меры, направленные на раннюю диагностику.

Резюме. Разработан РМЖ-биочип для определения 7 мутаций, определяющих наследственную форму РМЖ и РЯ, наиболее распространенных в странах Восточной Европы. С помощью РМЖ-биочипа протестировано 385 образцов ДНК пациентов с диагнозом РМЖ, 68 образцов пациентов с диагнозом РЯ и 33 образца пациентов, имеющих ПМЗН с поражением МЖ и/или яичников. Мутации в генах ВЯСА1/2 обнаружены у 6,4% пациентов с РМЖ, 11,8% пациентов с РЯ и 39,4% пациентов с ПМЗН с поражением МЖ и/или яичников. Наиболее частой мутацией во всех группах является мутация 5382т5С в гене ВЕСА!.

2 Анализ многофакторных заболеваний и фармакогенетические исследования с использованием биочипов

Многие распространенные заболевания человека, такие как, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, артериальная гипертония, спорадический рак различной локализации, астма, диабет и др. обусловлены сочетанием многих генетических факторов и факторов внешней среды. Вклад генетических факторов в развитие заболевания может быть различен, составляя от 10 до 40-50% на протяжении жизни. В

этой ситуации наличие определенных аллельных состояний генов не приводит к жестко детерминированным последствиям, а определяет лишь большую или меньшую вероятность развития заболевания.

2.1 Изучение полиморфизма в генах системы бнотрансформации

К таким широко известным генетическим маркерам, играющим заметную роль в развитии многих многофакторных заболеваний, относятся гены системы биотрансформации. Гены кодируют белки, осуществляющие дезактивацию и детоксикацию ксенобиотиков (мутагенов, канцерогенов, лекарственных средств, пищи и т.д.), и характеризуются значительной вариабельностью. Это, в частности, приводит к существованию фармакогенетического полиморфизма, т.е. к разным фенотипическим реакциям у пациентов на одни и те же лекарственные препараты. Одним из ферментов с ярко выраженным проявлением фармакогенетического полиморфизма, является тиопурин-8-метилтрансфераза (ТРМТ).

2.1.1 Анализ полиморфизма гена ТРМТ, приводящего к недостаточности фермента тиопурин-в-метил-трансферазы

Известно, что в среднем у 1 из 300 человек имеется выраженная недостаточность ферментной активности (ТРМТ), что приводит к тяжелой миелосупрессии при применении стандартных доз при лечении тиопуринами. Около 10% населения имеют промежуточную активность ТРМТ, при которой также возможно развитие токсического эффекта. Примерно 90% популяции имеют высокую активность ТРМТ (Кгупе181ау е/ а!., 1996).

В настоящее время описан аллель дикого типа ТРМТ*1, определяющий нормальную ферментную активность, и более 20 различных аллелей, которые кодируют фермент с пониженным уровнем активности белка (ТРМТ*1А, ТРМТ*2-*23) (8с11аеГ(е1ег е/ а!., 2006). Самыми распространенными из аллелей, приводящих к дефициту ферментной активности, являются ТРМТ*2 (полиморфизм 0238С), ТРМТ*ЗА (полиморфизмы С460А и А7190) и ТРМТ*ЗС (полиморфизм А719С), которые составляют от 85 до 95% случаев всех аллелей такого рода в мировых популяциях.

На основании данных литературы выбраны шесть наиболее распространенных в популяциях мира однонуклеотидных полиморфизмов в гене ТРМТ (0238С, 0292Т, С460А, в644А, Т68Ю, А719С) и разработан биочип для их анализа. Таким образом, с помощью биочипа мы можем детектировать восемь различных полиморфных аллелей, включающих как самые распространенные (ТРМТ*2, *ЗА, *ЗС), так и редкие аллели, встречающиеся в единичных случаях в отдельных популяциях (*ЗВ, *ЗС), *5, *7, *8), а также определять аллель дикого типа (ТРМТ*!).

На рис. 14 приведены схема расположения олигонуклеотидных проб на ТПМТ-биочипе (А) и примеры картин гибридизации для образцов с различными генотипами (Б и В). Биочип был протестирован на 60 контрольных образцах ДНК с известным генотипом. Результаты гибридизации на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами (ПДРФ-анализ или прямое секвенирование). Таким образом, точность метода диагностики вышеназванных полиморфизмов в гене ТРМТ с помощью биочипа составила 100%.

Проведено широкомасштабное исследование частот генотипов и аллелей гена ТРМТ у жителей европейской части России, включая восточных славян и жителей Северного Кавказа (91% и 9% общей выборки, соответственно). В результате из 880 обследуемых индивидов 52 (5,9 %) были гетерозиготны по локусу гена ТРМТ, из них у 43 (4,9 %) обнаружен генотип *1/*ЗА, у 7 (0,8%) - генотип *1/*ЗС. и у 2 (0,2%) человек -генотип *1/*2. Остальные 828 (94,1 %) индивидов имели генотип ТРМТ*1/*1 (дикий тип). Следует отметить, что генотип *1/*ЗА в нашем исследовании был обнаружен только у представителей славянской группы, в то время, как генотип *1/*ЗС, в большинстве случаев принадлежал жителям Северного Кавказа. Пациенты

гомозиготные по ТРМТ*2, *ЗА, *ЗС аллелям, а также носители *ЗВ, *3й, *7 и *8 аллелей в нашем исследовании обнаружены не были.

0238 йт в460 0644 Т681 А719

0238 0292 в460 в644 Т681 А719

238С 292Т 460А 644А 68Ю 7190

238С 292Т 460А 644А 6810 7190

Рис. 14. А - схема расположения олигонуклеотидных проб на ТПМТ-биочипе. Серым цветом отмечены ячейки с последовательностями дикого типа, белым цветом -полиморфные варианты. Б и В - картины гибридизации (слева) и диаграммы значений относительных интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа (справа): Б - генотип дикого типа ТРМТ*1/*1; В - генотип ТРМТ*1/*ЗА.

При анализе литературных данных по частотам аллелей гена ТПМТ в популяциях США, Европы, Африки, Китая, Юго-Восточной Азии, оказалось, что популяция жителей европейской части России наиболее близка к популяциям Европы и белого населения Америки (рис. 15).

Для выявления клинического значения полиморфизма гена ТРМТ врачами-гематологами было проведено сравнение переносимой дозы 6-МП и его гематологической токсичности у 59 больных ОЛЛ, 8 из которых были гетерозиготами по полиморфным аллелям гена ТРМТ, приводящим к недостаточности фермента, а остальные пациенты имели генотип дикого типа (Чупова и др., 2005).Оказалось, что пациентам, носителям аллелей ТРМТ*ЗА, ТРМТ*ЗС и ТРМТ*2 приходилось снижать дозу вследствие плохой переносимости 6-МП (264 мг/м" по сравнению с 312 мг/м";

р=0,04). Также у гетерозиготных пациентов в 2 раза чаще отменяли терапию 6-МП по сравнению с пациентами с генотипом дикого типа (20% по сравнению с 11%; р=0,01) вследствие развития острой гематологической токсичности, что нарушало сроки проведения лечения.

■ Россия [п=1400) □ Польша (пр716) □ Англия (П=Э9В) Америка (бел) (п=564) ¡Ц Америка (афро) (п=496) ■ Саами (п=Э6В) И Кения Еп=202) 0 Гана (п=434) |§§ Китай (ГРЗВ4)

t^TÍÍT 1 I J ÍtTÍt Л

ТРНТ-2 ТРМТ-ЗА ТРМТЗС

Рис. 15. Частоты наиболее распространенных аллелей гена ТРМТ в России и в популяциях мира.

Таким образом, диагностика полиморфных вариантов гена ТРМТ, приводящих к недостаточности фермента, важна для индивидуализации лечения. Уменьшение дозы лекарственного препарата у пациентов с пониженной ферментной активностью позволяет снизить токсичность его действия.

2.1.2 Создание биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации.

Совместное функционирование ферментов системы биотрансформации обеспечивает обезвреживание десятков тысяч ксенобиотиков всех химических классов и разных групп, включая канцерогены, мутагены, тератогены, пестициды, промышленные и сельскохозяйственные яды, пищевые добавки, красители, растворители, лекарственные препараты. Изменение активности ферментов биотрансформации и несбалансированность работы ферментов отдельных стадий этого процесса может приводить к повышенной восприимчивости организма к вредным воздействиям и, как следствие, к увеличению риска развития различных многофакторных заболеваний, в том числе онкологических.

При создании биочипа нами были выбраны гены CYPJA1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, кодирущие ферменты фазы 1 процесса биотрансформации цитохромы; гены GSTT1 и GSTM1, кодирующие глютатионтрансферазы (GST), и гены NQ01 и NAT2, продукты которых участвуют в реакциях фазы 2; а также гены MTHFR и MTRR, продукты которых участвуют в метаболизме фолатов. Роль полиморфизма в гене ТРМТ была рассмотрена выше.

Биочип позволяет анализировать 16 однонуклеотидных замен и 2 делеции в 10 генах: CYP1AI (4887С>А, 4889A>G, 6235Т>С), CYP2D6 (I934G>A, 2637delA), GSTTI (делеция), GSTM1 (деления), MTHFR (677С>Т, 1298А>С), MTRR (66A>G), NQOl (6090T), CYP2C9 (430C>T, 1075C>T), CYP2C19 (681G>A) и NAT2 (341Т>С, 481С>Т, 590G>A, 857G>A). На рис. 16 приведена схема биочипа и пример картины гибридизации. Для определения точности диагностического метода с использованием

биочипа использовали контрольные образцы с известным генотипом. Чувствительность и специфичность метода составили не менее 99%.

• • • •

СБТП С$ТМ1

С4887А и А4889С Т6235С

МТЯЙ N001

* £

• • • • • • • •

У ф

Генотип

СУР1А1 *]/*], СУР206*1/*1, С$ТТ1*0/*0, вЯТМ1 +/-.

М'ГИГП 677Т/С, МТШ 66АА. N001*1/*!. С7Р2С9*1/*1, МТ2590С/Л

Рис. 16. Схема биочипа (А) и картина гибридизации, полученная на ПФ- биочипе (Б). Стрелками указаны полиморфные варианты, наличие которых приводит к изменению каталитической активности ферментов. *Для генов С£777 (делеция) и С5ТА// (делеция) на схеме в двух верхних строках приведены «+», что соответствует олигонуклеотидам без делеции; в качестве внутреннего контроля использованы зонды, содержащие искусственную замену одного нуклеотида в центральной части.

На основе разработанного биочипа создана диагностическая тест-система ПФ-биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации. Тест-система зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике. С использованием тест-системы ПФ-биочип нами были проведены исследования по определению частот различных аллелей и генотипов генов системы биотрансформации в группах здоровых доноров и больных онкогематологичеекими заболеваниями.

2.1.3 Полиморфизм генов системы биотрансформации у здоровых доноров, жителей европейской части России.

Для анализа полиморфизма генов системы биотрансформации в российской популяции использовали две выборки. Выборка (1) включала 177 здоровых доноров, образцы ДНК были любезно предоставлены к.м.н. Никитиным Е.А. ( Гематологический научный центр РАМН, Москва) и д.б.н. Иващенко Т.Э. (НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург). Средний возраст составил 51 год (диапазон возраста от 20 до 102 лет; 50.8% мужчины).

Частота генотипа

CYP1A1 CYP1A1 CYP2D6 CYP2D6 CYP2C9 CYP2C9 CYP2C19

5235С/. 4889Gl- Ш7А/- 19 ЗЛА/- 2637DelAI- 430Т/- 1075CI- 6в1А/-

Частота генотипа

MTHFR 1298CI-

MTRR 66S/G

Рис. 17. Распределение различных генотипов генов системы биотрансформации в двух различных выборках здоровых доноров, жителей европейской части России, и в европейских популяциях. «Нулевой» 05Т77 генотип и «нулевой» С8ТМ1 генотип соответствуют отсутствию функциональных аллелей генов СТГ7У и СЗТМ1, соответственно. V/- обозначает сумму гомо-и гетерозиготных генотипов по данному полиморфизму.

Выборка (2) включала 490 здоровых доноров из числа студентов МГОУ (Москва). Средний возраст составил 20 лет (диапазон возраста от 18 до 34 лет; 50.2% мужчины). Обе выборки представлены жителями европейской части России, преимущественно восточными славянами. Результаты генотипирования в обеих выборках представлены на рис. 17 в сравнении с усредненными данными по европейским популяциям. Сравнение частот генотипов двух контрольных групп позволило сделать вывод о частотах аллелей/генотипов в российской популяции. Как видно на диаграмме, распределение генотипов в обеих российских группах существенно не различается. Единственным исключением является GSTT1 нулевой генотип: его частота в группе (1) составляет 0,288, в группе (2) - 0,192, но эта разница не является статистически достоверной (р = 0,14).. Также частоты генотипов в российских выборках близки к частотам, полученным для других европейских популяций (Krajinovic et а/., 1999; Labuda et al., 1999; Roddam et al., 2000; Garte et al, 2001; Wiemels et al., 2001; Майорова и др., 2002; Yuille et al., 2002;; Gemmati et al., 2004; Kracht et al., 2004; Gast et al., 2007). Это заключение согласуется с предыдущим исследованием российской популяции (Gaikovich et al., 2003). Это важная информация для правильной

интерпретации исследований по ассоциациям генотипов в исследованиях случай-контроль, поскольку частоты полиморфных маркеров в различных популяциях могут обнаруживать существенные различия. Особенно это важно при проведении исследований в многонациональных и гетерогенных по этническому составу странах, к которым относится Российская Федерация.

2.1.4 Анализ полиморфизма генов системы биотрансформации у больных лейкозами и лимфомами.

С использованием тест-системы ПФ-Биочип выполнены два исследования по анализу ассоциаций различных аллелей и генотипов генов системы биотрансформации с риском развития следующих заболеваний: 1) Т-клеточной лимфомы (НХЛ) и В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (В-ХЛЛ) у взрослых; 2) острых лейкозов у детей.

2.1.4.1 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития лейкозов и лимфом во взрослом возрасте.

Обследовано 76 пациентов с диагнозом Т-клеточная лимфома (НХЛ) и 83 пациента с диагнозом В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (В-ХЛЛ). Диагноз был установлен в соответствии с ВОЗ классификацией 1997 года (Нагш е? а/., 1997). Средний возраст больных НХЛ составил 50 лет (диапазон возраста от 18 до 78 лет; 48,7% мужчины), больных В-ХЛЛ - 53 года (диапазон возраста от 31 до 83 лет; 57,8% мужчины). В качестве контрольной группы использована выборка (1).

Было проведено генотипирование групп больных и здоровых доноров с помощью ПФ-биочипа. Статистически значимых различий в распределении различных генотипов генов СУР206, МТНРЛ, МТНЯ, Щ01, С57Т/, СУР2С19 и ШТ2 между группой здоровых доноров и группами больных НХЛ и В-ХЛЛ обнаружено не было. Как у пациентов с НХЛ, так и у пациентов с В-ХЛЛ чаще встречался «нулевой» С5ТА// генотип по сравнению со здоровыми донорами. В случае пациентов с НХЛ эта разница была статистически достоверна (ОЯ = 1,82; 95% С1 = 1,05-3,14; р = 0,0395). Также было обнаружено, что генотип СУР2С.9*2/*3 чаще встречался у больных В-ХЛЛ, чем у здоровых доноров (ОЯ = 9,5; 95% С1 = 1,03-86,9; р = 0,03).

Межаллельные и межгенные взаимодействия изучали посредством сравнительного анализа парных комбинаций генотипов между группами и расчета ОЯ, для того, чтобы оценить накопление определенных сочетаний генотипов среди больных в отличие от контроля. Было выявлено, что генотипы 4887А/-, 48890/-, и 6235С/- гена СУР1А1 в сочетании с «нулевым» йБТМ! генотипом встречаются чаще в группах больных, чем в группе здоровых доноров. Эта разница была статистически достоверна в случае больных В-ХЛЛ для комбинации генотипа 6235С/- гена СУР1А1 с «нулевым» вБТМ! генотипом (ОЯ = 2,4; 95% С1 = 1,17-5,04; р = 0,02) и комбинации вариантов 4887А/-, 48890/-, 6235С/- гена СУР1А1 с «нулевым» ЮТМ/ генотипом (ОЯ = 2,5; 95% С1 = 1,28-4,93; р = 0,01) (рис. 18).

При анализе распределения частот генотипов в группах больных и здоровых доноров в зависимости от пола для большинства генов системы биотрансформации различий выявлено не было. При анализе комбинаций генотипов было выявлено, что у мужчин с В-ХЛЛ чаще встречался генотип 4887А/-, 4889С/-, 6235С/- гена СУР1А1 по сравнению со здоровыми мужчинами (ОЯ = 2,4; 95% С1 = 1,1-5,0; р = 0.03). Также в группах женщин, больных НХЛ, достоверно чаще встречался двойной «нулевой» генотип 08ТТ1Ю8ТМ1 по сравнению с группой здоровых женщин (ОЯ = 3,0; 95% С1 = 1,05-8,4; р = 0,048). При анализе частот генотипов гена СУР2С9 было выявлено, что у мужчин с В-ХЛЛ достоверно чаще встречаются гомо- и гетерозиготные носители аллеля СУР2С9 *2 (ОК = 2,4; 95% С1 = 1.08-5,24, р = 0.036) и носители генотипа СУР2С9 *2/*3 (ОЯ = 2,09, 95% С1 = 1,13-3,87; р = 0,02).

+GSTM1-oro

6235C/- 4889G/- 4887A/- 6235С/- 6235C/-4889C/- 4889G/-4887AI-

Рис. 18. Распределение СУР1А1 генотипов в сочетании с «нулевым» С8ТМ1 генотипом у пациентов, больных НХЛ, В-ХЛЛ, и здоровых доноров.

Таким образом, наше исследование показало, что определенные генотипы и комбинации генотипов генов системы биотрансформации С.УР1А1, ОЗТТ1, С5ТМ1 и СУР2С9 могут служить факторами риска развития НХЛ и В-ХЛЛ у взрослых. Также выявлен половой диморфизм в распределении генотипов генов СУПА 1, С8ТТ1, С8ТМ1 и СУР2С9 среди больных и здоровых.

2.1.4.2 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития острого лейкоза у детей.

В исследование было включено 403 ребенка: 332 с диагнозом ОЛЛ и 71 с диагнозом ОНЛЛ. Все пациенты были младше 18 лет. Образцы крови/костного мозга получены из отделений онкогематологии Российской детской клинической больницы (Москва), Морозовской детской клинической больницы (Москва) и Московского областного онкологического диспансера (Балашиха). В качестве популяционного контроля использовали выборку (2), включающую 490 здоровых доноров (средний возраст - 20 лет).

OR=3,8

«нулевой» «нулевой» двойной

G STT1 GSTM1 «нулевой»

генотип генотип GSTT1/GSTM1

генотип

Рис. 19. Частоты GST генотипов детей больных острыми лейкозами, и здоровых доноров.

При анализе частот генотипов генов СУР1А1, СУР206, МТНП1, МГЛй, в5ТМ1, СУР2С9 и СУР2С19 у пациентов с ОЛЛ и ОНЛЛ не было выявлено достоверных различий по сравнению с группой здоровых доноров. Для гена NQ01 была выявлена более высокая частота генотипа *2/*2 у пациентов с ОНЛЛ по сравнению с контрольной выборкой (ОЯ = 2,8; 95% С1 = 1,2-6,7; р = 0,04).

В обеих группах пациентов «нулевой» бЭТП генотип встречался чаще, чем в контроле, для пациентов с ОЛЛ это различие было достоверно (ОЯ = 1,9; 95% С1 = 1,42,7, р < 0,0001). Также в группах детей, больных лейкозом, была отмечена более высокая частота двойного «нулевого» генотипа 05ТМ/ЛУ5777. Разница достоверна для детей с ОЛЛ, ОНЛЛ и для всей группы детей, больных острыми лейкозами (ОЛ) (ОК. = 2,95; 95% С1 = 1,9-4,5, р < 0,0001; ОЯ = 3,8; 95% С1 = 2,0-7,1; р = 0,0001 и ОЯ = 3,0; 95% С1 = 2,1-4,7, р < 0,0001; соответственно) (рис.19).

При анализе распределения аллелей и генотипов гена NAT2 было выявлено, что генотип 341Т/Т,481С/С,590С/С гена ИАТ2, соответствующий гомозиготе по аллелю «быстрого» ацетилирования ЫАТ2*4/*4 достоверно чаще встречался в общей группе детей, больных ОЛ (ОЯ = 1,8; 95% С1 = 1,07 - 3,0; р = 0.03).

+ЫАТ2

□ Доноры, п = 490

□ ОЛЛ, п = 332 ОНЛЛ, п = 71 ОЛЛ+ОНЛЛ, п = 403

«нулевой»

вягп

генотип

двойной «нулевой» вЗТТ1/в5ТМ1 генотип

Рис.20. Распределение «нулевых» (?5Т генотипов в сочетании с ЫАТ2 генотипом 341Т/Т,481С/С,59(Ю/С (*4/*4), у детей, больных острыми лейкозами, и здоровых доноров.

При анализе комбинаций генотипов выявлено, что генотип ЫАТ2 341Т/Т,481С/С,590С/С (*4/*4) в сочетании с «нулевым» ОЗТТ/ генотипом встречался достоверно чаще в группах больных ОЛЛ (ОЯ = 4,6; 95% С1 = 1,46 - 14,26; 0,008), ОНЛЛ (ОЯ = 5,4, 95% С1 = 1,17 - 24,48, р = 0,047) и в общей группе больных ОЛ (ОЯ = 4,7, 95% С1 = 1,55 - 14,27, р = 0,004), чем у здоровых доноров. Также генотип ЫАТ2 341Т/Т,481С/С,5900Ю (*4/*4) в сочетании с «нулевым» GSШ^ генотипом достоверно чаще встречался в группах больных ОЛЛ (ОЯ = 2,4; 95% С1 = 1,09 - 5,43; р = 0,04) и в общей группе больных ОЛ (ОЯ = 2,5; 95% С1 = 1,16 - 5,42; р = 0,024), чем у здоровых доноров. Комбинация генотипа ЫАТ2 341Т/Т,481С/С,590С/С (*4/*4) с двойным «нулевым» генотипом бХГГ// б^ГМ/ достоверно чаще встречалась в группах больных

ОЛЛ ((Ж = 12,1; 95% С1 = 1,50 - 97,04; р = 0.004), ОНЛЛ (СЖ = 21,6; 95% С1 = 2,21 -210,48; р = 0,007) и общей группе больных ОЛ (СЖ = 13,7; 95% С1 = 1,76 - 106,80; р = 0,002) по сравнению со здоровыми донорами.

Ассоциация полиморфизма в генах <75777 и/или СйТЛ// с развитием различных онкозаболеваний, в том числе, лейкозов, была обнаружена и ранее (ВаЦа е? а/., 2003). В отношении полиморфизма гена ЫАТ2 данные более противоречивы. Генотип ЫАТ2 341Т/Т,481С/С,590С/С (*4/*4) соответствует фенотипу «быстрого» ацетилирования (Голденкова-Павлова и др., 2006). Есть данные в пользу ассоциации аллелей ЫАТ2 с различными онкозаболеваниями, как в случае «быстрого» (СЫап е/ а/., 2006), так и «медленного» ацетилирования (Кга^поую е1 а!., 2000), Тем не менее, важно отметить, что комбинация полиморфных вариантов генов СБТИ и/или ОЗТМ/ и ИАТ2 обнаруживает гораздо более выраженные закономерности, чем для каждого гена в отдельности.

Половой диморфизм в распределении генотипов у больных и здоровых оказался наиболее выражен в случае гена МТЯЯ. У девочек с ОЛЛ, и в общей группе девочек с ОЛ, было выявлено уменьшение частоты гомозиготного генотипа 660/0 гена МТЯЯ, по сравнению с группой здоровых доноров женского пола (011 = 0,45; 95% С1 = 0,3-0,7; р = 0,001 и ОЯ = 0,50; 95% С1 = 0,3-0,8; р = 0,0015, соответственно). Таким образом, генотип 660/й гена МТЯЯ может являться протективным фактором при развитии лейкозов у девочек.

В целом, можно сказать, что определенные генотипы генов системы биотрансформации <?5777, вЯТКИ, ШТ2, МТЯЯ чаще встречаются у детей, больных лейкозом, и могут рассматриваться как факторы риска развития этого заболевания. Также очевидно, что при анализе таких сложных заболеваний, как лейкоз, недостаточно исследований аллельной вариабельности единичных локусов генов системы биотрансформации, более перспективным является комплексный анализ.

2.1.5 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития рецидива острого лейкоза у детей.

Также представляло интерес выяснить роль полиморфизма в генах системы биотрансформации в развитии рецидива при лейкозах у детей. С этой целью было проведено генотипирование с использованием ПФ-биочипа 332 детей с диагнозом ОЛЛ, из которых 258 пациентов были с первично диагностированным ОЛЛ и 74 пациента находились в рецидиве заболевания. Также протестирован 71 ребенок с диагнозом ОНЛЛ, из которых 41 пациент был с первично диагностированным лейкозом и 30 пациентов находились в рецидиве заболевания. Пациентам с диагнозом ОЛЛ проводилась программная терапия по протоколу А1Х-МВ-02, пациенты с диагнозом ОНЛЛ получали терапию по протоколу АМЬ-2000 (Москва-Минск). Критерием принадлежности пациентов к группе больных с первично диагностированным острым лейкозом являлось отсутствие развития рецидива заболевания в течение как минимум 1 года после установления диагноза.

При анализе частот СУР1А1 генотипов у детей с первично диагностированным острым лейкозом и в рецидиве заболевания выявлено, что среди пациентов с рецидивом ОЛЛ генотип СУР1А1 *1/*2А встречался чаще, чем в группе пациентов с первично диагностированным ОЛЛ (ОЯ = 2,3; 95% С1 = 1,1-4,8; р = 0,032). Такая же закономерность наблюдалась в общей группе пациентов с рецидивом ОЛ по сравнению с пациентами с первичным ОЛ (ОЯ = 2,11; 95% С1 = 1,1-4,0; р = 0,03). Для пациентов с ОНЛЛ статистических значимых различий получено не было.

При анализе частот генотипов гена йЗТТ! выявлено, что «нулевой» С8ТТ1 генотип заметно реже встречался у детей с рецидивом ОЛЛ и ОЛ, чем у детей с первично диагностированным лейкозом (ОЯ = 0,48; 0,26 - 0,90; р = 0,023 и ОИ. = 0,55;

0,33 - 0,92; р = 0,027, соответственно). Для пациентов с ОНЛЛ статистических 'значимых различий получено не было.

При анализе комбинаций C.YP1A1 и GST генотипов было обнаружено, что у пациентов с рецидивом ОЛЛ чаще встречался генотип CYP1AI *1/*2А в сочетании с «ненулевым» GSTT1 генотипом (OR = 2,36; 1,02 - 5,5; р = 0,049). Также генотип CYP1A1 *1/*2А в сочетании с двойным «ненулевым» GSTT1/GSTM1 чаще встречался у пациентов с рецидивом ОЛ по сравнению с пациентами с первично диагностированным ОЛ (OR = 3,48; 1,23 - 9,84; р = 0,03).

При анализе комбинаций генотипов гена NAT2 с генотипами других генов было обнаружено, что генотип NAT2 341 С/-.481T/-,590G/G,857G/G в сочетании с GSTT1 или GSTM1 «ненулевым» генотипом, а также двойным «ненулевым» генотипом GSTT1/GSTMI у пациентов с рецидивом ОЛЛ встречался чаще, чем у пациентов с первично диагностированным ОЛЛ (OR = 1,95; 95% CI =1,11- 3,43; р = 0,02; OR = 2,13; 95% С1 = 1,14 - 4,00; р = 0,02 и OR = 2,18; 95% С1 = 1,11 - 4,28; р = 0,03, соответственно). У пациентов с рецидивом ОНЛЛ чаще встречалась комбинация генотипа NAT2 341Т/Т,48!С/С,590А/- с «ненулевым» GSTTI генотипом по сравнению с пациентами с первичным ОНЛЛ (OR = 3,38; 95% CI = 1,08 - 10,57; р = 0,048).

Таким образом, можно сказать, что в развитии рецидива при ОЛЛ определенную роль могут играть генотипы генов GSTT1 и GSTM1. «Нулевой» GSTTI и/или GSTMI генотип, приводящий к отсутствию белкового продукта этих генов, в этой ситуации оказывает протективное действие. Известно, что глутатиои-Б-транеферазы могут обуславливать устойчивость к цитотоксичным хнмиопрепаратам, применяемым при лечении опухолевых заболеваний (Anderer et а!., 2000). Следовательно, можно предположить, что отсутствие фермента у носителей «нулевого» GSTT1 и/или GSTM1 генотипа приводит к накоплению цитотоксичных препаратов, что повышает эффективность их действия и приводит к более длительной безрецидивной выживаемости. «Ненулевой» GSTT1 и/или GSTMI генотип, таким образом, может рассматриваться как фактор риска развития рецидива. Независимым фактором риска развития рецидива при ОЛЛ является генотип C.YP1AI *1/*2А, определяющий повышенную каталитическую активность этого фермента. Этот эффект может усиливаться при комбинации «неблагоприятных» генотипов.

Интересным фактом является то, что фактором риска развития рецидива при ОЛЛ является вариант гена NAT2 341C/-,48IT/-,590G/G,857G/G (генотипы *5/*5 или *5/*4) в то время, как при ОНЛЛ с риском развития рецидива ассоциирован вариант гена NAT2 341Т/Т,481С/С,590А/- (генотипы *б/*б или *б/*4). И в том, и в другом случае эти генотипы определяют либо «медленный», либо «промежуточный» фенотип ацетилирования, но при разных формах лейкозов они представлены сочетанием разных аллелей.

Резюме. Разработан биочпп для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации. На основе этого подхода создана и сертифицирована для применения в клинике диагностистическая тест-система ПФ-биочип. Тест-система ПФ-биочип является удобным методом анализа и может использоваться как для дальнейших исследований (поиск различных аллелей как факторов риска развития опухолевых заболеваний или риска возникновения рецидивов), так и для клинической практики (коррекция доз лекарственных препаратов). Показано, что некоторые аллели генов системы биотрансформации ассоциированы с риском развития злокачественных заболеваний крови у взрослых и у детей, а также с риском развития рецидива лейкозов у детей. Также продемонстрировано клиническое значение полиморфизма гена ТРМТ при назначении дозы препаратов тиопуринового ряда.

2.2 Анализ полиморфизма гена NA Т2

N-ариламин ацетилтрасфераза (NAT2) является одним из ключевых ферментов фазы 2 процесса биотрансформации (метаболизма ксенобиотиков) и отвечает за детоксикацию промежуточных генотоксичных метаболитов в клетках различных тканей и органов. Ген NAT2 локализован на хромосоме 8р22, имеет протяженность около 2 т.п.н. и содержит 2 зкзона.

Кодирующий район гена NAT2 состоит из участка длиной 701 п.н., содержащего 17 SNP: 13 транзиций (111Т/С; 190С/Т; 191G/A; 282С/Т; 341Т/С; 364G/A; 481С/Т; 499G/A; 590G>A,759C/T; 803A/G; 857G/A; 859Т/С), 3 трансверсии (411А/Т; 434А/С; 845А/С) и одну делецию, приводящую к сдвигу рамки считывания (859del). Сочетания этих мутаций создают 36 аллельных вариантов NAT2 гена. Каждый из 36 аллелей кодирует фермент с различной скоростью ацетилирования. Для того, чтобы упростить анализ полиморфизма гена NAT2 и более точно дискриминировать различные аллели, разработан биочип для определения всех 16 замен. На рис. 21 представлен пример гибридизационной картины, полученной с помощью КАТ2-биочипа, содержащего набор олигонуклеотидных проб для анализа полиморфизма гена NAT2. Генотип образца определен k&kNAT2 *5В/*5В .

Комбинации 36 аллелей гена NAT2 образуют 660 различных генотипов. Следует отметить, что генотипирование на биочипе выявляет 66 комбинаций SNP (single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм), определяющих 165 генотипов, при которых возможны два различных фенотипа ацетилирования (промежуточный или медленный).

111 190 191 282 341 364 411 434 859

• • • • •

• • • • • II |

*> V ф # <г / ф ф • ш

• • •

t / | в

481 499 590 759 803 845 857

Генотип *5ВГ5В (341 С/С, 481ТЯ, 803G/G)

Рис. 21. Картина гибридизациизации на биочипе для анализа полиморфизма гена NAT2. Стрелками отмечены однонуклеотидные замены.

Для точного определения генотипов было необходимо установить цис- или транс-положение нуклеотидных замен. Для выявления гаплотипов, распространенных в популяции, проведено генотипирование с помощью разработанного биочипа и параллельно методом ПДРФ-анализа 98 неродственных индивидов, восточных славян, проживающих в Московском регионе. В исследованной выборке обнаружен

полиморфизм только по 6 позициям: 282С>Т, 341Т>С, 481 ОТ, 590G>A, 803A>G и 857G>A (рис. 22).

аплель •4 •5А *SB *5С *50 *6 А *6В •ТА '7В *12А

282 341 481 590 803 857 С Т С G A G

С T -С-ос т —о-ос

—О

с -о-

-о-

А ■О—

фенотип быстрый медленный медленный медленный медленный медленный медленный медленный медленный быстрый

Рис. 22. Аллели гена NAT2, выявленные при генотипировании славянской популяции Московского региона (п=98).

В сумме комбинация 6 SNP дает 10 различных аллелей гена NAT2. Два аллеля связаны с фенотипом «быстрого» ацетилирования (NAT2*4 and *12), и 8 аллелей (NAT2*5A, *5В, *5С, *5Д *6А, *6В, *7А and *7В) - с фенотипом «медленного» ацетилирования. Наиболее распространенный аллель «быстрого» ацетилирования NAT2*4 (дикий тип) встречался у 27,0% индивидов. Частоты наиболее распространенных «медленных» аллелей NAT2*5B (341С, 481Т, 8D3G) и *6А (282Т, 590А), составили 33,1% и 23,0%, соответственно (рис. 23).

0,4 0,35 0,3 1 0,25

§ 0,15 га т

0,1 0,05 0

Рис.23. Частоты аллелей гена ЫАТ2 у жителей европейской части России.

Наиболее распространенным SNP является транзиция 341 ОТ (маркер медленных аллелей группы *5), обнаруженная у 43,0% индивидов. Другая транзиция 590G>A, определяющая аллели группы *6, встречается в 26,6% случаев. Определяющим SNP для аллелей группы *7 является транзиция 857G/A, распространенная в азиатских популяциях. В нашей выборке она была обнаружена в 3% случаев. Как видно, проводя генотипирование по этим трем позициям гена NAT2, включенным в состав ПФ-биочипа, мы можем делать обоснованный вывод о наличии в генотипе «быстрых» и «медленных» аллелей и, соответственно, прогнозировать фенотип ацетилирования. Определение фенотипа ацетилирования играет существенную роль при назначении доз некоторых лекарственных препаратов, например, изониазида, применяющегося при лечении туберкулеза (Hiratsuka et al., 2002).

2.3 Анализ полиморфизма генов, участвующих в регуляции кровяного давления.

Подход, разработанный для анализа полиморфизма генов системы биотрансформации, был распространен на другую группу полиморфных генов, ассоциированных с риском развития сердечно-сосудистых патологий. Удобной моделью является ренин-ангиотензиновая система и функционально близкий к ней кинин-брадикининовый каскад. Ферменты этих метаболических цепей тесно сопряжены последовательными и параллельными химическими реакциями, что позволяет с помощью генетического тестирования оценить функциональное состояние всей системы в целом. Выбраны SNP в генах ренин-ангиотензиновой и брадикининовой системы, по литературным данным ассоциированные с риском развития артериальной гипертензии. Разработан ПФ-биочип (Кардио), включающий зонды для определения полиморфизма следующих генов REN (I9-83G>A), AGT (М235Т), AGTR1 (1166Л>С), AGTR2 (3123С>А), BKR2 (-58Т>С), MTHFR (6770Т), ADRB2 (48A>G, 81C>G). Биочип протестирован на контрольных образцах с известным генотипом. Пример гибридизационной картины приведен на рис. 24. Точность метода составила 99%.

• »

/¿V" j \ у»

.A m / '-Ш,

Генотип: REN (в/А) AGT(M/T) AGTR1 (А/С)

/щ\/ш\/¿Л * AGTR2 (С/С)

i ! ( ) \ BKR2 (С/С)

À m. А л A m i MTHFR (Т/Т)

■ ' ABRB2 (48А/G и 81C/G)

Рис. 24. Картина гибридизации на ПФ-биочипе (Кардио).

С использованием ПФ-Биочипа (Кардио) Глотов (Глотов, 2006) провел генотипирование 179 детей в возрасте от 9 до 17 лет с артериальной гипертензией (АГ), проходивших лечение в Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии МЗ РФ. Всем детям проводили суточный мониторинг артериального давления (СМАД) с целью подтверждения наличия АГ и уточнения ее динамики. Пациенты были разделены на две группы. В первую включили детей без подтвержденной в результате СМАД артериальной гипертензии и детей с лабильной формой АГ. Во вторую группу включили детей со стабильной формой АГ. Было показано, что наличие вариантов генов REN (Л-аллель и А/А генотип) и AGT (Г-аллель)

ассоциировано с формированием стабильной формы артериальной гипертензии у детей. Кроме того, выявлено, что аллели генов BKR2 (С-аллель) и AGTR2 (Л-аллель) ассоциированы с развитием артериальной гипертензии у мальчиков.

В настоящее время ПФ-биочип (Кардио) используется в Лаборатории пренатальной диагностики НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта для определения предрасположенности к развитию сердечно-сосудистых патологий при беременности. Дальнейшее развитие ПФ-биочипа (Кардио) предполагает включение в анализ полиморфизма генов системы гемостаза, генов липидного обмена и т.д. с целью разработки тест-систем для оценки индивидуального генетического риска развития инфарктов и инсультов.

3 Генетическая идентификация личности на основе анализа полиморфных локусов HLADQA1, ABO И AMEL.

Анализ полиморфных участков в геноме может служить основой при проведении генетических экспертиз в судебной медицине и криминалистике. Для решения задач генетического тестирования при идентификации личности были выбраны три локуса: HLA-DQA1, ABO и AMELXY. Локус HLA-DQAI (ген главного комплекса гистосовместимости второго класса) выбран из-за его высокой полиморфности (на июль 2009 года известно 34 аллеля). Локус ABO (ген, определяющий группу крови) также характеризуется высокой степенью полиморфизма (около 90 аллелей) и кроме этого позволяет получать информацию о группе крови ABO, которая может быть полезна при поиске подозреваемого. Ген AMEL, кодирующий внеклеточный матриксный белок, вовлеченный в процесс развития зубной эмали, принято использовать для определения половой принадлежности исследуемой ДНК, так как он расположен на половых хромосомах. Все три локуса расположены на разных хромосомах: HLA-DQA1: 6р21.3; ABO: 9q31.1-q34.2; AMELX: Хр22.31-р22.1; AMEL Y: Ypll) и наследуются независимо, что важно при оценке вероятности идентификации. Анализ полиморфизма в этих генах позволяет разбить всю популяцию на 1350 групп и отнести конкретного человека к одной из групп.

3.1 Разработка биочипа для анализа локусов HLADQA1, ABO И AMEL

Биочип включает олигонуклеотидные зонды для определения 9 групп аллелей гена HLA-DQA1, 5 групп аллелей гена ABO и 2 аллелей гена AMEL.

Разделение по группам аллелей и выбор определяющих аллели SNP проводили на основании базы данных по полиморфизму генов HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/). В гене HLA-DQA1 анализ ряда точечных замен во втором экзоне позволяет выделить следующие группы аллелей: *101 (DQA1*0101XX, 0104ХХ, 0105, 0107), *102 (.DQA1*0102XX), "103 (DQA1*0103), *106 (DQA1*010S), *201 (DQA1*0201), *03 (.DQA1*03XXXX), *04 (DQA1*04XXXX), *05 (DQA1* 05XXXX), *06 (DQA1*006XXXX). Участки второго экзона гена DQA1, по которым идентифицируются группы аллелей, приведены в табл.3. При этом все население можно разделить на 45 групп.

В гене AMEL аллель AMELX расположенный на хромосоме X, имеет в пятом экзоне трехбуквенную делецию. Это отличает его от аллеля AMELY, расположенного на хромосоме Y. Ниже представлены участки последовательностей пятого экзона, выбранные для определения половой принадлежности (делеция трех нуклеотидов выделена подчеркиванием): AMELX CCAGAGCAT-- - AAGGCCACCGTAC AMELY CCAGAGCATGATAAGACCACCATAC.

Табл. 3. Участки последовательности второго экзона гена HLA-DQAI, выбранные для определения групп аллелей. Жирным шрифтом и подчеркиванием выделены все БЫР, расположенные на данном участке последовательности.

