Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий

Грачев, Дмитрий Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий"

□О34иои I —

На правах рукописи

ГРАЧЕВ ДМИТРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры

митохондрий.

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Пущино - 2009

003488079

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Азарашвмли Тамара Сергеевна

Официальные доктор медицинских наук, профессор

оппоненты: Маевский Евгений Ильич

доктор биологических наук, профессор Сергеева Марина Глебовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится « гз _» ^^-2009 г. в И "^часов на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, д. 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, д. 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан « 23 » _ноября 2009 г.

Ученый секретарь л

/ /

диссертационного совета __ ^//^.ССС

кандидат физ.-мат. наук / Ланина Надежда Федоровна.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Бензодиазепины (БД) являются широко применяющимися в клинике соединениями, действие которых опосредовано через специфические, связывающие места - бензодиазепиновые рецепторы: центральный бензодиазепиновый рецептор, локализованный в центральной нервной системе (ЦНС), и периферический (PBR), функционирующий вне ЦНС. В последние годы PBR рассматривают в качестве терапевтической мишени при лечении таких заболеваний как эпилепсия, болезнь Альцгеймера, церебральная ишемия. Экспрессия PBR при различных патологиях, по-видимому, связана с нарушением его многочисленных биологических функций, таких как: регуляция клеточной пролиферации, дифференциации и апоптоза, стероидогенез и транспорт холестерина, биосинтез гема и транспорт порфирина. Следует отметить, что лимитирующие стадии стероидогенеза и биосинтеза гема протекают в митохондриях (Мх). Установлено, что уровень PBR в клетках повышается при опухолевой трансформации в клетках легких, кишечника, гортани, яичника простаты, нейробластомы, глиомы, гепатокарциномы, опухолевых клетках молочной железы. В клетке PBR локализован во внешней мембране Мх, концентрируясь в контактных сайтах. PBR представляет собой тримерный комплекс, состоящий из 18 кДа белка, названного недавно белок-транслокатор (TSPO), потенциал-зависимого анионного канала (VDAC) и переносчика адениновых нуклеотидов (ANT). При изучении PBR широко используют его высокоафинные лиганды как искусственные - РКП 195 и Ro 5-4864, так и эндогенные - холестерин, протопорфирин и DBI (ингибитор связывания диазепама).

Следует отметить, что белки, формирующие комплекс PBR/TSPO (VDAC, TSPO и ANT) вместе с циклофилином D до недавнего времени рассматривали как основу неспецифической Са2+-индуцируемой и циклоспорин-чувствительной поры (РТР), которая формируется во внутренней мембране Мх при достижении сверхпороговых концентраций кальция в Мх. Однако эксперименты, выполненные на мышах с выключенными генами VDAC и ANT, показали, что эти два белка не формируют структуру поры. Функционирование РТР рассматривают как начальную стадию программируемой гибели клеток (апоптоза). Таким образом, несмотря на

многолетние исследования, к настоящему моменту точный состав поры не установлен, так же как и механизм регуляции ее функционирования. Эта ситуация усугублялась тем фактом, что наряду с сомнением относительно структурной роли VDAC и ANT в РТР, отсутствовали данные, подтверждающие непосредственное участие TSPO в функционировании РТР. В дополнение к выявлению структурного состава РТР, большое значение имеет понимание механизма регуляции функционирования РТР. В связи с этим, стоит напомнить, что TSPO, VDAC и белки семейства Вс1-2 подвержены РКА-зависимому фосфорилированию. Ранее в нашей лаборатории были обнаружены мембраносвязанные фосфобелки Мх печени и мозга, уровень фосфорилирования которых коррелирует с открытием РТР. Эти данные позволили нам предположить существование механизма регуляции функционирования РТР, опосредованного фосфорилированием/ дефосфорилированием белков Мх, осуществляемым протеинкиназами/ протеинфосфатазами.

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным:

1. Выяснить уровень TSPO в Мх, изолированных из тканей мозга, первичной культуры астроцитов и клеток глиомы С6, установить молекулярную форму (мономер-димер), в которой TSPO присутствует в этих митохондриях.

2. Выявить степень непосредственного вовлечения TSPO в функционирование РТР с использованием антител, выработанных к TSPO, и проведением экспериментов на митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6, с пониженным содержанием TSPO (нокдаун).

3. Исследовать влияние TSPO и его лигандов на начальные стадии апоптоза, а также роли TSPO в регуляции РТР посредством TSPO-модулируемого фосфорилирования белков в Мх мозга и астроцитов.

Цель и основные задачи исследования.

Целью настоящей работы было выявление непосредственного участия TSPO в функционировании РТР, а также вовлечение TSPO и его лигандов в регуляцию РТР.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Определить содержание TSPO в митохондриях методом Western blot и выявить форму (мономер/димер), в которой TSPO присутствует в митохондриях,

изолированных из мозга крыс, первичной культуры астроцитов и клеток глиомы Сб. Сравнить уровень TSPO в этих митохондриях.

2. Методом иммунопреципитации установить возможное прямое взаимодействие TSPO с ANT в митохондриях мозга в присутствии пороговых концентраций Са2+, инициирующих открытие РТР.

3. Изучить влияние синтетических (РКП 195 и Ro 5-4864) и эндогенных (протопорфирин IX и ингибитор связывания диазепама) лигандов TSPO на параметры, характеризующие открытие РТР (скорости входа и выхода Са2+, величину мембранного потенциала и выход апоптогенных факторов (цитохром с и AIF) в присутствии пороговых концентраций Са:+, индуцирующих открытие РТР, и в присутствии блокатора РТР - циклоспорина А).

4. Выявить непосредственное участие TSPO в функционировании РТР, исследуя влияние специфических антител, выработанных к TSPO, на параметры открытия РТР.

5. Исследовать влияние снижения уровня экспрессии TSPO в клетках глиомы С6 на параметры РТР и сравнить их характеристики РТР в Мх, изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа

6. Исследовать участие TSPO в инициации выхода про-апоптотических факторов из митохондрий (AIF и цитохром с).

7. Исследовать влияние лигандов TSPO на фосфорилирование мембраносвязанных белков Мх в условиях индукции РТР.

Научная новизна.

В рамках выполнения диссертации впервые детально исследовано влияние лигандов TSPO (экзогенных и эндогенных) на параметры открытия РТР. Установлены формы, в которых TSPO присутствует в Мх мозга, астроцитов и клеток культуры глиомы Сб. Впервые показано, что во время открытия митохондриальной поры TSPO колокализуется с ANT и TSPO непосредственно принимает участие в высвобождении AIF. В экспериментах на изолированных Мх мозга с использованием антител, выработанных к TSPO, и в экспериментах, проведенных на изолированных Мх из клеток глиомы С6 (дикий тип, нокдаун), подтверждено непосредственное участие TSPO в функционировании РТР.

Обнаружена способность лигандов модулировать TSPO-регулируемое фосфорилирование белков Мх мозга и астроцитов.

Научно-практическая ценность.

Выявление новых фосфорилированных белков митохондрий мозга и корреляции между уровнем их фосфорилирования и индукцией неселективной митохондриальной поры указывает на существование нового механизма регуляции РТР. Обнаружено, что при опухолевой трансформации уровень TSPO повышается и появляются олигомерные формы TSPO, что является важным для понимания развития патологий, и может быть использовано в качестве опухолевого маркера. Обнаруженны различия в механизмах действия лигандов TSPO, что подтверждает важность исследований применительно к клинической практике в области терапии опухолей, нейродегенеративных заболеваний и открывает путь к разработке новых лекарственных соединений.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2007, 2009), XIV Европейской конференции биоэнергетиков (Москва, 2006), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Конгрессе Нейронаука для медицины и психологии (Судак, 2007, 2008), 5th International Symposium «Neuroprotection and Neurorepair Cerebral Ischemia and Stroke» (Магдебург, Германия, 2008).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 6 статей и 12 тезисов.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на_страницах машинописного текста и состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка

цитируемой литературы ( _ ссылок). Диссертация иллюстрирована _

Рисунками и_Таблицами.

МЕТОДЫ

Выделение Мх мозга крыс линии Вистар проводили методом стандартного дифференциального центрифугирования, несииаитические Мх мозга крыс очищали в градиенте плотностей Percoll. (Sims, 1990).

Мх из первичной культуры астроцитов (10-12 дневная культура), а также Мх из клеток глиомы С6 (дикого типа и нокдауна) выделяли по методу Almeida (Almeida, Medina, 1997) в нашей модификации.

Клетки глиомы Сб (TSPO нокдаун), дефицитные по TSPO (TSPO-нокдаун) были предоставлены профессором Gavish М. (Израиль).

Содержание белка в суспензии митохондрий определяли по методу Bradford

Для разделения митохондриальных белков применяли электрофорез в ПААГ (10-15%) в присутствии SDS в системе Лэммли (Laemmli, 1970). Фосфорилирование белков в Мх проводили по методу, разработанному в нашей лаборатории (Азарашвили, 1999).

Для получения авторадиограмм гели экспонировали 3-4 дня на рентгеновской плёнке Kodak X-Omat AR-5 (Sigma, США). Оптическую плотность рентгеновских плёнок в зоне локализации [у-32Р]АТР-меченых белков определяли с помощью сканирующего денситометра фирмы «BioRad».

Иммуноблот и нммунопреципнтацню проводились по стандартным методикам, перенос осуществляли на нитроцеллюлозную мембрану (0.2 мкм), для детекции белков использовали стандартные коммерческие антитела, визуализацию проводили при помощи системы ECL/H202.

Функциональное состояние митохондрий оценивали с помощью ТРР+-чувствительного электрода (Като, 1989), Са2+-селективного электрода и кислородного электрода Кларка. Митохондрии (1 мг белка/мл среды) инкубировали при комнатной температуре в изотонической среде, содержащей 10 мМ Tris-HCll (pH 7.4), 125 мМ KCL, 0.4 мМ КН2Р04, 5 мМ сукцинат калия и 2 цг/мл ротенон.

Иллюстрации: на Рисунках показаны результаты типичных экспериментов, на диаграммах представлены средние данные из 5-ти экспериментов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Идентификация TSPO в Мх различных тканей и идентификация его белков-партнеров.

Несмотря на многолетние исследования TSPO по связыванию лигандов и вовлечения его в многочисленные функции, не была проведена его детекция в Мх мозга и не была установлена его молекулярная форма, в которой TSPO находится в Мх. Поэтому содержание TSPO в Мх, изолированных из мозга, культуры астроцитов и клеток глиомы Сб, было определено при помощи проведения Western Blot анализа после электрофоретического разделения аликвот Мх (Рис. I). В эксперименте были использованы антитела, выработанные к 9-27 аминокислотным остаткам N-конца TSPO.

37 20 ■

■TSPO

\!\ .Mi Мх Mfnril Астр. Глиомы С 6

Рис. 1. Идентификация TSPO в Мх мозга крысы и культуре глиомы С6 и копреципитация ANT и TSPO.

Панель А - Мх мозга, панель Б -Мх астроцитов, панель В - Мх изолированные из глиомы С6 дикого типа. Панель Г. Копреципитация ANT и TSPO. 1 - лизат Мх, изолированных из мозга крысы. 2 -иммунопреципитат с антителами к TSPO Ab. 3 - иммунопреципитат с неспецифическими IgG антителами.

Слева стрелками указаны молекулярные маркеры.

Лтаг Мх м<пг:|

IUI с and TSPO

all I II 1С. I ¡141!

Ш1 с

Ш'1тп|[ф i: 'K-.Kii ч ;i

Было установлено, что TSPO находится в Мх мозга (панель А) и в Мх астроцитов (панель Б) в виде одной иммунно-реактивной полосы на уровне 18-20 кДа, что соответствует мономерной форме TSPO. В Мх, изолированных из клеток глиомы С6 (панель В), наблюдается несколько полос (на уровне 18, 36 и в области 70-80 кДа). Это указывает на существование не только мономеров, но димеров и олигомеров TSPO в этих митохондриях, в формировании которых, возможно, участвует N-конец TSPO. Поскольку клетки глиомы представляют собой

разновидность трансформированных агрессивных опухолевых клеток, в которых увеличена экспрессия TSPO, то обнаружение полимерных форм TSPO, возможно, согласуется с развитием опухолей или со степенью их агрессивности.

До недавнего времени основными структурными элементами РТР с читались VDAC внешней мембраны, ANT внутренней мембраны и циклофилин Д матрикса Мх. С другой стороны, при выделении хроматографически очищенного комплекса PBR было обнаружено, что PBR является тримерным комплексом, состоящим из 18 кДа белка, связывающего изохинолины, VDAC и ANT. Однако не была установлена возможная ассоциация 18 кДа белка (TSPO) с ANT во время функционирования РТР. Поскольку такие данные могли бы подтвердить структурную роль TSPO в РТР, была проведена иммунопреципитация TSPO в изолированных Мх мозга и проверена его колокализация с ANT. На панели Г показаны результаты иммунопреципитации белков Мх мозга крысы со специфическими поликлональными антителами к TSPO, которые демонстрируют, что антитела к TSPO способны осаждать ANT из митохондриального лизата (средний трек на панели Г). Таким образом, можно сделать вывод, что TSPO колокализуется с ANT в условиях открытой поры, указывая на непосредственное взаимодействие белков в этих условиях.

Глава 2. Влияние экзогенных и эндогенных лигандов TSPO на открытие РТР.

На следующем этапе исследования было выяснено влияние лигандов TSPO на основные параметры РТР.

2.1. Определение митохондриальных параметров.

450 0.7

400 0.6 •

350 0-5

О ^ зоо В 150 1 0.4 + * а. {Е W '

J00 0.2

150 0.1 <

100 0.0 •

--- - С1*

— ГРР* - охукси

Рисунок 2. Определение митохондриальных функций при Са2+-индуцируемом открытии РТР.

Стрелками указано время добавок. Основные параметры транспорта Са2+ схематически указаны на кривых.

На Рисунке 2 показана типичная картина изменения митохондриальных характеристик в условиях открытия/закрытия РТР при импульсном добавлении Са2+ к суспензии изолированных Мх, таких как скорость падения мембранного потенциала (VTPP+out; нмольхмин"'хмг белка"1), АТР-индуцируемая реполяризация мембраны (VTPP+in; нмоль*мин"'хмг белка"1), скорость входа Са2+ (VCa2+in; нмоль><мин"'хмг белка"1), скорость выхода Са2+ (VCa2+out; нмольхмин"'хмг белка"1), лаг-фаза выхода Са2+ (AT)ag; с), а также скорость потребления кислорода в состоянии 3 (V02st.3; нмоль Охмин"'*мг белка"1) и состоянии 4 (V02st.4; нмоль Охмин"'хмг белка"1). Стрелками указано время добавок СаСЬ, 1 мМ MgATP, лигандов TSPO и т.д.

Добавление малых количеств Са2+ (60-80 нмоль/мг белка) к суспензии митохондрий (первая добавка кальция) сопровождается временным снижением Аум, в результате транспорта Са2+ в матрикс митохондрий, и последующим полным восстановлением мембранного потенциала после завершения аккумуляции Са2+ в матриксе. При дальнейшем добавлении Са2+ (вторая добавка, которая в сумме с первой отражает пороговую концентрацию) происходит необратимое падение трансмембранного потенциала и наблюдается выход из митохондрий ранее аккумулированного в них Са2+, вследствие индукции открытия во внутренней митохондриальной мембране неселективной поры (Рис. 2).

2.2. Влияние лигандов TSPO на индукцию РТР Мх мозга крысы.

Влияние лигандов TSPO на индукцию РТР в Мх не было исследовано до настоящего времени, за исключением единственной работы, выполненной на изолированных Мх сердца, в которой было показано, что 100-200 мкМ Ro 5-4864 и РКП 195 ускоряли набухание Мх (Chelli, 2001). Следует подчеркнуть, что константы сродства этих лигандов были определены в области наномолярных концентраций. Для исследований были выбраны четыре лиганда, два экзогенных -Ro 5-4864 и РКП 195 (агонист и антагонист TSPO соответственно) и два эндогенных лиганда - протопорфирин IX (PPIX) и DBI (ингибитор связывания диазепамов).

Для определения действующих концентраций данных лигандов были проведены серии экспериментов, аналогичных эксперименту, представленному на Рисунке 2.

Было найдено, что РКП 195 способен ингибировать открытие РТР, начиная с концентрации 10 нМ и максимально замедлять индукцию выброса Са2+ при концентрации 100 нМ (Рис 3 А). Однако при дальнейшем увеличении концентрации до 50 мкМ РКП 195 начинает действовать как активатор поры, что, можно объяснить неспецифическим связыванием с другими компонентами рецептора Мх кроме ТБРО.

Рис. 3. Влияние различных концентраций лигандов TSPO на индукцию РТР в Мх мозга крысы. Панель А - концентрационный эффект PKI 1195 на Мх мозга крыс, Панель Б - концентрационный эффект Ro 5-4864 на Мх мозга крыс, Панель В -концентрационный эффект DB1 на Мх мозга крыс. Панель Г - концентрационный эффект РР1Х на Мх мозга крыс.

Несмотря на высокое сродство Ro 5-4864 к TSPO (10-50 нМ согласно литературным данным), значительный его эффект на индукцию РТР и транспорт Са2+ наблюдается только в концентрациях выше 50 мкМ (Рис. 3 Б). Эндогенный лиганд DB1 (Рис 3 В) способен подавлять выброс Са:+ Мх мозга уже при концентрации порядка 100 нМ, дальнейшее повышение его концентрации не приводит к каким-либо значимым изменениям. PPIX был способен значимо стимулировать выход Са"+, начиная с концентрации 1 мкМ (Рис. 3 Г).

Исходя из данных, представленных на Рисунке 3, в дальнейших экспериментах PPIX, Ro 5-4864, РК11195 и DBI использовали в концентрациях 1, 50, 0,1 и 0,1 мкМ соответственно. Экзогенные лиганды TSPO - РКП 195 и Ro 5-4864, считающиеся агонистом и антагонистом рецептора, разнонаправлено действуют на Мх только при наномолярных концентрациях, в присутствии же микромолярных концентраций они являются индукторами РТР (Рис. 4 А и Б). Аналогичным образом (как РКП 195 и Ro 5-4864 соответственно) на Мх мозга крысы действуют DBI и PPIX. Типичные эффекты лигандов TSPO на индукцию РТР в Мх мозга показаны на Рис 4, на котором видно, что PPIX при концентрации I мкМ ингибирует скорость входа Са2* на 40-55%, а лаг-фаза при этом уменьшается на 40-60%; Ro 54864 (50 мкМ) снижает скорость поглощения Са2+ на 40-60%, а лаг-фазу уменьшает на 10-40%. PKI 1195 (100 нМ), в свою очередь, ускоряет процесс входа Са2+ на 3060%, а лаг-фазу увеличивает на 25-35%, сходный эффект вызывает действие DBI (100 нМ).

Время, с Время, с

Рисунок 4. Типичные эффекты лигандов TSPO на индукцию РТР в Мх мозга крысы.

Панель А - эффект PPIX и Ro 5-4864; Панель Б - эффект DBI и PKI 1195.

Механизм воздействия лигандов PBR/TSPO на Мх пока не установлен. Однако известно, что PKI 1195, связывается с 18 кДа TSPO. Ro 5-4864 связывается с TSPO в меньших количествах, но сохраняет высокое сродство. Для его связывания необходимы другие компоненты PBR - VDAC и ANT. Механизм связывания РР1Х в настоящее время более ясен. Независимые работы показали, что кроме TSPO в его

связывании принимает участие ANT и VDAC, причем было показано, что PPIX с концентрации 2.5 мкМ закрывает канал VDAC, увеличивая тем самым проницаемость для Са3+, что приводит к ускорению открытия РТР.

Глава 3. Влияние антител к TSPO на открытие РТР в Мх мозга крысы.

3.1. Влияние антител к TSPO на функциональное состояние Мх мозга крысы.

На момент начала наших исследований вопрос о вовлечении TSPO в функционирование РТР являлся спорным. Для того чтобы подтвердить непосредственное участие TSPO в функционировании РТР, нами были использованы высокоспецифичные антитела, выработанные к фрагменту N-конца, содержащему 9-27 аминокислоты (VGLTLVPSLGGFM GAYFVR), предоставленные проф. Papadopoulos V.(Canada).

A C4V |---В .........

20» 301) 400 500 60Q

Время, с

a. if.

С .'!>

.11)0 .15(1 4WI Время, с

200 30(1 41(0 М<1 (>00 ТОП

го1 зои ми мк|

Время, с

Рисунок 5. Эффект апй-ТЭРО антител на транспорт Са2+, мембранный потенциал и потребление кислорода Мх мозга крысы. Панель А - контрольные Мх мозга крысы. Панель Б - Мх мозга, проинкубированные с анти-ТБРО антителами, панель В - Мх мозга в присутствии СбА, панель Г - Мх мозга в присутствии БСА фракции V (в той же концентрации, что и анти-ТБРО антитела).

Присутствие антител специфичных к Т8РО, практически не влияет на потребление кислорода в суспензии Мх мозга (Рис. 5). Однако антитела вызывают

сильное подавление выхода Са2+ из матрнкса Мх, особенно это заметно после второй добавки Са2+ (Рис. 5 Б), аналогично циклоспорину А. На Рис 5 В показано действие специфического ингибитора РТР - циклоспорина А, который ингибирует падение потенциала и выход Са2+ из Мх, подтверждая вовлечение РТР.

Для выяснения специфичности ингибирующего действия антител к TSPO и исключения факта их неспецифического воздействия на Мх, были использованы добавки БСА (фракция V) в аналогичном буфере в концентрациях, превышающих концентрацию антител к TSPO в несколько раз, коммерческие антитела, выработанные к целой молекуле, а также неродственные антитела. В негативном контроле не наблюдается значимых изменений в транспорте Са2+, схожих с эффектом антител (Рис. 5 Г). Используемые антитела способны узнавать мономерную и димерную формы TSPO. Поскольку часть молекул TSPO остается локализованной во внешней мембране (не в местах контакта мембран Мх), можно предположить, что антитела, взаимодействуя с ними, изменяют конформацию TSPO и его взаимодействие с VDAC, модифицируя проницаемость внешней мембраны для кальция и препятствуя открытию РТР, что подтверждает непосредственное участие TSPO в функционировании РТР.

3.2. Влияние антител к TSPO на выход апоптогенных факторов из Мх мозга крысы.

Поскольку выход апоптогенных факторов из Мх в присутствии пороговых концентраций кальция является одним их характерных признаков РТР, и, учитывая вовлечение TSPO в запуск апоптоза в различных культурах раковых клеток и тот факт, что антитела к TSPO способны подавлять индукцию РТР, было целесообразным изучить влияние данных антител на выход апоптогенных факторов из Мх мозга крысы. Для этого из суспензии Мх до и после индукции открытия поры были отобраны аликвоты, после центрифугирования белки супернатантов были подвержены электрофорезу с последующим проведением Western blot и окрашиванием мембран антителами, выработанными к цитохрому с и к A1F. В супернатантах контрольных Мх мозга крысы в отсутствии добавленного кальция были обнаружены лишь небольшие количества цитохрома с и AIF. При индукции поры посредством добавки пороговой концентрации Са2+ выход цитохрома с и AIF

существенно увеличивался, в 5 и 14 раз соответственно. При добавлении антител к суспензии Мх до нагрузки их кальцием было показано, что антитела, выработанные к Т8РО, были способны полностью и специфически подавлять Са2+-зависимый выход АШ, не влияя при этом на высвобождение цитохрома с (Рис. 6).

Выход и] Выход цитохрома с

1.5

О 1.0

г 0.5

Са2+

Ahtii-PBR антитела

Выход AIF Выход цитохрома с

Рисунок 6. Эффект анти-TSPO антител на выход цитохрома с и A1F из Мх мозга крыс при индукции РТР пороговыми концентрациями Са2*. Панель А - данные Western blot по выходу апоптогенных факторов из Мх мозга крысы; панель Б -количественный анализ данных Western blot.

Поскольку выход A1F является характерным признаком каспаз-независимого апоптоза, то полученные данные указывают на вовлечение TSPO в начальные стадии апоптоза, протекающему по каслаз-независимому пути.

Глава 4. Вовлечение ТвРО в индукцию РТР в Мх клеток глиомы Сб.

Известно, что экспрессия Т5РО увеличивается при канцерогенезе и уровень экспрессии коррелирует со степенью злокачественности опухоли. Кроме этого, установлено, что в присутствии активных форм кислорода могут быть образованы ковалентные дитирозиновые связи в Т8РО, в результате которых формируются его димеры и олигомеры. Такой процесс может происходить в опухолевых клетках.

поэтому в следующей серии экспериментов была предпринята попытка выяснения формы нахождения ТЭРО в митохондриях клеток глиомы Сб.

-TSPO

1 2 Глиома С6

; 60 ?

Ц 50 са

2 40 £

| 30 р

= 20 О

510 0

I Дикии тип I Нокдаун

18 кДа 36 кДа 80 кДа

Рисунок 7. Идентификация TSPO в Мх клеток глиомы Сб.

Панель А - данные Western blot анализа лизата Мх, изолированных из клеток дикого типа (1) и клеток с пониженной экспрессией TSPO (2). Панель Б -количественный анализ содержания различных форм TSPO в Мх глиомы С6 дикого типа и нокдауна.

Эксперименты проводились на двух типах культур: дикий тип и нокдаун, содержащий меньше TSPO. Как было определено методом Western blot степень снижения уровня TSPO в генмодифицированной культуре клеток глиомы С6 (нокдаун) составляла 30-50%. Кроме этого, на Рис 7 видно, что Мх глиомы содержат димерные и полимерные формы TSPO, в отличие от Мх мозга и астроцитов, содержащих только мономер. Это, возможно составляет основу для различий в Мх опухолевых и нормальных тканей и клеток. В Таблице 1 представлены характеристики параметров дыхания Мх, изолированных из клеток глиомы С6 двух видов (дикий тип и нокдаун). Уменьшение уровня экспрессии TSPO в культуре приводит к подавлению дыхания Мх, не изменяя степени сопряженности систем дыхания и окислительного фосфорилирования. Следует отметить, что изолированные Мх, утилизирующие янтарно-кислый калий, имели высокий коэффициент дыхательного контроля, равный 4, что говорит о факте сопряженности изолированных Мх.

Таблица 1. Количественный анализ функциональных параметров митохондрий, изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа и нокдауна.__

Vst.2 Vst.3 Vst.4 Vun. RCR

Дикий тип 12.84 ±2.33 57.42 ±7.30 15.22 ± 2.17 69.66 ±4.36 4.01 ±0.57

Нокдаун 9.81 ±4.65 41.13 ± 6.21 * 10.12 ± 2.90 * 54.93 ±6.57 * 3.98 ±0.39

В экспериментах было обнаружено, что снижение уровня экспрессии Т5РО приводит к уменьшению способности поглощать Са2', в частности, скорость входа Са2+ в Мх падает до 30%, время удержания Са:+ до 25%. Са2+ емкость Мх уменьшается до 35%, а скорость выхода Са2+ из Мх увеличивается до 30-35%.

_. 1Г.0

8-1140 " 1 120

га о

? ° О =

1 Дикий nul 1 Нокдаун

;100 —¿г*-g X,

* X

Л.-Х—

эа % = 1211

^ х I V о.

ь g

О S

^ А Ч*— г*— X

гг

,С*

- о

7Л

GV5

Рисунок 8. Влияние уровня экспрессии TSPO на транспорт Са2т Мх глиомы С6 и лиганд-модулируемую индукцию РТР. Панель А - количественный анализ параметров индукции РТР в Мх глиомы Сб (дикий тип и нокдаун). Панель Б -влияние PPIX на индукцию РТР в Мх глиомы С6 (дикий тип и нокдаун). Панель В -влияние PKI 1195 на индукцию РТР в Мх глиомы С6 (дикий тип и нокдаун).

Горизонтальными линиями обозначены соответствующие контроли.

Из полученных данных следует, что в результате уменьшения экспрессии ТЗРО происходит изменение чувствительности к его лигандам, в частности, практически исчезает чувствительность к РР1Х, при этом чувствительность к РКП 195 остается без изменений. Этот факт может быть объяснен достаточностью оставшихся мест связывания РКП 195 для функционирования ТЭРО и увеличением способности РКП 195 связываться с полимерной формой ТЗРО. Уменьшение способности связывать РР1Х подтверждает необходимость тримерного комплекса РВЯ для его переноса, формирование которого может быть нарушено при уменьшении уровня экспрессии ТЗРО.

Возможный механизм действия РР1Х и РКП 195 на Мх глиомы С6 проиллюстрирован на Схеме 1 (Рис. 9).

РКП 195

Г\

О 0. £ < О > с о щ

щ H 1 \J

Рисунок 9. Схема возможного механизма действия РР1Х и PKI 1195 на Мх глиомы Сб.

Дикий тип Нокдаун

Глава 5. Участие ТвРО и его лигандов в регуляции функционирования РТР на примере Са!+-зависимого фосфорилирования Мх мозга и астроцитов.

Функционирование РВЯ и его роль в различных патологических состояниях давно и широко изучается, однако механизм его регуляции в митохондриях до настоящего времени не выяснен. Ранее было показано, что лиганды РВЯ способны модулировать фосфорилирование мембранно-связанных белков Мх мозга (Азарашвили, 2005). В настоящей работе были продолжены эксперименты по

фосфорилированию белков в Мх, исследуя сравнительное изучение роли ТЯРО в фоефорилировании белков Мх, изолированных из мозга и астроцитов.

Для этого Мх мозга и астроцитов преинкубировали в присутствии лигандов в течение 3 минут при комнатной температуре и подвергали фосфорилированию в присутствии [у-"'"Р]АТР, согласно методу, разработанному ранее.

Содержание 3"Р было максимальным в белках с молекулярными массами 3.5, 17, 21, 46-48 и 65 кДа (Рис. 10 А). Основными фосфобелками в Мх астроцитов являются белки с м.м. 3.5, 46-48 и 65 кДа, что частично совпадает со спектром

Рисунок 10. Распределение

фосфобелков Мх мозга и астроцитов крысы в 808-ПААГ.

Панель Л - Авторадиограмма фосфорилированных белков Мх мозга крысы. Панель Б - Авторадиограмма фосфорилированных белков Мх астроцитов крысы.

Исходя из данных количественного анализа, видно (Рис. 11 А и 11 В), что уровень включения меченого фосфата в диапазоне м.м. 46 - 48 кДа и 3.5 кДа в обоих видах Мх повышается при увеличении концентрации PKI 1195 от 0.01 мкМ до 0.1 мкМ, а дальнейшее повышение концентрации РКП 195 до 1 мкМ приводит к ослаблению включения '"Р в эти полипептиды в Мх мозга. Однако в Мх астроцитов фосфорилирование 3.5 кДа пептида в присутствии 1 мкМ не уменьшается. Уровень фосфорилирования 67 кДа белка снижается при увеличении концентрации РКП 195. Ro 5-4864 в наномолярных концентрациях (0.01 и 0.1 мкМ) не оказывает значительного влияния на уровень фосфорилирования Мх мозга, хотя заметна небольшая тенденция к увеличению степени фосфорилирования 48 кДа и 3.5 кДа белков (Рис. 11 Б).

фосфобелков в Мх мозга (Рис.10 Б).

кДа

66.0 -45.0 " 30.0 -

3.46

кДа

66.0 45.0

30.0

3.46

Митохондрии мозга крысы Б

ISO

—™ 67 кДа с^: 48 кДа

«га 3.5 кДа

ILL

0.1

100 — Hi—

1 50

Cl.

Ro 5-4864 0.01

(мкМ)

0.1

250

5s 200

150 100 —i 50 ■

PKI 1195 (мкМ)

0.(11

Митохондрии астроцитов крысы

0.1

" 67 кДа

46-48 кДа » 3.5 кДа

250

о' 200

5 150

о. 50 0

Ro 5-4864 (мкМ)

I • I

■ Il 11

0.01

0.1

Рисунок 11. Влияние различных концентраций РК11195 и Ro 5-4864 на уровни фосфорилирования белков в интактных Мх мозга и астроцитов. Панель А-влияние PKI 1195 на фосфорилирование интактных Мх мозга крысы. Панель Б - влияние Ro 5-4864 на фосфорилирование интактных Мх мозга крысы. Панель В - влияние РКП 195 на фосфорилирование интактных Мх астроцитов крысы. Панель Г -влияние Ro 5-4864 на фосфорилирование интактных Мх астроцитов крысы. Горизонтальными линиями представлены уровни соответствующих контролей.

Эффект Ro 5-4864 на Мх астроцитов отличается от его действия на Мх мозга. Ro 5-4864 уменьшает уровень включения меченого фосфата в белки Мх астроцитов с м.м. 3.5 кДа и 46-48 кДа и увеличивает включение в белок с м.м. 67 кДа (Рис. 11 Г). Следует отметить, что в Мх астроцитов проявляется противоположный эффект PKI 1195 и Ro 5-4864 (антагониста и агониста TSPO) на включение 32Р в 67, 46-48 и 3.5 кДа белки. При сопоставлении данных, представленных на Рисунке 11 (А, Б) и 3, хорошо заметен факт корреляции концентрационных эффектов лигандов TSPO

на индукцию РТР и фосфорилирование белков Мх мозга. РКП 195 значимо влияет на индукцию РТР и фосфорилирование белков, начиная с концентрации 0,1 мкМ, а Ro 5-4864 в наномолярном диапазоне концентраций существенно не влияет на эти два процесса. РР1Х также обладает способностью увеличивать уровни фосфорилирования пептидов Мх мозга, аналогичной Ro 5-4864, однако эффект PPIX выражен более ярко, несмотря на более низкую концентрацию.

Дополнительно нами был изучено влияние антител к TSPO па фосфорилирование тех же белков. Было показано, что антитела к TSPO понижают степень включения 32Р в данные белки приблизительно на 20-45%, и уровни фосфорилирования 3.5 кДа и 43 кДа пептидов, в присутствии антител под действием описываемых лигандов, возвращаются к контрольным значениям. Эти факты подтверждают наши предположения о том, что функционирование РТР может регулироваться посредством фосфорилирования/дефосфорилирования мишхондриальных белков.

В Мх мозга 3.5 кДа пептид был ранее идентифицирован как фосфорилированная форма субъединицы с АТР-синтетазы, а среди белков с м.м. в диапазоне 46-48 кДа в Мх мозга и астроцитов был предварительно идентифицирован как фосфорилированной коннекси н-43.

Суммируя полученные результаты, можно было предложить рабочую схему функционирования и регуляции РТР и PBR, в которой видно, что лиганды TSPO способны модулировать фосфорилирование белков в Мх мозга и астроцитов, осуществляемое через PBR. Ранее показано, что TSPO, гидрофобная субъединица с F0F!-ATP-a3bi и коннексин-43, существуют в фосфорилированной форме. Регуляция посредством фосфорилирования, возможно, происходит через комплекс PBR. В митохондриях найден PBR-связывающий белок (РАР-7, PBR-associated protein), который связывается кроме TSPO и с регуляторной субъединицей 1а протеинкиназы A (PKA-RIa) и является якорным белком для PKA-RIa. Поскольку в комплекс PBR входят VDAC и ANT, которые также подвергаются фосфорилированию, то, возможно, модуляция фосфорилирования, вызванная лигандами, может приводить к изменению уровня фосфорилирования VDAC и ANT и связанных с ними белков. Таким образом, TSPO-зависимая модуляция активностей протеинкиназ и протеинфосфатаз может служить ключевым элементом в TSPO-индуцируемом каскаде сигнальной трансдукции в Мх и клетках. Согласно

полученным нами данным была составлена Схема, иллюстрирующая возможный механизм регуляции комплекса РВЯ и его вовлечение в индукцию начальных стадий апоптоза (Рисунок 12).

Апоптоз

Рисунок 12. Схема вовлечения PBR/TSPO в индукцию РТР и начальные стадии апоптоза.

ВЫВОДЫ

1. TSPO был детектирован в митохондриях мозга, первичной культуры астроцитов, а также клеток глиомы С6 методом Western blot с использованием специфических антител, выработанных к TSPO. Обнаружено, что в Мх мозга и астроцитов TSPO находится в мономерной форме, а в опухолевых клетках глиомы С6 TSPO образует димерные и олигомерные формы.

2. Методом иммунопреципитации показано, что в условиях индукции РТР в митохондриях мозга крысы TSPO ко-локализован с транслоказой адениновых нуклеотидов.

3. Установлено, что синтетический лиганд РКП 195 и эндогенный лиганд DB1 при концентрации 100 нМ подавляют индукцию РТР, а эндогенный лиганд РР1Х при концентрации 500нМ стимулирует открытие неселективной поры. Синтетические лиганды, Ro 5-4864 и РКП 195, при высоких концентрациях (50 мкМ) проявляют свойства индуктора РТР.

4. Показано, что специфические антитела, выработанные к TSPO, способны предотвращать открытие РТР, аналогично циклоспорину А и снижать действие лигандов на изолированные Мх мозга крыс.

5. Обнаружено, что снижение количества TSPO в клетках глиомы С6 на 3050%, приводит в результате к уменьшению скорости поглощения кальция и кальциевой емкости и увеличению скорости выхода кальция из Мх, изолированных из таких клеток. Кроме этого, в Мх, изолированных из нокдаун клеток глиомы С6, снижается чувствительность к PPIX и сохраняется чувствительность к РК11195.

6. Обнаружено, что в присутствии пороговых концентраций кальция TSPO непосредственно вовлекается в Са2+-зависимый выход AIF из митохондрий, не влияя на выход цитохрома с, что указывает на участие TSPO в начальных стадиях каспаз-независимого апоптоза.

7. Показано, что лиганды РК11195 и Ro 5-4864 модулируют фосфорилирование белков Мх мозга и астроцитов, подтверждая гипотезу о вовлечении I'BR в регуляцию РТР и апоптоза посредством фосфорилирования/дефосфорилирования, осуществляемого протеинкиназами/фосфатазами.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи

1. Azarashvili Т., Grachev D., Krestinina О., Evtodienko Y., Yurkov I., Papadopoulos V., Reiser G. The peripheral-type benzodiazepine receptor is involved in control of Ca2+-induced permeability transition pore opening in rat brain mitochondria. Cell Calcium, 2007, 42(1), 27-39.

2. Azarashvili Т., Krestinina 0., Galvita A., Grachev D., Baburina Y., Strieker R., Evtodienko Y., Reiser G. Ca2+-dependent permeability transition regulation in rat brain mitochondria by 2',3'-cyclic nucleotides and 2',3'-cyclic nucleotide З'-phosphodiesterase. Am J Physiol Cell Physiol., 2009, 296, 1428-1439.

3. Крестинина О.В., Грачев Д.Е., Одинокова И.В., Райзер Г., Азарашвили Т.С. Влияние лигандов периферического бензодиазепинового рецептора (PBR/TSPO) на открытие Са2+-индуцированной поры и фосфорилирование 3.5 кДа полипептида в митохондриях мозга крысы. Биохимия, 2009, 74(4), 522-531.

4. Крестинина О.В., Круглое А.Г., Грачев Д.Е., Бабурина Ю.Л., Мошков Д.А., Санталова И.М, Азарашвили Т.С. Возрастно-зависимые изменения функций митохондрий при Са3+-индуцируемом открытии поры. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2-4 июня 2009, Пущино, стр. 594-598.

5. Грачев Д.В., Крестинина О.В., Бабурина Ю.Л., Райзер Г., Азарашвили Т.С. PBR-модулируемое фосфорилирование белков в митохондриях астроцитов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2-4 июня 2009, Пущино, стр. 575-581.

6. Д.Е. Грачев, О.В. Крестинина, 10.JI. Бабурина, Г. Райзер, Т.С. Азарашвили. Эффект Ro 5-4864 и РКП 195 на фосфорилирование белков в митохондриях астроцитов. Биологические Мембраны, 2010, 27 (1), 1-8.

Тезисы докладов

1. A. Galvita, Т. Azarashvili, R. Stricker, L. Schild, О. Krestinina, D. Grachev, Y. Baburina, G. Reiser. Brain IP4 and PtdInsP3-binding protein, p42IP4, is involved in the regulation of Ca2+ transport in mitochondria. International conference "Neurodegenerative diseases: molecular mechanisms in a functional genomics framework", September 6-9, 2006, Berlin, p. 61.

2. T. Azarashvili, D. Grachev, O. Krestinina, Y. Evtodienko, I. Yurkov, V. Papadopoulos, G. Reiser. The Peripheral Benzodiazepine Receptor is involved in control of Permeability Transition Pore opening in Rat Brain Mitochondria. XIV European Bioenergetics Conference, 22-27 July 2006, Moscow, P2.5.22.

3. Galvita A., Grachev D., Baburina Y., Krestinina O., Azarashvili T., Strieker R., Reiser G. The neuron-specific protein, p42IP4 (Centaurin-alpha 1) is localized in mitochondria, interacts with 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase and is involved in regulation and control of mitochondrial Ca2+. The 12th STS Meeting «Signal Transduction - Receptors, Mediators and Genes», 29-31 October, 2008, Weimar, Germany, p. 107.

4. Galvita A., Baburina Y., Grachev D., Krestinina O., Azarashvili T., Strieker R., Reiser G. Novel subcellular localization of two brain specific proteins, p421P4 (Centaurin-alpha 1) and CNP (2,3-eyclic nucleotide 3-phosphodiesterase) in mitochondria.

5tli International Symposium «Neuroprotection and Neurorepair Cerebral Ischemia and Stroke», 17-20 May, 2008, Magdeburg, Germany, p. 18.

5. Galvita A., Grachev D., Baburina Y., Krcstinina O., Azaraslivili Т., Strieker R., Reiser G. Mitochondrial localization and interaction of Centaurin-alphal (p42IP4) and CNP (2,3-cyclic nucleotide 3-piiospliodicsterase) and their involvement in regulation of mitochondrial Ca2+ and control permeability transition. National conference «Molecular pathways in health and disease of the nervous system», September 11-13, 2008 Homburg/Saar, Germany, p. 14

6. Бабурина Ю.Л., Грачев Д.Е., Крестинина O.B., Райзер Г, Азарашвили Т.С. Идентификация 2\3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях мозга. Международная Конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 5-7 июня 2007, Пущино, стр. 210-212.

7. Грачев Д.Е., Крестинина О.В, Бабурина Ю.Л, Райзер Г., Азарашвили Т.С. Периферический бензодиазепиновый рецептор и коннексин-43 как возможные мишени карбеноксолона в митохондриях. Международная Конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 5-7 июня 2007, Пущино, стр. 212-215.

8. Grachev D.E, Krestinma O.V., Baburina Yu.L., Evtodienko Yu.V., Papadopoulos V, Reiser G, Azarashvili T.S. Role of the Peripheral Benzodiazepine Receptor in initiation of apoptosis. Нейронаука для медицины и психологии. Третий Международный Междисциплинарный Конгресс, Судак, Крым, Украина, 12-20 июня 2007, стр. 85-86.

9. Азарашвили Т.С., Бабурина ЮЛ., Грачев Д.Е., Крестинина О.В. ПБР как регулятор РТР в митохондриях. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая, 2008, Новосибирск, стр. 328.

10. Бабурина Ю.Л., Крестинина О.В., Грачев Д.Е., Азарашвили Т.С. Влияние субстратов 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы (CNP) на индукцию открытия РТР в митохондриях. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск, стр. 319.

11. Грачев Д.Е., Крестинина О.В., Одинокова И.В., Бабурина Ю.Л., Азарашвили Т.С. F|F0-ATPa3a как возможная мишень для лигандов периферического бензодиазепинового рецептора. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск, стр. 426.

12. Бабурина Ю.Л., Грачев Д.Е., Крестинина О.В., Евтодиенко Ю.В., Райзер Г., Азарашвили Т.С. Роль 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы в митохондриях мозга. IV международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», 10-20 июня, 2008, Судак, Украина, стр. 57-58.

Заказ№ 115-а/11/09 Подписано в печать 18.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грачев, Дмитрий Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Структура и функции митохондрий.

1.2. Структура и функции митохондриальных мембран.

1.3. Каналы внутренней мембраны Мх.

1.3.1. Анионный канал внутренней мембраны.

1.3.2. Полу-РТР (half-РТР, HP).

1.3.3. mtKvl.3.

1.4. Неспецифическая кальций-индуцируемая, циклоспорин А-чувствительная пора внутренней мембраны Мх (РТР).

1.5. Периферический бензодиазепиновый рецептор.

1.5.1. Лиганды TSPO.

1.5.2. Молекулярная структура TSPO.

1.5.3. TSPO при стрессе и неврозах.

1.5.4. TSPO и апоптоз.

1.5.5. TSPO и рак.

1.5.6. Гормональная регуляция плотности TSPO в эндокринных и не эндокринных органах.

1.5.7. TSPO и биосинтез стероидов.

1.5.8. TSPO и фосфорилирование.

1.5.9. TSPO и биосинтез гема.

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Химические препараты и биологические объекты.

2.2. Выделение Мх из мозга крыс.

2.3. Выделение Мх из культур клеток первичных астроцитов, и глиомы С6.

2.4. Определение белка по Лоури.

2.5. Фосфорилирование митохондриальных белков:.

2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.7. Иммуноблот и иммунопреципитация.

2.8. Измерение величины трансмембранного потенциала в Мх.

2.9. Определение выхода цитохрома с и AIF.

III. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Идентификация TSPO в Мх мозга и астроцитов крысы и Мх клеток глиомы С6.

3.2. Определение митохондриальных параметров.

3.3. Исследование участия PBR/TSPO в индукцию РТР в Мх мозга крысы.

3.3.1. Исследование влияния лигандов PBR/TSPO на индукцию РТР.

3.3.2. Исследование влияния DBI на РТР-стимулирующий эффект пальмитоил-СоА.

3.3.3. Влияние антител к TSPO на функциональное состояние Мх мозга крысы.

3.4. Влияние антител к TSPO на выход апоптогенных факторов из Мх мозга крысы.

3.5. ANT - белок-партнер TSPO, при открывании РТР.

3.6. Вовлечение TSPO в индукцию РТР в Мх клеток культуры глиомы С6.

3.7. Са2+-зависимое фосфорилирование Мх мозга и астроцитов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий"

Бензодиазепины (БД) являются соединениями, широко применяющимися в клинике, действие которых опосредовано через специфические связывающие места - бензодиазепиновые рецепторы, центральный бензодиазепиновый рецептор и периферический (PBR), функционирующий вне ЦНС. В последние годы PBR рассматривают в качестве терапевтической мишени при лечении таких заболеваний как эпилепсия, болезнь Альцгеймера, церебральная ишемия. Экспрессия PBR при различных патологиях, по-видимому, связана с нарушением его многочисленных биологических функций таких как: регуляция клеточной пролиферации, дифференциации и апоптоза; стероидогенез и транспорт холестерина, биосинтез гема и транспорт порфирина. Следует отметить, что лимитирующие стадии стероидогенеза и биосинтеза гема (перенос холестерина и протопорфирина на внутреннюю мембрану митохондрий (Мх)) протекают в Мх с помощью PBR. Установлено, что уровень PBR в клетках повышается при опухолевой трансформации в клетках легких, кишечника, гортани, яичников; простаты, нейробластомы, глиомы, гепатокарциномы, опухолевых клетках молочной железы. В клетке PBR локализован во внешней мембране Мх, концентрируясь в контактных сайтах. Он представляет собою тримерный комплекс, состоящий из 18 кДа белка, названного недавно белок-транслокатор (TSPO), потенциалзависимого анионного канала (VDAC) и переносчика адениновых нуклеотидов (ANT). При изучении широко используют его высокоафинные лиганды как искусственные - РКП 195 и Ro 5-4864, так и эндогенные - холестерин, протопорфирин и ингибитор связывания диазепама (DBI). (Awad, Gavish, 1988; Barnea et al., 1988).

Следует отметить, что белки, формирующие комплекс PBR (VDAC,TSPO и ANT)- вместе с CypD до недавнего времени рассматривали как основу неспецифической Са2+-индуцируемой и циклоспорин-чувствительной поры (РТР), которая формируется во внутренней мембране Мх в ответ на окислительный стресс или при достижении сверхпороговых концентраций кальция в Мх. Однако эксперименты, выполненные на мышах с выключенными генами VDAC и ANT, показали, что эти два белка не формируют структуру поры (McEnery et al., 1992; Halestrap et al., 1999; Basso et al., 2008).

Функционирование РТР рассматривают как начальную стадию программируемой гибели клеток (апоптоза). Несмотря на многолетние исследования, к настоящему моменту точный состав поры не установлен, так же как и механизм регуляции ее функционирования. Эта ситуация усугубляется тем фактом, что в последнее время получены данные, вызывающие сомнение относительно структурной роли VDAC и ANT в РТР и отсутствовали данные, подтверждающие непосредственное участие TSPO в функционировании РТР. В дополнение к выявлению структурного состава РТР, большое значение имеет понимание механизма регуляции функционирования РТР. В связи с этим, стоит напомнить, что TSPO, VDAC и белки семейства Вс1-2, известные как регуляторы РТР, подвержены РКА-зависимому фосфорилированию. Ранее в Мх печени и мозга нами были обнаружены мембраносвязанные фосфобелки, уровень фосфорилирования которых коррелировал с открытием РТР, что позволило нам предположить существование механизма регуляции функционирования РТР, опосредованного фосфорилированием/ дефосфорилированием белков Мх, осуществляемым протеинкиназами/ фосфатазами.

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным выяснение вопроса о присутствии TSPO в Мх, изолированных из тканей мозга, первичной культуры, астроцитов и клеток глиомы С6 в условиях открытой поры, выяснение его непосредственного участия в функционировании РТР с использованием антител, выработанных к TSPO и проведением экспериментов на Мх, изолированных из клеток глиомы С6, с пониженным содержанием TSPO* (нокдаун); а так- же исследование возможного вовлечения TSPO на начальные стадии апоптоза и влияние его лигандов на эти процессы, а также роль TSPO и его лигандов на уровень фосфорилирования белков в Мх.

Цель и основные задачи исследования.

Целью данного исследования было выявление непосредственного участия TSPO в функционировании РТР, а также вовлечение TSPO и его лигандов в регуляции РТР.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Выявить содержание TSPO в Мх методом Western blot и определить форму (мономер/димер), в которой TSPO присутствует в Мх, изолированных из мозга крыс, первичной культуры астроцитов и клеток глиомы Сб. Сравнить уровень TSPO в Мх мозга, глиальных клетках (астроцитах) и клеток глиомы С6 (как пример опухолевых клеток);

2. Методом иммунопреципитации установить возможное взаимодействие TSPO с ANT в Мх в присутствии пороговых концентраций Са2+, инициирующих открытие РТР;

3. Выявить непосредственное участие TSPO в функционировании РТР, исследуя влияние специфических антител, выработанных к TSPO, на параметры открытия РТР (величину мембранного потенциала, скорости поглощения и выхода Са2+, время удержания Са2+ в Мх, Са2+-индуцированное набухание Мх);

4. Изучить влияние синтетических (РКП 195 и Ro 5-4864) и эндогенных лигандов (протопорфирина IX (PPIX) и ингибитора связывания диазепама(ОВ1)) на параметры, характеризующие открытие РТР (скорости

О Авхода и выхода Са , величину мембранного потенциала и выход апоптогенных факторов (цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора (AIF)) в

24" присутствии пороговых концентраций ;Са , индуцирующих открытие РТР и< в, присутствии ингибитора РТР, циклоспорина А;

5. Сравнить характеристики РТРТ в Мх, изолированных из клеток культуры глиомы С6 дикого типа и нокдауна по TSPO;

6. Исследовать возможную корреляцию влияния лигандов TSPO на фосфорилирование мембранно-связанных белков Мх с индукцией открытия РТР.

Научная новизна.

В рамках выполнения диссертации впервые показано, что:

1. В Мх, изолированных из мозга и астроцитов присутствует мономер TSPO - 18 кДа белок, в то время как в Мх, изолированных из клеток глиомы С6 кроме мономера обнаружены димерные и олигомерные формы TSPO;

2. Методом иммунопреципитации, выполненной на изолированных Мх мозга, находящихся в двух состояниях (контроль и в присутствии пороговых концентраций Са2+, вызывающих индукцию РТР) впервые была обнаружена совместная локализация TSPO с ANT в условиях открытой поры;

3. Антитела, выработанные к TSPO, специфически предотвращают открытие неселективной поры в Мх, и действие антител проявляло концентрационную зависимость, дополнительно подтверждая прямое участие TSPO в функционировании РТР;

4. Антитела к TSPO способны подавлять выход AIF из Мх, не влияя на выход цитохрома с, что указывает на специфическое участие TSPO в системе освобождения AIF и в инициации развития апоптоза, протекающему по каспаз-независимому пути;

5. Впервые детально исследовано влияние лигандов TSPO (экзогенных и j t эндогенных) на параметры открытия РТР (скорости входа и выхода Са из Мх, а также диссипацию мембранного потенциала). DBI./AOBP; будучи лигандом TSPO, вовлекается-вместе с ним в функционирование РТР в Мх. В частности, показано,1 что пептид обладает способностью блокировать индукцию выхода кальция^ и падение мембранного потенциала, демонстрируя* CsA — подобный эффект. Напротив, антитела, полученные к DBI/ACBP, ускоряют открытие неселективной- поры;

6. Антитела к DBT/ACBP вызывают массированный выход AIF из Мх в присутствии пороговых концентраций Са2+, приводящих к открытию РТР, что указывает на участие как TSPO, так и DBI/ACBP в механизме освобождения AIF из Мх;

7. В экспериментах, выполненных на изолированных Мх мозга с использованием антител, выработанные к TSPO, а также в экспериментах, проведенных на Мх, изолированных из клеток глиомы С6 (дикий тип и нокдаун), подтверждено непосредственное участие TSPO в функционировании РТР;

8. Обнаружена способность лигандов модулировать TSPO-регулируемое фосфорилирование белков Мх.

Научно-практическая ценность.

Выявление новых фосфорилированных белков Мх мозга и корреляции между уровнем их фосфорилирования и индукцией неселективной митохондриальной поры указывает на существование нового механизма регуляции РТР. Обнаружено, что при опухолевой трансформации уровень TSPO повышается и появляются олигомерные формы TSPO, что является важным для понимания развития патологий, и может быть использовано в качестве опухолевого маркера. Обнаружены различия в механизмах действия лигандов TSPO, что подтверждает важность исследований применительно к клинической практике в области терапии опухолей, нейродегенеративных заболеваний и открывает путь к разработке новых лекарственных соединений.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Грачев, Дмитрий Евгеньевич

выводы

3. Установлено, что синтетический лиганд РКП 195 и эндогенный лиганд DBI при концентрации 100 нМ подавляют индукцию РТР, а эндогенный лиганд PPIX при концентрации 500 нМ стимулирует открытие неселективной поры. Синтетические лиганды, Ro 5-4864 и РКП 195, при высоких концентрациях (50 мкМ) проявляют свойства индуктора РТР.

6. Обнаружено, что в присутствии пороговых концентраций кальция TSPO непосредственно вовлекается в Са2+-зависимый выход AIF из митохондрий, не влияя на' выход цитохрома с, что указывает на участие TSPO в начальных стадиях каспаз-независимого апоптоза.

7. Показано, что лиганды РКП 195 и Ro 5-4864 модулируют фосфорилирование белков Мх мозга и астроцитов, подтверждая гипотезу о вовлечении PBR в регуляцию РТР и апоптоза посредством фосфорилирования/дефосфорилирования, осуществляемого протеинкиназами/фосфатазами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повышенный интерес к TSPO обусловлен его присутствием почти во всех тканях и органах тела животных и человека и значительными изменениями уровней его плотности в тканях при многочисленных патологиях, в том числе связанных с нейродегенеративными изменениями при таких заболеваниях как эпилепсия, болезнь Паркинсона, шизофрения, болезнь Альцгеймера. В центральной нервной системе TSPO локализован в глиальных клетках. Уровень его экспрессии увеличивается при нарушениях в ЦНС, включая воспаления, метаболический стресс, а также травматические, ишемические и химические повреждения мозга, что позволяет использовать его в качестве маркера при выявления нарушений в мозге. При этом потеря нейронов сопровождается увеличением плотности TSPO. Увеличение экспрессии TSPO в результате нейрональных повреждений наблюдается-первоначально в микроглии/макрофагах, а не в астроцитах. В этих клетках лиганды TSPO способствуют выживанию клеток, стимулируя пролиферацию-глиальных клеток или продукцию медиаторов (нейростероиды, цитокины или другие факторы), повышающих выживание клеток. С другой стороны, известны факты, когда лиганды TSPO, РКП 195 и Ro 5-4864 ингибировали пролиферацию клеток астроцитов. Подобные противоречия, связанные с использованием лигандов TSPO, появились в литературе и при изучении апоптоза в различных культурах клеток. Вовлечение TSPO в индукцию апоптоза интенсивно изучают в экспериментах с использованием лигандов TSPO и клеточных культур с пониженной экспрессией рецептора (нокаут и нокдаун культуры) (Casselas et al., 2002; Decaudin et al., 2002). В части работ проапоптическую роль TSPO- связывают с увеличением уровня экспрессии TSPO" в раковых клетках или со способностью синтетических лигандов. РК 11195 и Ro'5-4864 стимулировать,апоптоз в культуре, например в hepatic stellate cells (Fisher et al., 2001). В других работах продемонстрированы антиапоптические функции TSPO, в частности уменьшение окислительного стресса и ишемия/реперфузия-индуцируемого почечного тубулярного апоптоза, который ассоциируется с повышением уровня Вс1-2 и снижением Вах (Kunduzova et al., 2004). В нейрональных клетках РКП 195 и Ro 5-4864 ингибируют РТР и выход цитохрома с из Мх.

Преимущественная локализация TSPO в Мх (особенно в контактных местах между мембранами, где формируется РТР) и также активация индукции открытия РТР лигандами TSPO и высвобождение проапоптических факторов в Мх in situ, указывают на центральную роль, которую играет TSPO в апоптозе. Между тем, оставалось неясным, какую именно функцию TSPO выполняет в РТР. Неопределенность этого момента была основана на отсутствии прямых доказательств участия TSPO в структуре РТР. В настоящее время установлено, что ни VDAC, ни ANT, не формируют структуру поры, но их рассматривают в качестве основных ее модуляторов. Способность TSPO к ассоциации с VDAC и ANT, которая была выявлена в результате хроматографической очистки нативного TSPO, позволяет предполагать его включение в регуляцию РТР. Функцию TSPO обычно изучают с помощью его высокоаффинных лигандов. Интересно отметить, что афинность лигандов TSPO составляет порядка 10 нМ, однако влияние лигандов на функции изолированных Мх проявляется только в диапазоне микромолярных концентраций.

В настоящей работе мы исследовали функциональную роль. TSPO в Мх, в частности, его участие в функционировании РТР. Как известно, функционирование неселективной Са2+-индуцируемой и CsA-чувствительной поры характеризуется несколькими параметрами, такими как падение мембранного потенциала, выходом С а" и набуханием Мх, а также выходом апоптогенных факторов (цитохром с или AIF) из Мх. Прямое участие TSPO в РТР было показано при изучении влияния антител, выработанных к фрагменту N-конца (9-27) TSPO" на параметры индукции РТР "в МХ мозга. Оказалось, что антитела предотвращают открытие РТР в Мх концентрационно-зависимым образом, что указывает на вовлечение TSPO и, в частности его N-конца в индукцию РТР. Большое значение имеет обнаруженный нами факт, что л г антитела к TSPO специфически подавляют Са выход из Мх после нагрузки их

Са2+. В присутствии антитела к TSPO величина кальциевого выброса, определяемая как величина высвобождаемого Са2+, в три раза ниже по сравнению с контролем. На основании этих данных нами было выдвинуто предположение, что антитела к TSPO специфически подавляет систему высвобождения Са в Мх мозга крысы. Следующее подтверждение участия TSPO в изменении проницаемости внутренней мембраны Мх было исследование выхода апоптогенных факторов в результате открытия РТР и влияние антитела к TSPO на него. Нами было показано, что в условиях РТР происходит выход в цитозоль проапоптического фактора AIF, который непосредственно индуцирует конденсацию ядерного хроматина и фрагментацию низкомолекулярной ДНК, и что высвобождение фактора полностью подавляется антитела к TSPO. В результате проведенных экспериментов впервые были получены доказательства прямого участия TSPO в функционировании РТР, которое проявляется в осуществлении контроля над процессами высвобождения Са и AIF из Мх в цитозоль. Поскольку AIF является одним из основных эффекторов каспаз-независимого апоптоза, то можно предположить, что TSPO контролирует начальную стадию каспаз-независимого пути апоптоза.

Кроме этого, в данной работе продемонстрировано, что в Мх мозга присутствует белок иммунореактивный к антитела к TSPO, и идентифицированный как мономерная форма TSPO, и этот мономер в Мх мозга крысы способен ко-иммунопреципитироватьтся с ANT, основным компонентом РТР внутренней мембраны. Эти данные впервые демонстрируют физическую ассоциацию TSPO с ANT в Мх мозга крысы и, кроме того, указывают вовлечение TSPO и комплекса PBR в регуляции РТР. Эксперименты^ с использованием лигандов TSPO подтверждают это предположение. Было показано, что такие лиганды TSPO как PPIX и Ro 5-4864 стимулируют

Са2+индуцируемое открытие РТР в изолированных Мх печени и мозга в микромолярном диапазоне концентраций. Однако в наномолярном диапазоне концентраций РК 11195 проявляет противоположное, подавляющее действие на открытие поры. Эндогенные лиганды DBI и PPIX также модулируют индукцию открытия РТР, которая была CsA- чувствительной, что указывает на вовлечение РТР в исследуемый процесс. Кроме снижения потенциала и выхода кальция, изучаемые лиганды TSPO вызывали набухание Мх, что служит дополнительным доказательством его вовлечения в РТР. Действие лигандов на функционирование РТР могло быть ослаблено добавлением антитела к TSPO антител. Все эти данные свидетельствует о непосредственном участии TSPO в функционировании РТР и в начальных стадиях апоптоза.

В нашей лаборатории несколько лет ведутся работы по изучению регуляции РТР посредством фосфорилирования/дефосфорилирования белков Мх. Следует заметить, что TSPO фосфорилируется сАМР-зависимой протеинкиназой, фосфорилируются и его белки-партнеры: РАР-7, StAR и PLA2. В данной работе получены данные по влиянию лигандов TSPO на фосфорилирование белков Мх, демонстрирующие модулирующее действие лигандов TSPO РКП 195, Ro 5-4864 и PPIX на фосфорилирование белков. Мх мозга. Лиганд-модулируемое фосфорилирование обнаруженных белков коррелирует с процессом индукции РТР. А действие CsA и антитела к TSPO на уровень включения Р в данные белки имели однонаправленное действие в обоих процессах (фосфорилирование и подавление открытия поры). Из полученных данных можно выстроить систему регуляции РТР, осуществляемую PBR комплексом, состоящую из РАР-7, (TSPO/ PBR-ассоциированный белок), связанного с TSPO и регуляторной субъединицей 1а (PKA-RIa) цитозольной протеинкиназы А и, формирующий комплекс, способный осуществлять сАМР1зависимое фосфорилирование и передавать сигнал на контактирующие молекулы белка, VDAC и ANT. В полученных в последнее время* экспериментах фосфобелки в МХ мозга в районе 43-46 к Да были идентифицированы как фосфодиэстераза 2',3'-сАМР3 (CNP) и р421Р4, рецептор^ связывающий инозитол-4-фосфоат и фосфоинозитиды. Установлено, что CNP локализуется совместно с VDAC и ANT и, возможно,, с TSPO. Представленные нами' данные по влиянию лигандов TSPO и его антител на индукцию открытия РТР и фосфорилирование белков Мх, вместе с имеющимися в литературе данными по действию лигандов TSPO на фосфорилирование белков в живых клетках, позволяют нам заключить, что TSPO-индуцируемая инициация апоптотической сигнальной системы в Мх играет ключевую роль в РТР-опосредованном распределении Са2'" между Мх и цитозолем, стимуляции выхода AIF из межмембранного пространства Мх, а так же модуляции протеинкиназной и/или протеинфосфатазной активности. Кроме этого, принимая во внимание мультифункциональность TSPO и комплекса PBR в целом, можно предположить, что TSPO/PBR может служить важной мишенью при нейропротекции.

Са2 Аооптоз

Субъед. с АТФазы

Кпнпекспн 43 CNPaja К ЯЛ П Л ИНЬ)

Схема I. Схема вовлечения TSPO в индукцию РТР и начальные стадии апоптоза.

Согласно всему выше сказанному нами была составлена схема 1, принятая нами как рабочая в настоящий момент, которая иллюстрирует возможный механизм регуляции комплексов TSPO и его вовлечение в индукцию начальных стадий апоптоза. На схеме 1 проиллюстрировано, что посредством лигандов PBR/TSPO можно регулировать индукцию неспецифической поры Мх. Такие лиганды TSPO как PPIX и Ro 5-4864 стимулируют Са2+-индуцируемое открытие РТР в изолированных Мх в микромолярном диапазоне концентраций. В наномолярном диапазоне концентраций РК 11195 проявляет противоположное, подавляющее действие на открытие поры. Эндогенные лиганды DBI и PPIX также модулируют индукцию открытия поры (являясь суппрессором и идуктором соответственно), которая была CsA - чувствительной, что указывает на вовлечение РТР в исследуемый процесс. Также посредством TSPO происходит регуляция выхода AIF из Мх, возможно в этом задействован один из лигандов PBR/TSPO - DBI (Shulga et al., 2006). Обнаруженное лиганд-модулируемое фосфорилирование белков, коррелирующее с процессом индукции РТР, скорее всего осуществляется посредством протеинкиназы А, взаимодействующей с TSPO посредством PBR-ассоциированного белка РАР-7. На данный момент фосфоформы белков, подверженных PBR/TSPO-зависимому фосфорилированию, предварительно идентифицированы как субъединица с АТФазы, коннексин 43, CNP и впервые обнаруженная в Мх форма фосфорилированного кальпаина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грачев, Дмитрий Евгеньевич, Пущино

1. Евтодиенко Ю.В., Акименко В.К. Преобразование энергии в биологических системах / Пущино, ИБФМ РАН, 1998.

2. Зоров Д.Б. Митохондриальный транспорт нуклеиновых кислот. Участие бензодиазепинового рецептора//Биохимия, 1996,61(7), 1320-1332.

3. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. Биология, 3-е изд./ М.: Мир, 2004.

4. Anholt R.R.H., De Souza Е.В., Oster-Granite M.L., Snyder S.H. Peripheral-type benzodiazepine receptors: Autoradiographic localization in whole-body sections of neonatal rats //J.Pharmacol.Exp.Ther., 1985, 233, 517-526.

5. Ansseau M., von Frenckell R., Cerfontaine J.L., Papart P. Pilot study of PK 11195, a selective ligand for the peripheral-type benzodiazepine binding sites, in inpatients with anxious or depressive symptomatology // Pharmacopsychiatry., 1991,24(1), 8-12.

6. Arakane F., King S.R., Du Y., Kallen C.B., Walsh L.P., Watari H., Stocco D.M., Strauss III J.F. Phosphorylation of steroidogenic acute regulatory protein (StAR) modulates its steroidogenic activity // J. Biol. Chem., 1997, 272, 32656-32662

7. Azarashvili T.S., Odinokova I.V., Krestinina O.V., Gadjieva S.S., Evtodienko

8. Yu.V., Saris N-E. Regulation of protein phosphorilation in brain and livermitochondria by magnesium and calcium with emphasis on subunit с of ATP thsynthase.// 7 Europen Magnesium Congress, Zaragoza, Spain, 19-21, 2001, Plenary lecture 7.

9. Awad M., Gavish M. Binding of 3H.Ro 5-4864 and [3H]PK 11195 to cerebral cortex and peripheral tissues of various species: species differences and heterogeneity in peripheral benzodiazepine binding sites. // J. Neurochem., 1987, 49, 1407-1414.

10. Azuma Motoki, Yasuaki Kabe, Chikanori Kuramori, Masao Kondo, Yuki Yamaguchi, Hiroshi Handa. Adenine Nucleotide Translocator Transports Haem Precursors into Mitochondria // PLoS ONE, 2008, 3(8), 3070.

11. Baines C.P., Kaiserl R.A., Sheiko Т., Craigen W.J. and Molkentinl J.D. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. // Lett. Nature Cell Biol., 2007, 9(5), 550-560.

12. Basile A.S., Skolnick P. Subcellular localization of "peripheral-type" binding sites for benzodiazepines in rat brain // J.Neurochem., 1986, 46, 305-308.

13. Basile A.S., Klein D.C., Skolnick P. Characterization of benzodiazepine receptors in the bovine pineal gland: evidence for the presence of an atypical binding site // Brain Res. 1986,387(2), 127-35.

14. Basile A.S., Weissman B.A., Skolnick P. Maximal electroshock increases the density of 3H.Ro 5-4864 binding to mouse cerebral cortex // Brain Res Bull., 1987, 19(1), 1-7.

15. Basso E., Petronilli V., Forte M.A., Bemardi P. Phosphate is essential for inhibition of the mitochondrial permeability transition pore by cyclosporin A and by cyclophilin D ablation // J Biol Chem., 2008, 283(39), 26307-11.

16. Benavides J., Cornu P., Dennis Т., Dubois A., Hauw J.-J., Mackenzie E.T., Sazdovich V., Scatton B. Imaging of human brain lesions with an site radioligand // Annals.Nneurol., 1988, 24, 708-712.

17. Beatrice M.C., Vercesi A. and Pfeiffer D.R. The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential and the retention of Ca2+ by mitochondria.//J. Biol. Chem., 1980, v. 255, p. 8663-8671.

18. Bera A.K., Ghosh S., and Das S., Mitochondrial VDAC can be phosphorylated by cyclic AMP-dependent protein kinase // Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, 209; 213-217.

19. Bernardi P., Broekemeier K.M. and Pfeiffer D.R. Recent progress on regulation of the mitochondrial permeability transition pore; a Cyclosporin A-sensitive pore in the inner mitochondrial membrane.//J. Bioenerg. Biomembr., 1994, v. 26, p. 509-517.

20. Bernardi P. Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers and permeability transition // Physiological reviews, 1999, v. 79, №4, pp. 1127-1155.

21. Blahos IT.J., Whalin M:E., Krueger K.E. Identification and purification of a 10 kDa protein1 associated with mitochondrial benzodiazepine receptors // J.Biol.Chem., 1995, 270, 20285-20291.

22. Braestrup C., Squires R.F. Specific benzodiazepine receptors in rat brainоcharacterized by high-affinity ( H)diazepam binding // Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(9), 3805-9.

23. Broekemeier K.M., Dempsey M.E., Pfeiffer D.R. Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria.//J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 7826-7830.

24. Brustovetsky N., and Klingenberg M. Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large chennal by Ca2+ // Biochemistry, 1996, 35(26), 8483-8488.

25. Burnett G., and Kennedy E.P. The enzymatic phosphorylation of proteins // J. Biol. Chem., 1954, 211(2), 969-980.

26. Canat X., Carayon P., Bouaboula M., Cahard D., Shire D., Roque C., Le Fur G., Casellas P. Distribution profile and properties of peripheral type benzodiazepine receptors on human hemopoetic cells // Life.Sci., 1992, 52, 107-118.

27. Casellas P., Galiegue S. and Basile A.S. (2002) Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486.

28. Castedo M., Perfettini J.L., Kroemer G. Mitochondrial apoptosis and the peripheral benzodiazepine receptor: a novel target for viral and pharmacological manipulation // J Exp Med., 2002, 196(9), 1121-5.

29. Costa E., Guidotti A. Diazepam binding inhibitor (DBI): a peptide with multiple biological actions // Life Sci., 1991, 49, 325-3441. Л I

30. Crompton M., Ellinger H., Costi A. Ingibition by cyclosporin A of Ca -dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress //Biochem. J., 1988, v. 255, p. 357-360.

31. De Souza E.B., Anholt R.R.H., Murphy K.M.M., Snyder S.H., Kuhar M.J. Peripheral-type benzodiazepine receptor in endocrine organs: Autoradiographic localization in rat pituitary, adrenal, and testis // Endocrinology., 1985, 116, 567573.

32. Drugan R.C. Peripheral benzodiazepine receptors: molecular pharmacology to possible physiological significance in stress-induced hypertension // Clin Neuropharmacol., 1996, 19(6), 475-96.

33. Ducis I., Norenberg L.O., Norenberg M.D. Effect of ammonium chloride on the astrocyte benzodiazepine receptor // Brain Res., 1989, 493 (2), 362-365.

34. Evtodienko Yu.V., Teplova V.V., Sidash S.S., Ichas F., Mazat J.-P. Microtubule-active drugs suppress the closure of permeability transition pore in tumor mitochondria.//FEBS Lett., 1996, v. 393, p. 86-88.

35. Farges R., Joseph-Liauzun E., Shire D., Caput D., Le Fur G., Loison G., Ferrara P. Molecular basis for the different binding properties of benzodiazepines to human and bovine peripheral-type benzodiazepine receptors // FEBS Lett., 1993, 335(3), 305-8.

36. Ferrarese C., Tortorella R., Bogliun G., Beghi E., Cogliati Т., Zoia C., Passoni D., Frattola L. Decreased density of lymphocyte benzodiazepine receptors in drug-resistant epileptic patients // Epilepsy Res., 1997, 27(3), 181-5.

37. Ferrari S., Moret V. and Siliprandi N. Protein phosphorilation in rat liver mitochondria//Mol. and Cell Biochem., 1990, 97, 9-16.

38. Fischer R., Schmitt M., Bode, J.G. and Haussinger D. (2001) Expression of the peripheral-type benzodiazepine receptor and apoptosis induction in hepatic stellate cells. Gastroenterol. 120, 1212-1226

39. Galiegue S., Tinel N., and Casellas P. The peripheral benzodiazepine receptor: a promising therapeutic drug target // Curr. Med. Chem., 2003, 10(16), 1563-1572.

40. Gavish M., Fares F. The effect of freezing and thawing or of detergent treatment on peripheral benzodiazepine binding: the possible existence of an endogenous ligand // Eur J Pharmacol., 1985, 107(2), 283-4.

41. Gavish M., Bachman I., Shoukrun R., Katz Y., Veenman L., Weisinger G. and Weizman A. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor // Pharmacol. Rev., 1999, 51, 629-650.

42. Gunter Т.Е., Pfeiffer D.R. Mechanisms by wich mitochondria transport calcium // J. Physiol., 1990, v. 258, p. 755-786.

43. Grupp I.L., French J.F., Matlib M.A. Benzodiazepine Ro 5-4864 increases coronary flow // Eur J Pharmacol., 1987, 143(1), 143-7.

44. Halestrap A.P. The mitochondrial permeability transition: its molecular mechanism and role in reperfusion injury // Biochem. Soc. Symp., 1999, 66, 181203.

45. Hauet Т., Liu J., Li H., Gazouli M., Culty M., and Papadopoulos V. PBR, StAR, and PKA: partners in cholesterol transport in steroidogenic cells // Endocr. Res., 2002, 28(4), 395-401.

46. Hirsch J.D., Beyer C.F., Malkowitz L., Beer В., Blume A.J. Mitochondrial benzodiazepine receptors mediate inhibition of mitochondrial respiratory control // Mol.Pharmacol., 1989, 35, 157-163.

47. Hunter D.R., Haworth R.A. The Ca -induced membrane transition in mitochondria.//Arch. Biochem. Biophys., 1979, v. 195, p. 468-477.

48. Itzhak Y., Baker L. and Norenberg M.D. Characterization of the peripheral-type benzodiazepine receptors in cultured astrocytes: evidence for multiplicity // Glia ., 1993, 9,211-218.

49. Jun Liu, Hua Li, VassiliosPapadopoulos. PAP7, PBR/PKA-RIa-assiciated protein: a new element in the relay of the hormonal induction of steroidogenesis // Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2003, 85, 275-283.

50. Kinnally K.W., Zorov D.B., Antonenko Y.N., Snyder S.H., McEnery M.W., and, Tedeschi H. Mitochondrial benzodiazepine receptor linked to inner membrane ion channels by nanomolar actions of ligands // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90(4), 1374-1378.

51. Knudsen J., Hojrup P., Hansen H.O., Hansen H.F., Roepstorff P: Acyl-CoA-binding protein in the rat // Biochem. J., 1989, 262, 513-519.

52. Kokoszka J.E., Waymire K.G., Levy S.E., Sligh J.E., Cai J. The ADP/ATP translocator is not essential for the mitochondrial permeability transition pore. // Nature, 2004, 427, 461-465.

53. Kroemer G., Reed J.C. Mitochondrial control of cell death // Nature.Med., 2000, 6,513-519.

54. Kruger K.E., Papadopoulos V. Peripheral-type benzodiazepine receptors mediate transpocation cholesterol from outer to inner membranes in adrenocortical cells // J.Biol.Chem., 1990, 265, 15015-15022.

55. Laemmli U. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 II Nature, 1970, 227, 680-685.

56. Lai J.C., Clark J.B. Preparation of synaptic and nonsynaptic mitochondria from mammalian brain // Methods Enzymol., 1979, 55, 51-60.

57. Lehninger A.L. Mitochondria and calcium transport // Biochem. J., 1980, v. 190, p. 129.

58. Le Quoc K. and Le Quoc D. Involvement of the ADP/ATP carrier in calcium-induced perturbations of the mitochondria inner membrane permeability: impotance of the nucleotide binding site // Arch.Biochem. Biophys., 1988, 265, 249-257.

59. Le Quoc K. and Le Quoc D. Critical role of sulfhydryl groups in mitochondrial inner membrane structure // J.Biol.Chem., 1985, 260, 7422-7428.

60. Liu J., Li H., Papadopoulos V. PAP7, a PBR/PKA-RIalpha-associated protein: a new element in the relay of the hormonal induction of steroidogenesis // J Steroid Biochem Mol Biol., 2003, 85(2-5), 275-83.

61. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farra A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagents II J.Biol. Chem., 1951, 193(2), 265-275.

62. Malmstrom K. and Carafoli E. The interaction of Ca2+ with mitochondria from human myometrium// Arch. Biochem. Biophys., 1977, 182(2), 657-666.

63. McGeer E.G., Singh E.A., McGeer P.L. Peripheral-type benzodiazepine binding in Alzheimer disease // Alzheimer.Dis.Assoc.Disord., 1988, 2, 331-336.

64. Melloni E., Averna M., Salamino F., Sparatore В., Minafra R., Pontremoli S., Acyl-CoA-binding protein is a potent wi-calpain activator // J". Biol. Chem., 2000, 275, 82-86.

65. Muller G. and Bandlow W. Protein phosphorylation in yeast mitochondria: cAMP-dependence, submitochondrial localization and substrates of mitochondrial protein kinases // Yeast, 1987, 3, 161-174.

66. Nichols D.S., Crompton M. Mitochondrial calcium transport // FEBS Lett., 1980, 111,261-268.

67. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Brierly G.R. and Pfeiffer D. R. Magnesium ion modulates the sensitivity of the mitochondrial permeability pore to cyclosporin A and ADP // Arch. Biochem. Biophys., 1994, 311, 219-228.

68. Oliveira J.M., Gon?alves J. In situ mitochondrial Ca2+ buffering differences of intact neurons and astrocytes from cortex and striatum // Biol Chem., 2009, 284(8), 5010-20.

69. Olson J.M.M., Ciliax B.J., Mancini W.R., Young A.B. Presence of peripheral-type benzodiazepine binding sites on human erythrocyte membranes // Eur. J.Pharmacol., 1988, 152,47-53.

70. Papadopoulos V. Peripheral-type benzodiazepine/diazepam binding inhibitor receptor: biological role in steroidogenic cell function // Endocr. Rev., 1993, 14 222-240.

71. Parola A.L., Putnam C.W., Russell D.H., Laird H.E. 2nd. Solubilization and characterization of the liver peripheral-type benzodiazepine receptor // J Pharmacol Exp Ther., 1989, 250(3), 1149-55.

72. Parola A.L., Yamamura H.I. and Laird H.E. 3rd. Peripheral-type1 benzodiazepine receptors // Life Sci., 1993, 52, 1329-1342.

73. Paul S.M., Kempner E.S., Skolnick P. In situ molecular weight determination of brain1 and peripheral-benzodiazepine binding sites // Eur J Pharmacol., 1981, 76(4), 465-6.

74. Pawlikowski M., Lyson К., Kunert-Radek J., Stepien H. Effect of benzodiazepines on the proliferation of mouse spleen lymphocytes in vitro // J Neural Transitu, 1988, 73(2), 161-6.

75. Peter P.R., Xingming D., Boyd K.C., Stratford W.M. A functional role for mitochondrial proteinkinase Ca in bcl 2 phosphorilation and suppression of apoptosis.//J. Biol. Chem., 1998, 273, 25436-2442.

76. Petronilli V., Cola C., Bernardi P. Modulation of the mitochondrial Cyclosporin A-sensitive permeability transition pore.//J. Biol. Chem., 1993, 268, 1011-1016.

77. B.M. Polster G., Basanez A. Etxebarria, J.M. Hardwick, D.G. Nicholls. Calpain I induces cleavage and release of apoptosis-inducing factor from isolated mitochondria // J. Biol. Chem., 2005, 280, 6447-6454.

78. Riond J., Mattei M.G., Kaghad M., Dumont X., Guillemot J.C., Le Fur G., Caput D., Ferrara P. Molecular cloning and chromosomal localization of a human peripheral-type benzodiazepine receptor // Eur.J.Biochem., 1991, 195, 305-311.

79. Sabirov R.Z., Sheiko Т., Liu H., Deng D., Okada Y., Craigen WJ. Genetic demonstration that the plasma membrane maxianion channel and voltagedependent anion channels are unrelated proteins // J. Biol. Chem., 2006, 281, 1897-1904.

80. Saris N.-E.L., Krestinina O.V., Azarashvili T.S., Odinokova I.V., Tyynela J., Yevtodienko Yu.V. Regulation of ATP syntase by Ca and Mg -dependent phosphorylation of subunit с. 11 Advances in Magnesium Research: Nutrition and Health, 2001, pp. 101-106.

81. Snyder S.H. GABA-benzodiazepine receptor complex: focus on receptor subtypes and cyclopyrrolone drugs // Isr J Med Sci., 1987, 23(1-2), 145-52.

82. Sprengel R., Werner P., Seeburg P.H., Mukhin A.G., Santi M.R., Grayson D.R., Guidotti A., Krueger K.E. Molecular cloning and expression of cDNAencoding a peripheral-type benzodiazepine receptor I I J.Biol.Chem., 1989, 264, 20415-20421.

83. Szabo I., Bock J., Jekle A., Soddemann M., Adams C., Lang F., Zoratti M., Gulbins E. A novel potassium channel in lymphocyte mitochondria // J. Biol. Chem., 2005, 280, 12790-12798.

84. Tan W., Colombini M. VDAC closure increases calcium ion flux // Biochim Biophys Acta., 2007, 1768(10), 2510-5.

85. Tanveer A., Virji S., Andreeva L., Totty N.F., Hsuan J.J., Ward J.M., Crompton M. Involvement of cyclophilin D in the activation of a mitochondrial pore by Ca~ and oxidant stress // Eur.J.Biochem., 1996, 15, 166-172.

86. Technikova-Dobrova Z., Sardanelli A.M. and Papa S. Phosphorylation of mitochondrial proteins in bovine heart. Characterization of kinases and substrates //FEBS Lett., 1993, 322(1), 51-55.

87. Tomaska L. Mitochondrial protein phosphorylation: lessons from yeasts // Gene, 2000, 255(1), 59-64.

88. Verma A., Nye J.S. and Snyder S.H. Porphyrins are endogenous ligands for the mitochondrial (peripheral-type) benzodiazepine receptor // Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1987, 84, 2256-2260.

89. Wang H.G., Pathan N., Ethell I.M., Krajewski S., Yamaguchi Y., Shibasaki F.,1. Л I

90. McKeon F., Bobo Т., Franke T.F., and Reed J.C. Ca -induced apoptosis through calcineurin dephosphorylation of BAD // Science, 1999, 284(5412), 339-343:

91. Zamzami N., Susin S.A., Marchetti P., Hirsch Т., Gromez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis //J. Exp. Med., 1996, v. 183(4), 1533-1544.

92. Zisterer D.M, Williams D:C.' Peripheral-Type Benzodiazepine Receptors // Gen. Pharmac. 1997, 29(3), 305-314

93. Zoratti M., Szabo I. The mitochondrial permeability transition 11 Bioch. Biophys. Acta, 1995, v. 1241, 139-176.

94. Zoratti M., De Marchi U., Gulbins E., Szabo I. Novel channels of the inner mitochondrial membrane // Bioch. Biophys. Acta, 2009, 13, 3-8.

95. С чувством глубокой признательности выражаю благодарность руководителю моей работы Азарашвили Тамаре Сергеевне за чуткое отношение, руководство и помощь в работе.

96. Я благодарен моим рецензентам и оппонентам профессорам Маевскому Евгению Ильичу, Сергеевой Марине Глебовне и Новоселову Владимиру Ивановичу за время, уделенное моей работе, и за полезные замечания.

Информация о работе

Грачев, Дмитрий Евгеньевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы