Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ полиморфизма гена каппа-казеина у представителей подсемейства Bovinae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ полиморфизма гена каппа-казеина у представителей подсемейства Bovinae"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ. Н.И. ВАВИЛОВА

БАДАГУЕВА Юлия Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛЮ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОДСЕМЕЙСТВА В07И1АЕ

(03.00.15. - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканке ученой степени кандидата биологических наук

Р Г Б ОД 2 8 АВГ 1995

на правах рукописи

УДК 575. 174. 015. 3: 636.2

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Сулимова Г.Е.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущее учреждение: кафедра генетики и селекции биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

на заседании диссертационного совета (.дш£.4У.ш; при институте общей генетики им Н.И. Вавилова РАН по адресу: Москва, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН.

Янковский Н.К.

кандидат биологических наук

Капелинская Т.В.

Защита состоится

Автореферат разослан << >>

1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н. Полухина

Актуальность проблемы. За последние несколько лет значительно возрос интерес к изучению полиморфизма гена каппа-казеина (к-казеина), что обусловлено его функциональной и практической значимостью, к-Казеин обеспечивает стабильность мицел-лярной структуры молока, а также является источником биологически-активных ниэкомолекулярных веществ, образующихся при его ферментативном расщеплении. Ген к-казеина относится к кластеру казеиновых генов. Он имеет несколько аллелей и может служить удобным генетическим маркером для изучения генетической дифференциации групп животных. Типирование аллельных вариантов к-казеина имеет практическое значение, т.к. В-аллель обеспечивает более эффективное по сравнению с А-аллелем использование молока в сыроварении. Во многих странах, например в Германии, селекция на В-аллель к-казеина включена в программы по разведению крупного рогатого скота. Присутствие в структуре гена консервативных областей позволяет использовать его для сравнительного изучения видов с применением такого современного метода исследования как полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Несмотря на интенсивное исследование гена к-казеина у крупного рогатого скота, исследования родственных ему видов подсемейства Воугпае практически не проводились. Многие виды, относящиеся к этому подсемейству, широко используются в хозяйственной деятельности человека, в том числе и для получения молока (буйволы, яки). Эти виды интересны для селекционной практики, в частности для создания межвидовых гибридов. Немаловажен и тот факт, что ряд видов подсемейства находится на грани исчезновения и занесен в Красную книгу МСОП (например, зубры). В связи с этим, изучение генетического разнообразия видов, анализ межвидового и внутривидового полиморфизма, генов приобретает особую значимость в плане сохранения генофонда редких видов.

Целью нашей работы было исследование генетического разнообразия к-казеина у родственных видов подсемейства Воу1пае (яки, зубры и буйволы), а также у аборигенной якутской породы крупного рогатого скота.

- 4 -

Были поставлены следующие задачи:

1 - Разработка условий анализа полиморфизма регуляторной и кодирующей областей гена к-казеина на ДНК якутского скота, яков, зубров и буйволов с помощью гетерологичной ПЦР.

2 - Сравнительный анализ уровня полиморфности белок-коди-рующей (зкзон IV) и 5'-нетранслируемой областей гена к-казеина у представителей подсемейства Bovinae.

3 - Исследование аллельного разнообразия гена у крупного рогатого скота и родственных видов подсемейства Bovinae.

4 - Сравнительная характеристика представителей подсемейства Bovinae как по распределению аллелей гена к-казеина, так и по их частотам.

Научная новизна. В работе впервые осуществлено исследование гена k-казеина на уровне полиморфизма ДНК для следующих видов:"яки, зубры и буйволы, а также для якутской породы крупного рогатого скота методом ПЦР-ЦЦРФ. Отмечен высокий уровень консерватизма 5'-нетранслируемой области гена. С помощью ре'ст-рикционного анализа и последующего секвенирования продуктов амплификации экзона IV гена k-казеина выявлены два новых ранее не описанных аллеля: Н-аллель у буйволов и . G-аллель у яков и зубров. Определены нуклеотидные последовательности, отличающие новые аллели от ранее описанных. Впервые показаны меж- и внутривидовые различия исследованных в работе видов как rio встречаемости аллелей гена k-казеина, так и по их частотам.

Практическая ценность. В работе предложен метод тестирования пяти аллельных вариантов гена k-казеина (А, В, F, G и Н) методом ПЦР-ПДРФ для крупного рогатого скота и родственных видов. Метод удобен для быстрого генотипирования животных по данному локусу независимо от пола и возраста и может быть рекомендован для генетико-селекционных исследований. Показанный в работе высокий уровень генетического разнообразия исследованных видов по локусу k-казеина необходимо использовать в программах по межвидовому скрещиванию в целях обогащения генофонда крупного рогатого скота. Результаты работы вносят вклад в исследования филогенетических связей внутри семейства Bovidae (полорогие) и эволюционного происхождения аллелей гена. Данные по полиморфизму гена k-казеина могут быть также использованы при изучении ассоциаций различных аллелей гена с хозяйственно-ценными признаками, а также в качестве учебного материала при подготовке специалистов биологического профиля.

Апробация работы. Материалы-дисертации докладывались на I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров ( Саратов, 1994). Представлены и опубликованы тезисы на 1-ой международной конференции по частной генетике сельскохозяйственных животных (Аскания-Нова, 1992), на 1-ой международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1994), на региональной конференции. "Эколого-генетические исследования в Якутии" (Якутск, 1995). Апробация работы прошла на межлабораторном семинаре "Генетиса животных" ИОГен им. Н.И.Вавилова РАН. По теме диссертации опубликовано б тезисов, 2 статьи и 1 статья сдана в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного анализу структуры и полиморфизма генов казеинов; методической части; результатов исследования; обсуждения; выводов и списка литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на якутской породе крупного рогатого скота, яках, буйволах, зубрах двух линий (беловежская и кавказско-беловежская). Кроме того, в исследование были включ-неы отдельные представители горных зубров, бизонов, зубробизонов и гибридов як/якутский скот.

Выделение ДНК и злектрофоретический анализ проводили по стандартным методикам ( Маниатис и др., 1984).

Рестрикцию ДНК эндонуклеазами осуществляли при оптимальных для каждого фермента условиях: температуре и буфере. Электрофорез проводили в 2%-ном агарозном геле или в 6Х-нам полиакри-ламидном геле в трис-боратном буфере (Маниатис и др., 1984).

Полимеразную цепную реакцию проводили по БаНа еЬ а1. (1988), с модификациями.

Секвенирование продуктов амплификации проводили по методу Сэнгера в НПФ "Праймер".

Для подбора праймеров и выбора оптимальных условий поли-меразной цепной реакции использовали компьютерные программы "01^о" и "Тори1. Построение филогенетических деревьев осуществляли с помощью программы "Уоз^гг 6.0", разработанной в ИЦиГ СО РАН, г.Новосибирск.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ П0ЛИМЕРАЗН0Й ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

Для исследования были выбраны две фукционалъно различные области гена к-казеина: 5'-нетранслируемая область и фрагмент белок-кодирующей области (экзон IV), в которой локализованы нуклеотидные замены, приводящие к образованию сайтов рестрикции для нескольких рестриктаз и аминокислотным заменам, определяющим аллельные варианты гена.

Праймеры, используемые в работе: наименование последовательность локализация

праймера 5*-3' 5'-конца в

гене к-казеина ЗвЕ ТАТСАТТТАТ60ССАТТССАССА +10809.

Б(30 СТТСТТТйАТБТСТССТТАБАВТТ +11036

к1 ббСТБТААТТСТАВАААСАШ -449

кг гсАСТсгготтазсАатАоа +50

В результате проведенных экспериментов были подобраны оптимальные условия для амплификации б'-нетранслируемой области и экзона IV гена к-казеина (таблица 1).

таблица 1.

А | отжиг | синтез | плавление ||

|| праймеры 1.1 I II

1 1мин 1 1 мин I | мин I 1

л

1 БвЕ - ББО (1,3 56°С | 1,3 72°С| 1,0 90°С|

||--1-1-1-.-1|

| к1 - к2 |1,3 53°С | 1,2 72°СГ 0,9 91°С|

Так как подобранные праймеры гомологичны высококонсервативным участкам гена к-казеина, было обоснованным предположить, что данные праймеры и подобранные для них условия прове-

дения ЩР можно использовать для' амплификации ДНК родственных видов животных, нуклеотидная последовательность генов казеинов которых еще не расшифрована.

2. ЩР-ПДРФ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА 5'-НЕТРАНСЛИРУЕМОЙ .

ОБЛАСТИ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА.

При описанных вше условиях проведена амплификация участка 5'-нетранслируемой области гена к-казеина у представителей исследуемых видов подсемейства Bovinae (якутского скота, яков, зубров и. буйволов). При амплификации на всех образцах ДНК получен один фрагмент, размер которого у всех исследованных животных был одинаков и соответствовал ожидаемому (499нп), что указывает на отсутствие делеций или инсерций в данном участке гена.

Рестрикционный анализ амплифицироваяного участка с помощью зндонуклеаз рестрикции Alul и Bglll выявил одинаковую картину рестрикции: у всех исследованных образцов присутствуют сайты рестрикции Alul в положении -311 и +4?, а также сайт рестрикции Bglll в положении -110, как это и следовало из данных по нуклеотидной последовательности гена k-казеина коровы. Таким образом, ПЦР-ГДРФ анализ 5'-нетранслируемой области гена к-ка-зеина продемонстрировал отсутствие полиморфизма по сайтам рестрикции Alul и Bglll, что указывает на высокий консерватизм данной области гена в подсемействе Bovinae.

3. АМПЛИФИКАЦИЯ УЧАСТКА ЭКЗОНА IV ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА.

Была проведена амплификация участка гена k-казеина на ДНК якутского скота, яков, гибридов яков с якутским скотом, буйволов, зубров, бизонов и зубробизонов. При амплификации ДНК исследованных животных был получен один фрагмент, размер которого соответствует теоретическим расчетам и в каждом эксперименте одинаков для всех образцов, что свидетельствует об отсутствии каких-либо заметных делеций или вставок в данном участке гена.

Однако, имелись животные, ДНК которых не амплифицировалась с праймерами SGE и SG0 (таблица 2).

таблица 2.

Л---"I ■ Г -1 " 11

¡ | изучено | амплифици-1 не ампли- !|

| | всего | ровались | фицир. ||

II I п | п % I . п X ||

i беловежские I I I I

II зубры | 29 | 24 82,7 | 5 17,2 ||

|------1--:--|

|| кавказско-бело-1 | | ||

| вежские зубры | 17 | 14 82,4 | 3 17,6 ¡

I-1-ь—-н—--1

|| горные зубры | 2 | - - | 2 100,ОН

I I-1-1-1-i

|| бизоны I 3 I - - | 3 100,05

II-:-1-1--1-II

| зубробизоны I 2 | - - ¡ 2 100,0||

II-1-=-Н-1-1

1 якутский скот I 38 ¡30 78,9 | 8 21,1 |

I!-;-1-1-:-1-i

I яки' I 20 | 20 100,01 - - II

J--| -Н-1-—fl

I гибриды i | | II ■¡як/якутский скот| 2 I 2 100,01 - - ||

I I-1-1-:-1-II

I буйволы I б I 6 100,0| - - II

Известно, что отсутствие амплификации может наблюдаться при несовпадении 3'-концевого или ближайшего к нему нуклеотида в последовательностях, комплементарных праймерам (Багкаг е1 а1., 1990). Можно предположить, что в нашем случае отсутствие амплификации также обусловлено этой причиной, а не является артефактом, поскольку те же образцы ДНК давали эффективную амплификацию с другими парами праймеров.

4. РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ УЧАСТКА ЭКЗОНА IV ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА.

Для рестрикционного анализа данной области использовали четыре зндонуклеазы (TaqI, Hinfl, Hind III и PstI), сайты рестрикции которых присутствуют в последовательностях разных ал-лельных вариантов гена. Применение нескольких рестриктаз позволяет максимально полно изучить полиморфизм данной области гена. •

4.1. ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА КАША-КАЗЕИНА У ЯКУТСКОГО СКОТА.

При исследовании животных якутской породы крупного рогатого скота, наряду с А- и В- аллелями ( частота 80,ОХ и 13,3%, соответственно), был выявлен редкий аллель к-казеина - F-ал-лель с частотой 6,77*. Согласно нуклеотвдной последовательности этого аллеля (Сулимова и др., 1992), в F-аллеле отсутствуют сайты рестрикции TaqI и HindIII и присутствует сайт рестрикции PstI (как в А-ад деде), но в отличие от А-аллеля нет сайта рестрикции Hinfl, что позволяет тестировать его с помощью ПЦР-ГЗДРФ.

У животных якутской породы преобладает А-аллель к-казеина, что характерно для многих пород крупного рогатого скота: черно-пестрой (частота А-аллеля 73,7%), холмогорской (80,6%), голштинского скота (77,8%) (Уханов и др., 1993). Наличие у якутского скота редкого аллеля F согласуется с наблюдением о том, что локальные аборигенные породы характеризуются повышенной и более своеобразной генетической изменчивостью, наличием редких аллельных вариантов. Якутский скот значительно отличается от других пород крупного рогатого скота и выделяется в отдельный подвид Bos taurus turano-mongolicus. Эта порода формировалась в суровых климатических условиях, что не исключает роли адаптивных процессов в формировании профиля частот генов. Для якутского скота наблюдалось отклонение от распределения частот по Харди-Вайнбергу: Xz=29,42, df=3.

- 10 -

4.2. ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У БУЙВОЛОВ.

Бри изучении полиморфизма гена к-казеина у буйволов был обнаружен новый вариант рестрикционного полиморфизма, обозначенный нами как Н-аллель. Он имеет сайт рестрикции Hindi II (как В-аллель), но в отличие от В-аллеля не имеет сайта рестрикции TaqI. H-аллель не имеет также сайта рестрикции Pstl. Поскольку такой вариант полиморфизма ранее не был описан, было проведено секвенирование продуктов амплификации, полученных на ДНК буйволов (рис. 1).

+10809

5*- Ser РЪе Mat Ala Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gin Asp Lys А-аллелъ ТА ТСА ТТТ АТ6 GCC ATT CCA CCA AAG AAA ААТ CAG GAT AAA Н-аллель --------—---------—------------------

Thr eau Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro

А-аллель АСА GAA АТС CCT ACC АТС ААТ ACС ATT GCT AGT GGC GAG CCT

Н-аллель 136 ----T---- Val Val

Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val Glu Ser Thr Val Ala

А-аллель АСА ACT ACA CCT ACC ACC GAA GCA GTA GAG AGG ACT СТА GCT

Н-аллель 148 A------AIle Asn

Thr Leu Glu Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu

А-аллель ACT СТА GAA GAT TCT CCA GAA GTT ATT GAG AGC CCA CCT GAG

Н-аллель --- -------C- —С T— — --- --------X CT-------

Ala Ser Ser Ser 167 Val

Не Asn Thr Val Gin Val Thr Ser Thr Ala Val Term

А-аллель АТС AAC ACA GT6 CAA GTT ACT ТСА ACT GCA GTC TAA AAACTCT

Н-аллель -с- Thr -------CAla --- --- —. --- —С -ТС --- Thr Val +11036

Рис. 1. Нуклеотидная последовательность фрагмента экзона IV гена k-казеина буйвола ( Н-аллель) в сравнении с А-аллелем k-казеина коровы.

Определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации ДНК буйвола подтвердило, что 148-й кодон Н-аллеля соответствует таковому у В-аллеля, а 136-й кодон идентичен 136-ому кодону А-аллеля крупного рогатого скота. Следует отметить, что последовательность исследуемой области гена k-казеина буйвола значительно отличается от соответствующих участков нуклеотидной последовательности А- и В-аллелей крупного рогатого скота. От А-аллеля коровы он отличается нуклеотидными заменами в 13 кодонах, причем замены в 10 из них приводят к замене аминокислот (Рис. 1). Полученная на основе данной нуклеотидной последовательности аминокислотная последовательность полностью совпадает с последовательностью соответствующего фрагмента белковой молекулы, описанной ранее Мерсьером как k-казеин буйвола (Mercier et al., 1976). Таким образом, нами на уровне ДНК описан характерный для буйволов аллель (Н-ал~ лель) k-казеина, ранее отмеченный на белковом уровне.

В нашем исследовании у буйволов выявлен только один аллель k-казеина (Н-аллель), что возможно связано с небольшим размером выборки (п=6).

4.3 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У ЯКОВ.

При проведении рестрикционного анализа участка зкзона IV гена k-казеина яков и зубров, мы обнаружили наряду с А-аллге-лем, вариант рестрикционного полиморфизма, соответствующий Н-аллелю ' буйволов, т.е. наличие сайта рестрикции Hindi П и отсутствие сайтов рестрикции Hinfl, Taql и Pstl. Однако, сек-венирование данного продукта показало, что он отличается от нуклеотидной последовательности Н-аллеля буйвола, а близок по нуклеотидной последовательности А- и В-аллелям коровы (Рис.2). Этот аллель мы обозначили как 6-аллель.

+10809

Бег РЬе Ме1 А1а 11е Рго Рго Ьуз Ьуз Аил 61п Аэр Ьуи

1 5'-ТА ТСА ТТТ АТ6 6СС АТТ ССА ССА АА6 ААА ААТ СА6 ОАТ ААА

2 -----------------------------------------

3 -----------------------------------------

4 -----------------------------------------

ТЬг С1и Не Рго ТЬг Не Абп ТЬг 11е А1а Бег в1у Е1и Рго

1 АСА (¡АА АТС ССТ АСС АТС ААТ АСС АТТ £ЗСТ А6Т (3£аС САБ ССТ

2 --------------------------------------- ___

3 ---------------- ----------------

4 ------. —---------------:. — --------;--------

136

ТЬг Бег ТЬг Рго ТЬг Не Б1и А1а Уа1 61и Бег ТЬг Уа1 А1а

1 АСА АСТ АСА ССТ АСС АТС 6АА 8СА СТА вАв АСС АСТ СТА ОСТ

Е ----------------с-------------------------

3 ----------------с-------------------------

4 ----------------С-------------------------

148

ТЬг Ьеи С1и А1а Бег Рго 61и Уа1 Не СТи Бег Рго Рго в1и

1 АСТ СТА 6АА 6СТ ТСТ ССА 6АА 6ГТ АТТ ОА6 АБС ССА ССТ БАБ

2 ----------А-----------------;--------------

3 --------------------------------- ----------

4 -----------------------------------------

167

11е А2П ТЬг Уа1 СТп Уа1 ТЬг Бег ТЬг А1а 7а1 Тега

1 АТС ЛАС АСА БТВ САД СТТ АСТ ТСА АСС ШЗ ВТС ТАА АААСТСТ

4 ---------------------------т-----------------

+11018

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность фрагмента экзона IV гена к-казеина яка (3) и зубра (4) ( Б-аллель) в сравнении с А-аллелем (2) и В-аллелем (1) коровы.

В G-аллеле яка и зубра 148-й и 168-й кодоны совпадают с В-аллелем, а 136-й и 167-й кодоны соответствуют А-аллелю. Отсутствие сайта рестрикции PstI в G-аллеле объясняется тем, что он, как и А-аллель, имеет одну замену в 167-ом кодоне, но в отличие от А-аллеля не имеет второй нукяеотидной замены в 168-ом. Кроме того, терминаторный кодон G-аллеля яка отличается от терминаторных кодонов описанных ранее для других аллелей гена: ■ TGA вместо ТАА (Рис.2).

Полученные нами данные приобретают особый интерес в связи с данными о наличии у непальских яков нового варианта к-казеина (Х-вариант), обнаруженного методом изоэлектрофокусирования (Kawamoto et al., 1991). Х-Вариант тлеет более низкую изоэ-лектрическую точку по сравнению с А-вариантом, при изоэлектро-фокусировании его профиль не совпадает ни с одним из известных ранее. Наряду с Х-вариантом (частота 0,81) у непальских яков были выявлены А- и В-аллели к-казеина с частотой 0,01 и 0,18, соответственно (Kawamoto et al., 1991). Не исключено, что выявленный нами G-аллель яка соответствует Х-варианту к-казеина непальских яков. Однако, для проверки данного предположения необходимы данные об аминокислотной последовательности Х-алле-ля.

В нашей работе у яков отмечены А- и G-аллели к-казеина с частотой 47,5% и 52,5%, соответственно. При изучении ДНК гибридов яка с якутским скотом (п=2) был выявлен генотип АА по генуk-казеина, других аллелей и генотипов обнаружено не было. Проверка гипотезы о равновесии Харди-Вайнберга методом X2 показала, что X2 не отвергает гипотезы, т.е. частоты генотипов соответствуют ожидаемым (Х2=1,8, уровень значимости =0,05, df=l).

4.4. СРАВНЕНИЕ ЛИНИЙ ЗУБРОВ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА. Исследование полиморфизма гена к-казеина проводилось на двух линиях зубров: беловежской и кавказско-беловежской, выявлены два аллеля: Айв. Для обеих линий характерно преобладание й-аллеля (табл.3).

таблица 3.

Распределение частот аллелей и генотипов по гену к-казеина у кавказско-беловежской и беловежской линий зубров.

1 1 1 | Частоты аллелей 1. 1 | Частоты генотипов !

п 1 А 1 1 6 1 Г М 1 | АС 1 1 1 60 1

| Кавказско- | | беловежские] 14 | 0,107 1+0,058 1 I 0,803 1+0,058 1 | | 0,214 1+0,077 | 0,786 | 1+0,077 |

| Беловежские) 24 | 0,292 1+0,065 1 | 0,708 [+0,065 | 0,167 1+0,053 | 0,250 1+0,062 | 0,583 | 1+0,071 |

1 Зубры, | | в целом | I , 1 38 1 0,224 1+0,047 1 1 " | 0,776 1+0,047 1 ■ | 0,105 1+0,036 1 ......... 1 0,237 1+0,053 Г | 0,658 | 1+0,055 | 1 1

*- частоты аллелей и генотипов рассчитаны не на исследованную выборку в целом, а только на ту ее часть, которая давала амплификацию.

Высокая частота Н-аллеля и отсутствие редких аллелей у зубров в целом, возможно связаны с Инбридингом, обусловленным небольшой численностью зубров, и "эффектом основателя", т.к. все чистокровные зубры являются потомками 12 животных. У животных кавказско-беловежской линии отсутствуют гомозиготы АА, гетерозиготный генотип отмечен менее чем у одной четверти животных в выборке. Таким образом, при типировании аллельных вариантов к-казеина оказалось возможным улавливать различия на уровне двух линий. Проверка гипотезы о равновесии Харди-Вайн-берга показала, что метод X2 не отвергает гипотезы (Х2=3,66) при уровне значимости 0,05 и с!Г=1, т.о. частоты генотипов соответствуют ожидаемым.

4.5. ОЦЕНКА УРОВНЯ ГЕТЕР03ИГ0ТН0СТИ ИССЛЕДОВАННЫХ ВЫБОРОК ЖИВОТНЫХ ПО ГЕНУ КАППА-КАЗЕИНА.

На основе полученных данных был рассчитан уровень гетеро-зиготности и ожидаемая гетерозиготность исследованных выборок животных по гену к-казеина, результаты приведены в таблице 4. Для сравнения в таблице приведены-также данные, полученные в лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН при исследовании черно-пестрой породы крупного рогатого скота.

Таблица 4.

Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность.

1 Уровень Ожидаемая |

| гетерозиготности % гетерозиготность Z |

| зубры 23,7 34,8 |

| яки 35,0 49,9 1

| якутский скот 26,7 33,8 |

| черно-пестрый скот 46,6 38,8 |

Для всех изученных в работе видов характерен пониженный уровень гетерозиготности, что отражает последствия инбридинга. У зубров отмечена инбредная депрессия. Якутский скот и акклиматизированные в Якутии яки также представляют собой малочисленные и изолированные популяции.

ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОДСЕМЕЙСТВА BOVINAE.

Изучение полиморфизма гена k-казеина у различных видов подсемейства Bovinae выявило наличие нескольких аллелей. Наряду с описанными ранее для крупного рогатого скота аллелями, у родственных видов были выявлены новые аллели: G-аллель у яков и зубров и Н-аллель у буйволов.

Наиболее распространенным аллелем к-казеина крупного рогатого скота является А-аллель. Он также встречается и у родственных видов подсемейства (яков и зубров). У буйволов А-аллель нами не обнаружен, однако из-за немногочисленности выборки мы не можем однозначно судить об отсутствии А-аллеля у буйволов.

Нуклеотидная последовательность исследуемого фрагмента Б-аллелн аналогична последовательностям соответствующей области гена у А- и В-аллелей крупного рогатого скота, но при этом его 136-й кодон соответствует треонину (как в А-аллеле), а 148-й - аланину (как в В-аллеле)-(Рис. 3).

Н1пП РвЫ

-АСС-ОАТ-АСТ БСА- к-СпА

ТЬг Азр ТЬг А1а (Т-/НГ+/Нс1-/Р+)

РбЫ

-АСС-атт-:-АСТ ВСА- к-СпГ

ТЬг Уа1 ТЬг А1а (Т-/НГ-/Нс1-/Р+)

. ншш

-АСС-(ЗСТ-:-АСТ ШЗ- к-Спй

ТЬг А1а ТЬг А1а (Т-/НГ-/Нс!+/Р-)

Шл с/Ш

-АСС-(ЗСТ-АСС 6ТС- к-СпН

ТЬг А1а ТЬг Уа1 (Т-/НГ-/Нй+/Р-)

Гад/ НШШП

-АТС-(ЗСТ-АСС - к-СпВ

Не А1а ТЬг А1а (T+/Hf-/Hd4/P-)

136 148 167 168

Рис. 3. Рестрикционная карта амплифицированных участков IV экзона гена к-казеина (А-, В-, Г-, Н-, й- аллели) для эндонук-леаз Тад! (Т), МпП (НП, ШпсИП (Нй) и РбЫ (Р).

Наличие треонина и аланина в указанных положениях характерно для k-казеинов далеко отстоящих в эволюционном отношении видов: овцы, козы, человека (цитировано по Mercier et al., 1976), буйвола, яка, зубра (собственные данные). Исключение составляют крупный рогатый скот и зебу, у которых появляются А- и В-аллели k-казеина. Возможно, G-аллель соответствует гипотетическому предковому аллелю (Mercier et al., 1976), и от него в результате точечных замен произошли А- и В-аллели крупного рогатого скота (Рис. 4).

-THR-ASP- А-аллель

I

148 гипотетический

-THR-ALA--предковый

136 вариант

I

-ILE---—ALA—- В-аллель

Рис.4. Гипотетический путь образования аллелей А и В к-казеина коровы от предкового аллеля (Mercier et al., 1976).

Ранее при изучении полиморфизма гена k-казеина бизонов (с 10592 по 1146бн.) с использованием рестриктаз Hindi II и Rsal (Cronin and Cockett, 1993) было показано существование специфичного аллеля бизонов, у которого отсутствует сайт рестрикции HinduI и присутствуют два сайта рестрикции Rsal. Второй аллель k-казеина, выявленный у бизонов, имеет сайт рестрикции HindIII и один из двух сайтов рестрикции Rsal, возможно, он соответствует выявленному в нашей работе G-аллелю зубра, т.к. европейский зубр является ближайшим сородичем американского бизона.

формирования новых пород.

На основании полученных нами нуклеотидных последовательностей участка экзона IV гена к-казеина различных видов, с помощью программы построения филогенетических деревьев "УозЬогеб.О" были получены следующие дендрограммы (Рис. 5).

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

Рис. 5. Схемы дивергенции различных видов подсемейства Во-vinae: буйволов(1), яков(2), зубров(З), коровы(4) и зебу(5)*, полученные методом а) ближайших соседей (Nearest Neighbor Method) ; б) современного предка (The Present-day Ancestor Method) на основании нуклеотидной последовательности гена к-казеина.

- нуклеотидная последовательность соответствующего участка гена k-казеина зебу получена в лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН (Берберов, 1993).

Интересно отметить тот факт, что як кластеризуется с зубром, а не крупным рогатым скотом, что, по всей видимости, согласуется о точкой зрения многих исследователей о выделении яка в отдельный род (Poephagus).

Несмотря на то, что для построения дендрограммы использовали данные по фрагменту одного гена, полученная картина хорошо соответствует филогенетическим данным, что указывает на высокую информативность гена k-казеина и целесообразность его использования для сравнительных и эволюционных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия анализа полиморфизма ДНК двух функционально различных участков гена каппа-казеина: 5'-нетранслируемой области (с -449 по +50нл) и участка экзона IV (с +10809 по +11036нп) для представителей подсемейства Bovinae с использованием гетерологичной полимеразной цепной реакции.

2. У изученных видов (якутский скот, зубры, яки и .буйволы) рестрикционный полиморфизм пс эндонуклеазам Alul и Bglll в 5'-нетранслируемой. области отсутствует. Это указывает на высокий уровень консерватизма регуляторной области гена.

3. При изучении полиморфизма фрагмента экзона IV гена каппа-казеина среди видов подсемейства Bovinae выявлены новые, ранее не описанные аллели: Н-аллель у буйволов и G-аллель у яков и зубров. Определены нуклеотидные последовательности новых аллелей гена и разработана схема их типирования методом ПЦР-ПДРФ.

4. Показаны видовые различия в особенностях распределения аллелей гена каппа-казеина; в исследованных выборках определены следующие частоты аллелей: у якутского скота (А-аллель -0,800; В- 0,133; F- 0,067), у яков (А-аллель -0,525; G-0,475) и у зубров (А-аллель -0,224; G- 0,776). F-аллель отмечен только у якутского скота, Н-аллель - только у буйволов.

5. На основе нуклеотидных последовательностей фрагмента экзона IV изученных видов построены филогенетические деревья, хорошо согласующиеся с современными представлениями о происхождении видов подсемейства Bovinae.■ Таким образом, изучение полиморфизма гена каппа-казеина информативно для проведения сравнительных популяционно-генетических и филогенетических исследований различных видов животных.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

1. Удина И.Г., Бадагуева Ю.Н., Соколова С.С. Применение полимеразной цепной реакции при изучении консервативных участков гена каппа-казеина и DQB гена главного комплекса гистосов-местимости у крупного рогатого скота и родственных видов. Тезисы 1-ой международной конференции по частной генетике сельскохозяйственных животных. 18-20 мая 1993г., Аскания-Нова, Украина.

2. Бадагуева Ю.Н. Полиморфизм гена каппа-казеина у яков и крупного рогатого скота. Молекулярно-генетические маркеры животных. Тезисы 1-ой Международной конференции по молекуляр-но-генетическим маркерам животных. 27-29 января 1994г., Киев: Аграрная наука, стр. 51-52.

3. Соколова С.С., Бадагуева Ю.Н. Сравнительный анализ генофонда некоторых видов семейства Bovidae с использованием ДНК-полиморфизма генов главного комплекса гистосовместимости и гена каппа-казеина. Молекулярно-генетические маркеры животных. Тезисы 1-ой Международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных. 27-29 января 1994г., Киев: Аграрная наука, стр. 64.

4. Сипко Т.П., Удина И.Г., Бадагуева Ю.Н., Сулимова Г.Е. Сравнительная характеристика ДНК-полиморфизма гена каппа-казеина у представителей семейства Bovidae. Генетика. 1994г., т.30, N 2, стр. 225-229.

5. Udina I.G., Sipko Т.P., Rautian G.S., Badagueva Yu.N., Sulimova G.E. The study of DNA-polymorphism of European bison by PCR-analysis of kappa-casein gene and loci DQB and DRB of the major histocompatibility complex. The 5th World congress of genetics applied to livestock production. 7-14 August, 1994, Guelph, Ontario, Canada. Vol.21, P. 147-150.

6. Бадагуева Ю.Н., Сулимова Г.Е. ДНК-полиморфизм гена к-казеина у представителей семейства Bovidae. Материалы 1-го с'езда Вавидовского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС). (Саратов, 20-25 декабря 1994г.) Генетика. 1994г., т.30, приложение, стр. 11.

7. Бадагуева Ю.Н., Сулимова Г.Е., Удина И.Г. Полиморфизм гена каппа-казеина у якутского скота. Материалы региональной конференции " Эколого-генетические исследования в Якутии". 12 января 1995г. (в печати).

8. Сулимова Г.Е., Бадагуева Ю.Н., Удина И.Г. Изучение полиморфизма гена каппа-казеина у акклиматизированных в Якутии яков. Материалы региональной конференции " Эколого-генетические исследования в Якутии". 12 января 1995г. (в печати).

9. Удина И.Г., Сипко Т.П., Сулимова Г.Е., Соколова С.С., Бадагуева Ю.Н.. Полиморфизм ДНК генов главного комплекса гистосовместимости и каппа-казеина зубров и родственных видов. В серии "Современные научные обзоры", публикуемые по соглашению между РАН и издательствами "Gordon & Brick" и " Harvard Academic Publishers". 1995 (в печати).

10. Udina I.G., Sulimova G.E., Badagueva Yu.N. Characteristics of kappa-casein alleles in cattle breeds and some Bo-vidae species. The 46th Annual Meeting of the European Association for Animal Production. Commission on Animal Genetics. September 1995, Prague (в печати).