Группы аллелей Последовательность

1 101, 102, 103,106 CCTGGCGGTGGCCTGAGTTCAGCAAATTTG

201 TCTGGAAGTTGCCTCTGTTCCACAGACTTA

03 TCTGGCAGTTGCCTCTGTTCCGCAGATTTA

04, 05, 06 TCTGGTGTTTGCCTGTTCTCAGACAATTTA

2 101,102,106,04,05 CTGGCCAGTACACCCATGAAT CTGGCCAGTTCACCCATGAAT

103,201,06

3 101 ATGGAGATGAGGAGTTCTACGTG ATGGAGATGAGCAGTTCTACGTG ATGGAGACGAGCAGTTCTACGTG

102,103,106,05

04,06

4 101,102,103 GAGAGGAAGGAGACTGCCTGGCG GAGAGGAAGGAGGCTGCCTGGCG

106

5 103 ACCTGGAGAGGAAGGAGACT ACCTGGAGAAGAAGGAGACT

101,102

В гене ABO можно выделить 5 основных групп аллелей: А, В, О'.О'^О2, по анализу 4 нуклеотидных позиций в шестом и в седьмом экзонах. Анализ четырех SNP позволяет не только определить одну из четырех групп крови индивида, но и разделить все население на 15 групп (табл.4).

Табл.4. SNP в локусе ABO, по которым идентифицируются группы аллелей. Приведены участки последовательностей 6 и 7 экзонов. Жирным шрифтом и подчеркиванием выделены анализируемые SNP.

Анализируемый SNP Группы аллелей Последовательность

261G А, В, О2 GTGGTGACCCC

б 261delG о',о"' GTGGT;ACCCCT

экзон 297А А, О1 GGGCACATTCA

297G В, 0!У, О2 GGGCACGTTCA

646Т А, В, 0', О2 TGGAGTTCCGC

7 646А 0,у TGGAGATCCGC

экзон 657С А, 0',(Г, О2 CGACCACGTGG

657Т В CGACCATGTGG

На рис. 25 представлен пример гибридизационной картины для образца с генотипом: HLA-DQA1 201/03, АВОВ/О1, AMELXY.

При отработке условий гибридизации использовали образцы ДНК, содержащие клонированные участки второго экзона гена HLA-DQA1, а также образцы ДНК доноров с известной группой крови. 80 образцов ДНК после генотипирования на ИЛ-Биочипе

просеквенировали по 2 экзону гена HLA-DQA1, 6 и 7 экзонам гена ABO. Результаты генотипирования обоими методами совпали в 100% случаев.

А Б

101,102, 103,106 101,102. 103,106

201 201 101 101

03 03 101,102, 106, 04. 05 101,102, 106, 04, 45 102,103. 106, 05 102. ЮЗ. ¡06, 05 101.102. 103 101,102, 103 103, 201 103, 201

04,0S, 06 04, 05, 06 103,201, 06 103, 201, 04, 06 04, Об 106 106 101.102 101,102

А, В, 02 А. 02 А, В, 021, 02 А, 02, Olv

А, В, 02 А, 02 А, В, 021,02 А, 02, Olv

OI, Olv В, Olv Olv В

• •

• • » » i v

• •

• • » • • • * • • *

» • • •

Рис. 25. Картина гибридизации образца ДНК с генотипом HLA-DQA1 201/03, ABO В/О", AMELXY (А). В приведенной справа схеме цветом отмечены ячейки, в которых прошла гибридизация (Б).

Методом последовательных разведений была определена аналитическая чувствительность метода. Она составила около 100 пкг геномной ДНК на один анализ. Дальнейшее снижение количества анализируемой ДНК приводило к появлению ложной гомозиготности. При количестве анализируемой ДНК менее 10 пкг отсутствовал положительный флуоресцентный сигнал.

Также биочип был протестирован на образцах, моделирующих вещественные доказательства биологического происхождения, которые используют при проведении судебно-генетических экспертиз. Из биологических следов, а именно, из смывов слюны с окурков сигарет и с края стакана, из отпечатков пальцев на стакане, из следов пота на бумаге, оставленных лицами с известными генотипами, провели выделение ДНК и далее генотипирование на ИЛ-Биочипе. Во всех случаях получили совпадение генотипов, определенных с помощью биочипа, с генотипами лиц, участвовавших в тестировании.

3.2 Генотипирование с использованием ИЛ-биочипа

Для исследования частот аллелей генов HLA-DQA1 и ABO была собрана коллекция, включающая 352 образца ДНК здоровых доноров, жителей европейской части России славянского происхождения.

Результаты генотипирования по локусу HLA-DQA1 выявили в исследованной выборке 28 генотипов, из них наиболее распространенные генотипы: DOA1 *Ю1/*05 (9.9%), DQAl*102/*05 (9.1%), DQA¡*05/*05 (8,8%), DQA1*201/*05 (8,2%), DQA1 *102/*201(6,3%), DQA 1*102/*102 (6,0%). Аллели групп *106 и *06 обнаружены не были. Частоты аллелей гена HLA-DQA1 в сравнении с другими популяциями приведены на рис. 26. Наиболее распространенные группы аллелей среди славян, жителей

европейской части России: *05 (частота аллеля 0,29); *102 (частота аллеля 0,20); *.?0/(частота аллеля 0,15); *101(частота аллеля 0,13).

Рис. 26. Частоты групп аллелей HLA-DQA1 в различных популяциях.

Результаты генотипирования по локусу АВП выявили наиболее распространенные генотипы А/01 (17,7%;. В/01 (13,7%) и 0'/0"' (13,7%). Наиболее редкими оказались генотипы В/О2 (0,6%) и О'^/О2 (0,6%), генотип 0г/02 обнаружен не был. Распределение по группам крови выглядело следующим образом: I (0) группа (генотипы 0'0', 0'0'\ О'О2, 0,г0'\ 0V) - 29,8%; II (А) группа (генотипы АА, АО1, А(Г, А0:) - 35,3%:

III (В) группа (генотипы ВВ, ВО1. ВО1', ВО2) -26,4% и IV (АВ) группа (генотип АВ) - 8,5%. Таким образом, наиболее распространенной оказалась II (А) группа, а наиболее редкой

IV (АВ). Частоты аллелей ABO в исследованной выборке восточных славян в сравнении с частотами в других популяциях приведены на рис. 27. Наиболее распространенный аллель - 0 (частота аллеля 0,35), наиболее редкий - 0' (частота аллеля 0,02).

Рис. 27. Частоты групп аллелей ABO в различных популяциях.

При проверке соответствия распределения генотипов в локусах HLA-DQAJ и ABO равновесию Харди-Вейнберга (РХВ) получили, что РХВ для исследуемой популяции выполняется, как в случае локуса HLA-DQA1, так и в случае локуса ABO. Ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность составили для локуса DQA1 81,7% и 79,7%, соответственно; для ABO 73,9% и 73,8%, соответственно

Результаты геногипирования по локусу AMELXY совпали с анкетными данными по полу индивида в 100% случаев. Выборка включала 172 мужчин (49%) и 180 (51%) женщин.

3.3 Возможность применения ИЛ-Биочипа в идентификационных исследованиях

Для описания идентификационного потенциала локусов HLA-DQA1 и ABO использовали несколько параметров определяемых из частот аллелей и генотипов этих локусов, полученных в результате генотипирования. Определение параметров информативности локусов проводили с помощью программного обеспечения PowerMarker 1.0 (http://www.powermarker.net, http://statgen.ncsu.edu/powermarker) (табл. 5.).

Табл. 5. Основные параметры информативности локусов HLA-DQA1 и ABO . (Митяева, 2007).

Параметр HLA-DQA1 ABO

Вероятность случайного совпадения генотипов (рМ) 0,058 0,136

Дискриминирующий потенциал (PD) 0,942 0,864

Информационное содержание полиморфизма (PIC) 0,790 0,680

Потенциал исключения отцовства (РЕ) 0,595 0,487

Усредненный индекс отцовства (PI) 2,47 1,9

Это позволило провести сравнение ИЛ-Биочипа с коммерческими наборами, используемыми в генетической идентификации личности. Например, набор PowerPlex (Promega, США), позволяющий анализировать 8 STR-локусов, обладает PD в диапазоне 0.9973-0.9982 в зависимости от популяции, а у ИЛ-биочипа, анализирующего 3 локуса, PD составляет 0,9961 (Митяева, 2007). Основными методами, которые применяются при идентификации личности, в настоящее время являются серологический анализ группы крови и STR-анализ. К основным минусам серологического типирования отнести недостаточную универсальность: около 27% всех биологических следов, найденных на месте преступления, не поддаются такому анализу (по данным ЭКЦ МВД РФ). Кроме этого, серология не обладает высокой информативностью, так как выделяет всего 4 группы. STR-анализ, будучи наиболее информативным, требует достаточно дорогого импортного оборудования и высокой квалификации исполнителей. Анализ SNP при помощи биочипов является более простым и дешевым методом. Кроме этого, анализ SNP в генах позволяет получать фенотипические данные об индивиде (например, пол и группа крови). Для ИЛ-биочипа вероятность случайного совпадения генотипов по трем локусам (HLA-DQA1, ABO, AMEL) составляет рМ = рЩНЬА-DQAl)*pM(AB0)*pM{AMEL) = 0,058x0,136x0,5 = 0,0046 = 0,46%. Такая вероятность

случайного совпадения слишком велика для доказательства причастности к совершению преступления, однако позволяет решать такие задачи, как сужение круга подозреваемых, восстановление картины происшествия при наличии биологических следов от нескольких человек и т.п. Включение новых локусов в анализ на биочипе может существенно повысить информативность этого подхода.

Следует также отметить, что может быть расхождение между серологическим определением группы крови и определением по генетическим маркерам. Группа крови устанавливается по наличию на поверхности эритроцитов антигенов А или В, образованных из антигена Н. Ген ABO кодирует фермент гликозилтрансферазу, модифицирующий исходный антиген Н в антиген А или В. То есть, группа крови I (0) будет формироваться всегда при нарушениях активной гликозилтрансферазы (Yip, 2000). Однако мутации в других генах могут приводить к повреждению или отсутствию самого антигена Н. В этом случае, ABO-генотип может быть каким угодно, в то время как серологическая группа крови будет I (0). Такие случаи связаны с редкими мутациями в генах FUTI и FUT2, отвечающими за синтез антигена Н (Mizuno et al., 2004); так у жителей Индии подобные мутации встречаются с частотой 1:10000, а у европейцев -1:1000000. Также существуют аллели, относящиеся к группам А и В, но с низкой экспрессией антигенов А и В, и, наоборот, существуют нулевые аллели без 261delG, которые могут проявлять слабую экспрессию антигена А. В подобных случаях возможно расхождение между данными генотипирования и серологическим фенотипом с частотой менее 0.01% (Seltsam, 2005), что необходимо учитывать при использовании генотипирования по локусу ABO.

При определении пола по гену амелогенина также следует иметь в виду, что в некоторых случаях встречаются протяженные делеции (до 1000 кб) этого района Y-хромосомы. В таком случае, амплификация соответствующего фрагмента Y-хромосомы становится невозможной, и на биочипе можно определить только один аллель AMELX. Соответственно, мужчина, носитель такой Y-хромосомы будет идентифицирован как индивид женского пола. Однако число таких ошибок вряд ли будет превышать 0,02% (Mitchell et al., 2006).

Резюме. Разработанный ИЛ-биочип содержит олигонуклеотидные пробы для анализа полиморфизма в трех локусах HLA-DQA1, ABO и AMEL. Биочип позволяет проводить идентификацию биологических следов, содержащих ДНК со средней вероятностью идентификации 99,6%. При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно-медицинской практике при экспертизах, позволяющих, сузить круг подозреваемых или при опознании тел погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида.

4 Сравнение метода гибридизации на гидрогелевых биочипах с другими методами анализа мутаций

Гелевые микрочипы обладают рядом свойств, позволяющих проводить идентификацию точечных мутаций, а также других изменений в геноме (например, хромосомные нарушения) с высокой степенью надежности. Использование относительно коротких олигонуклеотидных проб (длиной 15-25 оснований) обеспечивает высокую степень дискриминации между совершенными и несовершенными дуплексами, а иммобилизация в объеме геля значительно увеличивает интенсивность положительных гибридизационных сигналов и позволяет применять для регистрации флуоресценции относительно простые и дешевые анализаторы изображения. Сравнение параметров анализа с помощью биочипов и с помощью других методов определения мутаций, используемых в биомедицине, приведено в табл.6.

Табл. 6. Сравнительные характеристики различных методов анализа полиморфизма.

Показатели ПДРФ-анализ ПЦР в реальном времени Биочипы

Точность метода средняя высокая высокая

Мультиплексность нет ограничена достаточно высокая

Время анализа 6-24 ч 2-3 ч 12-20ч

Возможность контаминации средняя низкая средняя

Определение гаплотипа возможно нет нет

Анализ в области «горячих точек» затруднен затруднен высоко эффективен

Количество ДНК пациента увеличивается с числом анализируемых точек увеличивается с числом анализируемых точек менее затратный метод

Относительная простота использования, воспроизводимость и надежность делают биочипы на гидрогелевой основе удобным инструментом в широкомасштабных молекулярно-биологических и биомедицинских исследованиях, а также в клинической диагностике.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы к многопараметрическому анализу различных генетических изменений в геноме человека, включая хромосомные перестройки и точечные мутации, на основе технологии гидрогелевых биологических микрочипов.

2. Разработаны методы выявления и идентификации хромосомных транслокаций при лейкозах и структурных перестроек локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора с помощью гибридизации на олигонуклеотидном биочипе. Показана эффективность метода анализа транслокаций в диагностике лейкозов и определены частоты транслокаций у детей, жителей России, больных различными формами этого заболевания. Создана тест-система ЛК-биочип и зарегистрирована в Росздравнадзоре. Создан прототип тест-системы для определения Т-клеточной клональности при диагностике Т-клеточных лимфом.

3. Разработан метод диагностики точечных мутаций в ВЯСА1/2 и СНЕК2 генах человека (185с!е1АС, ЗООТ>С, 4153с1е1А, и 5382шзС в гене ВВ.СА1, 695¡псТ и 6174с1е1Т в гене ВЯСА2, и варианта 1100с1е1С в гене СНЕК2). Определены частоты этих мутаций у пациентов с диагнозами РМЖ, РЯ и ПМЗН с поражением МЖ и яичников, жителей европейской части России.

4. Разработаны биочипы для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации, участвующих в метаболизме ксенобиотиков (лекарственные препараты, канцерогены, продукты питания и т.п.), гене NAT2 и генах ренин-ангиотензиновой системы, участвующих в регуляции кровяного давления. Тест-система ПФ-биочип зарегистрирована в Росздравнадзоре.

5. Определены частоты аллелей/генотипов генов системы биотрансформации CYP1AI, CYP2D6, GSTT1, GSTMI, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у здоровых жителей европейской части России и у больных лимфомами и лейкозами. Показано, что определенные генотипы генов CSTM1 и CYP1A1, а также их сочетания являются факторами риска развития НХЛ и B-XJIJI во взрослом возрасте. Генотипы генов GSTT1 и GSTM1 («нулевые» генотипы) и гена NAT2 (генотип *4/*4), а также их сочетания являются факторами риска развития острого лейкоза у детей. Генотипы генов GSTT1, GSTM1 («ненулевые генотипы») и генотип гена CYP1AI*1/*2A, а также их сочетания являются факторами риска развития рецидива при лейкозах у детей.

6. Определены частоты аллельных вариантов, приводящих к дефициту ферментной активности ТРМТ, у жителей европейской части России. Общая частота таких аллелей составляет 5,9%, наиболее частым является аллель ТРМТ*ЗА, также как в других европейских популяциях. Показано клиническое значение полиморфизма гена ТРМТ при лечении детей, больных лейкозами, препаратами тиопуринового ряда (6-меркапто пурин).

7. Разработаны методические подходы к генетической идентификации личности по анализу однонуклеотидного полиморфизма на примере локусов HLA-DQA1, ABO и AMEL, создана тест-система ИЛ-Биочип. Определены частоты аллелей генов HLA-DQA1 и ABO у жителей европейской части России. Показана целесообразность использования этого метода для скрининга образцов на первичном этапе судебно-генетических экспертиз.

Список публикаций

1. Godovikova T.S., Kolpashchikov D.M., Orlova T.N., Richter V.A., Ivanova T.M., Grochovsky S.L., Nasedkina T.V., Victorova L.S., Poletaev A.I. 5-[3-(E)-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzamido)propenyl-l]-2'-deoxy- uridine-5'-triphosphate substitutes for thymidine-5'-triphosphate in the polymerase chain reaction. (1999) Bioconjug Chem., 10(3): 529-37.

2. Фесенко Д.О., Наседкина T.B., Мирзабеков А.Д. Бактериальный микрочип: принцип работы на примере детекции антибиотиков. (2001) Докл.Акад.Наук, 381: 427-9.

3. Nasedkina Т., Domer P., Zharinov V., Hoberg J.,. Lysov Yu, Mirzabekov A. Identification of chromosomal translocations in Leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. (2002) Haematologica, 87: 363-372.

4. Исаева E.A., Жаринов B.C., Наседкина T.B.,. Флейшман E.B, Масчан A.A., Байдильдина Д.Д., Новичкова Г.А., Шнейдер М.М., Тимаков A.M., Алакаева И.Б., Карачунский А.И., Самочатова Е.В., Румянцев А.Г.. Анализ хромосомных аберраций при ОНЛЛ у детей методом полимеразной цепной реакции. (2002) Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 1(2): 81-82.

5. Исаева Е.А., Жаринов B.C., Наседкина Т.В., Рогачева Е.Р., Лаврухин Д.Б., Тимаков A.M., Инюшкина Е.В., Карачунский А.И., Румянцев А.Г. Анализ хромосомных аберраций и их прогностическое значение при остром

лимфобластном лейкозе. (2003) Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2(4): 59-66.

6. Nasedkina T.V., Zharinov V.S., Isaeva Е.А., Mityaeva O.N., Yurasov R.A, Surzhikov S.A.,. Turigin A.Yu, Rubina A.Yu., Karachunskii A.I., Gartenhaus R.B., Mirzabekov A.D. Clinical screening of gene rearrangements in childhood leukemia using a multiplex PCR-microarray approach. (2003) Clin. Cancer Res., 9: 5620-5629.

7. Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович B.M., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю.,. Рубина A.IO, Барский В.Е., Заседателев A.C. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. (2004) Мол. Биол., 38:5-16. (обзор)

8. .Митяева О.Н., Наседкина Т.В, Жаринов B.C., Исаева Е.А, Турыгин А.Ю., Чупеева В.В., Крейндлин Э.Я., Мирзабеков А.Д.. Анализ хромосомных транслокаций с участием гена MLL методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами (2004) Мол. Биол., 38(3): 449-456.

9. Исаева Е.А., Жаринов B.C., Наседкина Т.В., Митяева О.Н, Рогачева Е.Р., Лаврухин Д.Б., Карачунский А.И., Заседателев A.C., Румянцев А.Г.. Хромосомные аберрации при остром лимфобластном лейкозе у детей. (2004) Детская онкология, 4: 1-6.

10. Фесенко Д.О., Наседкина Т.В., Чудинов А.В, Прокопенко Д.В., Юрасов P.A., Заседателев A.C. Альгинатный гелевый микрочип для наблюдения в реальном времени внутриклеточных процессов в бактериальных и дрожжевых клетках.

(2005) Мол. Биол. 39 (1): 97-103.

11. Fesenko D.O., Nasedkina T.V., Prokopenko D.V., Mirzabekov A.D. Biosensing and monitoring of cell populations using the hydrogel bacterial microchip. (2005) Biosensors and Bioelectronics. 20: 1860-1865.

12. Глотов A.C., Наседкина T.B., Иващенко Т.Э., Юрасов P.A., Суржиков С.А., Паньков C.B., Чудинов A.B., Баранов B.C., Заседателев A.C. Создание биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации. (2005) Мол. Биол., 39(3): 403-412.

13.Чупова Н.В., Самочатова Е.В., Руднева А.Е., Солопова Г.Г.,.Наседкина Т.В, Федорова O.E., Глотов А.С, Землякова В.В., Крынецкий Е.Ю., Крынецкая Н.Ф., Рибейро Р.К, Эванс В.Э., Румянцев А.Г.. Генетический полиморфизм тиопурин-S-метилтрансферазы в лечении детей с острым лимфобластным лейкозом. (2005) Гематология и трансфузиология, .50 (6): 3-9.

14. Наседкина Т.В. Использование биологических микрочипов в онкогематологии.

(2006) Онкогематология , № 1-2: 25-37.

15. Федорова O.E., Синицка О.Н.,. Тихомирова Л.П, Вишневская Я.В., Заседателев A.C., Наседкина Т.В. Анализ точечных мутаций в гене BRCA1 методом гибридизации с гидрогелевыми микрочипами.(2006) Мол. Биол., 40 (1): 1-6.

16. Гра O.A., Глотов A.C., Кожекбаева Ж.М., Макарова О.В., Самочатова Е.В., Заседателев A.C., Наседкина Т.В. Опыт использования биочипов для анализа полиморфных вариантов гена CYP1A1 при лейкозах у детей. (2006) Медицинская генетика, № 4: 34-38.

17. Nasedkina T.V., Fedorova O.E., Glotov A.S., Chupova N.V., Samochatova E.V., Maiorova O.A., Zemlyakova V.V., Roudneva A.E., Chudinov A.V., Yurasov A.E., Kozhekbaeva J.M., Barsky V.E., Krusnetskiy E.Y., Krusnetskaia N.F., Cheng Ch., Ribeiro R.C., Evans W.E., Roumyantsev A.G., Zasedatelev A.S. Rapid genotyping of common deficient thiopurine S-methyltransferase (TPMT) alleles using the DNAmicrochip technique.(2006) Eur. J. Human Genetics, 14: 991-998.

18. Голденкова-Павлова И.В., Брускин C.A., Абдеев P.M., Маркарова Е.В., Бигвава С.Г., Радкевич Л.А, Курданов Х.А, Кожекбаева Ж.М., Глотов A.C., Гра O.A.,

Заседателев A.C., Наседкина Т.В., Пирузян Э.С.. Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека. (2006) Генетика, 42(8): 1443-1450.

19. Федорова O.E., Любченко Л.Н, Паяниди Ю.Г., Казубская Т.П., Амосенко Ф.А., Гарькавцева Р.Ф., Заседателев A.C., Наседкина Т.В. Использование биочипов при изучении распространенных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у больных органоспецифическим раком яичников и первично-множественными злокачественными новообразованиями с поражением яичников (российская популяция). (2007) Мол. Биол., 41 (1): 37-42.

20. Кожекбаева Ж.М., Глотов A.C., Гра O.A., Голденкова-Павлова И.В., Брускин С.А., Агафонова Е.Е., Маркарова Е.В., Абдеев P.M., Корсунская И.М., Пирузян Ан. Л., Барский В.Е., Заседателев A.C., Наседкина. Т.В. Определение функционально-значимых мутаций гена NAT2 с помощью биологических микрочипов. (2007) Мол. Биол., 41 (4): 725-733.

21. Митяева О.Н., Фесенко Д.О., Наседкина Т.В., Лысов Ю.П., Барский В.Е., Заседателев A.C., Иванов П.Л. Разработка и применение гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов для судебно-медицинской идентификации личности на примере локуса АВ0. (2007) Судебно-медицинская экспертиза, 50(2): 21-25.

22. Глотов A.C., Иващенко Т.Э., Образцова Г.И., Наседкина Т.В., Баранов B.C. Зависимость между возникновением стабильной артериальной гипертензии у детей и полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой системы. (2007) Мол. Биол. 41(1): 18-25.

23. Gra O.A., Sidorova J.V, Nikitin E.A., Turygin A.Y., Surzhikov S.A., Melikyan A.L., Sudarikov A.B., Zasedatelev A.S., Nasedkina T.V.. Analysis of T-cell receptor-y gene rearrangements using oligonucleotide microchip. (2007) J. Mol. Diagnostics, 9(2): 249257.

24. Sorokin N.V, Yurasov D.Y, Cherepanov A.I., Kozhekbaeva J.M., Chechetkin V.R., Gra O.A., Livshits M.A., Nasedkina T.V., Zasedatelev A.S. Effects of external transport on discrimination between perfect and mismatch duplexes on gel-based oligonucleotide microchips. (2007) J. Biomol. Struct. Dyn. 24(6): 571-578.

25. Наседкина T.B., Гусева H.A., Митяева О.Н., Гра O.A., Федорова O.E., Кожекбаева Ж.М., Глотов A.C., Паньков С.В., Юрасов P.A., Чудинов A.B., Заседателев A.C. Микрочипы в диагностике лимфопролиферативных заболеваний. (2007) Мол. медицина, 3: 54-60.

26. Alexandrova L.A., Jasko M.V., Belobritskaya Е.Е., Chudinov A.V., Mityaeva O.N., Nasedkina T.V., Zasedatelev A.S., Kukhanova M.K. New triphosphate conjugates bearing reporter groups: labeling of DNA fragments for microarray analysis. (2007) Bioconjug Chem., 18(3): 886-893.

27. Гра O.A., Глотов A.C., Кожекбаева Ж.М., Макарова О.В., Наседкина Т.В. Генетический полиморфизм GST, NAT2 и MTRR и предрасположенность к развитию острого лейкоза у детей. (2008) Мол. Биол. 42 (2): 1-13.

28. Самочатова Е.В., Масчан A.A., Алейникова О.В., Беспалова A.B., Байдильдина Д.Д., Дубровина М.Е., Флейшман Е.В., Наседкина Т.В., Румянцев С.А., Румянцев А.Г. Отдаленные результаты комбинированного лечения острого промиелоцитарного лейкоза у детей и подростков с использованием генной терапии. (2007) Терапевтический архив, 79(7): 26-30.

29. Gra О., GlotovA., Nikitin Е., Glotov О, Kuznetsova V., Chudinov A., Nasedkina Т. Polymorphisms in xenobiotic-metabolizing genes and the risk of Chronic Lymphocytic Leukemia and Non-Hodgkin's Lymphoma in adult Russian patients. (2008) Am. J. Hematol, 83(4): 279-87.

30. .Skudra S.,.Sinicka 0.,.Jankevics E., Inashkina I.,.Gorski B, Lubinski J.,.Nasedkina T, Fedorova O., Lyubchenko L., Tihomirova L. The 4154delA mutation carriers in the BRCA1 gene share common ancestry. (2009) Fam. Cancer, 8(1): 1-4.

31. Samochatova E.V., Chupova N.V., Rudneva A.E., Makarova O.A., Nasedkina T.V., Fedorova O.E., Glotov A.S., Kozhekbaeva Zh.M., Maiorova O.A., Roumyantsev A.G., Krynetski E.Y., Krynetskaia N.F., Evans W.E., Ribeiro R.C. TPMT genetic variations in populations of the Russian Federation. (2009) Pediatr Blood Cancer, 52(2): 203-208.

32. Наседкина T.B., Фесенко Д.О., Митяева O.H., Лысов Ю.П., Макаров А.А., Заседателев А.С. Определение фенотипических характеристик индивида по анализу генетических маркеров с помощью биологических микрочипов. (2008) Докл.Акад.Наук, 422(35): 1-4.

33. Nasedkina Т., Guseva N., Gra О., Mityaeva О., Chudinov A., Zasedatelev А. Diagnostic Microarrays in hematologic oncology. (2009) Molecular Diagnosis and Therapy, 13(2): 1-12.

34. Gra O.A., Kozhekbaeva Zh.M., Makarova O.V., Samochatova E.V., Nasedkina T.V. Polymorphism of biotransformation genes and risk of relapse in childhood acute leukemia. (2009) BJMG, 12(1): 21-35.

35. Nasedkina T.V, Gra O.A., Kozchekbaeva Zh.M., Zasedatelev A.S.. Metabolizing Gene Polymorphism Analysis and Susceptibility to Lymphoproliferative Diseases in Russian Population. In: "Population Genetics Research Progress", Nova Science Publishers, 2008; ISBN: 978-1-60456-449-5: Chapter IX; pp. 245-277.

Патенты

1. Мирзабеков А.Д., Наседкина T.B., Жаринов B.C., Исаева Е.А. «Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов) с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)», патент RU № 2286798.

2. Заседателев А.С., Наседкина Т.В., Глотов А.С. «Способ анализа генетического полиморфизма, определяющего предрасположенность к онкологическим заболеваниям и индивидуальную чувствительность к фармацевтическим препаратам с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)», патент RU № 2303634.

Заказ № 2б-а/10/09 Подписано в печать 03.10.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 3

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:ш/о@с/г.ги

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Наседкина, Татьяна Васильевна

Список сокращений.

Введение.

Цель и задачи исследования.

1 Обзор литературы.

1.1 Генетическая изменчивость.

1.1.1 Классификация мутаций. Мутации и генетический полиморфизм.

1.1.2 Основные методы выявления мутаций.

1.1.3. Идентификация новых мутаций.

1.1.4 Идентификация известных мутаций.

1.2 Биологические микрочипы как метод анализа генома.

1.2.1 История создания биологических микрочипов.

1.2.2 Различные технологические платформы.

1.2.3 Микрочипы высокой плотности в исследованиях генома человека.

1.2.4 Диагностические микрочипы низкой плотности.

1.2.5 Биологические микрочипы на основе трехмерных ячеек геля.

1.3 Генетические изменения при онкологических заболеваниях.

1.3.1 Хромосомные аберрации при лейкозах.

1.3.1.1 Классификация лейкозов.

1.3.1.2 Хромосомные перестройки в бластных клетках больных лейкозами.

1.3.1.3 Методы генодиагностики лейкозов.

1.3.1.3.1 Цитогенетический метод

1.3.1.3.2 FISH (флуоресцентная гибридизация in situ).

1.3.1.3.3 Обратная транскрипция с полимеразной цепной реакцией.

1.3.2 Структурные перестройки генов Т-клеточных рецепторов и определение Т- клональности.

1.3.2.1 Строение генов Т-клеточных рецепторов.

1.3.2.2 Основные методы диагностики Т-клеточной клональности.

1.3.3 Мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и наследственные формы РМЖ и РЯ.

1.3.3.1 Факторы риска развития РМЖ и РЯ.

1.3.3.2 Наследственные синдромы предрасположенности к РМЖ и РЯ.

1.3.3.3 Гены предрасположенности к РМЖ и РЯ.

1.3.3.3.1 Гены BRCA1 и BRCA2, их структура и функция.

1.3.3.3.2 Ген СНЕК2, его структура и функция.

1.3.3.4 Основные типы мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2, ассоциированные с риском развития РМЖ и РЯ.5 В

1.3.3.4.1 Спектр мутаций генов BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 в различных популяциях.

1.3.3.4.2 Риск развития рака для носителей BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 мутаций.

1.3.3.5 Диагностика мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2.

1.4 Генетические маркеры многофакторных заболеваний.

1.4.1 Гены ферментов системы биотрансформации.

1.4.1.1 Генетический полиморфизм тиопурин-8-метилтрансферазы (ТРМТ).

1.4.1.1.1 Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека.

1. 4.1.1.2 Фермент ТРМТ, его основные свойства и функции в клетке.

1.4.1.1.3 Полиморфизм гена ТРМТ.

1.4.1.2 Полиморфизм генов ферментов 1 и 2 фазы биотрансформации.

1.4.1.2.1 Гены цитохромов Р450.

1.4.1.2.1.1 Цитохром Р450 CYP1A1.

1.4.1.2.1.2 Подсемейство цитохромов CYPIIC.

1.4.1.2.1.3 Цитохром Р450 CYP2D6.

1.4.1.2.2 Гены, кодирующие ферменты фазы 2 биотрансформации.

1.4.1.2.2.1 Суперсемейство GST.

1. 4.1.2.2.2 Ариламин-Т^-ацетилтрансферазы (NAT).

1.4.1.2.3 Гены системы фолатного метаболизма.

1.4.1.2.3.1 Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR).

1.4.1.2.3.2 Метионинсинтазаредуктаза (MTRR).

1. 4.1.2.4 Гены системы биотрансформации и онкологические заболевания.

1.4.2 Генетическая предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям.

1.4.2.1 Генетические факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний.

1.4.2.1.1 Артериальная гипертензия.

1.4.2.1.2 Ренин-ангиотензиновая и кинин-брадикининовая системы.

1.4.2.2.3 Характеристика генов.

1.5 Генетический полиморфизм как основа идентификации личности на молекулярном уровне.

1.5.1 Молекулярно-генетический анализ в судебно-медицинской экспертизе.

1.5.2 SNP как мишень для идентификации личности.

1. 5.2.1 Локус HLA-DOA1.

1.5.2.2 Локус ABO.

1.5.2.3 Локус AMELXY.

2 Материалы и методы.

2.1 Клинический материал.

2.2 Анализ последовательностей, дизайн и синтез праймеров и зондов.

2.3 Технология производства биочипов.

2.4 Выделение РНК.

2.5 Выделение ДНК.

2.6 Цитогенетическое исследование.

2.7 Обратная транскрипция.

2.8 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.10 Флуоресцентное мечение ПЦР-продукта.

2.9 Гибридизация на биочипе.

2.10 Анализ изображения.

2.11 Другие методы определения мутаций.

2.12 Статистические методы.

3 Результаты и обсуждение.

3.1 Анализ генетических изменений при онкологических заболеваниях с использованием биочипов.

3.1.1 Выявление и идентификация хромосомных транслокаций.

3.1.1.1 Выбор транслокаций для анализа на биочипе.

3.1.1.2 Выбор последовательностей праймеров и зондов.

3.1.1.3 Разработка процедуры анализа транслокаций.

3.1.1.4 Скрининг клинических образцов.

3.1.1.5 Новое место перестройки t( 11; 19) MLL/ELL.

3.1.1.6 Сравнение с цитогенетическим методом.

3.1.1.7 Клиническое значение транслокаций.

3.1.1.8 Развитие подходов к анализу хромосомных транслокаций.

3.1.2 Определение Т-клеточной клональности.

3.1.2.1 Разработка биочипа для анализа перестроенных генов гамма-локуса Т-клеточного рецептора.

3.1.2.2 Разработка процедуры анализа.

3.1.2.3 Определение аналитической чувствительности метода.

3.1.2.4 Апробация метода определения Т-клональности с использованием биочипа.

3.1.3 Анализ мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственной формой РМЖ и РЯ.

3.1.3.1 Разработка биочипа и процедуры генотипирования для анализа мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2.

3.1.3.2. Анализ частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 в группах больных

РМЖ,РЯиПМЗН.

3.1.3.3 Клиническое значение мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2.

3.2 Анализ многофакторных заболеваний и фармакогенетические исследования с использованием биочипов.

3.2.1 Анализ полиморфизма генов системы биотрансформации.

3.2.1.1 Анализ полиморфизма гена ТРМТ.

3.2.1.2 Анализ полиморфизма других генов системы биотрансформации.

3.2.1.2.1 Создание биочипа для анализа полиморфизма генов

1 и 2 фазы биотрансформации.

3.2.1.2.2 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития лейкозов и лимфом у жителей европейской части России.

3.2.1.2.2.1 Распределение генотипов у взрослых пациентов с HXJI, B-XJIJI и здоровых доноров.

3.2.1.2.2.2 Распределение генотипов у детей, больных лейкозом, и здоровых доноров.

3.2.1.2.3 Распределение генотипов генов системы биотрансформации у здоровых жителей европейской части России.

3.2.1.2.4 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития рецидива острого лейкоза у детей.

3.2.1.2.4.1 Распределение генотипов у первичных больных и у больных в рецидиве заболевания.

3.2.1.2.4.2 Роль полиморфизма генов системы биотрансформации в развитии рецидива при лейкозах.

3.2.1.3 Анализ полиморфизма гена NAT2.

3.2.2 Анализ полиморфизма генов ренин-ангнотензиновой системы.

3.2.2.1 Разработка биочипа для анализа полиморфизма генов' ренин-ангиотензиновой системы.

3.3 Генетическая идентификация личности на основе анализа полиморфных локусов HLADQAl,ABOW.AMEL.

3.3.1 Разработка биочипа для анализа локусов HLADQA1, АВО И AMEL.

3.3.2 Генотипирование с использованием ИЛ-биочипа.

3.3.3 Возможность применения ИЛ-биочипа в идентификационных исследованиях.

3.4 Сравнение метода гибридизации на гидрогелевых биочипах с другими методами анализа мутаций.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биологических микрочипов"

Секвенирование генома человека и пост-геномный анализ открыли новую эру в биомедицинских исследованиях; Все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека. Это диагностика наследственных заболеваний, анализ генетических изменений в опухолевых клетках при уточнении диагноза и выборе терапии в онкологии. Получила развитие персонализированная медицина, которая изучает генетические особенности человека, его предрасположенность к различным заболеваниям и разрабатывает профилактические меры для их предупреждения. При лечении заболеваний с помощью современных лекарственных средств остро встает вопрос о переносимости лекарственных препаратов и предупреждении развития побочных реакций, что также может определяться генетическими характеристиками пациента. Этими проблемами занимается фармакогенетика, как одно из направлений персонализированной медицины. Также все чаще приходится прибегать к генетическому анализу при решении задач в области криминалистики и судебной медицины. Широкое использование молекулярно-генетических методов в практике невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить одновременный анализ множества генетических изменений. Одним из наиболее перспективных подходов являются биологические микрочипы.

Биологические микрочипы (microarrays) широко используют в самых разных областях молекулярной биологии, генетики, биомедицины, онкологии. При создании биологических микрочипов используются различные технологические платформы. Одной из наиболее известных является технология Affymetrix GeneChip (Santa Clara, CA, США). Микрочипы Affymetrix содержат до 10б индивидуальных элементов (зондов) и используются для параллельного анализа более 200 ООО полиморфных ДНК маркеров. Особенностью этого типа микрочипов является синтез олигонуклеотидных зондов прямо на поверхности кварцевых стекол методом фотолитографии. Также используют микрочипы, в которых на твердой подложке иммобилизованы предварительно синтезированные или выделенные фрагменты ДНК. Микрочипы, содержащие большое количество элементов, относятся к так называемым «микрочипам высокой плотности» и применяются в исследовательских целях. Выявление ограниченного набора генетических маркеров, используемого в диагностических целях, делает обоснованным переход к «микрочипам низкой плотности», содержащим десятки или одну - две сотни элементов. Как правило, в этих случаях используют микроскопические стекла с нанесенными и ковалентно пришитыми зондами. Особенностью технологии гидрогелевых биочипов является трехмерная структура ячеек геля, в которых иммобилизованы зонды (фрагменты ДНК или белки). Технология гидрогелевых биочипов развивается в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН с 1989 г. и является одной из наиболее востребованных платформ для разработки биочипов диагностической направленности.

В настоящем исследовании разработаны и апробированы следующие биочипы: JIK-биочип для выявления и идентификации хромосомных транслокаций; TJI-биочип для определения Т-клеточной клональности; РМЖ-биочип для определения мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственной формой рака молочной железы; ПФ-биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации; ПФ-биочип (Кардио) для определения полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы и ИЛ-биочип для генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека.

Необходимость анализа транслокаций при лейкозах связана с тем, что это заболевание занимает ведущее место среди онкологических заболеваний у детей. Всего лишь 20 лет назад выживаемость при детских лейкозах составляла 5-10%, тогда как в настоящее время она составляет 60-80% (по данным 5-летней оценки). Такой успех в лечении достигнут благодаря использованию наиболее эффективных комбинаций различных цитостатических препаратов, а также рационализации терапии, основанной на углубленной диагностике заболевания, в том числе и с использованием молекулярно-генетических методов. В настоящей работе при создании биочипа были выбраны 13 наиболее клинически значимых и часто встречающихся при лейкозах транслокаций: t(9;22) BCR/ABL р190 и р210, t(12;21 )TEL/AML, t(l;19) Е2А/РВХ, t(15;17) PML/RARA, t(8;21) AML/ETO, invl6 CBFB/MYH, t(4;ll) MLL/AF4 и другие транслокации с участием гена MLL. Каждая из этих транслокаций определяет вариант лейкоза с определенными клиническими характеристиками, характером течения заболевания и прогнозом и важна для выбора стратегии лечения.

Определение Т-клеточной клональности имеет значение при диагностике Т-клеточных лимфом. Традиционные методы диагностики: цитология, гистология, иммунофенотипирование и иммуногистохимия во многих случаях не позволяют провести дифференциальный диагноз между опухолевой и реактивной Т-клеточной пролиферацией. Методы молекулярной диагностики Т-клеточной клональности основаны на наличии одинаково перестроенных генов вариабельного региона Т-клеточных рецепторов (TCR) в опухолевых Т-лимфоцитах. Появление клона Т-лимфоцитов при опухоли сопровождается появлением и развитием популяции клеток с одинаковой перестройкой генов TCR, что может быть зарегистрировано по гибридизации с соответствующими зондами на биочипе.

Наличие мутаций в высоко пенентрантных генах-супрессорах BRCA1 и BRCA2 ассоциируется с повышенным риском развития рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ) у женщин. Эта модель уже является объектом генетического тестирования в странах Западной Европы и Америке. Исследования, выполненные на российских пациентах, показали, что в России распространен ряд терминальных мутаций (germ-line founder mutations), анализ которых позволяет эффективно выявлять лиц с высокой предрасположенностью к развитию заболевания. Также представляет интерес анализ больших выборок пациентов для получения более полной картины о частоте различных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке и для выявления доли наследственных форм в общей структуре заболеваемости.

За последнее время накоплено большое число данных о том, что генетический полиморфизм лежит в основе индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам, а также определяет наследственную предрасположенность к многофакторным заболеваниям. Именно поэтому анализ генетического полиморфизма является чрезвычайно актуальной задачей. Одними их наиболее часто исследуемых генов являются гены системы биотрансформации, белковые продукты которых принимают участие в метаболизме всех ксенобиотиков, поступающих в организм. Выявление ассоциаций различных аллелей генов с конкретным заболеванием и ответом на лекарственную терапию позволяет не только выявлять механизмы заболевания и исследовать его природу, но и разрабатывать подходы к персонализированной медицине, т.е. лечению, учитывающему биохимическую индивидуальность каждого пациента. Так, наследственная недостаточность фермента тиопурин-8-метилтрансферазы (ТРМТ), обусловленная инактивирующими однонуклеотидными заменами в гене ТРМТ, приводит к плохой переносимости лекарственных препаратов тиопуриновой группы (6-меркаптопурин, б-тиогуанин и азатиоприн). Стандартные дозы этих лекарств высоко токсичны для больных с недостаточностью этого фермента, причем токсический эффект может быть фатальным. В состав биочипа для определения индивидуальной переносимости лекарств также включены гены основных ферментов биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2, участвующих в метаболизме широкого спектра лекарственных препаратов. Имеются данные, что полиморфизм в генах системы биотраисформации вносит вклад в формирование некоторых онкологических заболеваний, например, таких как лимфомы и "лейкозы, а также влияет на частоту и особенности развития рецидивов. Исследование частоты аллелей указанных генов в российской популяции у больных и здоровых доноров позволяет выявить генетические факторы риска развития этих заболеваний.

Дальнейшее развитие этот подход к оценке полиморфизма генома при многофакторных заболеваниях получил при создании ПФ-биочипа (Кардио), предназначенного для анализа полиморфизма некоторых генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, участвующих в регуляции кровяного давления. Показано, что такие заболевания, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца и др. могут возникать вследствие неблагоприятного сочетанного эффекта многих (нескольких) аллелей полиморфных генов. Именно поэтому, разработка подхода для одновременного анализа полиморфизма многих генов имеет большое значение также и в изучении сердечно-сосудистой патологии.

Биочип для идентификации личности разработан для другой области современной медицины - судебно-генетической экспертизы. Задачи идентификации личности встают не только при поиске преступника, оставившего следы на месте преступления, но и при опознании тел погибших при природных или техногенных катастрофах, при террористических актах. В настоящее время основными методами анализа при идентификации личности остаются серологический анализ крови, и молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генома, известных как тандемные повторы с изменяющимся числом копий, в частности микросателлитов или STR (shot tandem repeats). Однако серологический анализ часто не эффективен при исследовании малых количеств биологических следов, а также деградированных образцов. STR-анализ требует пока еще достаточно дорогого импортного оборудования. Поэтому актуальна разработка новых подходов, обеспечивающих скрининг большого количества образцов, но в тоже время обладающих высокой специфичностью и чувствительностью.

Таким образом, биочипы могут служить удобным инструментом при анализе различных генетических изменений, включая как точечные мутации, так и некоторые хромосомные перестройки. Изучение генетических изменений человека в норме и при различных заболеваниях и разработка биочипов различной диагностической направленности для наиболее актуальных областей медицины позволяют поднять на более высокотехнологичный уровень, как современную клиническую диагностику, так и биомедицинские исследования в целом.

Цель исследования:

4. Разработать методические подходы к определению генетической предрасположенности к многофакторным заболеваниям на примере биочипа для определения полиморфизма в генах системы биотрапсформации и биочипа для анализа полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы.

7. Разработать методические подходы к генетической идентификации личности по анализу однонуклеотидного полиморфизма на примере локусов HLA-DOA1, АВО и AMEL. Определить частоты аллелей генов HLA-DQA1 и АВО и оценить возможности практического применения метода.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Наседкина, Татьяна Васильевна

5 ВЫВОДЫ

2. Разработаны методы выявления и идентификации хромосомных транслокаций при лейкозах и структурных перестроек локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора с помощью гибридизации на олигонуклеотидном биочипе. Показана эффективность метода анализа транслокаций в диагностике лейкозов и определены частоты транслокаций у детей, жителей России, больных различными формами этого заболевания. Создана тест-система JIK-биочип и зарегистрирована в Росздравнадзоре. Создан прототип тест-системы для определения Т-клеточной клональности при диагностике Т-клеточных лимфом.

3. Разработан метод диагностики точечных мутаций в BRCA1/2 и СНЕК2 генах человека (185delAG, 300T>G, 4153delA, и 5382insC в гене BRCA1, 695incT и 6174delT в гене BRCA2, и варианта llOOdelC в гене СНЕК2). Определены частоты этих мутаций у пациентов с диагнозами РМЖ, РЯ и ПМЗН с поражением МЖ и яичников, жителей европейской части России.

5. Определены частоты аллелей/генотипов генов системы биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTTI, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у здоровых жителей европейской части России и у больных лимфомами и лейкозами. Показано, что определенные генотипы генов GSTM1 и CYP1A1, а также их сочетания являются факторами риска развития НХЛ и В-ХЛЛ во взрослом возрасте. Генотипы генов GSTT1 и GSTM1 («нулевые» генотипы) и гена NAT2 (генотип *4/*4), а также их сочетания являются факторами риска развития острого лейкоза у детей. Генотипы генов GSTTI, GSTM1 («ненулевые генотипы») и генотип гена CYP1A1*1/*2A, а также их сочетания являются факторами риска развития рецидива при лейкозах у детей.

7. Разработаны методические подходы к генетической идентификации личности по анализу однонуклеотидного полиморфизма на примере локусов HLA-DQA1, АВО и AMEL, создана тест-система ИЛ-Биочип. Определены частоты аллелей генов HLA-DQA1 и АВО у жителей европейской части России. Показана целесообразность использования этого метода для скрининга образцов на первичном этапе судебно-генетических экспертиз.

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение генетической предрасположенности к многофакторным и инфекционным заболеваниям, фармакогенетика, создание "генетического паспорта", все это немыслимо без разработки новых методов исследования. На сегодняшний день наиболее подходящим методом для этих развивающихся направлений медицины и биологии является анализ, основанный на диагностике с помощью биочипов. Биочипы, в отличие от многих других методов анализа мутаций, позволяют анализировать множество мутаций у одного человека одновременно, что абсолютно необходимо для решения задач персонализированной медицины.

В настоящей работе разработаны методические подходы к выявлению различных изменений в геноме человека (хромосомных перестроек и точечных мутаций) на основе технологии гидрогелевых биочипов. Создан метод диагностики 13 транслокаций при острых и хронических лейкозах с использованием гибридизации на олигонуклеотидном биочипе. Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей, больных лейкозом. Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/4756-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. ЛК-Биочип используется в гематологических клиниках для уточнения диагноза, определения прогноза заболевания и выбора терапии. Разработан метод определения Т-клеточной клональности на основе гибридизации на биочипе. Показана возможность применения этого подхода в клинической диагностике Т-клеточных лимфом.

Разработан метод диагностики семи наиболее распространенных точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 (185delAG, 300T>G, 4153delA и 5382insC в гене BRCA1, 695insT и 6174delT в гене BRCA2, и llOOdeIC в гене СНЕК2). Определены частоты наиболее распространенных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у пациентов с РМЖ, РЯ и первично-множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН), что представляет интерес для клинической онкологии. РМЖ-биочип позволяет быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и может быть использован в онкологической практике. Выявление носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 помогает разработать наиболее эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкозаболевания и профилактику других злокачественных новообразований. У здоровых носителей это позволяет выбрать тактику проведения клинического мониторинга за состоянием здоровья и профилактику онкозаболеваний.

Разработан биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации. Определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1 (4887С>А, 4889A>G, 6235Г>С), CYP2D6 (1934G>A, 2637delA), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), MTHFR (677С>Т, 1298А>С), MTRR (66A>G), NQOl (609C>T), CYP2C9 (4300T, 1075C>T), CYP2C19 (681G>A) и NAT2 (341T>C, 4810T, 590G>A, 857G>A) у взрослых, больных HXJl или B-XJIJI, жителей европейской части России, и проведено сравнение с группой здоровых лиц. Показано, что полиморфные варианты гена CYP1A1 (4887С>А, 4889A>G, 6235Т>С) и «нулевой» GSTM1 генотип чаще встречаются у больных НХЛ и В-ХЛЛ, чем у здоровых индивидов.

Проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, N001, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей, больных острыми лейкозами, и здоровых индивидов. Впервые показано, что генотип NAT2 341T/T,481C/C,590G/G, а также сочетание данного генотипа с «нулевым» GSTT1 генотипом, «нулевым» GSTM1 генотипом и двойным «нулевым» GSTT1/GSTM1 генотипом встречается чаще у больных, чем у здоровых доноров и, таким образом, может рассматриваться, как фактор риска развития лейкозов у детей. Также обнаружено, что генотип MTRR 66G/G встречается реже у девочек, больных острыми лейкозами, по сравнению с группой здоровых доноров женского пола и, таким образом, может рассматриваться как фактор, предотвращающий развитие лейкозов у девочек.

Определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, N001, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей с первично диагностированным острым лейкозом и в рецидиве заболевания. Показана ассоциация генотипа CYP1A1*1/*2A и «ненулевого» GSTT1 генотипа с развитием рецидива ОЛЛ. При анализе частот аллелей гена NAT2 впервые обнаружено, что у пациентов с рецидивом ОЛЛ чаще встречается генотип NAT2 541 С/-, 481T/-,590G/G,857G/G, тогда как у пациентов с рецидивом ОНЛЛ - генотип 341Т/Т,481С/С,590АУ- (по сравнению с пациентами с первично диагностированным ОЛЛ и ОНЛЛ, соответственно). Эти данные могут быть использованы при разработке методов предиктивной диагностики лимфопролиферативных заболеваний и при оценке риска развития рецидива лейкоза у детей.

Впервые на большой выборке определены частоты аллелей и генотипов гена ТРМТ у детей с онкогематологическими заболеваниями и здоровых доноров в российской популяции. Проведено сравнение этих данных с частотами аллелей и генотипов, полученными для других популяций. Показано, что самым частым полиморфным аллелем является ТРМТ*ЗА (85,7% от всех исследованных аллелей), а более редкими аллелями ТРМТ*ЗС (9,5%) и ТРМТ*2 (4,8%). Это согласуется с ранее полученными данными для популяций Европы и Америки.

Диагностическая тест-система ПФ-биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г.). ПФ-биочип используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН и ГУ Научный центр здоровья детей РАМН для определения индивидуальной чувствительности к некоторым лекарственным препаратам, в том числе тиопуринам, а также риска развития некоторых многофакторных заболеваний и составления генетического паспорта.

Разработан биочип для определения полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы - ПФ-биочип (Кардио), который используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта РАМН и для анализа предрасположенности к развитию осложнений при беременности у женщин.

Разработан биочип для идентификации личности (ИЛ-биочип), позволяющий анализировать 9 аллелей гена HLA-DOA1, 5 аллей АВО и 2 аллеля гена AMEL. Проведено исследование основных параметров информативности локусов HLA-DOA1 и АВО и показано, что средняя вероятность идентификации личности с помощью разработанного биочипа составляет 99,6%. При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно-медицинской практике при экспертизах, позволяющих сузить круг подозреваемых или при опознании тел погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови АВО (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида, что является важной информацией для следователя при поиске преступника.

Таким образом, биочипы могут быть использованы и используются для решения широкого круга задач. Биочипы являются удобным инструментом в популяционных исследованиях, повышая произодительность скрининга больших групп населения на наличие множества полиморфных маркеров. Также, в некоторых случаях, биочипы могут уже сегодня служить в качестве надежного диагностического метода в клинической медицине.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Наседкина, Татьяна Васильевна, Москва

1. Под редакцией Иванова В.И., Киселева JI.JI. Геномика — медицине. ИКЦ «Академкнига». Москва. 2005.

2. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Специальная литература. СПб. 1997.

3. Хедрик Ф. Генетика популяций. Техносфера. Москва. 2003.

4. Van Ошшеп G.R.B., Bakker Е., den Dunnen J.T. The Human Genome Project and the future of diagnostics, treatment and prevention. Lancet. 1999. 354 (suppl.l). 5-10.

5. Estivill X., Bancells C., Ramos C. Et al. The Biomed CF mutation analysis consortium geographic distribution and regional origin of 272 cysric fibrosis mutations in European populations. Hum. Mutat. 1997. 10: 135-154.

6. Schildkraut CL, Marmur J, Doty P. The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies. J Mol Biol. 1961. 3: 595-617.

7. Hoyer B, McCartny B, Bolton E. Complementary RNA in nucleus and cytoplasm of mouse liver cells. Science. 1963. 140: 1408-1412.

8. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS. 1969. 64(2): 600-604.

9. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 1975. 98(3): 503-517.

10. Haralambidis J, Chai M, Tregear GW. Preparation of base-modified nucleosides suitable for non-radioactive label attachment and their incorporation into synthetic oligodeoxyribonucleotides. Nucleic Acids Res. 1987 15(12): 4857-4876.

11. Pachmann K, Reinecke K, Emmerich B, Thiel E. Highly fluorochrome labeled gene probes for quantitative tracing of RNA in individual cells by in situ hybridization. Bioconjug Chem. 1991 2(l):19-25

12. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73

13. Под ред. Херрингтона С., Магги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Мир. Москва. 1999.

14. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya Т. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. 86:2766-2770.

15. Glavac D., Dean M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum. Mutat. 1993. 2(5): P.404-414.

16. Майерс P., Шеффилд В., Кокс Д. Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий гель-электрофорез.

17. Edwards S.M., Kote-Jarai Z., Hamoudi R., Eeles R.A. An improved high throughput heteroduplex mutation detection (FMD). Ibid. 2001. 17: 220-232.

18. Cotton R.G.H. Detection of mutations in DNA and RNA by chemical cleavage. Methods in Molecular Biology. 1990. 7: 3-12.

19. Watson P, Lieberman R, Snyder C, Clark VJ, Lynch HT, Holt JT. Detecting BRCA2 protein truncation in tissue biopsies to identify breast cancers that arise in BRCA2 gene mutation carriers. J Clin Oncol. 2009. 27(24):3894-900.

20. Иващенко Т.Э., Асеев M.B., Баранов B.C. Методы молекулярной диагностики генных болезней. В кн.: Медицинские лабораторные технологии. Справочник. СПб.: Интермедика, 1999. Т.2. С. 603-617.

21. Allele-specific PCR in SNP genotyping. Gaudet M, Fara AG, Beritognolo I, Sabatti M. Methods Mol Biol. 2009. 578:415-424.

22. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени. Бином, Москва. 2009.

23. Skobeltsyna LM, Pyshnyi DV, Ivanova EM, Stepanov VA, Puzyrev VP, Dymshits GM, Kharkov VN, Zarytova VF Short Oligonucleotide Tandem Ligation Assay for Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in Y Chromosome. Mol Biotechnol. 2009 Sep 1.

24. Hashimoto M, Barany F, Soper SA. Polymerase chain reaction/ligase detection reaction/hybridization assays using flow-through microfluidic devices for the detection of low-abundant DNA point mutations. Biosens Bioelectron. 2006. 21(10):1915-1923.

25. Poulsen L, Petersen J, Dufva M. Genotyping of mutations in the beta-globin gene using allele specific hybridization. Methods Mol Biol. 2009. 529:157-170.

26. Blievernicht JK, Schaeffeler E, Klein K, Eichelbaum M, Schwab M, Zanger UM. MALDI-TOF mass spectrometry for multiplex genotyping of CYP2B6 single-nucleotide polymorphisms. Clin Chem. 2007. 53(l):24-33.

27. Лысов Ю., Флорентьев В., Хорлин А., Храпко К., Шик В., Мирзабеков А. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод. Докл. Акад. Наук СССР. 1988. 303: 1508-1511.

28. Southern Е.М. DNA microarrays. History and overview. Methods Mol Biol. 2001. 170: 1-15.

29. Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович B.M., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е., Заседателев А.С. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. Мол. Биол. 2004. 38: 5-16.

30. Stoughton R.B. Applications of DNA Microarrays in biology. Ann. Rev. Biochem. 2005. 74: 53-82.

31. Lee NH, Saeed AI. Microarrays: an overview; Methods Mol Biol. 2007. 353: 265-300.

32. Pritchard C., Underhill P., Greenfield A. Using DNA microarrays. Methods Mol Biol. 2008.461:605-29.

33. Patil N, Nouri N, McAllister L, Matsukaki H, Ryder T. Single-nucleotide polymorphism genotyping using microarrays. Curr Protoc Hum Genet. 2001 Chapter 2:Unit 2.9

34. Dalma-Weiszhausz DD, Warrington J, Tanimoto EY, Miyada CG. The affymetrix GeneChip platform: an overview. Methods Enzymol. 2006;410:3-28.

35. Gunderson KL. Whole-genome genotyping on bead arrays. Methods Mol Biol. 2009; 529:197-213.

36. Tebbutt SJ. Genotyping of single nucleotide polymorphisms by arrayed primer extension. Methods Mol Biol. 2007. 382: 149-161.

37. Pullat J, Metspalu A. Arrayed primer extension reaction for genotyping on oligonucleotide microarray. Methods Mol Biol. 2008; 444:161-7.

38. Sears C, Armstrong SA. Microarrays to identify new therapeutic strategies for cancer. Adv Cancer Res 2007. 96: 51-74

39. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992. 258: 818-21.

40. Mrozek К. Cytogenetic, molecular genetic, and clinical characteristics of acute myeloid leukemia with a complex karyotype. Semin Oncol. 2008.35(4):365-77.

41. Bodmer W, Bonilla C. Common and rare variants in multifactorial susceptibility to common diseases. Nat Genet. 2008. 40(6):695-701.

42. Tuma RS. Genome-wide association studies provoke debate and a new look at strategy. J Natl Cancer Inst. 2009. 101(15): 1041-1043.

43. Primdahl H, Wikman FP, von der Maase H, Zhou XG, Wolf H, Orntoft TF Allelic imbalances in human bladder cancer: genome-wide detection with high-density singlenucleotide polymorphism arrays. J Natl Cancer Inst. 2002; 94: 216-23

44. Nielaender I, Martin-Subero JI, Wagner F, Martinez-Climent JA, Siebert R. Partial uniparental disomy: a recurrent genetic mechanism alternative to chromosomal deletion in malignant lymphoma. Leukemia 2006; 20: 904-5

45. Heller Т., Kirchheiner J, Armstrong VW, Luthe H, Tzvetkov M, Brockmoller J, Oellerich M. AmpliChip CYP450 GeneChip: a new gene chip that allows rapid and accurate CYP2D6 genotyping. Ther Drug Monit. 2006; 28 (5): 673-7.

46. Marchionni L, Wilson RF, Wolff AC, Marinopoulos S, Parmigiani G, Bass EB, Goodman SN. Systematic review: gene expression profiling assays in early-stage breast cancer. Ann Intern Med. 2008; 148 (5): 358-69

47. Mikhailovich V, Gryadunov D, Kolchinsky A, Makarov AA, Zasedatelev A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. Bioessays. 2008; 30 (7): 673-82

48. Rubina AY, Kolchinsky A, Makarov AA, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. Proteomics. 2008; 8 (4): 817-31

49. Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov , SM, Konovalova EV, Mirzabekov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques. 2003; 34 (5): 1008-14, 101620, 1022

50. Bavykin SG, Akowski JP, Zakhariev VM, Barsky VE, Perov AN, Mirzabekov AD. Portable system for microbial sample preparation and oligonucleotide microarray analysis. Appl Environ Microbiol. 2001; 67 (2): 922-8

51. Fotin, A., Drobyshev A., Proudnikov D., Perov A., Mirzabekov A. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips Nucleic Acids Res. 1998. 26. P: 1515-1521.

52. Fesenko EE, Kireyev DE, Gryadunov DA, Mikhailovich VM, Grebennikova TV, L'vov DK, Zasedatelev AS. Oligonucleotide microchip for subtyping of influenza A virus. Influenza Other Respi Viruses. 2007 May; 1(3): 121-9.

53. Вуд М.Э., Банн П.А. Секреты гематологии и онкологии. Москва. Бином. 1997.

54. Алейникова О.В., Сыцкевич О.Н., Потапнев М.П. Современные методы диагностики острых лейкозов у детей и взрослых (методические рекомендации). Минск. 2000.

55. Под редакцией Волковой М. А. Клиническая онкогематология. М., Медицина, 2007.

56. Алейникова О.В., Потапнев М.П., Углова Т.А. Стратификация групп риска у детей с острым лимфобластным лейкозом. (Методические рекомендации). Минск. 2001.

57. Kosmider О, Moreau-Gachelin F. From mice to human: the "two-hit model" of leukemogenesis. Cell Cycle. 2006 5(6): 569-570.

58. Rabbits TH. Chromosomal translocations in human cancer. Nature 1994; 372: 143-149.

59. Look AT. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science 1997; 278: 1059-64

60. Greaves M. Childhood leukaemia. BMJ. 2002. V. 324(7332). P. 283-287.

61. Pui CH, Campana D, Evans WE. Childhood acute lymphoblastic leukaemia: current status and future perspectives. Lancet Oncol 2001; 2: 597-607

62. Aspland S., Bendall H., Murre C. The role of E2A-PBX1 in leukemogenesis. Oncogene 2001; 20, 5708-5717.

63. Saglio G, Pane F, Martinelli G, Guerrasio A. BCR/ABL transcripts and leukemia phenotype: an unsolved puzzle. Leuk Lymphoma. 1997. 26(3-4):281-6.

64. Melo JV. BCR-ABL gene variants. Baillieres Clin Haematol. 1997 Jun;10(2):203-22.

65. Roskoski R Jr. STI-571: an anticancer protein-tyrosine kinase inhibitor. Biochem Biophys Res Commun. 2003 . 3;309(4):709-17.

66. Lo Coco F, Diverio D, Pandoffi PP, Biondi A, Rossi V, Awisati G, Rambaldi A, Arcese W, Petti MC, Meloni G, et al. Molecular evaluation of residual disease as a predictor of relapse in acute promielocytic leukemia. Lancet 1992; 340: 1437-1448

67. Grimwade D, Lo Coco F. Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2002 Oct; 16(10): 1959-73.

68. Gu Y., Nakamura Т., Alder H. Prasad R, Canaani O, Cimino G, Croce CM, Canaani E. The t(4;ll) Chromosome Translocation of Human Acute Leukemias Fuses the ALL-1 Gene, Related to Drosophila trithorax, to the AF-4 Gene. Cell. 1992. 71. 701-708.

69. Auton PM. and Cleary ML. Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion proteins. Oncogene. 2001. 20: 5695-5707.

70. An Atlas on Chromosomes in Hematological Malignancies. Example: 1 lq23 and MLL partners. Leukemia. 2001. V. 15. P. 987-999.

71. Biondi A, Cimino G, Pieters R, Ching-Hon Pui. Biological and therapeutic aspects of infant leukemia. Blood. 2000. V. 96(1). P. 24-33.

72. Jolkowska J, Derwich K, Dawidowska M. Methods of minimal residual disease (MRD) detection in childhood haematological malignancies. J Appl Genet. 2007;48(l):77-83.

73. Haferlach T, Kern W, Schnittger S, Schoch C. Modern diagnostics in acute leukemias. Crit Rev Oncol Hematol. 2005; 56 (2): 223-34

74. Сергеев А.Г., Иванов P.A. Генодиагностика лейкозов. Пособие для врачей. Екатеринбург. 1998.

75. Mrozek К, Heerema NA, Bloomfield CD. Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev. 2004 18(2): 115-36.

76. Chen CC, Yang CF, Lee KD, You JY, Yu YB, Ho CH, Tzeng CH, Chau WK, Hsu HC, Gau JP. Complex karyotypes confer a poor survival in adult acute myeloid leukemia with unfavorable cytogenetic abnormalities. Cancer Genet Cytogenet. 2007; 174(2): 138-46.

77. Konn ZJ, Wright SL, Barber KE, Harrison С J. Fluorescence In situ hybridization (FISH) as a tool for the detection of significant chromosomal abnormalities in childhood leukaemia. Methods Mol Biol. 2009;538:29-55.

78. Rayeroux КС, Campbell LJ. Gene amplification in myeloid leukemias elucidated by fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet. 2009;193(1): 44-53.

79. Betts DR, Stanchescu R, Niggli FK, Cohen N, Rechavi G, Amariglio N, Trakhtenbrot L. SKY reveals a high frequency of unbalanced translocations involving chromosome 6 in t(12;21)-positive acute lymphoblastic leukemia. Leuk Res. 2008. 32(l):39-43.

80. Soszynska K, Mucha B, Debski R, Skonieczka K, Duszenko E, Koltan A, Wysocki M, Haus O. The application of conventional cytogenetics, FISH, and RT-PCR to detect genetic changes in 70 children with ALL. Ann Hematol. 2008 Dec;87(12):991-1002.

81. Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.C., Pedersen В., Jorgensen P. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood. 1998. V. 92. P. 574-588.

82. Lefranc M-P and Lefranc G. The T cell receptor Facts Book. London; Academic Press; 2001

83. Thompson SD, Manzo AR, Pelkonen J, Larche M, Hurwitz JL.Developmental T cell receptor gene rearrangements: relatedness of the alpha/beta and gamma/delta T cell precursor. Eur J Immunol. 1991. 21(8): 1939-1950

84. Theodorou I, Raphael M, Bigorgne C, Fourcade C, Lahet C, Cochet G, Lefranc MP, Gaulard P, Farcet JP. Recombination pattern of the TCR gamma locus in human peripheral T-cell lymphomas. J Pathol. 1994. 174(4):233-242.

85. Rezuke WN, Abernathy EC, Tsongalis GJ. Molecular diagnosis of B- and T-cell lymphomas: fundamental principles and clinical applications. Clinical Chemistry 1997; 43 (10): 1814-1823

86. Arber DA. Molecular diagnostic approach to non-Hodgkin's lymphoma. J Mol Diagn 2000; 2 (4): 178-190

87. Никитин EA, Левина EA, Судариков АБ. Роль молекулярных методов в диагностике и мониторинге лимфопролиферативных заболеваний. Гематология и трансфузиология 2001; 3: 19-26

88. Breit ТМ, Wolvers-Tettero LM, Beishuizen A, Verhoeven MA, van Wering ER, van Dongen JJ. Southern Blot Patterns, Frequencies, and Junctional Diversity of T-cell

89. Receptor-8 Gene Rearrangements in Acute Lymphoblastic Leukemia. Blood. 1993. 82(10): 3063-3074

90. Yu RC, Alaibac M. A Rapid Polymerase Chain Reaction-based Technique for Detecting Clonal T-cell Receptor Gene Rearrangements in Cutaneus T-cell Lymphomas of both ap and y5 Varieties. Diagn Mol Pathol 1996. 5(2): 121-126

91. Lynas C, Howe D. Simple, reliable detection of T cell clones by PCR-LIS-SSCP analysis of TCR rearrangement. Molecular and Cellular Probes 1998; 12: 41-48

92. Theodorou I, Delfau Larue MH, Bigorgne C, et al. Cutaneous T-cell infiltrates: analysis of T-cell receptor gamma gene rearrangement by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis. Blood 1995; 86: 305-310

93. Wickham CL, Lynas C, Ellard S. Detection of clonal T cell populations by high resolution PCR using fluorescently labelled nucleotides, evaluation using conventional LIS-SSCP. J Clin Mol Pathol 2000; 53: 150-154

94. Meier VS, Rufle A, Gudat F. Simutaneous Evaluation of T-and B-cell clonality, t(l 1;14) and t(14;18) by a Four-Color Multiplex PCR assay and Automated High-resolution Fragment Analysis. Am J Pathol 2001; 159 (6): 2031-2043

95. Трапезников H.H., Аксель E.M. 2000. В кн.: Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1998. М.: ОНЦ РАМН, 270с.

96. Parkin DM. Epidemiology of cancer: global patterns and trends. Toxicol Lett. 1998 28;102-103:227-34.

97. Cannistra S.A. 2004. Cancer of the ovary. N. Engl. J. Med. 351,2519-2529.

98. Memarzadch S., Berek J.S. 2001. Advances in the management of epithelial ovarian cancer. J. Reprod. Med. 46, 621-630.

99. Сельчук В. Ю., Попова Т. Н., Аверьянова С. В.2001. Первично-множественные синхронные злокачественные новообразования репродуктивной системы у женщин Российский онкологический журнал. 3,

100. Hulka BS, Moorman PG. Breast cancer: hormones and other risk factors. Maturitas. 2001 28;38(1):103-13.

101. Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer. 1999. 80(6):827-41.

102. McPherson K, Steel CM, Dixon JM. ABC of breast diseases. Breast cancer-epidemiology, risk factors, and genetics. BMJ. 2000 321(7261):624-8.

103. Enger SM, Ross RK, Paganini-Hill A, Carpenter CL, Bernstein L. Body size, physical activity, and breast cancer hormone receptor status: results from two case-control studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000 9(7):681-7.

104. Amos CI, Struewing JP. Genetic epidemiology of epithelial ovarian cancer. Cancer. 1993 Jan 15;71(2 SuppI):566-72.

105. Ness RB, Cramer DW, Goodman MT, Kjaer SK, Mallin K, Mosgaard BJ, Purdie DM, Risch HA, Vergona R, Wu AH. Infertility, fertility drugs, and ovarian cancer: a pooled analysis of case-control studies. Am J Epidemiol. 2002 Feb l;155(3):217-24.

106. Albano WA, Recabaren JA, Lynch HT, Campbell AS, Mailliard JA, Organ CH, Lynch JF, Kimberling WJ. Natural history of hereditary cancer of the breast and colon. Cancer. 1982 Jul 15;50(2):360-3.

107. Ford D, Easton DF, Bishop DT, Narod SA, Goldgar DE. Risks of cancer in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. Lancet. 1994 343 (8899):692-5.

108. Easton DF, Narod SA, Ford D, Steel M. The genetic epidemiology of BRCA1. Breast Cancer Linkage Consortium. Lancet. 1994; 344 (8924):761.

109. Lynch HT, Schuelke GS, Kimberling WJ, Albano WA, Lynch JF, Biscone KA, Lipkin ML, Deschner EE, Mikol YB, Sandberg AA. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndromes I and II). II. Biomarker studies. Cancer. 1985 Aug 15;56(4):939-51.

110. Li FP, Fraumeni JF Jr. Soft-tissue sarcomas, breast cancer, and other neoplasms. A familial syndrome? Ann Intern Med. 1969; 71(4):747-52.

111. Thull DL, Vogel VG. Recognition and management of hereditary breast cancer syndromes. Oncologist. 2004;9(1): 13-24.

112. Williams WR, Anderson DE. Genetic epidemiology of breast cancer: segregation analysis of 200 Danish pedigrees. Genet Epidemiol. 1984;l(l):7-20.

113. Carlson KJ, Skates SJ, Singer DE. Screening for ovarian cancer. Ann Intern Med. 1994. 121(2): 124-32.

114. Ragge NK, Salt A, Collin JR, Michalski A, Farndon PA. Gorlin syndrome: the PTCH gene links ocular developmental defects and tumour formation. Br J Ophthalmol. 2005 Aug;89(8):988-91.

115. Thompson D, Easton DF; Breast Cancer Linkage Consortium Cancer Incidence in BRCA1 mutation carriers. J Natl Cancer Inst. 2002 Sep 18;94(18):1358-65.

116. Wooster R, Neuhausen SL, Mangion J, Quirk Y, Ford D, Collins N, Nguyen K, Seal S, Tran T, Averill D. Localization of a breast cancer susceptibility gene, BRCA2, to chromosome 13ql2-13. Science. 1994. 265(5181):2088-2090

117. Hall JM, Lee MK, Newman B, Morrow JE, Anderson LA, Huey B, King MC. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21. Science. 1990 250(4988): 1684-1689.

118. Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, Futreal PA, Harshman K, Tavtigian S, Liu Q, Cochran C, Bennett LM, Ding W. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science. 1994. 266(5182): 66-71.

119. Chen CF, Li S, Chen Y, Chen PL, Sharp ZD, Lee WH. The nuclear localization sequences of the BRCA1 protein interact with the importin-alpha subunit of the nuclear transport signal receptor. J Biol Chem. 1996. 271(51):32863-8.

120. Scully R, Chen J, Ochs RL, Keegan K, Hoekstra M, Feunteun J, Livingston DM. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell. 1997. 90(3):425-35.

121. Cortez D, Wang Y, Qin J, Elledge SJ. Requirement of ATM-dependent phosphorylation of brcal in the DNA damage response to double-strand breaks. Science. 1999 86(5442): 1162-1166.

122. Bartek J, Lukas J. Mammalian Gl- and S-phase checkpoints in response to DNA damage. Curr Opin Cell Biol. 2001. 13(6):738-47.

123. Kastan MB, Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 2004. 432(7015):316-323.

124. Sung P. Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein. Science. 1994 265(5176):1241-3.

125. Zhong Q, Chen CF, Li S, Chen Y, Wang CC, Xiao J, Chen PL, Sharp ZD, Lee WH. Association of BRCA1 with the hRad50-hMrel l-p95 complex and the DNA damage response. Science. 1999. 285(5428):747-50.

126. Wang Q, Zhang H, Fishel R, Greene MI. BRCA1 and cell signaling. Oncogene. 2000 19(53): 6152-8

127. Razandi M, Pedram A, Rosen EM, Levin ER. BRCA1 inhibits membrane estrogen and growth factor receptor signaling to cell proliferation in breast cancer. Mol Cell Biol. 2004 24(13): 5900-13.

128. Wooster R, Bignell G, Lancaster J, Swift S, Seal S, Mangion J, Collins N, Gregory S, Gumbs C, Micklem G. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature. 1995. 378(6559):789-92

129. Bertwistle D, Swift S, Marston NJ, Jackson LE, Crossland S, Crompton MR, Marshall CJ, Ashworth A. Nuclear location and cell cycle regulation of the BRCA2 protein. Cancer Res. 1997. 57(24):5485-8.

130. Milner J, Ponder B, Hughes-Davies L, Seltmann M, Kouzarides T. Transcriptional activation functions in BRCA2. Nature. 1997. 386(6627): 772-773

131. Fuks F, Milner J, Kouzarides T. BRCA2 associates with acetyltransferase activity when bound to P/CAF. Oncogene. 1998. 17(19):2531-2534.

132. Davies AA, Masson JY, Mcllwraith MJ, Stasiak AZ, Stasiak A, Venkitaraman AR, West SC. Role of BRCA2 in control of the RAD51 recombination and DNA repair protein. Mol Cell. 2001. 7(2):273-82.

133. Yano K, Morotomi K, Saito H, Kato M, Matsuo F, Miki Y. Nuclear localization signals of the BRCA2 protein. Biochem Biophys Res Commun. 2000. 270(1): 171-175.

134. Daniels MJ, Wang Y, Lee M, Venkitaraman AR. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 2004 306(5697):876-879.

135. Matsuoka S, Huang M, Elledge SJ. Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase. Science. 1998. 282(5395): 1893-7.

136. Bartek J, Lukas J. Chkl and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer. Cancer Cell. 2003. 3(5):421-9.

137. Struewing JP, Hartge P, Wacholder S, Baker SM, Berlin M, McAdams M, Timmerman MM, Brody LC, Tucker MA. The risk of cancer associated with specific mutations of BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews. N Engl J Med. 1997.336(20):1401-1408.

138. Roa BB, Boyd AA, Volcik K, Richards CS. Ashkenazi Jewish population frequencies for common mutations in BRCA1 and BRCA2. Nat Genet. 1996. 14(2):185-7.

139. M0ller P, Hagen AI, Apold J, Maehle L, Clark N, Fiane B, L0vslett K, Hovig E, Vab0 A. Genetic epidemiology of BRCA mutations—family history detects less than 50% of the mutation carriers. Eur J Cancer. 2007. 43(11): 1713-7.

140. Heimdal K, Maehle L, Apold J, Pedersen JC, M0ller P. The Norwegian founder mutations in BRCA1: high penetrance confirmed in an incident cancer series and differences observed in the risk of ovarian cancer. Eur J Cancer. 2003. 39(15):2205-13.

141. Pal T, Permuth-Wey J, Holtje T, Sutphen R. BRCA1 and BRCA2 mutations in a study of African American breast cancer patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 13(11 Ptl):1794-9.

142. Tang NL, Pang CP, Yeo W, Choy KW, Lam PK, Suen M, Law LK, King WW, Johnson P, Hjelm M. Prevalence of mutations in the BRCA1 gene among Chinese patients with breast cancer. J Natl Cancer Inst. 1999. 91(10): 882-885.

143. Inoue R, Fukutomi T, Ushijima T, Matsumoto Y, Sugimura T, Nagao M. Germline mutation of BRCA1 in Japanese breast cancer families. Cancer Res. 1995. 55(16):3521-3524.

144. Gayther SA, Harrington P, Russell P, Kharkevich G, Garkavtseva RF, Ponder В A. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia. Am J Hum Genet. 1997. 60(5): 1239-42

145. BRGA1 gene predisposing to breast and ovarian cancers in Upper Silesia population. Acta Biochim Pol. 2002. 49(2):351-356.

146. Gronwald J,.Elsakov P, Gorski B, Lubinski J. High incidence of 4153delA BRCA1 gene mutations in Lithuanian breast- and breast-ovarian cancer families. Breast Cancer Res Treat. 2005. 94(2): 111-113.

147. Szabo CI, King MC. Population genetics of BRCA1 and BRCA2. Am J Hum Genet. 1997 60(5):1013-1020.

148. Struewing JP, Abeliovich D, Peretz T, Avishai N, Kaback MM- Collins FS, Brody LC. The carrier frequency of the BRCA1 185delAG mutation- is approximately 1 percent in , Ashkenazi Jewish individuals. Nat Genet. 1995. 11(2): 198-200:

149. Ciernikova S, Tomka M, Kovac M, Stevurkova- V, Zajac V. Ashkenazi founder BRCA1/BRCA2 mutations in Slovak hereditary breast and/or ovarian cancer families. Neoplasma. 2006 53(2): 97-102;

150. Van Der Looij M, Szabo C, Besznyak I, Liszka G, Csokay B, Pulay T, Toth J, Devilee P, King MC, Olah E. Prevalence of founder BRCA1 and BRGA2 mutations among breast and ovarian,cancer patients in Hungary. Int J Canccr. 2000 86(5):737-40,

151. Papp J, Raicevic L, Milasin J, Dimitrijevic B, Radulovic S, Olah E. Germline mutation' analysis of BRCA1 and BRCA2 genes in Yugoslav breast/ovarian cancer families. Oncol Rep. 1999 6(6): 1435-8.

152. Gorski B, Cybulski C, Huzarski T, Byrski T, Gronwald J, Jakubowska A, Stawicka M, Gozdecka-Grodecka S, Szwiec M, Urbanski K, Mitus J, Marczyk E, Dziuba J, Wandzel

153. P, Surdyka D, Haus О, Janiszewska H, Debniak T, Toloczko-Grabarek A, Medrek K, Masojc B, Mierzejewski M, Kowalska E, Narod SA, Lubinski J. Breast cancer predisposing alleles in Poland. Breast Cancer Res Treat. 2005. 92(1): 19-24.

154. Feki A, Jefford CE, Berardi P, Wu JY, Carrier L, Krause KH, Irminger-Finger I. BARD1 induces apoptosis by catalysing phosphorylation of p53 by DNA-damage response kinase. Oncogene. 2005. 24(23):3726-36.

155. The CHEK2 Breast Cancer Case-Control Consortium, 2004

156. Eccles DM. Hereditary cancer: guidelines in clinical practice. Breast and ovarian cancer genetics. Ann Oncol. 2004;15 Suppl 4:ivl33-138.

157. Brose MS, Rebbeck TR, Calzone KA, Stopfer JE, Nathanson KL, Weber BL. Cancer risk estimates for BRCA1 mutation carriers identified in a risk evaluation program. J Natl Cancer Inst. 2002 94(18): 1365-1372.

158. Kadouri L, Hubert A, Rotenberg Y, Hamburger T, Sagi M, Nechushtan C, Abeliovich D, Peretz T. Cancer risks in carriers of the BRCA1/2 Ashkenazi founder mutations. J Med Genet. 2007 44(7):467-71.

159. Goggins M, Schutte M, Lu J, Moskaluk CA, Weinstein CL, Petersen GM, Yeo CJ, Jackson CE, Lynch HT, Hruban RH, Kern SE. Germline BRCA2 gene mutations in patients with apparently sporadic pancreatic carcinomas. Cancer Res. 1996. 56(23):5360-5364.

160. Tai YC, Domchek S, Parmigiani G, Chen S. Breast cancer risk among male BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. J Natl Cancer Inst. 2007. 99(23): 1811-4.

161. Baysal BE, DeLoia JA, Willett-Brozick JE, Goodman MT, Brady MF, Modugno F, Lynch HT, Conley YP, Watson P, Gallion HH. Analysis of CIIEK2 gene for ovarian cancer susceptibility. Gynecol Oncol. 2004. 95(l):62-69.

162. Hamann U. Hereditary breast cancer: high risk genes, genetic testing and clinical implications. Clin Lab. 2000. 46(9-10): 447-461

163. O.Phillips KA, Andrulis IL, Goodwin PJ. Breast carcinomas arising in carriers of mutations in BRCA1 or BRCA2: are they prognostically different? J Clin Oncol. 1999 17(11): 3653-63.

164. Kennedy RD, Quinn JE, Mullan PB, Johnston PG, Harkin DP. The role of BRCAI in the cellular response to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 2004. 96(22): 1659-1668.

165. Calderon-Margalit R, Paltiel O. Prevention of breast cancer in women who carry BRCAI or BRCA2 mutations: a critical review of the literature. Int J Cancer. 2004. 112(3): 35764.

166. Kirk J, Brennan M, Houssami N, Ung O. An approach to the patient with a family history of breast cancer. Aust Fam Physician. 2006 35(l-2):43-7.

167. Cuzick J. Chemoprevention of breast cancer. Breast Cancer. 2008 15(l):10-6.

168. Zakaria S, Degnim AC. Prophylactic mastectomy. Surg Clin North Am. 2007 87(2):317-331.

169. Moscucci O, Clarke A. Prophylactic oophorectomy: a historical perspective. J Epidemiol Community Health. 2007 61(3): 182-184.

170. Баранов B.C. Баранова E.B. Иващенко Т.Э. Асеев M.B. Геном человека и гены «предрасположенности» (Введение в предиктивную медицину). СПб. Интермедика. 2000. 263с.

171. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э. Научные основы предиктивной медицины. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Новосибирск. Альта Виста. 2003; 3-19.

172. Пузырев В.П. Генетика артериальной гипертензии (современные исследовательские парадигмы). Клиническая медицина. 2003. Н. 1; 12-18.

173. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. М., Реафарм, 2004.

174. Сычев Д.А., Раменская Г.В., Игнатьев И.В., Кукес В.Г. Клиническая фармакогенетика. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007.

175. Середенин С.Б. Лекции по фармакогенетике. М., МИА, 2004.

176. Mancinelli L, Cronin М, Sadee W. Pharmacogenomics: the promise of personalized medicine. AAPS PharmSci. 2000 2(1):E4.

177. Nebert DW, Carvan MJ 3rd. Ecogenetics: from ecology to health. Toxicol Ind Health. 1997 13(2-3): 163-92

178. McGovern DP, Travis SP. Thiopurine therapy: when to start and when to stop. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003 15(3):219-23.

179. Sherer DW, Lebwohl MG. 6-thioguanine in the treatment of psoriasis: a case report and literature review. J Cutan Med Surg. 2002. 6(6):546-550.

180. Seidman EG, Furst DE. Pharmacogenetics for the individualization of treatment of rheumatic disorders using azathioprine. J Rheumatol. 2002. 29(12):2484-7.

181. Kozuch PL, Hanauer SB. Treatment of inflammatory bowel disease: a review of medical therapy. World J Gastroenterol. 2008 14(3):354-77.

182. Taylor AL.The African American Heart Failure Trial: a clinical trial update. Am J Cardiol. 2005. 96(7B):44-8.

183. Plunkett W, Gandhi V. Pharmacology of purine nucleoside analogues. Hematol Cell Ther. 1996. 38 Suppl 2:S67-74.

184. Lennard L.The clinical pharmacology of 6-mercaptopurine. Eur J Clin Pharmacol. 1992 43(4) :329-39.

185. Bostrom B, Erdmann G. Cellular pharmacology of 6-mercaptopurine in acute lymphoblastic leukemia. Am J Pediatr Hematol Oncol. 1993. 15(l):80-86

186. Tidd DM, Paterson AR. A biochemical mechanism for the delayed cytotoxic reaction of 6-mercaptopurine. Cancer Res. 1974 34(4):738-46.

187. Крынецкая Н.Ф., Крынецкий Е.Ю. Мишени антилейкемических агентов: молекулярные механизмы действия меркаптопурина. Мол.биол. 2000. 34(2): 10461053

188. Woodson LC, Ames MM, Selassie CD, Hansch C, Weinshilboum RM. Thiopurine methyltransferase. Aromatic thiol substrates and inhibition by benzoic acid derivatives. Mol Pharmacol. 1983 24(3):471-8.

189. Krynetski EY, Krynetskaia NF, Yanishevski Y, Evans WE. Methylation of mercaptopurine, thioguanine, and their nucleotide metabolites by heterologously expressed human thiopurine S-methyltransferase. Mol Pharmacol. 1995. 47(6):1141-7.

190. Kroplin T, Iven H. Methylation of 6-mercaptopurine and 6-thioguanine by thiopurine S-methyltransferase. A comparison of activity in red blood cell samples of 199 blood donors. Eur J Clin Pharmacol. 2000 56(4):343-5

191. Tay BS, Lilley RM, Murray AW, Atkinson MR. Inhibition of phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Ehrlich ascites-tumour cells by thiopurine nucleotides. Biochem Pharmacol. 1969. 18(4):936-8

192. Evans WE, Horner M, Chu YQ, Kalwinsky D, Roberts WM. Altered mercaptopurine metabolism, toxic effects, and dosage requirement in a thiopurine methyltransferase-deficient child with acute lymphocytic leukemia. J Pediatr. 1991. 119(6):985-9.

193. Lennard L, Van Loon JA, Lilleyman JS, Weinshilboum RM. Thiopurine pharmacogenetics in leukemia: correlation of erythrocyte thiopurine methyltransferase activity and 6-thioguanine nucleotide concentrations. Clin Pharmacol Ther. 1987 41(l):18-25.

194. McLeod HL. Commentary on interactions between 6-mercaptopurine therapy and thiopurine-methyl-transferase (TPMT) activity. Eur J Clin Pharmacol. 1995 48(l):85-8.

195. Coulthard SA, Hogarth LA, Little M, Matheson EC, Redfern CP, Minto L, Hall AG. The effect of thiopurine methyltransferase expression on sensitivity to thiopurine drugs. Mol Pharmacol. 2002 62(1): 102-9.

196. Decaux G, Horsmans Y, Houssiau F, Desager JP. High 6-thioguanine nucleotide levels and low thiopurine methyltransferase activity in patients with lupus erythematosus treated with azathioprine. Am J Ther. 2001 8(3): 147-50.

197. Weinshilboum R. Thiopurine pharmacogenetics: clinical and molecular studies of thiopurine methyltransferase. Drug Metab Dispos. 2001 29(4 Pt 2):601-5.

198. Krynetski EY, Evans WE. Pharmacogenetics as a molecular basis for individualized drug therapy: the thiopurine S-methyltransferase paradigm. Pharm Res. 1999. 16(3):342-349.

199. McLeod HL, Krynetski EY, Relling MV, Evans WE. Genetic polymorphism of thiopurine methyltransferase and its clinical relevance for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2000. 14(4):567-572.

200. Krynetski EY, Tai HL, Yates CR, Fessing MY, Loennechen T, Schuetz JD, Relling MV, Evans WE. Genetic polymorphism of thiopurine S-methyltransferase: clinical importance and molecular mechanisms. Pharmacogenetics. 1996 6(4):279-290.

201. Seki T, Tanaka T, Nakamura Y. Genomic structure and multiple single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the thiopurine S-methyltransferase (TPMT) gene. J Hum Genet. 2000. 45(5):299-302.

202. Weinshilboum RM, Sladek SL. Mercaptopurine pharmacogenetics: monogenic inheritance of erythrocyte thiopurine methyltransferase activity. Am J Hum Genet. 1980. 32(5): 651-62.

203. Schaeffeler E, Eichelbaum M, Reinisch W, Zanger UM, Schwab M. Three novel thiopurine S-methyltransferase allelic variants (TPMT*20, *21, *22) association with decreased enzyme function. Hum Mutat. 2006. 27(9):976.

204. Krynetski EY, Schuetz JD, Galpin AJ, Pui CH, Relling MV, Evans WE. A single point mutation leading to loss of catalytic activity in human thiopurine S-methyltransferase. PNAS. 1995 92(4):949-53.

205. Collie-Duguid ES, Pritchard SC, Powrie RH, Sludden J, Collier DA, Li T, McLeod HL. The frequency and distribution of thiopurine methyltransferase alleles in Caucasian and Asian populations. Pharmacogenetics. 1999. 9(1 ):37-42.

206. Ameyaw MM, Collie-Duguid ES, Powrie RH, Ofori-Adjei D, McLeod HL. Thiopurine methyltransferase alleles in British and Ghanaian populations. Hum Mol Genet. 1999 8(2):367-70.

207. Zhang JP, Guan YY, Wu JH, Xu AL, Zhou S, Huang M. Phenotyping and genotyping study of thiopurine S-methyltransferase in healthy Chinese children: a comparison of Han and Yao ethnic groups. Br J Clin Pharmacol. 2004. 58(2): 163-8.

208. Kumagai K, Hiyama K, Ishioka S, Sato H, Yamanishi Y, McLeod HL, Konishi F, Maeda H, Yamakido M. Allelotype frequency of the thiopurine methyltransferase (TPMT) gene in Japanese. Pharmacogenetics. 2001 11(3):275-8.

209. Hon YY, Fessing MY, Pui CH, Relling MV, Krynetski EY, Evans WE. Polymorphism of the thiopurine S-methyltransferase gene in African-Americans. Hum Mol Genet. 1999. 8(2):371-6.

210. Alves S, Prata MJ, Ferreira F, Amorim A. Screening of thiopurine S-methyltransferase mutations by horizontal conformation-sensitive gel electrophoresis. Hum Mutat. 2000 15(3): 246-53.

211. Белицкий Г.А., Якубовская М.Г. Генетический полиморфизм и вариабельность химического канцерогенеза. Биохимия. 2008. 73(5): 675-689.

212. Pelkonen О., Nebert D.W. Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: etiologic role in carcinogenesis. Pharmacol. Rev. 1982. 34(2): 189-222.

213. Cascorbi I., Brockmoller J., Roots I. A C4887A polymorphism in exon 7 of human CYP1A1: population frequency, mutation linkages, and impact on lung cancer susceptibility. Cancer Res. 1996. 56(21): 4965-4969.

214. Crofts F., Taioli E., Trachman J., Cosma G.N., Currie D., Toniolo P., Garte S.J. Functional significance of different human CYP1A1 genotypes. Carcinogenesis. 1994. 15(12): 2961-2963.

215. Aynacioglu A.S., Cascorbi I., Mrozikiewicz P.M., Roots I. High frequency of CYP1A1 mutations in a Turkish population. Arch. Toxicol. 1998. 72(4): 215-218.

216. Inoue K., Asao Т., Shimada T. Ethnic-related differences in the frequency distribution of genetic polymorphisms in the CYP1A1 and CYP1B1 genes in Japanese and Caucasian populations. Xenobiotica. 2000. 30(3): 285-295.

217. Bartsch H., Nair U., Risch A., Rojas M., Wikman H., Alexandrov K. Genetic polymorphism of CYP genes, alone or in combination, as a risk modifier of tobacco-related cancers. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2000. 9(1): 3-28.

218. Schwarz D., Kisselev P., Cascorbi I., Schunck W.H., Roots I. Differential metabolism of benzoa.pyrene and benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol by human CYP1A1 variants. Carcinogenesis. 2001. 22(3): 453-459.

219. Voso M.T., D'Alo F., Gumiero D., Guidi F., Hohaus S., Leone G. The CYPlAl*2a allele is an independent prognostic factor for acute myeloid leukemia. Haematologica. 2005. 90(7): 982-984.

220. Miners J.O., Birkett D.J. Cytochrome P4502C9: an enzyme of major importance in human drug metabolism. Br. J. Clin. Pharmacol. 1998. 45(6): 525-538.

221. Goldstein J.A. Clinical relevance of genetic polymorphisms in the human CYP2C subfamily. Br. J. Clin. Pharmacol. 2001. 52(4): 349-355.

222. Hooper WD, Pool WF, Woolf TF, Gal J. Stereoselective hydroxylation of tacrine in rats and humans. Drug Metab Dispos. 1994. 22(5): 719-724.

223. Sullivan-Klose Т.Н., Ghanayem B.I., Bell D.A., Zhang Z.Y., Kaminsky L.S., Shenfield G.M., Miners J.O., Birkett D.J., Goldstein J.A. The role of the CYP2C9-Leu359 allelic variant in the tolbutamide polymorphism. Pharmacogenetics. 1996. 6(4): 341-349.

224. Lee C.R., Goldstein J.A., Pieper J.A. Cytochrome P450 2C9 polymorphisms: a comprehensive review of the in-vitro and human data. Pharmacogenetics. 2002. 12(3): 251-263.

225. Aynacioglu A.S., Brockmoller J., Bauer S., Sachse C., Guzelbey P., Ongen Z., Nacak M., Roots I. Frequency of cytochrome P450 CYP2C9 variants in a Turkish population and functional relevance for phenytoin. Br. J. Clin. Pharmacol. 1999. 48(3): 409-415.

226. Kimura M., Ieiri I., Mamiya K., Urae A., Higuchi S. Genetic polymorphism of cytochrome P450s, CYP2C19, and CYP2C9 in a Japanese population. Ther. Drug. Monit. 1998. 20(3): 243-247.

227. Yasar U., Eliasson E., Dahl M.L., Johansson I., Ingelman-Sundberg M., Sjoqvist F. Validation of methods for CYP2C9 genotyping: frequencies of mutant alleles in a Swedish population// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. 254(3): 628-631.

228. Roddam P.L., Rollinson S., Kane E., Roman E., Moorman A., Cartwright R., Morgan G.J. Poor metabolizers at the cytochrome P450 2D6 and 2C19 loci are at increased risk of developing adult acute leukaemia. Pharmacogenetics. 2000. 10(7): 605-615.

229. Bertz R.J., Granneman G.R. Use of in vitro and in vivo data to estimate the likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions. Clin. Pharmacokinet. 1997. 32(3): 210-258.

230. Smith G., Stanley L.A., Sim E., Strange R.C., Wolf C.R. Metabolic polymorphisms and cancer susceptibility. Cancer Surv. 1995. 25: 27-65.

231. Gough A.C., Smith C.A., Howell S.M., Wolf C.R., Bryant S.P., Spurr N.K. Localization of the CYP2D gene locus to human chromosome 22ql3.1 by polymerase chain reaction, in situ hybridization, and linkage analysis. Genomics. 1993. 5(2):430-432.

232. Wolf C.R., Smith G. Cytochrome P450 CYP2D6. IARC Sci. Publ. 1999. 148: 209-229.

233. Gonzalez F.J., Skoda R.C., Kimura S., Umeno M., Zanger U.M., Nebert D.W., Gelboin H.V., Hardwick J.P., Meyer U.A. Characterization of the common genetic defect in humans deficient in debrisoquine metabolism. Nature. 1988. 331(6155): 442-446.

234. Bouchardy C., Benhamou S., Dayer P. The effect of tobacco on lung cancer risk depends on CYP2D6 activity. Cancer Res. 1996. 56(2): 251-253.

235. Hirvonen A., HusgafVel-Pursiainen K., Anttila S., Karjalainen A., Vainio H. Polymorphism in CYP1A1 and CYP2D6 genes: possible association with susceptibility to lung cancer. Environ. Health Perspect. 1993.101(3): 109-112.

236. Li H., Feng L., Xu Y., Yao L., Ouyang Т., Li J., Wang Т., Fan Z., Lin В., Li J., Xie Y. The association of CYP2D6 *10 polymorphism with breast cancer risk and clinico-pathologic characteristics in Chinese women. Acta Oncol. 2006. 45(5): 597-601.

237. Ansell P.J., Espinosa-Nicholas C., Curran E.M., Judy B.M., Philips B.J.,'Hannink M., Lubahn D.B. In vitro and in vivo regulation of antioxidant response element-dependent gene expression by estrogens. Endocrinology. 2004. 145(1): 311-317.

238. Kataoka К., Igarashi К., Itoh К., Fujiwara К.Т., Noda М., Yamamoto М., Nishizawa М. Small Maf proteins heterodimerize with Fos and may act as competitive repressors of the NF-E2 transcription factor. Mol. Cell Biol. 1995. 15(4): 2180-2190.

239. Rushmore Т.Н., Pickett C.B. Glutathione S-transferases, structure, regulation, and therapeutic implications. J. Biol. Chem. 1993. 268(16): 11475-11478.

240. Srivastava S.K., Watkins S.C., Schuetz E., Singh S.V. Role of glutathione conjugate efflux in cellular protection against benzoa.pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide-induced DNA damage. Mol Carcinog. 2002. 33(3): 156-162.

241. Weng M.W., Hsiao Y.M., Chiou H.L., Yang S.F., Hsieh Y.S., Cheng Y.W., Yang C.H., Ко J.L. Alleviation of benzoa.pyrene-diolepoxide-DNA damage in human lung carcinoma by glutathione S-transferase M2. DNA Repair (Amst). 2005. 4(4): 493-502.

242. Anuradha D., Reddy K.V., Kumar T.C., Neeraja S., Reddy P.R., Reddanna P. Purification and characterization of rat testicular glutathione S-transferases: role in the synthesis of eicosanoids. Asian J. Androl. 2000. 2(4): 277-282.

243. Chang M., Burgess J.R., Scholz R.W., Reddy C.C. The induction of specific rat liver glutathione S-transferase subunits under inadequate selenium nutrition causes an increase in prostaglandin F2 alpha formation. J. Biol. Chem. 1990. 265(10): 5418-5423.

244. Guji A., Nishiya H., Aoki M., Ohyatsu I., Yamaguchi M., Tokumura Y., Sugiyama H., Miyashita Т., Ono Y., Kunii O. Glutathione S-transferases as a cefpiramide binding protein in rat liver. Pharmacol. Toxicol. 1995. 76(3): 212-217.

245. Pemble S., Schroeder K.R., Spencer S.R., Meyer D.J., Hallier E., Bolt H.M., Ketterer В., Taylor J.B. Human glutathione S-transferase theta (GSTT1): cDNA cloning and the characterization of a genetic polymorphism. Biochem. J. 1994. 300 (Pt 1): 271-276.

246. Webb G., Vaska V., Coggan M., Board P. Chromosomal localization of the gene for the human theta class glutathione transferase (GSTT1). Genomics. 1996. 33(1): P. 121-123.

247. Вавилин B.A., Часовникова О.Б., Ляхович B.B., Гавалов С.М., Рябова О.А. Генетический полиморфизм глутатион-Б-трансферазы Ml и Т1 у детей, больных бронхиальной астмой. Вопросы медицинской химии. 2000. 46(4): 388-397.

248. Guo S.W. Glutathione S-transferases Ml/Tl gene polymorphisms and endometriosis: a meta-analysis of genetic association studies. Mol. Hum. Reprod. 2005. 11(10): 729-743.

249. Sharma A., Mishra A., Das B.C., Sardana S., Sharma J.K. Genetic polymorphism at GSTM1 and GSTT1 gene loci and susceptibility to oral cancer. Neoplasma. 2006. 53(4):. 309-315.

250. Balta G., Yuksek N., Ozyurek E., Ertem U., Hicsonmez G., Altay C., Gurgey A. Characterization of MTHFR, GSTM1, GSTT1, GSTP1, and CYP1A1 genotypes in childhood acute leukemia. Am. J. Hematol. 2003. 73(3): 154-160.

251. D'Alo F., Yoso M.T., Guidi F., Massini G., Scardocci A., Sica S., Pagano L., Hohaus S., Leone G. Polymorphisms of CYP1A1 and glutathione S-transferase and susceptibility to adult acute myeloid leukemia. Haematologica. 2004. 89(6): 664-670.

252. Hohaus S., Massini G., D'Alo F., Guidi F., Putzulu R., Scardocci A., Rabi A., Di Febo A.L., Yoso M.T., Leone G. Association between glutathione S-transferase genotypes and Hodgkin's lymphoma risk and prognosis. Clin. Cancer Res. 2003.9(9): 3435-3540.

253. Kerridge I., Lincz L., Scorgie F., Hickey D., Granter N., Spencer A. Association between xenobiotic gene polymorphisms and non-Hodgkin's lymphoma risk. Br. J. Haematol. 2002. 118(2): 477-481.

254. Wu M.S., Shun C.T., Huang S.P., Cheng A.L., Chen L.T., Lin J.T. Effect of interleukin-lbeta and glutathione S-transferase genotypes on the development of gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma. Haematologica. 2004. 89(8): 1015-1017.

255. Yuille M., Condie A., Hudson C., Kote-Jarai Z., Stone E., Eeles R., Matutes E., Catovsky D., Houlston R. Relationship between glutathione S-transferase Ml, Tl, and PI polymorphisms and chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2002. 99: 4216-4218.

256. Pearson W.R., Vorachek W.R., Xu S.J., Berger R., Hart I., Vannais D., Patterson D. Identification of class-mu glutathione transferase genes GSTM1-GSTM5 on human chromosome lpl3. Am. J. Hum. Genet. 1993. 53(1): 220-233.

257. Seidegard J., Vorachek W.R., Pero R.W., Pearson W.R. Hereditary differences in the expression of the human glutathione transferase active on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. 85(19): 7293-7297.

258. Cho H.J., Lee S.Y., Ki C.S., Kim J.W. GSTM1, GSTT1 and GSTP1 polymorphisms in the Korean population. J. Korean Med. Sci. 2005. 20(6): 1089-1092.

259. Rebbeck T.R. Molecular epidemiology of the human glutathione S-transferase genotypes GSTM1 and GSTT1 in cancer susceptibility. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1997. 6:733-743

260. Harada S., Abei M., Tanaka N., Agarwal D.P., Goedde H.W. Liver glutathione S-transferase polymorphism in Japanese and its pharmacogenetic importance. Hum. Genet. 1987. 75(4): 322-325.

261. Zhong S., Wyllie A.H., Barnes D., Wolf C.R., Spurr N.K. Relationship between the GSTM1 genetic polymorphism and susceptibility to bladder, breast and colon cancer. Carcinogenesis. 1993. 14(9): 1821-1824.

262. Kietthubthew S., Sriplung H., Au W.W. Genetic and environmental interactions on oral cancer in Southern Thailand. Environ. Mol. Mutagen. 2001. 37(2): 111-116.

263. Hong Y.J., Lee J.K., Lee G. H., Hong S.I. Influence of glutathione S-transferase Ml and T1 genotypes on larynx cancer risk among Korean smokers. Clin. Chem. Lab. Med. 2000.38(9): 917-919.

264. Bonner M.R., Bennett W.P., Xiong W., Lan Q., Brownson R.C., Harris C.C., Field R.W., Lubin J.H., Alavanja M.C. Radon, secondhand smoke, glutathione-S-transferase Ml and lung cancer among women. Int. J. Cancer. 2006. 119(6): 1462-1467.

265. Pompeo F., Brooke E., Kawamura A., Mushtaq A., Sim E. The pharmacogenetics of NAT: structural aspects. Pharmacogenomics. 2002. 3(1): 19-30.

266. Evans D.A., Manley K.A., McKusick V.A. Genetic control of isoniazid metabolism in man. Br. Med. J. 1960. 2(5197): 485-491.

267. Blum M., Grant D.M., McBride W., Heim M., Meyer U.A. Human arylamine N-acetyltransferase genes: isolation, chromosomal localization, and functional expression. DNA Cell Biol. 1990. 9(3): 193-203.

268. Hickman D., Risch A., Buckle V., Spurr N.K., Jeremiah S.J., McCarthy A., Sim E. Chromosomal localization of human genes for arylamine N-acetyltransferase. Biochem. J. 1994. 297 (Pt3): 441-445.

269. Никишина M.B., Макарова С.И., Акишев А.Г., Вавилин В.А., Дегтярев С.Х., Ляхович В.В. Рестрикционный анализ гена N-ацетилтрансферазы (NAT2) у европеоидов Западной Сибири. Генетика. 2004. 40(11): 1557-1561.

270. Meyer U.A., Zanger U.M. Molecular mechanisms of genetic polymorphisms of drug metabolism. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997. 37: 269-296.

271. Leff M.A., Fretland A.J., Doll M.A., Hein D.W. Novel human N-acetyltransferase 2 alleles that differ in mechanism for slow acetylator phenotype. J. Biol. Chem. 1999. 274(49): 34519-34522.

272. Sillanpaa P., Hirvonen A., Kataja V., Eskelinen M., Kosma V.M., Uusitupa M., Vainio H., Mitrunen K. NAT2 slow acetylator genotype as an important modifier of breast cancer risk. Int. J. Cancer. 2005. 114(4): 579-584.

273. Имянитов E.H., К.П. Хансон. Эпидемиология и биология рака мочевого пузыря. Практическая онкология. 2003. 4(4): 191-195.

274. William В.М., Abdel-tawab А.М., Hassan Е.А., Mohamed O.F. Acetylator phenotyping in patients with malignant lymphomas, using caffeine as the metabolic probe. Pol. J. Pharmacol. 2004. 56: 445-449.

275. Hein D.W. Molecular genetics and function of NAT1 and NAT2: role in aromatic amine metabolism and carcinogenesis. Mutat. Res. 2002. 506-507: 65-77.

276. Calvert H. An overview of folate metabolism: features relevant to the action and toxicities of antifolate anticancer agents. Semin. Oncol. 1999. 26(2 SuppI 6): 3-10.

277. Franco R.F., Simoes B.P., Tone L.G., Gabellini S.M., Zago M.A., Falcao R.P. The methylenetetrahydrofolate reductase C677T gene polymorphism decreases the risk of childhood acute lymphocytic leukaemia. Br. J. Haematol. 2001. 115(3): 616-618.

278. Goyette P., Christensen В., Rosenblatt D.S., Rozen R. Severe and mild mutations in cis for the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, and description of five novel mutations in MTHFR. Am. J. Hum. Genet. 1996. 59(6): 1268-1275.

279. Martin Y.N., Salavaggione O.E., Eckloff B.W., Wieben E.D., Schaid D.J., Weinshilboum R.M. Human methylenetetrahydrofolate reductase pharmacogenomics: gene resequencing and functional genomics // Pharmacogenet. Genomics. 2006. V. 16(4). P. 265-277.

280. Chen J., Giovannucci E., Kelsey K., Rimm E.B., Stampfer M.J., Colditz G.A., Spiegelman D., Willett W.C., Hunter D.J. A methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and the risk of colorectal cancer. Cancer Res. 1996. 56(21): 4862-4864.

281. Curtin K., Bigler J., Slattery M.L., Caan В., Potter J.D., Ulrich C.M. MTHFR C677T and A1298C polymorphisms: diet, estrogen, and risk of colon cancer. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2004. 13(2): 285-292.

282. Krajinovic M., Lamothe S., Labuda D., Lemieux-Blanchard E., Theoret Y., Moghrabi A., Sinnett D. Role of MTHFR genetic polymorphisms in the susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2004. 103(1). 252-257.

283. Fenech M., Ferguson L. Vitamins/minerals and genomic stability in humans. Mutat. Res, 2001.475: 1-6.

284. Майорова O.A., Нетребенко O.K., Шумилов П.В. Влияние полиморфных вариантов ферментных систем на развитие онкологических процессов (нутрициологические аспекты). Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2003. 2(1): 45-48.

285. Goldin LR, Landgren О, McMaster ML, Gridley G, Hemminki K, Li X, Mellemkjaer L, Olsen JH, Linet MS. Familial aggregation and heterogeneity of non-Hodgkin lymphoma in population-based samples. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005. 14: 2402-2406.

286. Chang ET, Smedby KE, Hjalgrim H, Porwit-MacDonald A, Roos G, Glimelius B, Adami HO. Family history of hematopoietic malignancy and risk of lymphoma. J Natl Cancer Inst. 2005. 97:1466-1474.

287. Skibola CF, Curry JD, Nieters A. Genetic susceptibility to lymphoma. Haematologica. 2007. 92(7):960-969.

288. Goldin LR, Pfeiffer RM, Li X, Hemminki K. Familial risk of lymphoproliferative tumors in families of patients with chronic lymphocytic leukemia: results from the Swedish Family-Cancer Database. Blood 2004. 104:1850-1854.

289. Skibola CF, Forrest MS, Coppede F, Agana L, Hubbard A, Smith MT, Bracci PM, Holly EA. Polymorphisms and haplotypes in folate-metabolizing genes and risk of non-Hodgkin lymphoma. Blood. 2004. 104(7):2155-2162.

290. Lemos MC, Cabrita FJ, Silva HA, Vivan M, Placido F, Regateiro FJ. Genetic polymorphism of CYP2D6, GSTM1 and NAT2 and susceptibility to haematological neoplasias. Carcinogenesis. 1999. 20(7): 1225-1229.

291. Sarmanova J, Benesova K, Gut I, Nedelcheva-Kristensen V, Tynkova L, Soucek P. Genetic polymorphisms of biotransformation enzymes in patients with Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphomas. Hum Mol Genet. 2001. 10(12): 1265-73.

292. Kerridge I, Lincz L, Scorgie F, Hickey D, Granter N, Spencer A. Association between xenobiotic gene polymorphisms and non-Hodgkin's lymphoma risk. Br J Haematol. 2002. 118(2):477-481.

293. Chiu ВС, Kolar C, Gapstur SM, Lawson T, Anderson JR, Weisenburger DD. Association of NAT and GST polymorphisms with non-Hodgkin's lymphoma: a population-based case-control study. Br J Haematol. 2005. 128(5):610-615.

294. Hohaus S, Massini G, D'Alo' F, Guidi F, Putzulu R, Scardocci A, Rabi A, Di Febo AL, Voso MT, Leone G. Association between glutathione S-transferase genotypes and Hodgkin's lymphoma risk and prognosis. Clin Cancer Res. 2003. 9(9):3435-3440.

295. Tsabouri S, Georgiou I, Katsaraki A, Bourantas KL. Glutathione sulfur transferase Ml and T1 genotypes in chronic lymphoblastic leukemia. Hematol J. 2004; 5(6):500-4.

296. Aydin-Sayitoglu M, Hatirnaz O, Erensoy N, Ozbek U. Role of CYP2D6, CYP1A1, CYP2E1, GSTT1, and GSTM1 genes in the susceptibility to acute leukemias. Am J Hematol. 2006. 81(3):162-170.

297. Balta G, Yuksek N, Ozyurek E, Ertem U, Hicsonmez G, Altay C, Gurgey A. Characterization of MTHFR, GSTM1, GSTT1, GSTP1, and CYP1A1 genotypes in childhood acute leukemia. Am J Hematol. 2003. 73(3): 154-160.

298. Krajinovic M, Labuda D, Richer C, Karimi S, Sinnett D. Susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia: influence of CYP1A1, CYP2D6, GSTM1, and GSTT1 genetic polymorphisms. Blood 1999. 93:1496-1501.

299. Pakakasama S, Mukda E, Sasanakul W, Kadegasem P, Udomsubpayakul U, Thithapandha A, Hongeng S. Polymorphisms of drug-metabolizing enzymes and risk of childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Hematol. 2005. 79(3):202-205.

300. Joseph T, Kusumakumary P, Chacko P, Abraham A, Radhakrishna Pillai M. Genetic polymorphism of CYP1A1, CYP2D6, GSTM1 and GSTT1 and susceptibility to acute lymphoblastic leukaemia in Indian children. Pediatr Blood Cancer. 2004. 43(5):560-567.

301. Пузырев В.П. Генетика артериальной гипертензии (современные исследовательские парадигмы). Клиническая медицина. 2003. Н. 1. Стр. 12-18.

302. Александров А.А. Повышенное артериальное давление в детском и подростковом возрасте (ювенильная артериальная гипертония). РМЖ. 1997. 9: 559-565.

303. Cheng S., Grow М.А., Pallaud С., Klitz W., Erlich H.A., Visvikis S., Chen J.J., Pullinger C.R., Malloy M.J., Siest G., Kane J.P. A multilocus genotyping assay for candidate markers of cardiovascular disease risk. Genome. Res. 1999. 9(10):. 936-949.

304. Брязгунов И.П. Первичная артериальная гипертензия у детей и подростков. Вопросы современной педиатрии. 2003. 2(3): 68-71.

305. Lifton R.P., Gharavi A.G., Geller D.S. Molecular mechanisms of human hypertension. Cell. 2001. 104(4): 545-556.399.0'Shaughnessy K.M. The genetics of essential hypertension. Br. J. Clin. Pharmacol. 2001. 51(1). P. 5-11.

306. Naber C.K., Siffert W., Erbel R., Heusch G. Genetics of human coronary vasomotion. Arch. Mai. Coeur. Vaiss. 2004. 97(3): 255-260.

307. Naber C.K., Siffert W. Genetics of human arterial hypertension. Minerva. Med. 2004. 95(5): 347-356.

308. Dufour C., Casane D., Denton D., Wickings J., Corvol P., Jeunemaitre X. Human-chimpanzee DNA sequence variation in the four major genes of the renin angiotensin system. Genomics. 2000. 69(1):. 14-26.

309. Rupert J.L., Kidd K.K., Norman L.E., Monsalve M.V., Hochachka P.W., Devine D.V. Genetic polymorphisms in the Renin-Angiotensin system in high-altitude and low-altitude Native American populations. Ann. Hum. Genet. 2003. 67(Pt 1): 17-25.

310. Frossard P.M., Lestringant G.G., Elshahat Y.I., John A., Obineche E.N. An Mbol two-allele polymorphism may implicate the human renin gene in primary hypertension. Hypertens. Res. 1998. 21(3): 221-225.

311. Frossard P.M., Lestringant G.G., Malloy M.J., Kane J.P. Human renin gene Bgll dimorphism associated with hypertension in two independent populations. Clin. Genet. 1999. 56(6): 428-433.

312. Procopciuc L., Popescu T„ Jebeleanu G., Pop D., Zdrenghea D. Essential arterial hypertension and polymorphism of angiotensinogen M235T gene. J. Cell. Mol. Med.2002. 6(2): 245-250.

313. Tsai C.T., Fallin D., Chiang F.T., Hwang J.J., Lai L.P., Hsu K.L., Tseng C.D., Liau C.S., Tseng Y.Z. Angiotensinogen gene haplotype and hypertension: interaction with ACE gene I allele. Hypertension. 2003. 41(1): P. 9-15.

314. Mondry A., Loh M., Liu P., Zhu A.L., Nagel M. Polymorphisms of the insertion / deletion ACE and M235T AGT genes and hypertension: surprising new findings and meta-analysis of data. BMC. Nephrol. 2005. 6(1): P. 1-10.

315. Benetos A., Safar M.E. Aortic collagen, aortic stiffness, and ATI receptors in experimental and human hypertension. Can. J. Physiol. Pharmacol. 1996. 74(7):862-866.

316. Jin J.J., Nakura J., Wu Z., Yamamoto M., Abe M., Chen Y., Tabara Y., Yamamoto Y., Igase M., Во X., Kohara K., Miki T. Association of angiotensin II type 2 receptor gene variant with hypertension. Hypertens. Res. 2003. 26(7): 547-552.

317. Williams A.G., Dhamrait S.S., Wootton P.T., Day S.H., Hawe E., Payne J.R., Myerson S.G., World M., Budgett R., Humphries S.E., Montgomery H.E. Bradykinin receptor gene variant and human physical performance. J. Appl. Physiol. 2004. 96(3): 938-942.

318. Heux S., Morin F„ Lea R.A., Ovcaric M., Tajouri L., Griffiths L.R. The methylentetrahydrofolate reductase gene variant (C677T) as a risk factor for essential hypertension in Caucasians. Hypertens. Res. 2004. 27(9): 663-667.

319. Jeffreys AJ., Wilson V., Thein S.L. Individual-specific "fingerprints" of human DNA. Nature. 1985.316:76

320. Gill P., Jeffreys AJ., Werrett D.J. Forensic application of DNA "Fingerprints". Nature. 1985. 318.: 577.

321. Иванов П.Л. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфозма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства. Суд. Мед. Эксп. 1999.4: 35-41.

322. Carey L., Mitnik L. Trends in DNA forensic analysis. Electrophoresis. 2002. 23:13861397.

323. Walsh SJ. Recent advances in forensic genetics. Expert Rev Mol Diagn. 2004. 4(1): 3140.

324. Frudakis T, Thomas M, Gaskin Z, Venkateswarlu K, Chandra KS, Ginjupalli S, Gunturi S, Natrajan S, Ponnuswamy V, Ponnuswamy K. Sequences associated with human iris pigmentation. Genetics. 2003.165(4): 2071-2083.

325. Frudakis T, Venkateswarlu K, Thomas M, Gaskin Z, Ginjupalli S, Gunturi S, Ponnuswamy V, Natarajan S, Nachimuthu P. A classifier for the SNP-based inference of ancestry. J Forensic Sci. 2003. 48(4):771-782.

326. Gill P. An assessment of the utility of single nucleotide polymorphisms (SNPs) for forensic purposes. Int J Legal Med. 2001. 114: 204-210.

327. Griffin TJ, Smith LM. Genetic identification by mass spectrometric analysis of single-nucleotide polymorphisms: ternary encoding of genotypes. Anal Chem. 2000. 72(14):. 3298-3302.

328. Ye J, Parra EJ, Sosnoski DM, Hiester K, Underbill PA, Shriver MD. Melting curve SNP (McSNP) genotyping: a useful approach for diallelic genotyping in forensic science. J Forensic Sci. 2002. 47(3): 593-600.

329. Rajalingam R., Ge P., Reed E.F. A sequencing-Based Typing Method for HLA-DQA1 Alleles. Human Immunology. 2004. 65: 373-379.

330. Seltsam A., Hallensleben M., Kollmann A., Blasczyk R. Tne nature of diversity and diversification at the ABO locus. Blood. 2003. 102: 3035-3042.

331. Yip SP. Single-tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common ABOalleles and readily identifies new alleles. Blood. 2000. 95: 1487-1492.

332. Yamamoto F., Clausen H., White Т., Marken J., Hakamori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group system. Nature. 1990. 345: 229-233.

333. Moradian-01dak J, Bouropoulos N, Wang L, Gharakhanian N. Analysis of self-assembly and apatite binding properties of amelogenin proteins lacking the hydrophilic C-terminal. Matrix Biol. 2002. 21(2): 197-205.

334. Akane A, Shiono H, Matsubara K, Nakahori Y, Seki S, Nagafuchi S, Yamada M, Nakagome Y. Sex identification of forensic specimens by polymerase chain reaction (PCR): two alternative methods. Forensic Sci Int. 1991. 49(1): 81-88.

335. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal.Biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.

336. Sambrook J., Fritsch EP., Maniatis. Molecular cloning: a Laboratory Coldspring Harbour Lab. Coldspring Harbour. NY. 1989.

337. Chudinov A.V., Kuznetsova V.E., Barsky V.E., Zasedatelev A.S. Indocyanine dyes and the derivatives thereof for analyzing biological micromolecules, заявка WO 2008/127139 Al.

338. Сидорова Ю.В. Т-клеточная клональность в диагностике лимфопролиферативных заболеваний. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2004., Москва.

339. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. Construction of a Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorohisms. Am J Hum Genet. 1980. 32: 314-331.

340. Brenner C, Morris J. Paternity index calculations in single locus hypervariable DNA probes: validation and other studies // In Proceedings for the International Symposium on Human Identification 1989.P. 21-53.

341. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTIC А // Москва. Издательство Медиа Сфера. 2003.

342. Thirman М., Levitan D., Kobayashi Н., Simon М., Rowley J. Cloning of ELL, a gene that fuses to MLL in a t(l I;19)(q23;pl3.1) in acute myeloid leukemia. PNAS. 1994. 91:.12110-12114.

343. Pihan G. Detection of gene fusions in acute leukemia using bead microarrays. Curr Protoc Cytom 2006 Feb; Chapter 13: Unit 13.7

344. Chun SM, Kim YL, Choi HB, Oh YT, Kim YJ, Lee S, Kim TG, Yang EG, Park YK, Kim DW, Han BD. Identification of leukemia specific fusion gene transcripts with a novel oligonucleotide array. Mol Diagn Ther 2007. 11 (1): 21-8.

345. Cascorbi I., Brockmoller J., Mrozikiewicz P.M., Bauer S., Loddenkemper R., Roots I. 1996. Homozygous rapid arylamine N-acetyltransferase (NAT2) genotype as a susceptibility factor for lung cancer. Cancer Res. 56, 3961-3966.

346. Gil J.P., Lechner M.C. 1998. Increased frequency of wild-type arylamine-N-acetyltransferase allele NAT2*4 homozygotes in Portuguese patients with colorectal cancer. Carcinogenesis. 19, 37-41.

347. Guo S.X., Taki Т., Ohnishi H., Piao H.Y., Tabuchi K., Bessho F., Hanada R., Yanagisawa M., Hayashi Y. 2000. Hypermethylation of pl6 and pl5 genes and RB protein expression in acute leukemia. Leuk. Res. 24, 39-46.

348. Papageorgiou G., Iliadis S., Botsoglou N., Dioudis C., Goulas A., Fletouris D., Dimitriadou-Vafiadou A. Lipid peroxidation of rat myocardial tissue following daunomycin administration. Toxicology. 1998. 126(2): 83-91.

349. Посвящаю свой труд светлой памяти Александры Алексеевны Прокофьевой-Бельговской, чьи взгляды и научные интересы оказали глубокое влияние на мое мировоззрение.

350. С особой признательностью и благодарностью хочется вспомнить Андрея Дариевича Мирзабекова, без которого эта работа никогда бы не состоялась.

351. Выражаю благодарность заведующему лабораторией биологических микрочипов, доктору физико-математических наук, профессору Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и участие в работе.

352. Благодарю всех сотрудников группы анализа мутаций в геноме человека, принимавших участие в работе: к.м.н. B.C. Жаринова, к.м.н. Е.А.Исаеву, к.б.н. Д.О.Фесенко, к.б.н. О.Н.Митяеву, к.б.н. О.А.Гра, к.б.н. Ж.М.Кожекбаеву, к.б.н.

353. A.С.Глотова, к.б.н. О.Е.Громыко, к.б.н. Н.А. Гусеву. Выражаю благодарность

Информация о работе

Наседкина, Татьяна Васильевна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биологических микрочипов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы