Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энзиматические способы детекции, идентификации и анализа нуклеиновых кислот на микрочипах гель-иммобилизованных олигонуклеотидов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубилей, Светлана Алексеевна, Москва

61' 99".....Ь Н ■ * - т<

' Российская Академия Наук

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта.

на правах рукописи

Дубилей Светлана Алексеевна

Энзиматические способы детекции, идентификации и анализа нуклеиновых кислот на микрочипах гель-иммобилизованных олигонуклеотидов

Специальность - 03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители д.х.н., проф., акад. А.Д.Мирзабеков

к. х. н. В.В.Шик

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Используемые сокращения...........................................................................................4

Введение...........................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы...........................................................................................6

1.1 Определение перинной структуры нуклеиновых кислот гибридизацией с микрочипом....................................................................................................................6

1.1.1 Секвенирование гибридизацией: методы и возможности. 6

1.1.2 Методы производства микрочипов. 10

1.1.3 Специфичность гибридизации. 14 2. Применение микрочипов в биологических исследованиях..................................18

1.2.1 Изучение экспресии и обнаружение новых генов. 18

1.2.2 Детекция мутаций и исследование полиморфизма. 20

1.2.3 Картирование генов и упорядочивание библиотек. 22 1.3 Минисеквенирование............................................................................................22

Глава 2. Материалы и Методы....................................................................................26

2.1 Использованные приборы и реактивы................................................................26

2.2 Синтез и очистка олигонуклеотидов....................................................................28

2.3 Приготовление олигонуклеотидных микрочипов................................................28

2.3.1 Приготовление микроматриц. 28

2.3.2 Иммобилизация олигонуклеотидов. 29

2.4 Детекция и обработка флуоресцентного сигнала...............................................30

2.5 Получение ДНК...................................................................................................... 31

2.5.1 Полимеразная Цепная Реакция. 31

2.5.2 Фосфорилирование олигодезоксинуклеотидов. 32

2.5.3 Фрагментирование ДНК. 33

2.5.4 Последовательное лигирование гель - иммобилизованных олигонуклеотидов.

.................................................•....................................................................................; 34

2.6 Минисеквенирование на олигонуклеотидных микрочипах.................................35

2.6.1 Анализ ДНК методом 3' концевых мисматчей. 35

2.6.2 Анализ ДНК методом прилегающих праймеров. 36

Глава 3. Результаты.....................................................................................................37

3.1 Последовательное лигирование на микрочипе гель-иммобилизованных олигонуклеотидов........................................................................................................37

3.1.1 Определение длины тетрануклеотидного повтора. 40

3.2 Минисеквенирование на олигонуклеотидных микрочипах.................................42

3.2.1 Оптимизация условий реакции. 44

3.2.2 Детекция генов токсинов Bacillus anthracis. . 51

3.2.3 Диагностика ß-талассемии. 52

3.2.4 Аллотипирование HLA DQA1. 58

Глава 4. Обсуждение результатов.............................................................................62

Выводы...........................................................................................................................68

Благодарности...............................................................................................................69

Список литературы.......................................................................................................70

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

dNTP дезоксинуклеотидтрифосфаты

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

TEMED М.Ы.М.Ы-тетраметилэтилендиамин

ПЦР/PCR полимеразная цепная реакция

нт. нуклеотидов

п.н. пар нуклеотидов

т.п.н. тысяч пар нуклеотидов

Тт температура плавления

FL/FAM флуоресцеин

TMR тетраметилродамин

TR техасский красный

AU/y.e. условные еденицы

ВВЕДЕНИЕ.

Успехи в разработке твердофазного синтеза олигонуклеотидов и методов гибридизации к концу 80-х годов заложили фундамент для возникновения принципиально новой технологии, основанной на использовании матриц иммобилизованных олигонуклеотидов. Объединение большого числа олигонуклеотидных проб на сравнительно небольшой поверхности матрицы (микрочипа) значительно расширило круг решаемых задач по исследованию первичной структуры нуклеиновых кислот. Благодаря олигонуклетидным чипам стали возможными параллельные манипуляции с тысячами проб нуклеиновых кислот. На сегоднешний день сфера применения микрочипов влючает картирование генома, скрининг клонов, упорядочивание библиотек клонов, детекцию специфических нуклеиновых кислот в сложной смеси (исследование экспрессии различних генов, диагностика вирусных и бактериальных инфекций), определение одиночных замен в последовательности (типирование генов, исследование полиморфизма генов, диагностика генетических заболеваний) и секвенирование.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Определение перичной структуры нуклеиновых кислот гибридизацией с микрочипом.

1.1.1 Секвенирование гибридизацией: методы и возможности.

Концепция секвкенирования гибридизацией появилась в конце 80-х (Bains and Smith, 1998; Dramaniac et al., 1989; Khrapko et al., 1989; Southern, 1989). Идея состоит в определении списка всех подпоследовательностей длины L присутствующих в анализируемой последовательности ДНК и последующей реконструкции последовательности путем упорядочивния этих подпоследовательностей по перекрыванию L-1. Список подпоследовательностей присутствующих в ДНК определялся гибридизацией с олигонуклеотидами. Длина олигнуклеотидных зондов предполагаемых для секвенирования составляет 8 нт., что является компромисом

о

между количеством необходимых олигонуклеотидов (4 =65 536 октамера) и длиной секвенируемого фрагмента.

Очевидно, существует два формата для получения гибридизационных данных: секвенируемая проба иммобилизуется на твердую подложку и последовательно гибридизуется с олигонуклеотидными зондами (дот-блот формат, Dramanac et et, 1989; Craig et al., 1990), либо на твердую подложку иммобилизуются олигонукпеотиды, затем проводится гибридизация с одной пробой (обратный дот-блот формат, Bains and Smith, 1988; Khrapko et al, 1989; Southern, 1989, Pease et al., 1994).

Первый, дот-блот формат оправдан только когда необходимо одновременно анализировать десятки тысяч проб ДНК. В противном случае для получения

сравнительно небольшого объема информации приходится затрачивать огромные усилия проводя большое количество гибридизаций. Поэтому такой формат предполагается использовать только для исследования геномов, картирования и упорядочиваня библиотек, иными словами только в очень крупномасштабных проектах (Miloslavljevic et al, 1996; Pharmaceutical Buisiness News, 1996). Реверс дот-блот формат болеше подходит для диагностики, детекции полиморфизма и, в особенности, для поиска неизвестных мутаций. В дальнейшем рассотрении мы обратим больше внимания этому формату. Таким образом, микрочип состоит из набора индивидуальных нуклеиновых кислот ковалентно связанных с твердой подложкой, образуя регулярный паттерн известной топологии. Секвенирующий (=универсальный) микрочип содержит набор всех возможных п-меров и, в первую очередь, используется для гибридизации с неизвестной последовательностью. На диагностическом микрочипе иммобилизован набор олигонуклеотидов специфичных для конкретной последовательности ДНК. Проба ДНК (РНК) фрагментируется (для уменьшения вероятности образования вторичной структуры, что интерферирует с гибридизацие на чипе), метится какой-либо репортерной молекулой и гибридизуется с микрочипом. В идеале ДНК гибридизуется только с теми олигонуклеотидами, которые полностью ей комплиментарны. Теоретически можно представить количественную гибридизацию, когда по результатам анализа гибридизационного паттерна можна будет составить список подпоследовательностей включающий также частоту их встречаемости в анализируемой последовательности (Bains and Smith, 1988). К сожалению, на сегодняшний день экспериментальные данные все еще далеки от такого идеала (см. ниже).

Как следует из вышесказанного, при реконструкции последовательности возникают неоднозначности, если подпоследовательность длиной более L-1 встречается

больше одного раза в исследуемой последовательности. Каждый такой повтор является точкой ветвления в процессе реконструкции, так как несколько последовательностей могут иметь одинаковый список подпоследовательностей. Эта проблема является самым существенным ограничивающим фактором для секвенирования de novo (Pevzher et al, 1991). На секвенирующем чипе октамеров однозначно можно реконструировать 94%, 32%, 0,9% фрагментов ДНК случайной последовательноси длиной соответственно 50, 200, 400 нт. (Chetverin and Kramer, 1994). Ситуация еще хуже с природной ДНК, так как она обычно содержит больше повторов. Компьютерная симуляция показывает, что разрешаемая длина для секвенирования на чипах может быть увеличена в четыре раза, если о фрагменте имеется дополнительная информация - например, последовательность концов, примерная длина фрагмента, или количество копий каждого д?-мера в последовательности (Pevsner; 1989; Bains, 1991). Интенсивность гибридизационного сигнала зависит от множества факторов, в частности GC-состава, вторичной структуры ДНК, окружающей последовательности (Southern et al., 1992\ Drmanacetal, 1993), так что восстановить количество встречаемости каждого фрагмента по гибридизационному паттерну не представляется возможным.

1.1.1. а. Дополнительная гибридизация встык и лигирование.

В работе {Pieters et al., 1989) было показано, что два пригибридизованных встык гексамерама формируют стабильный дуплекс. Анализ полученных дуплексов с помощью ядерного магнитного резонанса показал их соответствие В-форме ДНК с незначительными отклонениями в области концевых нуклеотидов. Стабилизация происходит за счет стекинг-взаимодействия соседних оснований из разных гексамеров. Таким образом, без дополнительных существенных затрат на синтез, иммобилизованные олигонуклеотиды можно удлиннить за счет гибридизации встык

кортоткого олигонуклеотида, который не образует самостоятельно стабильный дуплекс с ДНК (КИгарко е? а/., 1989). Так, дополнительной гибридизацией встык (ДГВ) пентамера на секвенирующем октамерном микрочипе генерируется частичная матрица 13-меров без существенного увеличения сложности микрочипа (удлиняется только часть иммобилизованных олигонукпеотидов, которые уже образовали дуплекс). Как было показано (Parinov et а!., 1996), гибридизация двух пентамеров встык также возможна. Однако, три пентамера расположенные встык самостоятельно образуют достаточно стабильный дуплекс. Таким образом, два раунда ДГВ позволяют получить частичный микрочип 18-меров. Библиотеку пентамеров составляет 1024 олигонуклеотида. Очевидно, что проводить такое количество дополнительных гибридизаций не очень веселое занятие. Однако, количество гибридизаций может быть существенно снижено при использовании в пентамерах универсальных оснований и (или) смеси всех четырех природных оснований вместе с использованием нескольких флуоресцентных красителей (о алгоритме см. УегаЛоу е( а\., 1996; Parinovet а1., 1996).

В ряде работ было показано, что чувствительности ДНКлигаз достаточно для выявления одниночных замен в районе сшиваемиго разрыва (1-апс1едгеп е\а\., 1988; Ватпдег et а1., 1990; Вагапу, 1991). В работе (Broude et а1., 1994) было предложено использовать лигирование смежных олигонукпеотидов для разработки альтернативного метода секвенирования. Основной особенностью предполагаемых чипов является использование «полу-двухцепочечной» иммобилизованной ДНК пробы, содержащей одноцепочечный свисающий конец известной последовательности длиной 5 нт. вместо обычных одноцепочечных проб. Лигирование одноцепочечной радиоактивно меченной ДНК прегибридизованной на эту 5-членную последовательность обеспечивает высокую дискриминацию одиночных З'-концевых мисматчей. Для возможности восстановления структуры

повторов и точек ветвления встречающихся в исследуемой последовательности было предложено использовать последовательное сиквенс-специфическое лигирование на олигонуклеотидных микрочипах (Dubiley et al., 1997). Однако, для диагностики, пруф-ридинга и пр., однозначная реконструкция исходного сиквенса в большинстве случаев не является проблемой, так как последовательность частично известна и разница в списках подпоследовательностей достаточна для для детекции мутаций. Для таких задач использование олигонуклеотидных микрочипов основывается на факте что для гаплоидного пробы каждая мутация (или полиморфизм) приводит к появлению новых олигонуклеотидов в списке подпоследовательностей с одновременным исчезновением подпоследовательностей входящих в дикий тип. Одиночная замена приведет к появлению L новых подпоследовательностей, делеция - к L-1, и инсерция к по крайней мере к L новых олигонуклеотидов, в зависимости от длины вставки, причем независимо от плоидности исследуемой пробы. Конечно, может произойти так, что список новых подпоследовательностей вызванных мутацией уже присутствует где:либо в последовательности дикого типа. В этом случае, гибридизационный паттерн останется неизменным и така мутация неможет быть детектирована на микрочипах. Однако, мутация может быть обнаружена если по крайней мере часть из новых подпоследовательностей отсутствует в списке для ДНК дикого типа, либо новый список не содержит часть подпоследовательностей для дикого типа.

1.1.2 Методы производства микрочипов.

В качестве подложки для микрочипов обычно используют кварцевое или обычное стекло (Maskosetal, 1992; Guoetal., 1994; Pease etal., 1994), или кремниевые пластинки (Lamture et al., 1994; Beattie et al., 1995). Стекло - достаточно дешевый

материал, обладает хорошими оптическими свойствами, химия его активации хорошо известна и широко используется в твердофазном синтезе и других биологических методах. Кремний - более дорогой материал, но он позволяет интегрировать электронную детекцию гибридизации. Также некоторыми авторами предполагалось использовать полипропиленовые подложки для олигонуклеотидных чипов (Maison et al., 1995; Southern, 1995), так как этот материал очень дешев и химически инертен.

Небольшие размеры микрочипов и полотное расположение олигонукпеотидов -необходимоы условия работы с реальными количествами образца нативной ДНК в реверс дот-блот формате. Существует два подхода в производстве таких чипов -иммобилизация пресинтезированных олигонуклеотидов, либо синтез олигонукпеотидов непосредственно на подложке чипа.

Первый метод имеет ряд преимуществ - разработанный твердофазный синтез олигонуклеотидов на коммерческих автоматических синтезаторах, разработана стандартная химия введения " модифицированных оснований, etc., возможность очистки и приведения концентраций до стадии нанесения олигонуклеотидов на микрочип. Таким способом можно получать чипы с иммобилизованными кДНК, бактериальными клонами, etc. Нанесение олигонуклеотидов с интервалом в 100-300 р возможно с помищью адаптированных роботизорованных систем (Beattie et al., 1995; Shalon et al., 1996; Yershov et al., 1996).

Однако, с точки зрения массового производства таких микрочипов, существуют проблемы. Прежде всего, время и сложность процессинга значительно увеличивается с увеличением длины олигонуклеотидов. Синтез и нанесение 4 096 гексамеров не выглядит задачей запредельной сложности. Однако, процессирование 16 384 гептамеров или 65 536 октамеров уже вызывает сложности.

Синтез in situ позволяет избежать процессирования десятков тысяч растворов, что, безусловно, большое преимущество по сравнению с предыдущим методом. A. Blanchard et al. использовали стандартный подход в in situ синтезе - каждый олигонуклеотид синтезировался отдельно. Стандартная фосфорамидитная химия олигонуклеотидного синтеза была адаптирования к нанообъемам (Blanchard and Hood, 1996). Принцип струйного принтера используется также рядом других групп (.Eggers et al., 1994). Такая технология позволяет синтезировть до 1 ООО олигонукпеотидов с интервалом в 100 р за 2 часа (Blanchard and Hood, 1996). Однако, количество необходимых шагов синтеза и сложность производства драматически возрастает с увеличением длины олигонулеотида. Единственный способ избежать этого - использование комбинаторной химии. Такое решение проблемы на основе фосфорамидитной химии предложил Е. Southern. На активированной подложке микрочипа закрепляется маска таким образом, что образуются параллельные каналы-строки (Southern et al., 1992; Southern et al., 1994; Maison et al., 1995). Один цикл синтеза происходит внутри канала, причем с разными предшественниками в каждом канале. После завершения цикла, подложку чипа поворачивают на 90°, так, что маска образует каналы-колонки, перпендикулярные предыдущим, и проводится следующий цикл синтеза. В результате повторений поворота маски каждый иммобилизационный сайт определяется пересечением строк и колонок, и несет определенный олигонуклеотид. При таком способе синтеза количество циклов синтеза равно длине олигонукпеотида (Southern et. al., 1992). Безусловно, такой подход имеет огромное преимущество для массового производства, так как проще провести 8 шагов синтеза вместо синтезирования 65 536 индивидуальных олигонукпеотидов. Однако, т