Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование аллельного полиморфизма генов и определение пола методом амплификации ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование аллельного полиморфизма генов и определение пола методом амплификации ДНК"

На правах рукописи

ОВЧИННИКОВ ИГОРЬ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА МЕТОДОМ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК

03.00.03 — МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

доктор биологических наук В. В. Носиков

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук О. В. Евграфов кандидат биологических наук М. И. Просняк

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН

Защита состоится 7 декабря 1993 г. в 1400 часов на заседании Специализированного совета Д 098.12.01. при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан 8 ноября 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы установлен феномен повышенной нестабильности определенных семейств . геномных элементов, хромосомных локусов и доменов, выявление полиморфизма которых является одним из центральных вопросов при исследовании молекулярно-генетических механизмов наследственных заболеваний. С другой стороны, выделение гипервариабельных локусов позволяет использовать их в •качест'ве высокоинформетивных маркеров при картировании генома, анализе сцепления с дефектными генами при наследственных заболеваниях и при гонотипировании личности.

Дополнительные возможности в исследовании высокополиморфных маркеров ДНК открылись с разработкой в 1985 году метода амплификации ДНК на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод обладает рядом достоинств, к числу которых' прежде всего относятся быстрота проведения эксперимента и возможность использования крайне малых количеств ДНК. Он позволяет проводить быстрое картирование генома и консуруйрование карт сцепления. Гипервариабельные лонуси, содержащие тандемные повторы с изменяющимся числом копий (в дальнейшем - тандемные повторы) являются с этой точки 'зрения наиболее перспективным типом полиаллельного полиморфизма. Исследование их полиморфизма методом амплификации ДНК дает также возможность решить крайне важные практические задачи постановлению роДства, определению отцовства и материнства,' индивидуальной идентификации и мониторингу трансплантантов костного мозга.

Цель работы. В настоящем исследовании сделана попытка применить метод амплификации ДНК на основе ПЦР для типирования локусов генома человека с мультиаллелькым полиморфизмом, обусловленным точечными заменами нуклеотидов в гене Н1А-БОА1 и тандемными повторами в гипервариабельных локусах человека. Параллельно решалась задача по разработке надежного метода определения пола на основе амплификации повторяющихся последовательностей ДНК, расположенных на половых хромосомах, который позволил бы проводить быструю пренатальную диагностику * пола. Необходимо было определить частоты встречаемости аллелей и генотипов гыта ньа-боа1 и гипервариабелышх локусов аров, 017Э5,

1СН<1, Б1эво в двух восточнославянских популяциях (русская города Москвы и белорусская) и показать их соответствие закону Харди-Вайнберга. Полученные данные необходимы для создания системы семейного анализа с цолыэ определения отцовства и материнства и комплексной системы биологической идентификации личности на основе амплификации ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа является частью комплексных исследований полиморфизма ДНК и генотигофования личности, проводимых лабораторией молекулярной диагности и геномной дактилоскопии ВНИИ генетика. До настоящего времени отсутствуют данные по популяционным исследованиям частот встречаемости аллелей и генотипов исследованных локусов в славянских популяциях, что заметно усложняет семейный анализ и проведение генотипирования личности в России. Нами впервые проведен анализ полиморфизма гена ньа-В0Л1 и четырех гипервариабельных -локусов в восточносдавянских популяциях и доказана их генетическая однородность. Метод анализа полиморфизма локусов с тавдемными повторами впервые предложен наш для семейного анализа с целью решения проблемы спорного отцовстеэ. В целом предложена система комплексной биологической идентификации человека на основе метода амплификации ДНК, которая включает определение? 1) половой принадлежности; 2) типирование аллелыю'го (точечного) полиморфизма гена нъл-осш; 3) типирование полиморфизма повторяющихся последовательностей. Разработанная нами система, включающая также оптимизацию методов выделения и очистки ДНК, применима при исследовании предрасположенности к аутоиммушшм заболеваниям, для правильного подбора пар донор-реципиент в трансплантологии, при исследовании динамики популяций.

Апробация работы.' Материалы, диссертации' докладывались на семинаре лаборатории • молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ВНИИ генетика (1993 г.), 23-й и 24-й Конференциях Европейского общества генетики человека (Бельгия, 1991 г. и Дания, 1992 г.), Конференции "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического использования"" (Москва, 1991 г.). Второй международной конференции по фингерпринтингу ДНК (Бразилия, 1992 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на ... страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выбор контрольной группы для исследования.

Для настоящего исследования были выбраны 86 семей из трех человек, кровь которых .была предоставлена для исследования спорного отцовства Московским бюро судебно-медицинской экспертизы. Белорусским бюро судебно-медицинской экспертизы и Центром генотипоскопии (г.Москва). Для популяциошшх исследований были выбраны неродственные члены семей, а также случайные индивиды, проходившие по экспертизам по идентификации личности из Москвы и Белоруси и сотрудники Института.

2. Выбор терчостабилыюй ДНК-полнмеразы и оптшалышх условий ПЦР для аншшфикацта больших фрагментов ДНК.

Исследование полиморфизма тандемных повторов на основе ПЦР требует использования термостабильной ДНК-полимеразы, позволяющей проводить амплификацию больших фрагментов ДНК в количестве, детектируемом бромистым этидием в агарозном или ПААГ геле. Для выбора подходящего фермента нами была разработана с использованием компьютерной программы ОНео модельная система, использующая в 'качестве матрицы ДНК Фпга Система состоит из 16 праймеров, которые позволяют синтезировать фрагменты ДНК фага X различной длины (табл.1). Праймеры тлеют длину по 24 п.н. (пары нуклеотидов) с 50%-ным содержащем пар с-с, у них отсутствуют внутренние ■ гомологии и гомологии по краям, а на 3' концах находятся основания с и С для лучшего связывания с ДНК. Праймеры 8 и 16 комплементарны соответствующим участкам на нижней цепи, а остальные - на верхней цепи ДНК фага к. Праймеры были выбраны так, чтобы различные комбинации праймеров ограничивали фрагменты ДНК длиной от 123 до 10030 п.н.

Мы исследовали следующие отечественные термостабильные ДНК-полимеразы:1) тш-полимераза (ИЯФ РАН, г.Гатчина); 2) TaqR-пoлимepJЗo ("Биотех", г.Москва). Тацп-полиме^аза за одну * минуту стадии синтеза успевает наработать детектируемое бромистым этидием количество фрагмента ДНК длиной .3,5-3,8 т.п.н., а •

Таблица 1.. , Система олигонуклеотидных праймеров, позволяющая с итерировать фрагменты ДНК фага к различной длины

N Начало Последовательность Длина фрагментов

праймера -

п.н. от N 16 от N 8

1 21699 САаТТЛААССААССАаСАСАСАОС 10030 5742

2 22497 ССОТОтаОАТАСАТСААСТОСАОС 9232 4944

3 24140 С СТСАТАССАСАТАТа ИАвАСОС 7589 3301

4 24933 ОСаААААСТТСАССТТТСТСТССС 6796 2508

5 26188 тастаастсАОсттсттстттАса 5541 1253

6 26608 СТОООСТАЛТСОАтаТОСССАТАС 5121 833

7 27311 ТААСТаИ?ААСТТССОСТССТССС 4418 130

8 27440а аЛТЛОСАаТСАТОТСААЛССАСОС 0

9 27854 АСОАТАСТСТОАТСССАТССТОТО 3875

10 28231 ■ СООЛТАААТСАССААСТССТТаСО . 3498

11 28760 ССТСТСТСТСССТААТССАААСТС 2969

12 29246 АТООСТСТССАТТССАТТСТССТа 2483

13 29735 ТСААСССОАТОТаЧОкОТАСаСЮ 1994

14 30187 АСАСССЛаТТТСССТАСТОТТАаС 1542

15 30726 АвАССССОИТАЛСАТСССОАТТО 1003

16 31728^ АСТОАЛТССССОАТСЛТСТАТСаС 0

а. Праймеры на нижнюю цепь.

ачь-полимераза за такое жо время позволяет получить фрагменты ДНК длиной 5 т.п.н. Фрагменты с максимально возможной длиной* были амплифицированы и ил-полимеразой при стадии синтеза три

минуты и имели размеры 5,5 и 6,5 т.п.н. соответственно.

3. Аыплификация гена НЬА-ВДА1 на основе ПЦР.

Для амплификации полиморфного участка гена ньа-П0Л1 использовали два олигонуклеотидных праймера, последовательности которых были рассчитаны нами (табл.2). Эти праймеры ограничивают область длиной 242 п.н. и комплементарны к консервативным участкам экзона 2 гена НЬА-грсш .

Локус Праймер Последовательность (5*->3*) Длина,

HLA-DQA1 DQa-12 о tсtgcaGGTGTAAACTTGTACCAGT 26

DQa-86 acggatocGGTAGCAGCGGTAGAGTTG 27

АРОВ ATGGAAACGGAGAAATTATG 20

CCTTCTCACTTGGCAAATAC 20

D17S5 . CGAAGAGTGAAGTGCACAGG 20

CACAGTCTTTATTCTTCAGCG - 21

ICHJ GGGCCCTGTCTCAGCTGGCGA 21

TGGCCTGGCTGCCCTGAGCAG 21

D1S80 GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG • 28

GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC 29

DYZ1 Y1 TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC 23

Y2 TTGAATGGAATGGGAACGAATGG 23

DYZ3 Y3 ATOATAGAAACGGAAATATG 20

Y4 AGTAGAATGCAAAGGGCTCC 20

DXZ1 X1 AATCATCAAATGGAGÄTTTG 20

X2 GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA 20

Примечание. Подчеркнуты участки узнавания рестриктаз (Pst i для

DQa-12 и BamH i для DQa-86). t ,

4. Гибридизация- с олигонуклеотиднши зондами, специфичными-к определенным аллелям.

В настоящее время для гена hla-dqai известно 8 аллелей: 'dqa1*0101, dqa1 *0102, dqa1*0t03, dqa1*0201,dqa1*0301, dqa1»0401 , dqa1»0501, dqa1*0б01. Некоторые аллели отличаются друг от друга только одной парой нуклеотидов. Поэтому важен правильный выбор системы олигонуклеотидных зондов, различающих все аллельные варианты как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии.

Нами были рассчитаны последовательности олигонуклеотидных зондов, представленные в табл.3. В этой системе зонд А1.0 (аминокислоты 47-я - 57-я, область D) выявляет наличие любой кз первых трех аллелей, а зонд a4.0 обнаруживает аллыш dqa1*0401, • dqai*0501 и dqa1 *0601. Зонд А1.2 гибридизуется с аллелями dqa1»0102, pqa1*0103 и dqa1*0401. Мы Нв раССЧИТЫЬЭЛИ сшциэльно •

Зонд Аллель Последовательность Область

Нуклеотидная (5'->3') Аминокислотная

А1 .0 В0А1»0101 СООТОаССТСАСТТСАОСАА 47 ИИРЕЕЗ 52 Б

В0А1 »0102

В0А1 »0103

А1 .1 В0А1 »0101 САССТАСААСТССТСАТСТС 31 БЕЕРУУ 37 В

А1 .2 В0А1 »0102 ОАСАТОАССАОТТСТАССТО 31 ВЕОГУУ 37 В

В0А1»0103

В0А1»0401

А1 .3 В0А1»0103 ТАСОТОСАССТСаАСААОАА 36 ТОНЕК 41 С

А2 .0 Б0А1 »0201 ОТТССАСАОАСТТАОАТТТа 51 РИКЬЮ1 58 Б

АЗ .0 Б0А1 »0301 СТТССаСАОАТТТАОААаАТ 51 РНЮЧШ 58 Б

А4 .0 В0А1 »0401 ТСТТТОССТаТТСТСАОАСА ' 47 СЬРУШ 52 В

I

А1.2-

УСРтоС^ТЯР—г—1-1—

и Л1 _1Л Г -V . Й V_^Г._1.1 _

-V- с 1-У иг >-

-V- а-уи >- я

-Т-У-йС и I

—51-5

—О—

А 4.0

| СЧ1) ОЙ2> • ОЯ») ОЯВ.Э) • ' ОП*>

опв) 1X18) М4.6)

|ош.з}«

оя4>

сяо ОП1) от) 1X10)

ряэ) ияэ,1) о«з.о)

_ооа:_

.00*4. .>_ „ГХ)А4.2.

а I 1*1«

00А1.2

3

ООА4.1

%

Рис. 1. Локализация аллель-спещфичных олигонуклеотидных зондов в экзоне 2 гена НЪА-ЙйАТ.

последовательности зондов для титрования аллелей ЩА1 »0501 и Б0А1»0601 в связи с их крайне редкой встречаемостью.

Восемь аллелей гена Н1Л-В0А1 могут быть отнесены к четырем основным группам (А1, А2, АЗ и А4), которые основаны на полиморфизме в кодонах 45-56 (область Б) (рис.1). В свою очередь аллельные ■ группы А1 и А4 мозкно разделить на аллели Б0А1 »0101, ВС)А1*0102, Б0А1*0103 И Э0А1*0401, С0А1»0501, 00А1*0б01 соответственно на основе полиморфизма в других областях (В, Си Е). Исходя из белковых- последовательностей можно ожидать дополнительное типирование аллельных вариантов в других областях гена НЬА-С0А1.

Применение радиоактивных зондов создает серьезные проблемы при их внедрении в широкую лабораторную и клиническую практику в связи с их нестабильностью и необходимостью соблюдения мер радиациошюй безопасности. Для преодоления этих недостатков нами предложен метод ферментативного биотинилирования олигонуклеотидных зондов.с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и биотинилированного аналога В1о-11-сЮТР; Было проведено сравнение чувствительности радиоактивных и полученных нерадиоактивных зондов. После проведения 50 циклов ПЦР гибридизационный сигнал получали при исходном количестве геномной ДНК в смеси для амплификации 10 пг, что близко к содержанию ДНК в одной клетке.

г

5. Амплификация П-лервариабельных локусов геноыа человека, содержащих тандешше повторы с изменяющимся числом копий.

Тандемные повторы с изменяющимся числом копий представляют . богатый источник высоко полиморфных маркеров для генетического картирования и идентификации личности. Используя ПЦР, мы проводили исследование' аллельного полиморфизма четырех минисателлитных повторов, расположешшх на различных хромосомах человека. Характеристики этих тандемных повторов с изменяющимся числом копий приведены в табл.4.

Для амплификации этих повторов мы использовали олигонуклеотидные праймеры, представленные в табл.2. Подбор оптимальных условий для проведения ПЦР тандемных повторов довольно трудоемок, т.к. успешная амплификация этих локусов возможна только в узком интервале нескольких, параметров, которые ' д^лзлы быть

Область шт

Локус по ном

Хромосомная локализация

Число аллелей

Размер аллелей (п.н.)

Гетерози-готность (%)а

ароВ АРОВ 2р2Э-р24

рУИЙ22 Б17Б5 17р13

(017330)

НУИ-1е IGHJ 14(132 рМСТ118 Б1Б80

25 15

•6 28

301 -1021 170-1430

470-920 350-1000

75-79 86-88

67-82 77-80,8

3 Гетерозиготность определена для различных популяций.

подобраны одновременно. Среди них наиболее важны: 1) оптимальная концентрация ионов Mg2+t 2) время и температура синтеза, 3) количество стадий в цикле, 4) предварительная денатурация геномной ДНК в реакционной смеси без фермента для исключения явления "дискриминации" аллелей, при котором синтезируются главным образом короткие по длине аллели, и гетерозиготный генотип проявляется на электрофорезе в виде гомозиготного фенотипа, 5) исходное количество геномной ДНК. Некоторые параметры ПЦР представлены в табл.5. ' "

Таблица 5. Условия ПЦР для амплификации тандемных' повторов- с изменяющимся числом копий .

Оптимальная кон- Температура / Время

центрация [Мй2*]

Локус тъь ■ Денатурация Отжиг' Синтез

АРОВ 6 тМ 4 тМ +94°с/1 мин +57°С/6 мин

Б17Б5 2 тМ 1 тМ •р94°С/1 мин +57°0/6 мин

IGHJ 2 тМ . 1 тМ +94°С/1,мин +67°С/6 мин

Б1Б80 8 тЫ ■ 2 тМ +94°С/"1» мин +65°С/1 мин +70°С/8 мин

Определенную трудность представляет точное определение размеров амплифицированных аллелей. Если для определения размеров аллелей в локусах D17S5 и IGHJ в качестве маркера размеров достаточно использовать плазмиду pBR322, обработанную рвстриктазой Alu I, то для точного определения размеров аллелей в локусах АРОВ и D1S80 требуется использование маркера, который, состоит из большого числа фрагментов, различающихся на 15-50 п.н. Однако в связи с отсутствием у нас таких маркеров, для измерения размеров был использован набор ранее амплифицированных аллелей. Аллели локусов АРОВ и D1S80, различающиеся на 30 и 16 п.н. соответственно, хорошо разделялись на 3%-ном (3% агарозы SeaKem) или 4%-ном (3% агарозы NuSieve и \% агарозы SeaKem) с последующем-окрашиванием бромистым этидием или в &% ПААГ с глицерином с последующим окрашиванием азотнокислым серебром.

6. Определение пола методом амплификации повторягщихся последовательностей ДНК, расположенных на половых хромосомах.

Олигонуклеотидные праймеры, использованные для диагностики пола приведены в табл.2. Праймеры Y1 и Y2 ограничивают локус в 149 п.н. повторяющейся последовательности-DYZ1 размером 3,4 т.п.н., . расположенной в гетерохроматиновой области длинного плеча Y-хромосомы. Данный повтор имеет 800-1500 копий на Y-хромосоме. Праймеры Y3 и Y4 фланкируют локус в 170 п.н. альфоидного повтора DYZ3 размером 5,5 т....н., расположенного в перицентромерной области Y-хромосомы • в количестве 100 копий. Праймеры XI и tZ ограничивают локус в 130 п.н. альфоидного повтора размером 2 •т.п.н., расположенного в перицентромерной области Х-хромосомы в количестве 5000 копий.

В результате проведенных исследований мы пришли к заключению о необходимости использования по крайней мере двух пар праймеров к различным участкам Y-хромосомы для повышения достоверности исследования и избежания, ошибок вследствии хромосомных нарушений. Определение пола с использованием праймеров Y1 и Y2 имеет определенные ограничения, т.к. у некоторых нормальных фертилышх мужчин эта область Y-хромосомы отсутствует, она может быть обнаружена как транслокация у одной из 3000 нормальных женщин. * Таким образом, диагностика пола только на основе амплификации

этого участка, может привести в отдельных случаях к ошибочным результатам.

Избежать ошибок позволяет амплификация альфоидного повтора на У-хромосоме с помощью праймеров УЗ и У4. Это объясняется тем, что альфоидный сателлит буйэ имеет значительную хромосомную специфичность и расположен в перицентромерной области У-хромосомы. Кроме того, число копий повтора в количестве 100 несколько уменьшает чувствительность системы к загрязнению посторонними единичными клетками.

Для пренатальной диагностики нола на исследование были представлены образцы хорионов, отобранные у 11 плодов в возрасте 8-10 недель. После выделения из них ДНК, первоначально проводили амплификацию повтора на Х-хромосоме с праймерами Х1 и Х2 с целью проверки пригодности образцов ДНК хорионов для проведения ПЦР.

Результаты, полученные на основе амплификации, контролировали традиционным цитогенетическим методом с определением пола по кариотипу (табл.6).• Методом амплификации .определено, что хорионы 2, Б, 9, 11 отобраны от плодов мужского пола, а хорионы 1, 3, 4,

6, 8, 10 - от плодов женского пола. Положительный результат амплификации с праймерами У1 и ^г2 и отрицательный с праймерами УЗ и У4 из ДНК хориона 7 в силу изложенных выше причин позволяют отнести плод к женскому полу. Цитогенетическим методом мужской пол диагностирован в образцах 2 и 5, женский - в образцах 1,3, 4, 6,

7, 8, 9. В образцах 10 и 11 определить пол по кариотипу не удалось в связи с плохим качеством исходного материала. Ошибочный результат определения пола с. помощью амплификации в образце 9-объясняется, по-видимому, загрязнением ДНК хориона посторонней ДНК человека мужского пола. • . *

7. Популяционные исследования.

7.1. Распределение частот аллелей и генотипов гена НЬА-1ХгЛ1.

Распределение частот встречаемости аллелей гена НЬА-С0А1 в двух славянских популяциях показано на рис.2. В русской популяции выявлены все возможные генотипы, число которых составляет 21. В белорусской популяции отмечено 13 генотипов. Данные о распределении генотипов гена Н1й-боа1 в двух славянских популяциях представлены в табл.7.

Образец Амплификация фрагмента Опредехошю пола

149 п.н. 170 п.н. 130 п.н. . ПЦР кариотип

(У1, У2) (УЗ, У4) (Х1, Х2)

1 - + ж • ж

2 + + + м м

3 - - + Ж ж

4 - - + Ж ж

5 + + + м . м

6 - - + Ж ж

7 + - + 7 (Ж) ж

8 - - + ж ж

9 + + + м м

10 - - + ж -

11 + + + м -

Примечание. Ж - женский пол, М - мужской пол.

г«(

т

■Л? №

р

I

№ ц-л

А'А

0101 о

Гг..В»

ы

¿я е$

ое}г\1

«Л

[а Щ

ш

иа

И £1

1 ! »а !___

02 <ни;

с*

т

I.. д

ж

£

___]

0-101

020! 0301

Рис. 2. Распределение частот встречаемости аллелей гена ШлА-ЩА1 в русской и белорусской (□) популяциях.

Количество генотипов / Частота генотипов

Русские Белорусы

Генотип Наблюдаемая Ожидаемая Наблюдаемая Ожидаемая

*0101/*0101 1/0,008 2,2/0,018 0/0,000 1 ,6/0,023

»0101/*0102 3/0,025 2,3/0,019 2/0,029 1 ,7/0,024

»0101 /*0103 7/0,058 7,3/0,061 5/0,071 3 ,4/0,049

*0101 / »0201 3/0,025 3,3/0,028 • 3/0,043 2 ,3/0,032

*0101/*0301 9/0,075 6,1/0,051 5/0,071 4 ,4/0,062

»0101 /*0401 8/0,067 8,7/0,072 6/0,086 6 ,2/0,088

*0102/#0102 1/0,008 0,6/0,005 0/0,000 0 ,4/0,006

*0102/*0103 3/0,025 3,9/0,033 2/0,029 1 ,8/0,026

»0102/*0201 2/0,017 0,9/0,015 1/0,014 1 ,2/0,017

»0102Л0301 Э/0,025 3,3/0,027 2/0,029 2 ,3/0,033

*0102/*0401 4/0,033 4,6/0,039 4/0,057 3' ,2/0,046

*0103/*0103 2/0,017 6,3/0,052 1/0,014 1 ,9/0,027

*0103/*0201 6/0,050 5,7/0,048 3/0,043 2 ,5/0,035

*0103/*0301 12/0,100 10,6/0,088 4/0,057 4 ,8/0,068

*0103/*0401 23/0,192 14,9/0,124 7/0.100 6 ,7/0,096

*0201/*0201 2/0,017 1,3/0,011 1/0,014 0 ,8/0,012

*0201/#0301 4/0,033 4,8/0,040 2/0,029 3 ,1/0,044

♦0201/*0401 6/0,050 6,8/0,056 4/0,057 4 ,4/0,063

*0301/*0301 2/0,017 4,4/0,037 1/0,014 3 ,0/0,043

*0301/*0401 14/0,117 12,5/0,104 14/0,200 8 ,5/0,121

*0401/*0401 5/0,042 8,8/0,073 3/0,043 6 ,0/0,086

7.2. Распределение частот аллелей и генотипов локуса АРОВ.

В двух славянских популяциях показано существование 13 аллелей локуса АРОВ длиной от 541 до 901 п.н. Нами для обозначения аллелей -локуса АРОВ, а также других локусов С тандемными повторами использована номенклатура, основанная на числе .повторяющихся единиц. Эта система представляется более удобной, т.к. позволяет проводить сравнение результатов, полученных в разных лабораториях и для разных популяций. В . белорусской популяции впервые обнаружена аллель "53" размером 901 п.н., не выявленная ранее в других европейских популяциях. Профили аллельных частот локуса АРОВ для русской и белорусской популяций приведены на рис.За. Выявлено 36 генотипов в русской популяции, среди которых 8 вариантов - гомозиготные. В белорусской популяции обнаружено 34 генотипа, в.т.ч. Б^гомозиготных.' Данные о распределении генотипов локуса АРОВ в двух славянских популяциях представлены в табл.8.

Количество генотипов / Частота генотипов

Русские Белорус"«

Генотип Наблюдаемая Ожидаемая Наблюдаемая Ожидаемая

»29«- ■"35" 2/0,016 1,4/0,012 -

«29«- .«ЗУ « 3/0,025 2,5/0,021 1/0,014 0,3/0,005

«29 «- •"41" ' 1/0,008 0,6/0,005 - -

"29"- .»45» 1/0,008 . 0,2/0,002 -

"31 "- "31" 1/0,000 0,1/0,001 - * —

"31 "- "35" 1/0,008 1,6/0,014 '1/0,014 0,9/0,012

"31 "- .«37 « 2/0,016 2,8/0,024 1/0,014 1,6/0,023

"31 "- .«39« - - 1/0,014 0,7/0,010

"31 "- "41" 1/0,008 0,7/0,006 - -

"31 "47" 2/0,016 0,4/0,003 - -

"31 "- »49» - - 1/0,014 0,3/0,005

"31 "- "51" - - 1/0,014 0,3/0,004

нЭЭн_ .«33« 1/0,008 0,1/0,001 - -

"33"- "35" - - 4/0,057 1,4/0,020

»ЗЗ». .«37« 4/0,033 2,5/0,021 2/0,029 2,6/0,037

"33 .«39« - - 1/0,014 1,2/0,017

"33 "- "41" ' - - 1/0,014 0,5/0,007

"33 "- .»49» 1/0,008 0,3/0,003 5,0/0,042' - -

"35"- "35" 9/0,075 2/0,029 2,1/0,029

"35"- ,ti 37 к 20/0,167 17,5/0,146 11/0,157 7,7/0,110

"35"- .«39« 2/0,016 3,7/0,031 •■ - - •

"35"- »41» 3/0,025 4,3/0,036 - -

. «35". "43" - - 1/0,014 0,3/0,005

"35"- "45" 1/0,008 1,6/0,014 2/0,029 0,7/0,010

"35"- •"47" 2/0,016 2,5/0,020. - -

,"35"- "53" - - 1/0,014 0,2/0,002

«37«_ .«37 « 16/0,133 4 15,4/0,128 ' 5/0,071 7,2/0,103

« 37 «_ .«39 " 2/0,017 ' 6,4/0,054. 6/0,086 6,4/0,092

"37 «_ "41!' 2/0,016 7,6/0,063 5/0,071 2,9/0,041

и 37 м- "43" - ■ - 1/0,014 0,6/0,009

«37«_ "45" 5/0,042 2,8/0,024 1/0,014 1,3/0,019

"37"- "47" 5/0,042 4,3/0,036- 2/0,029 1,6/0,023

м37 «_ »49» 5/0,042 6,0/0,033 3/0,043 2,9/0,041

"51" • 6/0,050 4,3/0,036" ' 2/0,029 2,3/0,032

«39«_ .»»29» 5/0,042 0,7/0,006 3/0,043 1,4/0,021

"39»»« "41" - - 2/0,029 1,3/0,018

«39«-. .»43» 1/0,008 ' 0,1/0,001 - -

«»39 "45" - - 1/0,014 0,6/0,008

1139.1« "47" - - 1/0,014 0,7/0,010

«39«- •»49» 2/0,016 0,8/0,007 1/0,014 1,3/0,018

"51" 1/0,008 0,9/0,008 1/0,014 1,0/0,014

"41 "41" 5/0,042 0,9/0,008 - ' -

"41 "45" 1/0,008 0,4/0,003 - -

«41 «_ "47" 2/0,016 1,1/0,009 - -

"41 »49 » 1/0,008 1,0/0,008 1/0,014 0,6/0,008

• "47м- »49» - - 1/0,014 0,3/0,005

"47 м- "51" 1/0,008 0,6/0,005 1/0.014 0,3/0,004

"49"- »49» 1/0,008 0,3/0,002 1/0,014 . 0,3/0,004

7.3. Распределение частот аллелей и генотипов локуса D17S5 (D17S30).

Показано существование 13 аллелей локуса D17S5 длиной от 170 до 940 п.н. в двух славянских популяциях. Профили аллельных частот локуса D17S5 для русской и белорусской популяций приведены на рис.30. Выявлено 36 генотипов, среди которых 8 гомозиготных вариантов, в русской популяции и 27 генотипов, в т.ч. 5 гомозиготных вариантов, в белорусской популяции. Данные о распределении генотипов локуса D17S5 в двух славянских популяциях представлены в табл.9.

7.4. Распределение частот аллелей и генотипов локуса IGHJ.

В двух славянских популяциях показано существование 7 аллелей локуса ighj длиной от 470 до 920 п.н. Аллель "13" размером 720 п.н. обнаружена нами впервые и не была ранее отмечена в других работах по исследованию полиморфизма этого локуса. Профили аллельных частот локуса ighj да^я русской и белорусской популяций приведены на рис.Зв. В русской популяции выявлено 19 генотипов, среди которых 5 гомозиготных вариантов. В белорусской популяции отмечено 15 .генотипов, в т.ч. 2 гомозиготных, варианта. Данные .о распределении генотипов локуса ighj в двух славянских популяциях представлены в табл.10. ■

7.5. Распределение частот аллелей и генотипов локуса D1S80.

В локусе D1S80 в -двух славянских популяциях выявлено 17 аллелей длиной от 414 до 670 п.н. Профили аллельных частот локуса D1S80 для русской и белорусской популяций приведены на рис.Зг. В русской популяции выявлено 47 генотипов, среди которых 10 гомозиготных вариантов. В белорусской популяции отмечен 41 генотип, в т.ч. 5 гомозиготных вариантов. Данные о распределении генотипов локуса D1S80 в двух славянских популяциях представлены в табл.11. ,

Количество генотипов / Частота генотипов

Тусские Белорус ы

Генотип Наблюдаемая Ожидаемая Наблюдаемая Ожидаемая

и«! "_"'] и 1/0,008 0,1/0,001 - -

и-j "~"2м - - 1/0,014 0,5/0,007

«11 ii_N3" - - 2/0,029 1,0/0,015

и■) 11 — 11411 4/0,033 2,8/0,023 2/0,029 1,7/0,024

"1 » — "¿Ii 1/0,008 0,5/0,004 - -

ii2»-»2" 2/0,016 1,1/0,009 2/0,029 0,6/0,009

Mg" — 2/0,016 3,2/0,027 3/0,043 2,7/0,039

н2<'-«4" 11/0,092 8,5/0,071 3/0,043 4,3/0,061

«2м—И6П . 1/0,008 1,4/0,012 1/0,014 0,6/0,008

"2м—"7й - - 1/0,014 0,2/0,003

«2"-м9" ' 3/0,025 1,8/0,015 — -

«2 "_ ||*| о" 1/0,008 1,8/0,015 — -

ii^it—ii*jn 4/0,033 2,6/0,022 4/0,057 3,0/0,043

14/0,117 13,7/0,114 13/0,186 9,5/0,136

4/0,033 2,4/0,020 2/0,029 3.7/0,053

»^Н —"gll • 1/0,016 2,4/0,020 - -

"^п—ндн 3/0, ,02 5 2,8/0,023 - -

•i'IO" 3/0,025 2,8/0,023 - -

- - 1/0,014 0,2/0,003

21/0,175 18,0/0,150 9/0,129 7,6/0,108

2/0,016 6,2/0,052 7/0,100 5,9/0,085

"4м-"6" 5/0,042 6,2/0,052 - -

"4»_"7н 2/0,016 1,1/0,009 - 1

м4м-"8" 2/0,016 3,1/0,026 1/0,014 2,3/0,033.

"4"—иди 5/0,042 7,3/0,061 - -

"4"_"-]0" 7/0,058 7,3/0,061 2/0,029 2,6/0,038

3/0,025 Ъ,5/0,005 2/0,029 1,2/0,017

"5»_ii6" 1/0,008 ... 1,1/0,009 1/0,014 0,8/0,011

ti(jit_"gii 1/0,008 0,5/0,004 1/0,014 0,9/0,013

м^"—"ди 2/0,016 1,3/0,011 1/0,014 0,7/0,009

"5"-"10м - - 2/0,029 1,0/0,015

м6"-"6" • 2/0,016 0,5/0,005 - -

"5й—«у» _ - 1/0,014 0,1/0,001

2/0,016 0,5/0,004 1/0,014 0,3/0,004

1/0,008 1,3/0,011 - -

«6"-"10" " - - 2/0,029 0,3/0,005

ну"-иди 1/0,008 0,1/0,001 - -

IIQ"_ид» 1/0,008 0,6/0,005 . 2/0,029 0,3/0,004

м8"-"10" 1/0,008 0,6/0,005 2/0,029 0,4/0,006

иди—"gii . 1/0,008 0,8/0,006 1/0,014 0,3/0,004

ligtl —Q" 1/0,008 1,5/0,013 - -

gii 1/0,008 0,1/0,001 -

"10"-"10" 3/0,025 0,8/0,006 - —

- 18

Таблица' 10. Наблюдаемые и ожидаемые частоты генотипов локуса 1сш у неродственных индивидов в русской и белорусской популяциях

Количество генотипов / Частота генотипов

Русские Белорусы

Генотип Наблюдаемая Ожидаемая Наблюдаемая. Ожидаемая

"8"- "8" 2/0,016 ' 1,8/0,015 - _

и 5/0,042 ' 2,1/0,017 1/0,014 0,7/0,010

"8"-- "10" ' 13/0,100 11,2/0,094 2/0,029 3,5/0,051

"8"- "12" 6/0,05 8,8/0,074 5/0,071 2,8/0,040

"8"- "13" ■ 1/0,008 1,3/0,011 - -

пдп_ ид н 2/0,016 0,6/0,005 - -

ngii_ "10" 1/0,008 6,6/0,055 3/0,043 5,3/0,076

нд il- "124 5/0,042 5,2/0,043 7/0,100 4,2/0,060

licit.. "13" 2/0,016 0,8/0,007 1/0,014 0,3/0,004

"10" -"10" 19/0,158 18,0/0,150 13/0,186 13,8/0,196

"10" -"12" 26/0,217 28,2/0,235 27/0,386 21,7/0,310

"10" -"13" 5/0,042 4,3/0,036 1/0,014 1,3/0,019

л10" -"16" 9/0,075 5.8/0,048 2/0,029 1,8/0,026

"10" -"17" . 1/0,008 0,7/0,006 1/0,014 0,9/0,012

"12" -"12" 15/0,125 11,1/0,092 3/0,043 . 8,6/0,123

«12" -"13" 1/0,008 3,4/0,028 1/0,014 1,0/0,015

"12" -"16" 5/0,042 4,5/0,038 2/0,029 1,4/0,020

"12" -"17" - - 1/0,014 0,7/0,010

"13" -"13" 1/0,008 0,3/0,002 - ' —

"16" -"17" 1/0,008 0,1/0,001 - -

7.6. Анализ.результатов популяционных исследований.

К настоящему времени описано большое количество гипервариабельных локусов, однако данные . о популяционных исследованиях с использованием таких локусов стали появляться 'только в последнее время. Высокая гетерозиготность и большое число аллелей создают определенные проблемы в статистической интерпретации популяционных данных. Статистичеошй анализ • распределения частот встречаемости ' аллелей и генотипов таких локусов состоит из:

1) анализ распределения частот аллелей и генотипов в каждом локусе ■ на предмет их соответствия закону Харди-Вайнберга,

2) исследование наблюдаемых и ожидаемых значений гетерозиготности,

3) выявление возможных причин формы распределения частот встречаемости аллелей локуса в популяции.

Для . определения соответствия полиморфизма локусов закону Харди-Вайнберга была разработана компьютерная программа, которая

Количество генотипов / Частота генотипов .

Русские Белорусы

Генотип Наблюдаемая Ожидаемая Наблюдаемая Ожидаемая

!<•] 7 » — "25" _ _ 1/0,014 0,1/0,002

"18"- "18" 11/0,092 10,2/0,085 2/0,029 1,9/0,027

"18"- идм 1/0,008 1,5/0,012 - -

"18"- "21" 3/0,025 1,8/0,015 - -

"18"- «22 " 2/0,016 2,3/0,019 - -

"18"- "24" 25/0,208 21,0/0,175 11/0,157 7,4/0,105

"18"- "25" 3/0,025 3,5/0,029 3/0,043 3,3/0,047

"18"- "26" 1/0,008 2,0/0,017 - -

"18"- "27 м - - 1/0,014 0,5/0,007

"18"- «28» . 4/0,033 2,9/0,025 1/0,014 '1 ,0/0,014

"18"- «29 м 1/0,008 2,3/0,019 2/0,029 1,2/0,016

"18"- "31" ' 8/0,067 4,4/0,036 1/0,014 1,0/0,014

"20" 1/0,008 0,1/0,001 - -

м -J g it _ "21" . 1/0,008 0,2/0,002 — -

и-] gti_ "24" 1/0,008 1,5/0,013 1/0,014 0,3/0,005

"19"- "29м 1/0;008 0,2/0,001 - -

"20"- "21" 1/0,008 0,3/0,002 - -

"20"- "22м - ' - - -

"20"- "23 " 1/0;008 0,4/0,003 . -

"20"- "24" 2/0,016 3,0/0,025 1/0,014 0,3/0.005

"20"- "25" 1/0,008 0,5/0,004 - -

"20"- "26" - - - -

"21 "- "22 " 1/0,008 0,2/0,002 1/0,014 0,2/0,003

"21"- "23 м 2/0,016 0,2/0,002 1/0,014 , 0,2/0,002 •

"21"- "24" .1/0,008 1,8/0,015 1/0,014 1,3/0,019

»21 и— "26"..„ - - 1/0,014 0,2/0,002 "

"21 »»29м 1/0,008 0,2/0,002 - -

"22 и— «»22 м 1/0,008 ®0,1/0,001 1/0,014 0,2/0,003

"22 н— "24" 1/0,008 .. 2,4/0,020 1/0,014 2,3/0,032

"22 "25" - - 1/0,014 1,0/0,014

"22 м— "27 м 1/0,008 " 0,2/0,001 - -

«22м- «29 « 1/0,008 0,3/0,002 — -

"22""* «30м - - 1/0,014 0,1/0,001

"22м— "31 м - 1/0,014 0,3/0,004

"23м— "23м 1/0,008 0,2/0,001 - -

"23 м— "24м 2/0,016 2,7/0,022 * - -

«23 "25 м ' 1/0,008 0,4/0,004 1/0,014 0,7/0,010

•'23 м— "28" 1/0,008 0,4/0,003 1/0,014 0,2/0,003

Н23М- "29 м - - . 1/0,014 .0,3/0,004

«2зи— "32 " _ - 1/0,014 0,1/0,002

"24"- "24" 14/0,117 10,8/0,090 8/0,114 7,2/0,103

"24"- "25" 1/0,008 3,6/0,03 5/0,071 6,4/0,092

"24"- "26" 2/0,016 2,1/0,017 - -

"24"- »27 и 2/0,016' 1,5/0,013 1/0,014 0,9/0,014

"24"- "28" 2/0,016 3,0/0,025 2/0,029 1,9/0,028

"24"- .1129" 1/0,008 2,4/0,020 1/0,014 2,3/0,030

»24"- "30" 1/0,008 0,3/0,002 1/0,014 0,6/0,009

»24"- "31 " 3/0,025 4,5/0,037 2/0,029 1,9/0,028

"24"- 1132 и - - 1/0,014 0,9/0,014

»24"- "33" - - 1/0,014 0,3/0,005

"25"- "25" 2/0,016 . 0,3/0,003 3/0,043 1,4/0,021

"25"- "26" 1/0,008 0,4/0,003 1/0,014 0,7/0,010

"25"- 1125ц - - 1/0,014 1,0/0,014

"25"- "31" 1/0,008 0,7/0,006 - -

"25"- "32" - - 1/0,014 0,4/0,006

"26"- "26" 1/0,008 0,1/0,001 - -

"26"- "27 " - - 1/0,014 0,1/0,002

"26"- "28" - - 1/0,014 0,2/0,003

"26"- "29" 1/0,008 0,2/0,002 - -

"26"- "31" - 1/0,014 0,2/0,003

"27"- "27" '1/0,008 0,1/0,001 - -

"20"- "28" 1/0,008 0,2/0,002 - -

"28"- "31" - - 1/0,014 0,3/0,004

"28"- 1132» 1/0,008 0,1/0,001 - -

"29"- "29" 1/0,008 0,1/0,001 1/0,014 0,2/0,003

"31"- "31 " 1/0,008 0,5/0,004 - -

»31"- ч >32 " 1/0,008 0,1/0,001 - -

предназначена для мультиаллельных локусов с кодоминантными аллелями. С ее помощью можно получить оценки частот встречаемости аллелей, проверить соответствие наблюдаемого распределения генотипов и наблюдаемого значения гетерозиготности ожидаемым показателям на основании закона Харди-Вайнберга. В программе все данные о частотах генотипов группируются в три класса: 1) гомозиготы по наличию данной аллели, 2) гетерозиготы с данной аллелью, 3)' оппозитныо гомозиготы (отсутствие данной аллели). На основе этих данных вычисляли математическое ожидание различных групп генотипов, критерий %2 для каждой аллели и соответствие ■ наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности. Шло статистически показано, что распределение частот встречаемости аллелей и генотипов гена ША-Б0А1 и исследованных локусов в двух славянских популяциях соответствует закону Харди-Вайнберга. Следовательно, аллели ассоциируются одна с другой случайно и эти частоты могут быть взяты за основу в популяционной генетике, семейном анализе и идентификации личности в судебной медицине. Наблюдаемые .и ожидаемые значения гетерозиготности, приведенные в табл.12, также соответствуют равновесию Харди-Вайнберга.

Для всех, исследованных гипервариабельных локусов наблюдаемая гетерозиготность меньше, ожщгёемой (кроме локуса IGHJ в белорусской популяции), что по ряду оценок может говорить о гетерогенности

0.0'

щ Л ЯП

, Зп 1!

29 31 33 35 37 39 4-1 43 45 47 49 51 53

Рис. За. Распределение частот встречаемости аллелей локуса АРОВ в русской и белорусской (□) популяциях.

0.2

0.1

0.0

-1--1--Г

Б1755 '

П '

М-, п

в и i у , .

6 7 8 9 Ю 11 1й

Рис. 36. Распределение частот встречаемости аллелей локуса В17Б5 в русской (0) и белорусской (О) популяциях.

0.5

Л

П 2

0 .Г

0.0

Рис. Зв. Распределение частот встречаемости аллелей локуса 1Ии в русской и белорусской (□) популяциях.

О 4

0.3

0.2 -

0.1

С.Г

17 18 1Й 20 21 22 28- 24 25 26.27 26 24> ЙО 31 32 3:)

'Рис. Зг. Распределение частот встречаемости аллелей докуса ШБ80 в русской (Щ) и белорусской (□) популяциях.

Русские ' Белорусы

Локус НоЪ Нех х2 Р . Н0Ъ ех X2 Р

DQA1 0,892 0,807 1,154 >,05 0,914 0,810 1,055 >,05

АРОВ 0,667 0,809 2,875 >,05 0,829 0,836 ' 0,001 >,05

D17S5 0,692 0,800 1,564 >,05 0,743 0,832 0,430 >,05

IGHJ 0,675 0,735 0,526 >,05 0,771 0,674 1,091 >,05

D1S80 0,717 0,802 1 ,087 >,05 0,786 0,840 1 ,037 >,05

HQb - наблюдаемая гетерозиготность; нех - ожидаемая гетерозиготность.

• популяции. В качестве основной причины этого факта мы считаем малый размер исследуемой выборки случайных индивидов из популяции. В гене HLA-DQA1 й рассмотренных гипервариабельных локусах почти все аллели имеют низкие частоты встречаемости. Из общего числа выявленных в этой работе аллелей, которое равно 56, только 7 аллелей в русской и 6 аллелей в белорусской популяциях имеют частоты, превышающие 0,250. В связи с этим исследование выборки могут быть просто недостаточны для открытия всех возможных генотипов,- а избыток гом<?зигот будет образовываться за счет большого количества гомозигот наиболее часто встречающихся аллелей. При соблюдейии равновесия Харди-Вайнберга можно подсчитать минимальный размер выборки (табл.13), необходимый для выявления всех возможных генотипов с вероятностью обнаружения всех генотипов в 90%, 95% или 99%:

г, > Тл2 , Г / k2+ 2CÜC (к-1) -к]

n > -k loge L -к (к - 1) -J '

где к - число аллелей в локусе, а - значение доверительного интервала.

Исходя из данных таблицы 13, наблюдаемый избыток гомозигот в этих" локусах можно рассматривать как артефакт малого размера выборки из популяции, а не следствие субструктуры популяции.

В целом, несмотря на отдельные различия, аллели гена HLA-DQA1

НаОлюда- Минимальный размер образца3

емое число ---

Локус аллелей а=о,ю , а=0,05 а=0,01

dqa1 6 151 174 231

аров 14 978 1109 1424

в17б5 . 13 ' 830 945 1 215

ighj 7 210 244 322

d1s80 .17 1497 1693 2152

а. Значения а, равные 0,10, 0,05 и 0,01 представляют доверительный интервал для вероятностей в 90%, 95% и 99%, что в образце представлены все возможные генотипы.

и каждого из исследованных гипервариабельных локусов имеют сходные картины распределения аллельных частот среди различных групп европеоидов. Среди представителей разных рас характер распределения частот аллелей имеет более значительные различия Сложное распределение аллелей показывают гипервариабельные локусы. Бимодальное, распределение частот аллелей выявлено в обоих славянских популяциях в локусах аров и d1"s5 и в белорусской популяции в локусе ighj, а мультимодальное" распределение - в обоих славянских популяциях для локуса D1S80 и в русской популяции в локусе ighj. В других исследованных ' популяциях также можно отметить различный характер распределения аллельных частот: -унимодальный - в .локусе D17S5 у американцев латиноамериканского происхождения;

-бимодальный - в локусе АРОВ и D17S5 в европейских популяция; -мультимодальный - в локусе .АРОВ и D1S80 у американцев европейского, латиноамериканского и африканского происхождения, в локусе D17S5 у американцев африканского происхождения, в локусе ighj в бельгийской популяции.

На наш взгляд наиболее- вероятна гипотеза, которая объясняет распределение частот аллелей исходя из их эволюционной древности.

Возраст аллели может быть предсказан из ее частоты и наиболее часто встречающиеся аллели являются наиболее древними.

Полученные статистические данные о распределении аллелей и генотипов гена ньа-бсш и четырёх гипервариабельных локусов в славянских популяциях создают теоретическую основу для их использования при определении родства в семейном анализе, идентификации личности . и в популяционной генетике. Такая возможность подтверждена исследованиями полиморфизма групп крови и белков в панмиктических (случайно скрещивающихся) популяциях.

8. Семейный анализ на основе различных методов типирования полиморфизма ДНК.

Нами было проведено сравнение различных методов 'семейного анализа с целью определения спорного отцовства с использованием мультилокусного ДНК-зонда и амплификацией четырех гипервариабельных локусов.

В качестве мультилокусного зонда был использован полученный в лаборатории 'молекулярной генетики мозга НЦПЗ РАМН ДНК-зонд Иес1-4, имеющий в качестве кор-последовательности повтор размером 12 п.н. из гена ему вируса нгу-1: ссссатстссасссссатстссас. с использованием этого зонда был проведен анализ 21 случая спорного отцовства. Истинное отцовство было установлено в 18 (85,1%\ случаях и исключено в 3 (14,3%) случаях. Распределение вероятностей отцовства в исследованных 18 семьях с доказанным отцовством приведено в т£КЗл.14.

Использование мультшюкусных зондов позволяет в большинстве случаев проводить позитивную идентификацию отцовства. Тем не менее определенные технические и статистические проблемы затрудняют использование мультшюкусных ДНК-профилей при "исследовании генетической структуры внутри и между популяциями, а также при определении отцовства или материнства в отсутствии одного из родителей. Только в редких случаях возможно отнести рестриктазные фрагменты к какому-либо локусу и таким" образом идентифицировать аллели, определить генотипы и измерить аллельные частоты. Одинаковая миграция негомологичных фрагментов и различия в числе локусов, -представленных в ДНК-профилях, увеличивают проблемы в определении сходства и различия между индивидами.

В 1991 году нами и группой Дк. Кассимана в Бельгии было

предложено использование метода амплификации комплекса повторяющихся последовательностей ДНК для семейного анализа. ПЦР позволяет проводить определение спорного отцовства с использованием малых количеств крови (3 мкл) или слюны. Очень важным преимуществом использования этих локусов является то, что до настоящего времени различными исследовательскими группами в них не выявлены мутации.

Ист>;люе отцовство было установлено в 57 (87,7%) случаях"и исключено 'в 8 (12.3Ж) случаях. Распределение вероятностей отцоБства . в исйледованных 57 семьях с доказанным отцовством приведено е табл.14. В случаях с исключением отцовства было показано, что мужчина,. не являющийся отцом ребенка, обычно исключается в двух локусах, а в двух других локусах результат ноинформативен, т.е. не исключает и не подтверждает отцовства.

Таблица 14. Сравнение вероятностей отцовства . и исключения отцовства, определенных различными методами

Вероятность Вероятность Семьи с установленным

отцовства исключения отцовством

ОТЦОВСТВа Г1ес1.-4 4 УЮТ

>99,99% , • <Ю~4 77,78% 24,56%

99,75-99,99% 10~4- 2,5х10~3 16,67% 40,35%

99,00-99,75% 2,5х10~3- Ю-2 5,-55% . 28,07%

95,00-99,00% >10"2 - 7,02%

Результаты, полученные при проведении семейного анализа, позволяют утверждать, что разработан новый эффективный метод определения отцовства и материнства, который сравним по- своим параметрам с мультилокусным фингерпринтингом ДНК. Типирование еще одного-двух локусов с тандемными повторами позволит достигнуть идентифицирующей способности мультилокусных ДНК-зондов.

1. Проведено типирование аллельного полиморфизма гена ньа-Б0А1 и гипервариабельных локусов генома человека, содержащих тандемные повторы с изменяющимся числом копий на основе амплификации • ,ДНК.' Рассчитана новая эффективная система олиго'нуклеотидных зондов, специфичны? к определенным аллелям гена нм-с0л1. Предложен метод проведения типирования полиморфизма гонов нерадиоактивными зондами, полученным! на основе ферментативного Оиотинилирования олигонуклеотидов с использованием торминальной дезокгашуклеотидилтрансферазы и биотинилированного аналога В1о-11-аитр. В локусах аров и юн.т выявлены аллели, не найденные ранее в других европейских популяциях.

2. Определены частоты встречаемости аллелей гена нЬл-с0а1 и четырех гипервариаОелышх локусов (аров, Ш735, Ю1и, Б1580) в двух славянских популяциях (русская и белорусская) и на основе разработанной компьютерной программы доказано их соответствие

'равновесию Харди-Вайнберга. Полученные результаты по частотам аллелей, генотипов, и значениям гетерозиготности создают теоретическую основу для их использования в. России в семейном анализе, для идентификации личности и в популяционной генетике.

3. Разработан быстрый и эффективный метод определешш пола на основе амплификации повторяющихся последовательностей ДНК,, расположенных на половых хромосомах. Показана возможность его успешного' -• применения при пренаталыюй диагностике половой принадлежности плода человека и при исследовании пятен крови и останков тела в судебной-медицине.

4. Проведено сравнительное исследование различных методов получения профилей ДНК для семейного анализа с целью определения спорного отцовства. Предложен новый метод геномной "дактилоскопии" на основе амплификации гипервариабелышх локусов человека, содержащих- тандемше повторы с изменяющимся числом копий, который позволяет надежно и быстро проводить исследование отцовства и материнства. Он также эффективен для решения многих вопросов, связанных с картированием генома, проблемой генетической изменчивости и для решения фундаментальных проблем популяционной и эволюционной генетики человека.

5. В работе создана комплексная система генетической идентификации личности на основе метода амплификации ДНК. Эта

система может служить в качестве молекулярно-генетического маркера для комплексной биологической идентификации в судебной медицине, которая включает определение пола, генотипирование личности и установление отцовства и материнства. Впервые в нашей стране предложенная в настоящей работе технология типирования полиморфизма ДНК на остове амплификации ДНК использована в судебной медицине для идентификации личности .при расследовании уголовш: лрвступлени',1. \\ определении спорного отцовства.

CiKCOK РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Овчинников И.В., Гаврилов Д.К., Носиков В.В., Дебабов В.Г. "Использование полиморазной цепной реакции для типированип аллелышх вариантов гена hla-dqai человека по гибридизации с

' олигонуклеотидяыми зондами, специфичными к определенным аллелям" Молекулярная биология, т.25, вып.5, стр.1286-1272 (1991).

2. Nosikov V.V., Ovchinnikov I.V., Gavrilov D.K., . Chelnokova 1J.V. "The use of synthetic oligonucleotide primers for amplification of a variable number of tandem repeats loci for paternity testing" liuclelo Acids Res., V.19 (Suppl.), P.219 (1991 ).

3. Gavrilov D.K., Ovchinnikov I.Y., Chelnokova M.V., Nosikov V.V. "The use of synthetic oligonucleotide primers for prenatal diagnosis of вех in chorionic villi via the polymerase chain reaction" Nucleic Acids Res., V.19 (Suppl.).,' P.257 (1991 ).

4. Gavrilov D.K., Ovchinnikov I.Y., Nosikov V.V. "The use of PCR technique and sequence specific oligonucleotides for HLA-DQA1 and DQB1 gene typing in a- group of insulin-dependent diabetes mellitus patients in'the Russian -population of Moscow" Nucleic Acids Res., V.19 (Suppl.)', P.258 (1991 ).

5. Ovchinnikov I.V., Gavrilov D.K., Nosikov V.V., Debaboy V.G. "The use of polymerase chain reaction to analyse allelic variations of HLA-DQ alpha and beta genes" In: Metabolism and Enzymology of Nucleic Acids Including Gene and Protein Engineering. Ed. by J.Balan. Bratislava, P.227-235 (1991).

•6. Nosikov V.V., Gavrilov D.K., Kuraeva T.L., Ovchinniko; I.V., Domuscohiev I.P., Dedov I.I. "Frequencies of alleles of HLA-DQAI and DQB1 genes in a group of insulin-dependent aiabetej

mellitus patients in the Russian population of Moscow" Diabetes Research and Clinical Praotice, V.14 (Suppl.1),- P.45 .(1991).

7. Овчинников И.В., Савельев Ю.И., Калашников А.В., Челнокова М.В., Носиков В.В., Дебабов В.Г.' "Определение половой

• принадлежности "вещественных доказательств биологического происхождения методом ферментативной амплификации ДНК" Судебно-медицинская экспертиза', N 1, стр.30-31 (1993).

8. Овчинников И.В., Савельев Ю.И., Калашников Л.В., Челнокова М.В., Носшсов В.В., Дебабов В.Г. "Типирование полиморфизма гена шл-вдальфа методом ферментативной амплификации для исследования вещественных доказательств биологического происхождения" Судебно-медицинская экспертиза, N г, стр.32-35 (1993).

9. Чистяков Д.А., Гаврилов Д.К., Овчинников И.В., Носиков В.В. "Анализ распределения аллелей, четырех гипервариабельных тандемных повторов среди неродственных представителей русской нации, проживающих в городе Москве, с помощью полимеразной цепной реакции". Молекулярная биология, .т.27, вып.6, стр. 1304-1314 (Î993).'

Ю. Ovchinnikov I.V., Chistyakov D.A., No3ikov V.V., Ovtchinnikova O.I., Chizhov Y.V. "PCR-based determination of HLA-DQA1 and some YHTR allele frequency profiles in east Slavonic, populations .for identity testing" Proceedings' of 13th Meeting of International Association of Forensic Scienoes, Dusseldorf, • in press (1993).

11.Ovchinnikov I.Y., Molaka Y.K., Shlensky A.B. and Rogaev E.I. "Different DNA profiling systems: comparative ' study for paternity testing" In: Advances in Forensic Haemogenetics 5, Springer-Verlag, in ргезз (1994).

12.Nosikov V.V., Ovchinnikov I.V., Gavrilov D.K., Chelnokova M.V. "Genetio analysis of some human VNTR looi by means of the PCR technique for paternity testing" Abstracts of 23d Annual Мзеting of European Sooiety of Human Genetios, Leuven, P.179 (1991).

13.Gavrilov . D.K., Ovchinnikov I.V., Chelnokova M.V., Milanova R.H., Kuraeva T.L., Dedov I.I. and Nosikov V.Y. "Combinations of HLA-DQA1 'and HLA-DQB1 gene alleles in patients with type I (insulin-dependent) diabetes mellitus" Abstracts of 24th Annual Meeting of European Sooiety of Human Genetics. Elsinore, P.75

(1 $92).

14.Rogaev E., Piraenov M., Ovchínnikov I., Perepechina I., Sirokvasheva E., Shlensky A., Korovaitseva 0., Stegnova Т. "DNA вех and paternity testing of tissue remains in oriminai iorensio cases" DNA Fingerprinting, Second. International Conference, Belo Horizonte, P.18 (1992). 15.0vohirmilcov I., Ро.-ИЛоу V.V., Chizhov V.Y. - "Polymorphisms of four ilfferent VNTR loci in the Byelorussian population and'in pat'.. lity testing by PCR technique" DNA Fingerprinting, Second International' Conference, Belo Horizonte (1992).