Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетической вариабельности Т-лимфоцитов и характеристика патологических клонов при аутоиммунных заболеваниях

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетической вариабельности Т-лимфоцитов и характеристика патологических клонов при аутоиммунных заболеваниях"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На пратх рукописи

ЧКАЛИНА АННА ВАЛЕРЬЕВНА

Изучение генетической вариабельности Т-лимфоцитов и

У .

характеристика патологических клонов при аутоиммунных заболеваниях

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005020735

і

Москва-2012

Работа выполнена в лаборатории сравнительной и функциональной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель: д. б. н. Юрий Борисович Лебедев

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, д.б.н., профессор

Сергей Михайлович Деев

Ведущий научный сотрудник Центра «Биоинженерия» РАН, к.б.н.

Михаил Анатольевич Эльдаров Ведущая организация: Центральный НИИ туберкулеза РАМН

Защита состоится «18» апреля 2012 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Автореферат разослан » уиак^ 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета доктор физ.-мат. наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время аутоиммунные заболевания относятся к числу основных медицинских проблем, требующих внимания. На данный момент известно более 80 различных аутоиммунных заболеваний человека. Причиной аутоиммунных заболеваний являются нарушения функционирования иммунной системы, в результате которых клетки иммунной системы атакуют органы и ткани собственного организма. Для ряда аутоиммунных состояний есть основания предполагать, что причиной развития может являться клональная экспансия аутореактивных Т-клеток. К таким заболеваниям относятся различного рода артриты, диабет I типа, рассеянный склероз.

Одним из аутоиммунных заболеваний, относящихся к группе артритов, является анкилозирующий спондилит (АС, болезнь Бехтерева, заболевание Штрумпелля-Мари). Генетические причины возникновения и развития этого заболевания окончательно не выяснены. По современным представлениям его можно отнести к мультигенным заболеваниям, так как показана корреляция между присутствием в геноме ряда аллельных вариантов генов с повышенным риском развития АС. Учитывая жесткую сцеплепность риска развития АС с одним из НЬА-В аллелей, кодирующим вариант молекулы МНС-1 типа, в настоящее время предполагается активное участие Т-клеток в развитии заболевания. Существующие гипотетические модели развития АС предполагают вклад в развитие заболевания различных типов взаимодействия внешних и внутренних факторов, так как наследуемость АС не является 100% среди монозиготных близнецов, подразумевая вклад факторов окружающей среды. В настоящий момент считается, что определяющим этапом и характеристическим признаком развития АС является изменение репертуара Т-лимфоцитов.

Данная работа посвящена изучению репертуара Т-лимфоцитов у больных АС, проведению систематического долговременного анализа и выявлению случаев Т-клеточной клональной экспансии, а также определению характеристик предположительно патогенных Т-клонов.

Выявление и характеристика клональной экспансии Т-лимфоцитов у больных АС, изучение динамики клонов Т-клеток в ходе заболевания вносят вклад в понимание механизмов возникновения аутоиммунных заболеваний в целом. Также, полученные данные о патогенных клонах Т-клеток при АС могут быть использованы для разработки средств терапии, профилактики и методов ранней диагностики.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось выявление клональной экспансии Т-лимфоцитов, характеристика и долговременный мониторинг патогенных клонов при анкилозирующем спондилите.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1) Получение ранжированных клонотек кДНК (3-цепей ТкР.

2) Масштабное секвенирование и анализ нуклеотидной последовательностей зрелых

генов р-цепей ТкР.

3) Характеристика высокопредставленных клонов Т-лимфоцитов.

4) Количественная оценка клональной экспансии.

5) Изучение стабильности олигоклональной экспансии во времени.

Научная новизна и практическая значимость работы

Работа была выполнена в рамках проекта «Комплексное изучение молекулярно-генетических причин нарушений толерантности Т-клеток иммунной системы организма человека при аутоиммунных заболеваниях». Данная работа посвящена идентификации предположительно патогенных клонов Т-лимфоцитов у больных анкилозирующим спондилитом.

По результатам настоящей работы предложен подход к систематическому анализу репертуара периферических Т-лимфоцитов и мониторингу клональной экспансии Т-клеток у больных АС. Такой подход позволяет не только выявлять выраженную экспансию индивидуальных клонов Т-лимфоцитов, но и изучать динамику изменения репертуара Т-клеток при аутоиммунных заболеваниях. Подход также применим для функциональной характеристики перепредставленных клонов Т-лимфоцитов.

Впервые был проведен систематический анализ Т-клеточной клональной экспансии при аутоиммунном заболевании, заключающийся в выявлении и количественной оценке клональной экспансии на протяжении длительного периода времени. Разработанный нами подход позволил охарактеризовать выявленные Т-клоны по ряду маркеров, характеризующих функционально различные субпопуляции Т-лимфоцигов, без искажения результатов, вызываемого культивированием in vitro.

Одним из основных результатов стало выявление стабильной Т-клеточной экспансии нескольких клонов. В том числе, обнаружен сложный клонотип включающий клоны, происходящие от нескольких предшественников, но экспрессирующие сходные по строению зрелые гены Т-клеточного рецептора с высокогомологичными антигенраспознающими

(С0113)-доменами. Полученные результаты существенно расширяют современные представления о молекулярных и клеточных механизмах развития и течения анкилозирующего спондилита.

Выявленные патогенные клоны могу служить маркерами заболевания и в дальнейшем мишенями для специфической терапии в клинической практике. Разработанный подход можно использовать при различных нарушениях функционирования иммунной системы, при которых наблюдается Т-клеточная клональная экспансия.

Апробация работы и публикации

Результаты работы представлялись на отечественных и международных конференциях, в том числе на XXI зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009), 15th International Summer School on Immunology "IMMUNE SYSTEM: GENES, RECEPTORS AND REGULATION" (Hvar, Croatia, 2009), 4th ESF Conference on functional genomics and disease, Dresden, Germany, 2010), 14th International congress on immunology (Kobe, Japan, 2010), European Human Genetics Conference 2011 (Amsterdam, The Nederlands, 2011), 36th FEBS Congress (Torino, Italy, 2011).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в российских и зарубежных журналах.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на I ¿^страницах, содержит ^ рисунков и таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и библиографического списка, включающего '¿^источников.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Получение библиотек р-цепей - клонотек р-цепей.

В ходе работы основное внимание было направлено на исследование разнообразия зрелых генов (3 -цепей содержащих вариабельные части (У-гены) 25 наиболее представленных, по литературным данным, в пуле зрелых генов ТкР семейств У-генов. Для выполнения данной задачи была разработана система праймеров, позволяющих специфически амплифицировать зрелые гены ТкР отдельных У-семейств.

Для изучения клонального разнообразия ТкР и мониторинга клональной экспансии Т-клеток периферической крови у больных АС нами был разработан подход, заключающийся в масштабном секвенировании, включающем гипервариабельный участок зрелых генов Р-цепи ТкР (СБЮ). Участок СБЛЗ образуется в ходе рекомбинации различных У-генов и фрагментов О и I и в основном обеспечивает специфичность ТкР к антигену.

Для получения клонотек Р-цепей ТкР были использованы образцы периферической крови двух ЖЛ-В*27-положительных пациентов с подтвержденным клинически и рентгенологически диагнозом «анкилозирующий спондилит». На момент исследования возраст пациентов составлял по 45 лет. Первые проявления болезни были зафиксированы около 20 лет. Первому больному на протяжении последних 3 лет каждые 1.5 месяца проводилась терапия препаратом Ремикейт, второму больному терапия препаратом Ремикейт проводилась один раз.

Из образцов периферической крови больных была выделена мононуклеарная фракция клеток с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте раствора фиколла. Из клеток мононуклеарной фракции периферической крови был выделен образец тотальной РНК, содержащий транскрипты зрелого гена ТкР. Далее проводили синтез первых цепей кДНК с использованием праймера олигоТ. Полученные образцы первых цепей кДНК использовались для специфической амплификации, с праймерами комплементарными вариабельному участку р-цепи и константному региону, и получения библиотек ПЦР-продуктов, содержащих фрагменты последовательностей зрелых генов ТкР с определенными участками У-генов.. Схема получения ампликонов ВУ-семейств ТкР представлена на рисунке 1.

BV„_F ->

Рисунок I Схема получения ампликонов для BV-семейств ТкР. BV„ вариабельная область гена ТкР; N - короткие нуклеотиды произвольного состава; D, J и С - D-, J-и константная область зрелого гена ТкР; горизонтальными стрелками обозначены расположение и ориентация праймеров, специфичных к вариабельной области BVn семейств ТкР (праймеры BVn_F)H константной области С (праймер T_uni_new_R).

Полученные ампликоны BV-семейств ТкР были клонированы в плазмидный вектор. После трансформации клеток E.coli были получены ранжированные библиотеки для 25 BV-семейств ТкР двух больных болезнью Бехтерева.

2. Секвенирование и анализ структуры ß-цепей ТкР.

Первичная структура клонированных ПЦР фрагментов ß-цепи ТкР была определенна, в среднем, для 96 клонов каждой из 50 ранжированных BV-клонотек ТкР. В целом, получено по 2400 сиквенсов ß-цепи ТкР для каждого пациента.

В результате количественного анализа состава клонотек ß-цепей ТкР была выявлена множественная клональная экспансия Т-клеток у двух пациентов АС. Мы допускали, что экспансия Т-клеток присутствует только в тех BV-семействах ТкР, в которых было выявлено более 5% идентичных аминокислотных последовательностей CDR3 участков. Полученные данные отражены в таблице 1.

Всего было выявлено 22 примера клональной экспансии. У пациента SL клональная экспансия найдена для 17, а у AV для 4-х из 25 проанализированных BV-семейств. Представленность клонотипов варьируется от 3,3% до 38% от семейства. Наиболее представленный клон для пациента SL BV1-VAL - 38%, для пациента AV клон BV7-YTP -17%.

Наряду с группами идентичных кДНК ТкР, характеризующих каждый из клонотипов, проведенный сравнительный структурный анализ позволил выявить шесть групп зрелых генов ТкР, которые обладают высокой степенью гомологии с клонотипом SL_BV2-DTG. Все шесть выявленных типов структуры ТкР предполагаемых клонов периферических Т-лимфоцитов обладают сходным строением - ВV2-D(D1 или D2)-BJ2.7-BC. Отличия в общей структуре 6 типов зрелых генов ТкР заключаются в присутствии одного из двух возможных вариантов D района и наличии различных по числу и составу нуклеотидных оснований, которые встраиваются в процессе VDJ рекомбинации и фланкируют D участок зрелого гена.

Согласно результатам проведенного анализа, следует исключить существование общего предшественника у обнаруженных клонов Т-лимфоцитов.

Таблица 1. Структура СРЮ и представленность основных Т-клонотипов.

Пациент БЬ Семейство Р-цепи ТкР Название клона Аминокислотная последовательность участка СІЖЗ ТкР выявленных Т клонов %♦

ВУ1 ВУ1-УАЬ ІЛТСАБЗУАІЛЗЬМУЕОУРОР 38

ВУ2 БУг-БТв УІСЗЛІШОТСТСУЕ(у/РОРО 10

ВУЗ ВУЗ-ЕТв ЬСАЗКЗЬЕТСтдрдНРСОО 3.8

ВУ4 ВУ4-УІ«Ї ЗЗГіХСЗУІШЗЕВТдУРОРС 9.3

ВУ5 ВУ5-08Я ЬУЬСАЗЗЗОАОЗЯТдУРСРО 4.9

ВУ6 ВУ6-ОУТ УІ.СА5800УТСЕІ.РР0ЕС5ІІ 3.7

ВУ7 ВУ7-ТТС ЬУЬСА55РТТСТ1АОТОУТР И

ВУ8 ВУ8-УАй УРСАБКУАОАКСКЕдРРСРС 5

ВУ9 ВУ9-ОЬО УРСАЗАОЬСРОРККРЗТЗОд 4.6

ВУ10 ВУІО-ІШО РСАЗБКАїиУВРТАКУІЛТОА 36

ВУ11 ВУП^Б У1-СА85Е*РШЖОАУР\\Т1КЬ 8

ВУ12 ВУ12-Ш) УУРСА180М8\¥ЕдУТСРСТ11 3.3

ВУ13 вуїз-доо УРСА88дССЕдУРСРСТКЬТ 16

ВУ14 BV1-RWG YFCASRWGSRADTQYFGPGT 8.4

ВУ15 ВУ15-805 1ЛТСАТ8В8НР118и:Ь8НдК 19.4

ВУ16 ВУ16-ЕОЯ РСАЗвдЕВІШТЕУСУТРОЗС 22.4

ВУ17 ВУ17-1ШУ СА88ШШУОУТРС8С 17

Пациент УА ВУ5 ВУ5-ЬБТ САБЗЬБТЕАРРОдО 10

ВУ7 ВУ7-УТР САБЗУТРСдСЕАРРСдС 17

ВУ7 вУ7-ды САВмдьюстосзкдрднрооо 11

ВУ9 ву9-дур САЗЗдУРРЕОРРСРС 12

ВУ14 ВУМ-РЕв САЗБРЕСКУСУТРСЗО И

* % от общего числа проанализированных клонов клонотеки (ВУп)

Последующий анализ структуры ТкР заключался в сравнении строения СБЯЗ доменов всех шести типов ТкР. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности ТкР Т-клонов в области СБЮ, являющиеся уникальными и определяющими специфичность Т-клеточного рецептора, представлены на рисунке 2. Как следует из данных, приведенных на рисунке, антиген-распознающий домен 6-ти типов ТкР имеет весьма близкое строение. В первом положении СЭЮ домена близкие по свойствам аминокислоты алифатического ряда (аланин или глицин) найдены у 5-ти типов. Совпадающие или близкие по свойствам

аминокислоты также обнаружены в положениях 3 и 5 большей части сравниваемых ТкР. Аминокислоты во втором и четвертом положениях совпадают у всех 6-ти типов. Последовательность из 16-ти аминокислотных остатков (положение 6-21) является полностью идентичной. Выявленная крайне высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей СОИЗ доменов рассматриваемых типов ТкР может указывать на идентичность узнаваемого ими пептида. Из сравнении результатов анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей СБЮ участка ТкР мы сделали предположение о независимом происхождении Т-клеточных клонов из различных тимоцитов, активированных посредством взаимодействия со структурно схожим(и) или идентичным(и) антигеном(ами).

Под тип ТСЇІ

ТИПІ ТТСТАСАТС И У I Тип2 ТТСТАСАТС Б У I ТипЗ ТТС ТАС АТС И У I Тип4 ТТСТАСАТС

И У I Тип5 ТТС ТАС АТС

р У I Типб ТТС ТАС АТС Р У I

ВУ2

ТЄС АСТ С Б ТОС АйТ С в ТвС АбТ С в ТвС АбТ

С в ТОС АвТ

С Э ТОС АЄТ С Э

ЄСТ АСА А Я ОСТ АвА А Я ССТ АвА А К вСТ АСА

А Я ОСТ АвА

А Я вСТ АСА А Я

вСО ОАТ АСС ООв АСА СОС ТАС ОАО САв ТАС ТТС ООО ССв ССС АСС АСС СТС АСС вТС АСА ОАО

ООТОТОУЕОУРСРСТЯІТУТ Е ССС ОАТ АЄС ООО ААТ ОЄС ТАС ОАО САС ТАС ТТС ООО ССО ООС АСС АО О СТС АСв втс АСА вАО

А, Г) и с; X С V К с V Р О )• с, т Я і Т V Г Е ОСТ О АС АСС ОСС САТ ОСС ТАС САС САй ТАС ТТС ОСО ССО ООС АСС АОО СТС АСО ОТС АСА ОАО С Э й О Н С У ЕрУРОРСТКЬТУТЕ ОСС САС АСв ОСС ОАО ССС ТАС ОАС САв ТАС ТТС ССС ССО СОС АСС АСС СТС АСС ОТС АСА ОАй А В 1 Ш Е ¡ТЯЕТУТ Е

САС САТ АОв ООО СОС ОСй ТАС ОАС САО ТАС ТТС ООО ССО ССС АСС АСС СТС АСС ОТС АСА ОАО

Е О И О ЯО У ЕрУ Р О Р в Т К і, Т УТ Е ООС САС АСО ССА САС ССС ТАС ОАО САв ТАС ТТС ОСС ССС ООС АСС АСС СТС АСС ОТС АСА ОАО О И Л О Е <Э У Ё ;<3 У О Р О Т Я Ь Т V :.Т Е

ВС

ОАС СТО ААА ААС ОТО ТТС

И Ь К N V Р САС СТО ААА ААС ОТО ТТС Б Е К N V Г ОАС СТС ААА ААС СТО ТТС О Ь К N V Р ЄАС СТО ААА ААС СТО ТТС Б Ь К N V Р ОАС СТО ААА ААС ОТО ТТС Б Е К N V Р ОАС СТО ААА ААС ОТО ТТС Б Е К N V Р

Рисунок 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности Т-клеточного рецептора ВУ2 семейства выявленных Т-клонов. ТС К В\'2 - обозначена вариабельная область гена соответствующая второму семейству ТкР; (№)„ О(ІЧ) - обозначена гирервариабельный участок гена ВУ2 семейства ТкР; Еи - .(-регион ТкР; ВС - константная область гена ТкР; рамкой выделена гипервариабельная область (СБЮ) и 1-регион генов ТкР ВУ2 семейства; серым цветом выделены идентичные аминокислоты во всех шести типах ТкР Т-клонов; серым цветом и жирным шрифтом обозначены идентичные аминокислоты, присутствующие в двух и более типах ТкР; серым цветом и подчеркиванием обозначены не идентичные аминокислоты относящиеся к одному классу (алифатические

3. Мониторинг клональной экспансии.

С целью подтверждения предполагаемой экспансии Т-клеточных клонов, несущих однотипные ТкР, была разработана и применена схема мониторинга Т-клонов в крови пациента на протяжении трех лет наблюдения. Для определения динамики изменения представленности каждого из Т-клонов в общем пуле периферических Т-лимфоцитов были подобраны дискриминирующие праймеры для каждого ранее выявленных клонотипов ТкР ВУ-семейств и проведена количественная ПЦР серии образцов кДНК. Праймеры использованные для количественной ПЦР, были специфичны к последовательности СБЯЗ участка зрелых генов ТкР изучаемых ВУ-семейств. Для повышения специфичности количественной ПЦР была разработана схема двустадийного ПЦР-анализа суммарной кДНК периферических Т-лимфоцитов (рисунке 3).

Ампликон В\'-п семейства

Bv-n Р

количественная ПЦР

Bv-n

Т uni new R

Bv-n F

BV-n N D N

BV-n

N

N

Bv-n mj type

ПЦР продукт CDR3 Т-клона

Bc_uni_Rs

ПЦР продукт В V-n семейства

Рисунок 3. Схема двустадийной ПЦР. BV-n - обозначена вариабельная область гена соответствующая одному из изучаемых семейств ТкР; N- произвольные нуклеотиды; D - D область гена ТкР; J - J область гена ТкР; С - константная область гена ТкР; расположение и ориентация праймеров специфичных к вариабельной области BV-n (праймер BV-n_F), константной области С (праймер T_uni_newJR), константной области С и J региону (праймер BC_uni_Rs) и гипервариабельному участку (праймеры Bv-n mj type )гена BV-n ТкР обозначены горизонтальными стрелками.

На первой стадии с помощью селективной ПЦР были амплифицированы кДНК библиотеки ТкР семи семейств BV с использованием праймеров Bv-n_F и T_uni_new_R. Далее, на второй стадии анализа, мы проводили количественную ПЦР в режиме реального времени с использованием праймера Bv-n_F и одного из специфических праймеров BV-n_mj, с использованием в качестве матрицы 20-кратного разведения ПЦР продуктов, полученных на первой стадии. Параллельно проводилась количественная ПЦР

амплификация кДНК ТкР всего семейства с использованием «заглубленного» праймера Т_ит_пе\у_]18. Таким образом, с помощью ПЦР в реальном времени была проведена количественная оценка экспансии Т-клонов относительно общего числа периферических Т-лимфоцитов, несущих анализируемое семейство ТкР. Данные количественных ПЦР, обработанные согласно математической модели Пфафла, приведены в таблице 1 для каждого из ранее выявленных СБЮ-типов Т-клонов семи ВУ-семейств.

Таблица 2. Мониторинг представленности амплифицированных Т-клонов у пациента 5Ь.

Т-клон Аминокислотная ноябрь июнь май

последовательность Т-клонотипа (СБЮ-регион) 2005 2006 2008

ВУ1-УАЬ СА88УАЬСиМУЕ(2УРСРО 50.2% ±6.8% 52.8% ±7% 61.0% ±2%

вуг-Бтв СЗАИСОТСТСУЕОУРСРС 12.1% ±1% 15.8% +/1.1% 10.8% ±1.3%

ВУ4-У1Ю С5УКС8ЕОТ<ЗУРОРО 4.3% ±0.3% 3.0% ±0.3% 3.8% ±0.9%

ВУ7-ТТС СА58РТТСТ1Л^СУТР050 6.4% ±0.8% 7.1% ±0.9% 5.7% ±0.7%

ВУ14-К\УС СА811\УС81Ш)Т<2УРСРО 5.6% ±0.5% 6.1% ±1.5% 4.7% ±1.15%

ВУ16-Е01* СА88<ЗЕ01К;ТЬУСУТР080 5.3% ±0.4% 4.4% ±0.9% 4.5% ±0.1%

ВУ17-ШУ СА581ШКУСУТРС50 9.6% ±0.4% 6.5% ±1.4% 10.5% ±0.6%

Нами было более детально рассмотрено семейство ВУ2, так как для него было выявлено наличие составного клонотипа, включающего 6-ть подтипов высокогомологичных ТкР. Для выявленных подтипов Т-клонов ВУ2 семейства, так же, были подобраны праймеры специфичные к последовательности СБЮ участка зрелых генов ТкР. Далее, с использованием подхода, описанного выше, была дана количественная оценка представленности данных подтипов в общем пуле периферических Т-лимфоцитов. Полученные в результате количественных ПЦР данные, обработанные согласно математической модели Пфафла, приведены на рисунке 4 для каждого из шести выявленных типов СБЮ ТкР ВУ2 семейства Т-клонов.

Для всех исследуемых в настоящей работе клонов Т-лимфоцитов показана явно выраженная, относительно стабильная и долговременная клональная экспансия.

Полученные результаты представляют один из немногих опубликованных случаев одновременной продолжительной и стабильной экспансии нескольких Т-клеточных клонов, происходящих от различных предшественников, но экспрессирующих сходные по строению зрелые гены ТкР с высокогомологичными СБЮ доменами, в периферической крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями.

(а)

(6)

0-1—.—,—,—;—,—,—,—,—,—,—,—,—,—,--—,—,—

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40

время, месяц

время, месяц

(В)

(Г)

-*-ВУ21уре5 -»- Ву2|уре6

время, месяц

время, месяц

Рисунок 4. Динамика изменения представленности Т-клонов Г!\'2 семейства ТкР.

(а) - динамика изменения представленности Т-клона первого типа (тип 1 на рис. 4а) относительно общей популяции ВУ2 Т-лимфоцитов; (б) - представленность Т-клонов типов 3 и 4; (в) - Т-клона тип 5 и 6; (г) - Т-клона тип 2 .

4. Функциональная характеристика отдельных Т-клонов.

На основе литературных данных мы предположили, что обнаруженные перепредставленные клоны Т-лимфоцитов могут находится в различных функциональных состояниях и принадлежать к разным субпопуляциям Т-клеток. Для характеристики субпопуляций используются различные методы, основанные на дифференциальной экспрессии различных мембранных молекул (поверхностных маркеров, СО) разными субспопуляциями клеток в зависимости от их функционального статуса.

Для функциональной характеристики ранее выявленных стабильных Т-клонов мы использовали метод проточной цитофлуориметрии для разделения клеток на субпопуляции, с последующим количественным анализом содержания перепредставленных Т-клонов с помощью ПЦР в реальном времени.

Из образцов периферической крови пациента SL были выделены несколько субпопуляций Т-лимфоцитов, различных по степени активации, а также разделенных по маркерам цитотосических и хелперных субпопуляций: CD4/CD8, CD27/CD28, CD45.

Использованный подход позволил охарактеризовать ранее выявленные Т-клоны, избегая их индивидуального выделения из периферической крови с последующим культивированием in vitro, что могло привести к ошибочной оценке распределения по субпопуляциям, вследствие изменений уровня экспрессии маркеров в условиях in vitro.

На первом этапе реализации данной задачи, общий пул моноцитарных клеток периферической крови был разделен на две субпопуляции по маркерам CD4 и CD8, в результате мы получили четыре фракции: CD4-/CD8-, CD4+/CD8+, CD4+/CD8-, CD4-/CD8+. Из каждой полученной фракции была выделена тотальная РНК и построены первые цепи кДНК. Оценка представленности ранее выявленных клонов проводилась с помощью ПЦР в две стадии. На второй стадии использовались СЭКЗ-специфические праймеры, соответствующие последовательности гипервариабельной области обнаруженных перепредставленных клонов. Полученные продукты амплификации были проанализированы с помощью электрофоретического анализа в 1,2 % агарозном геле. Фрагмент электрофоретического анализа представлен на рисунке 5.

СОВ*} | Bv?/®v7TT<i

¡4-Iiv J-jRWO

I!v -1KWO

Рисунок 5. Фрагмент электрофоретического анализа для амплифицированных клонов ВУ14-ьдас и в\7-ттс.

Из рисунка 5 видно распределение выявленных Т-клонов по субпопуляциям СБ4/С08.

При анализе указанных четырех субпопуляций было показано, что большинство амплифицированных клонов относятся к С08+ субпопуляции, т.е. к цитотоксическим Т-лимфоцитам, и только один клон является СБ4+ - т.е. относится к субпопуляции Т-хелперов. Результаты представлены в таблице 3.

Используя аналогичный подход, были получены образцы первых цепей кДНК для следующих субпопуляций Т-лимфоцитов: СБ27-/С028-, СБ27+/Сё28+, С027-/СБ28+, СОП+Ют-, а также: С027-/СП451Ъ\-, С027+/С045ЯА+, СП27-/СП45ЯА+, СОП+!СТ)45КА-. Далее бьша дана количественная оценка представленности Т-клонов с помощью ПЦР в реальном времени, с использованием СОЯЗ-специфических праймеров. Результаты суммированы в таблице 3.

В настоящее время считается, что цитотоксические Т-лимфоциты (СГ38+ Т-лимфоциты) с фенотипом С028+/С13451<А- или СВ27+/С045ЛА- являются клетками памяти не способными к продукции перфорина, либо продуцируют его на низком уровне, но продуцируют цитокины. СБ8+ Т-клетки с фенотипом С028-/СП45ЯА+ или С027-/С04511А+ - являются короткоживущими терминальными эффекторами Т-клеток и обладают высокой степенью продукции перфорина и ограниченным уровнем продукции цитокинов. С О 8+ Т-клетки с фенотипом С028-/С045КА- или СШ7-/С045ЯА- продуцируют перфорин на среднем уровне и представляют собой промежуточное звено между эффекторными клетками и Т-клетками памяти, т.е. эффекторные Т-лимфоциты памяти.

Из представленных в таблице 3 данных видно, что амплифицированные клоны ВУ1-УАЬ, ВУ2-БТС, и ВУ7-ТГС практически полностью состоят из клеток с фенотипом СЭ27-/СБ28-, что характеризует высокую цитотоксичность данных Т-клонов. Так же клетки клона ВУ1-УА1, и ВУ2-ОТС по большей мере относятся к эффекгорным Т-лимфоцитам памяти, и в меньшей к эффекторным Т-клеткам. Клон ВУ7-ТТО на 90% состоит из клеток с фенотипом СБ27-/ОЭ4511А+, что относит его к группе эффекторных Т-лимфоцитов и так же подтверждает его высокую цитотоксичность. Клон ВУ16-ЕОЯ в большей степени несет фенотип С027+/СЭ45Е1А- или СВ28+/С045ЯА-, на основании чего его можно отнести к Т-лимфоцитам памяти. Клон ВУ17-ГШУ так же в большей степени состоит из клеток памяти имеющих фенотип С027+/СВ45ЫА-. Клон ВУ14-К.\¥0 относится к субпопуляции хелперных Т-лимфоцитов и так же его можно отнести к эффекторным клеткам памяти.

Обнаруженные нами, стабильно существующие перепредставленные клоны Т-лимфоцитов в основном представляют собой популяцию цитотоксических короткоживущих терминально дифференцированных эффекторных клеток, практически не представленных клетками памяти. За исключением клонов ВУ16-ЕВЯ и ВУ17-1ШУ, большая часть которых является клетками памяти.

Таблица 3. Количественная представленность стабильных амплифицированных клонов в ряде субпопуляций Т-лимфоцитов.

Амплифицирова иные Т-клоны (пациент SL) CD4 / CD8 CD27/CD28 фракции CD27/CD45RA фракции

CD27+ CD28+- CD27+ CD28- CD27-CD28+ CD27-CD28- CD27+ CD45RA+ CD27+ CD45RA- CD27-CD45RA- CD27-CD45RA+

BV1VAL CD8 - - 2% 98% - - 66% 33%

BV2DTG CD8 - - 2% 98% - - 66% 33%

BV4VRG CD8 66% 33% - - нд нд - -

BV7_TTG CD8 - - - 100% - - 10% 90

BV14RWG CD4 - - 66% 33% - - 100% -

BV16EDR CD8 50% 25% - 25% - 75% 25% -

BV17_RNY CD8 - 66% - 33% - 66% - 33%

% - удельное содержание Т-лимфоцитов указанного клонотипа в пуле фракции С027/'С028. 5. Поиск партнерской а-цепи ТкР

Поскольку взаимодействие ТкР с антигеном в составе МНС I класса определяется сф-гетеродимером ТкР, мы сделали попытку определения партнерских a-цепей для клонов BV1 семейства.

Для выявления партнерской a-цепи был разработан новый экспериментальный подход, заключавшийся в оценке разнообразия a-цепей ТкР в популяции Т-лимфоцитов, экспрессирующих ТкР BV1 семейства. Из образца крови пациента SL, для которого ранее была показана высокая представленость Т-клона BV1- VAL, была выделена субпопуляция Т-клеток, экспрессирующих ТкР BV1 семейста. Из клеток полученной моноцитарной фракции была выделена тотальная РНК и построены первые цепи кДНК.

Для реализации поставленной задачи была разработана система праймеров, позволяющих амплифицировать кДНК широкого набора отдельных AV-семейства ТкР. Получение ПЦР-библиотек AV-семейств с образца кДНК осуществляли с использованием пары праймеров, TRAV„ , соответствующего вариабельной части aV гена ТкР, и Alpha_ const, соответствующего константной части гена a-цепи ТкР (рисунок 6).

АУП іог

>

Alpha const

Рисунок 6. Схема ПЦР: получение ПЦР-библиотек АУ-семейств. Расположение и ориентация праймеров обозначены горизонтальными стрелками.

Продукты амплификации были проанализированы с помощью электрофоретического анализа в 1,2% агарозном геле, представленном на рисунке 7.

Mr 9 10 И 12 13 19/14 16 18

Mr 19 20 21 22 23/29 24 25 26

Рисунок 7. Качественный анализ 31-го гена а-цепей ТкР.

По результатам ПЦР-анализа сделано заключение, что в исследуемом образце кДНК фракции ВУ1+ Т-клеток наиболее представленной является а-цепь 38го семейства.

Для подтверждения полученных результатов нами была произведена количественная оценка представленности транскрипта гена 38 семейства а-цепей ТкР относительно транскриптов всех генов альфа цепей, имеющихся в образце РНК из выделенной популяции ВУ1+ Т-клеток. Количественную оценку производили методом ПЦР в реальном времени. Эксперимент проводили в трех независимых повторностях. Полученные данные представлены в виде графика зависимости относительной флуоресценции от количества циклов ПЦР на рисунке 8 и были обработаны согласно математической модели Пфафла.

20 ЦИКЛЫ

Рисунок 8. Количественная оценка транскрипта гена 38 семейства а- цепей ТкР.

Доля АУ38 относительно общего количества а-цепей была рассчитана согласно формуле:

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

(Е дУюіаі) АУюМІ

АУ38,% = - х100%

(Е АУ38)С'ау38

Е-эффективность ПЦР-амплификации, оценивалась с помощью программы ЬіпВ^РСІІ.

Значение Сі было выбрано выше уровня базовой флуоресценции, в пределах фазы экспоненциального накопления флуоресцентного продукта реакции. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Расчет % АУ38 по методу Пфафла.

Независимые ЕАУ38 СІДУ38 Едісяаі С1А№Ы АУ38, % Средняя

повторносте АУ38, %

1 1,975 29,14 1,981 28,27 60,27 55,42 ±6,13

2 1,98 28,8 1,979 28,01 57,48

3 1,988 29,43 1,976 28,63 48,53

6. Н1а-типирование пациентов АС.

Известно, что важнейшим фактором патогенеза АС является семейная

предрасположенность, маркером которой считается одна из разновидностей антигена

-18 -

гистосовместимости НЬА-В27 - молекулы МНС-1 типа, являющиеся лигандами для ТкР цитотоксических лимфоцитов. На данный момент для ряда аллельных вариантов МНС показана связь с повышенным риском развития АС.

Нами было проведено генотипирование по 4м локусам МНС-1 типа: НЬА-А, В, С и Е обоих пациентов АС.

Первые цепи кДНК из клеток периферической крови пациентов были получены стандартным способом, описанным в разделе Материалы и методы. Далее, с помощью универсальных праймеров НЬА-й)г/НЬА-геу, специфичных к консервативным областям белок-кодирующих последовательностей всех четырех локусов (НЬА-А, В, С и Е), была наработана библиотека ПЦР-продуктов для каждого пациента. После очистки ПЦР-библиотеки были клонированы в плазмидный вектор.

Из клонов, несущих по результатам скрининга (с помощью бело-голубой селекции и ПЦР) целевую вставку, была выделена плазмидлая ДНК и проведено определение первичной последовательности вставки. Для каждого пациента было отсеквенировано по 200 клонов.

После сравнения полученных нами последовательностей кДНК с последовательностями аллельных вариантов ЯХЛ-локусов, доступных на интернет-ресурсе http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ для обоих пациентов были определены подгруппы аллелей по локусам НЬА-А, -В, -С и Е. Результаты отражены в таблице 5.

Пациент НЬА-А НЬА-В НЬА-С Н1А-Е

БЬ А02 В38, В2705 Cw2.2, Cwl203 Е0101

УА А26, А01 Bw72, В2705 Cw2.2 Е0101

Выводы

1. Создан новый экспериментальный подход к оценке репертуара периферических Т-лимфоцитов и идентификации клональной экспансии основанный на масштабном секвенировании кДНК (5-цепей Т-клеточных рецепторов и сравнительном структурном анализе антиген-распознающего домена.

2. Показано, что индивидуальные репертуары Т-лимфоцитов больных анкилозирующим спондилитом характеризуются выраженной устойчивостью и долговременно олигоклональной экспансией. В составе репертуаров двух больных выявлен 21 преобладающий клонотип Т-лимфоцитов.

3. Определено фенотипическое разнообразие выявленных клонотипов. Установлено, что единственный найденный клонотип Т-хелперов представлен исключительно эффекторными клетками памяти, а каждый из шести охарактеризованных клонотипов СБ8+ цитотоксических лимфоцитов состоит из нескольких субпопуляций Т-лимфоцитов с преобладанием либо эффекторных клеток, либо клеток памяти.

4. Впервые выявлен сложный клонотип цитотоксических Т-лимфоцитов, включающий шесть подтипов независимо сформировавшихся клонов Т-клеток, Т-клеточные рецепторы которых обладают высокогомологичными антиген-связывающими доменами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ:

1) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Chkalina A.V., Staroverov D.B., Amosova A.L., Mishin A.S,. Kurnikova M.A., Zvyagin I.V., Mutovina Z.Y., Gordeev A.V., Khaidukov S.V., Sharonov G.V., Shagin D.A., Chudakov D.M., Lebedev Y.B.. Individual characterization of stably expanded T cell clones in ankylosing spondylitis patients //Autoimmunity. 2009; 42(6): p. 525-536.

2) Чкалниа A.B., Звягин И.В., Мамедов И.З.,. Британова О.В, Староверов Д.Б., Лебедев Ю.Б.. Олигоклональная экспансия Т-клеток: изучение ее стабильности во времени // Биоорганическая химия. 2010; 36(2): с. 206-214

3) Zvyagin I.V., Mamedov I.Z., Britanova O.V., Staroverov D.B., Nasonov E.L., Bochkova A.G., Chkalina A.V., Kotlobay A.A., Korostin D.O., Rebrikov D.V., Lukyanov S., Lebedev Y.B., Chudakov D.M.. Contribution of functional KIR3DL1 to ankylosing spondylitis // Cellular and Molecular Immunology. 2010; 7(6): p. 471-476.

4) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Bolotin D.A., Chkalina A.V., Staroverov D.B., Zvyagin I.V., Kotlobay A.A., Turchaninova M.A., Fedorenko D.A, Novik A.A., Sharonov G.V., Lukyanov S., Chudakov D.M., Lebedev Y.B.. Quantitative tracking of T cell clones after haematopoietic stem cell transplantation // EMBO Mol Med. 2011; 3(4): p.201-207.

5) Britanova O.V., Staroverov D.B., Chkalina A.V., Kotlobay A.A., Zvezdova E.S., Bochkova A.G., Chudakov D.M. Single high-dose treatment with glucosaminyl-muramyl dipeptide is ineffective in treating ankylosing spondylitis // Rheumatol Int. 2011; 31(8): p. 1101-1103.

Материалы конференций:

1) Чкалипа A.B., Звягин И.В., Мамедов И.З., Лебедев Ю.Б. Новый метод выявления клональной экспансии Т-лимфоцитов. // XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009; сборник тезисов, с. 60.

2) Звягин И.В., Чкалина А.В., Котлобай А.А., Анисимова В.Е., Мамедов И.З., Лебедев Ю.Б. Создание гибридных белков, содержащих TCR-Vb, для элиминации семейства Т-лимфоцитов // XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009; сборник тезисов, с. 58.

3) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Chkalina A.V., Zvyagin I.V., Staroverov D.B., Amosova A.L., Chudakov D.M., Lebedev Y.B. Detection, study of stability and characterization of expanded T cell clones in patients with AS // 15th International Summer School on Immunology "IMMUNE SYSTEM: GENES, RECEPTORS AND REGULATION", Hvar, Croatia, 2009; Abstract book, p. 134.

4) I.V. Zvyagin, I.Z. Mamedov, A.V. Chkalina, D.M. Chudakov, S.A. Lukyanov, Y.B. Lebedev. Involvement of KIR3D receptor functional variants in ankylosing spondylitis initiation. // New Biotechnology. Abstracts of the 4th ESF Conference on Functional Genomics & Disease. Dresden, Germany, 2010; 275: p. s60.

5) I. V. Zvyagin, V. Y. Dorodnykh, I. Z. Mamedov, A. V. Chkalina, D. M. Chudakov, Y. B. Lebedev. Analysis of association of 5 ERAP1 SNPs and KIR3D alleles in patients with ankylosing spondylitis. // 14th International Congress on Immunology, Kobe, Japan, 2010; Abstract book, p. il28.

6) I. V. Zvyagin, I. Z. Mamedov, A. V. Chkalina, V. Y. Dorodnykh, D. M. Chudakov, S. A. Lukyanov, Y. B. Lebedev. Role of KIR3D receptor functional variants in ankylosing spondylitis. // European Journal of Human Genetics. Abtracts of the European Human Genetics Conference 2011. Amsterdam, The Netherlands, 2011; 19(S2): p. 383.

7) I. Zvyagin, V. Dorodnykh, I. Mamedov, D. Khmelkova, A. Chkalina, D. Chudakov, S. Lukyanov, Y. Lebedev. Analysis of association of several non-MHC loci with ankylosing spondylitis in Russian population // FEBS Journal. Abstracts of the 36th FEBS Congress. Torino, Italy, 2011; 278(S1): p. 255.

Заказ № 43-а /03/2012 Подписано в печать 12.03.2012 Тираж 80 экз. Усл. пл. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihzak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чкалина, Анна Валерьевна, Москва

61 12-3/1304

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

ЧКАЛИНА АННА ВАЛЕРЬЕВНА

Изучение генетической вариабельности Т-лимфоцитов и характеристика патологических клонов

при аутоиммунных заболеваниях

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСИОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Генетические факторы предрасположенности к развитию анкилозирующего спондилита

Анкилозирующий спондилит: история открытия и современное представление. 6

Генетические факторы развития анкилозирующего спондилита 7

МНС кластер генов и Анкилозирующий спондилит 8

Антиген гистосовместимости HLA В-27 в патогенезе Анкилозирующего спондилита 9

Роль HLA-B27 в патогенезе, гипотезы развития анкилозирующего спондилита 16

- Презентация на HLA-B27 артритогенных пептидов и гипотеза

молекулярной мимикрии 16

- Ошибочная сборка тримолекулярного комплекса HLA-B27 19

- Неправильный фолдинг белковых компонентов HLA-B27 21

-Повышенная репликативная активность внутриклеточных бактерий,

связанная с HLA-B27 22

Связь повышенного риска развития анкилозирующего спондилита

с другими генами МНС 23

- HLA гены кластера МНС I 23

- HLA гены кластера МНС II 25

- ТАР и LMP гены кластера МНС II 26

- HLA гены кластера МНС III 28

Связь аллельных вариантов не МНС генов с риском развития анкилозирующего

спондилита 29

- ген рецептора 1Ь 23 30

- ген ЕЯАР 1 и анкилозирующий спондилит 31

- АЭТХЯ2 34

- САШ)9 35

- СУР2Б6 36

-ТСРВ1 37

-Связь вариабельности генов КЖ рецепторов 1ЧК клеток с АС 38

- Кластер генов 11Л и анкилозирующий спондилит 40

-Локусы 21р15 и 2Ц22 41

Клональная экспансия Т-клеток 42

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46

- Материалы и методы 46

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 58

Цели и задачи исследования 59

Получение библиотек р-цепей - клонотек р-цепей. 60 Секвенирование и анализ Р-цепей. Подклоны семейств. Клональная экспансия 63

Мониторинг клональной экспансии 68

Функциональная характеристика отдельных Т- клонов 71

Поиск партнерской а-цепи 76

Н1а-типирование пациентов с анкилозирующим спондилитом 79

ВЫВОДЫ 81

БЛАГОДАРНОСТИ 82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 83

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АС - анкилозирующий спондилит (болезнь Бехтерева) ТкР - Т-клеточный рецептор; BV_n - семейства ТкР, классификация по р-цепи; AV_n- семейства ТкР, классификация по а-цепи BV, BD, BJ, ВС - основные структурные домены Р-цепи ТкР;

CDR3 - антигенсвязывающий участок ТкР (от анг. complementarity-determining region);

SNP- однонуклеотидный полиморфизм (от анг. SNP- single nucleotide polymorphism)

ФНО - фактор некроза опухоли Р2ш - Р2 микроглобулин н.о. - нуклеотидные основания

Введение

В настоящее время аутоиммунные заболевания относятся к числу основных медицинских проблем, требующих внимания. На данный момент известно более 80 различных аутоиммунных заболеваний человека. Причиной аутоиммунных заболеваний являются нарушения функционирования иммунной системы, в результате которых клетки иммунной системы атакуют органы и ткани собственного организма. Для ряда аутоиммунных состояний есть основания предполагать, что причиной развития может являтся клональная экспансия аутореактивных Т-клеток. К таким заболеваниям относятся различного рода артриты, диабет I типа, рассеянный склероз.

Одним из аутоиммунных заболеваний, относящихся к группе артритов, является анкилозирующий спондилит (АС, болезнь Бехтерева, заболевание Штрумпелля-Мари). Генетические причины возникновения и развития этого заболевания окончательно не выяснены. По современным представлениям его можно отнести к мультигенным заболеваниям, так как показана корреляция между присутствием в геноме ряда аллельных вариантов генов с повышенным риском развития АС. Учитывая жесткую сцепленность риска развития АС с одним из НЬА-В аллелей, кодирующим вариант молекулы МНС-1 типа, в настоящее время предполагается активное участие Т-клеток в развитии заболевания. Существующие гипотетические модели развития АС предполагают вклад в развитие заболевания различных типов взаимодействия внешних и внутренних факторов, так как наследуемость АС не является 100% среди монозиготных близнецов, подразумевая вклад факторов окружающей среды. В настоящий момент считается, что определяющим этапом и характеристическим признаком развития АС является изменение репертуара Т-лимфоцитов.

Выявление и характеристика клональной экспансии Т-лимфоцитов у больных АС, изучение динамики клонов Т-клеток в ходе заболевания вносят вклад в понимание механизмов возникновения аутоиммунных заболеваний в целом. Также полученные данные о патогенных клонах Т-клеток при АС могут быть использованы для разработки средств терапии, профилактики и методов ранней диагностики.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Генетические факторы предрасположенности к развитию анкилозирующего спондилита

Анкилозирующий спондилит: история открытия и современное представление.

Анкилозирующий спондилит (АС) - заболевание известное человечеству еще с античных времен, впервые было обнаружено при археологических изучениях египетских мумий. В 1559 году Реалдо Коломбо обнаружил характерные изменения для АС при описании скелета человека, которые были детально задокументированны в книге «Анатомия». Бернард Коннор, ирландский врач, в 1693 году описал скелет человека, в котором тазовая кость, поясничные позвонки, крестец, грудные позвонки с ребрами были сращены в единую кость. В конце восемнадцатого века появляются несколько клинических описаний АС, но на сегодняшний день первым описанием анкилозирующего спондилита считается описание сделанное русским врачом Владимиром Бехтеревым в 1893 году, тогда же болезни было присвоено второе название «Болезнь Бехтерева», которое до сих пор используется.

Анкилозирующий спондилит - хроническое воспалительное заболевание, поражающее осевой скелет и крестцово-подвздошные сочленения человека. Распространенность АС достаточно велика от 0,05% до 1,1%, в зависимости от региона. Основной особенностью протекания заболевания является постоянное воспаление суставов, при котором происходит постепенное ограничение их подвижности, которое в дальнейшем приводит к образованию анкилозов - сращиванию костей друг с другом. При уменьшении гибкости позвоночника, так же ограничивается подвижность суставов, связывающих ребра с грудными позвонками, что приводит к нарушению дыхания и ослаблению вентиляции легких.

Основное отличие АС от различного рода артритов это ограничение подвижности суставов, редко сопровождающиеся разрушением их, что является характерным для артритов.

Генетические факторы развития анкилозирующего спондилита

Анкилозирующий спондилит, одно из заболеваний, для которого был определен наследственный маркер, которым является один из генов главного комплекса гистосовместимости НЬА-В27. Есть предположение, что анкилозирующий спондилит является мультигенным заболеванием и НЬА-В27 не единственный ген, который определяет предрасположенность и развитие АС. Гены, с которыми установлена на данный момент ассоциация с АС представлены в таблице 1.

Таблица 1. Генетические ассоциации с анкилозирующим спондилитом.

Группа генов Продукты групп генов

ША-В27 HLA-B27 аллели

не Н1А-В27 МНС гены HLA-B60, HLA-B61, HLA-DRB1 *01, HLA-DRB1 *07, HLA-DRB1 *08, HLA-DRB1 *06, LMP2, LMP7, HSP-70, MIC, ТАР

Другие ассоциации с АС, отличные от генов МНС IL-1, IL-23R, ARTS, Kir-гены, CYP2D6 ANTXR2, CARD9, ERAP 1, TGFB1

МНС кластер генов и анкилозирующий спондилит

Гены главного комплекса гистосовместимости (МНС) человека образуют регион более 4 млн. п.о., формируя кластер на 6 хромосоме.((Ме1гга and Kaur 2003) Схематически гена МНС представлены на рисунке 1.

Chromosome 6

Tel Long arm Cen Short arm Tel

1II II I И I I I in ■■■ I ■■

DP DM DQ DR C4 C2Hsp70TNF ВС E A G F

lllllll Mill III ¡IN 111 II"-HH^

Gene map of the human leukocyte antigen (HLA) region

Expert Reviews in Molecular MedicmeC2003 Cambridge University Press Рисунок 1. Гены главное комплекса гистосовместимости.

Продукты генов МНС I и II принимают непосредственное участие в презентации пептидов, в составе комплексов МНС-пептид на поверхности антиген-презентирующей клетки. Продукты генов МНС III класса - белки системы комплемента. Между кластерами данных генов расположены гена, продукты который не относятся к МНС. Это гены, продукты которых непосредственно участвуют в иммунном ответе (TNFa, TNFb, HSP70) и гены-участники процессинга антигена, при подготовке к презентации его пептидов в составе МНС I или II(LMP и ТАР) (Paul 2008).

Кластер генов МНС-I представлен большим количеством генов, наиболее изученными являются гены ITLA-A, HLA-B и HLA-C. Продукты зрелых генов представляют собой мембраносвязанные тяжелые цепи в комплексе с р2микроглобулином (ß2m). ß2m образует с продуктами генов HLA гетеродимер и необходим для стабилизации структуры HLA. Функция продуктов генов МНС-I - презентация пептидов антиген распознающим клеткам иммунной системы. В результате распознавания реализуется цитотоксический ответ, если на поверхности антиген презентирующей клетки представлен вирусные пептиды или пептиды характерные для трансформированной клетки в составе МНС I.

Антиген гистосовместимости HLA В-27 в патогенезе анкилозирующего

спондилита.

HLA-B27, относится к антигенам гистосовместимости класса I (МНС I), и, соответственно, играет важную роль в развитии иммунитета против внутриклеточных вирусов и бактерий. Ген HLA-B2 7 расположен на 6 хромосоме, в составе суперлокуса HLA, к которому также относят гены МНС II и III классов, а также ряд других. Для локуса HLA-B, как и для других локусов МНС-I, характерна крайне высокая степень полиморфизма, в результате чего в популяции присутствует большое количество аллельных вариантов, кодирующих структурно различающиеся полипептиды. В настоящее время для локуса HLA-B описано более 2000 аллельных вариантов (включая аллели, не различающиеся на уровне белкового продукта, а также нулевые аллели).

Белки МНС I класса экспрессируются на поверхности всех ядерных клеток организма, включая антиген презентирующие клетки. После транскрипции гена HLA-B27 и сборки третичной структуры, белок связывается с §2-микроглобулином и олигопептидом, который в норме является продуктом протеолиза собственных белков. Тримолекулярный комплекс перемещается посредством аппарата Гольджи на клеточную поверхность, где презентируется CD8+ Т-лимфоцитам или рецепторам NK-клеток.

Важной характеристикой структуры HLA-B27, отличающей его от всех остальных МНС I, является наличие свободной тиольной (сульфгидрильной) группы Cys 67 (Madden 1995; Powis, Santos et al. 2009). Такая особенность структуры определяет способность молекулы HLA-B27 формировать гомодимер из двух полипептидных цепей МНС, не ассоциированный с р2-микроглобулином.

Еще одной особенностью структуры HLA-B27 является наличие остатка аргинина в положении 116, при участии которого происходит «заякоревание» пептида в положении P2.(Allen, O'Callaghan et al. 1999). Структура молекулы HLA-B27 представлена на рисунке 2. .

Рисунок 2. Структура молекулы HLA-B27. Цифрами обозначены наиболее значимые аминокислотные остатки в молекуле HLA-B27.

Аминокислотные остатки цистеина 67 и глутаминовой кислота 45 являются общими для всех вариантов HLA-B27, кодируемых аллелями, для которых показана ассоциация с риском развития АС. Наличие гистидина в положении 9 является ключевым аминокислотным остатком, отвечающим за стабильность комплекса антиген-Р2 микроглобулин (Piazza, Menozzi et al. 1980)

По результатам близнецовых исследований показано, что вклад генетических факторов в риск развития АС составляет 60-40%, что определяет, таким образом, достаточно высокую степень наследственной предрасположенности к развитию заболевания (Brown, Kennedy et al. 1997; Pedersen, Svendsen et al. 2008). Наиболее выраженная ассоциация риска развития заболевания показана для аллелей группы HLA-В27: более 90% пациентов с анкилозирующим спондилитом Европеоидной расы являются носителями HLA-B27. Однако, с другой стороны, не более 5% людей обладающих HLA-В27 болеют АС.

Аллели группы HLA-B27 неравномерно распределены среди популяций различной этнической принадлежности. Наибольшая частота встречаемости данной группы аллелей характерна для представителей северных территорий, эскимосов, коренных американцев

приполярной области, северной Канады (Boyer, Templin et al. 1997; Peschken and Esdaile 1999)

На данный момент группа аллелей HLA-B27 включает около 82 субвариантов, часть которых кодирует структурно различающиеся варианты антигена гистосовместимости HLA-B27 (по данным базы -International IMunoGene Tics information system [IMGT], 2011, http://www.ei.ac.uk/cgi-bin/imgt/hla/allele.cgi), фрагмент аминокислотного выравнивания представлен на рисунке 3. Основные различия в кодирующей части этих субвариантов сосредоточены во втором и третьем экзонах, которые кодируют а-1 и а-2 домены тяжелой цепи МНС-I. На основе популяционных исследований предполагается, что HLA-B2705, обнаруженный в большинстве популяциий, является предшественником всех остальных субвариантов аллелей HLA-B27(Ball and Khan 2001).

Рисунок 3. Фрагмент аминокислотного выравнивания субвариантов антигенов гистосовместимости HLA-B27 (Reveille 2006)

Position SO 7С 80 90 ICO 110 120 131 1>1 160 172

»♦глС-502 3YW ГВКТОТСКАК ftQTDRE^tiRT LLRYYliOSFA GSHVjONWG CI)V6P&3RLL FCTWPWnC- SSWTA RWEObRAYMBECVRVfliRRYL

b*2t01 •« —.....— ---t--n--- a......—..........-...............................................

3*2702 ...................M—I A.................................... .....................-.......

3*2"?05 -h- ............................-.........-........................ ......................

9*2"?С4 --- -...............3...........-..................—...............-E....................

3*2"? 05 03 3*2*70504 3*270505 3*270506

3*2705 08

B*2TG6 — -........- -.....S..........--........................D-У..........В....................

B*27f7 .......................................3..........— --НН-У----P...........................

B*27C8 --- ................S--N -RG.....-..................-...............................-.......

3*27 С 9 .............-....................................-.......Я...............................

3*2710 .............................................................-.......E....................

В* 2 Til ...................S...................9............- НИ H----P......-..........-.........

3*2712 ...........TN T-----3—N -T.G----------------------------------------------------------------

3*2713 ...............................-..........................................................

B*2714 —...................- --------------N T-----1----------------------....................

B*2715 — -........-......S-..........-....................................-В..........T-........

B*2716 ...........TM T..................-.........................................................

3*2717 -P................................................-...........-...........................

B*2718 ........S-TM T--Y--3--N -RG...........................................В....................

3*2719 —.........- -........-.............ir-a...........-........—---------------------------

3*2750 ...................3...........-.......................HH-i----P......E....................

3*2751 ...................3...................Я................P-?..........E...........-........

B*2753 -----M---F-TN 1—"U--3..............................— -.......—......—...................

3*2724 ...................3...................3...............НИ Y----P......E....................

B*27J5 -------------------3----------------------------------------—.....-E---W------L--.......

3*2756 ............Э......3----RG..........................................-.....................

3*2757 ...................................................— --PY--........-....................

S*2?i6 —...........................-..........—.........----------------------------1-------H-

При сравнении аллелей НЬА-В27 можно выделить три группы ( Рисунок 4). Для первой группы характерны аминокислотные замены в а1-домене. Наиболее часто встречающиеся аллели этой группы НЬА-В2703 и НЬА-В2702, в основном, обнаружены у представителей Африки. Ближнего Востока и у представителей Европеоидной расы. Вторая группа содержит замены как в а1 -домене, так и в сх2-домене структуры НЬА-В27. Наиболее представленный аллель этой группы что НЬА-В2704, обнаружен у жителей Азии, Китая. Кореи, Таиланда. Третья группа имеет схожий а1 домен с НЬА-В2705 и различные замены в а2 домене. Основной аллель этой группы - НЬА-В2707, чаще всего встречается у жителей Ближнего Востока, Турции и Греции.

НЬА-В2705

Группа 2

Группа 1

а1 а2 Представители

В2713 0 0 Европ.раса

В2703 1 0 Африка

В2717 1 0 нд

В2701 3 0 Европ. р.*/Африка

В2702 3 0 Европ.раса

В2716 3 0 Европ. раса

В2708 4 0 Европ. раса

В2726 4 0 Африка

В2712 7 0 Европ. раса

В2723 7 0 Европ.раса

а1 а2 Представители

В2704 1 1 Азия

В2715 1 2 Азия

В2706 1 3 Азия

В2725 1 3 Азия

В2721 1 4 НД

В2711 1 5 Азия

В2720 1 5 Азия

В2724 1 7 Азия

В2718 9 1 Азия

Группа 3

«1 а2 Представители

В2703 0 1 Африка

В2717 0 1 НД

В2701 0 2 НД

В2702 0 3 нд.

В2716 0 3 Европ.раса

В2708 0 3 Ближний Восток

В2726 0 5 Южная Азия

В2734 0 4 Западная Азия

Рисунок 4. Распределение по группам субвариантов группы аллелей НЬА-В27 на основе сходства аминокислотных последовательностей кодируемых полипептидов. Цифрами обозначено количество замен в а1 и а2 доменах НЬА-В2705. *- Европеоидная раса.

Так же можно выделить аллель HLA-B2713, который характеризуется очень высокой гомологией с HLA-B2705 и имеет замену только в лидерной последовательности вновь синтезируемого полипептида.

Учитывая выраженную ассоциацию HLA-B27 с риском АС к настоящему времени проведено большое количество ассоциативных исследований на выборках различной этнической принадлежности в результате которых показано, что присутствие части аллелей в генотипе повышает риск развития АС, в то время как другие субварианты ассоциированы с снижением риска заболевания (Таблица 2). (Reveille, Ball et al. 2001; Taurog 2007)

Таблица 2. Аллельные субварианты HLA-B27 по отношению к риску развития АС.

Субварианты ассоциированные с риском АС Субварианты не ассоциированные с АС

HLA-B2705, HLA-B2701, HLA-B2702, HLA-В2703, HLA-B2704, HLA-B2707, HLA-B2708, HLA-B271