Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF в клетках опухолей различной локализации с использованием биочипов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF в клетках опухолей различной локализации с использованием биочипов"

на правах рукописи

Емельянова Марина Александровна

АНАЛИЗ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ЕСГИ, КЯАБ, Р1КЗСА И ВЯАР В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕЙ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЧИПОВ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2014

27 НОЯ 2014

005555801

005555801

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук Научный руководитель:

ведущий научный сотрудник Лаборатории биологических микрочипов, доктор биологических наук, профессор

Наседкина Татьяна Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, зав. Лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Карпухин Александр Васильевич

доктор медицинских наук, зав. Отделом химического канцерогенеза Научно-исследовательского института канцерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук

Якубовская Марианна Геннадиевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

1 о

Защита состоится «2_5» Vg^ec^/W 2014г. в ^2 ~ч. на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автореферат разослан « 14 » с^/С-**— 2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук /г^ Крицын

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В подходах к лечению онкологических заболеваний в последние годы произошли значительные изменения. Активно использовавшиеся в химиотерапии противоопухолевые средства, направленные на прямое повреждение аппарата деления клетки, постепенно уступают место так называемым таргетным препаратам. Особенностью данных средств является то, что они воздействуют на критически важные для опухоли сигнальные пути, которые обеспечивают конкурентное преимущество раковой клетки перед здоровыми клетками организма за счет стимуляции клеточного роста, пролиферации, инвазии, метастазирования, ангиогенеза и подавления апоптоза. Одним из таких путей является EGFR-зависимый сигнальный каскад. Гиперэкспрессия рецептора эпидермального фактора роста (Epidermal growth factor receptor, EGFR) наблюдается во многих типах опухолей эпителиальной природы, поэтому представляется очевидным, что именно EGFR был выбран в качестве мишени первых таргетных препаратов. В настоящее время на рынке лекарственных средств доступно четыре антагониста EGFR. Условно их можно разделить на две группы. Это низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназной активности рецептора - гефитиниб и эрлотиниб, связывающиеся с его внутриклеточным доменом, и моноклонапьные антитела - цетуксимаб и панитумумаб, конкурирующие с природными лигандами за связывание с внеклеточным доменом EGFR. В ходе клинических испытаний было обнаружено, что ключевую роль в эффективности ингибиторов EGFR играют мутации в тирозинкиназном домене EGFR и в ряде его эффекторов, включая белки KRAS, BRAF и PIK3CA. Было установлено, что наличие точечных мутаций в 858 и 719 кодонах, а также небольших делеций в 19 экзоне гена EGFR обусловливает чувствительность опухоли к гефитинибу и эрлотинибу при лечении немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а присутствие мутации Т790М, напротив, вызывает устойчивость к данным препаратам. Невосприимчивость к анти-EGFR терапии также обусловлена наличием активирующих мутаций в генах KRAS, BRAF и PIK3CA. Мутантные белки стимулируют внутриклеточную сигнализацию независимо от самого EGFR, что делает блокировку данного рецептора таргетными препаратами неэффективной. В настоящее время идет активная разработка и внедрение в практику препаратов, направленных на подавление активности белков-эффекторов EGFR. В частности, при лечении меланомы с мутантным BRAF с недавнего времени используется ингибиторы вемурафениб, дабрафениб и траметиниб. Вемурафениб и дабрафениб избирательно блокируют BRAF, а мишенью траметиниба является МЕК1/2.

При анализе опухолевого материала доля клеток с анализируемыми соматическими мутациями может быть невелика, что не всегда позволяет выявить мутацию. Наиболее часто для решения этой проблемы используют аллель-специфичную ПЦР в реальном времени (АС-РВ-ПЦР) или секвенирование с предварительным обогащением образца мутантной ДНК, однако при одновременном

анализе большого количества мутаций использование данных методик становится достаточно трудоемким. В последнее время все большее распространение получает высокопроизводительное секвенирование. Оно позволяет выявлять мутации de novo и обладает высокой аналитической чувствительностью, но пока не находит широкого применения в рутинной клинической практике из-за высокой стоимости анализа и трудоемкости.

В настоящей работе для решения проблемы выявления соматических мутаций в опухоли предложен высокочувствительный метод, совмещающий LNA-блокирующую мультиплексную ПЦР с аллель-специфической гибридизацией на биочипе. LNA (locked nucleic acid) - это синтетический аналог РНК, имеющий дополнительную связь между 2'-0 и 4'-С, которая блокирует рибозу в N-конформации, подобно А-форме РНК. Такая «закрытая» конформация способствует увеличению термодинамической стабильности совершенного дуплекса DNA-LNA и нестабильности несовершенного. В результате присутствия в ПЦР-смеси LNA-содержащего олигонуклеотида, который комплементарно связывается с последовательностью дикого типа, препятствуя ее амплификации, происходит преимущественное увеличение числа копий мутантного аллеля.

Использование данного оригинального подхода позволяет одновременно анализировать большое количество соматических мутаций. Разработанный метод может быть применен для массового скрининга пациентов с различного рода злокачественными новообразованиями с целью индивидуального подбора наиболее эффективной противоопухолевой терапии, основанной на наличии достоверной информации о генетических маркерах, влияющих на восприимчивость опухоли к химиотерапевтическим препаратам.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью диссертационной работы является идентификация соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, Р1КЗСЛ и BRAF и выявление ассоциаций между генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками онкологических больных.

Достижение цели предусматривало решение следующих задач:

1. Разработать метод одновременной идентификации 37-ми функционально значимых соматических мутаций в генах EGFR (18 вариантов), KRAS (13 вариантов), PIK3CA (5 вариантов), BRAF(\ вариант).

2. Определить частоту и спектр мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF в опухолях различной локализации у онкологических больных.

3. Выполнить статистический анализ по выявлению ассоциаций между генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками онкологических больных.

4. Оценить эффективность применения разработанного подхода по идентификации соматических мутаций и достоверность получаемых результатов в сравнении с другими методами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые предложен метод анализа соматических мутаций в генах £GF^^, ЛГА45, В НА Г и Р1КЗСА, сочетающий в себе 1,ЫА-блокирую1цую мультиплексную ПЦР с последующей аллель-специфичной гибридизацией проду1сгов амплификации на гидрогелевых биочипах. Использование данного метода позволяет одновременно анализировать 37 клинически значимых мутаций в опухолевом материале и обладает высокой аналитической чувствительностью.

Метод был успешно применен для определения частоты и спектра соматических мутаций в вышеупомянутых генах в опухолях различной локализации (НМРЛ, раке поджелудочной железы (РПЖ), колоректальном раке (КРР) и меланоме) у онкологических больных. Проведен анализ ассоциаций между молекулярно-генетическими и клинико-анамнестическими характеристиками пациентов. Проведено сравнение эффективности применения разработанного метода с традиционными методами анализа.

Разработанный метод идентификации мутаций может найти применение в клинической диагностике при назначении противоопухолевой терапии онкологическим больным, так как позволяет избирательно назначать наиболее рациональное для пациента лечение, избегая применения неэффективных препаратов, наносящих вред здоровью за счет тяжелых побочных эффектов и имеющих высокую стоимость.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты работы были представлены на Европейской конференции по генетике человека (Гётеборг, Швеция, 2010; Париж, Франция 2013), XIV и XVI Российском Онкологическом конгрессе (Москва, Россия, 2010 и 2012), конференции по Молекулярной диагностике (Москва, Россия, 2010 и 2014), 36-ом конгрессе РЕВ5 (Турин, Италия, 2011) и XVIII Всероссийской научно-практической конференции «Аналитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины» (Москва, Россия, 2013). Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ФГБУ ИМБ РАН.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 9 тезисов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 261 источник. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста и содержит 35 рисунков и 24 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Клинический материал. В качестве клинического материала использовано 367 образцов опухолей, свежезамороженных в жидком азоте (HMPJI) или фиксированных в парафиновых блоках (РПЖ, КРР, меланома, HMPJI). Опухолевый материал получен от больных, прооперированных и/или получавших химиотерапевтическое лечение в НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН и использован с согласия Комитета по этике.

Выборка анализируемых образцов была получена от пациентов со следующими клиническими диагнозами:

Рак поджелудочной железы: 39 пациентов (18 мужчин и 21 женщина). Средний возраст больных составил 59,2±11,2 лет. У 35 больных была диагностирована аденокарцинома ПЖ, у 2 -аденокарцинома фатерова соска и у 2 - доброкачественные образования ПЖ.

Колоректалъный рак: 66 пациентов (28 мужчин и 38 женщин). Средний возраст больных составил 61,3±12,6 года. У 63 больных опухоль имела структуру аденокарциномы, для 3 пациентов гистологический тип опухоли был неизвестен.

Меланома: 93 пациентов (30 мужчин и 63 женщины). Средний возраст больных составил 54,9±14,5 года. У 41 больного была диагностирована узловая меланома, у 14 - поверхностно-распространяющаяся меланома, у 4 - акрально-лентигиозная меланома, у 1 - меланома типа злокачественного лентиго, для 33 пациентов данные о гистологическом типе опухоли отсутствовали.

Немелкоклеточный рак легкого: 150 пациентов (97 мужчин и 53 женщины). Средний возраст больных составил 59,5±10,5 лет. У 117 пациентов опухоль имела структуру аденокарциномы, у 25 - плоскоклеточного рака, у 2 - мукоэпидермоидного рака, у 2 - аденокистозного рака и у 1 -смешанного рака.

Образцы опухолевой ДНК с известными генотипами были предоставлены Московской городской онкологической больницей №62 и ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН.

Экстракиия опухолевой ДНК. Для выделения ДНК из свежезамороженного операционного материала использовали набор QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Германия), для выделения ДНК из операционного материала, фиксированного в парафиновых блоках - набор QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Германия).

Конструирование праймеров и иммобилизаиионных зондов. Последовательности генов получены из базы данных «NCBI» (США). Праймеры и иммобилизационные зонды подбирали с использованием программы Clone Manager («Scientific & Educational Software», США) и on-line приложения BLAST («NCBI», США).

Сайт-направленный мутагенез. Для тестирования разработанных биологических микрочипов некоторые мутантные последовательности генов EGFR, KRAS, BRAF и PIK3CA, несущие анализируемые точечные мутации, получены посредством сайт-направленного мутагенеза. Фрагменты 19 экзона EGFR, содержащие анализируемые на чипе делеции, синтезированы в коммерческой фирме «Евроген» (Москва, Россия).

Конструирование LNA-олигонуклеотидов. LNA-олигонуклеотиды моделировали с помощью on-line приложения (http://www.exiqon.com/oligo-tools). В их состав входили как LNA, так и ДНК-нуклеотиды, З'-конец молекулы был фосфорилирован для препятствия элонгации олигонуклеотида Taq-полимеразой.

Изготовление биочипов. Биологические микрочипы были изготовлены методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов полиакриламидного геля. Нанесение гелевых ячеек на пластиковую подложку производили на роботе QArray2 SN QA 3067 («Genetix PLC», Великобритания).

Полимеразная иепная уеакиия. Амплификацию анализируемых участков генов проводили с помощью двухэтапной мультиплексной LNA-блокирующей ПЦР. Для каждого фрагмента были подобраны и синтезированы две пары праймеров и один LNA-олигонуклеотид.

ПЦР-смесь первого этапа содержала равное количество прямого и обратного праймеров для каждого анализируемого участка и LNA-олигонуклеотид, в оптимальной концентрации, обеспечивающей преимущественную амплификацию мутантной последовательности гена.

На втором этапе в качестве матрицы использовали продукт первого этапа ПЦР. Реакционная смесь содержала праймеры второго этапа, причем обратного праймера содержалось в 10 раз больше, чем прямого, для преимущественного получения одноцепочечного продукта. ПЦР-смесь второго этапа не содержала LNA-олигонуклеотидов и включала флуоресцентно меченный дУТФ-Су5, который встраивался в цепь в процессе амплификации. В результате получали одноцепочечный флуоресцентно меченный ПЦР-продукт.

Для амплификации фрагментов гена EGFR использовали одну реакционную смесь на каждом из этапов ПЦР. Для амплификации целевых участков гена KRAS также использовали одну реакционную смесь в каждом раунде ПЦР. Для амплификации целевых фрагментов генов PIK3CA и BRAF использовали две реакционных смеси на каждом этапе ПЦР.

Гибридизация, регистрация изображения и обработка полученных результатов. Полученный на втором этапе мультиплексной ПЦР флуоресцентно меченный продукт использовали для гибридизации на биочипе. Флуоресцентный сигнал от ячейки микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов («БИОЧИП-ИМБ», Россия), снабженного прибором с зарядовой связью и программным обеспечением ImaGeWare. Поскольку все ячейки на биочипе дублированы, в расчетах использовали среднее значение сигнала по двум ячейкам.

Если флуоресцентные сигналы (J) в ячейках, содержащих зонды, комплементарные мутантной последовательности гена (J\rul), превышали сигналы в ячейках, содержащих зонды, комплементарные последовательностям дикого типа (Jm), делали вывод о наличии мутации в исследуемом образце.

Секвенироеание использовали для контроля результатов, полученных гибридизацией на микрочипах. ПЦР-продукты секвенировали на автоматическом секвенаторе ABI Prism Genetic Analyzer 3100 («Applied Biosystems», США) в центре коллективного пользования «Геном» при ФГБУ ИМБ РАН.

Статистическая обработка результатов. Возраст представлен как среднее ± стандартное отклонение. Ассоциации между генотипом и качественными клиническими признаками анализировали с помощью точного двухстороннего критерия Фищера или с помощью критерия Пирсона (х2) с поправкой Йетса. Для определения ассоциаций между возрастом пациентов и молекулярно-генетическими характеристиками опухолей использовали U-критерий Манна-Уитни. Уровень значимости всех критериев был принят в размере 5%. Статистический анализ проводили с использованием GraphPad InStat, версия 3.05 («GraphPad Software Inc.», США).

Результаты и обсуждение

Олигонуклеотидный микрочип. При разработке биологических микрочипов, основываясь на литературных данных, для анализа были выбраны наиболее распространенные соматические мутации в генах EGFR, KRAS, BRAF и PIK3CA, имеющие предиктивное значение при назначении противоопухолевой терапии:

• в гене EGFR: G719A, G719C, G719S, Т790М, L858R и делеции в 19 экзоне (E746-A750del [2варианта], E746-T751del insA, E746-T751del insV, E746-S752del insV, L747-A750del insP, L747-T751 del insP, L747-T751del, L747-P753del insS, E746-S752del insV, E746-A750del insQP, E746-T751del ins VA, E746-P753del insVS);

• в гене KRAS: G12S, G12R, G12C, G12D, G12A, G12V, G13D, G13V, G13A, G13C, G13R, Q61L и Q61H;

• в гене PIK3CA: Е542К, Е545К, Q546K, H1047L и H1047R;

• в гене BRAF мутацию V600E.

Для анализа каждой из мутации и соответствующих последовательностей дикого типа были сконструированы олигонуклеотидные зонды, которые представляли собой фрагменты длиной 1220 п.о., комплементарные анализируемым участкам генов, несущие вариабельный нуклеотид (или делецию), как правило, в центральном положении. В некоторые зонды для увеличения их дискриминирующей способности были введены LNA-нуклеотиды. Все зонды имели одинаковую

температуру плавления. На З'-конце зондов находился спейсер со свободной аминогруппой для иммобилизации в гидрогелевых ячейках биочипа. Каждая ячейка на биочипе дублировалась для повышения воспроизводимости результатов.

Поскольку для различных онкологических заболеваний наиболее характерны мутации в определенных генах, олигонуклеотиды для аллель-специфичной гибридизации были сгруппированы на трех отдельных подложках: первая - для анализа соматических мутаций в гене EGFR, вторая - в гене KRAS и третья - в генах PIK3CA и BRAF.

Каждый из разработанных биочипов был протестирован на способность определения тех мутаций, для которых были иммобилизованы специфические олигонуклеотидные зонды. Для этого использовали образцы опухолевой ДНК с известными генотипами. В ряде случаев, ввиду отсутствия клинических образцов с данной мутацией были использованы мутантные последовательности, полученные с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Анализ мутаций в гене EGFR. Американское общество клинической онкологии (ASCO) и российское Общество онкологов-химиотерапевтов (RUSSCO) рекомендует проводить тест на наличие соматических мутаций в гене EGFR перед назначением таргетных препаратов -гефитиниба и эрлотиниба при лечении немелкоклеточного рака легких. Это позволяет отбирать пациентов, для которых такое лечение будет наиболее эффективным.

Для анализа с помощью биочипа выбраны наиболее частые клинически значимые соматические мутации: делеции в 19 экзоне, точечные мутации в 719 и 858 кодонах, определяющие чувствительность опухоли к таргетной терапии гефитинибом и эрлотинибом, а также обусловливающая устойчивость к этим препаратам мутация Т790М.

На рис. 1 приведена схема расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе. В угловых позициях локализованы ячейки, содержащие флуоресцентный краситель Су5 для правильного позиционирования микрочипа при захвате изображения.

Рисунок 1. Схема расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе для анализа мутаций в гене EGFR. В верхнем ряду ячеек иммобилизованы олигонуклеотиды, комплементарные анализируемым последовательностям дикого типа (Wt). Различные мутантные варианты соответствующих последовательностей иммобилизованы в ячейках, расположенных ниже. Ячейки с олигонуклеотидными зондами, комплементарными наиболее часто встречающимся делениям в 19 экзоне, обозначены буквой «d» и соответствуют: dl - E746-A750del [вариант1: с.2235-2249 del], d2 - E746-A750del [вариант2: с.2236-2250 del], d3 - Е746-Т751 del insA, d4 - E746-T751 del insV, d5 - E746-S752 del insV, d6 - L747-A750 del insP, d7 - L747-T751del insP, d8 - L747-T751 del, d9 - L747-P753 del insS, dlO- E746-S752 del insV, dll -E746-A750 del insQP, dl2 - E746-T751 del insVA, dl3 - E746-P753 del insVS. Ячейки с олигонуклеотидами, соответствующими мутациям G719A, G719C и G719S, обозначены буквами А, С, S, соответственно. В ячейках М иммобилизованы зонды для идентификации мутации Т790М, а в ячейках R - для идентификации мутации L858R.

На рис. 2 представлены гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормированных сигналов флуоресценции по каждой группе ячеек (справа), полученные при анализе образца, не содержащего исследуемых мутаций в гене EGFR (2А) и образца, несущего мутацию L858R (2Б). Сигналы флуоресценции нормировались на максимальный сигнал в соответствующей группе ячеек. Считали, что образец содержит мутацию, если в ячейке, содержащей зонд, комплементарный мутантной последовательности, флуоресцентный сигнал выше, чем в соответствующей ячейке Wt. Отношение рассматриваемых сигналов JmJJwt для кодона 858 гена EGFR (рис. 2Б) составило 5,1, что свидетельствует о наличии мутации L858R в анализируемом образце.

экз.. 19 к.719 к.790 к.858

Рисунок 2. Гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормированных сигналов флуоресценции ячеек (справа), полученных при анализе образца, не содержащего исследуемых мутаций в гене EGFR (А) и образца, несущего мутацию L858R (Б).

Анализ мутаций в гене KRAS. ASCO и RUSSCO рекомендуют проводить анализ молекулярно-генетического статуса гена KRAS у больных КРР при назначении терапии цетуксимабом и панитумумабом, поскольку наличие мутаций в данном гене обусловливает устойчивость опухоли к данным таргетным препаратам.

При конструировании биочипа в анализ, помимо самых распространенных мутаций в кодонах 12 и 13, были включены две мутации в кодоне 61 гена KRAS. На рисунке 3 приведена схема иммобилизации олигонуклеотидных зондов для анализа 13 наиболее часто встречающихся клинически-значимых мутаций в гене KRAS.

кодом 12 кодом 13 кодон 61

Рисунок 3. Схема расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе для анализа мутаций в гене KRAS. В верхнем ряду иммобилизованы олигонуклеотиды, комплементарные анализируемым последовательностям дикого типа Ниже расположены ячейки, содержащие зонды, комплементарные последовательностям, несущим мутации. Обозначение ячеек соответствует однобуквенной аббревиатуре аминокислот.

На рисунке 4 представлены гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормированных сигналов флуоресценции по каждой группе ячеек (справа), полученные при анализе образца, не содержащего искомых мутаций (4А) и образца, несущего мутацию 012У (4Б). Отношение рассматриваемых сигналов JмJJwт для мутации 012У в гене КЯА5 (рис. 4Б) составило 8,3, что свидетельствует о наличии данной мутации в анализируемом образце.

Рисунок 4. Гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормированных сигналов флуоресценции ячеек (справа), полученные при анализе образца, не содержащего исследуемых мутаций (А) и образца, несущего мутацию G12V (Б).

Анализ мутаиий в генах PIK3CA и BRAF. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (англ. Food and Drug Administration, FDA) рекомендует использование вемурафениба, дабрафениба и траметиниба только для лечения больных меланомой, несущих мутацию в 600 кодоне гена BRAF.

Согласно литературным данным, наличие мутации V600E в гене BRAF обуславливает невосприимчивость к анти-EGFR терапии при лечении КРР, поэтому больным КРР с диким типом гена KRAS также рекомендуется проведение теста на выявление мутации V600E.

Ряд исследований свидетельствует, что мутации в гене PIK3CA ассоциированы с резистентностью к анти-EGFR терапии. Поэтому для анализа с помощью биочипа были выбраны наиболее часто встречающиеся и при этом имеющие предиктивное значение мутации: Е542К, Е545К, Q546K, H1047L, H1047R в гене Р/КЗСА и V600E в гене BRAF. На рис. 5А представлена схема локализации олигонуклеотидных зондов на биочипе. В верхнем ряду иммобилизованы

олигонуклеотиды для анализируемых последовательностей дикого типа. Различные мутантные варианты тех же самых последовательностей иммобилизованы в ячейках, расположенных ниже. В качестве примера гибридизационных картин (слева) и гистограмм нормализованных сигналов флуоресценции (справа) представлены результаты анализа образца, не содержащего исследуемых мутаций (рис. 5Б) и образца, содержащего мутации Е542К в гене Р1КЗСА и У600Е в гене ВИАР (рис. 5В). Отношение рассматриваемых сигналов JмшlJwт для кодона 542 гена Р1КЗСА и Jм„^Jwт для кодона 600 гена ВЯАР (рис. 5В) составило 6,1 и 7,6, соответственно, что свидетельствует о наличии мутаций Е542К Р1КЗСА и У600Е ВЯАР в анализируемом образце.

Р1КЗСА

БЯЛР

кодон542 кодон545 кодон546 кодон1047 кодонбОО

кодон542 кодом545 кодон546 кодон 1047 кодонбОО Р1КЗСА_Р1КЗСА_Р1КЗСА_ВЯАГ

В

Р1КЗСА

кодон542 кодон545 КОДОН546 кодон 1047 кодонбОО

?анные сигналы эсценции, о.е. о ° р А и о

1-1 1-

1 1 _ | □мит

£§ о ■ =1 1п1гп 1 1пп ■

0 1 от к, от к . от к, \л одон 542 кодон 545 кодон 546 Р1КЗСА Р1КЗСА /Т 1. К, \Л/Т Е. одон 1047 кодонбОО Р1КЗСА ВРАР

Рисунок 5. Схема расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе для анализа мутаций в генах Р1КЗСА и ВЯАР (А). Гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормализованных сигналов флуоресценции ячеек (справа), полученные при анализе образца, не содержащего исследуемых мутаций (Б) и образца, несущего мутации Е542К в гене Р1КЗСА и У600Е в гене ВЯАР (В).

Биочип для анализа мутаций в генах Р1КЗСА и ВК-11. Выше были

представлены три различных схемы нанесения олигонуклеотидных зондов для анализа соматических мутаций в генах ЕСРЯ, КЯАЭ, Р1КЗСА и ВЯАР.

В ряде случаев возникает необходимость одновременного анализа всех четырех генов,

например, при молекулярно-генетическом анализе пациентов с НМРЛ. Для решения этой задачи наборы олигонуклеотидов, описанные ранее, могут быть объединены на единой подложке (рис. 6).

SO0.2' л

1 1

1

1Г-Ч1—I 1—1

□MUT

10 11 12 13 14 .15 16 17 18

19 экэон EGFR_

кодон 719 EGFR

кодон 790 кодой 858 EGFR EGFR

5 SO.'

sites n

■ 1 1

щ 1

1 1

1 ■ 1

и гпгпгтгпгтгпИгпгпгтпг! 1 II1 1 пп

,23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35, 36 37 38, 39 40, 41 42 43 44, 45 46 47, 48 49

кодоны 12, 13 KRAS

кодон 61 кодон 542 кодоны 545, 546 кодон 1047 кодон 600 KRAS PIK3CA PIK3CA PIK3CA ^---

Рисунок 6. Схема иммобилизации олигонуклеотидных зондов для одновременного анализа мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF(А). Расшифровка условных обозначений: EGFR (1 - экзон 19 WT, 2 -E746-A750del [вариант1], 3 - E746-A750del [вариаит2], 4 - E746-T751del insA, 5 - E746-T751del insV, 6 -E746-S752del insV, 7 - L747-A750del insP, 8 - L747-T751del insP, 9 - L747-T751 del, 10 - L747-P753del insS, 11 - E746-S752del insV, 12 - E746-A750del insQP, 13 - E746-T751del insVA, 14 - E746-P753del insVS, 15 -кодон 719 WT, 16 - G719A, 17 - G719C, 18-G719S, 19-кодон 790 WT, 20 - T790M, 21 - кодон 858 WT, 22 - L858R), KRAS (23 - 12 кодон WT, 24 -G12S, 25 -G12R, 26 -G12C, 27 - G12D, 28 - G12A, 29 - G12V, 30 -кодон 13 WT, 31 - G13D, 32 - G13V, 33 - G13A, 34 - G13C, 35 - G13R, 36 - кодон 61 WT, 37 - Q61L, 38 -Q6IH), P1K3CA (39 - кодон 542 WT, 40 - E542K, 41 - кодон 545 WT, 42 - E545K, 43 - кодон 546 WT, 44 -Q546K, 45 - кодон 1047 WT, 46 - H1047L, 47 - H1047R), В RAF (48 - кодон 600 WT, 49 - V600E). Картина гибридизации (Б) и гистограмма нормированных сигналов флуоресценции (В), полученные при анализе клинического образца, содержащего E746-A750del в 19 экзоне гена EGFR. Номер столбца на гистограмме соответствует номеру олигонуклеотида на схеме иммобилизации.

Определение аналитической чувствительности метода. Было определено минимальное процентное содержание мутантной ДНК в образце на фоне ДНК дикого типа, которое может быть выявлено с помощью разработанной методики. Для этого ДНК, содержащая различные мутации (EGFR E746-A750del, G719S, Т790М, L858R; KRAS G12V, Q61H; PIK3CA Е542К, Е545К, H1047R; В RAF V600E), была смешана с ДНК дикого типа в различных пропорциях (10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% и 0,2% Mut ДНК на фоне WT ДНК) и проанализирована с использованием биочипов.

Было установлено, что минимально достоверно определяемое процентное содержание мутантной ДНК для анализа с помощью разработанной методики составляет 0,5-1 % (рис. 7).

WT-I

I

1

i ■

à о 1 '||0 8 X ^ Й06

8 §0.4 ||0.2

X WT S R С D А V

WT-I

S-I

S Eoi

5° 1 ¡¡о, gëo.6

18" §5,0.2

¥ " WT S R С D A V

90% WT: 10% G12V

95% WT : 5% G12V

go

—

X WT S R С D A V

Еш

5°

Ц

WT S R С D

98% WT : 2% G12V

1 WT : 1% G12V

1

5°- в-

11" и—

¡ri—

tfcfc g WT s

D

WT-I

IS-

II0'6

g|0 4

¡fa

I

WT S

D

99.5% WT : 0.5% G12V

99.f

. WT:0.2%G12V

Рисунок 7. Определение порогового содержания 012У КЯА8 мутации на фоне ДНК дикого типа в серии разведений: 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% и 0,2%. Фрагмент биочипа (слева) и нормализованные сигналы флуоресценции (справа) только для 12 кодона КЯА8 представлены для каждого разведения.

Следующим шагом было определение минимального количества ДНК, необходимого для анализа. Для этого образец ДНК, содержащий минимально определяемую долю мутантной ДНК, был разведен и проанализирован, как описано выше. Для достоверного определения мутаций с заданной аналитической чувствительностью ПЦР-смесь первого этапа ПЦР должна содержать не менее 10 нг ДНК.

Генотипипование клинических образиов. Анализ соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, Р1КЗСА и BRAF с использованием биочипов проведен в выборках образцов опухолей

поджелудочной железы, КРР, меланомы и НМРЛ.

Поскольку для каждого заболевания характерны мутации в определенных генах, анализ клинических образцов проводили только на наличие этих специфичных для конкретного типа опухоли мутаций в соответствующих генах. Так, образцы опухолей поджелудочной железы тестировали на наличие мутаций в гене КЯА8, образцы КРР анализировали на наличие мутаций в генах КЯА8, Р1КЗСА и ВЯАР, образцы меланомы анализировали на наличие мутаций в генах Р1КЗСА и ВИАИ, а образцы НМРЛ тестировали на наличие мутаций во всех четырех генах.

Генотипироеание образцов опухолей поджелудочной железы

Разработанный протокол генотипирования использовали для анализа мутаций в гене КЯА5 в 39 клинических образцах. Всего мутации обнаружены у 32 (82,1%) больных. В образцах аденокарцином ПЖ мутации были обнаружены в 31 из 34 (88,6%) случаев, а в аденокарциномах фатерова соска в 1 из 2 случаев. При доброкачественных изменениях ПЖ мутации не обнаружены.

Наиболее частыми были мутации 0120 (46,9% от общего числа мутаций) и С12У (37,5%), которые были выявлены в 15 и 12 случаях, соответственно. В трех образцах была обнаружена мутация 01211 (9,4%), в одном - 012А (3,1%) и еще в одном - 061Н (3,1%).

В качестве референс-метода использовали ПЦР-ПДРФ. Анализ был выполнен в ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН. Мутации в гене КЯА5 обнаружены в 25 из 39 (64,1%) образцов, при этом тип мутации данным методом не определялся.

Данные генотипирования, полученные с помощью биочипа и ПЦР-ПДРФ, совпали в 80% случаев. В одном образце мы не обнаружили мутацию в гене КЯАЗ, в то время как метод ПЦР-ПДРФ выявил ее на границе чувствительности метода. В остальных случаях расхождение результатов, полученных двумя методами, заключалось в том, что мутации обнаруживали с помощью гибридизации на биологическом микрочипе и не обнаруживали методом ПЦР-ПДРФ. Во всех случаях несовпадения результатов мы провели ПЦР в присутствии Ь]ЧА-олигонуклеотидов с последующим секвенированием и подтвердили присутствие мутаций, определенных ранее с помощью биочипа. Таким образом, показано, что разработанный метод обладает большей аналитической чувствительностью по сравнению с методом ПЦР-ПДРФ.

Ассоциаций между наличием в опухоли КЯАБ мутаций с полом и возрастом пациентов в нашем исследовании выявлено не было, что согласуется с литературными данными.

Генотипироеание образцов колоректального рака

Образцы колоректального рака (п=66) были протестированы на наличие соматических мутаций в генах КЯА8, Р1КЗСА и В КАР.

Соматические мутации в гене КЯАБ обнаружены в 37 (56,1%) случаях, в гене Р1КЗСА - в 13 (19,7%), а в гене ВЯАР в 5 (7,6%) случаях. В 23 (34,8%) образцах не было обнаружено ни одной мутации в исследуемых генах.

В гене KRAS наиболее частой была мутация G12D, которая была выявлена в 14 случаях (36,8% от общего числа мутаций). Часто встречалась мутация G13D (23,7%), обнаруженная в 9 образцах. В пяти случаях была обнаружена мутация G12V (13,2%), в четырех - G12C (10,5%), в двух - G12A (5,3%), в двух - G12S (5,3%) и еще в двух - G13R (5,3%). В одном образце были обнаружены сразу две мутации: G12V и G13D. Мутации в кодоне 61 обнаружены не были.

Для 61 из 66 образцов результаты анализа мутаций в гене KRAS, полученные с помощью биочипов, сравнили с результатами определения мутаций методом АС-РВ-ПЦР и методом ПЦР-ПДРФ. Анализ методом АС-РВ-ПЦР выполнен Лабораторией генодиагностики «Биолинк» (Новосибирск) а анализ методом ПЦР-ПДРФ с последующим секвенированием выполнен ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН (Москва). Методом аллель-специфичной гибридизации на биочипах мутации были обнаружены в 36 случаях, с помощью АС-РВ-ПЦР - в 26 случаях, а с помощью ПЦР-ПДРФ с последующим секвенированием - в 28 случаях. Совпадение результатов анализа с помощью биочипов с результатами, полученными методом ПЦР-ПДРФ, наблюдалось чаще (87,1%), чем с методом АС-РВ-ПЦР (83,9%). Стоит отметить, что разработанная «Биолинк» методика не предусматривает выявление мутации G13R. В случае если нами мутация была обнаружена, а другими методами - нет, результаты были подтверждены LNA-блокирующей ПЦР с последующим секвенированием.

Установлено, что в гене Р1КЗСА преобладала мутация Е545К, которая была обнаружена в 8 образцах (57,1% от общего количества мутаций в этом гене). В трех образцах выявлена мутация Е542К (21,4%). Мутации Q546K, H1047L, H1047R были найдены в одном случае каждая (7,1%). В одном образце обнаружено одновременно две мутации в гене PIK3CA-. Е542К и Е545К.

На рисунке 8 представлена диаграмма, отражающая распределение мутаций в выборке образцов КРР. В 8 (12,1%) образцах присутствовали одновременно мутации в генах PIK3CA и KRAS, а в 2 (3,0%) - PIK3CA и BRAF. Мутации в генах KRAS и BRAF по литературным данным считаются взаимоисключающими, но в нашем исследовании одновременно были обнаружены в одном образце (1,5%), который также имел мутацию и в гене PIK3CA. Мутации в гене PIK3CA достоверно чаще встречались у пациентов, имеющих мутации в гене BRAF (Р= 0,05).

a KRAS Mut (42.4%) и BRAF Mut (3.0%)

□ BRAF Mut+PIK3CA Mut (3.0%) H PIK3CA Mut (3.0%) H PIK3CA Mut+KRAS Mut (12.1%) П KRAS Mut+BRAF Mut +PIK3CA Mut (1.5%)

□ Wt (34.8%)

Рисунок 8. Распределение мутаций в генах KRAS, PIK3CA и BRAF в выборке образцов КРР.

Был проведен статистический анализ для выявления ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками пациентов (пол, возраст, локализация опухоли, стадия заболевания, ТЫМ). Установлено, что в группе больных КРР мутации в гене КИАБ достоверно чаще встречались у женщин {Р=0,02) и у пациентов, имеющих отдаленные метастазы (Р=0,04). Ассоциаций между наличием мутаций в генах Р1КЗСА и ВЯАР и клинико-анамнестическими характеристиками пациентов выявлено не было.

Генотипирование образцов меланомы

Было протестировано 93 образца меланомы на наличие мутаций Е545К, 0546К, Н1047Ь и Н104711 в гене Р1КЗСА и У600Е ВНАР. Мутации в гене Р1КЗСА обнаружены в 12 (12,9%) образцах, причем в одном случае одновременно присутствовали две различные мутации в этом гене: Е545К и Н104711. Самой распространенной была мутация Е545К, которая была выявлена в 8 случаях (61,5% от общего числа мутаций в этом гене). Мутация Н1047Я была обнаружена в 5 (38,5%) образцах.

Мутация У600Е в гене ВЯАР обнаружена в 44 (47,3%) случаях. В 8 (8,6%) образцах одновременно присутствовали мутации в обоих генах (рис. 9). В 45 (48,4%) образцах мутаций в ДНК не обнаружено. Мутации в генах Р1КЗСА и ВЯАР внутри выборки распределены независимо друг от друга (Р= 0,22).

Был проведен статистический анализ для выявления ассоциаций между наличием мутаций и клинико-анамнестическими характеристиками пациентов (пол, возраст, гистологический тип, стадия, ТЫМ). Средний возраст в группе пациентов с мутацией ВЯАГ У600Е был достоверно ниже, чем в группе с \УТ ВЯАР (50,2±14,1 уй 59,1±13,5 года, Р<0,01). В группе пациентов с мутациями гена Р1КЗСА средний возраст был несколько ниже, чем в группе с ХУТ Р1КЗСА (47,1±15,4 ув 56,1±14,0 года, Р=0,06), однако, разница не достигла статистически значимого уровня. Других статистически значимых ассоциаций выявлено не было.

Образцы меланомы (п=44) были также проанализированы методом АС-РВ-ПЦР Лабораторией генодиагностики «Биолинк» (Новосибирск) с помощью разработанной ими тест-системы для выявления мутаций в 600 кодоне гена ВДЛ/7. Данная тест-система позволяет выявлять мутации

V600E, V600K, но не позволяет различать их. Данные генотипирования, полученные с использованием биочипов и методом АС-РВ-ПЦР, совпали в 92,9% случаев. Для двух образцов методом АС-РВ-ПЦР не удалось провести анализ из-за низкого качества клинического материала. В трех образцах наблюдалось расхождение результатов: в одном образце мутация V600E была обнаружена с помощью биочипов, а в двух случаях, наоборот, мутации были найдены только с помощью АС-РВ-ПЦР. В случае расхождения результатов проводился анализ с LNA-блокирующей ПЦР с последующим секвенированием: в двух случаях, когда мутации были обнаружены только методом АС-РВ-ПЦР, образцы содержали V600K, поэтому они не были выявлены с помощью биочипов.

Генотипирование образцов НМРЛ

При анализе соматических мутаций были исследованы образцы ДНК, выделенные из свежезамороженного биопсийного материала НМРЛ (п=112), и образцы ДНК, полученные из опухолевого материала, фиксированного в парафиновых блоках (п=46). Для восьми случаев НМРЛ получены образцы ДНК двух типов.

ДНК из свежезамороженных образцов НМРЛ была проанализирована на наличие соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF, а ДНК, полученная из опухолевой ткани, фиксированной в парафиновых блоках - только на наличие мутаций в генах EGFR и KRAS из-за ограниченного количества опухолевого материала.

В результате генотипирования образцов ДНК, выделенных из свежезамороженных опухолевых биопсий, мутации в гене EGFR обнаружены у 14 (12,5%) из 112 пациентов. Мутации в 19 экзоне выявлены в семи (50,0%) случаях: в шести случаях зафиксирована делеция E746-A750del (5/6 -c.2235-2249del и 1 /6 - c.2236-2250del) и в одном - L747-T751 del. В семи (50,0%) случаях выявлена мутация L858R в 21 экзоне.

Мутации в гене KRAS обнаружены у 21 из 112 (18,8%) больных НМРЛ. У 19 из 21 пациента они приходятся на 12 кодон: в семи (33,3%) случаях выявлена мутация G12C, в пяти (23,8%) -G12D, в четырех (19%) - G12A и в трех (14,3%) - G12V. Мутации G13C и Q61H были обнаружены у одного пациента, каждая (4,8%).

Мутации в гене PIK3CA выявлены у 12 (10,7%) пациентов. В двух случаях пациенты одновременно несли по две мутации в данном гене (Е542К и Е545К; Е545К и H1047R). Всего было обнаружено 14 мутаций в гене PIK3CA-. Е542К в двух (14,3%) случаях, Е545К в шести (42,9%) случаях и H1047R в шести (42,9%) случаях.

Мутация V600E в гене BRAF была обнаружена только у 1 из 112 (0,9%) пациентов.

На рисунке 10 представлено распределение мутаций в выборке свежезамороженных образцов биопсийных препаратов НМРЛ. Присутствие мутаций в генах EGFR, KRAS и BRAF было взаимоисключающим, в то время как мутации в гене PIK3CA часто обнаруживались в опухоли вместе с мутациями в других генах, однако статистически значимых ассоциаций не выявлено.

НМРЛ.

Результаты генотипирования образцов свежезамороженного биопсийного материала, полученные на биочипах, были валидированы секвенированием по Сенгеру. Всего с помощью биочипов мы обнаружили 50 мутаций в генах ЯСУ-7?, КРАБ, Р1КЗСА и ВЯАР, и только 33 из них были выявлены секвенированием без предварительного обогащения мутантными последовательностями. В гене ЕСРЯ мутации были обнаружены в 11 (9,8%) случаях, в КЯА8 - в 17 (15,2%), в Р1КЗСА - в 4 (3,6%), в ВЯАР- 1 (0,9%). В случае расхождения результатов данные, полученные с помощью биочипов, были подтверждены ЬКА-блокирующей ПЦР с последующим секвенированием.

В результате анализа образцов ДНК, выделенных из парафиновых срезов, мутации в гене обнаружены в 13 из 46 (28,3%) случаев. В 7 (50,0% от общего количества мутаций) образцах выявлена мутация Ь858Я. В 6 случаях обнаружены делеции в 19 экзоне: в 5 случаях -Е746-А750с1е1, в одном - Ь747-Р753с1е1 тэБ. В одном (7,1%) образце выявлена редкая мутация 0719А.

Мутации в гене КЯА8 обнаружены в 6 из 46 образцов (13,0%) НМРЛ. В двух случаях выявлена мутация 012У. Мутации 0120, 012С, 012А, 0130 выявлены в одном случае (каждая). В группе образцов ДНК, выделенных из фиксированных в парафине тканей НМРЛ, присутствие мутаций в генах ЕСТлй и КЯАЗ также было взаимоисключающим.

Очевидно, что различия в частоте мутаций в гене а образцах ДНК, выделенных из

свежезамороженной ткани (12,5%) и образцах, выделенных из парафиновых срезов (28,3%) обусловлены разницей в составе анализируемых когорт пациентов: первая группа представляла собой рандомизированную выборку больных, прооперированных в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в 2007-2010 гг., тогда как во вторую группу вошли пациенты, которые уже были предварительно отобраны как кандидаты на проведение таргетной терапии.

Был проведен статистический анализ для выявления ассоциаций между генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками пациентов (пол, возраст, гистологический тип опухоли, стадия, TNM, статус курения). Анализ ассоциаций между наличием мутаций в генах EGFR и KRAS и клинико-анамнестическими характеристиками пациентов был проведен на объединенной выборке больных.

В группе больных HMPJI мутации в гене EGFR чаще встречались у женщин, чем у мужчин (Р«0,01), преимущественно в аденокарциномах (/>=0,01). Генетические повреждения гена EGFR значительно чаще были выявлены у никогда не куривших пациентов (Р«0,01). Мутации в гене KRAS с большей вероятностью выявлялись в аденокарциномах (Р=0,05) и у курящих/ранее куривших пациентов (Р«0,01).

На наличие мутаций в генах PIK3CA и BRAF анализировали только свежезамороженные образцы опухолевых тканей от 112 больных НМРЛ. В противоположность EGFR и KRAS мутациям, мутации в гене Р1КЗСА несколько чаще встречались у пациентов с плоскоклеточным раком, по сравнению с другими гистологическими типами (/>=0,07), однако разница не была статистически значимой. Других ассоциаций между генетическим статусом опухолей НМРЛ и клинико-анамнестическими характеристиками пациентов выявлено не было.

Результаты генотипирования образцов ДНК, выделенных из парафиновых блоков, на наличие мутации в гене EGFR, были проверены секвенированием. Подготовка материала для выделения ДНК включала его обогащение опухолевыми клетками. Секвенирование было выполнено лабораторией онкогеномики НИИ Канцерогенеза, ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина" РАМН. Мутации были обнаружены в 16 из 46 (34,8%) образцов. Таким образом, результаты генотипирования двумя различными методами совпали в 43 из 46 (93,5%) случаев. В трех образцах мутации в гене EGFR были выявлены секвенированием, но не обнаружены с помощью биочипов. В двух случаях это были делеции в 19 экзоне (E746-T751del и E746-K754del), которые не могут быть выявлены с помощью гибридизации на биочипе, так как олигонуклеотиды, комплементарные им на биочипе отсутствуют. В одном образце только секвенированием была обнаружена замена L858R.

Для 23 пациентов, свежезамороженный биопсийный материал которых был проанализирован с использованием биочипов, был проведен параллельный анализ их опухолевого материала, фиксированного в парафиновых блоках, на наличие мутаций в гене EGFR с помощью секвенирования. Несмотря на то, что ДНК получали разными методами и из разных участков опухоли, результаты совпали в 95,6% случаев. Только в одном случае мутация L858R была обнаружена с помощью биочипа в препаратах ДНК из свежей ткани и парафинового среза, но не была выявлена при секвенировании ДНК из среза. Этот спорный случай был проверен с помощью ПЦР в реальном времени: мутация была выявлена во вновь выделенном препарате ДНК от этого пациента.

Для 11 пациентов с помощью биочипов было проанализировано по два препарата ДНК, выделенных из разных участков свежезамороженной опухоли. Результаты анализа образцов ДНК от одного больного совпали во всех случаях, кроме одного пациента, у которого мутацию Р1КЗСА Е545К обнаружили только в одном препарате из двух. Данное расхождение результатов может быть объяснено гетерогенностью опухоли.

Различие в спектре мутаций в гене КЯЛН в опухолях различной локализации При анализе результатов генотипирования опухолей поджелудочной железы, КРР и НМРЛ было замечено, что спектр КЯАЗ мутаций в каждой из выборок имеет некоторые различия (рис. 11). К сожалению, из-за малой численности анализируемых групп, статистический анализ для выявления ассоциаций между типом КЯА8 мутаций и локализацией опухоли был выполнен только для мутаций 012С, 0120 и 012У.

50 45 40

СО 35 § 30

25 20 т 15 10 5 О

Ф '

□ РПЖ О КРР И НМРЛ

1

? 7

:

-Щ- \

1 , П II П П

С12Б 312И С12С С12Р С12А С12У С13Р С!ЗУ ЭЧЗА С13С С13Р? ОбИ 061Н

Рисунок 11. Спектр мутаций в гене КИА8 в опухолях различной локализации.

В данном исследовании мутация 012С значительно чаще обнаруживалась при НМРЛ (/><0,01) по сравнению с раком поджелудочной железы и колоректальным раком, а мутация 012У чаще встречалась у пациентов с раком поджелудочной железы (Р=0,03).

Несмотря на невозможность проведения статистического анализа, стоит отметить, что мутация 0130 значительно чаще встречалась у пациентов с КРР. Мутация 012Я была обнаружена преимущественно у больных раком поджелудочной железы, а 012А - при НМРЛ. Возможно, при увеличении размеров анализируемых выборок, эти закономерности получили бы статистическое подтверждение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основываясь на полученных результатах, можно сделать вывод, что разработанный метод является надежным инструментом для идентификации соматических мутаций. Метод обладает высокой аналитической чувствительностью и отличается высокой достоверностью получаемых результатов, сравнимой, а в ряде случаев, превосходящей таковую для ПЦР-ПДРФ, АС-РВ-ПЦР и секвенированием предварительно обогащенных опухолевой ДНК препаратов.

Для анализа с помощью разработанного подхода с одинаковой эффективностью может быть использована как ДНК, выделенная из свежезамороженной ткани, так и ДНК, выделенная из ткани, фиксированной в парафиновых блоках.

Разработанный метод может быть использован не только в исследовательских целях, но и в диагностических лабораториях для скрининга пациентов с различного рода злокачественными новообразованиями с целью индивидуального подбора наиболее эффективной противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод одновременной идентификации 37-ми функционально значимых соматических мутаций в генах EGFR (18 вариантов), KRAS (13 вариантов), PIK3CA (5 вариантов), BRAF { \ вариант).

2. Определены частота и спектр мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF в опухолях различной локализации у онкологических больных. Выявлены различия в спектре мутаций в гене KRAS в зависимости от локализации опухоли. При КРР мутации в гене PIK3CA достоверно чаще встречались у пациентов, имеющих мутации в гене BRAF (Р—0,05), а при HMPJ1 присутствие мутаций в генах EGFR и KRAS было взаимоисключающим (Р=0,03).

3. Определены ассоциации между генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками онкологических больных. В выборке КРР (п=66) мутации в гене KRAS достоверно чаще встречались у женщин (/>=0,02) и у пациентов, имеющих отдаленные метастазы (Р=0,04). В группе больных меланомой пациенты с мутациями в гене BRAF были моложе, чем пациенты с диким типом гена BRAF (Р<0,01). В выборке больных HMPJI (п=150) мутации в гене EGFR чаще встречались у женщин (Р«0,01), у некурящих пациентов (Р«0,01) и у лиц с аденокарциномами (Р=0,01). Мутации в гене KRAS чаще обнаруживали в аденокарциномах (Р=0,05) и у курильщиков (Р«0,01).

4. Проведена оценка эффективности применения разработанного подхода по идентификации соматических мутаций в сравнении с другими методами и показано, что разработанная методика обладает высокой достоверностью получаемых результатов и может быть использована в клинической практике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1) Емельянова М.А., Амосенко Ф.А., Чудинов A.B., Суржиков С.А., Казубская Т.П., Любченко Л.Н., Наседкина Т.В. Определение мутаций в гене KRAS в опухолевых клетках с помощью биологических микрочипов // Молекулярная биология. - 2011. - Т. 45. - № 5. - С. 863870.

2) Емельянова М.А., Мазуренко H.H., Гагарин И.М., Цыганова И.В., Зборовская И.Б., Архипова К.А., Мочальникова В.В., Любченко Л.Н., Наседкина Т.В. Определение мутаций в гене EGFR при немелкоклеточном раке легкого с помощью биологических микрочипов // Вестник РОНЦ u.M. H.H. Блохина РАМН. - 2012. - Т. 23. - № 3. - С. 15-23.

3) Emelyanova M., Arkhipova К., Mazurenko N., Chudinov A., Demidova I., Zborovskaya I., Lyubchenko L., Zasedatelev A., Nasedkina T. Sensitive genotyping of somatic mutations in the EGFR, KRAS, PIK3CA, BRAF genes from NSCLC patients using hydrogel biochips // Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. - 2014. - doi: 10.1097/PAI.0000000000000084.

Тезисы конференций

1) Emelyanova M.A., Amossenko F.A., ChudinovA.V., NasedkinaT.V. The analysis of mutations in the EGFR and K-ras genes using LNA-clamp PCR and hybridization with biochips // European Human Genetics Conference. - Sweden, Gothenburg. - European Journal of Human Genetics. - 2010. -P. 173-174.

2) Наседкина T.B., Емельянова M.A., Яценко Ю.Е., Амосенко Ф.А., Любченко Л.Н. Анализ соматических мутаций при онкологических заболеваниях с использованием биочипов II XIV Российский Онкологический конгресс. - Россия, Москва. - Материалы конгресса. — 2010. - С. 120.

3) Емельянова М.А., Амосенко Ф.А., Любченко Л.Н., Наседкина Т.В. Анализ мутаций в гене KRAS с помощью гибридизации на биологическом микрочипе // Молекулярная диагностика. -Россия, Москва. - Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. — 2010. - Т. 4. - С. 58-59.

4) Emelyanova М.А., Lubchenco L.N., Amossenko F.A., Nasedkina T.V. The analysis of mutations in the EGFR, KRAS and BRAF genes using hybridization with hydrogel biochips // 36,h Febs Congress. - Italy, Torino. - The Febs Journal. - 2011. - P. 204.

5) Наседкина T.B., Емельянова M.A., Абрамов И.С., Цыганова И.В., Архипова К.А., Зборовская И.Б., Мазуренко Н.Н., Любченко Л.Н. Биологические микрочипы в лабораторной диагностике злокачественных новообразований // XVI Российский Онкологический конгресс. -Россия, Москва. - Материалы XVI российского онкологического конгресса. Злокачественные опухоли. - 2012. - Т. 2. - № 2. - С. 77-80.

6) Любченко Л.Н., Черненко П.А., Емельянова М.А., Хатырев С.А., Писарева Е.Е., Шаманин

B.А., Коваленко С.П., Наседкина Т.В. Клинико-генетическая гетерогенность меланомы кожи // XVI Российский Онкологический конгресс. - Россия, Москва - Материалы XVI российского онкологического конгресса. Злокачественные опухоли. - 2012. - Т. 2. - № 2. - С. 81-90.

7) Наседкина Т.В., Емельянова М.А., Абрамов И.С., Зборовская И.Б., Черненко П.А., Любченко Л.Н., Мазуренко Н.Н. Биочипы в клинической диагностике онкологических заболеваний // Аначитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины. - Россия, Москва. - Материалы XVIII всероссийской научно-практической конференции «Аначитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины». - 2013. - №1. - С. 50.

8) Emelyanova М.А., Abramov I.S. Arkhipova K.A., Zborovskaya I.B., Lyubchenko L.N., Mazurenko N.N., Nasedkina T.V. The analysis of genetic alterations in the NSCLC patients using hybridization with diagnostic biochips // European Human Genetics Conference. - France, Paris. -European Journal of Human Genetics. -2013. - Vol. 21. - Suppl. 2. - P. 305.

9) Емельянова M.A., Абрамов И.С., Архипова K.A., Мазуренко Н.Н., Демидова И.А., Зборовская И.Б., Любченко Л.Н., Наседкина Т.В. Диагностика соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA, BRAF и транслокаций EML4-ALK у больных НМРЛ с использованием гидрогелевых биочипов // Молекулярная диагностика. - Россия, Москва. - Сборник трудов VIII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - 2014. - Т. 2. -

C. 117.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЕОРЯ рецептор эпидермального фактора роста

КЛА8 малая сигнальная ГТФаза

ВЯАР серин/треонин протеинкиназа

Р1КЗСА р110а каталитическая субъединица I класса Р1 3-киназ

МЕК1/2 киназа митоген-активирующей протеин киназы

НМРЛ немелкоклеточный рак легких

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

[ЖА дезоксирибонуклеиновая кислота

LNA синтетический аналог РНК, имеющий дополнительную связь между 2-0 и 4-С

ПЖ поджелудочная железа

РПЖ рак поджелудочной железы

КРР колоректальный рак

ПЦР полимеразная цепная реакция

У интенсивность флуоресценции

яизвсо российское Общество онкологов-химиотерапевтов

А5С0 Американское общество клинической онкологии

ИОА Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США

АС-РВ-ПЦР аллель-специфичная ПЦР в реальном времени

ПЦР-ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

Заказ № 256-1/11/2014 Подписано в печать 21.10.2014 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ.'zak@cfr.ru