Роль Translocator protein (TSPO) в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток при BRAF-положительной меланоме кожи

Гырылова, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль Translocator protein (TSPO) в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток при BRAF-положительной меланоме кожи
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль Translocator protein (TSPO) в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток при BRAF-положительной меланоме кожи"

На правах рукописи

ГЫРЫЛОВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

РОЛЬ TRANSLOCATOR PROTEIN (TSPO) В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ BRAF-ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ МЕЛАНОМЕ КОЖИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 НОЯ 2012

Новосибирск —2012

005054755

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенсцкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Рукша Татьяна Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры физиологии, факультета естественных наук, ФГБОУ ВПО «Новосибирский

государственный университет» Обухова Лидия Александровна

доктор медицинских наук, профессор профессор кафедры патологической анатомии

ГБОУ ВПО «НГМУ» Минздрав России Агеева Татьяна Августовна

Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения РАМН, Томск

Защита состоится «27» ноября 2012г. в « > часов на заседании диссертационного совета Д.001.048.01 при ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН по адресу: ул. Тимакова. 2; г. Новосибирск, 630117; тел/факс 8(383)333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

Автореферат разослан <_> октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Злокачественные новообразования кожи, включая меланому кожи, в структуре всех злокачественных опухолей человека составляют более чем одну третью часть, что делает их одними из наиболее часто встречающихся типов злокачественных новообразований (Pollock P.M. et al., 2003). Меланома кожи, являющаяся одной из наиболее агрессивных опухолей, стремительный рост заболеваемости которым в последние десятилетия регистрируется во всем мире (Cormier J.N. et al., 2006), включая страны с исторически низким уровнем заболеваемости, в то время как заболеваемость другими видами рака, наоборот, снижается (Losina Е, et al. 2007). Это позволяет расценивать меланому кожи как важную медико-социальную проблему, которая наносит невосполнимый экономический ущерб обществу.

По современным данным меланома характеризуется изначально молекулярным и генетическим разнообразием, определяющим клинический полиморфизм, а также особенности течения заболевания.

Пролиферация меланоцитов и меланобластов, выживание, дифференцировка и миграция являются важнейшими элементами нормальной физиологии кожи. Как показывают последние исследования, одним из ключевых изменений, происходящих при развитии меланомы кожи, является мутагенная активация сигнального каскада митоген-активированных протеинкиназ (МАРК).

Хотя многочисленные исследования оценивали мутацию BRAF и сигнальный механизм МАРК как перспективную мишень для терапии меланомы кожи, начальные клинические исследования не показали эффективность лечения меланомы с использованием ингибиторов BRAF или МАРК-сигналрегулирующей киназы (МЕК). Это связано с тем, что высокая пластичность клеток меланомы кожи позволяет ей оставаться одной из наиболее резистентных опухолей к химиотерапии.

Для преодоления механизмов резистентности и повышения эффективности терапии меланомы кожи может являться потенциальной мишенью митохондриальный белок-переносчик Translocator Protein, TSPO. Показано, что TSPO, как один из компонентов митохондриальных пор, может модулировать их функционирование путем увеличения продолжительности открытия, что ведет к снижению мембранного потенциала (Decaudin D. et al., 2002). TSPO является внутриклеточным белком с преимущественной митохондриальной и ядерной локализацией. Показано участие TSPO в регуляции пролиферации клеток, дифференцировки, апоптоза и ионного транспорта. Повышенные уровни TSPO обнаружены при различных типах злокачественных новообразований, в частности, при раке молочной железы, толстого кишечника, плоскоклеточном раке ротовой полости (Batarseh A. et al., 2010). Роль в канцерогенезе данного белка является изученной недостаточно, но предполагается, что он может потенцировать усиление клеточной пролиферации посредством участия в транспорте холестерина через биологические мембраны, что является необходимым для обеспечения пластических и энергетических затрат опухолевых клеток, характеризующихся высоким пролиферативным потенциалом. Помимо этого, выявлено, что лиганды TSPO при ряде злокачественных новообразований изменяют выраженность апоптоза,

клеточной пролиферации.

Цель работы

Оценить возможность модуляции клеточной пролиферации и апопт лигандами белка-переносчика (Translocator protein, TSPO) в BRAF-позитиви меланомах кожи.

Задачи исследования

1. Выявить особенности экспрессии TSPO в нейтрофилах периферической кр< больных меланомой кожи;

2. Определить уровень TSPO+ клеток и особенности экспрессии мРНК TSP( клетках BRAF-позитивной меланомы кожи после инкубации с лигандом TS PKI 1195 в концентрациях 10 nmol/L, 100 nmol/L, lO^mol/L.

3. Определить уровень TSPO+ клеток и особенности экспрессии мРНК TSP( клетках BRAF-позитивной меланомы кожи после инкубации с Ml ингибитором U0126 в концентрациях 10 цшо1/Ь, 50 цто1/Ь, а также i сочетанной инкубации с U0126 и PKI 1195;

4. Установить характер влияния лиганда TSPO, в том числе при сочетанг применении с МЕК-ингибитором U0126 на выраженность апоптоза пролиферации опухолевых клеток BRAF-позитивной меланомы кожи;

5. С помощью молекулярно-генетического анализа выявить часп встречаемости BRAF-позитивных меланом кожи, а также клини гистологических вариантов меланомы кожи в Красноярском крае.

Научная новизна

В представленной работе впервые получены данные о характере экспресс TSPO в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи, в том числе после воздейст) лигандом TSPO и МАРК-ингибитором U0126.

Впервые оценены изменения уровня пролиферации и апоптотической гибел клетках BRAF-позитивной меланомы кожи при модуляции уровня TSPO; показ; преимущество комбинированного применения модуляторов TSPO и MAI ингибиторов для индукции апоптоза в клетках меланомы. Впервые установж регулирующее действие сигнального пути МАРК на уровень экспрессии TSPO клетках меланомы кожи.

Впервые исследованы пациенты с меланомой кожи на предмет нали1 мутации гена BRAF в Красноярском крае, а также выявлены клини гистологические особенности меланомы кожи в зависимости от BRAF-статуса.

Научно-практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные указывают на возможно использования TSPO в качестве патогенетической мишени для модуляции ypoi пролиферации и апоптоза клеток меланомы.

Показано, что BRAF-позитивные меланомы кожи в высокой стеш присутствуют в популяции больных меланомой кожи, что также подчеркив необходимость дальнейших разработок, поиска молекулярных мишеней для тераг данного молекулярного-генетического варианта опухоли.

Выполненная работа поддержана грантом Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности (2010 г.).

Положения, выносимые на защиту

1. У больных меланомой кожи по сравнению со здоровыми лицами, изменена функциональная активность нейтрофилов, о чем свидетельствует снижение экспрессии TSPO в нейтрофилах периферической крови

2. Лиганд PKI 1195, специфически связываясь с TSPO, способен повышать его экспрессию в клетках меланомы кожи в наномолярных концентрациях, изменение экспрессии данного митохондриального белка происходит однонаправлено с уровнем апоптоза; ингибитор МАРК U0126 повышает уровень экспрессии мРНК TSPO в клетках меланомы кожи SK MELI, что доказывает его способность оказывать регулирующий эффект на TSPO;

3. Лиганд TSPO РКП 195 и ингибитор МАРК U0126 в эксперименте способен изменять выраженность апоптоза и уровень пролиферации в клетках меланомы кожи SK MELI, характеризующихся положительным BRAF-статусом. При комбинированном использовании лиганда TSPO РК11195 и МАРК-ингибитора U0126 достигается более выраженный активирующий эффект в отношении уровня апоптоза клеток меланомы кожи.

Внедрение результатов исследования

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику лаборатории биохимии опухолей ФГБУ НИИ Онкологии СО РАМН с 11 января 2012г. Также результаты внедрены в учебный процесс кафедры нормальной анатомии и гистологии человека ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет Минздрава» со 10 сентября 2012 г., в календарно-тематический план практических занятий по теме: «Цитология. Жизненный цикл клетки».

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на заседании кафедры патологической физиологии имени проф. В.В. Иванова Красноярского государственного медицинского университета имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, на IV и V региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009, 2011 гг.), 18-ом и 20-ом Конгрессе Европейской Академии Дерматологии и Венерологии (Берлин, 2009г., Лиссабон, 2011 г.), 6-ом Весеннем Симпозиуме Европейской Академии Дерматологии и Венерологии (Верона, 2012г.), в рамках Летней школы для дерматовенерологов «Research and Imaging Techniques» (Вена, 2010 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе в 4 журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования статей, содержащих результаты диссертационных исследований. Получен патент Российской Федерации на изобретение №2455993 «Способ индукции апоптотической гибели

клеток меланомы кожи», заявка № 2011127875, приоритет изобретения 6 ик 2011г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 107 страниц текста, состоит из введения, четы[ глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 рисунков, 6 табл] Библиографический список содержит 161 источник, из которых 8 отечественны; 157 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Гисто-морфологические особенности меланомы анализировались г проведении ретроспективного анализа 350 историй болезней пациент находившихся на стационарном лечении в КГУЗ «Красноярский краеЕ онкологический диспансер» с 2003 по 2007 гг. с диагнозом злокачествен! меланома кожи (рубрика С43) в соответствии с МКБ-10. Из которых 238 чело! были женщины, 112 - мужчины. Средний возраст больных составил 56 j [доверительный интервал 95% (ДИ 95%), 46,25-68]. Средний возраст мужч составлял 55 [ДИ 95%, 44-65] лет, женщин 58 [ДИ 95%, 48-69] лет. Из : пациентов 255 человек были с впервые установленным диагнозом (72,5 %). Среди возраст первичных больных был 55 [ДИ 95%, 45-65]. Оценивались поло-возрастн показатели, клинико-морфологические данные пациентов.

При анализе стадирования меланомы по классификации Американскс Объединенного Комитета по Раку (AJCC) выявлено, что из 255 пациентов с вперв установленным диагнозом у 54 (21%) меланома кожи определялась на III-стадиях, то есть у этой группы больных имелась метастазирующая опухоль.

Среди морфологических разновидностей наиболее часто встречал; поверхностно распространяющаяся меланома (57%), а также узловая фор пигментной меланомы (28%). Классификация меланомы кожи на различи субтипы основывается на анатомических и эпидемиологических особенностях, чт дальнейшем находит отражение в различиях в прогрессировании опухоли и, i следствие, в различном прогнозе заболевания. Молекулярно-генетичеа исследования выявили различия между меланомами разных субтипов, объяснякш разницу в эволюции данного новообразования (Curtin J.A. et al., 2005, Poetsch M al., 2003).

69% пациентов с поверхностно распространяющейся формой мелано составили женщины, и 31% мужчины. При узловой меланоме распределение полу также было сходным: 63% женщин и 37% мужчин. Хотя считается, что подт меланомы рассматривается как важный прогностический фактор, и узло) меланома признана более агрессивной формой опухоли, так как имеет 6oj выраженную вертикальную фазу роста и соответственно более высокий уров< инвазии, достоверных различий между пациентами с определяемыми метастазам] без метастазов при распределении клинико-морфологических типов мелано выявлено не было.

Толщина агрессивного компонента рассматривается как одна из иаибо. важных переменных для определения прогноза. В проанализированных исторр болезней верификация уровня инвазии при гистологическом исследован

проводилась по Кларку. Согласно этой классификации не первом уровне инвазии меланомные клетки заполняют весь верхний слой кожи, эпидермис, по-другому melanoma in situ. При втором уровне инвазии идет распространение клеток во второй слой кожи, дерму, на третьем-четвертом уровне происходит заполнение клеток меланомы на всю толщу дермы, при этом находятся в пределах этого слоя. При пятом уровне инвазии распространение опухоли происходит за пределы дермы, в подкожножировую клетчатку.

У большей части пациентов (119 человек, 46,9%) меланома определялась на III уровне инвазии, когда клетки меланомы заполняют весь сосочковый слой дермы, но не проникают в сетчатый слой. При этом у мужчин и женщин различий выявлено не было в распределении пациентов в зависимости от уровня инвазии, почти в половине случаев вне зависимости от пола доминировал III уровень: 43 и 48,5% соответственно. Кроме того, обращает на себя внимание достаточно высокий процент пациентов с неустановленным уровнем инвазии - 7,1%, при этом в группе мужчин и женщин доля таких пациентов равна.

Морфологические, молекулярно-генетические, культуральные исследования проводились на кафедре патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова ГОУ ВПО «Красноярский государственные медицинский университет», в лаборатории фотобиологии Учреждения Российской академии наук «Институт биофизики СО РАН».

Человеческая культура клеток меланомы кожи SK-MEL-1 (American Туре Cells Collection) была любезно предоставлена Московским НИИ Медицинской Экологии. Данная культура меланомы кожи имеет мутацию BRAF V600E, что было подтверждено результатами определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ анализ). Клетки выращивались в среде RPMI 1640 с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина при 37 °С в СО2 инкубаторе (5% СО2). Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2-4*106 кл/мл за 24 часа до начала эксперимента.

Далее клетки инкубировались с модуляторами МАРК и TSPO. Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2-4*106 кл/мл на следующий день к суспензии клеток добавлялся TSPO лиганд РКП 195 (Sigma) в концентрации 10 pmol/L, 100 nmol/L и 10 nmol/L. В другой группе к суспензии клеток добавлялся блокатор МАРК - U0126 (Sigma) в концентрации 10 и 50 цто1/Ь. В третьей серии экспериментов проводилось инкубирование клеток меланомы одновременно блокатором МАРК U0126 и лигандом РКП 195 в концентрациях 10 (imol/L и 100 nmol/L соответственно.

В контрольной группе клетки оставались без лечения. Через 72 часа осуществлялось центрифугирование клеток в течение 10 минут со скоростью 1,5 тыс./об., клеточный осадок промывался в холодном фосфатно-солевом буфере. Далее проводились морфологические исследования.

Иммуноцитохимическое исследование проводилось с культурой клеток SK-MEL1. Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2-4*106 кл/мл за 24 часа до экспериментов. После проведения экспериментального лечения клетки промывались, переносились на стекла и высушивались в парах 10% формалина для

фиксации в течение 30 минут. После этого проводилось окрашивание соглаа стандартным методикам с моноклональными антителами к TSPO (Trevige разведение 1:400). Также проводилось окрашивание с моноклональньи антителами к PCNA (Proliferating cell nucleus antigen, ядерный антиген клеточн! пролиферации, Novocastra, разведение 1:200), маркером клеточной пролифераци Для визуализации использовалась система иммунопероксидазной детекции Read^ to-Use (NovoLink Polymer Detection System, Leica Microsystems, Newcastle, Unit Kingdom) и диаминобензидин в качестве хромогена. Подсчет положителы окрашенных клеток производился при увеличении х400 с помощью микроско Olympus ВХ-41. Определялся процент положительно окрашенных клеток на Г клеток.

Выраженность апоптоза оценивалась с помощью окраски акридиновь оранжевым/бромистым этидием (АО/ЕВ) (Gerbu Biothechnick GmbH, N Biomedicals Inc.) согласно Ribble D., 2005 (Ribble D. et al., 2005). Определял процент апоптотических клеток с ядром, окрашенным (полностью и. фрагментарно) в оранжевый цвет. Ядра живых клеток окрашивались в зеленый цв( Визуализация проводилась с помощью флюоресцентного микроскопа Primo Si (Carl Zeiss Microimaging GmbH), подсчитывалось число апоптотических клеток 100 визуализируемых клеток.

Для определения полиморфизма гена BRAF V600E в качестве материа использовались гистологические срезы меланомы кожи, которые были получены 47 пациентов с меланомой кожи, после хирургического иссечения опухоли Красноярском краевом онкологическом диспансере им. А.И. Крыжановского. Пос иссечения опухоль была подвергнута стандартной методике фиксации д получения гистологических срезов. Выделение ДНК проводилось гистологических срезов согласно стандартной методике с использован» комплекта реагентов ДНК-сорб В (AmpliSens, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзор Выделенные образцы ДНК хранились при -20°С.

Для выявления мутации использовался метод определения полиморфиз: длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ анализ, RFLP-restriction fragment lenj polymorphism) описанный Nagasaka Т. et al. [Nagasaka Т. et al., 2004]. Праймеры N F, Wt-R и Mt-R (ООО «Сибэнзим», Новосибирск) были созданы для представлен сайта рестрикции Btsl (BioLabs, New England) в диком аллеле для анализа 6 кодона гена BRAF. Амплификация проводилась на амплификаторе BIS Тептюсус в объеме 25 мкл, содержащем ПЦР буфер, 1.5 ммоль/л MgC12 (ФГУН ЦНШ Ростпотребнадзора), 0.2 мкмоль\л каждого праймера Mt-F и Wt-R, 0.1ммоль/л dNT (5х dNTPs mix, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0.625 единиц TaqF полимера (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора) и 50 нг выделенной ДНК. Условия ПЦР бы следующими: 95° С - 11 мин, и 30 циклов: 95° С - 30 сек., 58° С - ЗОсек., 72° С -сек.; и 5 мин при 72° С.

Полученные ампликоны переосаждались по стандартной методике, подвергались рестрикции с помощью рестриктазы Btsl при температуре 55е С течение 6 часов. Для определения массы полученных продуктов рестрикц осуществляли электрофоретическое разделение в 12%-ом полиакриламидном ге (камера для электрофореза Helicon) при следующих параметрах: сила тока - 50 м

напряжение - 400 В, мощность - 15 Вт. После завершения электрофореза гель окрашивался бромистым этидием в течение 5 мин. Визуализация продуктов рестрикции осуществлялась с помощью прибора ChemiDoc (BioRad).

Далее проводился второй этап анализа со второй парой праймеров Mt-F и MtR, в тех же условиях. После амплификации продукты второго этапа ПЦР переосаждались и подвергались рестрикции в тех же условиях. В случае присутствия мутации гена BRAF в 600 кодоне ПЦР продукты массой 130 нуклеотидных пар (base pair, bp) разрезались на фрагменты массой 112 и 18 нуклеотидных пар, в случае отсутствия данной мутации продукты рестрикции были следующие: 78, 34 и 18 нуклеотидных пар.

Для определения уровня мРНК TSPO использовался метод ПЦР в реальном времени. Для этой цели из клеток меланомы после инкубации с РКП 195 и клеток контрольной группы производилось выделение РНК с помощью набора для выделения РНК «Рибо-золь-В» (AmpliSens) в соответствии с инструкцией производителя, после выделения РНК осуществлялась реакция обратной транскрипции с использованием комплекта реагентов «Реверта» (AmpliSens). Синтезированную в результате обратной транскрипции кДНК непосредственно использовали для постановки ПЦР в реальном времени, применяя специфичные праймеры к TSPO и ß-актину в качестве эндогенного контроля (TaqMan, Applied Biosystems). Амлификацию и детекцию осуществляли методом ПЦР в реальном времени на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Качественные результаты PT ПЦР были проанализированы по методу сравнения flCt, который определяет амплификационный цикл, во время которого флюоресценция образца стала достоверно выше базального сигнала. Мы выполняли соответствующую оценку TSPO сигналов путем нормализации TSPO сигналов к сигналам от ß-актина (Applied Biosystems). Программа термоциклирования при следующих условиях: 50°С — 2 мин, 95°С — 10 мин, 45 циклов: 95°С — 15 сек, 60°С — 1 мин.

Дизайн эксперимента представлен на рис. 1.

Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет программ Statistica 6.0. Применяли методы описательной статистики, результаты исследования проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса. В случае нормального распределения был использован t-критерий Стьюдента для независимых групп, в случаях, где распределение полученных статистических показателей отличалось от нормального, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи ¿/-критерии Манна-Уитни. Для количественных признаков общее межгрупповое различие оценивали при помощи критерия Крускала -Уоллиса. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. Статистическую обработку динамических рядов производили с помощью полинома второй степени.

Выборочные параметры, приводимые в таблицах имеют следующие обозначения: Me -медиана, р- достигнутый уровень значимости, п- объем анализируемой подгруппы. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

А.

_1_

_ПДРФ анализ, определение мутации BRAF V600E

В.

Рис. 1. Дизайн экспериментальной работы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначально была исследована экспрессия TSPO в клетках меланомы коя клеточной линии SK-MEL1 и в нейтрофилах пациентов с меланомой кожи, а таю проведен анализ изменения экспрессии TSPO в клетках меланомы после инкубащ клеток меланомы с его лигандом PKI 1195.

В клетках млекопитающих TSPO преимущественно локализуется митохондриях, и соответственно, участвует в регуляции фундаментальш процессов клетки. Однако, также было продемонстрировано, что TSF экспрессируется и в плазматической мембране эритроцитов, клеток, не имеющих i ядра, ни митохондрий (Olson J.M. et al., 1988). Кроме того, регистрирует экспрессия TSPO в плазматической мембране и цитоплазме нейтрофилс определяющаяся по результатам иммуноцитохимического исследования, ч приводит к стимуляции НАДФН-оксидазной активации этих клеток (Zavala F. et а 1991).

Определяли количество TSPO+ полиморфноядерных нейтрофилов периферической крови у пациентов с меланомой кожи. Для этого проводило иммуноцитохимическое окрашивание полиморфноядерных нейтрофилов (ПЖ выделенных из периферической крови здоровых лиц и больных меланомой кож

моноклональными антителами к ТБРО. Оценивалось число положительно окрашенных клеток. Локализация ТБРО в ПЯН преимущественно была ядерной и цитоплазматической. В нейтрофилах периферической крови здоровых лиц количество Т8РО окрашенных клеток составляло 98,25%. Определено достоверное снижение количества ТБРО+ ПЯН у больных меланомой кожи, по сравнению с показателями у здоровых лиц: 88% и 98,25% соответственно (р=0,016) (Рис. 2). Снижение количества ТБРО+ ПЯН у больных меланомой по сравнению с показателями здоровых лиц указывает на изменение функциональной активности нейтрофилов при меланоме кожи, а также дисрегуляцию экспрессии ТБРО при развитии меланомы кожи.

При иммуноцитохимическом исследовании клеток меланомы БК-МЕЫ с моноклональными антителами к ТБРО определялась преимущественно цитоплазматическая локализация белка. В клетках меланомы кожи контрольной группы количество Т8 ГЧ) клеток составляло 8 положительно окрашенных клеток на 100 клеток меланомы (Рис. 3).

Рис. 2. Рис. 3.

Рис. 2. TSPO полиморфноядерные нейтрофилы в периферической крови пациента с меланомой кожи: TSPO клетки окрашены иммунопероксидазным методом. Ув. х400.

Рис. 3. TSPO+ клетки меланомы кожи SK-MELl:TSPO+ клетки окрашены иммунопероксидазным методом. Ув. х400.

Как известно, TSPO локализуется на наружной митохондриальной мембране, однако, также была отмечена и перинуклеарная экспрессия в клетках рака молочной железы [Pretner Е. et al., 2006]. По результатам иммуноцитохимического исследования в культуре клеток меланомы кожи TSPO определялся преимущественно в цитоплазме (Рис. 3). В клетках меланомы кожи SK-MEL1 уровень TSPO составлял 8 положительно окрашенных клеток на 100 клеток меланомы.

