Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и апробация метода гибридизации на гидрогелевых биочипах для анализа MLL-транслокаций и SNP в геноме человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и апробация метода гибридизации на гидрогелевых биочипах для анализа MLL-транслокаций и SNP в геноме человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им В А ЭНГЕЛЬГАРДТА

на правей рукописи

Митяева Ольга Николаевна

РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ МЕТОДА ГИБРИДИЗАЦИИ НА ГИДРОГЕЛЕВЫХ БИОЧИПАХ ДЛЯ АНАЛИЗА МХ£-ТРАНСЛОКАЦИЙ И Б\Р В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

Москва - 2007

003159671

Диссертация выполнена в Институте молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН, на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный Наседкина Татьяна Васильевна сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН

Официальные оппоненты:

докт биол наук, зав Лабораторией

гормонов и рецепторов ИМБ РАН Рубцов Петр Михайлович

докт биол наук, проф зав Лабораторией молекулярной диагностики и геномной

дактилоскопии ГосНИИгенегяки Носиков Валерий Вячеславович

Ведущая организация:

Институт общей генетики им Н И Вавилова Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится рр/гп _2007 г в У ч на

заседании диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991 г Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " ^ " Ce. ii ги 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

(у/ " / ----------А М Крицын

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Сегодня все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека Это анализ мутаций при диагностике наследственных заболеваний, исследование изменений в геноме при уточнении диагноза и назначении терапии при онкологических заболеваниях Также зарождается новое направление в медицине - предиктивная медицина, которая изучает генетическую предрасположенность индивида к различным заболеваниям и пытается свести к минимуму шансы возникновения заболевания или снизить тяжесть протекания болезни путем корректировки образа жизни и ранней диагностики Широкое использование молекулярно-генетических методов в практике невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить одновременный анализ множества генетических изменений Одним из наиболее перспективных подходов на сегодняшний день является сочетание мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидной матрице или биологическом микрочипе (биочипе)

В работе предложены два биочипа биочип для анализа ряда хромосомных транслокаций при лейкозах у детей и биочип для идентификации личности, позволяющий анализировать набор однонуклеотидных полиморфизмов (SNP - single nucleotide polymorphism)

Необходимость анализа транслокаций при лейкозах связана с тем, что это заболевание занимает ведущее место среди онкологических заболеваний у детей Всего лишь 20 лет назад выживаемость при детских лейкозах составляла 5-10%, тогда как в настоящее время она составляет 60-80% (по данным 5-летней оценки) Такой успех в лечении был достигнут благодаря использованию наиболее эффективных комбинаций различных цитостатических препаратов, а так же рационализации терапии, основанной на углубленной диагностике заболевания, в том числе и с использованием молекулярно-генетических методов (Алейникова О В , 2002)

Ранее в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН был разработан ЛК-Биочип, который позволяет анализировать 8 наиболее часто встречающихся при лейкозах транслокаций t(9,22) BCR/ABL р190 и р210, t(4,ll) MLL/AF4, t(12,21 )TEL/AML, t(l,19) E2A/PBX, t(15,17) PML/RARA, t(8,21) AML/ETO, mvl6 CBFB/MYH Хотя эти транслокации и являются наиболее частыми, они не охватывают весь спектр транслокаций, которые необходимо диагностировать при постановке точного диагноза и назначении терапии Поэтому, первая часть диссертационной работы посвящена созданию биочипа, предназначенного для анализа дополнительных

3

семи транслокаций, в которых участвует ген MLL (Myeloid or Lymphoid Leukemia) Эта группа транслокаций особенно важна для больных лейкозом детей младше года, так как MiZ-транслокации в этих случаях наблюдаются в 50%-80%, в зависимости от типа лейкоза и, кроме этого, тяжесть заболевания тесно связана с тем, какая именно MLL-транслокация присутствует в клетках пораженного костного мозга

Биочип для идентификации личности предназначен для другой области современной медицины - судебно-медицинской экспертизы К сожалению, довольно часто встает задача идентификации личности, это не только поиск преступника, оставившего следы на месте преступления, но и опознание тел погибших при природных или техногенных катастрофах, при террористических актах В настоящее время основными методами анализа при идентификации личности остаются серологический анализ крови, и молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генома, известных как тандемные повторы с изменяющимся числом копий, в частности микросателлитов или STR (shot tandem repeats) Однако серологический анализ часто не эффективен при исследовании малых количеств биологических следов, а также деградированных образцов В этих случаях достаточно эффективен STR-анализ, однако он не дает фенотипической информации и требует дорогостоящего импортного оборудования Нами предложен альтернативный подход на основе метода гибридизации на олигонуклеотидном биочипе, который не требует дорогостоящего импортного оборудования, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет получать такие фенотипические данные об индивиде, как группа крови и половая принадлежность

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью данной работы являлось исследование возможности использования метода гибридизации на олигонуклеотидных биочипах для анализа хромосомных транслокаций с участием гена MLL при лейкозах и для анализа SNP при молекулярно-генетической идентификации личности Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач

1 Исследовать частоты MLi-транслокаций при лейкозах у детей с целью оценки необходимости создания тест-системы для клинической диагностики

2 Выбрать наиболее часто встречающиеся при лейкозах у детей транслокации с участием гена MLL и разработать олигонуклеотидный микрочил для их диагностики Определить порог чувствительности метода

3 Разработать олигонуклеотидный микрочил для судебно-медицинской генетической экспертизы Определить чувствительность метода

4 Оценить принципиальную возможность использования предложенного метода в судебно медицинской практике при работе с малыми количествами ДНК

5 Определить идентификационную информативность локусов, анализируемых с помощью разработанного микрочипа для идентификации личности в популяции славян

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Создан MLL-биочип, позволяющий выявлять 7 транслокаций с участием гена MLL t(4,ll) MLL/AF4, t(9,ll) MLL/AF9, t(ll,19) MLL/ENL, t(ll,19) MLL/ELL, t(6;ll) MLL/AF6, t(10,ll) MLL/AF10, dup(ll) MLL/MLL Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей с лейкозом, которые оказались близкими к данным по другим странам Впервые создан биочип для идентификации личности (ИЛ-биочип), позволяющий анализировать 9 аллелей гена HLA-DQA1, 5 аллей ABO и 2 аллеля гена AMEL Проведено исследование основных параметров информативности локусов HLA-DQA1 и ABO и показано, что средняя вероятность случайного совпадения генотипов при идентификации личности с помощью разработанного биочипа составит ~ 0 4%

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Матрица ячеек разработанного АЯХ-биочипа в включена в состав ЛК-Биочипа, который в настоящее время используется для выявления 13 транслокаций у больных лейкозом, что позволяет уточнять диагноз, прогнозировать исход заболевания и назначать наиболее подходящую терапию

Разработанный ИЛ-биочип позволяет проводить идентификацию биологических следов, содержащих ДНК. со средней вероятностью идентификации 99,6% При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно-медицинской практике при экспертизах, позволяющих, сузить круг подозреваемых или при опознании тел погибших При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида, что является важной информацией для следователя при поиске преступника

5

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы были представлены на Европейской конференции по генетике человека (Прага, 2005), на Симпозиуме «Биологические основы терапии онкогеметолопгческих заболеваний у детей» (Москва, 2002), на международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнолоши в медицине» (Новосибирск, 2006)

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 5 тезисов

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит ^^рисунков, схем и таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Анализ хромосомных транслокаций (Л/£Х-биочип).

В качестве источника РНК для работы с МИ-биочипом использовали культуру

клеток МУ, несущую транслокацию 1(4,11) МЬЬ/АР4, культур}' клеток НЬ-60 без

транслокаций, а также образцы костного мозга больных острым лейкозом которые

были предоставлены Российской детской клинической больницей (г Москва),

Морозовской детской городской клинической больницей (г Москва) и Московским

областным онкологическим диспансером (г Балашиха, Московской обл )

Метод анализа транслокаций при помощи олигонуклеотидных биочипов

предполагает следующие этапы подготовки образца Сначала из лейкоцитов костного

мозга или клеточной линии выделяли тотальную РНК Далее в ходе обратной

транскрипции получали кДНК, которая являлась матрицей для двухэтапной

мультиплексной ПЦР Во втором этапе ПЦР использовали сШТР с флуоресцентной

меткой, благодаря чему в результате получали флуоресцентно меченый продукт,

который гибридизовали на олигонуклеотидном биочипе в течение ночи

6

Идентификация личности.

В качестве источника ДНК для работы с биочипом для идентификации личности (ИЛ-биочипом) использовали клонированные участки гена DQA1, предоставленные ГосНИИгенетики, образцы слюны сотрудников ИМБ РАН и сотрудников ИОГен РАН Для популяционных исследований была собрана коллекция ДНК студентов Московского Гуманитарного Открытого Университета Все участники исследования заполнили предложенные им анкеты, сообщив место рождения, этнос до третьего колена (бабушки, дедушки), группу крови, если она была известна, и подписали информированное согласие на участие в исследовании

Подготовка образца для анализа при помощи ИЛ-биочипа включает следующие этапы Сначала из биологического материала, являющегося источником генетического материала (свежая кровь, пятна крови, слюна, смывы слюны с различных предметов и т п) выделяли ДНК Далее в ходе двухэталной мультиплексной ПЦР получали флуоресцентно меченые амплифицированные участки ДНК, расположенные в районе анализируемых локусов Далее полученный продукт гибридизовали на олигонуклеотидном биочипе

Регистрация изображения и обработка результата. Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов (ИМБ РАН, Россия) и программного обеспечения «Imageware» («Биочип-ИМБ», Россия)

После обработки флуоресцентной картины гибридизации программой "ImageWare" для пользователя доступна следующая информация таблица значений сигналов в каждой ячейке и результат анализа в виде текста об обнаруженных транслокациях или об их отсутствии в случае MLL-биочипа и генотипа в случае ИЛ-биочипа

Статистическая обработка данных и определение параметров информативности локусов. Статистическая обработка данных проводилась при помощи программного обеспечения PowerMarker 1 0 (http //www powermarker net http //statgen ncsu edu/powermarkerA. PowerStats

(http //www promega com/geneticidtools/ )

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Часть 1. Анализ транслокаций (MLL-биочип)

Выбор транслокаций с участием гена MLL. В литературе описано более 30 генов партнеров, с которыми ген MLL может образовывать транслокации Однако подавляющее число этих транслокаций встречаются крайне редко Поэтому нами было проведено предварительное исследование встречаемости транслокаций с участием гена MLL у детей болеющих разными типами лейкозов в России Был проведен скрининг 300 образцов РНК, выделенной из костного мозга пациентов, больных лейкозом методом ОТ-ПЦР по протоколу, разработанному Палисгардом и др (Pallisgaard N et al, 1998) Скрининг проводили на наличие следующих транслокаций t(4,l 1) MLL/AF4, t(9,11) MLL/AF9, t(l 1,19) MLL/ENL, t(l 1,19) MLL/ELL, t(6,ll) MLL/AF6, t(10,ll) MLL/AF10, t(l;ll) MLL/AFlq, t(l,ll) MLL/AFlp, 1(11,17) MLL/AF17, dup(ll) MLL/MLL В исследованных образцах были обнаружены транслокации t(4,ll)MLL/AF4, t(9,l 1) MLL/AF9,1(11,19) MLL/ENL, t(ll,19) MLL/ELL, t(6,ll) MLL/AF6, t(10,ll) MLL/AF10, dup(ll) MLL/MLL, для анализа которых и был разработан MLL-биочип Наличие транслокаций обнаруженных методом ОТ-ПЦР во всех случаях было подтверждено секвенированием Образцы, в которых были обнаружены MLL-транслокации использовали в качестве контрольных для отработки метода гибридизации на олигонуклеотидном биочипе

Выбор последовательностей праймеров для мультиплексной ПЦР и олигонуклеотидных зондов. Конструирование и принцип работы MLL-биочипа. Общие принципы выбора последовательностей праймеров и олигонуклеотидных зондов были сформулированы ранее (Глотов А С , 2006)

На рис 1 представлено схематичное изображение гена MLL, транслокации с участием этого гена и частичной тандемной дупликации Так же показано расположение праймеров участвующих в ПЦР Верхний праймер комплементарен участку гена MLL выше места слияния, нижний праймер комплементарен участку гена-партнера ниже места слияния То есть при наличии в образце транслокации в ходе ПЦР происходит экспоненциальное увеличение количества копий участков ДНК в районе транслокации, структура которой потом анализируется на биочипе, а в случае отсутствия транслокации происходит линейное увеличение копий ДНК содержащих участки генов MLL и генов-партнеров Из-за небольшого количества полученных копий в этом случае флуоресцентные сигналы на биочипе будут отсутствовать

□lOLJUL

Ген MLL

fltt-9 $«л аяtffteC ЖЕИ^

ГА

m

№

nniZJJ

Транслокация

Частичная тандемная дупликация

Рисунок 1 Схематичное изображение гена MLL, транслокации с участием этого гена и частичной тандемной дупликации Различные домены представлены в виде блоков и имеют следующие обозначения AT 1-3, AT-hook мотивы, SNL 1и2, домены субъядерной локализации (speckled nuclear localization signals), CxxC- цистеин богатый домен (Auton РМ ,2001) Стрелками схематично показано расположение праймеров участвующих в ПЦР

В большинстве случаев ген MLL в процессе транслокации претерпевает разрыв в 4 интронах - между 8 и 9 экзонами, между 9 и 10 экзонами, между 10 и 11 экзонами и между 11 и 12 экзонами То есть мРНК с MZZ-транслокацией представляет собой участок мРНК гена MLL, обрывающийся после 8-11 экзонов, к которому примыкает участок мРНК гена партнера, продолжая транскрипционную единицу Так как многие гены партнеры имеют также по несколько мест перестроек (от 2 до 4), то возможно около 50 возможных комбинаций MLL - ген-партнер Наносить на биочип 50 зондов, комплементарных непосредственно местам перестроек, нам показалось нецелесообразным и мы сконструировали биочип следующим образом (см таблицу

В нижнем ряду расположены олигонуклеотиды комплементарные участкам гена ABL, экспрессирующегося во всех клетках, и который мы использовали в качестве положительного контроля прохождения обратной транскрипции Выше расположен ряд олигонуклеотидов, комплементарных участкам 4 экзонов гена MLL -8, 9, 10 и И, по этим зондам мы можем определять место перестройки гена MLL Всю остальную часть чипа занимают олигонуклеотиды, комплементарные участкам генов-партнеров, по которым и определяется тип транслокации В случае dup(l 1) MLL/MLL, в качестве гена партнера выступает ген MLL, расположенный на гомологичной

1)

хромосоме Причем он претерпевает разрыв перед вторьм или третьим экзоном и за определение ¿ир(11) отвечает олигонуклеотид МЫеЗ, комплементарный участку третьего экзона гена МЫ Все олигонуклеотиды на биочипе повторены четырежды для надежности результатов При обработке результата гибридизации мы исключали из рассмотрения ячейки с самым высоким и с самым низким сигналом флуоресценции, и далее работали с усредненным сигналом оставшихся двух ячеек Такой подход позволяет избегать ложноотрицательных сигналов в случае механического повреждения ячеек и ложноположительных сигналов, например, в случае попадания в ячейку пылинки

АП0_1 АП0_1 АИ0_2 АР10_2 АБ10_3 АР10_3

АР10_1 АР10_1 АИ0_2 АП0_2 АИ0_3 АП0_3

ЕМ. ЖЬ АГб дгб ЕЬЬ_2 ЕЬЬ_2 АР9_2

ЕЮ, ШЬ АРб АРб Еи.__2 Е1Х_2 АР9_2 АР9_2

М1ХеЗ МШЗ АИ4 АР4 ВЦ-_1 АР9_1

МЬЬеЗ МШЗ АР4 АР4 ЕЬЬ_1 АИ>_1 АР9_1

М1Ае8 М1Хе8 МЦл9 МЦ.е9 МЬШО МЬЬеЮ МЬЬе11 М1Хе11

М1Ае8 МЬЬе8 МШЙ М1Ае9 мьию МЬШО МЬЬеП МЬЬе11

АБЬсши АВЬсоп! АВЬсой АВЬсой

Таблица 1 Схема расположения олигонуклеотидных зондов на ЛЯХ-биочипе Каждый зонд представлен в четырехкратном повторе

Разработка процедуры анализа транслокаций. Условия мультиплексной ПЦР и гибридизации отрабатывали на 14 ранее просеквенированных контрольных образцах с различными транслокациями, и на 3 контрольных образцах без транслокаций Примеры гибридизационных картин представлены на рис 1

Разработанный биочип был протестирован на 20 клинических образцах РНК, несущих различные МЬЬ-транслокации и на 10 образцах без транслокаций Все образцы были проанализированы на наличие М1Х-транслокаций методом ОТ-ПЦР, а образцы, несущие транслокации были также просеквенированы Для всех 30 образцов результаты гибридизации на биочипе, секвенирования и РТ-ПЦР совпали

Методом последовательных разведений был определен порог чувствительности метода, он составил 1 клетку несущую транслокацию, на 103-104 здоровых клеток

a) III ■ II ■ I б)

Рисунок 1. Примеры гибридизации hi 1ых картон: a) t(4;l i) MLLelO/AF4. б) образец без хромосомных транслокаций.

Частоты встречаемости анализируемых транслокаций при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) и остром нелимфовластном лейкозе (OHJLJ]), Всего методом ОТ-ГГЦР было протестировано около 300 образцов РНК больных лейкозом. Поскольку по данным зарубежных исследований спектр и частота MLL-Тран с локаций меняется в зависимости от нозологии заболевания и возраста пациента, мы отобрали три группы больных протестированных в период с января 2000 года ко декабрь 2003 года:

• дети до 1 года с первичным, не леченным ОЛЛ (14 человек)

• дети от 5 года до 3 лет с первичным, не леченным ОЛЛ (70 человек)

• дети старше 1 года с первичным, не леченным ОНЛЛ (78 человек).

Детей до года выделяли в отдельные группы так как по данным литературы AftL-транслокации при лейкозах особенно часта встречаются именно в этой возрастной группе (Satake, 1999),

Группу детей до года с первичным, не леченным ОНЛЛ исключили из рассмотрения, так как она составила всего три человека. В остальных ipynnax мы оценили встречаемость транслокаций с участием гена MLL. Результаты представлены на рисунке 2. Полученные нами данные о частотах встречаемости ЛйХ-транслокациЙ у детей больных лейкозом в РФ старше года близки к литературным данным по другим странам. Существенное отличие частоты встречаемости ЛЛ1-фанслокаций в группе детей до года больных ОЛЛ от данных литературы, скорее всего, объясняется малой выборкой, которая составила всего 14 человек.

0.8

0.7

0.6

D в России (данные,

0.5

полученные в ходе

0,4 -

исследования) □ а мире (данные литературы)

0,3

0 2 -

0.1 -

О

ОЛЛ до гсда ОЛЛ от года ОННЛ старше до трех лет года

Рисунок 2. Частоты встречаемости MLL-транслокаций у детей больных лейкозом в различных возрастных группах: при остром лимфобластном лейкозе у детей до года; при остром лимфобластном лейкозе у детей от года до 3 лет; при остром нелимф областном лейкозе у детей старше года (Hunger SP, 1998; Downing JR,

Часть 2, Ьиочип дли идентификации личности ЩЛ-Кнпчил].

Выбор л оку сов. Для решения задачи идентификации личности были выбраны три локуса: HLA-DQA}, ABO и AMELXY. Локус HLA-DQA1 (ген главного комплекса г истос о вместимости второго класса) был выбран из-за его высокой полиморфности (на декабрь 2006 года известно 34 аллеля). Локус ABO (ген, определяющий группу крови) так же характеризуется высокой полиморфностью (около 90 аллелей) и кроме этого позволяет получать информацию фенотипического характера об индивиде, которая может быть полезна при поиске подозреваемого. Ген AMEL (кодирует внеклеточный матрихсный белок, вовлеченный в процесс развития зубной эмали) был использован нами для определения половой принадлежности исследуемой ДНК, так как он расположен на половых хромосомах, Все три локуса расположены на разных хромосомах (HLA-DOA}. 6р21.3; ABO: 9q31 ,l-q34.2; AMEL: Xp22.31-p22.1) и наследуются независимо, что важно при оценке вероятности идентификации.

1994).

Конструирование и принцип работы биочипа. Был сконструирован биочип для определения 9 групп аллелей гена HLA-DQA1, 5 групп аллелей гена ABO и 2 аллелей гена AMEL То есть предлагаемый биочип позволяет делить все население на 1350 групп

Ген HLA-DOA1 Разработанный биочип позволяет анализировать ряд SNP во втором экзоне и выделять следующие группы аллелей группа 101 объединяет аллели 0101ХХ, 0104ХХ, 0105, 0107, группа 102 - 0102ХХ, группа 103- 0103, группа 106 -0106, группа 201 - 0201, группа 03 - ОЗХХХХ, группа 04 - 04ХХХХ, группа 05 -05ХХХХ, группа Об - 06ХХХХ В таблице 2 приведены 5 участков второго экзона гена DQA1 по которым идентифицируются группы аллелей В последней колонке представлены группы аллелей которым соответствуют представленные галлотипы В ходе анализа пошагово выделяем 5 множеств групп аллелей которые могут присутствовать в образце, далее пересекая эти пять множеств получаем искомые группы аллелей

Ген ABO Анализируя 4 SNP в шестом и в седьмом экзонах гена ABO, мы можем выделить 5 групп аллелей А, В, О1 ,&v,(?, которые позволяют не только определять одну из четырех групп крови индивида, а делить все население на 15 групп В таблице 3 представлены SNP, анализируемые на биочипе и группы аллелей которым они соответствуют Так же, как и при анализе гена HLA-DQA1, выделяем четыре множества возможных групп аллелей и далее, пересекая полученные множества, получаем конечный результат

Ген AMEL Аллель AMELXгена ÁMEL, расположенная на хромосоме X, имеет в пятом экзоне трехбуквенную делению, анализируя которую, можно отличать аллель AMELX от аллели AMELY, расположенный на хромосоме Y Ниже представлены участки последовательностей пятого экзона Последовательности зондов, иммобилизованных на микрочипе, выделены подчеркиванием

AMELX AGTGGTACCAGAGCAT- AAGGCCACCGTACCCT AMELY AGTGGTACCAOAGCATMgAAGACCACCATACTCT

Шаг № Последовательность Группы аллелей

1 CTGiCTGGfffl^GCCTl^^TCP^^íylTTS 101,102,103,106

CTGfCTGGi»TÍ!GCCTÍÍ«¡ 1С С \í M.YCTTl 201

СТС1СТССЙА^Т«СССТ«1ШГС1ЯШ1АТТТ1 03

CTGfCTGGl®ÍTl®GCCT«Í&CSeÁ^AÍTe 04, 05, 06

2 ctctggícagtícaSccatgaatttgatggaga 101,102,106,04,05

CTCTGGiCAGllCAiCCATGAATTTGATGGAGA 103,201,06

3 ATTTGATGGAGAlGAGlAGTTCTAlGTGGACC 101

ATTTGATGGAGAlGAGlAGTTCTAiGTGGACC 102,103,106,05

ATTTGATGGAGAlGAGiAGTTCTAlGTGGACC 04,06

4 acctggügaggaaggagIctgíctggcggtgg 101,102,103

acctg«gaggaaggagm:tg<sctggcggtgg 106

5 ggacctggígaggaaggagíctgIct 101,102,106, 201, 03

ggacctggSgaIgaaggagActgCct 103

Таблица 2 Участки последовательности второго экзона гена HLA-DQA1, по которым вдентифицируются группы аллелей Подчеркиванием выделены последовательности зондов иммобилизованных на чипе, цветом выделены все SNP, расположенные на данном участке последовательности

В таблице 4 представлена схема расположения олигонуклеотидов на биочипе В верхней части биочипа расположены олигонуклеотиды, используемые при анализе локуса HLA-DQA1, в нижней левой части расположены олигонуклеотиды, используемые при анализе локуса ABO, в правой нижней части расположены олигонуклеотиды, используемые при анализе локуса AMEL На схеме биочипа в каждой ячейке обозначены группы аллелей, которые соответствуют олигонуклеотиду, иммобилизованному в данной ячейке

Анализируемый SNP Последовательность Группы аллелей

6 экзон 261wt GTCCTCGTGGTÍACCCCTTGGCTGG А, В, О2

261deIG GTCCTCGTGGTlACCCCTTGGCTGG 0\<tv

297wt GGGAGGGCAClTTCAACATCGACA А, О1

297A>G GGGAGGGCACiTTCAACATCGACA В, 01У, О2

7 экзон 646wt GGACATGGAGÍTCCGCGACCACGT А, В, О1, О2

646T>A GGACATGGAGÍTCCGCGACCACGT

657wt TCCGCGACCAÜGTGGGCGTGGA A, о1

6570T TCCGCGACCAÍGTGGGCGTGGA В

Таблица 3 БИР в локусе АВ()Ъ по которым идентифицируются группы аллелей Подчеркиванием выделены последовательности зондов иммобилизованных на чипе, цветом выделены все БЫР, расположенные на данном участке последовательности

В отличие от MLL-биочипа, на ИЛ-биочипе все ячейки продублированы, а не повторены по четыре При обработке результата сигнал от двух ячеек сравнивали между собой и при отсутствии значительного различия в значениях интенсивности усредняли, а если наблюдалось сильное различие, эксперимент повторяли Биочип с четырьмя ячейками, не требует повтора эксперимента, в случае если сигнала одной из ячеек значительно выше или ниже остальных трех В то же время нанесение всего двух ячеек позволяет в два раза увеличить количество различных зондов, которые могут быть нанесены на одну подложку с целью повышения точности идентификации личности Однако в процессе тестирования биочипов мы пришли к выводу, что появление ложноотрицательных и ложноположительных сигналов, связанных с механическими повреждениями ячеек происходит достаточно редко (не превышает нескольких процентов) и поэтому нанесение зондов в двукратной повторности представляется наиболее оптимальным

На рисунке 2 представлен пример гибридизациошюй картины для образца с генотипом HLA-DQA1101/102, ABO B/01V, AMELXY В таблице 4 цветом выделены ячейки, которые в данном примере габридизационной картины имеют положительный сигнал

* *

ф #

w » * • * *

«* <é Ш m Ш 9

ч8 »

* » •

Рисунок 2. Пример гнбрндизанионной картины: HIA-DQAi ¡01/102, ABO Aj'0>v, AMELXY-

Отработка протокола анализа. Условия мультиплексной Г1ЦР и гибридизации отрабатывали на 10 контрольных образцах ДНК, содержавши клонированные участки второго экзона гена HLA-DQA1, и 10 контрольных образцах ДНК сотрудников Лаборатории биочипов ИМБ РАН. Контрольные образцы были предварительно просеквенироваяы.

Разработанный ИЛ-биочип был протестирован на 29 образцах ДНК, протигшрованных по локусу HLA-DQA1 методом аллель-специфичной ПЦР и на 24 образцах ДНК про тапиров анных по локусу ABO секвенированисм. Также биочип биочип был протестирован на 40 образцах ДНК сотрудников Лаборатории биочипов ИМБ РАН по локусу AMEL. Результаты гибридизации полностью совпали с результатами аллель-специфичной ПЦР в случае HLA-DQA1, с результатами се копирования а случае ABO и полом сотрудников лаборатории, участвовавших в исследовании.

Методом последовательных разведений был определен порог чувствительности метода. Она составила около 100 пкг геномной ДНК на анализ. Дальнейшее снижение количества анализируемой ДИК приводило к обнаружению ложной гомозиготности. При количестве анализируемой ДНК менее 10 пкг отсутствовал положительный флуоресцентный сигнал.

Ж iffll ¿¡¡gfpj А ■ С), г/г. о-'

líf жШШ л о ■■.....'Т - "' . ' -: А, В, : А, О'. :. 0::\ &

OV-r-' яви А (У, , о2 Ш. s • пШ в

míf^ В, (У. о2: ':.;■:-■■ шш..í 1 1 Ж ' 1 1.8,1,1!, .. ™ в

С-ЗЩЙ!-,--; -ГГу!' ' " AMELY. -г, ' " ! i ■НЕЕ

rAMElX AMELX Ш> |Sj¡h

Таблица 4. Схема расположения олигонуклеотидов на ИЛ-биочипе. Цветом выделены ячейки, которые в примере гибридизационной картины на рисунке 2 имеют положительный сигнал.

Тестирование на модельных объектах. Так как предполагается использование разработанного микрочипа в практике судебно-медицинской экспертизы, было проведено тестирование метода на модельных образцах: ДНК выделяли из смывов слюны с окурков сигарет, с края стакана, из следов пота на бумаге. Во всех случаях получили совпадение генотипа с генотипами контрольных образцов ДНК.

Ген оптирование коллекции ДНК. Для исследования частот аллелей генов HLA-DQA1 и ABO была собрана хо;1лекция из 543 образцов геномной ДНК студентов Московского государственного открытого университета (МГОУ).

Соответствие молекулярно-генетического анализа группы крови с серологическим Ген ABO кодирует гликозилтрансферазу, которая переносит специфический сахарный остаток на предшественник антигенов Н, что приводит к формированию антигенов А и В При отсутствии гликозилтрансферазы или при ее неактивной форме формирование антигенов А и В не происходит, то есть получается группа крови 0 (Seltsam А, 2003)

Молекулярно-генетический анализ позволяет определять генотип по локусу ABO, а серологический анализ позволяет определять фенотип по присутствию или отсутствию антигенов А и В

При сборе коллекции 206 участников исследования сообщили свою группу крови, которая была получена в различных медицинских учреждениях серологическим методом В 182 случаях (88,4%) результаты генотипирования совпали с фенотипами, сообщенными испытуемыми, в остальных 24 (11,6%) случаях результаты генотипирования не соответствовали фенотипам, сообщенным испытуемыми Причем, в 14 случаях выявились несовпадения вида фенотип А или В - генотип 0/0 Однако выявленные в этих случаях нулевые аллели относились к группам О"'и О1, которые характеризуются присутствием однонуклеотидной делеции в 261 позиции (261delG) Эта делеция ведет к сдвигу рамки считывания и, как следствие, к трансляции неактивной формы гликозилтрансферазы и отсутствию антигенов А и В (Yip SP, 2000) То есть у людей с 261delG, присутвующей в гомозиготном состоянии, не могут быть обнаружены антигены А и В Из 14 случаев несовпадения такого типа отобрали случайным образом три образца, в которых присутствие 261delG подтвердили секвенированием Вероятнее всего, случаи несовпадения такого типа можно объяснить ошибками серологического анализа и тем, что участники исследования могли неправильно запомнить свою группу крови

В качестве вероятных причин несовпадений в остальных 10 случаях (4,9% от общего числа сообщивших свою группу крови человек) могут быть как приведенные выше, так и другие Например, причиной несоответствия типа фенотип 0 — генотип А, В или AB могут быть мутации в генах FUTI и FUT2, кодирующих антиген Н, который является предшественником антигенов А и В Таким образом, даже при наличии функционирующей гликозилтрансферазы, в отсутствие Н-антигенов индивид будет иметь нулевую группу крови Так же существуют аллели, относящиеся к группам А и В, но с низкой экспрессией антигенов А и В И наоборот существуют нулевые аллели, которые могут проявлять слабую экспрессию антигена A (Seltsam А, 2005) Однако

18

вклад таких ошибок неясен и требует более строгого исследования, что было невозможно в нашем случае, так как результат серологического анализа группы крови получали со слов участников исследования

Основные параметры информативности локусов HLA-DQA1 и ABO для популяции славян Из образцов собранных в МГОУ, ИМБ РАН и ИОГен РАН была выделена группа неродственных восточных славян, которая составила 444 человека В этой группе были определены частоты аллелей генов HLA-DQA1 и ABO, которые представлены в виде диаграмм на рисунке 3

Для сравнения на диаграммы нанесены данные для популяций поляков и японцев в случае локуса HLA-DQA1 и данные для популяций белых европейцев и китайцев в случае локуса АВ0(Yip SP, 2000, Hashimoto М , 1994, Jungerman М , 1996)

Распределение генотипов в локусах, используемых для идентификации личности должны удовлетворять равновесию Харди-Вейнберга То есть генотипические частоты должны быть равны произведениям соответствующих генных частот Это говорит о том, что при наследовании не происходит изменения генотипических частот в популяции

Для проверки соответствия распределения генотипов в локусах HLA-DQA1 и ABO равновесию Харди-Вейнберга (РХВ) использовали программу PowerMarker 1 0, в которой реализуется точный или вероятностный тест Мы получили, что РХВ для исследуемой популяции выполняется как в случае локуса HLA-DQA1, так и в случае локуса ABO Были определены ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность, они составили для локуса DQA1 81 7% и 79 7% соответственно, для ABO 73 9% и 73 8% соответственно Близкие значения ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности также подтверждают выполнение РХВ

<3 восточные славяне Е поляки

j О японцы

101 102 103 201 03 04 05 06

А)

| ЕЗ восточные славяне : О белые европейцы ; □китайцы

02

Б)

Рисунок 3. Частоты групп аллелей в различных популяциях: a) HLA-DQA1, б) АВ0.

Для описания идентификационного потенциала л оку сов HLA-DQA} и А ВО использовали несколько параметров определяемых из частот встречаемости аллелей и генотипов этого локуса.

Основными такими параметрами являются:

V Р2

вероятность случайного совпадения генотипов - pM=J~< ' , где Р,- i-ый генотип;

дискриминирующий потенциал - PD=l-pM. Так же используют PIC -информационное содержание полиморфизма (Polimorpiiism information content).

PIC=l-(2]p(2)-2 ¿2A2Pj)> гДе Р, и Pj-1-ый и j-ый аллели

i=i (=1 j=,+1

Считают информативность локуса при Р1С>0 5 высокой, при О 25<Р1С<0 5 средней и при Р1С<0 25 низкой (Botsrem D, 1980)

Для оценки эффективности применения определенного локуса в судебно-медицинской экспертизе так же оценивают потенциал исключения отцовства (РЕ -power of exclusion) и усредненный индекс отцовства (PI - Typical Paternity Index) Вероятность отцовства (РР - parternity probability), величина которая является результатом проводимой экспертизы, вычисляется по формуле Байеса

(РР*~)

РР =--—--, где рр-априорная («до опыта») вероятность интересующего нас

рр*- + \-рр ч

события Обычно она равна 0 5 и определяется не экспертом, а судом

При рр=0 5 РР = v PI +1

Значения PI и РЕ связаны соотношением = 1 - РЕ (Иванов П Л, 1999)

То есть значение усредненного индекса отцовства и потенциал исключения отцовства позволяют оценить потенциальную точность установления отцовства при использовании определенного локуса или комбинации независимых локусов Основные параметры информативности локусов HLA-DQA1 и ABO представлены в таблице 4

Сравнение предлагаемого метода с другими методами, используемыми для идентификации личности. Основными методами, которые применяются при идентификации личности, в настоящее время являются серологический анализ группы крови и STR-анализ К основным минусам серологического анализа можно отнести невысокую точность анализа при исследовании малых количеств биологических следов, около 27% всех биологических следов найденных на месте преступления не поддаются такому анализу (по данным ИКЦ МВД РФ) Кроме этого серология не обладает высокой информативностью, так как выделяет всего 4 группы STR-анализ и анализ SNP при помощи биочипов сравнимы по сложности проведения, однако, большим плюсом микрочипов является то, что их использование не требует специального дорогостоящего импортного оборудования При этом информативность SNP-анализа достаточно велика Например, набор PowerPlex (Promega), позволяющий

анализировать 8 БТЯ-локусов обладает дискриминирующим потенциалом в диапазоне 0 9973-0 9982 в зависимости от популяции, а разработанный биочип, позволяющий анализировать 3 локуса

Параметр HLA-DQA1 ABO

Вероятность случайного совпадения генотипов (рМ) 0 058 0 136

Дискриминирующий потенциал (PD) 0 942 0 864

Информационное содержание полиморфизма (PIC) 0 790 0 680

Потенциал исключения отцовства (РЕ) 0 595 0 487

Усредненный индекс отцовства (PI) 2 47 1 9

Таблица 4 Основные параметры информативности локусов HLA-DQA1 и ABO

обладает дискриминирующим потенциалом 0 9961 Кроме этого SNP-анализ, являясь молекулярно-генетическим методом, позволяет получать фенотшшческие данные об индивиде (В нашем случае это группа крови, однако, существует потенциальная возможность определения расовой принадлежности, цвета глаз и т п)

Область применения разработанного ИЛ-биочипа. Вероятность случайного совпадения генотипов по трем локусам (HLA-DQA1, ABO, AMEL) составляет VM=yM(HLA-DQAl/*vM(AB0)*vM(AMEL)=0 058*0.136*0 5=0 0046= =0 46% Такая вероятность случайного совпадения слишком велика для доказательства причастности к совершению преступления, однако позволяет решать большое количество задач стоящих перед следствием Экспертиза, проведенная при помощи предлагаемого микрочипа позволяет сузить круг подозреваемых, выделить определенную линию поиска, помогает восстановить картину происшествия при

22

наличии биологических следов от нескольких человек Предложенный биочип может быть полезен при идентификации тел погибших при природных или техногенных катастрофах либо террористических актах

Выводы.

1. Определены частоты встречаемости MLL-транслокаций при различных типах лейкозов Они составили при остром лимфобластном лейкозе у детей от 0 до года - 46%, от года до трех лет - 9%, при остром нелимфобластном лейкозе у детей старше года - 8% Таким образом, MLL-транслокации являются распространенным диагностическим маркером при лейкозах у детей

2 Разработан ояигонуклеотидный биочип для анализа хромосомных транслокаций с участием гена MLL Порог чувствительности метода составил одну клетку с транслокацией на 103-104 здоровых клеток, что позволяет отслеживать эффективность терапии

3 Сконструирован олигонуклеотидный микрочип для анализа 9 аллелей гена HLÁ-DQA1, 5 аллелей ABO, 2 аллелей гена AMEL Чувствительность метода составила около 100 пкг ДНК на анализ

4 На 3 модельных объектах показана принципиальная возможность использования предложенного метода в судебно медицинской практике

5 Определена идентификационная информативность локусов HLA-DQA1 и ABO для популяции славян Было получено, что информативность 3 данных локусов близка к информативности 8 STR-локусов, анализируемых методом полиморфизма длин амплифицированных фрагментов, и используемых в коммерческом наборе PowerPlex (Promega)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, патенты

1 О.Н. Митяева, Т В Наседкина, В С Жаринов, Е А Исаева, А Ю, Турыгин, В В Чупеева, Э Я Крейндлин, А Д Мирзабеков Анализ хромосомных транслокаций с участием гена MLL методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочинами Молекулярная биология 2004, том 38, №3, с 449-456

2 О.Н. Митяева, Д О Фесенко, Т В Наседкина, Ю П Лысов, В Е Барский, АС Заседателев, ПЛ Иванов Разработка и применение гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов для судебно-медицинской идентификации личности на примере локуса АВО Судебно-медицинская экспертиза 2007, №2

3 TV Nasedkma, VS Zharinov, EA Isaeva, O.N. Mityaeva, RNYurasov, SA Surzhikov, A.YTungin, AY Rubina, AI Karachunskn, RB Gartenhaus, AD Mirzabekov Clinical screening of gene rearrangements in childhood leukemia using a multiplex PCR-rmcroarray approach С1ш Cancer Res 2003, 9(15), p-p 5620-5629

4 LA Alexandrova, MV Jasko, EE Belobntskaya, AV Chudinov, ON Mityaeva, TV Nasedkma, AS Zasedatelev, MK Kukhanova New triphosphate conjugates bearing reporter groups labeling of DNA fragments for microarray analysis Bioconjug Chem 2007 May-Jun;18(3) 886-93

5 ТВ Наседкина, H А Гусева, О.Н Митяева, О А Гра, О Е Федорова, Ж.М Кожекбаева, А С Глотов, С В Паньков, Р А Юрасов, А В Чудинов, А С Заседателев Микрочипы в диагностике лимфопролиферативных заболеваний Молекулярная медицина, 2007 г, № 3, стр 54-60

Тезисы

1 О.Н. Митяева, Т В Наседкина, А Д Мирзабеков Анализ транслокаций с участием гена МЬЬ методом гибридизации на олигонуклеотидных микрочипах Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы конгресса Москва 2003

2 ТВ Наседкина, В С Жаринов, Е А Исаева, О.Н. Митяева, ОЕ Федорова, А С Глотов, А Д Мирзабеков Молекулярно-генеггический анализ онкологических заболеваний с использованием технологии биочипов

Материалы III Симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей» Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2002, том 1 №2

3 O.N Mityaeva, Е A Isaeva, V S Zharmov, А V Chudmov, R В Yurasov, A S Zasedatelev, T V Nasedkma Analisis of chromosomal translocations involved MLL gene using hybridization with oligonucleotide microarrays Eur Journ Hum Genet, vl3, suppl ,2005

4 O.H. Митяева, T В Наседкина, E А Исаева, В С Жаринов, А С Заседателев Анализ транслокаций с участием гена MLL при лейкозах методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами Вопросы гематологии/онкологии и иммунологии в педиатрии Материалы IV Симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2004, том 3 №4

5 Olga Mityaeva, Denis Fesenko, Yrii Lysov, Tatyana Nasedkma Low density microarrays for forensic DNA analysis 3rd International Conference "Genomics, Proteomics, Biomfomatics and Nanotechnologies for Medicine", Novosibirsk, 2006

Подписано в печать 07 09 2007 г Исполнено 10 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 677 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Митяева, Ольга Николаевна

Список сокращений.

Введение.

Цель и задачи исследования.

Глава II. 2. Обзор Литературы.

1.1. Биочипы: история создания, типы, применение.

1.1.1 Основные этапы развития методов основанных на гибридизации нуклеиновых кислот.

1.1.2 Биологические микрочипы на основе трехмерных ячеек геля.

1.1.3 Применение гелевых биочипов в биологии и медицине.

1.2 Классификация мутаций.

1.3 Хромосомные транслокации при лейкозах.

1.3.1 Классификация лейкозов.

1.3.2 Хромосомные аберрации при лейкозах.

1.3.3 Транслокации с участием гена MLL.

1.3.4 Методы генодиагностики лейкозов.

1.4 Молекулярно-генетический анализ в судебно-медицинской экспертизе.

1.4.1 История применения молекулярно-генетических методов в судебно-медицинской экспертизе.

1.4.2 SNP - мишень для молекулярно-генетического анализа в судебно-медицинской экспертизе.

1.4.3 Ген ABO.

1.4.4 Ген HLA-DQA1.

1.4.5 Ген AMELXY.

1.4.6. Оценка идентификационной информативности локуса.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Источники генетического материала.

2.2 Общая схема проведения анализа.

2.3 Экстракция тотальной РНК из лимфоцитов костного мозга.

2.4 Экстракция геномной ДНК из слюны.

2.5 Аллель-специфичная ПЦР для генотипирования локуса HLA-DQA1.

2.6 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.6.1 ОТ-ПЦР для анализа MZ-транслокаций.

2.6.2 ПЦР для идентификации личности.

2.7 Синтез олигонуклеотидов для иммобилизации в гелевых ячейках микрочипа.

2.8 Изготовление микрочипов.

2.8.1 Последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов и схема МХ-Биочипа.

2.8.2 Последовательность иммобилизованных олигонуклеотидов и схема ИЛ-Биочипа.

2.9 Визуализация ПЦР продуктов в агарозном геле.

2.10 Гибридизация на олигонуклеотидном биочипе.

2.11 Регистрация изображения и обработка результата.

2.12 Статистическая обработка данных.

Глава III. 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Анализ транслокаций (MZ-Биочип).

3.1.1. Выбор транслокаций с участием гена

3.1.2. Выбор последовательностей праймеров для мультиплексной ПЦР и олигонуклеотидных зондов. Конструирование и принцип работы МХ-Биочипа.

3.1.3. Разработка процедуры анализа транслокаций.

3.1.4 Алгоритм анализа гибридизационной картины, используемый в программном обеспечении "ImageWare".

3.1.5. Частоты встречаемости анализируемых транслокаций при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) и остром нелимфобластном лейкозе (ОНЛЛ).

3.1 .б.Новое место перестройки t(l 1;19) MLL/ELL.

3.1.7. Особенности анализа dup(l 1).

3.1.8. Отличительные особенности метода гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе.

3.2. Биочип для идентификации личности (ИЛ-Биочип).

3.2.1. Выбор локусов.

3.2.2. Конструирование и принцип работы биочипа.

3.2.3. Алгоритм анализа гибридизационной картины, используемый в программном обеспечении "ImageWare".

3.2.4. Отработка протокола анализа.

3.2.5 Тестирование на модельных объектах.

3.2.6. Генотипирование коллекции ДНК.

3.2.6.1 Соответствие молекулярно-генетического анализа группы крови с серологическим.

3.2.6.2. Основные параметры информативности локусов HLA-DQA1 и ABO для популяции славян.

3.2.7 Сравнение предлагаемого метода с другими методами, используемыми для идентификации личности.

3.2.8 Область применения разработанного ИЛ-Биочипа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и апробация метода гибридизации на гидрогелевых биочипах для анализа MLL-транслокаций и SNP в геноме человека"

Сегодня все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека. Это анализ мутаций при диагностике наследственных заболеваний, исследование изменений в геноме при уточнении диагноза и назначении терапии при онкологических заболеваниях. Также зарождается новое направление в медицине - предиктивная медицина, которая изучает генетическую предрасположенность индивида к различным заболеваниям и пытается свести к минимуму шансы возникновения заболевания или снизить тяжесть протекания болезни путем корректировки образа жизни и ранней диагностики. Широкое использование молекулярно-генетических методов в практике невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить одновременный анализ множества генетических изменений. Одним из наиболее перспективных подходов на сегодняшний день является сочетание мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидной матрице или биологическом микрочипе (биочипе).

В работе предложены два биочипа: биочип для анализа ряда хромосомных транслокаций при лейкозах у детей и биочип для идентификации личности, позволяющий анализировать набор однонуклеотидных полиморфизмов (SNP - single nucleotide polymorphism).

Необходимость анализа транслокаций при лейкозах связана с тем, что это заболевание занимает ведущее место среди онкологических заболеваний у детей. Всего лишь 20 лет назад выживаемость при детских лейкозах составляла 5-10%, тогда как в настоящее время она составляет 60-80% (по данным 5-летней оценки). Такой успех в лечении был достигнут благодаря использованию наиболее эффективных комбинаций различных цитостатических препаратов, а так же рационализации терапии, основанной на углубленной диагностике заболевания, в том числе и с использованием молекулярно-генетических методов. (Алейникова О.В. и др., 2002)

Ранее в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН был разработан ЛК-Биочип, который позволяет анализировать 8 наиболее часто встречающихся при лейкозах транслокаций: t(9;22) BCR/ABL р190 и р210, t(4;l 1) MLL/AF4, t(12;21 )TEL/AML, t(l;19) E2A/PBX, t(15;17) PML/RARA, t(8;21) AML/ETO, invlö CBFB/MYH. Хотя эти транслокации и являются наиболее частыми, они не охватывают весь спектр транслокаций, которые необходимо выявлять при постановке точного диагноза и назначении терапии. Поэтому, первая часть диссертационной работы посвящена созданию биочипа, предназначенного для анализа дополнительных семи транслокаций, в которых участвует ген MLL (Myeloid or Lymphoid Leukemia). Эта группа транслокаций особенно важна для больных лейкозом детей младше года, так как MLL-транслокации в этих случаях наблюдаются в 50%-80%, в зависимости от типа лейкоза и, кроме этого, тяжесть заболевания тесно связана с тем, какая именно MIZ-транслокация присутствует в клетках пораженного костного мозга.

Биочип для идентификации личности предназначен для другой области современной медицины - судебно-медицинской экспертизы. К сожалению, довольно часто встает задача идентификации личности, это не только поиск преступника, оставившего следы на месте преступления, но и опознание тел погибших при природных или техногенных катастрофах, при террористических актах. В настоящее время основными методами анализа при идентификации личности остаются серологический анализ крови, и молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генома, известных как тандемные повторы с изменяющимся числом копий, в частности микросателлитов или STR (shot tandem repeats). Однако серологический анализ часто не эффективен при исследовании малых количеств биологических следов, а также деградированных образцов. В этих случаях достаточно эффективен STR-анализ, однако он не дает фенотипической информации и требует дорогостоящего импортного оборудования. Нами предложен альтернативный подход на основе метода гибридизации на олигонуклеотидном биочипе, который не требует дорогостоящего импортного оборудования, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет получать такие фенотипические данные об индивиде, как группа крови и половая принадлежность.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось исследование возможности использования метода гибридизации на олигонуклеотидных биочипах для анализа хромосомных транслокаций с участием гена МЫ при лейкозах и для анализа БМ* при молекулярно-генетической идентификации личности. Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

1. Исследовать частоты МХ-транслокаций при лейкозах у детей с целью оценки необходимости создания тест-системы для клинической диагностики.

2. Выбрать наиболее часто встречающиеся при лейкозах у детей транслокации с участием гена МЫ и разработать олигонуклеотидный микрочип для их диагностики. Определить чувствительность метода.

3. Разработать олигонуклеотидный микрочип для судебно-медицинской генетической экспертизы. Определить чувствительность метода.

4. Оценить принципиальную возможность использования предложенного метода в судебно-медицинской практике при работе с малыми количествами ДНК.

5. Определить идентификационную информативность локусов, анализируемых с помощью разработанного микрочипа для идентификации личности в популяции славян.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Митяева, Ольга Николаевна

Выводы.

1. Определены частоты встречаемости МП-транслокаций при различных типах лейкозов. Они составили: при остром лимфобластном лейкозе у детей от 0 до года - 46%, от года до трех лет - 9%; при остром нелимфобластном лейкозе у детей старше года

8%. Таким образом, MZZ-транслокации являются распространенным диагностическим маркером при лейкозах у детей.

2. Разработан олигонуклеотидный биочип для анализа хромосомных транслокаций с участием гена МП. Чувствительность - 1 клетка с транслокацией на 103-104 здоровых клеток, что позволяет отслеживать эффективность терапии.

3. Сконструирован олигонуклеотидный микрочип для анализа 9 аллелей гена HLA-DQA1, 5 аллелей ABO, 2 аллелей гена AMEL. Чувствительность метода составила около 100 пкг ДНК на анализ.

4. На 3 модельных объектах показана принципиальная возможность использования предложенного метода в судебно-медицинской практике.

5. Определена идентификационная информативность локусов HLA-DQA1 и ABO для популяции славян. Было получено, что информативность 3 данных локусов близка к информативности 8 STR-локусов, анализируемых методом полиморфизма длин амплифицированных фрагментов, и используемых в коммерческом наборе PowerPlex (Promega).

Заключение.

В современной медицине все чаще требуется знание о генетических особенностях человека. Это и выявление мутаций при наследственных заболеваниях, и исследование генетических изменений в опухолях для постановки диагноза и назначении терапии при онкологических заболеваниях.

Однако такие молекулярно-генетические исследования требуют новых методов исследования, которые позволили бы надежно и быстро анализировать одновременно большое количество генетических маркеров.

Один из таких методов был предложен в данной работе для анализа ряда хромосомных транслокаций при лейкозе и для идентификации личности путем анализа набора SNP.

В первой части работы описан биочип для анализа семи MLL-транслокаций, а также показано, что предложенный метод анализа обладает достаточной чувствительностью для использования его в клинической практике для отслеживания минимальной остаточной болезни.

Во второй части работы исследована возможность использования биочипов при молекулярно-генетической идентификации личности. Был определен порог чувствительности предлагаемого метода, который составил 100 пкг на анализ, также на модельных образцах показана принципиальная возможность использования предложенного метода в судебно-медицинской практике.

Кроме этого определена идентификационная информативность локусов, анализируемых на предложенном биочипе. Мы получили, что при анализе SNP в трех локусах - HLA-DQA1, ABO, AMEL - вероятность случайного совпадения генотипов составляет 0,46%, что является слишком большой величиной для доказательства причастности индивида к преступлению, однако, позволяет значительно сузить круг подозреваемых. Вероятность случайного совпадения может быть существенно понижена путем расширения набора анализируемых локусов, причем к существенному усложнению методики это не приведет.

Таким образом, была показана возможность использования предложенного метода на практике, как в диагностике лейкозов для анализа хромосомных транслокаций, так и в судебно-медицинской экспертизе для идентификации личности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Митяева, Ольга Николаевна, Москва

1. Алейникова О.В., Сыцкевич О.Н., Потапнев М.П. Современные методы диагностики острых лейкозов у детей и взрослых (методические рекомендации) // Минск. 2000.

2. Алейникова О.В., Потапнев М.П., Углова Т.А. Стратификация групп риска у детей с острым лимфобластным лейкозом. Методические рекомендации. Минск. 2001.

3. Вуд М.Э., Банн П.А. Секреты гематологии и онкологии // Москва. Бином. 1997.

4. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний // Специальная литература. СПб. 1997.

5. Гра O.A., Глотов A.C., Кожекбаева Ж.М., Макарова О.В., Самочатова Е.В., Заседателев A.C., Наседкина Т.В. Опыт использования биочипов для анализа полиморфных вариантов гена CYP1 Al при лейкозах у детей // Медицинская генетика.2006. В. 4. Стр. 34-38.

6. Под редакцией Иванова В,И., Киселева Л.Л. Геномика -медицине // ИКЦ «Академкнига». Москва. 2005.

7. Иванов П.JI. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфозма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства // Суд. Мед. Эксп. 1999. В 4. Стр. 35-41.

8. Иванов П.Л. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе // Вестник Российской Академии Наук. 2003. Т 73. В. 12. Стр. 10851097.

9. Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е., Заседателев A.C. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. Стр. 5-16.

10. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века. Выступление на научной сессии общего собрания РАН // Вестник Российской Академии Наук. 2003.Т. 73 В. 5. Стр. 412 .

11. Лысов Ю., Флорентьев В., Хорлин А., Храпко К., Шик В., Мирзабеков А. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод // Докл. Акад. Наук СССР. 1988. Т. 303. Стр. 1508-1511.

12. Пименов М.Г., Культин А.Ю., Кондрашов С.А. Научные и практические аспекты криминалистического ДНК-анализа: Учебное пособие. // ГУ ЭКЦ МВД России. Москва. 2001.

13. Сергеев А.Г., Иванов Р.А. Генодиагностика лейкозов. Пособие для врачей // Екатеринбург. 1998.

14. Хедрик Ф. Генетика популяций // Техносфера. Москва. 2003.

15. Под ред. Херрингтона С., Магки Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. //Мир. Москва. 1999.

16. Шик В.В., Лебедь Ю.Б., Крюков Г.В. Идентификация аллелей HLA-DQA1 методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами // Мол. Биол. Гена. 1998. Т32. В.5. Стр. 813-822.

17. An Atlas on Chromosomes in Hematological Malignancies. Example: 1 lq23 and MIL partners // Leukemia. 2001. V. 15. P. 987-999.

18. Akane A, Shiono H, Matsubara K, Nakahori Y, Seki S, Nagafuchi S, Yamada M, Nakagome Y. Sex identification of forensic specimens by polymerase chain reaction (PCR): two alternative methods // Forensic Sci Int. 1991. V49(l). P. 81-88.

19. Auton PM. and Cleary ML. Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion proteins // Oncogene. 2001. V. 20. P. 5695-5707.

20. Biondi A, Cimino G, Pieters R, Ching-Hon Pui. Biological and therapeutic aspects of infant leukemia // Blood. 2000. V. 96(1). P. 2433.

21. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. Construction of a Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorohisms // Am J Hum Genet. 1980. V. 32. P. 314-331.

22. Brenner C, Morris J. Paternity index calculations in single locus hypervariable DNA probes: validation and other studies // In

23. Proceedings for the International Symposium on Human Identification 1989. P. 21-53.

24. Dupont M., Goldsborough A., Levayer T., J. Savare et. al. Multiplex Fluorescent RT-PCR to Quantify Leukemic Fusion Transcripts // BioTechnicues. 2002. V. 33. P. 158-164.

25. Carey L., Mitnik L. Trends in DNA forensic analysis.// Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 1386-1397.

26. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal.Biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.

27. Clark J., Smith F., Arceci J. Update in childhood acute myeloid leukemia: recent developments in the molecular basis of disease and novel therapies // Current Opinion in Hematology. 2003. V. 10. P. 31-39.

28. D.O. Fesenko, T.V. Nasedkina, D.V. Prokopenko, A.D. Mirzabekov. Biosensing and monitoring of cell populations using the hydrogel bacterial microchip // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V. 20. P. 1860-1865.

29. Frudakis T, Thomas M, Gaskin Z, Venkateswarlu K, Chandra KS, Ginjupalli S, Gunturi S, Natrajan S, Ponnuswamy V, Ponnuswamy K.

30. Sequences associated with human iris pigmentation // Genetics. 2003. V. 165(4). P. 2071-2083.

31. Frudakis T, Venkateswarlu K, Thomas M, Gaskin Z, Ginjupalli S, Gunturi S, Ponnuswamy V, Natarajan S, Nachimuthu P. A classifier for the SNP-based inference of ancestry // J Forensic Sei. 2003. V. 48(4). P.771-782.

32. Jeffreys AJ., Wilson V., Thein S.L. Individual-specific "fingerprints" of human DNA // Nature. 1985. V. 316. P.76

33. M. Jungerman. Proceedings of 12th International Histocompatibility // Workshop. 1996. V. 2. P. 194.

34. Hashimoto M, Kinoshita T, Yamasaki M, Tanaka H, Imanishi T, Ihara H, Ichikawa Y, Fukunishi T. Gene frequencies and haplotypic associations within the HLA region in 916 unrelated Japanese individuals//Tissue Antigens. 1994.V. 44(3). P. 166-73.

35. Henegariu, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance and P.H. Vogt. "Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-step Protocol" // BioTechniques. 1997. V. 23(3). P. 504-511.

36. Hoyer B, McCartny B, Bolton E. Complementary RNA in nucleus and cytoplasm of mouse liver cells // Science. 1963. V. 140. P.1408-12.

37. Gill P. An assessment of the utility of single nucleotide polymorphisms (SNPs) for forensic purposes // Int J Legal Med. 2001. V. 114. P. 204-210.

38. Gill P., Jeffreys AJ., Werrett D.J. Forensic application of DNA "Fingerprints"//Nature. 1985. V.318. P.577.

39. Greaves M. Childhood leukaemia // BMJ. 2002. V. 324(7332). P. 283-287.

40. Greene SR, Yuan ZA, Wright JT, Amjad H, Abrams WR, Buchanan JA, Trachtenberg DI, Gibson CW. A new frameshift mutationencoding a truncated amelogenin leads to X-linked amelogenesis imperfecta //Arch Oral Biol. 2002. V. 47(3). P. 211-217.

41. Griffin TJ, Smith LM. Genetic identification by mass spectrometric analysis of single-nucleotide polymorphisms: ternary encoding of genotypes // Anal Chem. 2000. V.15. V.72(14). P. 3298-3302.

42. Gu Y., Nakamura T., Alder H. et. al. The t(4;l 1) Chromosome Translocation of Human Acute Leukemias Fuses the ALL-1 Gene, Related to Drosophila trithorax, to the AF-4 Gene // Cell. 1992. V. 71. P. 701-708.

43. Lander E. Array of hope // Nat Genet. 1999. V. 21. P. 3-4.

44. Mitani K., Kanada Y., Ogawa S., Tanaka T., Inazawa J., Yazaki Y., Hirai H. Cloning of several species of MLL/MEN chimeric cDNA inmyeloid leukemia with t( 11 ; 19)(q23;p 13.1 ) translocation // Blood. 1995. V. 85. P. 2017-2024.

45. Moradian-Oldak J, Bouropoulos N, Wang L, Gharakhanian N. Analysis of self-assembly and apatite binding properties of amelogenin proteins lacking the hydrophilic C-terminal // Matrix Biol. 2002. V. 21(2). P. 197-205.

46. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations // PNAS. 1969. V.64(2). P.600-604.

47. Rajalingam R., Ge P., Reed E.F. A sequencing-Based Typing Method for HLA-DQA1 Alleles // Human Immunology. 2004. V. 65. P. 373379.

48. Rubnitz J.E., Raimondi S.C., Tong X., Srivastava D.K., Razzouk B.I., Shurtleff S.A., Downing J.R., Pui C.H., Ribeiro R.C., Behm F.G. Favorable impact of the t(9;l 1) in childhood acute myeloid leukemia //J Clin Oncol. 2002. V. 20. P. 2302-2309.

49. Sambrook J., Fritsch EP., Maniatis. Molecular cloning: a Laboratory Coldspring Harbour Lab. Coldspring Harbour. NY. 1989.

50. Satake N, Maseki N, Nishiyama M, Kobayashi H, Sakurai M, Inaba H, Katano N, Horikoshi Y, Eguchi H, Miyake M, Seto M, Kaneko Y. Chromosome abnormalities and MLL rearrangements in acute myeloid leukemia of infants //Leukemia. 1999. V.13(7). P. 10131017.

51. Schildkraut CL, Marmur J, Doty P. The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies // J Mol Biol. 1961. V.3.P. 595-617.

52. Schnittger S, Wormann B., Hiddemann W., Griesinger F.Partial tandem duplications of the MLL gene are detectable in peripheral blood and bone marrow of nearly all healthy donors // Blood. 1998. V. 92. P. 1728-1734.

53. Seltsam A., Hallensleben M., Kollmann A., Blasczyk R. Tne nature of diversity and diversification at the ABO locus // Blood. 2003. V. 102. P. 3035-3042.

54. Seltsam A., Gupta C., Wagner F., Blasczyk R. Nondeletional AB0*0 alleles express weak blood group A phenotypes // Transfusion. 2005. V. 45. P. 359-365.

55. Stephen P. Hunger and Micaael L. Cleary. What Significance Should We Attribute to the Detection of MLL Fusion Transcripts? // Blood. 1998. V. 92(3 ). P. 709-711.

56. So CW and Cleary ML. Common mechanism for oncogenic activation of MLL by forkhead family proteins // Blood. 2003. V. 101(2). P. 633-639.

57. Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J Mol Biol. 1975. V. 98(3). P. 503517.

58. Stephen P. Hunger and Micaael L. Cleary. What Significance Should We Attribute to the Detection of MLL Fusion Transcripts? // Blood. 1998. V. 92(3). P. 709-711.

59. Thirman M., Levitan D., Kobayashi H., Simon M., Rowley J. Cloning of ELL, a gene that fuses to MLL in a t(l I;19)(q23;pl3.1) in acute myeloid leukemia//PNAS. 1994. V. 91. P.12110-12114.

60. Walsh SJ. Recent advances in forensic genetics.// Expert Rev Mol Diagn. 2004. V. 4(1). P. 31-40.

61. Yamamoto F., Clausen H., White T., Marken J., Hakamori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group system // Nature. 1990. V. 345. P. 229-233.

62. Ye J, Parra EJ, Sosnoski DM, Hiester K, Underhill PA, Shriver MD. Melting curve SNP (McSNP) genotyping: a useful approach for diallelic genotyping in forensic science // J Forensic Sci. 2002 V. 47(3). P. 593-600.

63. Yip SP. Single-tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common ABOalleles and readily identifies new alleles // Blood. 2000. V. 95. P. 1487-1492.

64. Благодарю д.б.н., профессора В.В. Носикова, д.б.н., профессора П. Л. Иванова, Р.Я. Якшимбетова за предоставленные образцы ДНК.

65. Также благодарю Ольгу Гра, Ольгу Макарову и к.б.н. Жанну Кожекбаеву за помощь в сборе образцов слюны для проведения исследований.