Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности генетического полиморфизма HLA-антигенов при приобретенной апластической анемии и миелодиспластическом синдроме у детей

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности генетического полиморфизма HLA-антигенов при приобретенной апластической анемии и миелодиспластическом синдроме у детей"

На правах рукописи

Чумак Анна Александровна

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА НЬА-АНТИГЕНОВ ПРИ ПРИОБРЕТЕННОЙ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ И МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ У ДЕТЕЙ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

31 /013

Москва-2013

005536325

Работа выполнена в Государственном Бюджетном Учреждении Здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы» и Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов».

Научные руководители: Астрелина Татьяна Алексеевна

Азова Мадина Мухамедовна

Официальные оппоненты: Кузьменко Лариса Григорьевна

Филиппова Тамара Владимировна

доктор медицинских наук, заместитель директора по медицинской части ГБУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы»

кандидат биологических наук, доцент, доцент-исследователь кафедры биологии и общей генетики ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

доктор медицинских наук, профессор кафедры педиатрии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

доктор медицинских наук, профессор кафедры медицинской генетики ГБОУ ВПО «Первый Московский

государственный медицинский

университет имени И.М. Сеченова»

Ведущая организация: ФГБУ «Российский научно-

исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»

Защита диссертации состоится «» 2013 года в ^-^""часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203.05 при ФГВОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УНИБЦ (Научная библиотека) ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6) и на сайте www.rudn.ru.

Автореферат размещен на сайте www.vak.ed.gov.ru Автореферат разослан « ^/ » ^^/Р-К2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203.05 кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Приобретенная апластическая анемия (ПАА) и миелодиспластический синдром (МДС) относятся к группе тяжелых патологий кроветворной системы, сопровождающихся угнетением костномозгового кроветворения. Заболеваемость ПАА составляет 2-3 случая на 1 млн. населения в год в европейских странах и 3-5 случаев на 1 млн. населения в год в странах Азии (Issaragrísil S., 2006; Young N.S., 2008). Данный показатель при МДС значительно выше: 3-5 случаев на 100 000 населения в год (Aul С., 1992; Rádlund А., 1995; Maynadié М., 1996; Greenberg P.L., 2006; Рукавицын O.A., 2007; Kaushansky К., 2010). Однако следует отметить, что 80% заболевших МДС - это люди старше 60 лет. Общая заболеваемость детского населения составляет 3,6 случая на 1 млн. в год (Greenberg P.L., 2006; Рукавицын O.A., 2007; Rollison D.E., 2008).

Около 40 лет назад появились первые результаты исследований распределения антигенов HLA-системы у больных ПАА (Albert Е., 1976; Dausset J., 1977). В 1983 г. было обнаружено, что в разных этнических группах развитие данного заболевания связано с разными антигенами HLA-системы (D'Amaro J., 1983). Появление новой технологии HLA-типирования - полимеразной цепной реакции — позволило выявлять ассоциации заболеваний не с антигенами, а с определенными аллельными вариантами генов HLA. К настоящему времени накоплено значительное количество данных о том, что при возникновении ПАА и МДС важную роль играет наличие конкретных групп аллелей генов HLA. Так, показано, что HLA DRB1*15 является маркером предрасположенности к развитию ПАА и МДС и ассоциируется с благоприятным ответом на иммуносупрессивную терапию (ИСТ) (Oguz F.S., 2002; Saunthararajah Y., 2002; Nakao S., 2006; Stern M., 2006; Sugimori C„ 2007; Huang Y.L., 2007; Yoshida N„ 2008; Cui J.X., 2010; Dhaliwal J.S., 2011; Lu S.Y., 2012). Также установлена взаимосвязь ПАА с конкретными аллелями. К примеру, HLA DRB1*1501 ассоциирован с тяжелой и нетяжелой формами апластической анемии (АА), а DRB 1*1302 встречается достоверно реже у пациентов с тяжелой формой ПАА (SongE.Y., 2008). Выявлено, что определенные HLA-гаплотипы характеризуются выраженной ассоциацией с развитием ПАА (Nakao S., 1994; Капустин С.И., 1998). Имеются также данные об ассоциации циклоспорин-зависимой ПАА с гаплотипом DRB1*1501-DQA1*0102-DQB1*0602, однако они несколько противоречивы (Nakao S., 1994).

В России изучение особенностей распределения HLA-аллелей у больных с АА было проведено лишь в популяции Северо-Западного региона (Капустин С.И., 1998).

Таким образом, несмотря на многочисленные работы, посвященные исследованию взаимосвязи между индивидуальными иммуногенетическими факторами и предрасположенностью к развитию ПАА и МДС, сведения о роли антигенов HLA в патогенезе данных заболеваний противоречивы и требуют дальнейшего изучения. Особо следует отметить, что не охарактеризована частота встречаемости групп аллелей HLA у больных ПАА и МДС детей славянской популяции. Не установлена взаимосвязь факторов HLA-системы с риском развития данных заболеваний у здоровых детей славянской популяции в зависимости от возраста и пола ребенка, с клиническими формами, степенью тяжести ПАА и МДС, а также ответом на иммуносупрессивную терапию у детей, больных ПАА. Исследованию данных вопросов, имеющих важное фундаментальное и прикладное значение, и посвящена настоящая работа.

Цель исследования

Изучить генетический полиморфизм НЬА-антигенов при приобретенной апластической анемии и миелодиспластическом синдроме у детей.

Задачи исследования

1. Изучить частоту встречаемости различных аллельных групп генов НЬА у больных ПАА детей и здорового населения славянской популяции.

2. Выявить ассоциации между группами аллелей НЬА и предрасположенностью к развитию ПАА, клинической формой и степенью тяжести данного заболевания в зависимости от пола и возраста ребенка.

3. Установить взаимосвязь между группами аллелей НЬА и ответом больных ПАА детей на ИСТ.

4. Исследовать характер распределения групп аллелей НЬА-системы I и II класса у детей с МДС и здорового населения славянской популяции.

5. Выявить НЬА-маркеры предрасположенности и протекции к заболеванию МДС у детей.

Научная новизна работы

Впервые изучено распределение генов НЬА I и II класса у больных ПАА детей славянской популяции в зависимости от пола, возраста, клинической формы, степени тяжести заболевания и ответа на ИСТ.

Впервые выявлено, что общими генетическими маркерами предрасположенности к развитию ПАА и, в частности, идиопатической апластической анемии (ИАА) у мальчиков старше 14 лет и девочек младше 14 лет славянской популяции являются НЬА В1Ш1*15 и В*51. Охарактеризованы специфические генетические маркеры предрасположенности к развитию ПАА и, в частности, ИАА у девочек младше 14 лет (ВС?В1*06), у мальчиков младше 14 лет (НЬА В*08, В*40 и Б1Ш1*03).

Впервые установлены характерные генетические маркеры заболевания сверхтяжелой ПАА у мальчиков (НЬА В*08, В*14, БЯВ1*03, Б1Ш1*15) и тяжелой ПАА у мальчиков и девочек (НЬА ОБ1В1*15).

Впервые выявлено, что НЬА Б1Ш1*15 представляет собой прогностический генетический маркер ПАА, чувствительной к применению ИСТ, у детей славянской популяции.

Впервые изучено распределение генов НЬА класса I и II у больных МДС детей славянской популяции и выявлены генетические маркеры, определяющие риск возникновения МДС: НЬА А*11, А*26, В*40, ШШ1*14.

Впервые выявлены общие маркеры протекции к развитию ПАА и, в частности, ИАА. К их числу у мальчиков старше 14 лет и девочек старше 14 лет относится Б1Ш1*04, у мальчиков младше 14 лет - БИВ 1*07. Показано, что характерным маркером протекции к развитию ПАА у мальчиков младше 14 лет выступает В*44, к развитию тяжелой формы ПАА у детей - 1*04; МДС у детей - 0<ЗВ 1*02.

Практическая значимость работы

В результате проведенного исследования на основе типирования полиморфных НЬА-генов с помощью молекулярно-генетического метода были выявлены иммуногенетические маркеры предрасположенности и протекции к развитию ПАА у

детей в зависимости от возраста, пола, предрасположенности к клиническим формам заболевания, тяжести течения и ответа на ИСТ.

Вероятное прогнозирование риска развития ПАА и МДС у детей на основе анализа генетического полиморфизма HLA-генов позволит верифицировать диагноз на начальных этапах развития заболевания.

Данные об иммуногенетических маркерах ПАА и МДС у детей в зависимости от возраста и пола позволят педиатрам, врачам-гематологам, терапевтам своевременно диагностировать заболевание, выявлять группу риска и проводить генетическое прогнозирование и мониторинг в семьях больных ПАА и МДС.

Важное практическое значение имеет обнаружение у детей HLA-маркеров заболевания ПАА, позволяющих прогнозировать тяжесть течения и ответ на иммуносупрессивную терапию.

Положения, выносимые на защиту

1. Характер частотного распределения групп аллелей HLA у больных ПАА или МДС детей славянской популяции имеет существенные отличия от их распределения среди здорового населения той же популяции.

2. Изучение иммуногенетических факторов у детей, больных ПАА и МДС, позволяет выявить маркеры HLA, определяющие риск возникновения заболевания у здорового детского населения.

3. Профиль HLA-маркеров предрасположенности и протекции к развитию ПАА у детей имеет характерные особенности, зависящие от пола и возраста ребенка и ассоциированные с клинической формой и тяжестью заболевания, а также ответом на ИСТ у больных детей.

4. Данные об HLA-маркерах ПАА и МДС у детей могут быть использованы для прогнозирования течения соответствующего заболевания и ответа на иммуносупрессивную терапию.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования внедрены в практику работы Государственного Бюджетного Учреждения Здравоохранения города Москвы «Банка стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы» (директор - д.м.н М.В. Яковлева).

Апробация диссертации

Работа апробирована на международной 26-й Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, EFI and 19th the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation, AIBT) (Ливерпуль, 2012 г.), V научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2012 г.), конгрессе гематологов России (Москва, 2012 г.), VI научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (Москва, 2012 г.), 27-й Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, EFI) (Маастрихт, 2013 г.), 12-ом международном симпозиуме по Миелодиспластическим синдромам (Берлин, 2013 г.), совместном заседании кафедры биологии и общей генетики РУДН и сотрудников ГБУЗ «Банк стволовых клеток ДЗМ», 2013 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки РФ для публикации основных научных результатов докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, главы, в которой изложены полученные результаты и их обсуждение, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 43 таблицы и 11 рисунков. Библиография включает 165 источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 2 группы пациентов:

1. группа больных ПАА - 147 детей в возрасте от 1 до 18 лет (62 девочки и 85 мальчиков, средний возраст составил 11,33±5,6 лет) с установленным диагнозом ПАА.

Диагноз ПАА был установлен согласно международным стандартам (British Committee for Standarts in Haematology (BCSH)). В группу больных были включены дети с двумя формами ПАА: идиопатической и гепатит-ассоциированной. Диагноз идиопатической ПАА был выставлен у 135 детей (76 мальчиков и 59 девочек), средний возраст которых составил 11,3±5,68 лет. Идиопатическая ПАА - форма ПАА, при которой этиологический фактор в развитии ПАА неясен и не был определен. Диагноз гепатит-ассоциированной ПАА был установлен у 12 пациентов (9 мальчиков и 3 девочки), средний возраст которых составил 9±4,8 лет.

Степень тяжести АА у пациентов определялась по классическим модифицированным критериям Camitta/EBMT (1976, 1988 г.). Пациенты в зависимости от степени тяжести ПАА были разделены на 3 группы: дети с тяжелой формой ПАА (41 ребенок), со сверхтяжелой формой ПАА (71 ребенок), со среднетяжелой формой ПАА (5 детей). У остальных 30 больных степень тяжести АА не была определена.

В настоящем исследовании сведения об ответе на комбинированную ИСТ препаратами антитимоцитарного глобулина (АТГ) и циклоспорина А (ЦсА) были получены у 58 детей. У 39 детей (16 мальчиков и 23 девочки) был получен ответ на ИСТ (полный, парциальный или минимальный), а у 19 детей (13 мальчиков и 6 девочек) было установлено рефрактерное течение ПАА.

Заключение о диагнозе, клинической форме, степени тяжести, ответе на ИСТ было получено при изучении медицинской документации.

2. группа больных МДС - 39 пациентов в возрасте от 1,5 лет до 17 лет (20 девочек и 19 мальчиков, средний возраст составил 7,8±4,65 лет) с установленным диагнозом МДС.

У 8 детей (5 мальчиков и 3 девочки, средний возраст - 5,87±3,75 лет) был выставлен диагноз рефрактерной анемии (РА); у 10 детей (2 мальчика и 8 девочек, средний возраст - 6,45±4,86 лет) была диагностирована рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ); у 1 пациента (девочки 14 лет) - рефрактерная анемия с

избытком бластов в стадии трансформации (РАИБТ); у 1 девочки 12 лет -хронический миеломоноцитарный лейкоз (XMMJI); у 1 мальчика 7 лет -неклассифицируемый МДС. У остальных детей (п=18, из них 11 мальчиков и 7 девочек, средний возраст - 8,44±4,85 лет) был диагностирован МДС, но не определена форма заболевания.

Диагноз и форма МДС были установлены в соответствии с классификацией ВОЗ и классификацией Франко-Американо-Британской группы (FAB-классификацией).

Заключение о диагнозе и клинической форме МДС было получено при изучении медицинской документации.

Пациенты с ПАА и МДС находились на лечении в отделении 1-ой гематологии ФГБУ Российская детская клиническая больница (главный врач - д.м.н., профессор H.H. Ваганов, заведующая отделением к.м.н. З.М. Дышлевая, заведующая отделением трансплантации костного мозга д.м.н. Е.В. Скоробогатова), ФГБУ МДГКБ (главный врач - д.м.н., профессор И.Е. Колтунов, заведующий отделением к.м.н. K.JI. Кондратчик) и ГКБ им. С.П. Боткина (главный врач д.м.н., профессор В.Н. Яковлев, заведующая городским гематологическим центром B.JI. Иванова), Амурской ДГКБ, Иркутской ГОДКБ, ДРКБ МЗ Республики Татарстан, Нижегородская ОДКБ, Свердловская ОДКБ, ГУЗ ОДКБ г.Ростова, ГУЗ ОДКБ г. Воронежа, ОДКБ г. Челябинска, Свердловской ОДКБ, Волгоградского областного клинического онкологического диспансера в период с 2003 по 2011 гг.

Контрольная группа была представлена 1700 новорожденными условно здоровыми детьми, родившимися на 37-41 неделе гестации, образцы пуповинной крови которых были типированы по системе HLA, прошли тестирование на вирусную и микробную контаминацию и были внесены в реестр неродственных доноров в г. Москве за период с 2004 по 2009 год. Образцы пуповинной крови и результаты HLA-типирования находятся на хранении в ГБУЗ «БСК ДЗМ» (заведующая лабораторией HLA-типирования к.б.н. JI.JI. Лебедева).

В настоящем исследовании все пациенты и контрольная группа относились к славянской популяции.

Методы исследования

Получение материала

Периферическую кровь у пациентов с ПАА и МДС брали в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. Пуповинная кровь была собрана при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных (37-41 недель гестации) при наличии информированного согласия матери и отсутствии стандартных противопоказаний к донорству.

Выделение ДНК из биоматериала

Геномную ДНК выделяли из свежих или замороженных образцов крови методом сепарации на магнитных частицах. На первом этапе выделения ДНК (приготовление лизата) в пробирку объемом 1,5 мл вносили протеазу, исследуемый образец крови и лизирующий буфер для деструкции клеток и находящихся в них связывающих белков. На следующем этапе образующийся лизат переносили в первую пробирку специального стрипа. Подготовленные пластиковые стрипы помещали на платформу-держатель, которая загружалась в прибор King Fisher, снабженный программным обеспечением. По окончании процесса содержимое последней пробирки, содержащей раствор выделенной ДНК, переносили в чистую промаркированную пробирку.

Измерение концентрации и чистоты ДНК на спектрофотометре

Концентрацию выделенной ДНК измеряли в сравнении с чистым элюирующим раствором по оптической плотности OD260. Степень чистоты ДНК оценивали с помощью многоволнового режима А2бо/28о- Указанные характеристики определяли с использованием спектрофотометра фирмы «Biorad» (США). Образцы для исследования соответствовали предъявляемым к ним требованиям - концентрация ДНК > 50 нг/мкл и отношение А260/280 составляло 1,7-1,9.

Молекулярные методы типиуоеания

Генотипирование методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов

Гибридизацию с помощью олигонуклеотидных зондов (SSO) проводили с использованием автоматического процессора Dynal AutoRELI™ 48 Mk и сертифицированных реагентов RELI™ SSO фирмы Invitrogen. На первом этапе готовили рабочую ПЦР-смесь для амплификации участков определенного гена HLA (-А, -В, -Cw, -DRB или DQB1), включающую в себя 7,5 мкл ДНК (концентрацией 1315 нг/мкл), 15 мкл Mastermix (нуклеотиды, биотинилированные праймеры и 100 ед./мл Taq polymerase), 7,5 мкл 0,6 мМ MgCI2. В результате амплифицировались не аллель-специфические HLA-ампликоны, а гипервариабельные регионы отдельных локусов с образованием локус-специфичных продуктов. На втором этапе проводили денатурацию ампликонов щелочью для формирования одноцепочной ДНК. Искомые участки ДНК фиксировались в процессе блот-гибридизации, проводимой в автоматическом режиме. На этом этапе специфические участки ДНК связывались (конъюгировали) с олигонуклеотидными зондами, нанесенными на нейлоновые стрипы, на которых в результате колориметрической реакции появлялись сине-голубые полоски в тех местах, где произошла гибридизация с зондом. Полученные результаты считывали сканированием стрипа с помощью сканера AutoCam. Интерпретацию результатов проводили в автоматическом режиме с использованием программы Dynal РМР. Методом SSO выявляли генотип HLA по всем исследуемым локусам на уровне групп аллелей.

Генотипирование методом ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров

Метод SSP применяли при генотипировании образцов крови больных детей, а также для разрешения двойных интерпретаций результатов, возникающих при использовании метода SSO.

Процесс состоял из нескольких этапов:

1. Амплификация (в пробирку с Mastermix, содержащую смесь для амплификации исследуемого локуса HLA (-А, -В, -Cw, -DRB или DQB1), буферный раствор, MgCL2, нуклеотиды и краситель, добавляли дистиллированную воду, раствор ДНК (50нг/мкл) и термостабильную ДНК-полимеразу в пропорциях, указанных в прилагаемых к наборам таблицах. Аликвоты (по 10 мкл) полученного состава вносили в лунки специального термопланшета, содержащие лиофилизированные пары праймеров, после чего планшеты помещали в амплификатор и запускали необходимую программу).

2. Электрофорез в 2% агарозном геле.

3. Интерпретация результатов (регистрацию сигналов электрофореграммы, фотографирование изображения и документирование результатов в электронном виде осуществляли с помощью гельдокументирующей системы «ДиДжиДок» (США) и компьютерной программы «UPV»)

Всего было проведено 9440 лабораторных исследований.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов и оценка взаимосвязи между группами аллелей HLA и развитием заболевания ПАА или МДС, а также оценка достоверности полученных данных выполнялись с использованием следующих показателей и критериев: частоты встречаемости групп аллелей HLA в долях f, критерия z с поправкой Иейтса на непрерывность, критерия %2 с поправкой Йейтса, точного двустороннего критерия Фишера, уровня достоверности р. Если различия долей групп аллелей HLA в опытной и контрольной группе оказывались статистически значимыми, вычислялся показатель «отношение шансов» - OR (odds ratio) с 95% «доверительным интервалом». При OR > 1 наступление заболевания более вероятно для пациентов с исследуемой группой аллелей, и предполагаемый фактор риска является значимым. Сравнение групп проводили с помощью методик Стентона Гланца, 1999 г. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программ «Microsoft Excel», «Statistica for Windows» v. 6.0, StatSoft Inc. (США) и «Open Epi» (Open Source Epidemiologie Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности генетического полиморфизма антигенов HLA системы у детей с ПАА

Были исследованы гены HLA I класса (А*, В*, С*) и II класса (DRB1* и DQB1*). У больных с ПАА и в контрольной группе были выявлены следующие группы аллелей: А*01, А*02, А*03, А*11, А*23, А*24, А*25, А*26, А*29, А°*30, А*31, А*32, А*33, А*66, А*68, В*07, В*08, В*13, В*14, В*15, В*18, В*27, В*35, В*37, В*38, В*39, В*40, В*41, В*44, В*47, В*48, В*49, В*50, В*51, В*52, В*55, В*56, В*57, С*01, С*02, С*03, С*04, С*05, С*06, С*07, С*08, С*12, С*14, С*15, С*16, С*17, DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*10, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13, DRB1*14, DRB1*15, DRB1*16, DQB1*02, DQB1*03, DQB1 *04, DQB1 *05, DQB1 *06.

Анализ полученных результатов показал, что в исследованных группах распределение по частоте встречаемости групп аллелей HLA I и II классов в целом соответствовало таковому в славянской популяции. Дальнейшие исследования генов HLA проводили у больных, разделенных на группы по следующим критериям: пол, возраст, клиническая форма ПАА, степень тяжести ПАА и ответ на ИСТ. В заключении изучали общую когорту больных без разделения на группы.

После расчета показателя OR были выявлены общие и характерные маркеры предрасположенности и протекции к развитию ПАА у детей; было установлено, во сколько раз риск заболеть ПАА в группе риска (т.е. у детей-носителей конкретной группы аллелей HLA) выше соответствующего показателя у детей, не несущих в генотипе данную группу аллелей HLA.

В графиках и таблицах отображены только те группы аллелей HLA, частота встречаемости которых в группе больных достоверно отличается от таковой в контрольной группе.

Особенности распределения групп аллелей HLA у детей с ПАА и контрольной группы в зависимости от пола

Установлено, что характер распределения частоты встречаемости аллельных групп HLA в контрольной группе не зависит от пола.

Пациенты с МАЛ были разделены на 2 группы: группа мальчиков, п=85, средний возраст составил 12,5±3,53 лет; группа девочек, п=62, средний возраст-10,75±3,54 лет.

Результаты оценки частоты встречаемости аллельиых групп НЬА у мальчиков и девочек, больных ПАА и контрольной группе представлены на рисунках 1 и 2.

В группе девочек, больных ПАА, отмечалось достоверное увеличение частоты встречаемости групп аллелей Н1.А ГЖВ1*15 и О0В1*06 и снижение частоты встречаемости В*38 и ОЯВ1*01, в то время как у больных мальчиков по сравнению с контролем наблюдалось значимое повышение частоты встречаемости групп аллелей А*01, В»08, В*40, 011В1*03, 01Ш1*15 0<}В1*06 и снижение частоты встречаемости В*44, С*06, *04, ОЯВ1 *07.

В'їв СЖВТ01 С«ВГ15 0081*08

■ Коитропкм» групп* (п-1700) (3 девоч» е АА (п»«2)]

Рисунок* 1. Частота встречаемости групп аллелей НЬА в группе девочек є ПАА и в контрольной группе, в долях

0.35

6 о.з £ з

Г I о «

X ч | »

Б"1 0.15

I І 0-1

? 0.09 О

[■Контрольная группа (п=1700) 0 Мальчиш с АА (п=85)|

Рисунок 2. Чаеюіа веіречаемости групп аллелей HLA в группе мальчиков с ПАА и в контрольной группе, в долях

Таблица 1

Различия иммуногенетических факторов предрасположенности и протекции к развитию ПАА в зависимости от пола и возраста

Группа аллелей НЬА Девочки и мальчики (п=147) Девочки (п=62) Девочки младше 14 лет (п=40) Девочки старше 14 лет (п=22) Мальчики (п=85) Мальчики младше 14 лет (п=52) Мальчики старше 14 лет (п=33)

СЖ С1 СЖ С1 СЖ С1 ОИ С1 ОИ С1 СЖ С1 СЖ С1

А*01 - - - - ......- : - 1,75 1,06-2,86 - - - -

В*08 - - - ; - - - 2,22 1,27-3,77 2,53 1,24-4,93 - -

В*14 1,98 1,03-3,58 - - - - - - - - - -

В*38 0,16 0,03-0,56 0 0,001-0,75 - - - - - - - - -

В*40 - - ■ :::-:...... - 2,19 1,14-4,01 2,7 1,23-5,75 - -

В*44 - - - - : - -; 0,36 0,14-0,79 0,2 0,03-0,71 - -

В*51 1,91 1,10-3,21 - - 3,31 : 1,3-7,57 - - - - 3,37 1,1-8,85

С*06 - - п/а п'а п/а а'а п/а ш'а 0,3 0,093-0,80 п/а п/а п/а п/а

ОЯВ1*01 - - 0,35 0,12-0,84 - - - - - - -

ВЬ1В1*03 1,58 1,02-2,39 ■:■:" - - - - 2,29 1,39-3,77 2,85 1,5-5,2 - -

БЯВ1 *04 0,42 0,23-0,72 - т : - 0 0,001-0,67 0,4 0,181-0,82 - - 0,13 0,02-0,8

БИВ 1*07 - - -,:■■:;..... 0,4 0,2-0,74 0,3 0,1-0,739 - -

2,47 1,73-3,53 2,74 1,59-4,72 3,32 1,66-6,67 - ■¿■■я ' 2,29 1,45-3,62 - - 4,18 1,97-9,07

ПОВ1*06 2,1 1,41-3,15 2,86 1,54-5,51 2.47 1,17-5,42 п/а п/а 1,69 1,01-2,82 - - п/а п/а

Согласно данным, представленным в таблице 1, риск развития ПАА выше у девочек-носителей БИВ 1*15 и ПС)В1*06, причем он возрастает по сравнению с не носителями в 2,74 и 2,86 раза, соответственно. Если у детей с ПАА не было выявлено определенной группы аллелей НЬА, то для неё показатель (Ж равен нулю, а нижний предел доверительного интервала стремится к нулю. Таким образом, минимальный риск развития ПАА у девочек ассоциирован с наличием группы аллелей В*38.

Распределение групп аллелей НЬА у детей с ПАА в зависимости от возраста

Для выявления возрастных различий по частоте встречаемости маркеров предрасположенности и протекции антигенов НЬА у детей с ПАА пациенты были разделены на 2 группы: 1) группа больных ПАА младше 14 лет (п=92, из них 52 мальчика и 40 девочек, средний возраст составил 8,1±3,35 лет); 2) группа больных ПАА старше 14 лет (п=55, из них 33 мальчика и 22 девочки, средний возраст составил 15,6±1,98 лет).

Дети с ПАА младше 14 лет и старше 14 лет были разделены в зависимости от пола на 2 подгруппы с соответствующим числом пациентов. У девочек в группе больных ПАА младше 14 лет отмечалось достоверное увеличение частоты встречаемости групп аллелей В*51, ИЯВ 1*15 и Б(ЗВ1*06. Очевидно, что в группе мальчиков, больных ПАА, младше 14 лет особенности распределения аллелей НЬА значительно отличались от таковых у девочек. У мальчиков данной группы отмечались достоверное увеличение частоты встречаемости В*08, В*40 и Б11В 1*03 и снижение частоты встречаемости В*44, БЯВ1*07. Выявлено, что риск развития ПАА у девочек младше 14 лет в 3 раза выше у носителей НЬА В*51 и Б11В1*15 (табл.1).

Наличие В*08, В*40 и БИВ 1*03 в генотипе мальчиков ассоциировано с высоким риском развития ПАА в возрасте до 14 лет. Маркерами протекции к развитию ПАА у мальчиков этой возрастной группы являются В*44 и Б1Ш1*07 (табл.1).

В группе девочек с ПАА старше 14 лет было выявлено достоверное снижение частоты встречаемости НЬА БЫВ 1*04 по сравнению с контролем. Согласно полученным данным, БГШ1*04 является маркером протекции к развитию ПАА у девочек старше 14 лет и сводит риск развития данного заболевания практически к нулю (табл.1).

У мальчиков в группе больных ПАА старше 14 лет было отмечено достоверное увеличение частоты встречаемости В*51 и БКВ1*15 и снижение этого показателя у НЬА БИВ 1*04 по сравнению с контролем. Следовательно, В*51 и БЫВ 1*15 представляют собой маркеры предрасположенности к ПАА у мальчиков данной возрастной группы, причем наличие в генотипе НЬА БИВ 1*15 увеличивает риск развития ПАА более чем в 4 раза. Протекторными свойствами к развитию ПАА у мальчиков старше 14 лет обладает БКВ1*04.

Приведенные результаты наглядно демонстрируют различия маркеров предрасположенности и протекции к заболеванию ПАА по возрасту. По-видимому, в разные возрастные периоды в развитии ПАА принимают участие разные патогенетические механизмы, которые, в свою очередь, вовлекают разные иммуногенетические факторы.

Особенности распределения групп ахчелей ¡ILA у детей, больных ПАЛ, в зависимости от клинической формы заболевания

В связи с возможной ролью иммуногснстичсских факторов в формировании предрасположенности к разным клиническим формам НАЛ, представлялось необходимым исследовать группу детей с идиопатической АЛ (ИАА) (п=135, средний возраст - И,3±5,68 лет) и гепатнт-ассоцнрованной ПАА. Тем не менее, группу с гепатит-ассоцинрованной IIAA не изучали из-за ей малочисленности (12 деіей).

В группе больных детей отмечалось увеличение частоты встречаемости HLA ВМ4, В*51, DRB1*03, DRBI*I5 и DQB1»06 и снижение частоты встречаемости В*38, DRBI *04 (рис. 3). Па популяционном уровне риск развития ИАА у детей-носителей В* 14, DRB1ф 15, либо DQB1 *06 возрастает в 2 и более раза по сравнению с детьми, у которых эти аллели отсутствуют. Маркерами протекции к этой форме ПАА оказались В*38 и DRB1*04.

0*14 B-3« В*51 DRB1-03 DRB1-04 ORBI'15 ООВІ-Ов

■ Контрольная группа (п"1700) Шдвти с ИАА (п=13б)

Рисунок 3. Частота встречаемости групп аллелей НЬА у детей с ИАА и контрольной группе, в долях

Принимая во внимание то, что на развитие ПАА у детей разного пола и возраста влияют разные иммуногенетические факторы, дальнейшие исследования в группе детей с ИАА проводили с учетом данных критериев.

Было установлено, что в группах девочек (п=59) и мальчиков (п=»76) с идиоматической формой АА распределение частоты встречаемости групп аллелей НЬА было подобно наблюдаемому в соответствующих группах больных ПАА. Таким образом, DRBI*I5 и ГХ)В1*06 представляют собой маркеры предрасположенности к развитию идиопатической формы АА у девочек, в то время, как с маркерами В*38 и 1ЖВI *01 связаны протекторные свойства к данной форме заболевания (табл. 2).

Специфическими маркерами предрасположенности к ИАА для мальчиков являются В*08, В*40, DRB1•03, и общими с девочками - маркеры DRB1*15 и 0<?В1«06(табл.2).

Таблица 2

Различия иммуногенетических факторов предрасположенности и протекции к развитию ИЛА в зависимости от пола и возраста

Группы аллелей НЬА Девочки и мальчики (п=135) Девочки (п=59) Девочки младше 14 лет (п=38) Девочки старше 14 лет (п=21) Мальчики (п=76) Мальчики младше 14 лет (п=44) Мальчики старше 14 лет (п=32)

сж С1 (Ж С1 (Ж С1 (Ж С1 (Ж С1 (Ж С1 <Ж С!

В*08 - - - - - 2,22 1,23-3,88 2,42 1,11-4,99 - -

В*14 2 1,02-3,69 -■V ....... - - - : - . ............. - - - - - -

В*38 0,18 0,03-0,62 о 0,001-0,64 - 1 - ; - - - - - - - -

В*40 - - - - - 2,28 1,15-4,28 3,36 1,48-7,12 - -

В*44 - - - 7 ■■. ■ ... 0,4 0,16-0,9 - - - -

В*51 1,99 1,12-3,37 - - 2,96 1,08-7,09 ■! - ■ " - - - - 3,73 1,2-9,9

БКВ1*01 - - 0,21 0,05-0,62 - ■ - - - -

шш*оз 1,62 1,03-2,48 .....-'"'":" :.......- ........... .....-г ............ 2,35 1,38-3,93 2,88 1,48-5,6 - -

ОКВ1*04 0,31 0,15-0,59 г .-........ ■'„■-Г '--/;...... : 0 0,001-0,70 0,27 0,09-0,64 - - 0 0,0-0,47

Р1Ш1*07 - - - 0,4 0,19-0,78 0,28 0,09-0,79 - -

01*81*15 2,81 1,94-4,07 3,06 : 1,76-5,35 3,79 1,86-7,86 ' ■■■ -......... 2,64 1,63-4,26 - - 5 2,28-11,5

Б<2В1*06 2,15 1,43-3,27 2,77 1,48-5,34 2,48 1,17-5.42 : п/а п/а 1,77 1,04-3,07 - - п/а п/а

Были выделены подгруппы девочек с ИАА младше 14 лет (п=38), мальчиков с ИАА младше 14 лет (п=44), девочек с ИАА старше 14 лет (п=21), мальчиков с ИАА старше 14 лет (п=32). На рисунке 4 представлено распределение частоты встречаемости групп аллелей НЬА у мальчиков и девочек с ИАА младше 14 лет и контрольной группе. В группе девочек с ИАА младше 14 лет было отмечено достоверное увеличение частоты встречаемости НЬА В*51, 0[Ш1*15, ОС>В1*06. В группе мальчиков с ИАА младше 14 лет выявлено статистически значимое увеличение частоты встречаемости НЬА В*08, В*40, 01Ш1*03 и снижение ОГШ1 *07. Необходимо отметить, что риск заболеть идиопатической формой АА у девочек младше 14 лет-носителей ОЯВ1*15 возрастает по сравнению с не носителями более чем в 3,5 раза.

В группе девочек с ИАА старше 14 лет отмечалось достоверное снижение частоты встречаемости НЬА ВИЗ 1*04, при этом в группе мальчиков с ИАА старше 14 лет было обнаружено значимое увеличение встречаемости В*51 и ВГШ1*15 и снижение НЬА БИВ 1*04 по сравнению с контролем. Следовательно, наличие БЫВ 1*04 у детей этой возрастной группы ассоциировано с протекцией к заболеванию ИАА независимо от пола, в то время как наличие В*51 и ОГШ1 *15 в генотипе мальчиков ассоциировано с предрасположенностью к данной форме заболевания. Наличие в генотипе НЬА ОЯВ1*15 увеличивает риск развития заболевания у мальчиков старше 14 лет в 5 раз.

В связи с тем, что ИАА является преобладающей формой в диагнозе ПАА, распределение частоты встречаемости групп аллелей НЬА у больных ПАА формируется преимущественно соответствующими показателями в группе больных ИАА детей. Следовательно, именно данным фактом можно объяснить отсутствие существенных отличий в спектре иммуногенетических маркеров ПАА и её идиопатической формы.

Однако для большинства иммуногенетических маркеров предрасположенности к ИАА у детей показатели ОЯ были больше, чем рассчитанные для маркеров ПАА. К примеру, это отмечено для ОЯ у маркера ОЯВ1*15 в группах девочек (011=3,06) и мальчиков (ОЯ=2,64) с ИАА и в группах девочек (ОЯ=2,74) и мальчиков (ОЯ=2,29) с ПАА. Это обусловлено тем, что статистическая обработка результатов типирования детей с ИАА, была проведена без учёта результатов детей с гепатит-ассоциированной АА. В этой связи можно предположить, что выявленные иммуногенетические маркеры являются значимыми для ИАА, а возникновение гепатит-ассоциированной АА обусловлено отличным от ИАА патогенезом с вовлечением иных иммуногенетических маркеров. Следовательно, у носителей ВЯВ1*15 существует высокий риск заболеть именно идиопатической формой АА.

ВДмочшеИАЛкладие 14 пет (п-38| ИКоитрогкнав группа (п»1700) а кЦльчло* с ИАА иладше 14 лет (п=44)

Рисунок 4. Частота встречаемости групп аллелей HLA у мальчиков с НАЛ младше 14 лет, девочек с ИАА младше 14 лет н контрольной группе, в долях

Особенности распределения групп аыелей НИ у детей с ПАЛ в зависимости от тяжести заболевания

Интенсивность возникающих патологических реакций в патогенезе ПАА предположительно связана с индивидуальным профилем HLA-системы и детерминирует различную степень тяжести этого заболевания. Для проверки данной гипотезы было проведено исследование частоты встречаемости групп аллелей HLA в группах со сверхтяжелой и тяжелой формой ПАА. Степень тяжести АА у пациентов устанавливалась на основании классических модифицированных критериев Camitla/F.BMT (1976, 1988 г.) Пациенты в зависимости от формы тяжести ПАА были разделены на 3 группы: I) пациенты с тяжелой формой ПАА - 41 ребенок, из них 25 мальчиков н 16 девочек, средний возраст составил И,36±4,03 лет; 2) пациенты со сверхтяжелой формой ПАА - 71 ребенок, из них 38 мальчиков и 33 девочки, средний возраст составил 9,44±4,61 лет; 3) пациенты со срсднстяжелой формой ПАА - 5 детей, из них 3 мальчика и 2 девочки, средний возраст составил 13,8±4,32 лет.

Изучение частоты встречаемости групп аллелей HLA было проведено в группах со сверхтяжелой и тяжелой формой ПАА.

На рисунке 5 показано распределение частоты встречаемости групп аллелей HLA в группе пациентов со сверхтяжелой формой ИАА (п=71) по сравнению с контрольной. В опытной группе отмечалось достоверное увеличение частоты встречаемости HLA В* 14, DRB1*03, DRB1*I5, DQBl'06, при этом, на популяционном уровне наибольший риск развития сверхтяжелой формы ПАА ассоциирован с группами аллелей HLA В* 14, DRB1 * 15 и DQB1 *06 (табл.3).

Для выявления различий в факторах предрасположенности к развитию сверхтяжелой формы ПАА в зависимости от пола группа детей со сверхтяжелой формой ПАА была разделена на подгруппы мальчиков (п=38, средний возраст - 9.3±4,73 лет) и девочек (п=33, средний возраст - 9,6±4,54 лет). В отличие от девочек, в группе мальчиков со сверхтяжелой МАЛ было отмечено статистически значимое увеличение частоты встречаемости таких групп аллелей, как HLA В*08 (f-0,161, р»0,003), В* 14 (f-0.073, р-0,04). DRBI *03 (f=O.I75, р=0,003), DRBI*1S (f=0.215. р=0,02). Согласно полученным данным, вышеуказанные группы аллелей представляют собой характерные маркеры предрасположенности к заболеванию сверхтяжелой ПАА у мальчиков, причем у носителей HLA В* 14 или DRBI*03 риск заболеть сверхтяжелой формой ПАА повышается почти в 3 раза (табл. 3).

В группе детей с тяжелой формой ПАА было отмечено достоверное увеличение частоты встречаемости HLA DRB1*15 и снижение DRBI*04 по сравнению с контрольной группой (рис. 6). Пациентов с тяжелой формой IIAA разделить по полу не представлялось возможным ввиду малочисленности получаемых выборок. Согласно данным, представленным в таблице 3, общим маркером предрасположенности к развитию тяжелой формы ПАА у детей и сверхтяжелой формы ПАА у мальчиков является группа аллелей HLA DRBI* 15, и риск заболеть этими формами у детей-носителей DRBI* 15 по сравнению с не носителями примерно одинаковый. Протек-торными свойствами к развитию тяжелой формы ПАЛ у детей обладает DRBI *04.

B*14 DRB1*03 DRB1-15 ООВГОб

■ Контрольная группа (п=1700) И Дети со сверхтяжелом формой АА (п=71)

Рисунок 5. Частота встречаемости групп аллелей Ш.А в группе пациентов со сверхтяжелой формой ПАА, в долях

о

0КВ1*04

0ЙВГ15

[и Контрольная группа (п»1700) Я Дати с пи—пой ША (пМ1) |

Рисунок 6. Частота встречаемости групп аллелей НІЛ в группе пациентов с тяжелой фор чий Г1АА и коні рольной группе, в долях

Таблица 5

Различим нммуної снетнческнх факторов предрасположенности и протекции к ратвитию ПАА в тависнмости от формы тяжести ПАЛ

[іуппа аллелей НІ.Л Сверхтяжелая форма І1ЛА, мальчики и девочки (о=71) Сверхтяжелая форма ПАА, мальчики (п-38) Сверхтяжелая форма ПАЛ, лсиочки (в=33) Тяжелая форма ПАА, мальчики и девочки (п=41)

и <Ж СІ ОК СІ СЖ СІ СЖ СІ

В*08 . 3,12 1,45-6,45 •

В*14 2,67 1,15-5.60 3,05 1,03-7,67 _ _

ПК В1-03 1,89 1,05-3,32 2,9 1,41-5.74

ІЖВ1 *04 _ . _ 0,19 0,03-0,7

1ЖН1*15 2,23 1,34-3,7 2,25 1,14-4,36 2,28 1,18-4,35

ІЮВІ'Об 2,15 1.24-3,77 п/а о'а п/а п/а п/а п/а

Особенности распределения аллельных групп НИ у детей, больных ПАА. в зависимости от ответа на ИСТ

Одной из актуальных задач при плакировании проведения ИСТ при АА является прогнозирование ответа на терапию (Кулагин АД., 2008 г.). В згой связи значительный интерес с практической точки зрения представляло изучение иммуногенетических факторов, прогнозирующих благоприятный ответ на комбинированную ИСТ, применяемую при ПАА.

У 39 детей (16 мальчиков и 23 девочки, средний возраст - 10,07±4,34 лет) получен ответ на ИСТ (полный, парциальный или минимальный), а у 19 детей (13 мальчиков и 6 девочек, средний возраст - 8,23*4,57 лет) установлено рефрактерное течение ПАА. У остальных детей (г»=89) ответ на ИСТ оценить не представлялось возможным, так как у 41 ребенка была проведена или была запланирована трансплантация костного мозга, у остальных 45 детей либо период наблюдения не был достаточен для оценки, либо не было сведений о проводимой ИСТ. У 3 детей был отмечен рецидив ПАЛ.

Единственной группой аллелей, частота встречаемости которой в исследуемой группе достоверно отличалась от таковой в контрольной, была ГЖВ1»15 (Г=0,285, р=0,0004). В таблице 4 представлены показатели (Ж и С1, рассчитанные для данной группы аллелей.

Таблица 4

Иччуногенетнческне фан-юры предрасположенности детей к рашитию ПАА, чувствительной к комбинированной ИСТ

Группы аллелей II LA Теги (п=39)

OR CI

DRB1*15 3,94 1,99-7,9

Наличие маркера HLA DRB1*15 в генотипе ребенка повышает риск заболеть ПАА почти в 2,5 раза (OR=2,47, CI 1,73-3,53, р=0,0001) по сравнению с детьми, у которых отсутствует эта группа аллелей (см. табл.1) В то же время риск заболеть ПАА. чувствительной к применению ИСТ. у носителей IILA DRBI*I5 возрастает в 4 раза. Таким образом, дети-носители DRBIM5 имеют наряду с высоким риском развития ПАА, больше шансов выздороветь в результате применения ИСТ.

Кроме того, было проведено сравнение частоты встречаемости аллелей HLA в группах детей, ответивших на ИСТ. и рефрактерных к ИСТ (п=19).

ТаблицаS

Частота встречаемости групп аллелей HLA в группах детей с ПАА, ответивших на ИСТ, рефрактерных к ИСТ, в долях

Группы аллелей HLA Ответившие на ИСТ (п=39) Рефрактерные к ИСТ (п=19) р

А*24 f-0,166 1=0 р=0,02

DRBI *15 f4>,285 f=0,105 р-0,02

В группе больных детей, ответивших на ИСТ, частоты встречаемости НЬА Л*24 и DRBI♦15 были, соответственно, в 1,6 и 2,7 раза выше, чем в группе детей, рефрактерных к ИСТ. что позволило считать данные маркеры факторами благоприятного ответа на ИСТ при ПАА.

Особенности распределения групп агяеяей HLA у детей с ПАА После того, как частота встречаемости аллелей IILA была изучена у больных ПАЛ, разделенных на группы, исследование этого показателя было проведено в общей когорте детей с ПАА. Таким образом, можно было оценить, насколько увеличение частоты встречаемости определенного HLA-антигена в отдельной группе больных влияет на частоту его встречаемости в обшей группе.

Группу больных ПАА составили 147 детей (85 мальчиков и 62 девочки) в возрасте от 1 до 18 лет (средний возраст - II,33*5.6 лет). У детей с ПАА по сравнению с контрольной группой было выявлено достоверное увеличение частоты встречаемости HLA Вф14, B*5I, DRB1*03, DRBI'IS, DQBI*06 и снижение частоты встречаемости В*38, DRB1*04 (рис. 7).

■ Контрольная группа (П" 1700) о Дет с ПАА (п»147)

Рисунок 7. Частота встречаемости групп аллелей 1ИЛ у легей с НАЛ и контрольной группе, в долях

Для сравнения полученных результатов приведены сводные таблицы I, 2, 3, содержащие пбпбшеннме снслення о маркерах предрасположенности и протекции к ПАА у детей разных исследованных групп. Анализ данных показал, что профиль антигенов НЬА в группе детей с ПАА практически совпадает с таковым в группе детей с ИАА. Как уже упоминалось ранее, поскольку ИАА является преобладающей формой ПАА, вполне допустимо, что существенных отличий в спектре иммуногенетических маркеров ПАА и ее ндиопатической формы у детей не выявлено.

Обращает на себя внимание тот факт, что частота всгречаемосги группы аллелей Н1.А ОЯВ1*15 была увеличена в изученных подгруппах детей с ПАА, за исключением мальчиков младше 14 лет, девочек старше 14 лет и девочек со сверхтяжелой формой ПАА. Следовательно, этот маркер можно рассматривать в качестве общего маркера предрасположенности к развитию ПАА и, в частности, ИАА у мальчиков старше 14 лет и девочек младше 14 лет. Однако степень его влияния на риск развития ПАА варьирует. Так, при наличии 011В 1*15 риск развития ПАА увеличивается по сравнению с не

носителями в 2 - 5 раз у детей разного пола и возраста и при различных формах ПАА, причем наиболее значителен риск развития идиопатической формы ПАА у девочек младше 14 лет и мальчиков старше 14 лет.

Что касается групп аллелей НЬА ВЧ4, В*51. Ц(Ш1*03, 1Х?В1«06. то возрастание частоты их встречаемости в группе детей с ПАА обусловлено увеличением данного показателя в отдельных группах детей. Так, например, появление НЬЛ В* 14, по-видимому, связано с накоплением данного маркера в группе мальчиков со сверхтяжелой формой ПАА. Увеличение частоты встречаемости В*51 было отмечено у девочек с ПАА младше 14 лет и у мальчиков старше 14 лет, и риск заболеть ПАА у носителей этого маркера увеличивается в 3,31 и 3,73 раза, соответственно. Именно в этой связи, при изучении обшей группы больных ПАА детей наблюдалась достаточно высокая частота встречаемости данного маркера. То же касается группы аллелей НЬА 1ЖВ1 *03, частота которой была наиболее высокой в группе мальчиков со сверхтяжелой формой. Возрастание частоты встречаемости группы аллелей Н1.А [Х}В1 *06 у больных ПАА, вполне вероятно, обусловлено существованием феномена неравновесного сцепления и формированием устойчивого гаплотипа НЬА ЭИВ) * 15-1Х}В1 *06.

Полученные результаты еще раз подтверждают необходимость изучения генетического полиморфизма НГА-системы не только в отношении заболевания в целом, но и в группах больных в зависимости от пола, возраста, клинической формы и других факторов. Это связано с тем, что выявленные НЬА-маркеры предрасположенности могут, к примеру, увеличивать риск заболевания у детей определенного возраста и пола, и не оказывать влияния на остальных. Различие в факторах иммуногенегической предрасположенности позволяет говорить об участии отличающихся механизмов в развитии заболевания у разных популяцнонных групп и по-новому рассматривать уже имеющиеся модели патогенеза ПАА. Таким образом, полученные результаты о НЬА-маркерах предрасположенности н протекции к ПАА могут представлять значительное фундаментальное и практическое значение.

Особенности генетического полиморфизма антигенов ИМ системы у детей, больных МДС

Исследуемую группу составили 39 детей, больных МДС. в возрасте от 1.5 до 17 лет (20 девочек и 19 мальчиков, средний возраст составил 7,8±4,65 лет).

Проведенные исследования показали, что характер распределения частоты встречаемости групп аллелей НЬА класса I и II в группе больных МДС детей и контрольной группе в целом соответствовал таковому в славянской популяции.

Группа детей с МДС ввиду малочисленности не была разделена на подгруппы в зависимости от пола, возраста и формы заболевания.

Как видно из полученных данных, в когорте детей с МДС было обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости групп аллелей НЬА А*11, А*26, В*40, ГЖВI • 14 и снижение частоты встречаемости 1)ОВ1 *02 (рис. 8).

Иммуногенетические факторы предрасположенности и протекции к развитию МДС у детей представлены в таблице 6. Маркерами предрасположенности к развитию МДС у детей являются группы аллелей АФ11, А*26, В*40, 01Ш1*14.

А-11 А-26 В-40 ОЯВ1Ч4 С001-02

■ Контрольная группа (о-1700) ИДетм с МДС (г»-3в) ,

Рисунок 8. Частота встречаемости групп аллелей НЬА в группе детей с МДС и контрольной группе, в долях

Причем у детей-носителей групп аллелей А*П. А*26 риск развития данного заболевания увеличивается более чем в 3 раза, а при наличии НЬА 0ИВ1 * 14 - почти в 4 раза по сравнению с не носителями. Маркером протекции к развитою МДС у детей является 1Х}В1*02.

Таблица 6

Иммуногеиетические факторы предрасположенности и протекции к развитию МДС у детей на популяционном уровне

Группы аллелей НЬЛ Дет « МДС (о—39)

(Ж С1

А*11 3,13 1,37-6,69

А*26 3,02 1.23-6,74

В*40 2,88 1,12-6,63

1ЖНП4 3,% 1,16-10,75

[Х}В1*02 0,33 0,12-0,88

Таким образом, в результате проведенного исследования были обнаружены генетические маркеры предрасположенности и протекции к ПАА у детей славянской популяции, определяющие риск возникновения заболевания в зависимости от пола, возраста, клинической формы, степени тяжести и чувствительности к ИСТ, и генетические маркеры МДС у детей славянской популяции. Полученные данные представляют ие только научный, но и значительный практический интерес, т.к. позволяют проводить генетическое прогнозирование и мониторинг в семьях больных ПАА и МДС.

выводы

1. Общими маркерами предрасположенности к развитию ПАА и, в частности, ИАА для мальчиков старше 14 лет и девочек младше 14 лет славянской популяции являются группы аллелей 01Ш1 * 15 и В*51.

2. Характерным маркером предрасположенности к ПАА и, в частности, ИАА для девочек младше 14 лет является группа аллелей ОС>В1 *06; для мальчиков младше 14 лет - группы аллелей: В*08, В*40, ВЯВ1*03.

3. Общим маркером предрасположенности к заболеванию сверхтяжелой формой у мальчиков и тяжелой формой ПАА у детей славянской популяции является НЬА ВЯВ1*15. Характерными маркерами предрасположенности к развитию сверхтяжелой формы ПАА у мальчиков славянской популяции выступают В*08, В* 14 и ОЯВ1*03.

4. Маркером предрасположенности к развитию ПАА, чувствительной к применению комбинированной ИСТ у детей славянской популяции, является НЬА ОЯВ1*15.

5. Общим маркером протекции к развитию ПАА и, в частности, ИАА для мальчиков старше 14 лет и девочек старше 14 лет является Б11В 1*04; для мальчиков младше 14 лет - Б1Ш1*07. Характерным маркером протекции к развитию ПАА у мальчиков младше 14 лет выступает В*44; к развитию тяжелой формы ПАА у детей -БИВ 1*04.

6. НЬА-маркерами предрасположенности к МДС у детей славянской популяции являются группы аллелей НЬА А*11, А*26, В*40, ОЯВ1*14; маркером протекции к МДС -ОС2В 1*02.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При установлении НЬА-иммуногенетической предрасположенности у детей к ПАА и МДС необходимо учитывать их популяционную принадлежность.

2. Полученные данные распределения генов НЬА-системы у детей, больных ПАА или МДС, характерны для славянской популяции и рекомендуются для использования при проведении подобных исследований в медицинских учреждениях в других регионах России.

3. Детей, в генотипе которых выявлен НЬА-маркер ПАА или МДС, при генетическом прогнозировании рекомендуется относить к группе риска развития соответствующего заболевания.

4. Определение маркеров НЬА-системы целесообразно применять при медико-генетическом консультировании в семье с ребенком, больным ПАА или МДС.

5. Полученные данные о НЬА-иммуногенетической предрасположенности к ПАА рекомендуется использовать для своевременного прогнозирования развития определенной клинической формы заболевания, его тяжести, ответа на ИСТ у больных ПАА.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чумак А.А., Лебедева Л.Л., Пухликова Т.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Масчан М.А. Взаимосвязь антигенов HLA системы с развитием приобретенной апластической анемии и миелодиспластического синдрома у детей в московском регионе. // Материалы V научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ ». - Москва. - 2012г. - с. 24-25.

2. Chumak A., Lebedeva L., Pukhlikova T., Astrelina T., Yakovleva M. Distribution of HLA haplotype frequencies in Russian of Moscow region. // Tissue Antigenes. - 2012. -79 (№6). - P351. - p.576.

3. Chumak A.A., Lebedeva L.L., Pukhlikova T.V., Stavcev D.S., Maschan M.A., Astrelina T.A, Yakovleva M.V., Association between HLA and the development of aplastic anemia and myelodysplastic syndrome among Russian children in the Moscow region. // Tissue Antigenes. -2012.-79 (№6). - P405. - p.587.

4. Чумак A.A., Лебедева Л.Л., Пухликова T.B., Астрелина Т.А., Масчан М.А., Яковлева М.В. Ассоциация антигенов HLA системы с приобретенной апластической анемией и миелодиспластическим синдромом у детей. // Журнал Гематология и трансфузиология. - 2012. - 57(№3). - с.57-58.

5. Чумак А.А., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Значение генетического полиморфизма в патогенезе апластической анемии. // Журнал Вопросы диагностики в педиатрии. - 2012. - 4(№ 4). - с.5-14.

6. Чумак А.А., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Лебедева Л.Л., Пухликова Т.В., Дышлевая З.М., Архипова А.Н. Прогностическое значение иммуногенетических факторов при приобретенной апластической анемии и миелодиспластическом синдроме у детей. // Материалы VI научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения ». Москва, 2012г. - с. 38-40.

7. А.А. Чумак, Т.А. Астрелина, М.В. Яковлева, Л.Л. Лебедева, Т.В. Пухликова, З.М. Дышлевая, А.Н. Архипова, М.М. Азова. Особенности генетического полиморфизма HLA-ангигенов при приобретенной апластической анемии у детей. // Журнал Вестник РУДН, серия Медицина. - 2013. -№1. - с. 15-19.

8. Чумак А.А., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Особенности антигенов HLA-системы в патогенезе развития миелодиспластического синдрома. // Журнал Гематология и трансфузиология. - 2013. - 58(№ 1). - с.38-42.

9. Chumak А.А., Lebedeva L.L., Pukhlikova T.V., Stavcev D.S., Dyshlevaya Z.M., Arkhipova A.N., Astrelina T.A, Yakovleva M.V. Genetic polymorphism of HLA-antigens in children with acquired aplastic anemia. // Tissue Antigenes. -2013.-81 (№5). - P203. -p.381.

10. Chumak A.A., Lebedeva L.L., Pukhlikova T.V., Stavcev D.S., Dyshlevaya Z.M., Arkhipova A.N., Astrelina T.A, Yakovleva M.V. Association between HLA and the development of myelodysplastic syndrome among children in the Moscow region. // Leukemia Research Journal. - 2013. - 37(№6). - P037. -p.539.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - апластическая анемия

АТГ - антитимоцитарный глобулин

ИАА - идиопатическая апластическая анемия

ИСТ - иммуносупрессивная терапия

МДС- миелодиспластический синдром

ПАА - приобретенная апластическая анемия

ПЦР- полимеразная цепная реакция

ЦсА - циклоспорин А

CI - доверительный интервал

f- частота встречаемости группы аллелей HLA

HLA - человеческие лейкоцитарные антигены (Human leukocyte antigen) n/a - not available

OR (odds ratio) - однофакторное отношение шансов

SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) - метод гибридизации с помощью

олигонуклеотидных зондов

SSP (Sequence Specific Primer) - метод ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров

Чумак Анна Александровна (Россия) «Особенности генетического полиморфизма HLA-антигенов при приобретенной апластической анемии и миелодиспластическом синдроме у детей»

Диссертационное исследование посвящено изучению актуальной проблемы в иммуногенетике - изучению особенностей генетического полиморфизма HLA-антигенов при приобретенной апластической анемии (ПАА) и миелодиспластическом синдроме (МДС) у детей. На основании типирования HLA-генов была исследована частота встречаемости различных групп аллелей HLA в контрольной группе и у больных ПАА или МДС детей славянской популяции. Охарактеризованы HLA-маркеры предрасположенности и протекции к развитию ПАА у детей в зависимости от пола, возраста ребенка, а также влияющие на риск развития определенной клинической формы, степени тяжести приобретенной апластической анемии. Выявлены HLA-факторы, являющиеся предикторами благоприятного ответа на иммуносуперессивную терапию у детей, больных ПАА. Охарактеризованы HLA-маркеры предрасположенности и протекции к развитию МДС у детей.

Chumak Anna Aleksandrovna (Russian Federation)

«Characteristics of the genetic polymorphism of HLA-antigens in acquired aplastic anemia and myelodysplastic syndrome in children»

The dissertation research is devoted to the study of the current problem in the immunogenetics - study of the characteristics of the genetic polymorphism of HLA-antigens in acquired aplastic anemia (AAA) and myelodysplastic syndrome (MDS) in children. Based on the typing of HLA-genes the frequency of occurrence of different groups of HLA-alleles has been studied in the control group and in children with MDS or AAA, related to Slavic population. HLA - markers of predisposition and protection to the development of AAA have been characterized in children depending on gender, age of the child, as well as influencing the risk of developing a particular clinical form, the severity of acquired aplastic anemia. HLA -factors that are predictive of a favorable response to immunosuperessive therapy in children with AAA were identified. HLA - markers of predisposition and protection to the development of MDS in children have been characterized.

Заказ № 58-Р/10/2013 Подписано в печать 17.10.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 \4jvy www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Чумак, Анна Александровна, Москва

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи

04201363991

Чумак Анна Александровна

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА НЬА-АНТИГЕНОВ ПРИ ПРИОБРЕТЕННОЙ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ И МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ

У ДЕТЕЙ

03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук Астрелина Т. А. кандидат биологических наук

Азова М.М.

Москва, 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - апластическая анемия

АТГ - антитимоцитарный глобулин

АФ - анемия Фанкони

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ДВА - анемия Даймонда-Блекфана

ИАА - идиопатическая апластическая анемия

ИСТ - иммуносупрессивная терапия

МДС-миелодиспластический синдром

OMJI - острый миелолейкоз

ПАА - приобретенная апластическая анемия

ПЦР- полимеразная цепная реакция

ЦсА - циклоспорин А

CI - доверительный интервал

f - частота встречаемости группы аллелей HLA

GPI-A - гликозилфосфатидилинозитоловый якорь

HLA - человеческие лейкоцитарные антигены (Human leukocyte antigen) n/a - not available

OR (odds ratio) - однофакторное отношение шансов

SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) - метод гибридизации с

помощью олигонуклеотидных зондов

SSP (Sequence Specific Primer) - метод ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Стр. 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Современные представления о главном комплексе 9 гистосовместимости

1.2. Роль генетических факторов в патогенезе 13 апластической анемии

1.3. Роль генетических факторов в патогенезе 37 миелодиспластического синдрома

Глава 3. Особенности генетического полиморфизма антигенов НЬА системы у детей, больных ПАА и МДС (Результаты и обсуждение)

3.1. Особенности генетического полиморфизма антигенов 66 НЬА системы у детей, больных ПАА

3.2. Особенности генетического полиморфизма антигенов 106 НЬА системы у детей, больных МДС

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.3. Статистическая обработка результатов

48

53

61

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

112

117

116

ВВЕДЕНИЕ

Приобретенная апластическая анемия (ПАА) и миелодиспластический синдром (МДС) относятся к группе тяжелых патологий кроветворной системы, сопровождающихся угнетением костномозгового кроветворения. Заболеваемость ПАА составляет 2-3 случая на 1 млн. населения в год в европейских странах и 3-5 случаев на 1 млн. населения в год в странах Азии [72,73,161]. Данный показатель при МДС значительно выше: 3-5 случаев на 100 ООО населения в год [5,25,61,78,103,117]. Однако следует отметить, что 80% заболевших МДС - это люди старше 60 лет. Общая заболеваемость детского населения составляет 3,6 случая на 1 млн. в год [5,61,123].

Около 40 лет назад появились первые результаты исследований распределения антигенов HLA-системы у больных ПАА [23,40]. В 1983 г. было обнаружено, что в разных этнических группах развитие данного заболевания связано с разными антигенами HLA-системы [39]. Появление новой технологии HLA-типирования - полимеразной цепной реакции -позволило выявлять ассоциации заболеваний не с антигенами, а с определенными аллельными вариантами генов HLA. К настоящему времени накоплено значительное количество данных о том, что при возникновении ПАА и МДС важную роль играет наличие конкретных групп аллелей генов HLA. Так, показано, что HLA DRB1*15 является маркером предрасположенности к развитию ПАА и МДС и ассоциируется с благоприятным ответом на иммуносупрессивную терапию (ИСТ) [37,39,69,106,111,125,139]. Также установлена взаимосвязь ПАА с конкретными аллелями. К примеру, ITLA DRB1*1501 ассоциирован с тяжелой и нетяжелой формами апластической анемии (АА), а DRB 1*1302 встречается достоверно реже у пациентов с тяжелой формой ПАА [137]. Выявлено, что определенные HLA-гаплотипы дают более выраженную ассоциацию с ПАА [12,105]. Имеются также данные об ассоциации

циклоспорин-зависимой ПАА с гаплотипом БКВ1* 1501 -БС^АРО 102-БрВ 1*0602, однако они несколько противоречивы [105].

В России изучение особенностей распределения НЬА-аллелей у больных с АА было проведено лишь в популяции Северо-Западного региона [12].

Таким образом, несмотря на многочисленные работы, посвященные исследованию взаимосвязи между индивидуальными

иммуногенетическими факторами и предрасположенностью к развитию ПАА и МДС, сведения о роли антигенов НЬА в патогенезе данных заболеваний противоречивы и требуют дальнейшего изучения. Особо следует отметить, что не охарактеризована частота встречаемости групп аллелей НЬА у больных ПАА и МДС детей славянской популяции. Не установлена взаимосвязь факторов НЬА-системы с риском развития данных заболеваний у здоровых детей славянской популяции в зависимости от возраста и пола ребенка, с клиническими формами, степенью тяжести ПАА и МДС, а также ответом на иммуносупрессивную терапию у детей, больных ПАА. Исследованию данных вопросов, имеющих важное фундаментальное и прикладное значение, и посвящена настоящая работа.

Цель исследования

Изучить генетический полиморфизм НЬА-антигенов при приобретенной апластической анемии и миелодиспластическом синдроме у детей.

Задачи исследования

1. Изучить частоту встречаемости различных аллельных групп генов НЬА у больных ПАА детей и здорового населения славянской популяции.

2. Выявить ассоциации между группами аллелей НЬА и предрасположенностью к развитию ПАА, клинической формой и степенью тяжести данного заболевания в зависимости от пола и возраста ребенка.

3. Установить взаимосвязь между группами аллелей НЬА и ответом больных ПАА детей на ИСТ.

4. Исследовать характер распределения групп аллелей НЬА-системы I и II класса у детей с МДС и здорового населения славянской популяции.

5. Выявить НЬА-маркеры предрасположенности и протекции к заболеванию МДС у детей.

Научная новизна

Впервые изучено распределение генов НЬА I и II класса у больных ПАА детей славянской популяции в зависимости от пола, возраста, клинической формы, степени тяжести заболевания и ответа на ИСТ.

Впервые выявлено, что общими генетическими маркерами предрасположенности к развитию ПАА и, в частности, идиопатической апластической анемии (ИАА) у мальчиков старше 14 лет и девочек младше 14 лет славянской популяции являются НЬА Б11В1*15 и В*51. Охарактеризованы специфические генетические маркеры предрасположенности к развитию ПАА и, в частности, ИАА у девочек младше 14 лет (БС>В1*06), у мальчиков младше 14 лет (НЬА В*08, В*40 и 011В1*03).

Впервые установлены характерные генетические маркеры заболевания сверхтяжелой ПАА у мальчиков (НЬА В*08, В* 14, БКВ1*03, ЭЯВ1 * 15) и тяжелой ПАА у мальчиков и девочек (НЬА БИВ 1*15).

Впервые выявлено, что НЬА ОКВ1*15 представляет собой прогностический генетический маркер ПАА, чувствительной к применению ИСТ, у детей славянской популяции.

Впервые изучено распределение генов НЬА класса I и II у больных МДС детей славянской популяции и выявлены генетические маркеры, определяющие риск возникновения МДС: НЬА А*11, А*26, В*40, БКВ1*14.

Впервые выявлены общие маркеры протекции к развитию ПАА и, в частности, ИАА. К их числу у мальчиков старше 14 лет и девочек старше 14 лет относится БИВ 1*04, у мальчиков младше 14 лет - Б11В1*07. Также показано, что характерным маркером протекции к развитию ПАА у мальчиков младше 14 лет выступает В*44, к развитию тяжелой формы ПАА у детей - БИВ 1 *04; МДС у детей - БС>В 1*02.

Практическая значимость

В результате проведенного исследования на основе типирования полиморфных НЬА-генов с помощью молекулярно-генетического метода были выявлены иммуногенетические маркеры предрасположенности и протекции к развитию ПАА у детей в зависимости от возраста, пола, предрасположенности к клиническим . формам заболевания, тяжести течения и ответа на ИСТ.

Вероятное прогнозирование риска развития ПАА и МДС у детей на основе анализа генетического полиморфизма НЬА-генов позволит верифицировать диагноз на начальных этапах развития заболевания.

Данные об иммуногенетических маркерах ПАА и МДС у детей в зависимости от возраста и пола позволят педиатрам, врачам-гематологам, терапевтам своевременно диагностировать заболевание, выявлять группу риска и проводить генетическое прогнозирование и мониторинг в семьях больных ПАА и МДС.

Важное практическое значение имеет обнаружение у детей НЬА-маркеров заболевания ПАА, позволяющих прогнозировать тяжесть течения и ответ на иммуносупрессивную терапию.

Положения, выносимые на защиту:

1. Характер частотного распределения групп аллелей НЬА у больных ПАА или МДС детей славянской популяции имеет существенные отличия от их распределения среди здорового населения той же популяции.

2. Изучение иммуногенетических факторов у детей, больных ПАА и МДС, позволяет выявить маркеры НЬА, определяющие риск возникновения заболевания у здорового детского населения.

3. Профиль НЬА-маркеров предрасположенности и протекции к развитию ПАА у детей имеет характерные особенности, зависящие от пола и возраста ребенка и ассоциированные с клинической формой и тяжестью заболевания, а также ответом на ИСТ у больных детей.

4. Данные об НЬА-маркерах ПАА и МДС у детей могут быть использованы для прогнозирования течения соответствующего заболевания и ответа на иммуносупрессивную терапию.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о главном комплексе гистосовместимости

Главный комплекс гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex - МНС) расположен у человека на 6-й хромосоме и занимает участок ДНК длиной до 4x106 пар оснований, включающий около 200 генов [19,22]. Основными особенностями комплекса являются его значительная полигенность — наличие нескольких неаллельных генов, белковые продукты которых сходны в структурном отношении и выполняют идентичные функции, а также полиморфизм - присутствие многих аллельных вариантов одного и того же гена. Все гены комплекса наследуются по кодоминантному типу [6,22].

Главный комплекс гистосовместимости у человека включает три группы генов [22]:

1. гены, контролирующие молекулы I класса (классические гены HLA - А, -В, -С ; неклассические -Е, -F, -G, -Н);

2. гены, контролирующие молекулы II класса (DP, DQ, DR); к этой же группе генов относятся LMP и ТАР, продукты которых не презентируют антиген, но участвуют в его внутриклеточной обработке и образовании комплекса антигенного пептида с молекулами МНС;

3. гены III класса, не причастные к молекулам гистосовместимости и презентации антигена, но ответственные за синтез компонентов системы комплемента (С2, С4, фактор В), фактора некроза опухолей - а и (3, ферментов, участвующих в синтезе гормонов.

Наиболее важными в иммунологическом отношении гликопротеинами, контролируемыми комплексом, являются антигены I и II классов, регулирующие отторжение или приживление аллотрансплантата. Их структура была определена с помощью рентгеноструктурного анализа.

Молекула НЬА I класса состоит из тяжелой цепи, включающей три домена: а1, а2, и аЗ, и одной легкой цепи - р2-микроглобулина. Связывание антигенного пептида молекулой I класса происходит в антигенсвязывающей щели, дно которой образовано Р-складчатостыо доменов полипептидной цепи, а стенки а — спиральными участками доменов. В построении этой антигенсвязывающей полости принимают участие а1 и а2 - домены тяжелой цепи [98].

Молекула НЬА II класса представляет собой гетеродимер, состоящий из двух нековалентно связанных цепей: аир, каждая из которых включает два домена: а1, а2, и р1, Р2, соответственно. Антигенсвязывающая область организована также, как у молекул НЬА I класса. Однако в построении этой области принимают участие а1 и Р1 - домены соответствующих цепей [22,98].

В молекулах НЬА антигенный пептид встраивается в полость путем заякоривания в её дно.

Между молекулами I и II классов видно структурное сходство: однотипная пространственная организация, количество доменов, принцип построения антигенсвязывающей области.

Молекулы класса I представлены на мембране всех клеток организма, кроме эритроцитов, нейронов и клеток трофобласта [4, 22]. Молекулы класса II экспрессируются на иммунокомпетентных клетках, принимающих участие в формировании иммунного ответа: активированных эндотелиальных, эпителиальных и тучных клетках, макрофагах, дендритных клетках, В-лимфоцитах [4].

1.1.1. Полиморфизм и номенклатура НЬА.

В настоящее время гены НЬА-А, В, С, Б11, и БР представляют собой наиболее полиморфные гены из числа известных у человека. В связи с использованием высокоразрешающего НЬА-типирования в клинической практике, количество выявленных аллелей в каждом из этих локусов

постоянно возрастает [102]. На июль 2012 года общее количество аллелей в локусах HLA составило 8016 [101]. В таблице 1 представлено количество известных аллелей по различным генам HLA. Пептиды, кодируемые аллелями представленных генов, могут отличаться друг от друга по 1-30 аминокислотным остаткам. Номенклатуру аллелей и локусов HLA определяет Номенклатурный Комитет по системе HLA (ВОЗ), который отслеживает обнаружение новых аллелей и регулярно публикует список вновь открытых аллелей HLA. В базе данных Комитета (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla) хранится информация о сиквенсах аллелей [101,102]. Перечень аллелей HLA, выявленных на основании секвенирования, утверждается Номенклатурным Комитетом по системе HLA и ежемесячно публикуется в журнале Tissue Antigens, кроме того, полный список аллелей регулярно представляется в журналах European Journal of Immunogenetics и Human Immunology.

Таблица 1

Аллельный полиморфизм классических генов HLA

Гены системы HLA Количество известных аллелей

Класс I

А 2013

В 2605

С 1551

Класс II

DRA 7

DRB1 1159

DQA1 47

DQB1 176

DPA1 34

DPB1 155

Все аллели в соответствии с последовательностью нуклеотидов объединены в группы аллелей. Различия в последовательности нуклеотидов у аллелей, относящихся к одной группе, существенно меньше, чем между аллелями разных групп.

1.1.2. Роль НЬА-антигенов в индукции иммунного ответа.

В связи с огромным значением в трансплантологии долгое время молекулы НЬА рассматривали с точки зрения антигенов гистосовместимости. Однако позднее было обнаружено, что молекулы НЬА выполняют в организме множество функций [4]. После того, как в середине 70-х годов прошлого века Р.Цинкернагелем и П.Догерти было обнаружено, что Т-клетки способны распознавать не чужое, а «измененное свое», то есть распознавать антиген не в свободной форме, а после его встраивания в состав молекул НЬА, стало ясно, что эти антигены играют ключевую роль в индукции и реализации иммунного ответа [46].

В молекулы НЬА I класса встраиваются пептиды эндогенного происхождения, образующиеся в результате деградации в цитоплазматических органеллах - протеасомах. В дальнейшем образовавшиеся пептиды транспортируются в эндоплазматический ретикулум и при контакте с молекулами НЬА I класса встраиваются в их полость. В составе мембран эндоплазматического ретикулума этот комплекс перемещается вначале в аппарат Гольджи, а затем на поверхность клетки [22,55].

Пептиды, презентируемые в составе НЬА II класса, имеют экзогенное происхождение. Поглощенные в результате эндоцитоза внеклеточные антигены попадают в эндосомы. С эндосомой сливаются секреторные везикулы, формирующиеся из аппарата Гольджи и содержащие встроенные в мембрану молекулы НЬА II класса. После экзоцитоза сформированной таким образом эндосомы, её мембрана сливается с мембраной клетки, и молекулы НЬА II класса со встроенными в их полость пептидами оказываются на клеточной поверхности [55].

К настоящему моменту установлено, что два описанных пути процессинга антигенов не изолированы друг от друга, и существует явление перекрестной презентации, которое объясняет, например, как реализуется цитотоксический иммунный ответ на экзогенные антигены с участием С08+-Т-лимфоцитов и молекул HLAI класса [22,65].

Взаимодействие Т-лимфоцитов с антигенами HLA происходит при участии вспомогательных молекул - корецепторов - CD4 и CD8. С доменом (32 продукта МНС класса II связывается молекула CD4, являющаяся маркером Т-хелперов, а с доменом аЗ продукта МНС класса

I соединяется а-цепь CD8, маркера клеток Т-цитотоксических лимфоцитов. Распознавание пептидов в контексте молекулы МНС класса

II ведет к формированию популяции клеток Т-хелперов 1, необходимых для индукции и пролиферации Т-цитотоксических лимфоцитов, и Т-хелперов 2, индуцирующих гуморальный иммунный ответ. Распознавание пептидов в контексте молекулы МНС класса I ведет к формированию популяции Т-цитотоксических лимфоцитов и реализации клеточного цитотоксического иммунного ответа [4,22].

Особенности структуры антигенсвязывающей щели молекул HLA обусловливают предпочтение в связывании одних пептидов и невозможность связывания других [22]. Следовательно, от того, насколько эффективно антигенный пептид презентируется Т-клеткам, зависит интенсивность иммунного ответа. Таким образом, посредством данного механизма осуществляется контроль иммунного ответа на генетическом уровне и детермини