В дальнейшем после инкубации клеток меланомы с лигандом TSPO РК11195 происходило достоверное увеличение количества TSPO+ клеток с 8% уровня до 7085% в зависимости от выбранной концентрации лиганда: максимальный уровень иммунопозитивных к TSPO клеток определялся при инкубации с РКП 195 в концентрации 10 |imol/L. По результатам ПЦР в реальном времени уровень экспрессии мРНК TSPO изменялся только после инкубации с РКП 195 в

концентрации 100 nmol/L (р<0,05) (Рис. 4). Таким образом, специфический лига!. TSPO PKI 1195 связывается со своим белком и резко увеличивает количество TSPC клеток меланомы кожи. Известно, что изменение экспрессии данн01 митохондриального белка влияет на особенности его функционирования (Veenm; L. et al., 2007). Согласно литературным данным более 20 типов клеток различнь тканей и органов, в том числе клетки злокачественных опухолей проявляй чувствительность к проапоптотическому действию PKI 1195, наиболее эффективна концентрацией, в большинстве случаев достоверно увеличивающей уровег апоптотической гибели клеток была концентрация 100 nmol/L.

2.5

0,5

;ô.o?7 ;

РКП 195 10 nmol/L

РК11195 10 mmol/L

MPHKTsPO

Рис.4. Уровень экспрессии мРНК TSPO в клетках меланомы после инкубации лигандом TSPO PKI 1195 по результатам ПЦР в реальном времени. Оценка сигнал! _ проводилась путем определения ACt, который определялся при нормализации TSP сигналов к сигналам от р-актина. Для достоверного сравнения уровня экспресс! мРНК TSPO в контроле и после инкубации с РКП 195 использовали критер^! Манна-Уитни. Me [25%;75%].

*- отличия от значения показателя контрольной группы достоверны р < 0.05.

В этой связи в представленном исследовании были оценены изменен! пролиферации клеток и уровня апоптоза в клетках меланомы кожи SK-MEL1 пос.ч: воздействия лигандом РКП 195. После инкубации с РКП 195 регистрировало! : снижение уровня PCNA+ клеток с 80% в группе контроля до 62% после инкубации РКП 196 в концентрации 10 nmol/L (р<0,05), до 28% в концентрации 100 nmol/L, до 22% в концентрации 10 nmol/L (различия достоверны, р<0,001) (Рис. 7, ? Данный факт является свидетельством снижения пролиферативной активное" клеток меланомы и говорит об успешности лечения. Уровень апоптоза увеличился : 5 раз от 5% до 24% в концентрации 10 nmol/L, до 26% в концентрации 100 nmol/L, i до 26,6 % в концентрации 10 |imol/L (различия достоверны, р<0,05) (Рис.5, 6). Таки : образом, лиганд TSPO РКП 195 в эксперименте демонстрирует способное'!

индуцировать апоптоз также и в клетках меланомы, что не было показано ранее.

Рис. 5. Рис.6.

Рис. 5. Клетки меланомы кожи SK-MEL1 после окрашивания акридиновым оранжевым/бромистым этидием. Живые клетки визуализируется с равномерно зеленым окрашиванием ядра и цитоплазмы. Ув. х400.

Рис. 6. Клетки меланомы кожи SK-MEL1 после инкубации с PKI 1195 +U0126 в концентрации 100 nmol/L и 10 nmol/L. Апоптотические клетки имеют фрагментированный и конденсированный хроматин оранжевого или зеленого цвета.

Рис. 7. Рис. 8.

Рис. 7. PCNA+ клетки меланомы кожи SK-MEL1, клетки окрашены иммунопероксидазным методом. Ув. х400.

Рис. 8. PCNA" клетки меланомы кожи SK-MEL1 после инкубации с PKI 1195 в концентрациях 100 nmol/L и с (JO 126 10 |imol/L по результатам иммуноцитохимического исследования. Ув. х400.

Говоря о регуляции экспрессии и функциональной активности TSPO, известно, что протеинкиназа Се также регулирует экспрессию данного белка (da Rocha А.В. et al., 2002). Протеинкиназа Се вовлечена в многие сигнальные клеточные процессы, и в том числе, в сигнальный механизм МАРК, регулирующий фундаментальные аспекты жизнедеятельности клеток, в том числе, было установлено, что протеинкиназа Се регулирует экспрессию гена TSPO через МАРК сигнальный каскад, в свою очередь, приводит к активации транскрипционных факторов c-Jun и STAT3 (Batarseh A. et al., 2010).

В этой связи на следующем этапе исследований использовался ингибитор

МАРК U0126 для оценки влияния на уровень экспрессии TSPO. U0126 являет! ингибитором фосфорилирования протеинкиназы МЕК, эффекторной протеинкиназ_ МАРК сигнального каскада. U0126 ингибирует способность МЕК фосфорилированию протеинкиназы ERK, и, в конечном итоге, изменяс промоторную активность гена TSPO (Batarseh А. et al., 2010). В клетках меланом кожи SK MELI после инкубации с ингибитором МАРК U0126 в концентрации 10 , 50 (imol/L происходило достоверное увеличение уровня TSPO+ клеток по сравнешг с контрольной группой в 10-11 раз с 8% до 83-92% (р<0,001). Результат иммуноцитохимического исследования подтверждались результатами ПЦР реальном времени: достоверно увеличилась экспрессия мРНК TSPO nocj использования U0126 в концентрации 10 (.imol/L (р<0,05) (Рис. 9). Как уя указывалось выше, известно, что блокаторы МАРК эффективны в отношенк_ индукции апоптоза клеток меланомы, с другой стороны, в дальнейшем клеткг меланомы вырабатывается резистентность к данным агентам.

Поэтому мы оценивали сочетанные эффекты лиганда TSPO и блокато{ МАРК для определения их апоптоз-стимулирующего действия, эффекта i пролиферацию клеток меланомы. В нашем исследовании при сочетание использовании лиганда TSPO РКП 195 и блокатора МАРК U0126 в концентрацш 100 nmol/L и 10 |imol/L соответственно, в культуре клеток меланомы SK-MEL i также происходило увеличение количества TSPO+ клеток меланомы кожи с 8% ; 75% (р<0,001), подтвержденное повышением экспрессии мРНК TSPO г результатам ПЦР в реальном времени (р<0,05) (Рис. 9).

UCJ126 UСМ26 РК11195 iOQnmol/L*

10 mmol-'L SOmmot/L U0126 10 mmol/L MPHKTsPO

Рис. 9. Уровень экспрессии мРНК Т5РО в клетках меланомы после инкубации о ингибитором МАРК и0126, результаты ПЦР в реальном времени. Оценка Т8Р сигналов проводилась путем определения АО, который определялся пр нормализации сигналов Т8РО к сигналам от Р-актина. Для достоверного сравнен» уровня экспрессии мРНК Т8РО в контроле и после лечения использовали критерк Манна-Уитни. Ме [25%-75%].

*- отличия от значения показателя контрольной группы достоверны р < 0.05.

Таким образом, изменение экспрессии Т8РО ассоциировано с различным физиологическими эффектами, такими как процессы клеточной гибели

пролиферации. Понимание механизмов экспрессии гена TSPO необходимо для разработки диагностических, терапевтических и прогностических мероприятий, в частности при злокачественных заболеваниях, и при меланоме кожи. Можно резюмировать, что меланома кожи характеризуется определенным профилем экспрессии данного белка. Использование лиганда TSPO, а также блокаторов МАРК сигнального каскада оказывает регулирующее влияние на его экспрессию.

Стоит предположить, что в клетках меланомы SK-MEL 1 с низким профилем экспрессии TSPO происходит изменение активности митохондриальной поры, и, как следствие, снижение выраженности апоптотической гибели клеток меланомы на фоне неограниченной пролиферации, что является ключевым событием начальных изменений при опухолевой трансформации клеток, ведущих к формированию опухолевого фенотипа.

Как известно, МАРК сигнальный каскад активируется протеинкиназой С, в свою очередь, регулирующей промоторную активность и экспрессию TSPO. Данный сигнальный каскад, как уже упоминалось, является одним из наиболее патогенетически важных сигнальных механизмов в развитии меланомы кожи, активация МАРК каскада отмечается в высоком проценте случаев меланомы кожи (Izumi Y. et al., 2005). В результате происходит активация сигнального каскада МАРК через онкогенную активацию BRAF или RAS, что вызывается активирующей мутацией BRAF V600E.

Последние исследования продемонстрировали, что именно BRAF статус ассоциируется с селективностью лечения ингибиторами МЕК при меланоме кожи, ингибирование протеинкиназы МЕК определяет рациональный терапевтический подход к лечению меланомы с положительным BRAF статусом (Solit D.B. et al., 2006, Martindale J.L. et al., 2002). Было отмечено, что в высоких концентрациях ингибиторы МЕК, к которым относится и U0126, достоверно снижают пролиферацию клеток различных линий меланомы кожи и в режиме монотерапии, а также достоверно снижают уровень метастатических поражений в легких (Sharma А. et al., 2005, Sharma A. et al., 2006, Adnane L. et al., 2005, Grabe С., 2002).

В нашем исследовании было также продемонстрировано наличие эффекта ингибитора МАРК U0126 на пролиферацию клеток меланомы кожи SK MELI, характеризующихся положительным BRAF статусом. При использовании U0126 в концентрациях 10 и 50 |imol/L происходило снижение уровня PCNA+ клеток до 24 и 59% соответственно (р<0,001). Параллельно со снижением пролиферативного уровня происходило и увеличение уровня апоптотической гибели с 5% в контрольной группе до 14,7- 33% (р<0,001).

Из литературных данных известно, что лиганд TSPO РКП 195 обладает выраженным синергетическим эффектом в комбинации с проапоптотическими агентами. РКП 195 показывал проапоптотический эффект в сочетании с разнообразными противоопухолевыми препаратами. Потенциальным преимуществом сочетанного действия РКП 195 с другими противоопухолевыми и цитотоксическими веществами является возможность снижения дозы вышеуказанных средств, повышая при этом их эффективность. В случае меланомы кожи сочетанное применение антагониста TSPO РКП 195 с МАРК-ингибиторами должно быть исследовано далее для оценки возможного снижения вероятности

развития химиорезистентности, столь характерной для клеток меланомы кожи.

К механизмам, посредством которых может развиваться проапоптотическс действие в таком случае, относят активацию каспаз и дисфункцию митохондри (Chauhan D. et al., 2004).

Таким образом, на следующем этапе исследований были проанализирован: эффекты комбинированного воздействия блокатора МАРК U0126 в сочетании лигандом TSPO PK 11195 и проведен сравнительный анализ этих эффектов отношении отдельного действия этих агентов. Для определения эффективност определяли изменение уровня пролиферации и апоптотической гибели в культур клеток меланомы кожи SK MELI.

В качестве рабочих концентраций были использованы наименее низки концентрации препаратов, которые по данным литературы обладаю положительным эффектом на уровень пролиферации и апоптоза: 10 nmol/L лиганд PKI 1195 и 10(imol/L блокатора МАРК U0126. А также использовали концентращп РКП 195 100 nmol/L, как достоверно изменяющую экспрессию белка TSPO, исход из результатов, полученных ранее в нашем исследовании (достоверное изменени уровня мРНК TSPO по результатам ПЦР в реальном времени), в комбинации U0126 в концентрации 10(imol/L, также достоверно приводящей к измененш уровня экспрессии мРНК TSPO.

В результате, при анализе изменений пролиферативной активности клето меланомы отмечается снижение количества PCNA+ клеток до 45%, при этом эт результаты были сопоставимы с режимом монотерапии PKI 1195 и U0126 (62 и 59° соответственно). Преимуществ в комбинации данных агентов в отношени изменения тестируемых параметров выявлено не было.

Однако при анализе изменения уровня апоптотической гибели клето меланомы кожи SK MELI было отмечено резкое увеличение данного показателя в раз в сравнении с группой контроля (с 5% уровня в группе контроля до 42% группе исследования). В режиме монотерапии РКП 195 и U0126 показател апоптотической гибели увеличивались лишь в 5 и 6 раз.

Таким образом, были выявлены достоверно значимые различи эффективности терапии в режиме монотерапии в сравнение с комбинированны] лечением. Так, уровень апоптотической гибели после лечения РКП 195 100 nmol/ составил 26%, а после лечения в комбинации с U0126 10 ^mol/L уровен апоптозположительных клеток достоверно увеличился до 42% (р=0,049, при р<0,0 различия достоверны). Уровень апоптотической гибели после лечения U0126 1 (.imol/L составил 33%, а после лечения в комбинации с PKI 1195 100 nmol/L процен апоптозположительных клеток достоверно увеличился до 42% (р=0,049, при р<0,0 различия достоверны).

Таким образом, стоит резюмировать, что в клетках меланомы РКП 195 таюк потенцировал проапоптотические эффекты, в данном случае - МАРК-ингибитор U0126. Следовательно, РКП 195, специфический лиганд-антагонист TSPO, може использоваться в качестве проапоптотического агента при меланоме кожи.

Выполненное исследование также служит доказательством возможност использования TSPO в качестве молекулярной мишени при меланоме кожи, в toi числе, для достижения более выраженного эффекта в отношении регуляци

пролиферации и апоптоза клеток меланомы кожи.

Современные представления о патогенезе меланомы кожи позволили предположить, что данная опухоль характеризуется не только клиническим и патоморфологическим разнообразием, но также и различными молекулярными механизмами развития. В частности, считается, что мутации гена BRAF играют ключевую роль в формировании меланомы кожи в участках, подверженных воздействию ультрафиолетового излучения (Cohen Y. et al., 2004).

В этой связи в дальнейшем было проведено молекулярно-генетическое исследование с целью определения распространенности BRAF-позитивных меланом в Красноярском крае.

Согласно современным генетическим исследованиям наиболее часто при меланоме кожи встречается мутация BRAF V600E, по результатам различных групп исследователей в различных популяциях частота варьирует от 60 до 70% среди пациентов с меланомой кожи (Davies Н. et al., 2002, Shinozaki М. et al., 2004, Mercer K.E. et al., 2003). В Красноярском крае распространенность случаев меланомы кожи, имеющих данную соматическую мутацию ранее не исследовалась. Анализ BRAF-статуса больных меланомой кожи производился с помощью ПДРФ-анализа на основе ПЦР гистологических срезов больных меланомой кожи с различным уровнем инвазии опухоли, находящихся на стационарном лечении после хирургического иссечения опухоли в КГУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с диагнозом злокачественная меланома кожи (рубрика С43) в соответствии с МКБ-10.

Цитологическая картина при меланоме кожи характеризовалась следующими признаками опухолевого фенотипа: меланомные клетки отличались обильной цитоплазмой и наличием гранул пигмента, измененным ядерно-

цитоплазматическим отношением, ящерной атипией от средней до тяжелой степени, гиперхромией ядер, неровной ядерной мембрана, наличием высокого количества митозов, в том числе патологических (Рис. 10, 11).

Рис. 10

Рис. 10. Поверхностно-распространяющаяся меланома. Цитологическая характеристика: клеточная атипия, множественные митозы в меланомных клетках. Ув. х400.

Рис. 11. Поверхностно-распространяющаяся меланома. Цитологическая характеристика: клеточная атипия, ядерная атипия, гиперхромия ядер. У в. х400.

ЯШЗИ Рис.11

Рис. 12. Поверхностно-распространяющаяся меланома: формирующийся узе опухоли, который приподнимает эпидермис и сжимает сосочковый слой дермы. У

хюо.

Гистологическая картина различалась в зависимости от типа опухоли и фаз роста (уровня инвазии). Так, при наиболее часто встречающемся поверхностно распространяющемся типе меланомы наблюдался педжетоидный ти распространения клеток (опухолевые клетки распространяются на все слс эпидермиса) в эпидермисе, клетки инфильтрируют эпидермис, также комплекс атипичных меланоцитов распространяются до сосочкового слоя дермы, возможн формирование гнезд опухолевых клеток. В подлежащей дерме выраже? лимфоцитарная инфильтрация. При инвазии меланомных клеток в более глубокр слои дермы и глубже опухолевые клетки становятся менее пигментированным] воспалительный инфильтрат не так выражен (Рис. 12).

Используя данный метод определения ВИАГ статуса, ПДРФ анализ, м_: выявили мутацию в 43 (85,1%) из 47 протестированных меланом. Мутащ отсутствовала лишь в 4 случаях (14,9%). Кроме того, меланомы был гетерозиготными, т.е. продукты амплификации разрезались на фрагменты 112 и Г Ьр, что говорит о присутствии мутации, и в то же время после амплификации с второй парой праймеров продукты ПЦР рестрицировались на фрагменты 78, 34 и 1 Ьр, что говорит о ее отсутствии. Либо были гомозиготные образцы, и в результат^ рестрикции получались фрагменты лишь 112 и 18 Ьр (Рис. 13).

. 1 3 4 м

150Ьр

ШШШ^ ....... -.. 1зоьр 1зоьр

ШРЕвТИСТЕО р 112Ьр 78Ьр ЙЕвТгаСТЕО Тооьр

................. р»

Рис. 13. ПДРФ анализ ВЯАР мутации У600Е.

М-маркер молекулярного веса, 1, 2- фрагменты ДНК до рестрикции. 3,4 -фрагменты ДНК после рестрикции, 3- фрагмент ДНК 112 Ьр, 4 -фрагмент ДНК 78 Ьр.

Учитывая то, что данная мутация является активирующей, даже в случае гетерозиготного генотипа происходит активация сигнального каскада МАРК, что приводит к неограниченной пролиферации меланоцитов.

При анализе клинических данных у большинства пациентов, имеющих мутацию ВЯАР У600Е, меланома кожи локализовалась в области лица и шеи (44,2%), а также в области конечностей (41,8%). Для сравнения по данным ЕИейюге! Л.А. пациенты с меланомой кожи, имеющей мутацию ВЯАР, преимущественно имели первичную локализацию меланомы в области конечностей (41%) и туловища (46%) (ЕИегЬоге! ГА. е( а1., 2011).

При анализе гистологических вариантов опухоли преобладал поверхностно-распространяющийся тип меланомы кожи (82,9%), и лишь три случая узловой меланомы (6, 8 %) и 4 случая (9 %) лентиго - меланомы. В виду того, что большинство проанализированных меланом на предмет наличия мутации относились к поверхностно распространяющейся форме, то и среди меланом, имеющих мутацию ВЯАР в нашем исследовании к этому клиническому варианту относилось большинство - 76,6% меланом.

Генетический профиль опухоли влияет на агрессивность клинического поведения. Одним из важнейших прогностических факторов при меланоме является уровень инвазии опухоли по Кларку. При анализе уровня инвазии опухоли среди меланом, протестированных нами на предмет наличия мутации ВЯАР выявили, что среди меланом с положительным ВЯАР статусом в 39,5 % определялся 1-П уровень инвазии, в 41,8% III уровень, и в 18,6% 1У-У уровень. При сравнении с данными литературы проведенный анализ 109 случаев меланом, с положительным ВЯАР статусом, определялся 1-П уровень в 11% случаев, III уровень в 38,5% и 1У-У в 50,5% случаев (ЕИегИоге! ГА. е1 а1„ 2011).

Полученные данные говорят о высокой частоте данной мутации среди пациентов с меланомой кожи в Красноярском крае. Кроме того, отсутствие значимых различий между группами сравнения говорит об универсальности

мутации BRAF V600E, то есть активация МАРК каскадного пути происходит bi зависимости от пола, и в любом возрасте.

Известно, что одним из важных факторов риска развития меланомы ко» является ультрафиолетовое облучение (УФО) (Cummins D.L. et al., 2006, Cockbu M. et al., 2001). Как уже указывалось выше, Красноярский край не относится регионам с высоким уровнем инсоляции, однако, повсеместное использован] искусственных источников УФО является фактором риска развития меланомы коя и в данной территории. Учитывая высокий уровень выявленной мутации BR/ среди проанализированных пациентов с меланомой кожи и преимущественну локализацию первичного очага на открытых участках тела (лицо, конечное« можно предположить, что действительно изменение уровня инсоляции пациент« Красноярского края может влиять на появление мутации BRAF и дальнейш развитие меланомы.

Сложившаяся неблагоприятная ситуация по заболеваемости и смертное: меланомой кожи в Красноярском крае и в Российской Федерации в целом требу немедленных мероприятий по профилактике и изменений подходов к тераш меланомы кожи. Основные стратегии по первичной профилактике меланомы коя должны быть направлены на ограничение воздействия основных этиологичесю факторов, в первую очередь, ультрафиолетового облучения. Завершить создание основ персонифицированной терапии, полногеномным скринингом отделы взятого пациента и подбора препаратов в зависимости от биологии клеток опухоли.

ВЫВОДЫ

1. У больных меланомой нарушена функциональная активность нейтрофилов, i что указывает снижение уровня TSPO+ клеток в нейтрофилах периферическс крови по сравнению с показателем здоровых лиц.

2. Экспрессия TSPO в клетках меланомы кожи индуцируется лигандом данно) рецептора РКП 195, при этом повышение уровня мРНК TSPO происход» только при инкубации с PKI 1195 в концентрации 100 nmol/L;

3. Экспрессия TSPO в клетках меланомы кожи повышается при действг ингибитора сигнального пути МАРК U0126 при концентрациях последнего 1 jimol/L, что доказывает регуляторный эффект данного механизма передач сигнала в отношении TSPO.

4. Лиганд TSPO РКП 195 обладает способностью вызывать изменение уровг апоптоза и пролиферации клеток меланомы; при этом РКП 195 потенциру( проапоптотический и антипролиферативный эффекты МАРК-ингибито{ U0126, что показывает возможность использования TSPO в качссп молекулярной мишени для оптимизации способов противоопухолевс терапии в отношении BRAF-положительной меланомы кожи.

5. BRAF-позитивные меланомы доминируют в популяции вне зависимости с пола, возраста, локализации и гистотипа опухоли.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Распространенность BRAF-позитнвных меланом в Красноярском крае определяет и необходимость поиска новых регуляторов пролиферации и апоптоза клеток меланомы у таких пациентов.

2. Необходимо учитывать BRAF статус пациентов с меланомой кожи, и в дальнейшем использовать комбинированную терапию, включаюшей применение BRAF ингибиторов в сочетании с препаратами, воздействующими на процессы пролиферации или апоптотической гибели клеток, например в качестве мишени может выступать TSPO.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рукша Т.Г. Канцерогенез и старение кожи / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова, A.B. Зубова // Актуальные вопросы долголетия - Красноярск, 2008.- С.162-172.

2. Федоша A.B. Изменение экспрессии белков, ассоциированных со стероидогенезом, у пациентов с меланомой кожи / A.B. Федоша, С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Молекулярная медицина и биобезопасность: Тезисы международной конференции - 2008, Новосибирск - С. 103-104.

3. Гырылова С.Н. Эпидемиология и клинико-морфологическая характеристика меланомы кожи в Красноярском крае за 2003-2007 гг. / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Сибирский онкологический журнал - 2009, - Прил. №1,- С.56-57. (Тезисы к региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии»).

4. Гырылова С.Н. Изменение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в полиморфноядерных нейтрофилах периферической крови у пациентов с меланомой кожи / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Молекулярная медицина и биобезопасность: Тезисы международной конференции - 2009, Москва - С.73-75.

5. Рукша Т.Г. Нарушения механизмов передачи сигнала при меланоме кожи / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова // Сибирский журнал дерматологии и венерологии. - 2009.-№3.- С.46-47.

6. Гырылова С.Н. Особенности эпидемиологии и клинических проявлений меланомы кожи в Красноярском крае / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша, Г.А Арутюнян // Вестник дерматологии и венерологии.- 2009. - №6.-С.21-27. (из списка ВАК)

7. Gyrylova S.N. The clinical epidemiology of cutaneous melanoma / S.N. Gyrylova, T.G. Ruksha // Abstracts of 18-th Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology - 2009, Berlin.

8. Рукша Т.Г. Актуальные проблемы ранней диагностики меланомы кожи / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова // Человек и лекарство: Тезисы XVII Российского Национального конгресса - 2010, Москва - С.237.

9. Рукша Т.Г. Применение TSPO в качестве патогенетической мишени для воздействия на пролиферацию клеток меланомы / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова // Достижения современной онкологии: Материалы Всероссийской

научно-практической конференции с международным участием. - Варна)

2010, - С.263-265.

Ю.Рукша Т.Г. Злокачественные новообразования кожи: анализ заболеваемости Красноярском крае, проблемы профилактики и совершенствования ран» диагностики / Т.Г. Рукша, М.Б. Аксененко, С.Н. Гырылова // Вестн) дерматологии и венерологии - 2010.-№4.- С.4-9. (из списка ВАК).

П.Комина А.В. Применение метода ПЦР в реальном времени для оцет экспрессии апоптоз-ассоциированного белка / А.В. Комина, С.Н. Гырылов Т.Г. Рукша // Молекулярная диагностика: Сборник трудов VII всероссийск< научно-практической конференции с международным участием - Моске 2010 - С.86-87.

12. Гырылова С.Н. Ингибирование MAPK-сигнального механизма как спос< патогенетической коррекции пролиферации клеток меланомы кожи / С.1 Гырылова, Т.Г. Рукша // Сибирский журнал дерматологии и венерологии

2011. -№12,- С.77-78.

13.Гырылова С.Н. Индукция апоптоза клеток меланомы лигандом TSP РКП 195 / С.Н. Гырылова, А.В. Комина, Рукша Т.Г. // Сибирсю онкологический журнал -2011. - №1,- С.40-43. (из списка ВАК)

14. Анализ BRAF-статуса у больных меланомой кожи / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша, Зобова С.Н., Комина А.В., Аксененко М.Б. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2011. - №6,- С.27-30. (из списка ВАК)

15.Рукша Т.Г. Молекулярная генетика меланомы кожи: современные подходы диагностике и персонификации терапии / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова Abstract on the 2-nd Continental Congress of Dermatology of the Internation Society of Dermatology - St. Petersburg, 2011 - C.327.

16. Гырылова С.Н. Способ модуляции апоптоза и клеточной пролифсращ клеток меланомы кожи / С.Н. Гырылова // Сибирский онкологичесю журнал - Томск, 2011,- Прил. №1,- С.38-39. (Тезисы к VI региональнс конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клиническс онкологии»)

17.Gyrylova S.N. Translocator Protein (TSPO) ligand PK11195 induces apoptosis ' melanoma cells / S.N. Gyrylova, T.G. Ruksha, A.V. Komina // Abstracts of 20-Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology - Lisbo 2011.

18.Gyrylova S.N. Translocator Protein (TSPO) ligand PK11195 induces apoptosis in melanoma cells / S.N. Gyrylova, T.G. Ruksha, A.V. Komina // Abstracts of 6-th Spring Symposium of the European Academy of Dermatology and Venereology -Verona, 2012.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

PCNA (proliferating cell nuclear ап^еп)-ядерный антиген пролиферирующих клеток TSPO - Translocator protein

МАРК (Mitogen activating protein kinase signaling pathway) - сигнальный каскад митоген-активированных протеинкиназ

МЕК (MAP kinase kinase) - МАРК-сигналрегулирующая киназа мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

РКП 195 - 1-(2-хлорофенил)-Ы-метил-Ы-(1-метил-пропил)- изохинолинкарбоксамид ПДРФ анализ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР - полимеразная цепная реакция УФО - ультрафиолетовое облучение

Соискатель

Гырылова С.Н.

Отпечатано в типографии «Печатный Двор» Красноярск, Марковского, 19. тел./факс: +7(391)266-12-90 Пл. - 1.0 Тираж 100 экземпляров Бумага офсетная 80 гр/м.кв Способ печати - оперативный

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Гырылова, Светлана Николаевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные представления о молекулярных механизмах развития меланомы кожи. Нарушения клеточной пролиферации.

1.2. Нарушение регуляции апоптотической гибели клеток при меланоме кожи.

1.3. Апоптоз-ассоциированный белок TSPO и применение его лигандов в экспериментальной терапии злокачественных новообразований.

Глава 2. Материал и методы исследования.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Модуляция уровня TSPO в клетках меланомы лигандом TSPO

PKI 1195 и ингибитором МАРК U0126.

3.2. Оценка интенсивности клеточной пролиферации и апоптоза после инкубации клеток меланомы с лигандом TSPO РКП 195, ингибитором МАРК U0126.

3.3. Молекулярно-генетический анализ биоптатов кожи . больных первичной меланомой для верификации мутации гена BRAF V600E.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль Translocator protein (TSPO) в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток при BRAF-положительной меланоме кожи"

Актуальность проблемы

Злокачественные новообразования кожи, включая меланому кожи, в структуре всех злокачественных опухолей человека составляют более чем одну третью часть, что делает их одними из наиболее часто встречающихся типов злокачественных новообразований [Pollock P.M. et al., 2003]. Злокачественная меланома кожи, являющаяся одной из наиболее агрессивных опухолей, в Российской Федерации относится к редким видам злокачественных новообразований [Кубанова А.А. и др., 2007]. Несмотря на это, в Красноярском крае заболеваемость меланомой увеличивается, параллельно идет также увеличение показателей смертности [Гырылова С.Н., 2009]. При этом прирост данных показателей происходит интенсивно, уровень смертности в Красноярском крае приближается к соответствующим показателям стран с наиболее высокими показателями заболеваемости. Все это позволяет расценивать меланому кожи как важную медико-социальную проблему, которая наносит невосполнимый экономический ущерб обществу.

Меланома кожи является не только клинически разнородной опухолью, классифицирующейся на различные клинические и гистологические варианты. По современным данным меланома характеризуется изначально молекулярным и генетическим разнообразием, определяющим клинический полиморфизм, а также особенности течения заболевания.

Пролиферация меланоцитов, выживание, дифференцировка и миграция являются важнейшими элементами нормальной физиологии кожи. Как показывают последние исследования, одним из ключевых изменений, происходящих при развитии меланомы кожи, является мутагенная активация сигнального каскада митоген-активированных протеинкиназ (МАРК).

Хотя многочисленные доклинические исследования оценивали мутацию BRAF и сигнальный механизм МАРК как перспективную мишень для терапии меланомы кожи, начальные клинические исследования не показали эффективность лечения меланомы с использованием ингибиторов BRAF или МАРК-сигналрегулирующей киназы (МЕК). Это связано с тем, что высокая пластичность клеток меланомы кожи позволяет ей оставаться одной из наиболее резистентных опухолей к химиотерапии. Метастазирующая меланома является прогностически крайне неблагоприятной опухолью, резистентной ко всем видам традиционной химиотерапии и тестируемым биологическим агентам [Мерабишвили В.М., 2006].

Для преодоления механизмов резистентности и повышения эффективности терапии меланомы кожи может являться потенциальной мишенью митохондриальный белок Translocator Protein, TSPO. Показано, что TSPO, как один из компонентов митохондриальных пор, может модулировать их функционирование путем увеличения продолжительности открытия, что ведет к снижению мембранного потенциала [Decaudin D. et al., 2002]. TSPO является внутриклеточным белком с преимущественной митохондриальной и ядерной локализацией. Показано участие TSPO в регуляции пролиферации клеток, дифференцировки, апоптоза и ионного транспорта. Повышенные уровни TSPO обнаружены при различных типах злокачественных новообразований, в частности, при раке молочной железы, толстого кишечника, плоскоклеточном раке ротовой полости [Batarseh A. et al., 2010]. Роль в канцерогенезе данного белка является изученной недостаточно, но предполагается, что он может потенцировать усиление клеточной пролиферации посредством участия в транспорте холестерина через биологические мембраны, что является необходимым для обеспечения пластических и энергетических затрат опухолевых клеток, характеризующихся высоким пролиферативным потенциалом. Помимо этого, выявлено, что лиганды TSPO при ряде злокачественных новообразований изменяют выраженность апоптоза, клеточной пролиферации [Veenman L. et al., 2007].

Цель работы

Оценить возможность регуляции клеточной пролиферации и апоптоза лигандами белка-переносчика (Translocator protein, TSPO) в BRAF-позитивных меланомах кожи.

Задачи исследования

1. Выявить особенности экспрессии TSPO в нейтрофилах периферической крови больных меланомой кожи;

2. Определить уровень TSPO+ клеток и особенности экспрессии мРНК TSPO в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи после инкубации с лигандом TSPO РКП 195 в концентрациях 10 nmol/L, 100 nmol/L, 10fimol/L.

3. Определить уровень TSPO+ клеток и особенности экспрессии мРНК TSPO в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи после инкубации с МЕК-ингибитором U0126 в концентрациях 10 fimol/L, 50 |imol/L, а также при сочетанной инкубации с U0126 и PKI 1195;

4. Установить характер влияния лиганда TSPO, в том числе при сочетанном применении с МЕК-ингибитором U0126 на выраженность апоптоза и пролиферации опухолевых клеток BRAF-позитивной меланомы кожи;

5. С помощью молекулярно-генетического анализа выявить частоту встречаемости BRAF-позитивных меланом кожи, а также клинико-гистологических вариантов меланомы кожи в Красноярском крае.

Научная новизна

В представленной работе впервые получены данные о характере экспрессии TSPO в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи, в том числе после воздействия лигандом TSPO и МАРК-ингибитором U0126.

Впервые оценены изменения уровня пролиферации и апоптотической гибели в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи при модуляции уровня TSPO; показано преимущество комбинированного применения модуляторов TSPO и МАРК-ингибиторов для индукции апоптоза в клетках меланомы. Впервые установлено регулирующее действие сигнального пути МАРК на уровень экспрессии TsPO в клетках меланомы кожи.

Впервые исследованы пациенты с меланомой кожи на предмет наличия мутации гена BRAF в Красноярском крае, а также выявлены клинико-гистологические особенности меланомы кожи в зависимости от BRAF-статуса.

Научно-практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные указывают на возможность использования TSPO в качестве патогенетической мишени для модуляции уровня пролиферации и апоптоза клеток меланомы. Кроме того, показано, что комбинированная терапия лигандом TSPO РКП 195 в сочетании с блокаторами МАРК требует дальнейшего изучения как возможный новый подход к персонализированному лечению данного заболевания при BRAF-позитивных меланомах кожи.

Показано, что BRAF-позитивные меланомы кожи в высокой степени присутствуют в популяции больных меланомой кожи - жителей Красноярского края, что также подчеркивает необходимость дальнейших разработок, поиска молекулярных мишеней для терапии данного молекулярного-генетического варианта опухоли.

Выполненная работа поддержана грантами Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности (2010 г.).

Положения, выносимые на защиту

2. Лиганд РКП 195, специфически связываясь с TSPO, способен повышать его экспрессию в клетках меланомы кожи в наномолярных концентрациях, изменение экспрессии данного митохондриального белка происходит однонаправлено с уровнем апоптоза; ингибитор МАРК U0126 повышает уровень экспрессии мРНК TSPO в клетках меланомы кожи SK MELI, что доказывает его способность оказывать регулирующий эффект на TSPO;

3. Лиганд TSPO РКП 195 и ингибитор МАРК U0126 в эксперименте демонстрируют способность изменять выраженность апоптоза и уровень пролиферации в клетках меланомы кожи SK MELI, характеризующихся положительным BRAF-статусом. При комбинированном использовании лиганда TSPO РКП 195 и МАРК-ингибитора U0126 достигается более выраженный активирующий эффект в отношении уровня апоптоза клеток меланомы кожи.

Внедрение результатов исследования

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику лаборатории биохимии опухолей ФГБУ НИИ Онкологии СО РАМН с 11 января 2012г., а также в учебный процесс кафедры нормальной анатомии и гистологии человека ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет Минздрава» с 20 апреля 2012 г., в календарно-тематический план практических занятий по теме: «Цитология. Жизненный цикл клетки».

Апробация работы

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе в 4 журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования статей, содержащих результаты диссертационных исследований. Получен патент Российской Федерации на изобретение №2455993 «Способ индукции апоптотической гибели клеток меланомы кожи», заявка № 2011127875, приоритет изобретения 6 июля 2011г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 107 страниц текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 рисунков, 6 таблиц. Библиографический список содержит 161 источников, из которых 8 отечественных и 153 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Гырылова, Светлана Николаевна

выводы

1. У больных меланомой кожи нарушена функциональная активность нейтрофилов, на что указывает снижение уровня TSPO+ клеток в нейтрофилах периферической крови по сравнению показателем здоровых лиц.

2. Экспрессия TSPO в клетках меланомы кожи индуцирцется лигандом данного рецептора РКП 195, при этом повышение уровня мРНК TSPO регистрируется только при инкубации с РКП 195 в концентрации 100 nmol/L;

3. Экспрессия TSPO в клетках меланомы кожи повышается при действии ингибитора сигнального пути МАРК U0126 при концентрациях последнего 10 ¡imol/L, что доказывает регуляторный эффект данного механизма передачи сигнала в отношении TSPO.

4. Лиганд TSPO РКП 195 обладает способностью вызывать изменение уровня апоптоза и пролиферации клеток меланомы; при этом РКП 195 потенцирует проапоптотический и антипролиферативный эффекты МАРК-ингибитора U0126, что показывает возможность использования TSPO в качестве молекулярной мишени для оптимизации способов противоопухолевой терапии в отношении BRAF-положительной меланомы кожи.

5. BRAF-позитивные меланомы доминируют в популяции вне зависимости от пола, возраста, локализации и гистотипа опухоли.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Распространенность ВКАБ-позитивных меланом в Красноярском крае определяет и необходимость поиска новых регуляторов пролиферации и апоптоза клеток меланомы у таких пациентов.

2. Необходимо учитывать ВКАР статус пациентов с меланомой кожи, и в дальнейшем использовать комбинированную терапию, включающей применение ВКАР ингибиторов в сочетании с препаратами, воздействующими на процессы пролиферации или апоптотической гибели клеток, например в качестве мишени может выступать ТБРО.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гырылова, Светлана Николаевна, Новосибирск

1. Аравийская Е.Р. Ультрафиолет, его влияние на кожу. Современные принципы фотопротекции / Аравийская Е.Р, Соколовский Е.В. // Вестн. Дерматол. Венерол. 2003.- №2. - С.14-17.

2. Ахтямов С.Н. Клинико-морфологические особенности старения кожи / Ахтямов С.Н, Кягова A.A. // Вестн. Дерматол. Венерол. 2005.- №4. -С.60-64.

3. Гырылова С.Н. Особенности эпидемиологии меланомы кожи в Красноярском крае / Гырылова С.Н, Рукша Т.Г, Арутюнян Г.А. // Вестн. Дерматол. Вененрол,- 2009.- № 6.- С.21-27.

4. Злокачественные новообразования в России в 2004 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. Чиссова В.И. 2006.

5. Кубанова A.A. Злокачественные новообразования кожи в структуре онкологической заболеваемости в Российской Федерации / Кубанова A.A., Мартынов A.A. // Вестн. Дерматол. и Венерол. -2007.-№6.-С.19-24.

6. Мерабишвили В.М. Злокачественная меланома кожи современные тенденции (заболеваемость, смертность, диагностика, морфологическая верификация) / Мерабишвили В.М. // Вопр. Онкол.- 2006.- № 3.- 275-287.

7. Рукша Т.Г. Современные представления об этиологии и патогенезе / Рукша Т.Г, Прохоренков В.И, Салмина А.Б. и др. // Вестн. Дерматол. Венерол. 2007.- №5. - С.22-28.

8. Селедцов В.И. Иммунологические и клинические аспекты применения ксеновакцинотерапии в лечении меланомы / Селедцов В.И, Фельде М.А, Самарин Д.М. и др.// Росс. Онкол. Журн.-2006.-№4.-С.23-28.

9. Adnane L. Sorafenib (BAY 43-9006, Nexavar((R))), a dual-action inhibitor that targets RAF/MEK/ERK pathway in tumor cells and tyrosine kinases

10. VEGFR/PDGFR in tumor vasculature / Adnane L., Trail P.A., Taylor I. et al. // Methods Enzymol.-2005.- Vol. 407.- P.597-612.

11. Aplin A.E. Mechanisms of resistance to RAF inhibitors in melanoma / Aplin A.E., Kaplan F.M., Shao Y. // J. Invest. Dermatol. 2011. - Vol. 131. -P. 1817-20.

12. Atkins M.B. High-dose recombinant interleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993 / Atkins M.B., Lotze M.T., Dutcher J.P. et al. // J. Clin. Oncol.-1999.-Vol.17.-P.2105-2116.

13. Atkins M.B. Innovations and challenges in melanoma: summary statement from the first Cambridge conference / Atkins M.B., Elder D.E., Essner R. et al. // Clin. Cancer Res.- 2006.- Vol.12.- P.2291-2296.

14. Aust D.E. Mutations of the BRAF gene in ulcerative colitis-related colorectal carcinoma / Aust D.E., Haase M., Dobryden L. et al // Int. J. Cancer.-2005.-Vol. 115.-P.673-7.

15. Baguley B.C. Novel strategies for overcoming multidrug resistance in cancer / Baguley B.C. // Biodrugs.-2002. Vol.16.-P.97 -103.

16. Beadling C. KIT Gene Mutations and Copy Number in Melanoma Subtypes / Beadling C., Jacobson-Dunlop E., Hodi F.S. et al. // Clin. Cancer Res.-2008.-Vol.14.-P. 6821 6828.

17. Berger W. Possible role of the multidrug resistance-associated protein (MRP) in chemoresistance of human melanoma cells / Berger W., Hauptmann E., Elbling L. etal. //Int. J. Cancer. 1997.-Vol.-71.-P. 108-115.

18. Brochez L. Diagnostic ability of general practitioners and dermatologists in discriminating pigmented skin lesions I Brochez L., Verhaeghe E., Bleyen L. et al. // J. Am. Acad. Dermatol. 2001.-Vol.44.-P. 979-986.

19. Brose M.S. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma / Brose M.S., Volpe P., Feldman M. et al. // Cancer Res.- 2002.-Vol. 62.-P. 6997-7000.

20. Carracedo A. Inhibition of mTORCl leads to MAPK pathway activation through a PI3K-dependent feedback loop in human cancer // Carracedo A., Ma L., Teruya-Feldstein J. et al. // J. Clin. Invest. 2008.- Vol.- 118.-P. 3065-3074.

21. Casellas P. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function / Casellas P., Galiegue S., Basile A.S. // Neurochem Int. 2002.-Vol. 40. - P. 475-86.

22. Chapman P.B. Phase III multicenter randomized trial of the Dartmouth regimen versus dacarbazine in patients with metastatic melanoma / Chapman P.B., Einhorn L.H., Meyers M.H. et al // J. Clin. Oncol.-1999.- Vol.17.- P. 27452751.

23. Chamberlain A.J. Nodular Type and Older Age as the Most Significant Associations of Thick Melanoma in Victoria, Australia / Chamberlain A.J., Fritschi L., Giles G.G. et al. //Arch. Dermatol.- 2002.-Vol.l38.-P.609-614.

24. Chauhan D. Targeting mitochondria to overcome conventional and bortezomib/proteasome inhibitor PS-341 resistance in multiple myeloma (MM) cells / Chauhan D., Li G., Podar K. et al. // Blood. 2004.- Vol. 104. - P. 2458 - 2466.

25. Chetoui N. Down-Regulation of Mcl-1 by Small Interfering RNA Sensitizes Resistant Melanoma Cells to Fas-Mediated Apoptosis / Chetoui N., Sylla K., Gagnon-Houde J.V. et al. // Mol. Cancer Res.-2008.- Vol.6.- P.42.

26. Chelli B. Peripheral-type benzodiazepine receptor ligands: mitochondrial permeability transition induction in rat cardiac tissue / Chelli B., Falleni A., Salvetti F. et al. // Biochem. Pharmacol. 2001. - Vol. 61. - P. 695-705.

27. Chelli B. PK 11195 differentially affects cell survival in human wild-type and 18 kDa translocator protein-silenced ADF astrocytoma cells / Chelli B., Salvetti A., Da Pozzo E. et al // J. Cell. Biochem. 2008.- Vol.105. -P. 712-723

28. Cockburn M. Recall Bias in Self-reported Melanoma Risk Factors / Cockburn M., Hamilton A., Mack T. // Am. J. Epidemiol. 2001. - Vol. 153. - P.1021 -1026.

29. Cohen Y. Exon 15 BRAF Mutations Are Uncommon in Melanomas Arising in Nonsun-Exposed Sites / Cohen Y., Rosenbaum E., Begum S. et al. // Clin. Cancer Res.-2004.-Vol.10.-P. 3444.

30. Cormier J.N. Ethnic Differences Among Patients With Cutaneous Melanoma / Cormier J.N., Xing Y., Ding M. et al. // Arch. Intern. Med. 2006. - Vol.166. -P.1907 - 1914.

31. Costantini P. Mitochondrion as a Novel Target of Anticancer Chemotherapy / Costantini P., Jacotot E., Decaudin D. et al. // J. Natl. Cancer Inst. 2000.-Vol. 92.- P. 1042 - 1053.

32. Curtin J.A. Distinct sets of genetic alterations in melanoma / Curtin J.A., Fridlyand J., Kageshita T. et al. // N. Engl. J. Med.- 2005.-Vol. 353(20).-P.2135-2147.

33. Curtin J.A. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. Curtin J.A., Fridlyand J., Kageshita T. et al. //N. Engl. J. Med. 2005.-Vol.353.-P.2135-47.

34. Curtin J.A. Somatic activation of KIT in distinct subtypes of melanoma / Curtin J.A., Busam K., Pinkel D. et al. // J. Clin. Oncol. -2006.-Vol.24.-P.4340-6.

35. Cummins D.L. Cutaneous malignant melanoma / Cummins J.M., Pantle H., Silverman M.A. et al. // Mayo Clin. Proc. 2006. - Vol. 81. - P.500-7.

36. Dallaporta B. Plasma Membrane Potential in Thymocyte Apoptosis / Dallaporta B., Marchetti P., de Pablo M.A. et al.// J. Immunol. 1999.- Vol. 162.-P. 6534 - 6542.

37. Daniotti M. BRAF alterations are associated with complex mutational profiles in malignant melanoma / Daniotti M., Oggionni M., Ranzani T. et al. // 0ncogene.-2004. Vol. 23.-P. 5968-77.

38. Danson S. Improving outcomes in advanced malignant melanoma: update on systemic therapy / Danson S., Lorigan P. // Drugs. 2005.-Vol.65.-733-743.

39. De Jong D. Subcellular localization of the Bcl-2 protein in malignant and normal lymphoid cells / De Jong D., Prins F. A., Mason D. Y. et al. // Cancer Res. 1994 .- Vol. 54.- P. 256-260.

40. Decaudin D. Peripheral Benzodiazepine Receptor Ligands Reverse Apoptosis Resistance of Cancer Cells in Vitro and in Vivo / Decaudin D., Castedo M., Nemati F. et al. // Cancer Res.-2002.-Vol. 62.-P.1388.

41. Dietrich D.R. Toxicological and pathological applications of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), a novel endogenous marker for cell proliferation / Dietrich D.R. // Crit. Rev. Toxicol. 1993.- Vol. 23.- P.77-109.

42. Dumaz N. In Melanoma, RAS Mutations Are Accompanied by Switching Signaling from BRAF to CRAF and Disrupted Cyclic AMP Signaling / Dumaz N., Hayward R., Martin J. et al. // Cancer Res.-2006.-Vol. 66.-P. 9483.

43. Eisen T. Phase I trial of sorafenib (BAY 43-9006) combined with dacarbazine (DTIC) in patients with metastatic melanoma / Eisen T., Ahmad T., Marais R., et al. // Eur. J. Cancer Suppl.-2005.-Vol.3.-P.349.

44. Ellerhorst J.A. Clinical Correlates of NRAS and BRAF Mutations in Primary Human Melanoma / Ellerhorst J.A., Greene V.R., Ekmekcioglu S. et al. // Clin. Cancer Res.-2011.-Vol. 17.-P. 229.

45. Fafalios A. Translocator protein blockade reduces prostate tumor growth // Fafalios A., Akhavan A., Parwani A.V., et al. // Clin. Cancer Res. 2009.- Vol. 15.-P. 6177-6184.

46. Fan J. Translocator Protein 2 Is Involved in Cholesterol Redistribution during Erythropoiesis / Fan J, Rone M.B, Papadopoulos V. // J. of Biological Chemistry.-2009.-Vol. 284.-P.30484-30497.

47. Fecher L.A. Effectively targeting BRAF in melanoma: a formidable challenge / Fecher L.A, Amaravadi R, Schuchter L.M. // Pigment Cell Melanoma Res. -2008.-Vol. 21.-P.410-1.

48. Ferreira C.G. Apoptosis: Target of Cancer Therapy / Ferreira C.G, Epping M, Kruyt F.A.E. et al. // Clin. Cancer Res. -2002.-Vol. 8.-P. 2024 2034.

49. Flaherty K.T. Narrative Review: BRAF Opens the Door for Therapeutic Advances in Melanoma / Flaherty K.T. // Ann. Intern. Med. 2010. - Vol.153. -P. 587-591.

50. Flaherty K.T. Chemotherapy and targeted therapy combinations in advanced melanoma / Flaherty K.T. // Clin. Cancer Res.-2006.-Vol. 12.-2366-2370.

51. Gottesman M. M. Mechanisms of cancer drug resistance / Gottesman M. M. // Annu. Rev. Med. 2002.-Vol.53.-P. 615 -627.

52. Grossman D. Drug resistance in melanoma: mechanisms, apoptosis, and new potential therapeutic agents / Grossman D, Altieri D. C. // Cancer Metastasis Rev. 2001.-Vol.20.-P.3 -11.

53. Goldie J.H. Drug resistance in cancer: a perspective / Goldie J.H. // Cancer Metastasis Rev. 2001.-Vol. 20. - P.63 -68.

54. Garbe C. Systematic Review of Medical Treatment in Melanoma: Current Status and Future Prospects / Garbe C, Eigentler T.E, Keilholz U. et al. // The Oncologist.-2011.-Vol. 16- P.5-24.

55. Garbe C. Diagnosis and treatment of cutaneous melanoma: state of the art 2006 / Garbe C., Eigentler T.K. // Melanoma Res. 2007.-Vol.-17.-P.l 17-27.

56. Grabe C. Chemotherapy and chemoimmunotherapy in disseminated malignant melanoma / Grabe C. // Melanoma Res.- 2002 .- Vol. 2.-P. 291 -299.

57. Greenlee R.T. Cancer statistics / Greenlee R.T., Murray T., Bolden S. et al. // CA Cancer J. Clin. 2000. - Vol. 50. - P.7-33.

58. Grange J.M. Immunotherapy for malignant melanoma—tracing Ariadne's thread through the labyrinth / Grange J.M., Krone B., Stanford J.L. // Eur. J. Cancer. 2009. - Vol. 45. - P. 2266-73.

59. Jemal A. Recent trends in cutaneous melanoma incidence among whites in the United States / Jemal A., Devesa S.S., Hartge P. et al. // J. Natl. Cancer Inst.-2001.-Vol. 93.- P.678-668.

60. Hanahan D. The hallmarks of cancer / Hanahan D., Weinberg R.A. // Cell.-2000.-Vol.l00.-P.57-70.

61. Hingorani S.R. Suppression of BRAF(V599E) in human melanoma abrogates transformation / Hingorani S.R., Jacobetz M.A., Robertson G.P. et al. // Cancer Res.- 2003.- Vol.63.- P. 5198-5202.

62. Helmach H. Drug-resistance in human melanoma / Helmach H., Rossmann E., KernM. A. et al. //Int. J. Cancer.-2001.-Vol. 93.-P. 617 -622.

63. Helmach H. Drug resistance towards etoposide and cisplatin in human melanoma cells is associated with drug-dependent apoptosis deficiency /

64. Helmach H., Kern M. A., Rossmann E. et al. // J. Investig. Dermatol. 2002.-Vol.18.-P. 923-932.

65. Hemmings D.H. Cutaneous Melanoma in a Multiethnic Population Is This a Different Disease? / Hemmings D.H., Johnson S., Tominaga G.T. et al. // Arch. Surg. 2004.-Vol.l39.-P.968-973.

66. Huang D. Inhibition of MAPK Kinase Signaling Pathways Suppressed Renal Cell Carcinoma Growth and Angiogenesis In vivo / Huang D., Ding Y., Luo W-M. et al. // Cancer Res. 2008.- Vol. 68,- P.81 - 88.

67. Hirsch T. PK11195, a ligand of the mitochondrial benzodiazepine receptor, facilitates the induction of apoptosis and reverses Bcl-2-mediated cytoprotection / Hirsch T., Decaudin D., Susin S. A. et al. // Exp. Cell Res. -1998. Vol. 241. - P.426-434.

68. Hersey P. Apoptosis and melanoma: how new insights are effecting the development of new therapies for melanoma / Hersey P. // Curr. Opin. Oncol.-2006.-Vol.18.-P. 189-196.

69. Hofbauer G.F. Fas ligand reduces viability in primary melanoma short-term cell cultures more than in metastatic melanoma short-term cell cultures / Hofbauer G.F., Hatta N., Daigle I. et al. // Dermatology.- 2005.- Vol. 211.-P.318-324.

70. Hocker T.L. Melanoma genetics and therapeutic approaches in the 21st century: moving from the benchside to the bedside / Hocker T.L., Singh M.K., Tsao H. // J. Invest. Dermatol. 2008.-Vol. 128.- P. 2575-95.

71. Keiran S.M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases / Keiran S.M., Haass N.H., Brafford P.A. et al. // Mol. Cancer Ther.- 2006.-Vol.5.-P.l 136-44.

72. Kirsner R.S. The Association of Medicare Health Care Delivery Systems With Stage at Diagnosis and Survival for Patients With Melanoma / Kirsner R.S., Wilkinson J.D., Ma F. et al. //Arch. Dermatol.- 2005.- Vol. 141. -P.753-757.

73. Kato T. Improvement in survival rate of patients with acral melanoma observed in the past 22 years in Sendai / Kato T., Suetake T., Sugiyama Y. et al. // Japan. Clin. Exp. Dermatol.- 1993.-Vol.l8.-P.107-110.

74. Karbowniczek M. mTOR is activated in the majority of malignant melanomas / Karbowniczek M., Spittle C.S., Morrison T. et al. // J. Invest. Dermatol.- 2008.-Vol. 128.-P. 980-987.

75. Kumar R. BRAF mutations are common somatic events in melanocytic nevi / Kumar R., Angelini S., Snellman E. et al. // J. Invest. Dermatol.- 2004.- Vol.-122.-P. 342-8.

76. Kane R.C. Sorafenib for the treatment of advanced renal cell carcinoma / Kane R.C., Farrell A.T., Saber H., et al. // Clin. Cancer Res.- 2006.-Vol.12.-P.7271-8.

77. Kalkhoran S. Historical, Clinical, and Dermoscopic Characteristics of Thin Nodular Melanoma / Kalkhoran S., Milne O., Zalaudek I. et al. // Arch. Dermatol.-2010.-Vol. 146.-P.311-318.

78. Kumar S.M. Mutant V600E BRAF Increases Hypoxia Inducible Factor-la Expression in Melanoma / Kumar S.M., Yu H., Edwards R. et al. // Cancer Res.-2007.-Vol. 67.-P. 3177.

79. Kugler W. Ligands of the mitochondrial 18 kDa translocator protein attenuate apoptosis of human glioblastoma cells exposed to erucylphosphohomocholine / Kugler W., Veenman L., Shandalov Y. et al. // Cell Oncol. 2008. - Vol. 30. -P.435-50.

80. Kroemer G. Mitochondrial control of apoptosis / Kroemer G., Zamzami N., Susin S. A. //Immunol. Today. 1997. - Vol. 18. - P. 44-51.

81. Liu W. Rate of growth in melanomas: characteristics and associations of rapidly growing melanomas / Liu W., Dowling J.P., Murray W.K. et al. // Arch. Dermatol. 2006.-Vol.l42(12).-P.1551-1558.

82. Levin E. The peripheral-type benzodiazepine receptor and tumorigenicity: isoquinoline binding protein (IBP) antisense knockdown in the C6 glioma cell line. Levin E., Premkumar A., Veenman L. Et al. // Biochemistry. 2005. -Vol. 44.- P.9924-35.

83. Lage H. Modulation of DNA topoisomerase II activity and expression in melanoma cells with acquired drug resistance / Lage H., Helmach H., Dietel M. et al. // Br. J. Cancer.- 2000.-Vol. 82.- P. 488 -491.

84. Lindholm C. Invasive cutaneous malignant melanoma in Sweden, 1990-1999: a prospective, population-based study of survival and prognostic factors / Lindholm C., Andersson R., Dufmats M., et al. // Cancer.-2004.-Vol. 101.-P.2067-2078.

85. Lorigan P. Systemic therapy for metastatic malignant melanoma—from deeply disappointing to bright future? // Lorigan P., Eisen T., Hauschild A. // Exp. Dermatol. 2008. - Vol. 17. - P.383-94.

86. Liem A.A. The role of signal transduction in cancer treatment and drug resistance / Liem A.A., Chamberlain M. P., Wolf C. R. et al. // Eur. J. Surg. Oncol.- 2002.-Vol. 28.-P. 679 -684.

87. Lev D.C. Exposure of Melanoma Cells to Dacarbazine Results in Enhanced Tumor Growth and Metastasis In Vivo / Lev D.C., Onn A., Melinkova V.O. et al. // J. of Clin. Oncol. 2004.-Vol. 22 No 11.- P.2092-2100.

88. Liao Y-H. ARMS Depletion Facilitates UV Irradiation-Induced Apoptotic Cell Death in Melanoma / Liao Y-H., Hsu S-M., Huang P-H. // Cancer Res.-2007.-Vol. 67.-P. 11547 11556.

89. Libra M. Analysis of BRAF mutation in primary and metastatic melanoma / Libra M., Malaponte G., Navolanic P.M. et al. // Cell Cycle. -2005.- Vol. 4.-P. 1382-4.

90. Liu D. Suppression of BRAF/MEK/MAP Kinase Pathway Restores Expression of Iodide-Metabolizing Genes in Thyroid Cells Expressing the V600E BRAF Mutant / Liu D., Hu S., Hou P. et al. // Clin. Cancer Res.- 2007,-Vol.13.-P.1341.

91. Losina E. Visual Screening for Malignant Melanoma. A Cost-effectiveness Analysis / Losina E., Walensky R.P., Geller A. et al. // Arch. Dermatol. 2007.-Vol. 143.-P.21-28.

92. Maaser K. Overexpression of the peripheral benzodiazepine receptor is a relevant prognostic factor in stage III colorectal cancer // Maaser K., Grabowski P., Sutter A.P., et al // Clin. Cancer Res.- 2002,- Vol. 8.- P. 3205-3209.

93. Melck A.L. The Utility of BRAF Testing in the Management of Papillary Thyroid Cancer / Melck A.L., Yip L., Carty S.E. // The Oncologist. 2010. -Vol. 15.-P.1285-1293.

94. Mercer K.E. Raf proteins and cancer: BRAF is identified as a mutational target / Mercer K.E., Pritchard C.A. // Biochim. Biophys. Acta.- 2003.-Vol. 1653.-P. 25-40.

95. Maldonado J.L. Determinants of BRAF Mutations in Primary Melanomas / Maldonado J.L., Fridlyand J., Patel H. et al. // J. Natl. Cancer Inst.-2003.-Vol.95.-P. 1878 1890.

96. Martindale J.L. Cellular response to oxidative stress: signaling for suicide and survival / Martindale J.L., Holbrook N.J. // J. Cell Physiol. 2002. - Vol. 192.-P. 1-15.

97. Middleton M.R. Randomized Phase III study of temozolomide versus dacarbazine in the treatment of patients with advanced metastatic malignant melanoma / Middleton M.R., Grob J.J., Aaronson N., et al // J. Clin. Oncol.-2000.- Vol. 18. P.158-166.

98. Mills C. Ro5-4864 promotes neonatal motor neuron survival and nerve regeneration in adult rats / Mills C., Makwana M., Wallace A. et al. // Eur. J. Neurosci. 2008. - Vol. 27. - P. 937-946.

99. Michaloglou C. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi / Michaloglou C., Vredeveld L.C., Soengas M.S. et al. // Nature. 2005. - 436. -P. 720-4.

100. Nagasaka T. Colorectal Cancer With Mutation in BRAF, KRAS, and Wild-Type With Respect to Both Oncogenes Showing Different Patterns of DNA Methylation / Nagasaka T, Sasamoto H, Notohara K. et al. // J. Clin. Oncol. 2004. - Vol. 22. - P. 4584 - 4594.

101. Olson J. M. Presence of peripheral-type benzodiazepine binding sites on human erythrocyte membranes / Olson J. M, Ciliax B. J, Mancini W. R. Et al. //Eur. J. Pharmacol. -1988. Vol.152.-P. 47-53.

102. Okaro A.C. Pklll95, a mitochondrial benzodiazepine receptor antagonist, reduces apoptosis threshold in Bcl-XL and Mcl-1 expressing human cholangiocarcinoma cells / Okaro A.C., Fennell D.A, Corbo M. et al. // Gut. -2002.-Vol. 51.-P.556 561.

103. Peli J. Oncogenic Ras inhibits Fas ligand-mediated apoptosis by downregulating the expression of Fas / Peli J, Schroter M, Rudaz C. et al. // EMBO J. 1999.- Vol. 18.-P. 1824-1831.

104. Poetsch M. Can different genetic changes characterize histogenetic subtypes and biologic behaviour in sporadic malignant melanoma of the skin? / Poetsch M, Dittberner T, Woenckhaus C. // Cell Mol. Life Sei. -2003.-Vol. 60(9).-P. 1923-1932.

105. Pepkorn M. The Spitz nevus is melanoma / Pepkorn M. // Am. J. Dermatopathol. 2005.-Vol. 27.-P.367-9.

106. Pretner E. Cancer-related Overexpression of the Peripheral-type Benzodiazepine Receptor and Cytostatic Anticancer Effects of Ginkgo biloba Extract (EGb 761) / Pretner E, Amri H, Li W. et al. // Anticancer Res. 2006.-Vol. 26.-P. 9-22.

107. Pollock P.M. High frequency of BRAF mutations in nevi / Pollock P.M., Harper U.H, Hansen K.S et al. //Nat. Genet. 2002.-Vol. 33.-P.19 - 20.

108. Ribble D. A simple technique for quantifying apoptosis in 96-well plates / Ribble D., Goldstein N.B., Norris D.A. et al. // BMC Biotechnol. -2005. -Vol. 5. P.12.

109. Ries L.A. The annual report to the nation on the status of cancer, 19731997, with a special section on colorectal cancer / Ries L.A., Wingo P.A., Miller D.S. et al. // Cancer.- 2000.-Vol.-88. P.2398-424.

110. Rigel D.S. ABCDE—An Evolving Concept in the Early Detection of Melanoma / Rigel D.S., Friedman R.J., Kopf A.W. et al. // Arch. Dermatol. -2005,-Vol. 141 .-P. 1032-1034.

111. Runger T. Alterations of DNA repair in melanoma cell lines resistant to cisplatin, fotemustine, or etopside / Runger T., Emmert S., Schadendorf D. et al. // J. Investig. Dermatol. 2000. - Vol.114.-P. 34 -39.

112. Shinozaki M. Incidence of BRAF oncogene mutation and clinical relevance for primary cutaneous melanomas / Shinozaki M., Fujimoto A., Morton D.L. et al. // Clin. Cancer Res. 2004.-Vol.10.-P. 1753-7.

113. Solit D.B. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition / Solit D.B., Garraway L.A., Pratilas C.A. et al. //Nature.- 2006.-Vol. 439.-P.358-62.

114. Smalley K.S.M. Increased cyclin D1 expression can mediate BRAF inhibitor resistance in BRAF V600E-mutated melanomas / Smalley K.S.M., Lioni M., Dalla Palma M. et al. // Mol. Cancer Ther.-2008.- Vol.7.-P. 2876.

115. Smalley K.S.M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases Smalley K.S.M., Haass N.K., Brafford P.A. et al. // Mol. Cancer Ther.-2006.-Vol.5.-P.1136.

116. Salvetti F. Effect of noise exposure on rat cardiac peripheral benzodiazepine receptors / Salvetti F., Chelli B., Gesi M. et al. // Life Sci.-2000.- Vol. 66.-P.1165-75.

117. Satyamoorthy K. Constitutive mitogen-activated protein kinase activation in melanoma is mediated by both BRAF mutations and autocrine growth factor stimulation / Satyamoorthy K., Li G., Gerrero M.R. et al. // Cancer Res.- 2003.- Vol.-63.-P.756-9.

118. Shinozaki M. Incidence of BRAF Oncogene Mutation and Clinical Relevance for Primary Cutaneous Melanomas / Shinozaki M., Fujimoto A., Morton D.L. et al. // Clin. Cancer Res. 2004.-Vol. 10.-P. 1753 - 1757.

119. Stahl J.M. Loss of PTEN Promotes Tumor Development in Malignant Melanoma / Stahl J.M., Cheung M., Sharma A. et al. // Cancer Res. 2003.-Vol.63.-P.2881-2890.

120. Solit D.B. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition / Solit D.B., Garraway L.A., Pratilas C.A., et al. //Nature.- 2006.-Vol. 439.-P.358-62.

121. Stahl J.M. Deregulated Akt3 activity promotes development of malignant melanoma / Stahl J.M., Sharma A., Cheung M. et al. // Cancer Res.-2004.-Vol.64.-P. 7002-7010.

122. Sharma A. Mutant V599EB-Raf regulates growth and vascular development of malignant melanoma tumors / Sharma A., Trivedi N.R., Zimmerman M.A. et al. // Cancer Res.- 2005.-Vol.65.-P.2412-2421.

123. Smalley K.S. Increased cyclin D1 expression can mediate BRAF inhibitor resistance in BRAF V600E-mutated melanomas / Smalley K.S., Lioni M., Palma M.D. et al. // Mol. Cancer Ther. 2008. - Vol. 7. - P. 2876-2883.

124. Soengas M.S. Apoptosis and melanoma chemoresistance / Soengas M.S., Lowe S.W. // Oncogene.- 2003.-Vol. 22.-P. 3138-3151.

125. Strand S. Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (APO-l/Fas) ligand-expressing tumor cells—a mechanism of immune evasion / Strand, S., Hofmann W. J., Hug H. et al. //Nat. Med. 1996.- Vol.2.- P.1361-1366.

126. Soengas M. S. Inactivation of the apoptosis effector Apaf-1 in malignant melanoma / Soengas M. S., Capodieci P., Polsky D. et al. // Nature.-2001.-Vol. 409.-P.207-211.

127. Serrone L., Hershey P. The chemoresistance of human malignant melanoma: an update//Melanoma Res.-1999.-Vol.3.-P. 51 -58.

128. Skatrud P.L. The impact of multiple drug resistance (MDR) proteins on chemotherapy and drug discovery / Skatrud P. L. // Prog. Drug Res. 2002.-Vol. 58.-P. 99-131.

129. Sieben N.L. In ovarian neoplasms, BRAF, but not KRAS, mutations are restricted to low-grade serous tumours / Sieben N.L., Macropoulos P., Roemen G.M. et al. // J. Pathol.- 2004.-Vol. 202.-P.336-40.

130. Sekulic A. Malignant melanoma in the 21st century: the emerging molecular landscape // Sekulic A., Haluska P., Miller A.J. et al. // Mayo Clin. Proc. 2008. - Vol. 83. - P.825-46.

131. Tang D. Quantitative Preclinical Imaging of TSPO Expression in Glioma Using N,N-Diethyl-2-(2-(4-(2-l 8F-Fluoroethoxy)Phenyl)-5,7

132. Dimethylpyrazolol,5-a.Pyrimidin-3-yl)Acetamide // Tang D., Hight M.R., McKinley E.T. et al. II J. Nucl. Med.- 2012.- Vol.53.- P.287-294.

133. Tas F. Malignant Melanoma in Turkey: A Single Institution's Experience on 475 Cases / Tas F., Kurul S., Camlica H. et al. // Jpn. J. Clin. Oncol. 2006.-Vol. 36.- P. 794 - 799.

134. Tannock I.F. Tumor physiology and drug resistance / Tannock I. F. // Cancer Metastasis Rev.- 2002.-Vol. 20.-P.123 -132.

135. Torres L.F. Analysis of PCNA, p53, and bcl-2 Expression in the Sequence Primary Acquired Melanosis-Conjunctival Melanoma / Torres L.F., Sänchez-Suarez P., Rodriguez-Reyes A.A. et al. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2005. - Vol.46. - P. 3409.

136. Tuveson D.A. BRAF as a potential therapeutic target in melanoma and other malignancies / Tuveson D.A., Weber B.L., Herlyn M. et al. // Cancer Cell.- 2003.-Vol.4.-P.95-8.

137. Uribe P. BRAF mutation: a frequent event in benign, atypical, and malignant melanocytic lesions of the skin / Uribe P., II Wistuba, Gonzalez S. II Am. J. Dermatopathol.- 2003.-Vol. 25.-P.3 65-70.

138. Veenman L. Channel-like functions of the 18-kDa translocator protein (TSPO): regulation of apoptosis and steroidogenesis as part of the host-defense response / Veenman L., Papadopoulos V., Gavish M.// Curr. Pharm. Des.-2007,-Vol. 13.-P. 2385-405.

139. Vrabec J.P. Cell-Type-Specific Opening of the Retinal Ganglion Cell Mitochondrial Permeability Transition Pore / Vrabec J.P., Lieven C.J., Levin L.A. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2003.- Vol. 44.- P. 2774.

140. Wajant H. CD95L/FasL and TRAIL in tumour surveillance and cancer therapy / Wajant H. // Cancer Treat. Res. 2006. - Vol.l30.-P.141-165.

141. Woods M. J. Multiple forms and locations for the peripheral-type benzodiazepine receptor / Woods M. J., Williams D. C. // Biochem. Pharmacol. -1996.-Vol. 52.-P.l 805-1814.

142. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer / Xing M. // Endocr. Relat. Cancer.-2005.-Vol.12.-P. 245-62.

143. Yazdi A.S. Mutations of the BRAF gene in benign and malignant melanocytic lesions / Yazdi A.S., Palmedo G., Flaig M.G. et al. // J. Invest. Dermatol.-2003.-Vol. 121.-P. 1160-2.

144. Zavala F. A monoclonal antibody against peripheral benzodiazepine receptor activities the human neutrophil NADPH-oxidase / Zavala F., Masson A., Brys L. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991.- Vol.176. -P. 1577-1583.

Информация о работе

Гырылова, Светлана Николаевна
кандидата медицинских наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Роль Translocator protein (TSPO) в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток при BRAF-положительной меланоме кожи - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Роль Translocator protein (TSPO) в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток при BRAF-положительной меланоме кожи - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы