Выявление мутаций в генах K-ras, B-raf и APC при некоторых онкологических заболеваниях

Вдовиченко, Константин Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление мутаций в генах K-ras, B-raf и APC при некоторых онкологических заболеваниях
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Выявление мутаций в генах K-ras, B-raf и APC при некоторых онкологических заболеваниях"

На правах рукописи

Вдовиченко Константин Константинович

Выявление мутаций в генах k-ras, b-raf и APC при некоторых онкологических заболеваниях

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно - клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Белохвостое Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Чеботарев Александр Николаевич

доктор медицинских наук

Шахтарин Владимир Васильевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «РГМУ» Федерального агентства но здравоохранению и социальному развитию РФ

на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8 |

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «_»_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

доцент О. Б. Гигини

Защита состоится «_»

2006 г. в

час.

¿Ж>6А

3 Актуальность проблемы

В России и других развитых странах смертность от рака стоит на втором месте после смертности от сердечно-сосудистых заболевший. Известно, что при выявлении опухоли на ранних этапах развития заболевания клинический прогноз является наиболее благоприятным, вероятность излечения многих форм рака при этом высока, объем оперативного или иного лечебного вмешательства в таких случаях имеет ограниченную травматичность для больного. Вследствие этого диагностика злокачественных новообразований на доклинических стадиях развития опухолевого процесса является одной из приоритетных задач в современной онкологии.

В последние несколько десятилетий наука добилась больших успехов в раскрытии молекулярных механизмов канцерогенеза, однако большинство исследований в данной области не выходит за рамки академической науки. В последние годы наметилась тенденция интеграции фундаментальных и прикладных лабораторных исследований и медицинской практики для нужд медицины в диагностике и выборе тактики лечения онкологических заболеваний. Раскрытие молекулярных механизмов канцерогенеза позволяет создавать новые высокоэффективные нетоксичные агенты, действующие непосредственно при повреждениях тех или иных генов, повреждающихся при возникновении неоплазий. При таком подходе увеличивается терапевтический эффект лечения и уменьшается проявление побочных эффектов. Применение целевых агентов имеет смысл при известной молекулярной картине опухоли, что требует разработки новых, применимых в клинике методов обнаружения генетических мутаций

Хотя современная медицина обладает большим арсеналом методов инструментальной клинической диагностики онкологических заболеваний, раннее обнаружение опухолей возможно не всегда. Кроме того, многие «инструментальные» диагностические процедуры имеют инвазивный характер.

В связи с отсутствием в современной клинической практике «инструментов» для установки точного молекулярно-генетнческого «диагноза» при опухолевых заболеваниях возникает задача поиска новых, чувствительных и надежных методов диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. К числу таких методов относится новое направление в современной медицине - молекулярно-генетическая диагностика. В отличие от иммунохимических онкомаркеров, молекулярно-генетические онкомаркеры обычно являются мутантными генами опухолевого происхождения, попадающие в кровоток, изменения в которых имеют как качественный, так и количественный характер. Основным исследуемым материалом при этом служит плазма крови. Факт присутствия нуклеиновых кислот в плазме крови был обнаружен еще в 1948 году (Mandel Р et al., 1948). При более поздних исследованиях состава и происхождения нуклеиновых кислот плазмы крови было обнаружено, что опухолевые клетки выделяют свою ДНК в кровоток (Stroun М et al., 1989), причем количество

РОС. НАЦИОНАЛЬНА ' БИБЛИОТЕКА

ДНК в плазме крови онкологических пациентов обычно намного больше, чем у здоровых (Stroun M et al., 1989; Shapiro В et al., 1983).

При исследовании ДНК из опухоли и плазмы крови обнаруживаемые мутации в генах-онкомаркерах идентичны, в то время как при исследовании ДНК плазмы крови здоровых пациентов (не имеющих онкологического диагноза) такие мутации не выявляются (Vasioukhin V et al., 1994; Anker P et al., 1997). Отсутствие в норме и присутствие при раке в плазме крови мутантных генов опухолевого происхождения является принципиальным преимуществом молекулярно-генетических онкомаркеров перед иммунохимическими. Преимуществом является и более высокая чувствительность молекулярно-генетических маркеров (в тысячу и более раз).

Молекулярно-генетический анализ позволяет выявить мутации в онкозначимых генах, когда трансформированных клеток в организме еще менее миллиона, то есть на доклинических этапах онкологического заболевания. Несмотря на большое количество научных работ, методы диагностики онкологических заболеваний, описанные в литературе и позволяющие проводить исследования в условиях хорошо оснащенных научных лабораторий, в широкой клинической практике до сих пор не применяются. В настоящей работе мы оптимизировали такие методы для применения в условиях клинико-диагностических лабораторий.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось усовершенствование существующих методов анализа генов K-ras, B-raf и APC для использования их в диагностике и мониторинге некоторых онкологических заболеваний. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) адаптация метода обогащенной ПЦР гена K-ras для выявления мутаций этого гена в различных биологических образцах, в том числе и вплазме крови;

2) оптимизация условий проведения ПЦР и последующего анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов (SSCP) для выявления мутаций в гене B-rafi

3) разработка праймеров и подбор условий проведения ПЦР и SSCP-анализа для выявления мутаций в гене А PC;

4) оценка применимости разработанных методических приемов к анализу различных биологических образцов, включая плазму крови, для массового обследования.

Научная новизна

Научная новизна данного исследования заключается в:

1) адаптации методов исследования молекулярно-генетических онкомаркеров, известных для опухолевых тканей, к ДНК плазмы крови;

2) разработке методики определения мутаций в гене B-raf {15-й экзон) в различных биологических образцах методом SSCP-анализа;

3) разработке праймеров и подбора условий определения мутаций в гене ЛРС(!5-й экзон, район 1309-го кодона) в различных биологических образцах методом SSCP-анализа.

Практическая значимость работы

1) методики анализа генов K-ras, B-raf и APC адаптированы к использованию в научно-исследовательских медицинских учреждениях и молекулярно-диагностических центрах. Методы анализа генов K-ras и B-raf внедрены в работу Казанского Государственного Университета, Ростовского Медицинского Университета, Саратовского Медицинского Института; ООО «Центр молекулярно-генетической диагностики» (г. Тюмень).

2) на основе полученных данных сформировано новое прикладное исследование - «Создание набора для диагностики ряда онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта».

Апробация работы

Материалы диссертации апробированы на совместной научно-практической конференции сотрудников лаборатории регуляции кроветворения, отделения онкогематологии, отдела нейроонкологии и лаборатории молекулярной генетики НИИ детской гематологии г. Москвы от 30 сентября 2004 г.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен в одном томе на 200 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы библиографический список (2 источника отечественной и 232 источника зарубежной литературы) и приложение. Работа содержит 7 таблиц, 38 рисунков. Работа выполнена в НИИ детской гематологии МЗ РФ (директор НИИ ДГ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А. Г. Румянцев), на базе лаборатории молекулярной генетики (зав. лабораторией - доктор медицинских наук А. С. Белохвостое).

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Стандартные биологические образцы с охарактеризованными генами. В качестве положительных контролей для исследования гена K-ras использовали ДНК клеточной линии SW480. В качестве положительного контроля при исследовании гена B-raf использовали ДНК клеточных линий НТ29 и SK-MEL-28, любезно предоставленных П. М. Чумаковым. Кроме того, в целях проверки качества определения мутантного гена K-ras и как межлабораторный контроль использовали ДНК, полученную из послеоперационного материала от больного опухолью толстой кишки с установленным наличием в этой ДНК мутантной формы гена K-ras. Аликвота этой ДНК была любезно предоставлена профессором А. Руссо (Antonio Russo), онкологический

институт г. Палермо, Италия, а также ДНК, полученную из послеоперационного материала с охарактеризованной мутацией в гене K-ras, аликвота которой была любезно предоставлена М. Г. Якубовской, РОНЦ РАМН. В качестве образцов, имеющих мутации в гене B-raf и А PC, использовали ДНК из послеоперационного материала, характер мутаций в котором был установлен методом прямого секвенирования. В качестве отрицательных контролей при исследовании гена K-ras использовали ДНК клеточных линий Н-9, предоставленные А. А. Ставровской, РОНЦ РАМН, а также линий НТ29 и SK-MEL-28, в которых ген K-ras представлен аллелями дикого типа. Отрицательным контролем при исследовании гена B-raf служила ДНК клеточной линии SW480.

Оптимизацию условий проведения анализа вышеперечисленных генов проводили как с использованием контрольных препаратов, так и с использованием клинических образцов.

Биоло! ические образцы из клинического материала. Клинический материал был любезно предоставлен отделением опухолей головы и шеи НИИ онкологии им. Герцена, лабораторией патоморфологии 62-ой городской больницы, отделением оперативной лапароскопии 31-ой больницы г. Москвы, НИИ гастроэнрологии, НИИЦ проктологии, отделением онкологии РДКБ, амбулаторным отделением и отделением преливания крови НИИ детской гематологии МЗ РФ и заводским здравпунктом ОАО «Стерлитамак-каучук».

Клиническими образцами служили препараты ДНК, полученные из послеоперационного материала (свежая ткань и парафинированные блоки для гистологических исследований), плазмы и клеток крови, клетчного осадка мочи, а также буккальных клеток (соскоб со щеки).

Для оценки пригодности выбранных условий проведения анализов генов K-ras, B-raf и APC использовали различные биологические образцы, полученные от обследуемых пациентов. При этом пациентов условно разделили на 4 группы: здоровые доноры; лица без онкологического диагноза; лица, работающие во вредных условиях, связанных с канцерогенной опасностью; онкологические и онкогематологические больные со злокачественными новообразованиями.

В первую группу (здоровые доноры) вошли 34 человека, у которых анализировали ДНК из плазмы и/или клеток крови, а иногда ДНК выделенную из буккальных клеток слизистой внутренней поверхности щеки.

Вторую группу составляли лица без онкологического диагноза, обратившиеся самостоятельно или по направлению врача для исключения или обнаружения возможности онкологического заболевания (94 человека).

Третью группу составляли лица, работающие во вредных условиях, связанных с канцерогенной опасностью (386 человек). Эти лица работают в условиях загрязнения воздуха цехов парами органических растворителей и промежуточными продуктами химического органического синтеза искусственных каучуков.

Четвертую группу составляли онкологические и онкогематологические больные со злокачественными новообразованиями (233 человека). Эта группа была разделена на подгруппы в зависимости от локализации опухоли И других характеристик.

Выделение ДНК. Плазму крови получали из венозной крови путем трехступенчатого центрифугирования. Плазму крови обрабатывали протеиназой К и затем выделяли ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции с последующей этанольной преципитацией.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили либо по стандартной схеме с использованием соответствующих пар праймеров (15-й экзон гена B-raf район 1309 кодона гена АРС), либо по трехпраймерной схеме (ген K-ras) на термоциклере MasterCycler (Eppendorf, Германия). Последовательности праймеров для амплификации участка 1-го экзона гена K-ras приведены в Vasioukhin et al., 1994, гена B-raf в работе Davies et al., 2002. Нуклеотидные последовательности праймеров для анализа района 1309-го кодона гена АРС были подобраны с использованием программ Premier Primer 5.0 (PREMIER Biosoft International) и Fast PCR 2.5.39 ("PCR Team", Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland)

SSCP-анализ. Поиск точковых мутаций проводили методом регистрации конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP-анализ). Визуализацию ДНК в ПААГ проводили при помощи окрашивания нитратом серебра.

Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование). Для подтверждения специфичности получаемого амплифицируемого фрагмента проводили определение его нуклеотидной последовательности методом секвенирования с использованием аппарата ABI Prism 373а.

Статистическая обработка результатов. Оценку достоверности различий между частотами встречаемости качественных признаков проводили с помощью расчета непараметрической статистики и точного критерия Фишера с использованием программы STATISTICA v. 6.0 («StatSoft»),

Результаты и их обсуждение

Оптимизация условий проведения обогащенной ПЦР для выявления мутаций в 12-ом кодоне гена K-ras. Содержание ДНК в плазме крови здоровых доноров в среднем составляет около 20 нг/мл, т. е. примерно в 2500 раз меньше, чем в клетках из того же объема крови. Этот факт потребовал адаптации условий проведения ПЦР применительно к ДНК плазмы крови.

Для оптимизации анализа проводили подбор условий для отдельных этапов. Оптимизировали параметры ПЦР: количество ДНК-поЛимеразы, кратность буфера для проведения ПЦР, температуру отжига праймеров и временные характеристики проведения ПЦР.

В эксперименте по подбору условий анализа использовали ДНК плазмы крови. Было показано, что оптимальными условиями проведения первой ПЦР (в 25 мкл) при анализе гена K-ras являются: 2 ед Taq-полимеразы,

кратность буфера для ПЦР 1,5. Подбор оптимальной температуры отжига праймеров в первой ПЦР проводили, варьируя температуру от 48°С до 58°С. Наилучшее соотношение по количеству амплификата и отсутствием дополнительных неспецифических продуктов наблюдали при температуре 54°С.

При малых концентрациях ДНК использование стандартной концентрации праймеров (обычно 200 нМ) нарушает оптимальное соотношение ДНК-матрицы и праймеров. Поэтому в целях оптимизации методики варьировавали концентрацию праймеров. Была изучена воспроизводимость результатов ПЦР при выявлении мутаций в 12-м кодоне гена К-га$ в условиях изменения концентрации праймеров. Показано, что чувствительность анализа максимальна при концентрации праймеров 20 нМ на первом этапе ПЦР. Для подбора концентрации праймеров в первом этапе ПЦР и выявления влияния этой концентрации на результаты анализа провели три этапа анализа обогащенной ПЦР: первую ПЦР (различные концентрации праймеров), первую рестрикцию и вторую ПЦР, условия которй оставались постоянными, (рис. 1).

Из рисунка видно, что концентрация праймеров менее 10 нМ недостаточна. В то же время увеличение концентрации праймеров в первом этапе ПЦР до 30 нМ увеличивает количество неспецифических продуктов (рис. 1, дорожка 14). Увеличение концетрации праймеров более 30 нМ увеличивает количество неспецифических продуктов в условиях малых концентраций ДНК (электрофореграмма не приведена). Количество и «чистота» целевого продукта при концентрации 20 нМ являются оптимальными. Эти условия были использованы для анализа образцов ДНК плазмы крови, поскольку количества ДНК в этих образцах сопоставимы с таковыми в эксперименте.

Таким образом, оптимальными для выявления мутантной формы гена К-газ (мутация в двух первых нуклеотидах 12-го кодона) оказались следующие условия ПЦР (с «горячим» стартом):

Первый этап- Т^ - 54°С, 1 мин; элонгация - 72°С, 1 мин, плавление цепей - 94°С, 1 мин, количество циклов - 25. Концентрация праймеров - 20 нМ, 2 ед полимеразы. (1,5 х буфер для ПЦР).

Первая обработка ждонуклеазой рестрикции • 60 °С, 60 мин.

Второй этап (ПЦР с «горячим» стартом): Т^ - 54°С, 1 мин, элонгация цепи - 72"С, 1 мин, плавление цепей - 94°С, 40 с, количество циклов - 35, конечный отжиг - 54°С, 3 мин. Концентрация праймеров - 100 нМ, 2 ед полимеразы.

Вторая обработка эндонуклеазой рестрикции 60 "С, 60 мин.

Была исследована чувствительность выявления мутантной формы гена К-газ при оптимальных условиях проведения ГПДР. Показано, что в охарактеризованном образце ДНК из опухоли толстой кишки, содержащем не более 10% мутантной формы гена ЛГ-гаг, мутации выявлялись при анализе уже 30 геном-эквивалентов (рис. 2).

Рис. 1. Электрофореграмма эксперимента по подбору концентрации праймеров в первом этапе ПЦР для анализа гена К-гш.

Дорожки 1-7 - количество вносимой в смесь для первою этапа ПЦР ДНК* равно 900 пкг, дорожки 8-14 - количество вносимой в смесь для первого этапа ПЦР ДНК* равно 300 пкг Концентрация праймеров в смеси для первого этапа ПЦР (условия рестрикции и второго этапа ПЦР постоянны):_

Номера дорожек 1,8 2,9 3,10 4, 11 5, 12 6,13 7, 14

Концентрация праймеров, нМ 0 1 5 10 15 20 30

* - ДНК из послеоперационного материала опухоли толстой кишки (ДНК была любезно предоставлена профессором А. Руссо (Antonio Russo), онкологический институт г Палермо, Италия)

1 Ш 2 2R 3 3R 4 4R 5

157 bp. 143 bp-

Рис. 2.

Определение чувствительности анализа при

выявлении мутантной формы гена К-гаь.

1-4 -результаты третьего этапа анализа (вторая ПЦР); 1Я~4Я- результаты четвертого этапа анализа (обработка BstN I); ■ 5 - маркер длины нуклеотидных фрагментов.

Количество геномной ДНК для выявления мутантной формы гена, пкг: 1 - 5280 или 1600 геном-эквивалентов; 2 - 528 или 160 геном-эквивалентов;

3-106 или 30 геном-эквивалентов;

4-53 или 15 геном эквивалентов.

Специфичность ПЦР гена K-ras с мутациями в 12-м кодоне и характер точковых мутаций. Дня подтверждения специфичности амплифицируемого фрагмента гена K-ras методом прямого секвенирования использовали клинический образец (биологический материал больного аденокарциномой поджелудочной железы), в котором при исследовании данного гена методом обогащенной ПЦР была обнаружена мутация.

Часть секвеиограммы продутое амплификации и расшифровка нуклеотидной последовательности для образца ДНК из опухолевого материала этого больного приведена на рис. 3. При секвенировании этого образца в нуклеотидной последовательности гена K-ras в позиции, отвечающей 12-му кодону, находится триплет СТА, что соответствует комплементарной последовательности GAT - триплету, кодирующему аминокислотный остаток аспарагиновой кислоты. В норме в данном кодоне должен находиться аминокислотный остаток глицина, кодируемого триплетом GGT (ССА на данной секвенограме). Таким образом, из секвенограммы видно, что в нуклеотидной последовательности гена K-ras в исследуемом образце произошла нуклеотидная замена во второй позиции 12-го кодона гена.

Такая замена основания нуклеотида С—*Т (цитозин на тимин) приводит к синтезу мутантного белка Ras с заменой аминокислоты глицин на аспарагиновую кислоту. Замещение глицина на аспартат ведет, вероятно, к изменению конформации белкового продукта гена K-ras вследствие появления в регуляторном сайте отрицательного заряда, мимикрирующего GTP, при связывании с которым этот белок переходит в активную форму. Это ведет к постоянной активации этого белка и неконтролируемой стимуляции клеточного деления.

С G С С |АI с| А 5 С Т С С А Л. С t А С СА

Рис. 3. Часть секвенограммы исследуемого участка гена K-ras из ДНК послеоперационного опухолевого материала больного Т Приведена 5'-3' последовательность антисмысловой цепи. Жирной линией подчеркнута часть последовательности праймера «5'». Рамкой обведен 12-й кодон, стрелка указывает на яуклеотидную замену С—>Т, приводящую к аминокислотной замене в 12-й позиции Gly—»Asp белкового продукта гена K-ras.

Всего в представленной работе на присутствие мутантной формы гена К-гю было проанализировано образцов от 194 пациентов с различными онкологическими заболеваниями и 90 больных с неонкологическими заболеваниями; опухолевая ткань 54 больных из парафинированных блоков с диагнозом, подтвержденным морфологически; а также группа обследуемых (386 человек), работающих в условиях вредного производства.

Хотя в задачу исследования не входила оценка частоты возникновения мутаций гена К-газ у отдельных групп онкологических больных, небольшие группы больных, для которых характерно наличие или отсутствие данной мутации, были проанализированы для оценки пригодности метода в клинико-диагностической практике. Так у больных с опухолями молочной железы, где такая мутация по литературным сведениям практически не встречается, присутствие мутантной формы гена К-газ не выявлено ни в образцах ткани самих опухолей (40 образцов), ни в образцах ДНК плазмы крови (56 образцов).

Таким образом, при опухолях молочной железы мутации 12-м кодоне гена К-гая по данным нашего исследования не характерны, что согласуется с литературными сведениями. В образцы ДНК опухолей толстой кишки мутации в 12-м кодоне гена К~га$ удалось обнаружить в 2-х случаях из 5-ти, причем присутствие мутантной формы гена обнаруживалось и в соответствующих образцах ДНК плазмы крови. По данным литературы частота встречаемости мутантного гена К-гай в популяции северной Европы мала для колоректальных опухолей (15%), тогда как в США и в западной Европе эта цифра составляет около 70%. В данной работе полученная цифра, которая ни в коей мере не претендует на значение частоты встречаемости мутантной формы гена К-гая при колоректальных раках в российской популяции, тем не менее занимает промежуточное положение среди таковых, приводимых для популяций северной Европы и США

При исследовании материала ДНК опухолей поджелудочной железы мутации в гене К-гав выявили в 9 случаях из 15, что сотавляет 60%. При обследовании ДНК плазмы крови от 7-ми пациентов с подозрением на опухоль поджелудочной железы мутантная форма гена К-гаэ была выявлена в 4 случаях (57%). При обследовании двух пациентов, прооперированных по поводу удаления опухоли поджелудочной железы через неделю после проведения операции в ДНК плазмы крови этих пациентов обнаруживалась мутантная форма гена К-гав. Имеются литературные данные о том, что ДНК опухолевого происхождения может циркулировать в кровотоке до двух недель после удаления опухоли, по-этому присутствие в плазме крови мутантного гена может иметь прогностическую ценность только после этого срока.

При паппилярном раке щитовидной железы мутации в гене К-гав были обнаружены в 4 образцах опухолевого материала из 6 В плазме крови таких больных в 4 случаях из 18.

Анализ, проведенный у 33 больных онкогсматологическими заболеваниями, показал, что в 8 (24%) случаях в клетках крови

присутствовала мутантная форма гена К-гая. Это относилось к больным лейкозами и неходжкинскими лимфомами, тогда как при лимфогранулематозе мутаций в гене К-гаэ не встречалось. В литературе приводятся данные о возможности активации генов гав-семейства при онкогематологических заболеваниях: при этом описывается возможность активации генов Н-газ и Ы-гаБ, а мутации в гене К-гси - при миелодисплазиях. Данные, полученные в этой работе при обследовании онкогематологических больных, несколько отличаются от приводимых в литературе для западноевропейской популяции, однако для подтверждения достоверности этих различий необходимо провести массовое обследование.

Таким образом, разработанная схема анализа гена К-гав в ДНК плазмы крови пригодна для использования в клинической диагностике.

Оптимизация условий анализа 15-го экзона гена В-гаГ Исследование 1

изменений в 15-м экзоне гена В-гаГ проводили методом ПЦР-ЗЯСР-анализа. Использование такой методики вместо секвенирования значительно удешевляет анализ, что делает его доступным для применения в практических лабораториях. При использовании конформационного анализа для исследования изменений в нуклеотидной последовательности требуется амплификат, содержащий минимальное (в идеале нулевое) количество неспецифических фрагментов. Для получения амплификата 15-го экзона гена В-гаГ такого качества потребовалось оптимизировать условия ПЦР, а также условия БЗСР-электрофореза.

Для минимизации количества неспецифических фрагментов при проведении ПЦР варьировали температуры отжига праймеров в интервале температур 53 - 59°С. Оказалось, что оптимальная температура отжига в использованных условиях была 57°С.

Было найдено, что оптимальными условия ЗБСР-электрофореза продуктов ПЦР-амплификации являются:

- плотность ПААГ - 15% (акриламид : бисакриламид = 29 : I, весовое соотношение);

- напряженность электрического поля - 16,3 В/см;

- температура проведения электрофореза - +4 °С;

- время проведения электрофореза в камере для вертикального электрофореза с высотой стекол 15 см - 8 час.

Сравнение режимов проведения БЗСР-анализа продуктов амплификации 15-го экзона гена В-гаГ представлено на рис. 4. Как видно из рисунка, при большей напряженности электрического поля амплифицированные фрагменты ДНК как нормальной последовательности гена В-гаГ (образцы 1а и 2а), так и имеющие замену в 599 кодоне (У599Е, образцы За и 4а), не отличаются на электрофореграмме по расхождению конформеров, имеющих и неимеющих данной замены. При уменьшении напряженности электрического поля, увеличении плотности ПААГ и увеличении времени проведения электрофореза наблюдаются четкие различия между

конформерами, соответствующими последовательности «дикого типа» и последовательности, имеющей замену в 599 кодоне.

1а 2а За 4а 16 26 36 46

с мутацией

Рис. 4. Сравнение режимов проведения SSCP-анализа продуктов амплификации 15-го экзона гена B-raf.

А - 12% ПААГ, +4"С, 20.7 В/см, 5 час; Б - 15% ПААГ, +4'С, 16.3 В/см, 8 час. Цифрами обозначены: 1а, б и 2а, б - продукт амплификации ДНК гена B-raf «дикого типа»; За, б - продукт амплификации ДНК гена B-raf с мутацией в 599 кодоне (ДНК из клеточной линии НТ29, V599E); 4а, б - продукт амплификации ДНК гена B-raf с мутацией в 599 кодоне (ДНК из клеточной линии SK-MEL-28, V599E).

Применимость анализа гена В-га</ при использовании клинических образцов. Для оценки применимости выбранных условий анализа исследовали наличие изменений в 15-ом экзоне гена В-гс^ в различных биологических образцах, полученных либо от больных с установленным онкологическим диагнозом (различные типы опухолей), находящихся на лечении в различных медицинских учреждениях России, либо от здоровых доноров или лиц с неустановленным или неподтвержденным онкологическим заболеванием. Отдельную группу обследуемых составили пациенты с опухолями щитовидной железы, в которых по данным американских и европейских исследователей наблюдается высокая встречаемость мутаций в гене В

Всего на присутствие мутантной формы гена В-га[ проанализировано биологических образцов от 129 человек. Было показано, что в 12 случаях из 55 мутантный ген ВгаГ выявлялся в ДНК из опухолевой ткани, в 13 случаях из 110 - в ДНК плазмы крови.

У пациентов с опухолями щитовидной железы (все гистологические типы) измененный ген Я-га/выявили в опухолевой ткани в 2 случаях из 5, а в плазме крови ни в одном из 14, тогда как по данным американских и европейских исследователей наблюдается более высокая встречаемость

мутаций в гене В-га/при этой патологии. К сожалению, приведенные данные не могут быть статистически достоверными из-за малого числа исследованных случаев, и по полученным результатам выводы о частоте встречаемости мутантной формы гена В-га/ при опухолях щитовидной железы у российских больных сделать нельзя.

Из 15 образцов опухолей поджелудочной железы мутации в 15-м экзоне гена В-га/ обнаружить не удалось.

Из 6 проанализированных образцов опухолей от больных кожной меланомой изменения в 15-м экзоне гена В-га/ выявлены в 3 случаях, в отличие от увеальных меланом (0/5), что соответствует встречаемости мутаций этого гена у больных в США.

Специфичность ПЦР 15-го экзона гена В-га/ и характер мутаций.

Специфичность амплификации ДНК 15-го экзона гена В-га/ была подтверждена прямым секвенированием. Секвенирование образцов подтвердило наличие изменений в нуклеотидной последовательности, выявленное методом 88СР-анализа (рис. 5-9). Так, при исследовании различных биологических образцов двух больных кожной меланомой у первого пациента мутантная форма гена не была найдена ни в ДНК из опухолевого материала, ни в ДНК плазмы крови. У второго больного мутация в опухолевой ткани совпала с мутацией, найденной в отдаленном метастазе этой опухоли.

Рис. 5. ББСР-электрофореграмма продуктов амплификации гена В-га/ 1 - из препарата ДНК плазмы крови здорового донора, 2 - из препарата ДНК плазмы крови больной 1 (кожная меланома, мутантной формы гена не выявлено), 3 - из препарата ДНК плазмы крови больного 2 (кожная меланома, выявлено присутствие мутантной формы гена (указана стрелкой)).

Таким образом, анализ изменений в гене В-га/ может производиться не только в опухолевой ткани, но и в плазме крови, что дает основу для оценки изменений гена В-га/ как молекулярно-генетического онкомаркера для

мониторинга заболевания, а возможно и для раиней диагностики некоторых типов опухолей.

Рис. 6. Фрагмент секвенограммы амплифицированной ДНК 15-го экзона гена В-га/. Пациент 1. Материал ДНК опухоли.

Уа1—»СНи

Рис. 8. Фрагмент секвенограммы амплифицированной ДНК 15-го экзона гена В-га/. Пациент 2. Материал ДНК опухоли.

Рис. 7. Фрагмент секвенограммы амплифицированной ДНК 15-го экзона гена В-га/. Пациент 1. Материал ДНК плазмы крови.

Л/а1—»Ф1и

098 599 «00

Рис. 9. Фрагмент секвенограммы амплифицированной ДНК 15-го экзона гена В-га/. Пациент 2. Материал ДНК метастаза.

Разработка новых эффективных средств целевой терапии на основе ингибиторов серин-треониновой киназы, кодируемой геном В-га/, делает актуальным исследование этого гена у онкологических больных для обоснования лечения такими препаратами.

При исследовании образцов ДНК плазмы крови пациента, страдающего неоперированной злокачественной фиброзной гистиоцитомой, а также пациента, оперированного по поводу аденокарциномы придаточных пазух носа, в 15-ом экзоне гена В-га/обнаружили гомозиготную делецию (рис. 10).

Стоит отметить, что заболевание у этих пациентов носило тяжелый характер. В литературе на сегодняшний день не описано подобных случаев

Рис. 10. Электрофореграмма продуктов амплификации гена В-га/от различных онкологических больных. Материал ДНК плазмы крови. 1 - Опухоль яичника; 2 - Нет онкологического диагноза; 3 -Злокачественная фиброзная гистиоцитома; 4 -Онкологический диагноз не установлен; 5 - Опухоль яичника.

Ген АРС. Анализ гена аденоматозного полипоза кишечника - АРС -получил широкое распространение в развитых странах, где опухоли толстой кишки - одно из наиболее частых онкологических заболеваний. Широко распространена эта патология и в нашей стране. Известно, что профилактика и раннее выявление данной опухоли многократно увеличивают шанс на успешное лечение.

Однако для массовых исследований гена АРС, как и для оценки гена В-raf, целесообразно использовать относительно недорогой SSCP-анализ. В данной работе были разработаны и оптимизированы условия исследования гена АРС методом ПЦР-БЗСР-анализа.

Наиболее эффективное разделение конформеров при электрофорезе наблюдали в 15% ПААГ при температуре проведения электрофореза +4°С, напряженности электрического поля - 17 В/см и времени проведения электрофореза - 5 час.

Было показано , что ген АРС в в этих условиях может быть проанализирван не только в опухолевой ткани, но и в ДНК из плазмы крови. При этом выявленные при SSCP-анализе изменения нуклеотидной последовательности были подтверждены при прямом секвенировании соответствующих образцов.

Специфичность ПЦР гена АРС. При секвенировании продукта амплификации гена АРС получили специфическую для данного гена последовательность. Результат секвенирования материала ДНК плазмы крови здорового донора представлен на рис. 11. Из рисунка видно, что нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта амплифицируемого фрагмента гена АРС полностью соответствует нуклеотидной последовательности этого гена, приведенной в международных базах данных по геному человека (http://www.ensembl.org: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Наитапох

gomma«Hwn

Рис. 11. Секвенограмма ПЦР-продукта гена АРС (район 1309-го кодона). Над пиками приведена нуклеотидная последовательность участка гена АРС (верхняя строка) и соответствующая пикам последовательность (нижняя строка). Стрелкой обозначена последовательность З'-праймера. В овал обведена неуверенно читаемая последовательность, примыкающая к 5'-праймеру.

У больного А092 с аденокарциномой толстой кишки, где с помощью SSCP-анализа обнаружили дефект гена АРС, в ДНК опухоли и плазмы крови присутствие изменений в нуклеотидной последовательности в районе 1309 кодона гена АРС было подтверждено секвенированием (рис. 12).

ЦИК опухолевого материала

1313 1311 && 1309 1308 1301 1306 I30S ЯЧ 1303 1302_

т'с с с'* » т',ст т'т т с'т Т Т'Т яТ'ТТ с'т С с'^тл т'т Т о'с* ['( ( к 1

ДНК плазми крови

1312 НИ ев 1J09 ют 1307 130« 1303 ЯМ 1303 1305

ДНК клеток крови

1312 1311 1310 1309 1308 1307 1306 1303 1303 1303

il т с tu А Т «С Т Т'Т Т С 1т Т т1 Т А Т 1т TClT G С^т » Т ' Т Т G ' С А 01 G

Рис. 12. Фрагмент секвенофаммы района 1309 кодона гена А PC в ДНК плазмы крови (второе исследование), опухолевого материала и клеток крови пациента А092. Представлена комплементарная ревертированная последовательность

Особенностью этого случая явилось наличие сразу 2-х мутаций: одной -наследственной и второй - приобретенной. Из рисунка видно, что в ДНК плазмы крови в данном образце присутствуют фракции мутантного гена в 1310 кодоне, которые приводят к нескольким заменам аминокислот в белковом продукте. Возможной причиной множественности имеющихся последовательностей является клоновая природа опухоли. Из данной секвенофаммы можно сделать вывод, что количество фракции, несущей триплет АТТ в 1310 кодоне (вместо СТТ) значительно болыпе, чем фракции ATA. Вероятно, первая мутация возникла раньше, чем и вызвано ее относительно большое количество по отношению ко второй. В клетках крови этого больного, как и в остальных его биологических образцах, присутствует фракция с заменой в 1304 кодоне триплета TAT на GAT. Такая замена не ведет к изменению в аминокислотной последовательности белкового продукта гена. В то же время основная фракция с заменой в 1310 кодоне в опухолевом материале (и в плазме крови, соответственно) приводит к замене положительно заряженной аминокислоты лизин на нейтральный аспарагин,

что может приводить к коиформациоиным изменениям в белке и как следствие - изменению или потере его функции.

Всего были обследованы ДНК-образцы от 7 больных с колоректальными опухолями. При этом изменения в гене АРС были найдены в 2 из 6 образцов ДНК плазмы крови и в 3 из 4 образцах опухолевой ДНК. При обследовании 72 онкологических больных с другими опухолями мутации в гене АРС были найдены в 4 из 49 образцов ДНК плазмы крови и в 7 из 36 образцов опухолевой ткани. Наличие мутаций в гене АРС при различных опухолях, помимо опухолей толстой кишки, объясняется тем, что ген АРС является геном-супрессором опухолевого роста и может экспрессироваться в целом ряде тканей.

Полученные результаты показывают, что SSCP-анализ пригоден для предварительной оценки наличия мутаций в гене АРС, также как и в случае гена B-raf и позволяет заместить на первом этапе лабораторной диагностики онкологических заболеваний более трудоемкий и требующий дорогого оборудования метод секвенирования.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ дефектных генов опухолевого происхождения помогает решать широкий круг вопросов диагностики, мониторинга и прогноза эффективности тех или иных средств химиотерапии. Более того, такой анализ является совершенно необходимым в случае использования нового направления лечения онкологических заболеваний - целевой терапии (таргет-терапии), включающей замещение или исправление функций дефектных генов в злокачественных клетках. Тем не менее методы, используемые в научных исследованиях ДНК опухолевого происхождения, как правило, трудоемки и требуют дорогостоящего оборудования, что затрудняет анализ дефектных генов в условиях онкологических клиник.

Выбор, адаптация и оптимизация методических приемов, выполненные в данной работе, позволяют использовать более пригодные для клинико-лабораторной диагностики методы. Более того показано, что в выбранных условиях возможен анализ не только образцов самой опухоли, но и других образцов, содержащих ДНК опухолевого происхождения, например, плазмы крови. Использование для выделения ДНК из биологических образцов протеиназы К повышает чувствительность и специфичность последующих анализов как показано на примере ПЦР гена K-ras.

Показано, что при выбранных условиях проведения реакции «обогащенной» ПЦР с трехпраймерной схемой для оценки мутаций в 12-м кодоне гена K-ras чувствительность метода может достигать три мутантных копии гена в образце. Это важно при анализе генетического материала в плазме крови и других биологических жидкостях и может лечь в основу ранней доклинической диагностики рака. Благодаря очень высокой чувствительности метода теоретически становится возможным выявление даже небольшой группы клеток, вставших на путь малигнизации, которые обычно элиминируются при благоприятных условиях. Вероятно, этим можно

объяснить тот факт, что у двух неонкологических больных из 90 обследованных однократное выявление мутантного гена K-ras в плазме крови не подтвердилось при повторном заборе крови через 2 недели, то есть метод при однократном применении может привести к гипердиагностике. Для исключения последней при положительном результате анализа гена tiras в плазме крови у клинически здоровых лиц следует проводить повторный анализ через 2-3 недели.

Проведенное в настоящей работе исследование в плазме крови гена liras у лиц, контактирующих с органическими растворителями и канцерогенными веществами в условиях вредного производства, показало, что мутантная форма этого гена у таких лиц встречается намного чаще, чем у здоровых людей (р=0,0049, по данным этого исследования). Такого рода данные описаны также в литературе, и интерпретируются как возможность определения предраковых изменений или диагностики начинающегося заболевания. Вследствие этого можно заключить, что оценка гена K-ras у лиц, работающих в условиях вредного производства, может стать основой для разработки новых норм допустимых вредных канцерогенных воздействий с одной стороны, и служить полезной информацией при формировании групп риска для выявления и профилактики онкологических заболеваний с другой стороны.

Разработанные условия анализа позволяют создать диагностический набор для оценки гена K-ras в широком круге биологических образцов по сравнению с уже существущими коммерческими наборами для анализа гена K-ras в кале («12K-RAS», АВ Analítica; «АА464-469», Biowar и др.).

В случае анализа гена B-raf до настоящего времени использовались приемы, не подходящие для выполнения массовых клинических тестов. Введенное нами использование SSCP-анализа для выявления мутантных аллелей гена B-raf позволяет упростить методику проведения подобных тестов. Прямое секвенирование продуктов ПЦР показало, что выбранные условия выявления мутаций в гене B-raf пригодны для оценки наличия мутантной формы гена как в тканях, так и в плазме крови. Примененный нами ПЦР-SSCP-анализ не требует сложного оборудования и дорогих реактивов как другие методики, и таким образом может выполняться на базе клинико-диагностической лаборатории. Аналогичные преимущества имеет использование SSCP-анализа для выявления мутантных аллелей гена АРС.

Важно отметить, что прямое секвенирование позволяет выявить мутантный ген, если его содержание превышает 15-20% от гена дикого типа, тогда как для SSCP-анализа достаточно 5-7%, а при использовании капиллярного электрофореза для такого анализа или денатурирующей ВЭЖХ с флюоресцентной детекцией достаточно 0,1%, что особенно важно для выявления мутантного гена в плазме крови, лимфоузлах, клетках мочи для ранней онкодиагностики и мониторинга заболевания.

Подводя итог данной работы, можно считать, что предложенные методики определения мутаций в исследованных генах могут быть применены в условиях клинико-диагностических лабораторий.

Выводы

1. Предварительная обработка биологических образцов протеиназой К повышает точность определения мутантных форм генов К-ras, B-raf и APC в плазме крови.

2. Установлены оптимальные условия проведения обогащенной полимеразной цепной реакции с тремя праймерами для выявления мутаций в гене K-ras при исследовании ДНК плазмы крови.

3. Анализ мутаций гена K-ras в ДНК плазмы крови может быть использован для оценки риска онкологических заболеваний на предприятиях с вредными условиями производства.

4. Определены оптимальные условия анализа гена B-raf - другого ключевой гена RAS-сигнального внутриклеточного регуляторного каскада.

5. Наибольшая частота встречаемости мутаций в гене B-raf приходится на опухоли щитовидной железы, меланомы и опухоли толстой кишки. В случае опухолей щитовидной железы и меланом наличие мутаций в гене В-raf не исключает наличие в тех же опухолевых клетках мутантной формы гена K-ras.

6. Определены оптимальные условия анализа АРС - гена другого сигнального каскада - WNT.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Белохвостое А. С., Цветкова И. А., Маркова С. И., Вдовиченко К. К. Методические особенности анализа мутаций гена K-ras в ДНК плазмы крови онкологических больных // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.- 2002,- т. 1, № 2.- с. 79.

2. Хохлов А. П., Доценко А. Н., Осипова Е. Ю., Астрелина Т. А., Белохвостое А. С., Вдовиченко К. К., Сидорова И. К. Цитотоксический эффект препарата Севит-Ф на культуру клеток Н-9 лимфолейкоза человека // Российский Биотерапевтический журнал.- 2002.-Т.1, №2.- с. 148.

3. Бартновский А. Э., Вдовиченко К. К., Белохвостое А. С., Котус Е. В., Сесина Н. В. Мутантные гены опухолевого происхождения в плазме крови больных в диагностике и мониторинге онкологических заболеваний // 9-й Росс. нац. конг. «Человек и лекарство»: Тез. докл.- М., 8-12 апр. 2002.- с. 559.

4. Вдовиченко К. К., Белохвостое А. С., Котус Е. В., Цветкова И. А., Чичканова Ю. В. Особенности и стандартизация анализа мутаций гена K-ras в ДНК плазмы крови онкологических больных при использовании двух эндонуклеаз рестрикции BstN 1 и Alul // Проблемы стандартизации.- 2002.-№3.

5. Вдовиченко К. К., Цветкова И. А., Чичканова Ю. В. Методические особенности анализа мутаций гена K-ras в ДНК плазмы крови онкологических больных // 9-й Росс. нац. конг. «Человек и лекарство»: Тез. докл.- М., 8-12 апр. 2002.- с. 559.

6. Вдовиченко К. FC., Маркова С. И., Цветкова И. А., Белохвостое А. С.. Особенности выявления мутантной формы гена К-Ras в плазме крови принекоторых типах окологических заболеваний // Вопросы гематологии/онкологии и иммунологии в педиатрии.- 2003,- т. 2(1).- сс 71-75.

7. Вдовиченко К. К., Белохвостов А. С., Маркова С И., Абрамов А. А., Румянцев А. Г. Особенности выявления мутантной формы гена B-raf¡ в плазме крови при онкологических заболеваниях // Вопросы гематологии/онкологии и иммунологии в педиатрии,- 2004.- т. 3(2).- сс 37-39.

8. VdovicherJko КК, Markova SI, Belokhvostov AS. Mutant Form of BRAF Gene in Blood Plasma of Cancer Patients // Ann N Y Acad Sei.- 2004.- v 1022,- pp 228231.

Вдовиченко Константин Константинович «Выявление мутаций в генах K-Ras, B-raf и АРС при некоторых онкологических заболеваниях»

В настоящей работе методики анализа генов K-ras, B-raf и АРС были адаптированы к использованию в научно-исследовательских медицинских учреждениях и молекулярно-диагностических центрах.

Продемонстрирована возможность использования молекулярно-генетических методов для анализа различных биологических образцов.

Показано, что полученные в ходе исследования результаты не противоречат данным исследований, проведенных в различных научно-исследовательских лабораториях мира. В то же время в настоящем исследовании получены новые данные, не описанные в литературе.

На основе полученных данных сформировано новое прикладное исследование - «Создание набора для диагностики ряда онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта».

Konstantin К. Vdovichenko

«Revelation of mutations in K-Ras, B-raf and APC genes at some oncological

disorders»

In this study K-ras, B-raf, and APC genes analyzing techniques were adapted in order to could be used in medical clinics and research centers too.

An utilization ability of molecular-genetic methods to analyze different biological samples was demonstrated.

It has been shown, that results obtained in this study, do not contrary to world wide research data. At the same time some new data were obtained in this work.

Novel applied investigation based on acquired data was formed. It is "Development of the kit for diagnostics of intestinal tract oncological malignancies"

»-3316

Подписано в печать 20- ¿¿¿'¿Фор мат 60x84/16. Тираж4$0 экз. Усл. печ. л. Заказ 4

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вдовиченко, Константин Константинович

Введение

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Нарушения внутриклеточной сигнальной трансдукции как основа злокачественного роста.

1.2. RAS-сигнальный каскад.

1.3. Ras: ГЕНЫ и БЕЛКИ.

1.3. 1. Ras-семейства.

1.3.2. Ras-гены и белки в клетках млекопитающих.

1.3.3. Активация Ras-белков и трансформирующие свойства.

1.3.4. Различия между Н-, К- и N-Ras.

1.4. Регуляторы сигнального Ras-каскада.

1.5. Белки - мишени Ras.

1.6. Raf.

1.7. WNT-сигнальный каскад.

1.8. Нарушения в генах K-ras, Braf и АРС при некоторых онкологических заболеваниях.

1.8.1. Ген K-ras.

1.8.2. Ген B-raf.

1.8.3. Ген АРС.

1.9. Нуклеиновые кислоты крови.

1.10. Адресная терапия (таргет-терапия).

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Распределение обследуемых лиц по группам и характеристика изучаемых биологических образцов.

2.2. Забор крови.

2.3. Режимы центрифугирования.

2.4. Выделение ДНК из биоматериала.

2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР): 71 ГЕН K-ras 72 ГЕН B-raf 78 ГЕНЛРС.

2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. ГенЛГ-ras.

3.1.1. Оптимизация условий проведения обогащенной ПЦР для выявления мутаций в 12-ом кодоне гена K-ras.

3.1.2. Специфичность ПЦР гена K-ras с мутациями в 12-м кодоне и характер точковых мутаций.

3.2. Ген B-raf. 121 3.2.1 Оптимизация условий электрофореза при оценке дефектов гена B-raf.

3.3. Ген АРС.

3.3.1. Специфичность ПЦР.

3.3.2. Оптимизация условий электрофореза.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление мутаций в генах K-ras, B-raf и APC при некоторых онкологических заболеваниях"

Актуальность темы исследования. В странах Европы и Северной Америки смертность от рака стоит на втором месте после смертности от сердечно-сосудистых заболеваний. Так, например, только в США число смертей от онкологических заболеваний в 1994 году было больше на 6% по сравнению с 1970 годом. Известно, что при выявлении опухоли на ранних этапах развития заболевания клинический прогноз является наиболее благоприятным, вероятность излечения многих форм рака при этом высока, объем оперативного или иного лечебного вмешательства в таких случаях имеет ограниченную травматичность для больного. Вследствие этого ранняя диагностика злокачественных новообразований, особенно на доклинических стадиях развития опухолевого процесса, является одной из приоритетных задач в современной онкологии.

Известно, что рак - это комплексное заболевание, возникающее в результате прогрессивного накопления генетических повреждений и эпигенетических изменений в клетке. В последние несколько десятилетий наука добилась больших успехов в раскрытии молекулярных механизмов канцерогенеза: было описано около 200 генов и их белковых продуктов, напрямую или косвенно связанных с возникновением рака, однако большинство исследований в данной области не выходит за рамки академической науки. В последние годы наметилась тенденция интеграции фундаментальных и прикладных лабораторных исследований и медицинской практики для нужд медицины в диагностике и выборе тактики лечения онкологических заболеваний. Результаты многих научных исследований применяются в клинике, подходы к диагностике и лечению многих онкологических заболеваний базируются на достижениях молекулярной генетики. Раскрытие молекулярных механизмов канцерогенеза позволяет создавать новые высокоэффективные нетоксичные агенты, действующие непосредственно при повреждениях тех или иных генов, повреждающихся при возникновении неоплазий. Так, например, разработаны препараты, действующие при гиперэкспрессии рецептора к эпидермальному ростовому фактору - ZD 1839 ("Iressa"), OSI-774 (Tarceva) - ингибиторы тирозинкиназного домена рецептора. BAY 43 9006 - новый агент, ингибирующий белковый продукт гена B-raf, часто повреждающегося при меланомах и папиллярных опухолях щитовидной железы. Также созданы и проходят клинические испытания препараты, действующие на молекулярные шапероны - ингибиторы Hsp90 (17AAG), блокаторы ростовых факторов сосудистого эндотелия - Avastin, SU11248 и многие другие [1]. При таком подходе увеличивается терапевтический эффект лечения и уменьшается проявление побочных эффектов. Для применения целевых агентов необходимо иметь информацию о наличии дефектов, которые данное средство призвано исправить. Это требует разработки новых, применимых в клинике методов обнаружения генетических мутаций.

Хотя современная медицина обладает большим арсеналом методов инструментальной клинической диагностики онкологических заболеваний, раннее обнаружение опухолей возможно не всегда. Кроме того, многие инструментальные» диагностические процедуры имеют инвазивный характер.

Иммунохимические методы, хотя и не инвазивны и имеют относительно невысокую стоимость проведения анализа, имеют недостаточную чувствительность для выявления неоплазии на ранних стадиях. Важно отметить, что иммунохимические онкомаркеры, как правило, являются нормальными компонентами плазмы крови. При злокачественных новообразованиях увеличивается их концентрация в крови, но такой эффект может быть вызывай воспалительными процессами.

Для установления диагноза часто используют гистологическую верификацию, для чего прибегают к биопсии. Несмотря на то, что биопсия дает информацию о морфологических характеристиках, результат ее зависит от точности попадания в опухолевый очаг. Кроме того, биопсия травматична для пациента.

В связи с недостатками вышеперечисленных методов возникает задача поиска новых, более чувствительных и надежных методов диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. К числу таких методов относится новое направление в современной медицине - молекулярно-генетическая диагностика. В отличие от иммунохимических онкомаркеров, молекулярно-генетические онкомаркеры обычно являются мутантными генами опухолевого происхождения, изменения в которых имеют как качественный, так и количественный характер. Выявление молекулярно-генетических онкомаркеров основано на исследовании нуклеиновых кислот плазмы крови. Факт присутствия нуклеиновых кислот в плазме крови был обнаружен еще в 1948 году [2]. При более поздних исследованиях состава и происхождения нуклеиновых кислот плазмы крови было обнаружено, что опухолевые клетки выделяют свою ДНК в кровоток [3], причем количество ДНК в плазме крови онкологических пациентов обычно намного больше, чем у здоровых [3,4].

При исследовании ДНК из опухоли и плазмы крови обнаруживаемые мутации в генах-онкомаркерах идентичны, в то время как при исследовании ДНК плазмы крови здоровых пациентов (не имеющих онкологического диагноза) такие мутации не выявляются [5, 6]. Отсутствие в норме и присутствие при раке в плазме крови мутантных генов опухолевого происхождения является принципиальным преимуществом молекулярно-генетических онкомаркеров перед иммунохимическими. Преимуществом является и более высокая чувствительность молекулярно-генетических маркеров (в тысячу и более раз).

Известно, что на пути трансформации в клетке происходит ряд генетических событий, ведущих к нарушению функций генов, контролирующих клеточный цикл и поддержание целостности генома. Такими событиями в клетке являются генетические (замена оснований, делеции-инсерции, сдвиг рамки считывания, амплификация генов, реципрокные и нереципрокные транслокации и др.) или эпигенетические (изменение статуса метилирования регуляторных областей генов) нарушения [7, 8]. Следствием таких событий являются сбои в регулировке клеточного цикла, при котором клетка приобретает повышенный пролиферативный потенциал; потеря клеткой дифференцировки и неспособность выполнять свои функции в организме; утрата генетической стабильности, ведущая к дальнейшему накоплению мутаций. Молекулярно-генетический анализ позволяет выявить такие мутации, когда количество трансформировавшихся клеток в организме исчисляется несколькими тысячами, то есть на самых ранних, еще доклинических этапах онкологического заболевания.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось усовершенствование существующих методов анализа генов K-ras, B-raf и АРС для использования их в диагностике и мониторинге некоторых онкологических заболеваний.

Для осуществления цели исследования были определены следующие задачи:

1) адаптация метода обогащенной ПЦР гена K-ras для выявления мутаций этого гена в различных биологических образцах;

2) оптимизация условий проведения ПЦР и последующего анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов (SSCP) для выявления мутаций в гене B-raf,

3) разработка праймеров и подбор условий проведения ПЦР и SSCP-анализа для выявления мутаций в гене АРС',

Научная новизна работы.

Научная новизна данного исследования заключается в:

1) адаптации методов исследования молекулярно-генетических онкомаркеров, известных для опухолевых тканей, к ДНК плазмы крови, где концентрация ДНК в тысячи раз меньше, чем концентрация ДНК из опухолевого материала того же объёма;

2) разработке методики определения мутаций в гене B-raf { 15-й экзон) в различных биологических образцах, включая ДНК плазмы крови, методом SSCP-анализа.

3) разработке праймеров и подбора условий методики определения мутаций в гене АРС (15-й экзон, район 1309-го кодона) в различных биологических образцах, включая ДНК плазмы крови, методом SSCP-анализа.

Практическая значимость.

1) методики анализа генов K-ras, B-raf и АРС адаптированы к использованию в научно-исследовательских медицинских учреждениях и молекулярно-диагностических центрах. Методы анализа генов K-ras и B-raf внедрены в работу Казанского Государственного Университета,

Ростовского Медицинского Университета, Саратовского Медицинского Института; ООО «Центр молекулярно-генетической диагностики» (г. Тюмень).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях и 5 тезисах докладов.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Вдовиченко, Константин Константинович

выводы

1. Предварительная обработка биологических образцов протеиназой К повышает точность определения мутантных форм генов K-ras, B-raf и АРС в плазме крови.

6. Определены оптимальные условия анализа АРС - гена другого сигнального каскада - WNT.

Практические рекомендации

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вдовиченко, Константин Константинович, Москва

1. Matherials of "1st International Symposium on Signal Transduction Modulators in

2. Cancer Therapy", September 23-25,2002, Amsterdam, The Netherlands.

3. Mandel P., Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguine chez l'Homme. CR

4. Acad. Sci. Paris 1948; 142: 241-3.

5. Stroun M., Anker P., Maurice P. et al. Neoplastic characteristics of the DNA found inthe plasma of cancer patients. Oncol. 1989; 46: 318-22.

6. Shapiro В., Chakrabarty M., Cohn E. M. et al. Determination of circulating DNAlevels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease. Cancer 1983; 51:2116-20.

7. Anker P., Lefort F., Vasioukhin V. et al. K-ras gene mutationsin the plasma ofcolorectal cancer patients. Gastroenterology 1997; 112: 1114-20.

8. Hahn W. C., Weinberg R. A. Modelling the molecular circuitry of cancer. Nature

9. Rev. Cancer 2002; 2: 331-41.

10. Hanahan D„ Weinberg R. A. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100: 57-70.

11. Nebert D. W. Transcription factors and cancer: an overview. Toxicology 2002; 181182: 131-41.

12. Bishop J. M. Molecular themes in oncogenesis. Cell 1991; 64: 235-48.

13. Levine A. J. The tumor suppressor genes. Annu. Rev. Biochem. 1993; 62: 623-51.

14. Rabbits Т. H. . Nature 1994; 72: 143-49.

15. Weinberg R. A. The molecular basis of oncogenes and tumor suppressor genes.

16. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1995; 758: 331-8.

17. Hunter T. Oncoprotein networks. Cell 1997; 88: 333-46.

18. Hooper M. L. Pyk2 and Src-family protein-tyrosine kinases compensate for the lossof FAK in fibronectin-stimulated signaling events but Pyk2 does not fully function to enhance FAK- cell migration. EMBO J. 1998; 17: 6783-9.

19. Harvey J. J. An unidentified virus which causes the rapid production of tumors inmice. Nature 1964; 204: 1104-5.

20. Kirsten W. H. and Mayer L. A. Morphologic responses to a murine erythroblastosisvirus. J. Natl. Cancer Inst. 1967; 39: 311-35.

21. Shih T. Y., Weeks M. O., Young H. A. et al. Identification of sarcoma virus-codedphosphoprotein in nonproducer cells transformed by Kirsten or Harvey murine sarcoma virus. Virology 1979; 96: 64-79.

22. Lowy D. R. and Willumsen В. M. Function and regulation of ras. Ann Rev Biochem1993; 62: 851-91.

23. Downward J. Ras signalling and apoptosis. Curr Opin Genet Dev 1998; 8: 49-54.

24. Khosravi-Far R., Campbell S., Rossman K. L. et al. Increasing complexity of Rassignal transduction: involvement of Rho family proteins. Adv Cancer Res 1998; 72: 57-107.

25. Bourne H. R., D. A. Sanders & F. McCormick: The GTPase superfamily: aconserved switch for diverse cell functions. Nature 1990; 348:125-32.

26. Bos J. L.: Ras-like GTPases. Biochim Biophys Acta 1997; 1333: M19-31.

27. Kimmelman A., T. Tolkacheva, M. V. Lorenzi, M. Osada & A. M.-L. Chan:1.entification and characterization of R-rayJ: a novel member of the RAS gene family with a non-ubiquitous pattern of tissue distribution. Oncogene 1997; 15: 2675-85.

28. Matsumoto К., T. Asano & T. Endo: Novel small GTPase M-Ras participates inreorganization of actin cytoskeleton. Oncogene 1997; 15: 2409-17.

29. Kitayama H., Y. Sugimoto, T. Matsuzaki, Y. Ikawa & M. Noda: A ras-related genewith transformation suppressor activity. Cell 1989; 56: 77-84.

30. Barbacid M.: ras genes. Ann Rev Biochem 1987; 56: 779-827.

31. Paciucci R. & A. Pellicer: Dissection of the mouse N-ras gene upstream regulatorysequences, overlapping with an adjacent gene. Mol Cell Biol 1991; 11: 1334-43.

32. Jeffers M. & A. Pellicer: Identification of multiple promoters within the N-ras protooncogene. Biochem Biophys Acta 1994; 1219: 623-35.

33. Cohen J. В., S. D. Broz & A. D. Levinson: Expression of the H-ras proto-oncogeneis controlled by alternative splicing. Cell 1989; 58: 461-72.

34. Leon J., I. Guerrero & A. Pellicer: Different expression of the ras gene family inmice. Mol Cell Biol 1987; 7: 1535-40.

35. Furth M. E., Т. H. Aldrich & C. Cordon-Cardo: Expression of ras proto-oncogeneproteins in normal human tissues. Oncogene 1987; 1: 47-58.

36. Pells S., M. Divjak, P. Romanowski, K. Impey, N. J. Hawkins, A. R. Clarke, M. L.

37. Hooper & D. J. Williamson: Developmentally-regulated expression of murine K-ras isoforms. Oncogene 1997; 15: 1781-86.

38. Scheele J. S., J. M. Rhee & G. R. Boss: Determination of absolute amounts of GDPand GTP bound to Ras in mammalian cells: comparison of parental and Ras-overproducing NIH 3T3 fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 10971100.

39. Quincoces A. F. & J. Leon: Serum growth factors up-regulate H-ras, K-ras, and Nras proto-oncogenes in fibroblasts. Cell Growth Differ 1995; 6: 271-79.

40. Quincoces A. F., I. Polanco, T. Thomson & J. Leon: Positive autoregulation of rasgenes expression in fibroblasts. FEBS Lett 1997; 416: 317-23.

41. Ulsh L. & T. Y. Shih: Metabolic turnover of human c-rasH p21 protein of EJ bladdercarcinoma and its normal cellular and viral homologs. Mol Cell Biol 1984; 4: 1647-52.

42. Casey, P. J., P. A. Solski, C. J. Der, and J. E. Buss. p21ras is modified by a farnesylisoprenoid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86: 8323-7.

43. Gutierrez L„ Magee A. I., Marshall C. J., Hancock J. F. Posttranslational processingof p21ras is two-step and involves carboxyl-methylation and carboxy-terminal proteolysis. EMBOJ1989; 8: 1093-8.

44. Willumsen В. M., Norris K., Papageorge A. G. et al. Harvey murine sarcoma virusp21 ras protein: biological and biochemical significance of the cysteine nearest the carboxy terminus. EMBO J 1984; 3: 2581-5.

45. Lacal P. M., Pennington C. Y., Lacal J. C. Transforming activity of ras proteinstranslocated to the plasma membrane by a myristoylation sequence from the src gene product. Oncogene 1988; 2: 533-7.

46. Roy, S., R. Luetterforst, A. Harding, A. Apolloni, M. Etheridge, E. Stang, B. Rolls,

47. J. F. Hancock, and R. G. Parton. 1999. Dominant-negative caveolin inhibits H-Ras function by disrupting cholesterol-rich plasma membrane domains. Nat. Cell Biol. 1:98-105.

48. Buss J. E., P. A. Solski, J. P. Schaeffer, M. J. MacDonald & C. J. Der: Activation ofthe cellular proto-oncogene product p21Ras by addition of a myristylation signal. Science 243, 1600-1603 (1989)

49. Bollag G. & F. McCormick: Regulators and effectors of ras proteins. Ann Rev Cell1. Biol 7,601-632(1991)

50. Boguski M. S. & F. McCormick: Proteins regulating Ras and its relatives. Nature366, 643-654 (1993)

51. Wittinghofer A. & E. Pai: The structure of Ras protein: a model for a universalmolecular switch. Trends Biochem Sci 16, 382-387 (1991)

52. Ma J. & M. Karplus: Molecular switch in signal transduction: reaction paths of theconformational changes in ras p21 .Proc Natl Acad Sci USA 94, 11905-11910 (1997)

53. Bos J. L.: ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res 49,4682-46891989)

54. Rodenhuis S.: ras and human tumors. Semin Cancer Biol 3, 241-247 (1992)

55. Bos J. L., Fearon E. R., Hamilton S. R. et al. Prevalence of ras gene mutations inhuman colorectal cancers. Nature 1987; 327: 293-297.

56. Forrester K., Almoguera C., Han K. et al. Detection of high incidence of K-rasoncogenes during human colon tumorigenesis. Nature 1987; 327: 298-303.

57. Rashid A. Cellular and molecular biology of biliary tract cancers. Surg. Oncol. Clin.

58. N. Am. 2002; 11(4): 995-1009.

59. Tannapfel A, Benicke M, Katalinic A. et al. Frequency of pl6(INK4A) alterationsand K-ras mutations in intrahepatic cholangiocarcinoma of the liver. Gut 2000; 47: 721-727.

60. Moore P. S., Beghelli S., Zamboni G., Scarpa A. Genetic abnormalities in pancreaticcancer. Mol. Cancer 2003; 2(1): 7-13.

61. Cowgill SM, Muscarella P. The genetic of pancreatic cancer. Am. J. Surg.2003; 186(3): 279-286.

62. Zhang LF, Gao WM, Gealy R, Weissfeld J, Elder E, Whiteside TL, Keohavong P.

63. Comparison of K-ras gene mutations in tumour and sputum DNA of patients with lung cancer. Biomarkers 2003; 8(2): 156-161.

64. Kovalchuk O, Chyczewska E, Niklinska W, Niklinski J, Naumnik W, Chyczewski

65. K-ras codon 12 mutations with enriched PCR method in operable non-small cell lung cancer. Folia Histochem. Cytobiol. 2001; 39 suppl 2: 68-69.

66. Kinzler K. W. & B. Vogelstein: Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 87,159.170(1996)

67. Brandt-Rauf P. W., R. P. Carty, J. Chen, M. Avitable, J. Lubowsky & M. R. Pincus:

68. Structure of the carboxyl terminus of the RAS gene-encoded P21 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5869-5873 (1988)

69. Mellersh H., A. J. Strain & D. J. Hill: Expression of the proto-oncogenes c-H-ras and

70. N-ras in early second trimester human fetal tissues. Biochem Biophys Res Commun 141,510-6(1986)

71. Tanaka Т., N. Ida, H. Shimoda, C. Waki, D. J. Slamon & M. J. Cline: Organ specificexpression of ras oncoproteins during growth and development of the rat. Mol Cell Biochem 70, 97-104 (1986)

72. Fiorucci G. & A. Hall: All three human ras genes are expressed in a wide range oftissues. Biochem. Biophys. Acta 950, 81-83 (1988)

73. Muller R., D. J. Slamon, E. D. Adamson, J. M. Tremblay, D. Muller, M. J. Cline &

74. M. Verma: Transcription of c-onc genes c-rasKi and c-fms during mouse development. Mol Cell Biol 3,1062-1069 (1983)

75. Delgado M. D., A. F. Quincoces, M. T. Gomez-Casares, C. A. Martinez, M. A.

76. Cuadrado, C. Richard & J. Leon: Differential expression of ras protooncogenesduring in vitro differentiation of human erythroleukemia cells. Cancer Res 52, 5979-84(1992)

77. Grand R. J. A. & D. Owen: The biochemistry of ras p21. BiochemJ 279, 609-6311991)

78. Mangues R., T. Corral, N. E. Kohl, W. F. Symmans, S. Lu, M. Malumbres, J. B.

79. Gibbs, A. Oliff & A. Pellicer: Antitumor effect of a farnesyl protein transferase inhibitor in mammary and lymphoid tumors overexpressing N-ray in transgenic mice. Cancer Res 58,1253-1259 (1998)

80. Mizuno Т., К. Kaibuchi, Т. Yamamoto, M. Kawamura, T. Sakoda, H. Fujioka, Y.

81. Matsuura & Y. Takai: A stimulatory GDP/GTP exchange protein for smg p21 is active on the post-translationally processed form of c-Ki-ras p21 and rhoA p21. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6442-6446 (1991)

82. Jones M. K. & J. H. Jackson: Ras-GRF activates Ha-Ras, but not N-Ras or K-Ras4B, protein In vivo. J Biol Chem 273,1782-1787 (1998)

83. Francis-Lang H., M. Zannini, M. De Felice, M. T. Berlingieri, A. Fusco & R. Di1.uro: Multiple mechanisms of interference between transformation and differentiation in thyroid cells. Mol Cell Biol 12, 5793-5800 (1992)

84. Yan Z., M. Chen, M. Perucho & E. Friedman: Oncogenic Ki-ras but not oncogenic

85. Ha-ray blocks integrin □ 1-chain maturation in colon epithelial cells. J Biol Chem 272,30928-30936(1997)

86. Yan Z„ X. Deng, M. Chen, Y. Xu, M. Ahram, B. F. Sloane & E. Friedman:

87. Oncogenic c-Ki-ras but not oncogenic c-Ha-ray up-regulates CEA expression and disrupts basolateral polarity in colon epithelial cells. J Biol Chem 272,27902-27907(1997)

88. Hamilton M. & A. Wolfman: Ha-ras and N-ras regulate МАРК activity by distinctmechanisms In vivo. Oncogene 16, 1417-1428 (1998)

89. Pawson Т.: Protein modules and signalling networks. Nature 373, 573-580 (1995)

90. Bonfini L., E. Migliaccio, G. Pellici, L. Lanfrancone & P. G. Pelicci: Not all She'sroads lead to Ras. Trends Biochem Sci 21, 257-261 (1996)

91. Lopez-Ilasaca M., P. Crespo, P. G. Pellici, J. S. Gutkind & R. Wetzker: Linkage of

92. G protein-coupled receptors to the МАРК signaling pathway through PI 3-kinase. Science 275,394-397 (1997)

93. Crespo P., N. Xu, W. F. Symonds & J. S. Gutkind: Ras-dependent activation of

94. MAP kinase pathway mediated by G-protein beta gamma sub units. Nature 369, 418-420(1994)

95. Polakis P. & F. McCormick: Structural requirements for the interaction of p21raswith GAP, exchange factors, and its biological effector target. J Biol Chem 268, 9157-9160(1993)

96. Fujita-Yoshigaki J., M. Shirouzu, Y. Ito, S. Hattori, S. Furuyama, S. Nishimura & S.

97. Yokoyama: A constitutive effector region on the C-terminal side of switch I of the Ras protein. J Biol Chem 270,4661-4667 (1995)

98. Stokoe D., S. G. Mcdonald, K. Cadwallader, M. Symmons & J. F. Hancock:

99. Activation of Raf as a result of recruitment to the plasma membrane. Science 264, 1463-1467(1994)

100. Kyriakis J. M., H. App, X. Zhang, P. Banerjee, D. L. Brautigan, U. R. Rapp & J.

101. Avruch: Raf-1 activates MAP kinase-kinase. Nature 358,417-421 (1992)

102. Cowley S., H. Paterson, P. Kemp & C. J. Marshall: Activation of MAP kinase kinaseis necessary and sufficient for PC 12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell 77, 841-852 (1994)

103. Ahn N. G., R. Seger, R. L. Bratlien, C. D. Diltz, N. K. Tonks & E. G. Krebs:

104. Multiple components in an epidermal growth factor-stimulated protein kinase cascade. In vitro activation of a myelin basic protein/microtubule associated protein 2 kinase. J Biol Chem 266,4220-4227 (1991)

105. Gomez N. & P. Cohen: Dissection of the protein kinase cascade by which nervegrowth factor activates MAP kinases. Nature 351, 69-72 (1991)

106. Kosako H., Y. Gotoh, S. Matsuda, M. Ishikawa & E. Nishida: Xenopus MAP kinaseactivator is a serine/threonine/tyrosine kinase activated by threonine phosphorylation. EMBO J11,2903-2908 (1992)

107. Nakielny S., P. Cohen, J. Wu & T. W. Sturgill: MAP kinase activator from insulinstimulated skeletal muscle is a protein threonine/tyrosine kinase. EMBO J11, 2123-2129 (1992)

108. Williams, N. G., and Roberts, Т. M. Signal transduction pathways involving the Rafproto-oncogene. (1994) Cancer Metastasis Rev. 13, 105-116.

109. Storm, S. M., Cleveland, J. L., and Rapp, U. R. Expression of raf family protooncogenes in normal mouse tissues (1990) Oncogene 5, 345-351

110. Stephens, R. M., Sithanandam, G., Copeland, T. D., Kaplan, D. R., Rapp, U. R., and

111. Morrison, D. K. 95-kilodalton B-Raf serine/threonine kinase: identification of the protein and its major autophosphorylation site (1992) Mo I. Cell. Biol. 12, 37333742.

112. Marais R., Y. Light, H. F. Paterson, C. S. Mason & C. J. Marshall: Differentialregulation of Raf-1, A-Raf, and B.Raf by oncogenic Ras and tyrosine kinases. J Biol Chem 272,4378-4383 (1997)

113. Katz M. E. & F. McCormick: Signal transduction from multiple Ras effectors. Curr

114. Opin Genet Dev 7,75-79 (1997)

115. Leevers S. J., H. F. Paterson & C. J. Marshall: Requirement for Ras in Raf activationis overcome by targeting raf to the plasma membrane. Nature 369,411-414 (1994)

116. Barnier J. V., Papin C., Eychene A. et al. The Mouse B-raf Gene Encodes Multiple

117. Protein Isoforms with Tissue-specific Expression. J. Biol. Chem. 1995; 270 (40): 23381-23389

118. Bogoyevitch M. A., Marshall C. J., Sugden P. H. Hypertrophic agonists stimulate theactivities of the protein kinases c-Raf and A-Raf in cultured ventricular myocytes. J. Biol. Chem. 1995; 270:26303-26310.

119. Nusse R., Varmus H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor viruscontain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell 1982; 31: 99-109.

120. Behrens J., Jerchow B. A., Wurtele M. et al. Functional interaction of an axinhomolog, conducnin, with B-catenin, APC, and GSK3B. Science 1998; 280: 5969.

121. Groden J., Thliveris A., Samowitz W. et al. Identification and characterization of thefamilial adenomatous polyposis coli gene. Cell 1991; 66: 589-600.

122. Sparks А. В., Morin P. J., Vogelstein B. Mutational analysis of the APC/betacatenin/Tcf pathway in colorectal cancer. Cancer Res 1998; 58: 1130-4.

123. Korinek V., Barker N., Morin P. J. et al. Constitutive transcriptional activation by abeta-catenin-Tcf complex in APC -/- colon carcinoma. Science 1997; 275: 1784-7.

124. Su L. K., Burrell M., Hill D. E. et al. APC binds to the novel protein EB1. Cancer Res 1995;55:2972-7.

125. Smith K. J., Levy D. В., Maupin P. et al. Wild-type but not mutant APC associates with the microtubule cytoskeleton.

126. Cancer Res 1994; 54:3672-5.

127. Pulciani S., Santos E., Lauver A. et al. Oncogene in solid human tumors. Nature1982; 300: 539-542.

128. Feig L. A., Bast R. C., Knapp R. C. et al. Somatic activation of ras-K gene in ahuman ovarian carcinoma. Science 1984; 223: 698-701.

129. Rodenhuis S., van de Wetering M. L., Mooi W. J.et al. Mutational activation of the K-RAS oncogene: a possible pathogenetic factor in adenocarcinoma of the lung. New Eng. J. Med. 1987; 317: 929-935.

130. Takeda S., Ichii S., Nakamura Y. Detection of K-ras mutation in sputum by mutantallele-specific amplification (MASA). Hum. Mutat. 1993; 2: 112-7.

131. Ahrendt S. A., Decker P. A., Alawi E. A. et al. Cigarette smoking is strongly associated with mutation of the K-ras gene in patients with primary denocarcinoma of the lung. Cancer 2001; 92: 1525-30.

132. Keohavong P., Lan Q., Gao W. M. et al. K-ras mutations in lung carcinomas from nonsmoking women exposed to unvented coal smoke in China. Lung Cancer. 2003;41:21-7.

133. Nakano H., Yamamoto F., Neville C. et al. Isolation of transforming sequences of two human lung carcinomas: structural and functional analysis of the activated c-K-ras oncogenes. Proc. Nat. Acad. Sci. 1984; 81: 71-5.

134. Toyooka S., Tsukuda K., Ouchida M. et al. Detection of codon 61 point mutations of the K-ras gene in lung and colorectal cancers by enriched PCR. Oncol Rep. 2003; 10:1455-9.

135. Hilbe W., Dlaska M., Duba H. C. et al. Automated real-time PCR to determine K-ras codon 12 mutations in non-small cell lung cancer: comparison with immunohistochemistry and clinico-pathological features. Int J Oncol 2003; 23: 1121-6.

136. Grossi F., Loprevite M., Chiaramondia M. et al. Prognostic significance of K-ras, p53, bcl-2, PCNA, CD34 in radically resected non-small cell lung cancers. Eur J Cancer 2003;39:1242-50.

137. Ramirez J. L., Sarries C., de Castro P. L. et al. Methylation patterns and K-ras mutations in tumor and paired serum of resected non-small-cell lung cancer patients. Cancer Lett. 2003; 193: 207-16.

138. Kovalchuk О., Chyczewska E., Niklinska W. et al. K-ras codon 12 mutations detected with enriched PCR method in operable non-small cell lung cancer. Folia Histochem Cytobiol. 2001; 39 Suppl 2: 68-9.

139. Miyakis S., Sourvinos G., Spandidos D. A. Differential expression and mutation ofthe ras family genes in human breast cancer. Biochem Biophys Res Commun. 1998;251:609-12.

140. Burmer G. C., Loeb L. A. Mutations in the KRAS2 oncogene during progressivestages of human colon carcinoma. Proc. Nat. Acad. Sci. 1989; 86: 2403-7.

141. Sidransky D., Tokino Т., Hamilton S. R. et al. Identification of RAS oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 1992; 256: 102-5.

142. Otori K., Oda Y., Sugiyama K. et al. High frequency of K-ras mutations in humancolorectal hyperplastic polyps. Gut 1997; 40: 660-3.

143. Vogelstein В., Fearon E. R., Hamilton S. et al. Genetic alterations duringcolorectal-tumor development. N Engl J Med 1988; 319: 525-532.

144. Fearon E. R., Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell1990;61:759-767.

145. Mendelsohn J., Howley P. M., Israel M. A. et al. The molecular basis of cancer. 2ndedition. W. B. Saunders Company. 2001, p. 300.

146. Rajagopalan H., Bardelli A., Lengauer C. et al. RAF/RAS oncogenes andmismatch-repair status. Nature 2002; 418: 934 only.

147. Chan T. L., Zhao W., Leung S. Y. et al. Cancer Genome Project. BRAF and KRASmutations in colorectal hyperplastic polyps and serrated adenomas. Cancer Res. 2003;63:4878-81.

148. Yuen S. Т., Davies H., Chan T. L. et al. Similarity of the phenotypic patternsassociated with BRAF and KRAS mutations in colorectal neoplasia. Cancer Res. 2002;62:6451-5.

149. Fransen K., Klintenas M., Osterstrom A, et al. Mutation analysis of the BRAF,

150. ARAF and RAF-1 genes in human colorectal adenocarcinomas. Carcinogenesis. 2003 Epub ahead of print.

151. Lindforss U., Papadogiannakis N., Zetterquist H. et al. Distribution of geneticvariants in preneoplastic areas of colorectal tumours. Eur J Surg Oncol. 2003; 29: 491-6.

152. Almoguera C., Shibata D., Forrester K. et al. Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes. Cell 1988; 53: 549-54.

153. Hruban R. H., Goggins M., Parsons, et al. Genetic progression in the pancreatic ducts (Commentary). Clin. Cancer Res 2000; 6: 2969-72.

154. Hruban R. H., Wilentz R. E., Kern S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. Am. J. Pathol. 2000; 156:1821-5.

155. Laghi L., Orbetegli O., Bianchi P.et al. Common occurrence of multiple K-RAS mutations in pancreatic cancers with associated precursor lesions and in biliary cancers. Oncogene 2002; 21: 4301-6.

156. Smit V. Т. H. В. M., Boot A. J. M., Smits A. M. M. et al. KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas. Nucleic Acids Res. 1988; 16: 7773-82.

157. Motojima K., Urano Т., Nagata Y. et al. Detection of point mutations in the Kirsten-ras oncogene provides evidence for the multicentricity of pancreatic carcinoma. Ann. Surg. 1993; 217: 138-43.

158. Sugio К., Molberg К., Albores-Saavedra J. et al. K-Ras mutations and allelic loss at 5q and 18q in the development of human pancreatic cancers. Int J Pancreatol 1997;21:205-17.

159. Matsubayashi H., Watanabe H., Nishikura K. et al. Determination of pancreatic ductal carcinoma histogenesis by analysis of mucous quality and K-Ras mutation. Cancer 1998; 82:651-60.

160. Luttges J, Schlehe В, Menke M, et al: The K-Ras mutation pattern in pancreatic ductal adenocarcinoma usually is identical to that in associated normal, hyperplastic and metaplastic epithelium. Cancer 1999; 85: 1703-10.

161. Schaeffer В. K., Glasner S., Kuhlmann E. et al. Mutated c-K-Ras in small pancreatic adenocarcinomas. Pancreas 1994; 9: 161-5.

162. Liu E., Hjelle В., Morgan R. et al. Mutations of the Kirsten-ras proto-oncogene in human preleukaemia. Nature 1987; 330: 186-8.

163. Bollag G., Adler F., el Masry N. et al. Biochemical characterization of a novel KRAS insertion mutation from a human leukemia. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32491-4.

164. Bezieau S., Devilder M.-C., Avet-Loiseau H. et al. High incidence of N and K-Ras activating mutations in multiple myeloma and primary plasma cell leukemia at diagnosis. Hum. Mutat. 2001; 18: 212-24.

165. Sithanandam G., Kolch W., Duh F. M. et al. Complete coding sequence of a human B-raf cDNA and detection of B-raf protein kinase with isozyme specific antibodies. Oncogene 1990; 5: 1775-80.

166. Ikawa S., Fukui M., Ueyama Y. et al. B-raf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangement. Mol Cell Biol 1988; 8: 2651-4.

167. Eychene A., Barnier J. V., Apiou F. et al. Chromosomal assignment of two human B-raf(Rmil) proto-oncogene loci: B-raf-1 encoding the p94(Braf/Rmil) and B-raf-2, a processed pseudogene. Oncogene 1992; 7: 1657-60.

168. Sithanandam G., Druck Т., Cannizzaro L. A. et al. B-raf and a B-raf pseudogene are located on 7q in man. Oncogene 1992; 7: 795-799.

169. Davies H., Bignell G. R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002; 417: 949-954.

170. Hingorani S. R., Jacobetz M. A., Robertson G. P. et al. Suppression of BRAF(V599E) in human melanoma abrogates transformation. Cancer Res. 2003; 63: 5198-202.

171. Brose M. S., Volpe P., Feldman M. et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer Res. 2002; 62: 6997-7000.

172. Naoki K., Chen Т. H., Richards W. G. et al. Missense mutations of the BRAF gene in human lung adenocarcinoma. Cancer Res. 2002; 62: 7001-3.

173. Edmunds S. С., Cree I. A., Di Nicolantonio F. et al. Absence of BRAF gene mutations in uveal melanomas in contrast to cutaneous melanomas. Brit. J. Cancer 2003; 88: 1403-5.

174. Cohen Y., Goldenberg-Cohen N., Parrella P. et al. Lack of BRAF mutation in primary uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44: 2876-8.

175. Cruz F. 3rd, Rubin B. P., Wilson D. et al. Absence of BRAF and NRAS mutations in uveal melanoma. Cancer Res. 2003; 63: 5761-6.

176. Weber A., Hengge U. R., Urbanik D. et al. Absence of Mutations of the BRAF Gene and Constitutive Activation of Extracellular-Regulated Kinase in Malignant Melanomas of the Uvea. Lab Invest. 2003; 83: 1771-6.

177. Rimoldi D., Salvi S., Lienard D. et al. Lack of BRAF mutations in uveal melanoma. Cancer Res. 2003; 63: 5712-5.

178. Pollock P. M., Harper U. L., Hansen K. S. et al. High frequency of BRAF mutations in nevi. Nature Genet. 2003; 33: 19-20.

179. Uribe P., Wistuba I. I., Gonzalez S. BRAF mutation: a frequent event in benign, atypical, and malignant melanocytic lesions of the skin. Am J Dermatopathol. 2003; 25: 365-70.

180. Yazdi A. S., Palmedo G., Flaig M. J. et al. Different frequencies of a BRAF point mutation in melanocytic skin lesions. Pigment Cell Res. 2003; 16: 580.

181. Kumar R., Angelini S., Hemminki K. Activating BRAF and N-Ras mutations in sporadic primary melanomas: an inverse association with allelic loss on chromosome 9. Oncogene. 2003; 22: 9217-24.

182. Dong J., Phelps R. G., Qiao R. et al. BRAF oncogenic mutations correlate with progression rather than initiation of human melanoma. Cancer Res. 2003; 63: 3883-5.

183. Gorden A., Osman I., Gai W. et al. Analysis of BRAF and N-RAS mutations in metastatic melanoma tissues. Cancer Res. 2003; 63: 3955-7.

184. Omholt K„ Platz A., Kanter L. et al. NRAS and BRAF Mutations Arise Early during Melanoma Pathogenesis and Are Preserved throughout Tumor Progression. Clin Cancer Res. 2003; 9: 6483-8.

185. Lang J., Boxer M., MacKie R. Absence of exon 15 BRAF germline mutations in familial melanoma. Hum Mutat. 2003; 21: 327-30.

186. Meyer P., Klaes R., Schmitt C. et al. Exclusion of BRAF V599E as a melanoma susceptibility mutation. Int J Cancer. 2003; 106: 78-80.

187. Laud K., Kannengiesser C., Avril M. F. et al. BRAF as a melanoma susceptibility candidate gene? Cancer Res. 2003; 63: 3061-5.

188. Meyer P., Sergi C., Garbe C. Polymorphisms of the BRAF gene predispose males to malignant melanoma. J Carcinog. 2003 Nov 14 Epub ahead of print.

189. Cohen Y., Xing M., Mambo E. et al. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma. J Natl Cancer Inst. 2003; 95: 625-7.

190. Kimura E. Т., Nikiforova M. N., Zhu Z. et al. High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer: genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma. Cancer Res. 2003; 63: 1454-7.

191. Soares P., Trovisco V., Rocha A. S. et al. BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene. 2003; 22: 4578-80.

192. Xu X., Quiros R. M., Gattuso P. et al. High prevalence of BRAF gene mutation in papillary thyroid carcinomas and thyroid tumor cell lines. Cancer Res. 2003; 63: 4561-7.

193. Namba H., Nakashima M., Hayashi T. et al. Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88: 4393-7.

194. Fukushima Т., Suzuki S., Mashiko M. et al. BRAF mutations in papillary carcinomas of the thyroid. Oncogene. 2003; 22: 6455-7.

195. Lee S. H., Lee J. W., Soung Y. H. et al. BRAF and KRAS mutations in stomach cancer. Oncogene. 2003; 22: 6942-5.

196. Oliveira C., Pinto M., Duval A. et al. BRAF mutations characterize colon but not gastric cancer with mismatch repair deficiency. Oncogene. 2003; 22: 9192-6.

197. Kim I. J., Park J. H., Kang H. C. et al. Mutational analysis of BRAF and K-ras in gastric cancers: absence of BRAF mutations in gastric cancers. Hum Genet. 2003; 114: 118-20.

198. Singer G., Oldt R. 3rd, Cohen Y. et al. Mutations in BRAF and KRAS characterize the development of low-grade ovarian serous carcinoma. Natl Cancer Inst. 2003; 95:484-6.

199. Gemignani M. L., Schlaerth A. C., Bogomolniy F. et al. Role of KRAS and BRAF gene mutations in mucinous ovarian carcinoma. Gynecol Oncol. 2003; 90: 378-81.

200. Calhoun E. S., Jones J. В., Ashfaq R. et al. BRAF and FBXW7 (CDC4, FBW7, AGO, SEL10) mutations in distinct subsets of pancreatic cancer: potential therapeutic targets. Am J Pathol. 2003; 163: 1255-60.

201. Tannapfel A., Sommerer F., Benicke M. et al. Mutations of the BRAF gene in cholangiocarcinoma but not in hepatocellular carcinoma. Gut. 2003; 52: 706-12.

202. Nagase H., Nakamura Y. Mutations of APC (adenomatous polyposis coli) gene. Hum Mutat 1993; 2:425-34.

203. Cottrell S., Bicknell D., Kaklamanis L. et al. Molecular analysis of APC mutations in familial adenomatous polyposis and sporadic colon carcinomas. Lancet 1992; 340: 626-30.

204. Yuan P., Sun M. H., Zhang J. S. et al. APC and K-ras gene mutation in aberrant crypt foci of human colon. World J Gastroenterol. 2001; 7: 352-6.

205. Powell S. M., Zilz N., Beazer-Barclay Y. et al. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature. 1992; 359: 235-7.

206. Miyoshi Y. Nagase H, Ando H. et al. Somatic mutations of the APC gene in colorectal tumors: mutation cluster region in the APC gene. Hum Mol Genet 1992; 1:229-33.

207. Beroud C., Soussi T. APC gene: database of germline and somatic mutations in human tumors and cell lines. Nucleic Acids Res 1996; 24: 121-4.

208. Nakatsuru S., Yanagisawa A., Ichii S. et al. Somatic mutation of the APC gene in gastric cancer: frequent mutations in very well differentiated adenocarcinoma and signet-ring cell carcinoma. Hum Mol Genet. 1992; 1: 559-63.

209. Nakatsuru S., Yanagisawa A., Furukawa Y. et al. Somatic mutations of the APC gene in precancerous lesion of the stomach. Hum Mol Genet. 1993; 2: 1463-5.

210. Tamura G., Maesawa C., Suzuki Y. et al. Mutations of the APC gene occur during early stages of gastric adenoma development. Cancer Res. 1994; 54:1149-51.

211. Lee J. H., Abraham S. C., Kim H. S. et al. Inverse relationship between APC gene mutation in gastric adenomas and development of adenocarcinoma. Am J Pathol. 2002; 161:611-8.

212. Furuuchi K., Tada M., Yamada H. et al. Somatic mutations of the APC gene in primary breast cancers. Am J Pathol. 2000; 156: 1997-2005.

213. Yashima K., Nakamori S., Murakami Y. et al. Mutations of the adenomatous polyposis coli gene in the mutation cluster region: comparison of human pancreatic and colorectal cancers. Int J Cancer. 1994; 59: 43-7.

214. Horii A., Nakatsuru S., Miyoshi Y. et al. Frequent somatic mutations of the APC gene in human pancreatic cancer. Cancer Res. 1992; 52: 6696-8.

215. Leon S. A., Shapiro В., Sklaroff D. M. et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977; 37: 646 650.

216. Maebo A. Plasma DNA level as a tumor marker in primary lung cancer. Jap J Thoracic Dis 1990; 28: 1085- 1091.

217. Fournie G. J., Courtin J. P., Laval F. Plasma DNA as a marker of cancerous cell death. Investigation in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing human tumour. Cancer Let 1995; 2: 221 227.

218. Stroun M., Anker P., Lyautey J. Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1987; 23: 707-12.

219. Stroun M., Lyautey J., Lederrey A. et al. About the possible origin and mechanism of circulating DNA. Apoptosis and active DNA release. Clin. Chem. Acta 2001; 313: 139-142.

220. Bevilacqua R. A., Nunes D. N., Stroun M. et al. The use of genetic instability as a clinical tool for cancer diagnosis. Semin Cancer Biol. 1998; 8:447-53.

221. Steinman C. R. Free DNA in serum and plasma from normal adults. J Clin Invest1975;56:512-515.

222. Kopreski M. S., Benko F. A., Rwee C. et al. Detection of mutant K-ras DNA in plasma or serum of patients with colorectal cancer. Br J Cancer 1997; 76: 1293-9.

223. Mulcahy H., Anker P., Lyautey J. et al. A prospective study of K-ras mutations in the plasma of pancreatic cancer patients. Clin Cancer Res 1998; 4: 271-5.

224. Yamada Т., Nakamori S., Ohzato H. et al. Circulating DNA K-ras mutation in pancreatic adenocarcinoma. Clin Cancer Res 1998; 4: 1527-32.

225. Hibi K., Robinson C. R., Booker S. et al. Molecular detection of genetic alterationsin the serum of colorectal cancer patients. Cancer Res 1998; 58: 1405-7.

226. Lam N. Y., Rainer Т. H., Chiu R. W. et al. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis. Clin Chem 2004; 50:256-7.

227. Alvibac M., Filotico R., Gianella C. et al. The effect of fixation type on DNA extracted from paraffin-embedded tissue for PCR studies in dermatopathology. Dermatology 1997; 195: 105-107.

228. Barnard R., Futo V., Pecheniuk. M et al. PCR bias toward the wild-type k-ras and p53 sequences: implications for PCR detection of mutations and cancer diagnosis. Biotechniques 1998; 25: 684-91.

229. Ward R., Hawkins N., O'Grady R. et al. Restriction endonuclease-mediated selective polymerase chain reaction. A novel assay for detection of K-ras mutations in clinical samples. Am J Pathol. 1998; 153: 373-9.

230. Burns W. C., Liu Y. S., Dow C. et al. Direct PCR from paraffin-embedded tissue. Biotechniques 1997; 22: 638-40.

231. Roberts N. J., Impey T. L., Applegate T. L. et al. Rapid, sensitivedetection of mutant alleles in codon 12 of K-ras by REMS-PCR. Biotechniques 1999; 27: 41822.

232. Mulcahy H. E., Lyautey J., Lederrey C. et al. A prospective study of K-ras mutations in the plasma of pancreatic cancer patients. Clin Cancer Res 1998; 4: 271-5.

233. Kahn S. M., Jiang W. Culbertson T. A. et al. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via "enriched" PCR amplification. Oncogene 1991; 6: 1079-83.

234. McGrath J. P., Capon D. J., Smith D. H. et al. Structure and organization of the human Ki-ras proto-oncogene and a related processed pseudogene. Nature 1983; 304 (5926): 501-6.215. http://p53.curie.fr/p53 site version 2.0/APCdatabase.html

235. Servomaa K., Kiuru A., Kosma V.-M. et al. p53 and K-ras gene mutations in carcinoma of the rectum among Finnish women. Mol Pathol 2000; 53: 24-30.

236. Garicochea В., Giorgi R., Odone V. F. et al. Mutational analysis of N-Ras and GAP-related domain of the neurofibromatosis type 1 gene in chronic myelogenous leukemia. Leukemia Res 1998; 22: 1003-7.

237. Corradini P., Ladetto M., Voena C. et al. Mutational activation of N- and K-ras oncogenes in plasma cell dyscrasias. Blood 1993; 81: 2708-13.

238. Shinozaki M., O'Day S., Kuo C. et al. Detection and clinical utility of Braf mutation in serum of melanoma patients. Circulating Nucleic Acid in Plasma and Serum 3rd Congress. John Wayne Cancer Institute, Santa Monica, CA, USA. November 9-12,2003.

239. Белохвостов А. С., Румянцев А. Г. Онкомаркеры. Москва: МАКС Пресс, 2003.

240. Alguacil J., Porta M., Malats N. et al. Occupational exposure to organic solvents and K-ras mutations in exocrine pancreatic cancer. Carcinogenesis 2002; 23: 1016.

241. Tada M., Omata M., Kawai S. et al. Detection of ras gene mutations in pancreatic juice and blood of patients with pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res 1993; 53: 2472-4.

242. Lecomte Т., Berger A., Zinzindohoue F. et al. Detection of free-circulating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis. Int J Cancer 2002; 100: 542-8.

243. Saetta A. A., Papanastasiou P., Michalopoulos N. V. et al. Mutational analysis of Braf in gallbladder carcinomas in association with K-ras and p53 mutations and microsatellite instability. Virchows Arch 2004; Jun 19.

244. Kim J. С., Foxworth A., Waldman T. et al. B-raf is dispensable for K-ras-mediated oncogenesis in human cancer cells. Cancer Res 2004; 64: 1932-7.

245. Rykova Е. Y., Laktionov P. P., Skvortsova Т. Е. et al. Extracellular DNA in breast cancer: Cell-surface-bound, tumor-derived extracellular DNA in blood of patients with breast cancer and nonmalignant tumors. Ann N Y Acad Sci 2004; 1022: 21720.

246. Schlechte H. H., Stelzer C., Weickmann S. et al. TP53 gene in blood plasma DNA of tumor patients. Ann N Y Acad Sci 2004; 1022: 61-9.

247. F. Lalloo. Genetics for Oncologists. Remedica Publishing Limited 2002.

248. Hirt B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. Mol Biol 1967; 26: 365-9.

249. Malumbres M., Pellicer A. RAS PATHWAYS TO CELL CYCLE CONTROL AND CELL TRANSFORMATION. Front in Biosci 1998; 3: 887-912.

250. Sulston J. E., Waterston R. Toward a complete human genome sequence. Genome Res. 1998; 8: 1097-108

251. International Human Genome Sequencing Consortium. The DNA sequence of Homo sapiens. 2003.

Информация о работе

Вдовиченко, Константин Константинович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Выявление мутаций в генах K-ras, B-raf и APC при некоторых онкологических заболеваниях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы