Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация аллелей гена HLA DQA1 методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация аллелей гена HLA DQA1 методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами"

Московский Физико-Технический Институт.

РГ и ОД

. ,, , . - На правах рукописи

Лебедь Юлия Борисовна.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА НЬА ООА1

МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИИ С ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫМИ МИКРОЧИПАМИ.

Специальность 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1998

Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики МФТИ и в лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители: к. х. н., В. В. Шик

д. х. н., академик А. Д. Мирзабеков.

Официальные оппоненты: д. ф-м. н. профессор,

В. И. Иванов,

д. биол. н., Н. К. Янковский

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится « » октября 1998 г. в час. На заседании диссертационного совета К. 063. 91. 10 при Московском Физико-Техническом институте по адресу 141700, г. Долгопрудный, Московская обл., Институтский пер., 9, в аудитории 113 ГК.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «_» сентября 1998 г.

Ученый секретарь Специиализированного ученого совета к. ф.-м. н.

В. Б. Киреев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние 3-4 года в разработке высокоинтегрированных олигонуклеотидных микрочипов произошел гигантский прогресс. Уже опубликованы данные об изготовлении олигонуклеотидных чипов, содержащих до 400 ООО олигонуклеотидов на поверхности менее 1.6 см2 [Wodicka L et al. 1997]. В 1996-1997 году были выпущены на рынок чипы для анализа мутаций в митохондриальной ДНК человека [Chee М et al., 1996J, в гене BRCA1 [Hacia J. G., et al., 1996] гене p53 [Castellino A.M., 1997], генах протеазы и ревертазы вируса иммунодефицита человека [Lipshutz R.J., et. al., 1995]. Опубликованы данные об анализе экспрессии генома пекарских дрожжей на олигонуклеотидных чипах [Wodicka L et al. 1997] и чипах, содержащих ПЦР продукты [DeRisi J. L., et. al., 1997]. Несколько ранее сообщалось об использовании чипов для диагностики р-талассемии [Yershov G., et. al., 1996] и идентификации микроорганизмов [Guschin D. Y„ et.al., 1997]. Данная работа иллюстрирует возможность применения чипов для идентификации аллелей генов главного комплекса гистосовместимости (HLA). Мы выбрали для отработки методов типирования ген DQA1 как наиболее простую модель, чтобы в дальнейшем, возможно, распространить эти методы на другие гены HLA

Цель работы. Целью данной работы является разработка методических подходов диагностики генного полиморфизма, в частности - типирования генов главного комплекса гистосовместимости путем анализа нуклеотидной последовательности гена с помощью гибридизации с олигонуклеотидной матрицей.

Научная новизна работы. Предложен набор олигонуклеотидов и алгоритм для автоматического распознавания аллелей гена HLA DQA1. Оптимизированы методики приготовления флуоресцентно-меченных проб для гибридизации: ПЦР, in vitro транскрипция, фрагментация РНК. Исследована эффективность идентификации аллелей в гомозиготных и гетерозиготных образцах ДНК пациентов методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами. Научно-практическое значение работы. Типирование генов главного комплекса гистосовместимости человека, основанное на анализе нуклеотидной последовательности, необходимо при подборе пар донор-реципиент при трансплантации, для диагностики наследственных заболеваний, ассоциированных с некоторыми аллелями HLA. Анализ нуклеотидной последовательности высокополиморфных генов, к каким относятся гены HLA, с помощью стандартных диагностических методов затруднен, для него может потребоваться дорогостоящее секвенирование.

Гибридизация с олигонуклеотидными микрочипами - это более быстрый метод диагностики, дающий возможность автоматизировать процесс типирования, одновременно обрабатывать множество образцов ДНК пациентов. Данный метод позволяет надежно идентифицировать аллель НЬА БС)А1 и может быть рекомендован для типирования других генов НЬА. Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 80 стр., включая 2 табл., 10 рис. и состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, и Выводы. Библиография включает 105 наименований. Основные результаты получены автором самостоятельно. Микроматрицы были приготовлены В. В. Чупеевой и Э. Я. Крейндлиным, анализ флуоресцентного изображения проводился совместно с Г. Крюковым.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Олигонуклеотиды, комплементарные полиморфным участкам НЬА Б(2А1 гена, иммобилизовали в элементах полиакриламидного геля, ковалентно связанного с поверхностью предметного стекла. Микрочип содержал 70 олигонуклеотидов, иммобилизованных в ячейках геля размером 100x100x20 цМ. Для иммобилизации олигонуклеотидов, полиакриламидный гель обрабатывали раствором гидразин-гидрата, замещающим часть амидных групп на гидразидные. Олигонуклеотиды, предназначенные для иммобилизации, содержали на 3'-конце 3-метилуридин. Перед нанесением на чип 2',3'-г/ыс-диольные группы рибозы З'-концевого 3-метилуридинового звена олигонуклеотидов окисляли КаЮд до диальдегида. На каждый гелевый элемент микроматрицы с помощью специально сконструированного робота наносили 1 нл (0.5-1.0 пмоль) раствора одного из активированных олигонуклеотидов /Уегсйоу (?., е{ а1, 1996]. Реакция альдегидных групп олигонуклеотидов с гидразидными группами геля обеспечивала иммобилизацию /Ккгарко К. К, ей а1, 1991].

Выбор олигонуклеотидов.

В настоящее время известно 15 аллелей DQЛ1. По степени сходства кодирующей части нуклеотидной последовательности аллели можно условно разбить на три группы: дел;* 0101-01021-01022-0103-0104; £>£Ш*0201-03011-0302; £2/47*0401-05011-05012-05013-0502-0503-0601. Внутри обозначенных групп есть аллели, отличающиеся друг от друга всего на один или два нуклеотида, например - *0101 и ♦0104; *0401 и *0601; *03011 и *0302. Большинство вариабельных позиций гена 0()А1 содержится во втором и третьем экзоне - это одно-трехнуклеотидные замены и небольшие делеции. Наиболее полиморфный участок находится между кодонами 45-57 второго экзона, где плотность изменений столь высока, что затрагивает практически каждый кодон. По последовательности второго экзона можно идентифицировать группы аллелей НЬА DQA1, - *0101 и *0104; *03011 и *0302; *01021 и *01022; *05011, *05012, *05013 и *0503, которые в этих пределах неотличимы друг от друга, и пять аллелей -*0103, *0201, *0401, *0502 и *0601. Используя дополнительно последовательность третьего экзона, удается различить также аллели *05011, *05013 и *0503, *0302 и *03011, а

для нахождения отличий между аллелями *0101 и *0104 необходимо анализировать последовательность первого экзона В<ЗА1.

Иммобилизованные на микрочипе олигонуклеотиды были выбраны таким образом, чтобы идентифицировать практически все вариабельные позиции второго и третьего экзонов БС)А1. Олигонуклеотиды были комплементарны кодирующей цепи аллелей Б(5А1 и для удобства обработки результатов разбиты на группы. Группа содержит набор гомологичных олигонуклеотидов, охватывающих все известные аллельные варианты данной вариабельной позиции Б(ЗА1 гена. Кроме того, в некоторые группы, покрывающие 2 или 3 близко расположенных полиморфных основания, включали один или два контрольных олигонуклеотида, отличающиеся от всех известных аллелей по нуклеотидной последовательности по крайней мере одной заменой. Олигонуклеотиды отбирали по следующим правилам:

Во-первых, вариабельная позиция гена должна находиться в середине последовательности олигонуклеотида, т. к. неспаренные основания в центре молекулы сильнее дестабилизируют дуплекс, чем концевые мисматчи [ОосЦ'сг М. У., еА а1. 1995]. Во-вторых, длина олигонуклеотидов должна обеспечить образование стабильного дуплекса при хорошей дискриминации перфектных дуплексов от дуплексов, содержащих неспаренные основания,

поэтому мы использовали для разных участков Б<ЗА1 гена олигонуклеотиды длиной от 10 до 12 оснований. В третьих, так как стабильности различных перфектных дуплексов, образованных короткими олигонуклеотидами, могут значительно отличаться, то следует сравнивать флуоресценцию только перфектного дуплекса и соответствующего ему дуплекса с неспаренным основанием. Поэтому в каждую группу олигонуклеотидов включали контрольный олигонуклеотид (олигонуклеотиды) с мисматчевой последовательностью для каждого из известных аллелей. Для того, чтобы определить, какой из дуплексов является перфектным, сравнивали интенсивности флуоресценции внутри группы близких по последовательности олигонуклеотидов.

Приготовление флуоресцентно-меченных проб для гибридизации.

Титрование аллелей НЬА DQA1 было проведено для 12 образцов ДНК, выделенной из крови пациентов. Для приготовления флуоресцентно-меченных проб были оптимизированы условия ПЦР-амплификации второго и третьего экзонов Н1Л DQA1. На первой стадии ПЦР использовали геномную ДНК человека, получая отдельно второй и третий экзон Н1А DQA1 (рис.3). На второй стадии ПЦР в двухцепочечный ДНК-продукт второго и третьего

экзонов включали промотор Т7 ДНК-полимеразы, используя прямой праймер с присоединенной последовательностью промотора Т7. ПЦР-продукты с промотором Т7 использовали в качестве матриц для ш у/гго-транскрипции.

Рисунок 1. 1 2 3 4 & 6 Т 8 9 10 11

2.0 тн,-1.2 тгш.-

0.В1П.Н,-

0.4 тпя-

" ^ ' ' - } , .s ' А Щ

" . " ' Л - <4 ' -■•rv-'. : • Si

- 350 п.н.

- 2X1 п.н.

- 50 пн.

Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов 2-го экзона DQA1 гена после двух раундов амплификации, в 1.5%- агарозном геле: 2-9 - продукты ПЦР, соответствующие образцам ДНК 1 -ДНК 7, содержащие промотор Т7; 11 -ДНК после первого раунда амплификации ПЦР (без промотора) Т7; 1,10- маркеры длины. Гель окрашен бромистым этидием

Мы использовали для приготовления одноцепочечных проб in vitro транскрипцию с помощью Т7 ДНК-полимеразы, т. к. этот метод позволяет избежать негативных сторон асимметричной ПЦР, дает большой выход материала (в наших условиях, до 100 мкг РНК) и упрощает процесс подготовки пробы.

Гибридизация иммобилизованных в геле олигонуклеотидов с длинными молекулами ДНК (РНК) малоэффективна, из-за того, что образование внутримолекулярных дуплексов в длинной ДНК (РНК) часто термодинамически более выгодно, чем образование межмолекулярных дуплексов с иммобилизованными олигонуклеотидами. Поэтому было предложено фрагментировать длинную одноцепочечную пробу на более короткие фрагменты.

Рисунок 2.

А)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

™ f.

Б)

12 3

- 1.77 т.п.н.

_ 0-53 т.п.н.

- 0.4 т.пд

- 0.2В т.п.н.

0.15 т.п.н.

L t

Е

А) Разделение продуктов in vitro транскрипции ДНК 2-го экзона в 6%-ном ПААГ, содержащем 8 M мочевину: Дорожки 1-8 : РНК соответствуют матрицам ДНК1 - ДНК 7 на рис.4; Дорожка 9 - РНК-маркеры . Гель окрашен SYBR Green II ("Molecular Probes ", США).

Б) Разделение ф.чуореы\ентно меченных продуктов фрагментации РНК (без удаления коротких продуктов ) в 20%-ном ПААГ, содержащем 8 M мочевину - дорожки 1, 2 ; дорожки 3, 4 -флуоресцентно меченные II-мер и 17-мер, соответственно.

Большинство известных способов фрагментации нуклеиновых кислот, как химических (фрагментация реагентами Максама-Гилберта [Махат А. М. & Gilbert W. 1980], так и ферментативных [Rhodes D. & Klug А. 1980], обладают определенной избирательностью к нуклеотидной последовательности. Неоднородность расщепления различных фосфодиэфирных связей может приводить к различию концентраций отдельных фрагментов в гибридизационной смеси. Случайность фрагментации важна для секвенирования с помощью гибридизации с олигонуклеотидной матрицей (СГОМ) [Khrapko, K.R., et. al., 1991], однако менее существенна для диагностики известных мутаций, когда сравнивают пары олигонуклеотидов, образовавших совершенный и несовершенный дуплексы с исследуемой ДНК. В этом случае можно использовать более простые методы фрагментации, при которых внесение разрывов близко к случайному. Для РНК такими методами являются щелочной и кислотный гидролиз [Кочетков Н. К, и др., 1970]. Чтобы оценить неоднородность гидролиза отдельных фосфодиэфирных связей в молекуле РНК, использовали фрагмент длиной 70 оснований (часть первого интрона ß-глобинового гена) меченный по 5'-концу с помощью Р32. РНК обрабатывали кислотой или щелочью в течение различного времени, затем продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в денатурирующем

полиакриламидном геле. На основании полученных данных было показано, что кислотный гидролиз при 60°имеет слабо выраженную специфичность, и было выбрано время фрагментации 20 мин., дающее наибольший выход продуктов длиной от 12 до 30 оснований. Транскрипты кодирующей цепи второго и третьего экзона HLA DQA1 фрагментировали, затем метили флуоресцентно, как описано в [Prudnikov D. & Mirzabekov А., 1996], с использованием изотиоцианата флуоресцеина и сульфохлорида техасского красного ("Molecular Probes", США), и очищали гель-фильтрацией от мелких продуктов гидролиза и свободной метки. Гибридизация и анализ полученных данных.

Флуоресцентный сигнал ячеек микрочипа регистрировали в реальном времени с помощью флуоресцентного микроскопа (Россия), снабженного ПЗС камерой и программным обеспечением WinView фирмы "Prinston Instruments" (США) [Yershov,G., et al., 1996, Иванов И. Б., и др., 1997]. Изображение микрочипа, полученное с помощью ПЗС-камеры, при гибридизации с пробами второго и третьего экзона дано на рисЗА и рис. 4. Численные значения интенсивности флуоресценции гелевых элементов чипа с вычетом локального фона вокруг элементов преобразовывали в текстовый формат и представляли в виде таблиц Excel 7 (рис ЗБ.).

Рисунок 3.

А)

Б)

1 23456789 10

51

52

53

54

55

56

А) Изображение чипа при гибридизации с пробой второго экзонаДНК 4, и Б) соответствующая ему таблица штенсивностей сигналов с вычетом локального фона в виде таблицы в Excel 7. Схема расположения на чипе олигонуклеотидов для второго экзона приведена в Таблице 1.

Существует несколько методов проведения гибридизации. Можно проводить длительную инкубацию при низкой температуре до насыщения флуоресцентного сигнала, затем начать повышение

3.7 77.8 2.1 72.0 34.1 5.9 264 3.7 113.8 337.8

299.7 21.7 31.1 433 2 168 3 816.6 123.5 59.7 5.8 5.8

3.9 10.4 3.6 5.4 19.7 86.6 28.5 7.0 6.8 65.5

6.1 1.7 1.9 20.7 1.6 0.9 0.5 5.7 2.4 126.7

41.0 3.8 9.4 86.0 0.4 7.7 3.7 3.9 116.3 1.4

1.9 3.4 125.6 5.0 3.6 2.0 3.5 58.6 28.7 48.2

температуры, непрерывно регистрируя изменение флуоресценции элементов чипа в равновесных условиях. Таким образом строят кривые плавления, дающие возможность четко дискриминировать перфектные дуплексы и дуплексы с мисматчами \Drobyshev А., с1. а1, 1997]

Рисунок 4.

А)

123456789 10

в*

52 ^СИЬ!^ - -ск ; Ч

* (_ у - .- •'":

Б)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

¿¿¿¿У; V © О с

-С

Изображение участка чипа с олигонуклеотидами для третьего экзона при гибридизации с пробами третьего экзопа ДНК 4 (А), и ДНК 1 (Б). Схема расположения на чипе олигонуклеотидов третьего экзона приведена в Таблице 2.

Недостатком этого способа является его длительность, поскольку из-за замедленной диффузии гибридизационное равновесие в ячейках с иммобилизованными в геле

олигонуклеотидами может устанавливаться в течение нескольких суток \Livshits М. А. & \tirzabekov А. £>., 1996]. Поэтому мы использовали другой метод, позволяющий значительно сократить время гибридизации и отмывки. Наилучшая дискриминация перфектных и мисматчевых дуплексов может быть достигнута при низких температурах [ЬтИШ М. А. & МигаЪёком А. В., 1996]. Удаление гибридизационной пробы и отмывка буфером при низкой температуре создают условия для более быстрой диссоциации коротких или неправильно спаренных дуплексов по сравнению с полноразмерными совершенными дуплексами. Большая интенсивность флуоресценции ячейки в группе может быть результатом как повышенной стабильности совершенного дуплекса, так и кроссгибридизации, поэтому мы проводили гибридизацию при комнатной температуре в присутствии' формамида. Такие условия увеличивают скорость гибридизации и в значительной мере препятствуют неправильному спариванию оснований и образованию коротких дуплексов (см., напр., [Сксе М., ег. аI., /996]). Экспериментально подобрав температуру и время отмывки, можно получить дискриминацию перфектных дуплексов от мисматчевых, достаточную для идентификации аллелей, и после гибридизации мы сразу же проводили отмывку холодным гибридизационным буфером при 4°С. Обычно флуоресцирующие элементы чипа были видны в

присутствии гибридизационной смеси, но краткая отмывка холодным гибридизационным буфером улучшает контраст: отношение сигнал/фон повышается почти в 100 раз, при этом флуоресценция ячеек микрочипа практически не меняется. Резкий контраст и высокая скорость гибридизации пробы на чипе обусловлены высокой . концентрацией иммобилизованных олигонуклеотидов (до 10 мМ) [Уткоу.С., е1. а!., 1996], в то время как концентрация пробы не превышает 10-20 мкМ. По нашим данным, увеличение длительности гибридизации или концентрации пробы повышает флуоресцентный сигнал элементов микрочипа, но не сказывается на общем виде картины, так же, как и отмывка с повышением температуры почти не влияет на результат типирования. При высоких концентрациях пробы можно провести гибридизацию за 10-15 мин и правильно идентифицировать аллель, при этом гибридизация, отмывка, получение изображения и автоматический анализ гибридизационной картины занимали всего около 30 мин.

Интенсивность флуоресценции ячеек определяется долей олигонуклеотидов, образовавших дуплекс с флуоресцентно меченной пробой. Равновесные константы ассоциации полностью комплементарных дуплексов больше, чем у несовершенных дуплексов, особенно, если неспаренное основание находится в

центре /УегхАоу.С., е(. а1, 1996, ОоОусг М. е1 а!., 1995], поэтому при идентификации аллелей мы исходили из предположения, что самые яркие ячейки в гомологичных группах соответствуют полной комплементарности олигонуклеотида чипа и гибридизационной пробы. Им присваивалось условное значение "1", а более темным ячейкам (соответствовавших несовершенным дуплексам), присваивалось значение "О". Для всех аллелей НЬА й()А1 были составлены матрицы соответствия олигонуклеотидов гомологичных групп последовательности аллелей, представляющие собой столбцы чередующихся "1" и "О". Цифрой "1" обозначали присутствие комплементарной последовательности в данном аллеле, цифрой "О" -отсутствие (см. Табл 1, 2). С теоретическими матрицами соответствия сравнивали экспериментально полученные значения сигнала.

Численные значения сигналов различных ячеек могут меняться в зависимости от концентрации пробы, длительности гибридизации и др. Однако оказалось, что отношение интенсивностей, нормированных на суммарную интенсивность флуоресценции всех ячеек гомологичного набора олигонуклеотидов более устойчиво к вариациям эксперимента. В таблицах 1 и 2 приведены нормированные значения интенсивности каждой ячейки

в процентах от суммарной интенсивности всех дуплексов гомологичного набора.

При анализе результатов гибридизации, экспериментально найденные матрицы соответствия сравнивались с теоретическими с помощью программы, написанной на языке Visual Basic for MS Office. При полном совпадении. матриц автоматически назывался аллель. Если же матрицы частично отличались, то назывался аллель, сходство с матрицей соответствия которого было наибольшим. Для окончательного вывода просматривали флуоресцентное изображение чипа, чтобы убедиться в отсутствии видимых артефактов, таких, как флуоресцирующие пузырьки воздуха или грязь. Алгоритм идентификации гетерозигот был следующим. Если в одной группе гомологичных олигонуклеотидов чипа обнаруживались два интенсивно флуоресцирующих элемента, величины сигнала которых отличались меньше, чем на 20%, то считали, что в обоих элементах образовались перфектные дуплексы, т. е., данная проба комплементарна двум олигонуклеотидам гомологичного набора и является гетерозиготной по локальному полиморфному участку. Образец ДНК считался гетерозиготным, если большинство локальных полиморфных сайтов соответствовало гетерозиготному генотипу, а полученная матрица соответствия была суперпозицией матриц соответствия двух известных гомозигот,

расчитанных на основании нуклеотидной последовательности.

Таким образом был идентифицирован аллель гена DQA1 в 12 образцах ДНК пациентов. Результаты типирования «вслепую» совпали с результатами, полученными независимо стандартными методами. Для семи образцов, обозначенных как ДНК1-ДНК7, последовательность обеих цепей ПЦР-продукта второго экзона была определена по Сэнгеру. Для пяти образцов, обозначенных как Е1-Е5, аллель определяли с помощью анализа полиморфизма длин рестриктных фрагментов. С помощью компьютерного анализа результатов гибридизации с матрицей иммобилизованных олигонуклеотидов (см. Таблицы 1 и 2) 11 образцов были идентифицированы как гомозиготы. Образец ДНК 3 был идентифицирован как гетерозигота по группе аллелей £>2Л7*0401 и *05011/*05012/*05013. При гибридизации с пробой второго экзона для ДНК 3 двум парам олигонуклеотидов, 86-1 и 86-3, 81-9 и 81-10 (Табл 1.), соответствуют большие значения интенсивности флуоресценции, чем контрольным олигонуклеотидам этих групп, но близкие по величине в каждом из наборов (ср. Табл. 1 значения флуоресценции для гетерозиготного образца ДНК 3 и образца ДНК 4, идентифицированного как гомозигота по группе аллелей*05011/*05012/*05013, неразличимых во втором экзоне).

Таблица 1.

Координаты элементов ДНК ДНК

микрочипа, 4 3 см

последовательности см о см о г> о

(от 5' к 3'), о о о « со о m о

комплементарные т- СМ п т- т- т- , ч- п "г- см т-

иммобилизованным о т- о т- о т- о см о со о ** о о ю ю о in © (О

олигонуклеотидам, О * О * о + о * о * о « о о * * о # о «

S1-1 5'-ag ttt tac ggt 10.6 17.2 1 1 1 0 0 0 0 0 0

S1-2 5'-ад tCt tac ggt 80.6 66.1 0 0 0 1 0 1 1 1 1

S1-3 5'-ag tCt taT ggt 8.8 16.7 0 0 0 0 1 0 0 0 0

S1 - 4 5'-cag tac acc cat 56.9 69.4 1 1 0 0 0 1 1 1 0

S1 - 5 5'-cag tTc acc cat 38.1 22.2 0 0 1 1 0 0 0 0 1

S1 - 6 5'-cag tac aGc cat 5.0 8.4 0 0 0 0 1 0 0 0 0

S1-7 5'-a gat gag gag t 4.9 14.2 1 0 0 0 0 0 0 0 0

S1 - 8 5'-a gaC gag gag t 1.1 7.5 0 0 0 1 1 0 0 0 0

S1-9 5'-a gaC gag Сад t 31.0 37.5 0 0 0 0 0 1 0 0 1

S1-10 5'-a gat gag Сад t 63.0 40.8 0 1 1 0 0 0 1 1 0

S2-1 5'-tc tac gtg gac 73.9 62.4 1 1 1 0 0 1 1 1 1

S2-2 5'-tc taT gtg gac 13.1 19.1 0 0 0 1 1 0 0 0 0

S2-3 5'-tc taA gtg gac 13.1 18.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S2- 4 5'-ctg gag agg aag 37.5 33.1 1 1 0 1 1 0 0 0 0

S2- 5 5'-ctg-gag aAg aag 17.3 19.7 0 0 1 0 0 0 0 0 0

S2- 6 5'-ctg gGg agg aag 45.2 47.2 0 0 0 0 0 1 1 1 1

S3-1 5'-tgg cgg tgg cct 12.6 10.1 1 1 1 0 0 0 0 0 0

S3-2 5'-tgg AAg tTg cct 11.2 21.2 0 0 0 1 0 0 0 0 0

S3- 3 5'-tgg cAg tTg cct 9:1 10.9 0 0 0 0 1 0 0 0 0

S3- 4 5'-tgg cgT tTg cct 16.1 11.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S3- 5 5'-tgg cgg tTg cct 14.0 4.9 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S3-6 5'-tgg TgT tTg cct 37.0 41.8 0 0 0 0 0 1 1 1 1

S3- 7 5'-g cct gag ttc 19.1 13.5 1 1 1 0 0 0 0 0 0

S3-8 5'-g cct CTg ttc 11.7 11.7 0 0 0 1 1 0 0 0 0

S3- 9 5'-g cct gTg ttc 12.0 12.1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S3-10 5'-g cct gTT Ctc 41.8 48.1 0 0 0 0 0 1 1 1 1

S4-1 5'-g cct gaT Ctc 15.4 14.6 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Таблица 1 (продолжение).

Координаты элементов микрочипа, последовательности (от 5' к 3'), комплементарные иммобилизованным олигонуклеотидам. ДНК 4 ДНК 3 o o » T— o ■*— o * CN РЧ O *- o * CN O o # m o r- O * T" o <N o * CM o со o * To m ? o o * m o 1П o . *. T- M r T" O O ю m o o * * CM o U) o * T— o u> o *

S4-2 5'-te age ааа ttt 17.1 15.0 1 1 1 0 0 0 0 0 0

S4-3 5'-íc agA ааа ttt 20.4 15.4 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S4-4 5'-te agA Caa ttt 40.0 34.8 0 0 0 0 0 1 1 1 1

S4-5 5'-te CAc aGa Ctt 9.1 11.4 0 0 0 1 0 0 0 0 0

S4-6 5'-tc CAc aGa ttt 8.2 10.4 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S4-7 5'-tc Cgc aGa ttt 5.2 13.0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

S4-8 5'-tt gga ggt ttt g 5.7 10.8 1 1 1 0 0 0 0 0 0

S4-9 5'-tt ggT ggt ttt g 5.8 5.1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S4-10 5'-tt Aga ttt gac с 56.5 52.9 0 0 0 1 0 1 1 1 1

S5-1 5'-tt Tga ttt gac e 13.2 22.0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S5-2 5'-tt Aga AgA ttt g 7.3 3.6 0 0 0 0 1 0 0 0 0

S5-3 5'-tt Tga AgA ttt g 11.5 5.7 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S5- 4 5'-ttt gac ecg ca 93.1 94.7 1 1 1 1 1 1 1 0 1

S5- 5 5'-ttt gac eGg ca 6.9 5.3 0 0 0 0 0 0 0 1 0

S5- 6 5'-gct gtg gca aaa 10.1 14.5 1 1 1 0 0 0 0 0 0

S5- 7 5'-gct gtg Аса aaa 7.8 51.8 0 0 0 0 0 1 0 0 1

S5- 8 5'-gct gtg CTa aaa 7.8 5.7 0 0 0 1 1 0 0 0 0

S5- 9 5'-gct gtC CTa aaa 74.2 27.9 0 0 0 0 0 0 1 1 0

S5-10 5'-aac ate atg att 1.3 12.1 1 1 1 0 0 0 0 0 0

S6-1 5'-aac ate Ctg att 4.2 32.5 0 0 0 1 0 1 0 0 1

S6- 2 5'-aac ate Gtg att 4.4 11.0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

S6- 3 5'-aac aGT Ctg att 81.5 31.5 0 0 0 0 0 0 1 1 0

S6- 4 5'-aac aGA Ctg att 8.6 12.8 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Результат типирования: FJ -r-o o ^f «o o * * T- O OOlO Ю Ю o o o « * «

1-й столбец - последовательности и координаты элементов чипа (см. Рис.3). 2-й и 3-й столбцы- экспериментальные значения сигнала, при гибридизации со вторым экзономДНКЗ и ДНК 4, в процентах от суммарного сигнала набора. Столбцы 4-12 — соответствие олигонуклеотидов аллелям НЬА Б()А1.

Таблица 2.

Координаты элементов микрочипа, последовательности, (от 5' к 3'), комплементарные иммобилизованным олигонуклеотидам. ДНК 1 ДНК 3 ДНК 4 ДНК 5 ДНК 7 Е1 CN СЧ S" Т- es о о т- то о * * п о т— О * Г" ч- о о со ч- о о * * т- CN О О см со о о # * <N ¡5 т- гч- СМ 33 О m in ЕШ О Е* * со то 1Л о * CJ о 1П о *

S2-6 5'-с ctc atC tgt et 7.1 4.7 10.3 10.6 77.5 63.0 1 0 0 0 0 0

S2-5 5'-c ctc att tgt et 92.9 95.3 89.7 89.4 22.5 37.0 0 1 1 1 1 1

S2-3 5'-ggg cag tea gtc 7.3 9.8 13.8 32.1 52.9 59.0 1 0 0 0 0 0

S2-2 5'-ggg caC tea gtc 69.3 70.1 60.0 47.5 35.3 26.6 0 0 1 1 1 1

S2-1 5'-ggg caC Gca gtc 23.4 20.1 26.2 20.4 11.8 14.5 0 1 0 0 0 0

S1-10 5'-et get gat gag 76.2 34.5 13.3 49.7 75.4 59.1 1 1 1 0 0 0

S1-9 5'-et gAt gat gag 10.7 3.6 4.3 20.1 11.2 16.3 0 0 0 0 0 0

S1-8 5'-ct get gaG gag 12.2 52.4 66.8 24.0 12.6 17.4 0 0 0 1 1 0

S1-7 5'-ct Tet gaG gag 0.9 9.5 15.5 6.2 0.8 7.2 0 0 0 0 0 1

S1-6 5'-tgg ggA etg g 8.4 16.0 13.0 13.9 9.8 15.4 0 0 0 0 1 0

S1-5 5'-tgg gge etg g 91.5 84.0 87.0 86.1 90.2 84.6 1 1 1 1 0 1

Результат гипирования: V О СО о « Т" т~ О if) О * ч— О m о тО ем о * О о * о о *

1-й столбец - последовательности, комплементарные олигонуклеотидам для третьего экзона и координаты элементов чипа (см. Рис.4). Столбцы 2-7 — экспериментальные значения сигнала, выраженные в процентах от суммарной интенсивности элементов набора при гибридизации с б образцами ДНК третьего экзона. Столбцы 8-13 - соответствие олигонуклеотидов аллелям НЬА 0()А1.

Для третьего экзона сходная картина наблюдается для олигонуклеотидов Б1-8 и 81-10 (Табл. 2). Таким образом, для ДНК 3 в гетерозиготных сайтах второго и третьего экзона наблюдается по два интенсивно флуоресцирующих элемента, что доказывает

гетерозиготность образца. Данный результат был также подтвержден с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Картина распределения ярких ячеек по чипу достаточно строго воспроизводится для одного и того же образца, как в разных экспериментальных условиях, так и для проб, подготовленных в разное время, а также для разных образцов, имеющих одинаковый генотип (см. Табл. 1 и 2). Многократное подтверждения генотипа по многим полиморфным участкам увеличивает достоверность типирования. Таким образом, гибридизация с олигонуклеотидными микрочипами позволяет быстро, надежно и воспроизводимо определить аллель как для гомозиготных, так и для гетерозиготных образцов ДНК. Этот метод может быть рекомендован для типирования других локусов НЬАI и II класса.

выводы

1) Предложен набор олигонуклеотидов и алгоритм для идентификации аллелей HLA DQA1.

2) Оптимизированы методики приготовления флуоресцентно-меченных проб для гибридизации: ПЦР, in vitro транскрипции, фрагментации РНК.

3) Показано, что гибридизация пробы - флуоресцентно-меченной РНК второго и третьего экзонов HLA DQA1 с иммобилизованными в геле олигонуклеотидами позволяет надежно дискриминировать перфектные и мисматчевые дуплексы, а низкотемпературная отмывка гибридизационным буфером позволяет многократно увеличить уровень сигнала по сравнению с фоном.

4) Типировано 12 образцов ДНК пациентов. Для семи образцов правильность типирования подтверждена секвенированием по Сэнгеру обеих цепей ПЦР-продукта второго экзона HLA DQA1, и для пяти - методом анализа полиморфизма длин рестриктных фрагментов. Продемонстрировано, что гибридизация с олигонуклеотидными микрочипами позволяет надежно и воспроизводимо идентифицировать аллель HLA DQA1, как для гомозиготных, так и гетерозиготных образцов.

Содержание диссертации изложено в следующих работах:

1) Шик В. В., Лебедь Ю. Б., Крюков Г. В.," Идентификация аллелей

НЬА ОС>А1 методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами." (1998) Молекулярная биология, т 32, №5, стр. 813-822.

2) Лебедь Ю. Б., Шик В. В., "Типирование гена НЬА Б<ЗА1 методом гибридизации с биологическими микрочипами". Юбилейная научная конференция МФТИ, 28-29 ноября 1997 г.