Изучение молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований щитовидной железы

Васильев, Евгений Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований щитовидной железы
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований щитовидной железы"

Ца правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ Евгений Витальевич

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.00.15 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории эпигенетики ГУ Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Залетаев Д.В. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Носиков В.В. доктор биологических наук Поляков А.В.

Ведущая организация:

< НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН

в_часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.16.01 ГУ МГНЦ РАМН

по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.

Защита диссертации состоится

2005 г.

Автореферат разослан " т?" 2005

г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук,

профессор

Курило Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак щитовидной железы (РЩЖ) - наиболее распространенная злокачественная опухоль эндокринных желез (90%), которая составляет около 1% всех диагностируемых злокачественных новообразований. ' Ежегодно в России регистрируется более 6 тыс. новых случаев и отмечается тенденция к увеличению заболеваемости РЩЖ. Смертность в результате злокачественных новообразований ЩЖ превышает совокупную летальность от онкопатологий всех остальных эндокринных органов.

Эффективность терапии РЩЖ напрямую зависит от распространенности опухолевого процесса, поэтому первостепенное значение имеет проблема усовершенствования существующих и внедрения новых методов ранней дооперационной диагностики РЩЖ. Несмотря на то, что РЩЖ занимает скромное место в общей статистике онкологических заболеваний человека, пальпируемые узловые образования ЩЖ различного генеза выявляются в популяции довольно часто (у ~1% лиц в возрасте 20 лет и у ~5% лиц в возрасте 60 лет), а при скрининговом ультразвуковом исследовании частота обнаружения узлов ЩЖ достигает 20-50%. Онкологическая настороженность при наличии любого узла в ЩЖ обусловливает необходимость применения современных и более эффективных молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих проводить раннюю или досимптоматическую диагностику злокачественных опухолевых образований, а также прогнозировать риск малигнизации узлового образования.

Существует четыре основных гистологических варианта РЩЖ, которые составляют 98% злокачественных опухолей ЩЖ: папиллярный РЩЖ (ПР1ЦЖ), фолликулярный РЩЖ (ФРЩЖ), анапластаческий (недифференцированный) РЩЖ и медуллярный (МРЩЖ).

Идентификация генетических факторов, ассоциированных с патогенезом каждого из перечисленных типов РЩЖ, является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. С точки зрения фундаментальной науки, дифференцированные опухоли ЩЖ фолликулярного происхождения (ПРЩЖ и ФРЩЖ) представляют собой уникальную модель для изучения закономерностей патогенеза различных морфологических и клинических типов опухоли, происходящих из одного типа клеток. Становится все более очевидным, что неопластическая трансформация тиреоцита, особенности гистогенеза опухоли, темпы её роста и прогрессия определяются структурными и функциональными ' нарушениями клеточного генома.

Особая роль в молекулярной этиологии медуллярной и папиллярной тиреокарцином принадлежит протоонкогену RET. Активирующие точковые ► мутации RET являются причиной 95% случаев семейных форм МРЩЖ. В связи с этим стала возможной досимптоматическая и пренатальная диагностика заболевания в семьях с отягощенной наследственностью методами молекулярной генетики. ДНК-диагностика наследственного МРЩЖ широко применяется во многих медицинских центрах мира, однако не достаточно

POf ■ L ■

К/Г?>'>{«Г

распространена в практике отечественных эндокринологических и онкологических клиник.

Значительный интерес представляет изучение соматических нарушений генома, маркирующих злокачественные опухоли ЩЖ. Настоящее исследование посвящено разработке методических подходов выявления таких нарушений, а также оценке их диагностической значимости как потенциальных маркеров РЩЖ для российских больных.

Принимая во внимание медицинскую, социальную и научную значимость проблемы злокачественных новообразований ЩЖ, изучение генетических нарушений в опухолевой клетке представляется крайне перспективным направлением в молекулярной и клинической онкологии и позволит расширить наши знания о природе РЩЖ на генетическом уровне.

Цель работы и задачи исследования: Целью настоящей работы является изучение наследственных и соматических молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием наиболее частых вариантов РЩЖ и разработка экспериментальных подходов к ранней и досимптоматической диагностике злокачественных новообразований ЩЖ. Достижение поставленной цели предусматривает решение следующих экспериментальных задач:

1. Провести поиск и характеристику терминальных мутаций протоонкогена RET у пациентов с различными формами МРЩЖ.

2. Разработать скрининговый метод выявления химерных онкогенов RET/PTC в тканях узловых образований ЩЖ на основе определения гиперэкспрессии тирозинкиназного домена RET с помощью полуколичественной RT-PCR.

3. Определить частоту химерных онкогенов RET/PTC в узловых образованиях ЩЖ и провести идентификацию наиболее распространенных вариантов перестроек в Л£7ХРГС-положительных образцах.

4. Определить частоту мутаций протоонкогена BRAF в тканях различных узловых образований ЩЖ.

5. Оценить диагностическую значимость перестроек RET/PTC и соматических мутаций BRAF в качестве потенциальных маркеров злокачественности новообразований ЩЖ.

Научная новизна. В результате проведенного исследования изучен спектр мутаций протоонкогена RET у больных с семейной и спорадической формами МРЩЖ. Выявлено 11 различных мутаций протоонкогена RET у 46 человек из 25 семей. Впервые идентифицирована комплексная терминальная мутация (делеция с инсерцией без сдвига рамки считывания) 1895 1907 delins4 в 11 экзоне RET и впервые в России обнаружена редкая терминальная трансверсия G1891T (D631Y). Установлено, что преобладающим типом терминальных мутаций в гене RET у российских больных с наследственными формами МРЩЖ являются миссенс-мутации внеклеточного цистеин-богатого домена. Впервые выявлена "молчащая" мутация G2673A (S891S) в семье с наследственным ПРЩЖ.

Впервые в России охарактеризована частота соматических перестроек RET/PTC и мутаций гена BRAF в выборке спорадических узловых образований

ЩЖ и показана специфичность этих нарушений для ПРЩЖ. В двух случаях ПРЩЖ выявлены редкие или не охарактеризованные варианты перестроек RET/PTC, а также обнаружен новый онкоген ARFP/RET в ткани радиационно-индуцированного ПРЩЖ. Помимо стандартной замены Т1796А, впервые при ПРЩЖ описаны две новые соматические мутации гена BRAF: G1753A (Е585К) и делеция del 1800_1811. Механизм онкогенного действия последней мутации, затрагивающей "активирующий сегмент" киназы B-RAF может представлять теоретический интерес для изучения регуляции ее активности.

Практическая значимость. В результате проведенного исследования разработаны подходы для молекулярной диагностики и характеристики микроструктурной патологии гена RET при наследуемых формах МРЩЖ. Проведена ДНК-диагностика у 72 больных с МРЩЖ из 64 неродственных семей, а также у 30 их здоровых родственников. Практическая значимость работы связна с возможностью досимптоматической диагностики МРЩЖ среди лиц повышенного риска, а также выявления новых семейных случаев МРЩЖ. У 13 человек терминальные мутации RET обнаружены до начала клинической манифестации заболевания, а профилактическое хирургическое лечение проведено четырем из них. У 17 обследованных здоровых родственников носительство мутации было исключено. Наследственный характер заболевания установлен для пациентов со "спорадическим" МРЩЖ из 10 семей.

Высокая частота перестроек RET/PTC и мутаций гена BRAF в обследованных тканях ПРЩЖ (75.8%), а также их абсолютная специфичность для ПРЩЖ делает эти генетические нарушения перспективными молекулярными маркерами злокачественности для дооперационной дифференциальной диагностики ПРЩЖ. Именно ПРЩЖ составляет большинство случаев РЩЖ (60-80%) и поражает людей трудоспособного возраста (30-50 лет). С этим связана социально-экономическая значимость результатов настоящего исследования.

Методы, использованные в данной работе, вполне доступны и могут быть адаптированы к применению в клинических лабораториях. Результаты исследования внедрены в практику МРНЦ РАМН (Обнинск) и ЭНЦ РАМН.

Положения, выносимые на защиту:

1. Определены частота и спектр мутаций протоонкогена RET при различных формах МРЩЖ; наибольшую диагностическую значимость имеют мутации цистеин-богатой области внеклеточного домена RET.

2. Разработан эффективный скрининговый метод выявления химерных онкогенов RET/PTC с помощью сравнительного анализа экспрессии внеклеточного и каталитического доменов RET.

3. Соматические перестройки RET/PTC и мутации гена BRAF -специфические молекулярные маркеры ПРЩЖ, которые представляют собой альтернативные механизмы активации RAS-RAF-MEK-ERK МАР-киназного каскада в этиопатогенезе ПРЩЖ.

4. Соматические мутации гена BRAF при ПРЩЖ достоверно чаще встречаются у пациентов старшей возрастной группы.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека ESHG (Страсбург,

2002; Бирмингем, 2003; Мюнхен, 2004); научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" (Москва, июнь 2002), на конференции ГНТП «Геном человека» (Москва, 2002); межлабораторных семинарах МГНЦ РАМН и на заседании Ученого Совета МРНЦ РАМН (Обнинск, 20 июля 2004). По результатам исследования опубликовано 4 статьи и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на /£5^страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Иллюстративный материал представлен 8 таблицами и 20 рисунками. Список цитируемой литературы содержит^Л»У источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты с различными формами МРЩЖ и их ближайшие родственники были отобраны в отделении радиохирургии Медицинского радиологического научного центра (МРНЦ) РАМН (Обнинск), в детском отделении Эндокринологического научного центра (ЭНЦ) РАМН и в клинике Российского онкологического научного центра (РОНЦ) им. H.H. Блохина РАМН. Исследование выполнено на образцах периферической крови 102 человек из 64 семей, включая 72 больных с наследственной и спорадической формами МРЩЖ и 30 их здоровых родственников. Кровь 6 больных из 3 семей с наследственным ПРЩЖ направлена из отделения радиохирургии МРНЦ РАМН.

Пациенты с узловыми образованиями ЩЖ были отобраны и прооперированы в отделении радиохирургии МРНЦ РАМН и в ЭНЦ РАМН. Выборку узловых образований ЩЖ составили 91 образец ПРЩЖ, 3 ФРЩЖ, 11 фолликулярных аденом ЩЖ (ФАЩЖ), 4 многоузловых (МУЗ) и 9 одноузловых (ОУЗ) зобов. Гистологический диагноз МРЩЖ и других узловых образований ЩЖ верифицирован в отделениях патоморфологии соответствующих учреждений.

Выделение ДНК. Для получения из венозной крови ДНК необходимой степени чистоты и молекулярного веса использовали стандартный метод фенол-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989). Выделение РНК и ДНК из тканей узловых образований ЩЖ проводили с использованием реактива "TRIzol" (Life Techologies, Inc.) согласно инструкциям производителя.

Реакцию обратной транскрипции (синтез к ДНК) проводили с использованием случайных гексануклеотидных праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV (НИИ Эпидемиологии) с добавлением ингибитора рибонуклеаз ("MBI Fermentas", Литва) согласно прилагаемой инструкции.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме на программируемом термоциклере «МС2» ("ДНК-технология", Россия) с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq ("MBI Fermentas", Литва). Последовательности олигонуклеотидных праймеров для амплификации 10, 11,

13, 14, 15, 16 экзонов гена RET приведены в ранее опубликованной работе (Васильев и др., 2004а). Метод выявления химерных онкогенов RET/PTC в тканях узловых образований ЩЖ основывался на определении гиперэкспрессии тирозинкиназного домена RET с помощью мультиплексной RT-PCR. Соотношение RET-ЕС и RET-ТК транскриптов оценивалось путем сканирования окрашенного ПААГ и денситометрии фрагментов ДНК с применением программы TotalLab v. 1.10 ("Nonlinear Etynamics Ltd."). Для выявления мажорной соматической мутации Т1796А использован метод специфической амплификации мутантного аллеля (ARMS-ПЦР). Условия реакций и последовательности праймеров для определения перестроек RET/PTC и мутаций гена BRA F приведены в работе (Васильев и др., 2004b).

Рестрикционный анализ. Выявление мутаций Т1900С, T1900G и G1901А в 634 кодоне гена RET проводилось путем рестрикции ПЦР-фрагментов 11 экзона с применением эндонуклеаз Hin6l (BstHHl), НаеIII и Rsaï (ООО "СибЭнзим") согласно рекомендациям производителя.

SSCP-анализ. Поиск точковых мутаций проводили методом регистрации конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP-анализ), предложенным Orita с сотр. (1989). Визуализацию ДНК в ПАА1 проводили по усовершенствованной методике AgNOj-окраски, предложенной Blum с сотр. (1982).

Определение нуклеотидной последовательности. Автоматическое секвенирование выполнено по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits "Applied Biosystems".

Компьютерный анализ последовательностей ДНК на наличие сайтов узнавания ферментов рестрикции проводился с помощью программ Genepro и Vector NTI. Анализ хроматограмм секвенированных последовательностей выполнялся с помощью программы Chromas v. 1.45.

Статистическая обработка результатов. Оценку достоверности различий между частотами встречаемости качественных признаков проводили с помощью расчета непараметрической статистики у} и точного критерия Фишера с использованием программы STATISTICA v. 6.0 ("StatSoft").

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-генетический анализ гена RET_у больных с

наследственной и спорадической формами МРЩЖ. Медуллярная гиреокарцинома составляет 5-10% всех злокачественных новообразований щитовидной железы и происходит из парафолликулярных (кальцитонин продуцирующих) С-клеток. В большинстве случаев (70-80%) эта опухоль возникает спорадически, а у 20-30% пациентов прослеживается семейный анамнез. Наследственно обусловленная форма МРЩЖ включает 3 различных клинических синдрома с аутосомно-доминантным типом наследования: семейный медуллярный рак щитовидной железы (СМРЩЖ), синдром

множественной эндокринной неоплазии 2-го типа А (МЭН-2А) и синдром множественной эндокринной неоплазии 2-го типа Б (МЭН-2Б).

Генетическое сцепление синдрома МЭН-2А с ДНК-маркером D10S5 в прицентромерном районе длинного плеча хромосомы 10 впервые было продемонстрировано в 1987 г. (Simpson et al., 1987), а первые герминальные миссенс-мутации протоонкогена RET (REarranged during Transfection) у пациентов с синдромом МЭН-2А обнаружены в 1993 г. (Mulligan et al., 1993). Впоследствии герминальные мутации гена RET были выявлены в случаях синдрома МЭН-2Б и СМРЩЖ (Donis-Keller et al., 1993; Hofstra et al., 1994). Нротоонкоген RET, расположенный на длинном плече 10 хромосомы (локус 10qll.2), имеет протяженность -55 тыс.п.н. и содержит 21 экзон. Белковый продукт гена RET является тирозинкиназным мембраносвязанным рецептором, который состоит из внеклеточного (лиганд-связывающего), трансмембранного и внутриклеточного (каталитического) доменов. Внеклеточная часть RET, отвечающая за связывание с лигандами, содержит дистальный кадхерин-подобный участок и проксимальный гомодимеризационный богатый цистеином район.

Герминальные точковые миссенс-мутации, обусловливающие развитие МЭН-2А и большинства случаев СМРЩЖ, приводят к замене цистеина на другую аминокислоту в цистеин-богатом домене, соответствующем 10 и 11 экзонам гена RET. Мутации в кодонах 609, 611, 618, 620 (экзон 10) и 634 (экзон 11) обнаруживаются в 98% случаев МЭН-2А и 80% СМРЩЖ. В 10-20% случаев СМРЩЖ аминокислотные замены выявляются во внутриклеточных тирозинкиназных доменах, кодируемых экзонами 13 (кодоны 768, 790, 791), 14 (кодоны 804, 844) и 15 (кодон 891) (Eng, 1999). Синдром МЭН-2Б в 95% случаев сопровождается уникальной точковой мутацией М918Т в 16 экзоне RET.

В настоящей работе представлены результаты молекулярно-генетического обследования 102 человек, включая 72 пациента с различными формами МРЩЖ из 64 неродственных семей, а также 30 их ближайших родственников. Диагноз МЭН-2А (сочетание МРЩЖ с феохромоцитомой и/или гиперпаратиреозом хотя бы у одного из членов семьи) был поставлен в 7 семьях. У 3 неродственных пациентов МРЩЖ сочетался с фенотипическими аномалиями, характерными для синдрома МЭН-2Б. Наследственный характер заболевания (наличие МРЩЖ хотя бы у двух членов семьи без признаков феохромоцитомы и гиперпаратиреоза) был отмечен в 7 семьях. В семейном анамнезе остальных 47 пациентов указания на онкологическую патологию ЩЖ отсутствовали.

Для обнаружения трех наиболее частых мутаций в 634 цистеиновом кодоне был выполнен рестрикционный анализ 11 экзона RET. В результате однонуклеотидных замен Т1900С, G1901A и T1900G появляются сайты расщепления для рестриктаз Hinöl, Rsal и НаеIII соответственно. Пример выявления мутации Т1900С в семье с МЭН-2А с использованием рестрикционного анализа показан на рис. 1.

М 6

Нормашиая последовательность:

«31 «32 633 6» 635 63« 637

GAC GAG CTG TGC CGC ACG GTG

Мухангная последовательность'

631 632 633 634 635 636 e31 GAC GAG CTjC CGC |CGC ACG GTG t

Hh761

Рис. 1. Выявление мутации C634R с помощью рестрикционного анализа. Нормальный аллель - 324 п.н., мутантный - 234 п.н. Дорожки 1,3,5 -продукты амплификации 11 экзона без рестрикхазной обработки, в дорожках 2,4,6 - продукты гидролиза ферментом Hin6\. МЭН2А-1, МЭН2А-2 - ДНК пациентов с синдромом МЭН-2А. М-маркер длины фрагментов ДНК (pUC19/Mspl). Длины фрагментов ДНК указаны в парах нуклеотидов (п.н.)

Тестирование 634 кодона на наличие других миссенс-мутаций и поиск мутаций в 609, 611, 618, 620 цистеиновых кодонах проводили с помощью автоматического секвенирования 11 и 10 экзонов. В 6 из 7 обследованных семей с МЭН-2А были обнаружены однонуклеотидные замены в 634 кодоне, причем самая частая из описанных мутаций Т1900С встретилась в 4 семьях. В остальных 2 семьях обнаружена замена Gl901 Т. Из 7 семей с СМРЩЖ мутации в 634 кодоне выявлены в 4, а мутация Gl 859А в 620 кодоне (C620Y) - в ) семье.

В 8 из 47 обследованных семей со спорадической формой МРЩЖ выявлены терминальные мутации 10 и 11 экзонов гена RET.

Все пациенты с диагнозами МРЩЖ и СМРЩЖ, у которых не обнаружено мутаций в 10 и 11 экзонах, были протестированы методом SSCP на наличие мутаций в экзонах 13, 14, 15 и 16.

У двоих неродственных пациентов со спорадическим МРЩЖ выявлена трансверсия А2372Т в 791 кодоне RET (экзон 13), приводящая к замене аминокислотTyr-»Phe. Результат секвенирования представлен на рис.2.

А-»Т

С А А А Т Т STTT 5 CG

789

790

791

792

Рис. 2. Результат выявления мутации А2372Т в 791 кодоне гена №Т(У79Щ у пациента со спорадическим МРЩЖ методом прямого секвенирования.

Однонуклеотидные замены T2307G (L769L), С2508Т (S836S), C2712G (S904S), обнаруженные в экзонах 13, 14 и 15 соответственно, оказались полиморфными вариантами, не приводящими к аминокислотным заменам в кодируемом белке.

У всех троих пациентов с диагнозом МЭН-2Б обнаружена стандартная для этого заболевания мутация Т2753С в 918 кодоне RET, приводящая к замене аминокислот Met—>Thr.

Количество обследованных пациентов с различными клиническими формами МРЩЖ и результаты тестирования гена RET приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Спектр мутаций протоонкогена RET, выявленных у пациентов с различными формами МРЩЖ.

Экзон Кодон Нуклеотиды Аминок-та Семей

11 634 Т1900С (TGC—>CGC) C634R (Cys—»Arg) 4 - МЭН-2А 1 - СМРЩЖ 1 - МРЩЖ 6

11 634 Gl901А (TGC—>ТАС) C634Y (Cys—»Гуг) 3 - СМРЩЖ 3 - МРЩЖ 6

11 634 Gl90IT (TGC—>ТТС) C634F (Cys—>Phe) 2 - МЭН-2А

11 634 T1900G (TGC—»GGC) C634G (Cys—»Gly) 1 - МРЩЖ

И 634 Gl901С (TGC—>TCC) C634S (Cys—»Ser) 1 - МРЩЖ

И 631 G1891T (GAC—>TAC) D631Y (Asp—»Tyr) 1 - МРЩЖ

11 632-636 1895907 delins 4 F.LCRT—>VR 1 - МЭН-2А

10 620 T185 8C (TGC—»CGC) C620R (Cys—»Arg) 1 - МРЩЖ

10 620 Gl859A (TGC—»TAC) C620Y (Cys—»Tyr) 1 - СМРЩЖ

13 791 A2372T (TAT-VITT) Y791F (Tyr—»Phe) 2 - МРЩЖ

16 918 T2753C (ATG—>ACG) M918T (Met—»Thr) 3 - МЭН-2Б

Как видно из таблицы 1, у большинства пациентов обнаружены мутации в цистеиновых кодонах 634 и 620, что согласуется с данными литературы (в том числе и отечественными - Амосенко и др., 2003) о распределении наиболее частых мутаций. Известно, что существует определенная зависимость клинической картины заболевания от локализации и характера мутации. Так, у лиц с мутацией в 634 кодоне риск развития феохромоцитомы составляет около 50%, а при мутации в 10 экзоне - 10%. В ряде исследований показана четкая взаимосвязь между мутациями в 634 кодоне и наличием феохромоцитомы и/или гиперплазии паращитовидных желез (Eng et al., 1996).

По результатам нашего исследования, фенотип МЭН-2А наиболее часто ассоциирован с мутациями в 634 кодоне, особенно с заменой C634R. Эта мутация обнаружена в 4 из 7 обследованных семей с МЭН-2А. Кроме того, замена C634R была выявлена в 2 семьях без очевидных клинических признаков МЭН-2А. Интересно заметить, что, по данным литературы, ни в одной из обследованных до сих пор семей с СМРЩЖ замены C634R обнаружено не

было. В связи с этим всем нашим пациентам с указанной мутацией было рекомендовано провести тщательное обследование на предмет выявления феохромоцитомы и гиперпаратиреоза.

Помимо стандартных мутаций в 620 и 634 кодонах нами обнаружена редкая однонуклеотидная замена G1891T (D631Y) в нецистеиновом 631 кодоне. Замена аминокислот Asp-» Туг в этом случае происходит между соседними цистеиновыми остатками (соответствующими кодонам 630 и 634), в результате чего локально меняется конформация рецептора и, вероятно, нарушается образование внутримолекулярных дисульфидных связей.

Среди необычных мутаций при МЭН-2А и СМРЩЖ известны 2 случая дупликаций в экзоне 11 (протяженностью 9 и 12 п.н.) (Hoppner et al., 1998) и 1 случай дупликации 9 п.н. в экзоне 8 (Pigny et al., 1999). Каждая из трех этих мутаций приводит к вставке 3 или 4 аминокислот, одна из которых - цистеин. В настоящей работе выявлен новый тип мутаций при МЭН-2А: у 2 пациентов из семьи с диагнозом МЭН-2А в 11 экзоне была обнаружена делеция 13 и инсерция 4 нуклеотидов (1895_1907delinsTGCG). Мутация нарушает структуру кодонов с 632 по 636, но сдвига рамки считывания при трансляции не происходит. Результат секвенирования и схема мутации представлены на рис. 3.

Ранее была обнаружена похожая мутация 1895_1918delinsTGCGGC в ткани медуллярной тиреокарциномы, однако в ДНК из крови пациента она отсутствовала, т.е. была соматической (Marsh et al., 1998). Описываемая нами делеция с инсерцией 1895_1907delinsTGCG является первым случаем терминальной мутации такого типа.

629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 CACTGTGCGAC GAGCTGTGC С G С А С G GTGATC G С

Норма

629 630 631 637 638 639 640 641

(_А_11-*_^ ]-*-1 t-1 -А-1 , Л , ,-А-)

CACTGTGCGAC G Т G С G G GTGATCGCAGC CGCTGT Мутация

Рис. 3. Результат секвенирования мутации 1895_1907delinsTGCG у пациента с МЭН-2А и нормальной последовательности 11 -го экзона RET. Области делеции и инсерции подчеркнуты.

В двух обследованных семьях с наследственной формой МРЩЖ мутаций выявлено не было, что, по-видимому, связано с наличием мутации в других, не исследованных экзонах гена RET. В таких случаях дальнейшему тестированию RET, по рекомендациям некоторых авторов, должна предшествовать непрямая ДНК-диагностика с использованием полиморфных внутригенных или внегенных маркеров, подтверждающая сцепление заболевания с локусом 1 Oq 11.2. Однако в упомянутых двух семьях количество пораженных родственников не было достаточным для анализа сцепления.

В результате проведенного молекулярно-генетического тестирования были обнаружены 11 различных мутаций протоонкогена RET у 46 человек из 25 неродственных семей с различными формами МРЩЖ, причем одна из мутаций (1895_1907delinsTGCG) выявлена впервые.

Таблица 2. Результаты тестирования протоонкогена RET у пациентов с различными клиническими формами МРЩЖ.

Диагноз Семей с мутациями Количество человек с мутациями Мутаций, выявленных доклинически Исключено мутаций у родственников Обследовано семей Обследовано человек

МЭН-2А 7 16 4 8 7 24

МЭН-2Б 3 3 0 0 3 3

СМРЩЖ 5 11 3 3 7 16

МРЩЖ 10 16 6 6 47 59

Всего 25 46 13 17 64 102

Основная цель ДНК-диагностики при МРЩЖ заключается в своевременном выявлении или исключении носительства патологического гена у ближайших родственников пациента с ранее выявленной мутацией. Теоретически в семье с известной мутацией 50% родственников не являются её носителями, и риск развития у них заболевания не превышает такового в общей популяции. Эти лица не нуждаются в дальнейшем и повторном обследовании. Выявление терминальной мутации у здорового родственника (обычно ребенка) становится, как правило, абсолютным показанием для проведения профилактической тотальной тиреоидэктомии, поскольку более чем у 90% детей с характерными мутациями протоонкогена RET, рано или поздно развивается МРЩЖ.

В настоящей работе у 13 человек мутации были обнаружены до начала клинической манифестации заболевания, а профилактическое хирургическое лечение проведено четырем из них. У 17 обследованных нами здоровых родственников носительство мутации было исключено.

Молекулярно-генетические исследования, кроме того, необходимы для выявления новых семейных случаев МРЩЖ. Терминальные мутации протоонкогена RET обнаруживаются примерно у 5-10% пациентов с, казалось бы, явной спорадической формой МРЩЖ. Вероятность наследственного характера заболевания существенно выше у молодых пациентов с

мультицентрическим ростом С-клеточной опухоли или поражением обеих долей щитовидной железы. В настоящее время предпочтение отдается скринингу мутаций протоонкогена RET в клетках периферической крови даже при явных спорадических формах МРЩЖ. В проведенном обследовании 47 человек со спорадическим МРЩЖ терминальные мутации были обнаружены в 10 случаях, 1 оказавшихся в действительности наследуемыми.

Таким образом, в современной эндокринологической практике молекулярно-генетический анализ протоонкогена RET становится ведущим методом ' предиктивной диагностики МРЩЖ, позволяющим во многих случаях отказаться от традиционных биохимических тестов.

Перестройки RET/РТС в тканях ПРШЖ и других узловых образований

ЩЖ. Молекулярной основой как медуллярных, так и значительной части папиллярных тиреокарцином является приобретение аномально высокой фосфорилирующей активности белковым продуктом гена RET. Однако механизмы активации рецепторной тирозинкиназы RET в этих двух типах опухолей ЩЖ принципиально различаются. В то время как для МРЩЖ характерны активирующие точковые мутации RET, ПРЩЖ связывают с вовлечением протоонкогена RET в хромосомные перестройки (инверсии и транслокации), в результате которых происходит слияние участка, кодирующего тирозинкиназный домен RET с 5'-концевым фрагментом одного из генов-доноров, активно транскрибируемых в тиреоцитах. Таким способом образуются структурно измененные формы протоонкогена RET, называемые RET/PTC-онкогенами. Результатом их экспрессии является гиперпродукция химерных RET/PTC онкобелков, обладающих постоянной тирозин-фосфорилирующей активностью, которые, по всей видимости, играют роль в патогенезе ПРЩЖ (Santoro et al., 2002). На сегодняшний день известно не менее 16 вариантов химерных онкогенов RET/PTC с участием, по крайней мере, 11 различных генов-доноров.

В настоящей работе проведена идентификация перестроек RET/PTC в выборке различных узловых образованиях ЩЖ, включавшей 91 образец ПРЩЖ, 3 ФРЩЖ, 11 фолликулярных аденом ЩЖ (ФАЩЖ), четыре многоузловых (МУЗ) и 9 одноузловых (ОУЗ) зобов.

Возникновение химерных RET/PTC-онкогенов сопровождается потерей в » новообразованных мутированных генах района, содержащего промотор гена RET и фрагмента, кодирующего внеклеточный (экстрацеллюлярный ЕС) домен RET При этом транскрипция участка, кодирующего тирозинкиназный (ТК) домен • гибридного гена, попадает под контроль гораздо более сильного (по сравнению с RET в тиреоцитах) промотора активирующего гена-донора. В результате экспрессия (транскрипция) участка, кодирующего ТК-домен RET, становится преобладающей по сравнению с экспрессией фрагмента, кодирующего ЕС-домен. Соотношение RET-ЕС и RET-ТК транскриптов может быть оценено

методом полуколичественной мультиплексной RT-PCR с применением двух пар праймеров.

Точки хромосомных разрывов во всех известных ЛЕГ/РГС-онкогенах (кроме RET/PTC4) приходятся на область 11-го интрона RET протяженность™ 1.8 тыс. п.н. Поэтому в настоящей работе для анализа экспрессии участка, кодирующего ЕС-домен, были выбраны праймеры, расположенные в 7 и 8 экзонах RET, а праймеры для обнаружения RET-ТК мРНК соответствовали экзонам 12-13. В тканях нормальной ЩЖ и ЛЕТ/РГС-негативных опухолей ЩЖ уровень экспрессии мРНК ЕС- и ТК-доменов примерно одинаков (за счет примеси С-клеток и, возможно, слабой экспрессии RET в фолликулярных тиреоцитах). Существенно повышенная интенсивность сигнала, соответствующего RET-ТК по сравнению с ЛЕТ-ЕС, указывает на наличие перестройки RET/PTC (Рис. 4).

а. М1 2346678

Pixel Position Fixe) Position

»l ; Ii '-H iti JU

RET7PTC+ RET/PTC -

Рис. 4. Сравнительный анализ экспрессии ЕС- и ТК- доменов протоонкогена RET методом мультиплексной RT-PCR. а) 1,2 - ЛЕГ/РГС-положительные ПРЖЩ; 3,4,5 -Я£7У/ТС-отрицательные ПРЩЖ, 6,7 - ФАЩЖ, 8 - ОУЗ, 9 - МУЗ. Явное усиление RET-ТК-сигнала по сравнению с RET-ЕС в дорожках 1 и 2 указывает на возможное наличие RET/PTC перестроек. M - маркер длины фрагментов ДНК, п.н. (Pucl9/Afopl). б) Показания денситометра в случае наличия (дорожка 2) и отсутствия (дорожка 6) перестроек RET/PTC.

При сравнительном анализе экспрессии фрагментов ЕС- и ТК- доменов RET нами выявлены 12 &Е7УРГС-положительных случаев ПРЩЖ из 85 обследованных, что составляет 14%. Ни в одном из образцов ФРЩЖ, ФАЩЖ, ОУЗ и МУЗ дисбаланса экспрессии RET-ТК и RET-ЕС обнаружено не было.

Идентификация конкретных перестроек (RET/PTC 1, RET/PTC2 и RET/PTC3) проводилась методом RT-PCR с четырьмя праймерами, один из которых отжигается в 12 экзоне RET, а три остальных соответствуют последовательностям генов Н4, PRKAR1A и ELE1. Из 12 образцов ПРЩЖ, в которых наблюдался дисбаланс экспрессии RET-EC и RET-ТК, присутствие

транскриптов химерного онкогена RET/PTC1 было показано в 7, a RET/PTC3 - в 2 случаях (Рис. 5). Перестройки RET/PTC2 выявлено не было.

М 1 2 3 4 6

Рис. 5. Выявление химерных онкогенов ШТ/РТС1 и ЯЕТ/РТСЗ методом ИТ-РСЯ. 1 - Я£Т/Р70-положительный ПРЖЩ; 2 - КЕТ/РТС 1- положи ильный ПРЩЖ, 3, 4, 5 образцы ПРЩЖ, не содержащие перестроек ЯЕТ/РТС1, ЯЕТ/РТС2 и ЯЕТ/РТСЗ М маркер длины фрагментов ДНК, п.н. (Рис19/М?/Я).

Верификация мутаций КЕТ/РТС1 и ЯЕТ/РТСЗ проводилась с помощью прямого секвенирования соответствующих ЯТ-РСЛ продуктов (Рис. 6а,б).

а. ШЕТ/РТС1

RET

С СТ6С ССлА» С С С А SCGTTACCATCCAeGATCCAAA 6TS0 GAATTCCCTCGGAAG

6. RET/PTQ

ELE1

ПЕГ

AAA©CAGACCTTGeAGAACAGTCAeDA66ATCCAAA ОТО ВВААТТ С ССТС 56 А АС

>мш

шшшЫй

9. ARFP/RET

--- RFP -»1«- RET --

GCAGCCCACCAGGOAGCTCCTGCAGGAGGATCCAiiAeTSGGAATTCCCTCGGAAG

Рис. 6. Результат секвенирования химерных транскриптов КЕТ/РТС1(г), ЯЕТ/РТСЗ (б) и АКЕР/ЯЕТ (в).

В остальных 3 случаях ПРЩЖ с повышенной экспрессией КЕТ-ТК предполагаемые ЛЕТ/РГС-перестройки не принадлежали ни к одному из трех вариантов ЯЕТ/РТС1-3. В одной из таких опухолей с помощью ЯТ-РСЯ и прямого секвенирования нами был обнаружен химерный онкоген АЯЕР/КЕТ.

Результат секвенирования представлен на рис. 6. Этот вариант RET/PTC-перестройки представляет собой результат сбалансированной транслокации t(6;10)(p21.3;ql 1.2), которая сопровождается слиянием участка, кодирующего гирозинкиназный домен RET с 5'-частью гена RFP (RET Finger Protein). Точки хромосомных разрывов в этом случае приходятся на 3 и 11 интроны генов RFP и RET соответственно.

Первая RFP/RET перестройка была обнаружена еще в 1985 г. в классических экспериментах по трансфекции фибробластов мыши опухолевой ДНК и расценена как экспериментальный артефакт (Takahashi et al., 1985). Именно тогда протоонкоген RET получил свое название ("REarranged during Transfection")- В отличие от нового ARFP/RET-оикотена, точки разрыва в генах RFP и RET затрагивали интроны 7 и 9 соответственно. Поэтому первоначально обнаруженный химерный онкоген RFP/RET ("RET') имел большую протяженность с сохранением трансмембранного и частично ЕС-домена. Химерный онкоген ARFP/RET лишен участка, кодирующего трансмембранный домен и, подобно остальным RET/PTC-онкогент, его продукт представляет собой цитоплазматический белок.

Существуют наблюдения относительно различий клинических и гистологических характеристик ПРЩЖ в зависимости от присутствия конкретного варианта перестройки RET/PTC. Эти различия, по-видимому, объясняются индивидуальными структурными особенностями N-концевой части каждого химерного онкобелка RET/PTC, привносимой тем или иным партнерским полипептидом. С другой стороны, такие различия могут быть обусловлены гаплонедостаточностью гена-партнера, одна из копий которого рекомбинирует с локусом RET.

Мутация RET/PTC3, как правило, ассоциируется с ранней клинической манифестацией ПРЩЖ и более агрессивным поведением опухоли по сравнению с RET/PTC 1. ЛЕТ/Р70-положительные опухоли характеризуются более инвазивным и быстрым ростом, а также частым метастазированием (Nikiforov et al., 1997). Кроме того, показана связь RET/PTCЗ-перестроек с формированием особого, фолликулярно-солидного гистологического варианта ПРЩЖ (Thomas et al., 1999). Действительно, оба обследованных нами пациента с мутацией RET/PTC3 на момент оперативного вмешательства имели развернутую стадию ПРЩЖ с метастазами, а их возраст составлял 11 и 25 лет. Существенное преобладание перестроек RET/PTC3 среди детей, пострадавших от загрязнения радиоактивными изотопами в результате Чернобыльской катастрофы, указывает на исключительную роль радиации в патогенезе RET/PTC3-индуцированного ПРЩЖ. Однако сведений о возможном воздействии радиации в анамнезе этих двух пациентов не имеется.

Выявленные нами 7 RET/PTC1-положительных опухолей представляют собой хорошо дифференцированные ПРЩЖ типичного папиллярного строения, характеризующиеся медленным ростом и благоприятным клиническим

прогнозом. Случай необычной перестройки ARFP/RET относится к пациенту, в анамнезе которого отмечается факт лучевой терапии области шеи по поводу лимфопролиферативного заболевания, а морфологическая картина опухоли соответствует фолликулярному варианту ПРЩЖ.

Остальные два не идентифицированных нами RET/PTC- онкогена, принадлежат, вероятно, к редким перестройкам RET/PTC или являются новыми, еще не охарактеризованными, вариантами химерных онкогенов RET/PTC.

Отсутствие мутаций RET/PTC в доброкачественных ФАЩЖ, ОУЗ и МУЗ, а также в случаях ФРЩЖ подтверждают результаты большинства исследований, согласно которым RET/PTC-онкогены являются характерными маркерами лишь ПРЩЖ.

Спектр и частота соматических мутаций протоонкогена BRAF при ПРЩЖ и других узловых образованиях ЩЖ. Для выявления стандартной мутации Т1796А в 599 кодоне гена BRAF нами был использован метод специфической амплификации мутантного аллеля, называемый также ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Специфическая амплификация мутантного аллеля достигается тем, что последний нуклеотид на 3'-конце одного из олигонуклеотидных праймеров соответствует мутантной последовательности. Поскольку Taq-полимераза лишена З'-экзонуклеазной (корректирующей) активности, в случае некомплементарности этого основания соответствующему нуклеотиду матрицы, наращивания цепи не происходит. Благодаря этому, ПЦР-продукт образуется лишь при наличии ожидаемой мутации в исследуемой ДНК (Рис. 7).

М 1 234567 8

Рис. 7. Выявление мутации Т1796А в гене ВРАГ методом специфической амплификации мутантного аллеля. 1, 2, 4- ПРЩЖ с мутацией Т1796А, 3, 5, 7 - ПРЩЖ с диким типом В КАР, 6 - ПРЩЖ с мутацией с!е11800 1811; 8-нормальная ДНК человека Присутствие фрагмента длиной 125 п.н. указывает на наличие замены Т1796А. М - маркер длины фрагментов ДНК, п.н. (рТ1С191Мхр\).

В 60.4% (55 из 91) обследованных нами образцов ПРЩЖ выявлена мутация Т1796А, приводящая к замене аминокислоты У599Е в белке В-ЯАР. Наличие

этой мутации подтверждено прямым секвенированием 15 экзона BRAF. Ни в одном из 3 случаев ФРЩЖ, 11 ФАЩЖ и 13 тканях узлового зоба ЩЖ стандартной замены Т1796А обнаружено не было.

Таким образом, эта активирующая мутация является наиболее частым из известных на сегодняшний день соматических генетических нарушений при ПРЩЖ. Ее частота в папиллярных тиреокарциномах, согласно исследованиям других авторов, составляет 29-69% (Cohen et al., 2003; Puxeddu et al., 2004). Во всех работах замена Т1796А обнаруживалась исключительно в ткани ПРЩЖ, но отсутствовала в доброкачественных опухолях и достаточно редко встречалась в прочих злокачественных новообразованиях ЩЖ.

В настоящей работе были выявлены две новые соматические мутации BRAF при ПРЩЖ. В одном образце нами выявлена транзиция G1753A (Е585К) благодаря появлению дополнительной гетеродуплексной полосы на электрофореграмме. Мутация сопровождается заменой аминокислоты Glu—»Lys в 585 положении белка B-RAF.

Вторая нетривиальная мутация представляет собой делецию 12 нуклеотидов del 1800_1811 и обнаружена нами впервые. Делеция нарушает структуру кодонов с 600 по 604, но сдвига рамки считывания при трансляции не происходит. Поскольку границы делеции не совпадают с границами кодонов, выпадение четырех аминокислот с 601 по 604 сопровождается еще и заменой Lys—»Asn в 600 положении белкового продукта (Рис. 8).

я. Мутация del 1800_1811

AJa Thr Val Asn* Gly Ser Hie Gin Phe Glu Gin Leu 537 598 599 600 605 606 607 608 609 610 611 612 GCTACAGTGAATGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTG

б. Нормальная последовательность:

Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gin 597 538 539 600 601 602 603 604 605 606 607 608

ï С TA CA GT G A A AT С T С G AT G G A G T G G G T С С CAT CAG

Рис. 8. Результат секвенирования 15 экзона ВЯАР в образце ПРЩЖ, содержащем мутацию dell800_1811. Область делеции подчеркнута.

Предполагаемый механизм активирующего действия мутации У599Е заключается в следующем. Активация киназы В-ЯАР в нормальных условиях происходит за счет фосфорилирования остатков треонина (в позиции 598) и серина (в позиции 601). Отрицательный заряд глутаминовой кислоты, которую

содержит мутантный белок в положении 599, имитирует отрицательный заряд фосфорилированной (активной) формы B-RAF. Активность мутантной киназы B-RAF, таким образом, перестает регулироваться фосфорилированием Т598 и S601 и становится неконтролируемой (Davies et al., 2002).

Все известные на сегодняшний день онкогенные точковые мутации BRAF локализуются в высоко консервативном районе CR3 (Conserved Region 3), соответствующем киназному домену белка. В этом домене принято различать N-концевую (АТФ-связывающую) и С-концевую (субстрат-распознающую) части. Последовательность 15 экзона BRAF кодирует вторую из них. Ключевым элементом субстрат-распознающего фрагмента ("активирующим сегментом") является последовательность 30 аминокислот между консервативными мотивами DFG и АРЕ. Описанная нами делеция dell800 1811 затрагивает 8-12 аминокислоты этого "активирующего сегмента". Механизм активации киназы B-RAF в случае делеции dell800_1811, по-видимому, связан с нарушением внутримолекулярных гидрофобных взаимодействий между "активирующим сегментом" и глицин-богатой "G-петлей", которые в нормальных условиях должны обеспечивать стабильность неактивной конформации фермента.

В обследованной нами выборке ПРЩЖ мутации BRAF достоверно чаще выявлялись у пациентов старшей возрастной группы. Мы располагали информацией о возрасте на момент операции для 81 человека с диагнозом ПРЩЖ. Диапазон их возрастов - от 10 до 68 лет, а средний возраст обследованных нами пациентов с ПРЩЖ - 44 года.

По результатам нашего исследования, среди пациентов старше 45 лет число опухолей, в которых обнаружены мутации BRAF, в 3 раза превышает случаи без мутаций (27 и 9 соответственно), а для больных старше 50 лет это соотношение равно 7 (21/3) (Табл. 3).

Таблица 3. Частота обнаружения соматических мутаций BRAF в зависимости от возраста пациентов для пограничных возрастов 45 лет (а) и 50 лет (б).

а) б)

Мутация BRAF + Нет мутации Всего:

Возраст <45 23 28.4% 22 27 2% 45 55.6%

Возраст >45 27 33.3% 9 11.1% 36 44.4%

Всего: 50 61.7% 31 38.3% 81

Мутация BRAF + Нет мутации Всего'

Возраст <50 29 35.8% 28 34,6% 57 70.4%

Возраст >50 21 25,9% 3 3.7% 24 29.6%

Всего: 50 61.7% 31 38.3% 81

Достоверное преобладание соматических мутаций BRAF в возрастной группе старше 45 лет показано с использованием статистического критерия х2 (х2=4.83; р=0.028) и точного двустороннего критерия Фишера (р=0.0386). С увеличением пограничного возраста до 50 лет достоверность различий возрастает (р=0.0023,

точный двусторонний критерий Фишера). Критический уровень значимости (а) принимался равным 0.05.

Похожие закономерности были выявлены и другими авторами. По результатам исследования спорадического (не связанного с радиацией) ТТРЩЖ у детей и молодых людей, частота мутации V599E гена BRAF была низкой и не превышала 6%. При обследованнии образцов постчернобыльского радиационно-индуцированного ПРЩЖ частота стандартной замены V599E в гене BRAF оказалась крайне низкой в подгруппе детей младше 15 лет (на момент операции) и возрастала с увеличением возраста пациентов (Lima et al., 2004; Kumagai et al., 2004). Таким образом, низкая частота соматических мутаций BRAF при ПРЩЖ в детском и юношеском возрасте наблюдается независимо от предшествующего воздействия радиации. Следовательно, мутагенная роль ионизирующей радиации в канцерогенезе BRAF У599Е-положительных опухолей невелика или развитие опухоли из тиреоцигов с мутацями BRAF требует более длительного латентного периода. Возможно, точковые мутации BRAF и связанный с ними патогенез опухолей ЩЖ представляют собой результат кумулятивного эффекта неизвестных канцерогенов, воздействующих в течение жизни.

Важно заметить, что в настоящей работе мутации гена BRAF не были обнаружены ни в одном из 12 ЛЕТУРГС-положительных ПРЩЖ, что совпадает с результатами других авторов (Soeres et al., 2003; Nikiforova et al., 2003), согласно которым, Д£77Р7,С-перестройки протоонкогена RET и мутация V599E BRAF являются альтернативными механизмами активации RAS-RAF-MEK-ERK МАР-киназного каскада в папиллярных карциномах ЩЖ.

В целом, согласно результатам нашего исследования, суммарная частота RET/PTC-перестроек и мутаций BRAF в не перекрывающихся образцах ПРЩЖ составила 75,8% (69 из 91). Частоты обнаружения химерных онкогенов RET/PTC и мутаций BRAF в различных узловых образованиях ЩЖ приведены в таблице 4.

Таблица 4. Частота перестроек RET/PTC и соматических мутаций гена BRAF в узловых образованиях ЩЖ.

Узловое образование ЩЖ Химерный онкоген RET/PTC Мутация BRAF

RET/PTC1 RET/PTC2 RET/PTC3 ARFP/RET RET/PTCX Т1796А G1753A del 1800 1811

ПРЩЖ 7/85 (8 2%) 0/85 (0%) 2/85 (2.4%) 1/85 (1 2%) 2/85 (2.4%) 55/91 (60.4%) 1/91 (1.1%) 1/91 (1 1%)

ФРЩЖ 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)

ФАЩЖ 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%)

ОУЗ 0/9 (0%) 0/9 (0%) 0/9 (0%) 0/9 (0%) 0/9 (0%) 0/9 (0%) 0/9 (0%) 0/9 (0%)

МУЗ 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)

Всего 12/85 (14.1% 57/91 (62.6%)

69/91 (75.8%)

Представленные в настоящей работе результаты могут иметь и непосредственное практическое значение. Поскольку в обследованной группе больных, проживающих в Российской Федерации, нами обнаружена относительно высокая частота мутаций гена BRAF, специфичных для ПРЩЖ, молекулярно-генетический анализ может быть высокоинформативным подспорьем на стадии дооперационной дифференциальной диагностики. Благодаря высокой чувствительности и надежности описанных методов, возможно проведение молекулярного исследования материала тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ), что может быть особенно важным в случае неоднозначного результата цитологического исследования подозрительных узлов ЩЖ. Доступность информации о мутационном статусе BRAF также может оказать влияние на выбор тактики лечения.

Молекулярно-генетический анализ протоонкогенов RET и BRAF у больных с семейным ПРЩЖ. В настоящей работе для 6 пациентов из 3 семей был проведен поиск терминальных нарушений в генах BRAF и RET, вовлеченных в патогенез большинства спорадических ПРЩЖ. Сведения о возможном контакте с ионизирующим излучением в анамнезе этих семей отсутствуют. Поэтому, учитывая молодой возраст пациентов, наследственный характер заболевания в этих семьях представляется весьма вероятным (Рис. 9).

Рис. 9. Родословные обследованных семей с наследственным ПРЩЖ (с указанием возраста пациентов).

Поиск терминальных мутаций BRAF у пациентов с семейным ПРЩЖ мы проводили с помощью SSCP-анализа 15-го экзона, а для выявления стандартной замены Т1976А использован метод ARMS-ПЦР. Ни у одного из обследованных пациентов методом SSCP изменений электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК не обнаружено. Стандартная замена Т1976А также отсутствовала во всех 6 случаях. На сегодняшний день нет ни одного сообщения о выявлении наследуемых онкогенных мутаций BRAF. В настоящий момент отсутствуют публикации, посвященные исследованию гена BRAF при наследственных опухолях ЩЖ. Возможно, терминальные мутации BRAF несовместимы с нормальным эмбриональным развитием, т.е. являются летальными.

Для обнаружения терминальных перестроек RET/PTC мы применили метод мультиплексной полуколичественной RT-PCR, сравнивающий экспрессию Ж- и

13 30 26

Семья 1 Семья 2

Семья 3

ЕС- доменов протоонкогена RET в лимфоцитах крови больных с наследственным ПРЩЖ. Ни у одного из 6 пациентов экспрессии гена RET в крови зарегистрировано не было. Кроме того, результаты RT-PCR со специфическими праймерами на химернные онкогены RET/PTC1, RET/PTC2 и RET/PTC3 были отрицательными. Следует сказать, что в настоящее время случаи терминальных перестроек RET/PTC у человека не известны.

С целью выявления терминальных мутаций протоонкогена RET для каждого из 6 пациентов было проведено прямое секвенирование экзонов 10, 11, 13-16. В семье 1 у обеих больных (женщина 49 лет и её 13-летняя дочь) обнаружена 1е1ерозиготная замена G2673A в 15 экзоне RET. Результат секвенирования представлен на рис. 10.

88В 890 891 892 893

GAAGATTTCA GATTT CG

Рис. 10. Результат секвенирования 15 экзона RET, содержащего терминальную замену G2673A (S891S), у пациента с ПРЩЖ из семьи 1.

Обнаруженная транзиция G2673A не приводит к замене аминокислот (S891S) и, вероятно, представляет собой "молчащую" мутацию, поскольку полиморфные варианты в этой позиции и в этом кодоне до сих пор не описаны. В то же время 891 ко дон RET является одной из мишеней для мутаций в семьях с наследственным МРЩЖ (Hofstra et al., 1997). Кроме того, известен случай терминальной мутации T2671G (S891A) в семье со смешанной медуллярно-папиллярной тиреокарциномой (Fugazzola et al., 2002).

Возможность патогенного характера обнаруженной нами замены G2673A (S891S) нельзя исключить без исследования транскрипции 15 экзона RET в опухолевом материале ПРЩЖ. Известно, что однонуклеотидные замены в ряде случаев могут существенно изменять стабильность и вторичную структуру молекулы мРНК, а также нарушать сплайсинг соответствующих экзонов гена. На сегодняшний день известно не менее 23 заболеваний и генов, в которых "трансляционно молчащие" внутриэкзонные замены нуклеотидов на самом деле представляют собой мутации сплайсинга (Cartegni et al., 2002). Некоторые из этих мутаций приводят к созданию альтернативных донорных или акцепторных сайтов сплайсинга, другие нарушают структуру энхансеров ESE (exonic splicing enhancer) или сайленссров ESS (exonic splicing silencer) сплайсинга экзонов. По мнению специалистов, изучающих болезни сплайсинга, многие исследователи ошибочно причисляют все обнаруженные "молчащие" мутации к трансляционно

нейтральным полиморфизмам, поэтому публикуемая частота мутаций сплайсинга занижена по сравнению с истинной (Cartegni et al., 2002).

К сожалению, для нашего исследования не был доступен операционный материал ПРЩЖ или других ЛЕГ-экспрессирующих тканей пациентов из семьи 1, у которых обнаружена замена G2673A (S891S), поэтому изучение влияния этой мутации на сплайсинг 15 экзона RET с помощью прямых методов (RT-PCR) не проводилось.

До недавнего времени участие протоонкогена RET в патогенезе ПРЩЖ связывали исключительно с образованием химерных онкогенов RET/PTC. Однако в литературе появляется все больше сообщений о случаях смешанных медуллярно-папиллярных тиреокарцином или об ассоциации МРЩЖ и ПРЩЖ в одной семье с идентифицированной терминальной точковой мутацией гена RET (Melillo et al., 2004). Кроме того, в одной из линий трансгенных мышей, экспрессирующих мутантный аллель RET C634R под контролем промотора кальцитонинового гена, обнаружено сочетание МРЩЖ и ПРЩЖ (Reynolds et al., 2001). Принимая во внимание все эти факты, представляется маловероятным случайное возникновение ПРЩЖ у лиц с МРЩЖ и терминальными мутациями RET. Mellilo с соавт. (2004) в экспериментах in vitro впервые доказали трансформирующую активность некоторых онкогенных мутаций RET на клеточной линии тиреоцитов фолликулярного происхождения. Следовательно, умеренная онкогенная активность мутантных форм рецептора RET в фолликулярных тиреоцитах может объяснить редкие случаи ПРЩЖ в семьях с терминальными точковыми мутациями протоонкогена RET. Возможно, точковые мутации RET также играют роль в этиопатогенезе или формируют предрасположенность к возникновению спорадических ПРЩЖ, однако такие исследования, как правило, не проводятся. Детальный скрининг протоонкогена ЛЕГ в образцах ПРЩЖ в будущем поможет разрешить этот вопрос.

выводы

1. Определена частота и спектр молекулярной патологии протоонкогена RET при обследовании 72 пациентов из 64 неродственных семей с различными клиническими формами МРЩЖ. Идентифицировано 11 различных мутаций RET у 33 больных из 25 семей. Впервые выявлена и охарактеризована терминальная делеция с инсерцией 1895_1907delins4 в 11 экзоне гена RET. У 13 человек мутации обнаружены до начала клинической манифестации заболевания; у 17 носительство мутаций гена RET исключено.

2 Разработан эффективный метод выявления химерных онкогенов RET/PTC с помощью сравнительного анализа экспрессии внеклеточного и каталитического доменов протоонкогена RET. В 14.1% (12/85) папиллярных тиреокарцином обнаружен дисбаланс экспрессии ТК- и ЕС- доменов, указывающий на наличие перестроек RET/PTC. Среди них - 7 случаев RET/PTC1, 2 - RET/PTC3, 1 - ARFP/RET и 2 неидентифицированных онкогена RET/PTC.

3 Определена частота соматических мутаций гена BRAF в выборке папиллярных карцином ЩЖ. В 60% (55 из 91) образцов ПРЩЖ обнаружена трансверсия Т1796А. Показано достоверное преобладание мутации Т1796А у пациентов старшей возрастной группы. Впервые при ПРЩЖ описаны транзиция G1753A и делеция dell800 1811.

4. Отсутствие случаев перекрывания мутаций гена BRAF и онкогенов RET/PTC позволяет считать эти два события альтернативными механизмами активации МАР-киназного сигнального каскада в этиопатогенезе папиллярных карцином ЩЖ. Суммарная частота мутаций BRAF и перестроек RET/PTC в обследованных образцах ПРЩЖ составила 75,8% (69/91). В связи с высокой частотой и специфичностью эти маркеры могут быть использованы для предоперационной диагностики ПРЩЖ.

5. Проведен скрининг точковых мутаций протоонкогена RET у 6 пациентов из 3 семей с наследственным ПРЩЖ. У 2 пациентов из одной семьи обнаружена однонуклеотидная замена G2673A (S891S). Терминальных перестроек RET/PTC и мутаций гена BRAF в случаях семейного ПРЩЖ не обнаружено.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Васильев Е.В., Румянцев П.О., Полякова Е.Ю., Исаев П.А., Любченко Л.Н., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярная диагностика мутаций протоонкогена RET при различных формах медуллярного рака щитовидной железы. Молекулярная медицина 2004а №2 с.54-60.

2. Васильев Е.В., Румянцев П.О., Саенко В.А., Ильин А.А., Полякова Е.Ю., Немцова М.В., Залетаев Д.В.Молекулярный анализ структурных нарушений генома папиллярных карцином щитовидной железы. Молекулярная биология 2004b; 38, №4 с. 642-653.

3. Васильев Е.В., Румянцев П.О., Саенко В.А., Ильин А.А., Полякова Е.Ю., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Радиационно-индуцированные опухоли: диагностика молекулярной патологии в различных формах рака щитовидной железы. Вестник НИИ Молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова 2004с; №4 с.55-73.

4. Васильев Е.В., Полякова Е.Ю., Петеркова В.А., Румянцев П.О., Землякова В.В., Залетаев Д.В. Поиск и характеристика молекулярных маркеров при различных формах рака и узлов щитовидной железы. Тезисы докладов научно-практического симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении". Москва, 20-21 июня 2002, с.136-139.

5. Васильев Е.В., Полякова Е.Ю., Петеркова В.А., Румянцев П.О., Землякова В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. "Молекулярный анализ различных форм рака щитовидной железы".// Тезисы докладов конференции "Геном человека". Москва, 2002 - с. 103-104.

6. Vasil'ev E.V., Polyakova E.Y., Peterkova V.A., Roumiantsev P.O., Zaletayev D.V. "Molecular analysis of the RET proto-oncogene on MEN II patients."// Abst. European human genetics conference 2002, May 25-29, Strasbourg, France. European Journal of Human Genetics 2002, vol.lO-suppl.l-May 2002. p.247.

7. Vasil'ev E.V., Polyakova E.Y., Peterkova V.A., Roumiantsev P.O., Zaletayev D.V DNA Testing for the Mutations Causing Multiple Endocrine Neoplasia Type 2.// Abst. European human genetics conference 2003, May 3-6, Birmingham, England. European Journal of Human Genetics 2003, vol.11-suppl.l-May 2003. p.71.

8. Vasil'ev E.V., Roumiantsev P.O., Saenko V.A., II'in A.A., Polyakova E.Y., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V. В RAF mutations and RET/PTC rearrangements in papillary thyroid carcinoma.// Abst. European Human Genetics Conference 2004, June 12-15, Munich, Germany. European Journal ofHuman Genetics 2004, vol.12-suppl.l-June 2004. p.175.

9. Кузнецов H.C., Бельцевич Д.Г., Полякова Е.Ю., Васильев Е.В., Немцова М.В. Диагностика и лечение синдрома множественных эндокринных неоплазий 2 типа. Хирургия 2002; №2 с. 4-10.

10. Zaletayev D.V., Vasil'ev E.V., Roumiantsev P.O., Saenko V.A., Il'in A.A., Polyakova E.Y., Nemtsova M.V. Molecular analysis of structural anomalies on patients with medullary and papillary thyroid carcinomas. //Abst. 18th Meeting of the European Association for cancer research. Innsbruck, Austria 3-6 July 2004.

11. Orlova E.M., Polyakova E.Y., Vasil'ev E.V., Zaletayev D.V., Shushkov R.V., Peterkova V.A. A case of ACTH-producing medullary thyroid carcinoma associated multiple endocrine neoplasia type 2B (MEN2B) in a girl. //Abst. 6th European endocrinologist's congress 2003, April 26-30, Lion, France.

Принято к исполнению 28/03/2005 Исполнено 29/03/2005

Заказ № 726 Тираж 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat ги

РНБ Русский фонд

2005-4 45254

f & 5. »

î I ï 1

■ i- а : * ;

г s /

• к ..

i Í

2 2 ДПР7865

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильев, Евгений Витальевич

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клиническая характеристика злокачественных опухолей ЩЖ.

1.1.1. Гистологическая классификация РЩЖ.

1.1.2. Клинико-эпидемиологическая характеристика РЩЖ.

1.2. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза МРЩЖ.

1.3. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза опухолей ЩЖ фолликулярного происхождения.

1.3.1. Рецептор тиреотропного гормона.

1.3.2. Протоонкоген RET.

1.3.3. Перестройка PAX-8/PPARy.

1.3.4. Протоонкоген NTRK1.

1.3.5. Протоонкогены семейства RAS.

1.3.6. Протоонкоген BRAF.

1.3.7. Протоонкоген МЕТ.

1.3.8. Гены-супрессоры роста опухолей.

1.4. Резюме.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика клинического материала.

2.2. Забор крови и операционного материала.

2.3. Выделение геномной ДНК.

2.4. Выделение РНК из крови и операционного материала.

2.5. Спектрофотометрическое определение концентрации РНК.

2.6. Синтез кДНК.

2.7. Полимеразная цепная реакция.

2.7.1. ПЦР кодирующих районов гена RET.

2.7.2. Сравнительный анализ экспрессии ЕС- и ТК- доменов RET методом полуколичественной RT-PCR.

2.7.3. Идентификация перестроек RET/PTC1, RET/PTC2, RET/PTC и ARFP/RET методом RT-PCR.

2.7.4. Аллель-специфическая амплификация мутантного аллеля BRAF.

2.8. Рестриктный анализ.

2.9. Электрофоретическое разделение ДНК.

2.9.1. Электрофорез ДНК в неденатурирующем ПААГ.

2.9.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.10. Детекция точковых мутаций методом SSCP.

2.11.Окрашивание ПААГ нитратом серебра.

2.12. Определение нуклеотидной последовательности.

2.13. Программное обеспечение.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Молекулярно-генетический анализ гена RET у больных с наследственной и спорадической формами МРЩЖ.

3.2. Перестройки RET/PTC в тканях ПРЩЖ и других узловых образований ЩЖ.

3.3. Спектр и частота соматических мутациий гена BRAF при ПРЩЖ и других узловых образовниях ЩЖ.

3.4. Молекулярно-генетический анализ протоонкогенов RET и BRAF у больных с семейным ПРЩЖ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований щитовидной железы"

Рак щитовидной железы (РЩЖ) является наиболее распространенной злокачественной опухолью эндокринных желез (90%) и составляет около 1% всех диагностируемых злокачественных новообразований. Ежегодно в России регистрируется более 6 тыс. новых случаев и отмечается тенденция к увеличению заболеваемости РЩЖ. Смертность в результате злокачественных новообразований ЩЖ превышает совокупную летальность от онкопатологий всех остальных эндокринных органов.

В настоящее время методом выбора при лечении злокачественных опухолей ЩЖ, диагностированных клинически и цитологически, является тотальная тиреоидэкгомия в сочетании с хирургическим удалением лимфатических узлов, расположенных по путям возможного метастазирования опухоли. Эффективность терапии РЩЖ напрямую зависит от распространенности опухолевого процесса, поэтому первостепенное значение имеет проблема усовершенствования существующих и внедрения новых методов ранней дооперационной диагностики РЩЖ. Несмотря на то, что РЩЖ занимает скромное место в общей статистике онкологических заболеваний человека, пальпируемые узловые образования ЩЖ различного генеза выявляются в популяции довольно часто (у ~1% лиц в возрасте 20 лет и у ~5% лиц в возрасте 60 лет), а при скрининговом ультразвуковом исследовании частота обнаружения узлов ЩЖ достигает 20-50%. Онкологическая настороженность при наличии любого узла в ЩЖ обусловливает необходимость применения современных и более эффективных молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих проводить раннюю и досимптоматическую диагностику злокачественных опухолевых образований, а также прогнозировать риск малигнизации узлового образования.

Существует четыре основных гистологических варианта РЩЖ, которые составляют 98% злокачественных опухолей ЩЖ: папиллярный РЩЖ (ПРЩЖ), фолликулярный РЩЖ (ФРЩЖ), анапластический (недифференцированный) РЩЖ и медуллярный (МРЩЖ).

Идентификация генетических факторов, ассоциированных с патогенезом каждого их перечисленных типов РЩЖ, является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. С точки зрения фундаментальной науки, дифференцированные опухоли ЩЖ фолликулярного происхождения (ПРЩЖ и ФРЩЖ) представляют собой уникальную модель для изучения закономерностей патогенеза различных морфологических и клинических типов опухоли, происходящих из одного типа клеток. Становится все более очевидным, что неопластическая трансформация тиреоцита, особенности гистогенеза опухоли, темпы её роста и прогрессия определяются структурными и функциональными нарушениями клеточного генома.

Особая роль в молекулярной этиологии медуллярной и папиллярной тиреокарцином принадлежит протоонкогену RET. Активирующие точковые мутации RET являются причиной 95% случаев семейных форм МРЩЖ. В связи с этим стала возможной досимптоматическая и пренатальная диагностика заболевания в семьях с отягощенной наследственностью методами молекулярной генетики. ДНК-диагностика наследственного МРЩЖ широко применяется во многих медицинских центрах мира, однако не достаточно распространена в практике отечественных эндокринологических и онкологических клиник.

Значительный интерес представляет изучение соматических нарушений генома, маркирующих злокачественные опухоли ЩЖ. Среди таких нарушений наибольшего внимания заслуживают онкогенные перестройки гена RET (RET/PTC) и соматические мутации протоонкогена BRAF, которые, по данным исследований последних лет, специфичны для наиболее распространенного варианта злокачественных опухолей ЩЖ - ПРЩЖ. Настоящее исследование посвящено разработке методических подходов к их выявлению, а также оценке диагностической значимости этих нарушений как потенциальных маркеров ПРЩЖ для российских больных.

Цель и задачи исследования

Цель работы - изучение наследственных и соматических молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием наиболее частых вариантов РЩЖ и разработка экспериментальных подходов к ранней и досимптоматической диагностике злокачественных новообразований ЩЖ.

Достижение поставленной цели предусматривает решение следующих экспериментальных задач:

3. Определить частоту химерных онкогенов RET/PTC в узловых образованиях ЩЖ и провести идентификацию наиболее распространенных вариантов перестроек в RET/PTC-положительных образцах.

4. Определить частоту мутаций протоонкогена BRAF в тканях различных узловых образований ЩЖ.

Научная новизна

В результате проведенного исследования изучен спектр мутаций протоонкогена RET у больных с семейной и спорадической формами МРЩЖ. Выявлено 11 различных мутаций протоонкогена RET у 46 человек из 25 семей. Впервые идентифицирована комплексная терминальная мутация (делеция с инсерцией без сдвига рамки считывания) 18951907 delins4 в 11 экзоне RET и впервые в России обнаружена редкая геминальная трансверсия G1891T (D631Y). Установлено, что преобладающим типом терминальных мутаций в гене RET у российских больных с наследственными формами МРЩЖ являются миссенс-мугации внеклеточного цистеин-богатого домена. Впервые выявлена "молчащая" мутация G2673A (S891S) в семье с наследственным ПРЩЖ.

Впервые в России охарактеризована частота соматических перестроек RET/PTC и мутаций гена BRAF в выборке спорадических узловых образований ЩЖ и показана специфичность этих нарушений для ПРЩЖ. В двух случаях ПРЩЖ выявлены редкие или не охарактеризованные варианты перестроек RET/PTC, а также обнаружен новый онкоген ARFP/RET в ткани радиационно-индуцированного ПРЩЖ. Помимо стандартной замены Т1796А, впервые при ПРЩЖ описаны две новые соматические мутации гена BRAF: G1753A

Е585К) и делеция del 18001811. Механизм онкогенного действия последней мутации, затрагивающей "активирующий сегмент" киназы B-RAF может представлять теоретический интерес для изучения регуляции ее активности.

Практическая значимость

В результате проведенного исследования разработаны подходы для молекулярной диагностики и характеристики микроструктурной патологии гена RET при наследуемых формах МРЩЖ. Проведена ДНК-диагностика у 72 больных с МРЩЖ из 64 неродственных семей, а также у 30 их здоровых родственников. Практическая значимость работы связна с возможностью досимптоматической диагностики МРЩЖ среди лиц повышенного риска, а также выявления новых семейных случаев МРЩЖ. У 13 человек терминальные мутации RET обнаружены до начала клинической манифестации заболевания, а профилактическое хирургическое лечение проведено четырем из них. У 17 обследованных здоровых родственников носительство мутации было исключено. Наследственный характер заболевания установлен для пациентов со "спорадическим" МРЩЖ из 10 семей.

Положения, выносимые на защиту

3. Соматические перестройки RET/PTC и мутации гена BRAF - специфические молекулярные маркеры ПРЩЖ, которые представляют собой альтернативные механизмы активации RAS-RAF-MEK-ERK МАР-киназного каскада в этиопатогенезе ПРЩЖ.

4. Соматические мутации гена BRAF при ПРЩЖ достоверно чаще встречаются у пациентов старшей возрастной группы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Васильев, Евгений Витальевич

выводы

1. Определена частота и спектр молекулярной патологии протоонкогена RET при обследовании 72 пациентов из 64 неродственных семей с различными клиническими формами МРЩЖ. Идентифицировано 11 различных мутаций RET у 33 больных из 25 семей. Впервые выявлена и охарактеризована терминальная делеция с инсерцией 18951907delins4 в 11 экзоне гена RET. У 13 человек мутации обнаружены до начала клинической манифестации заболевания; у 17 носительство мутаций гена RET исключено.

2. Разработан эффективный метод выявления химерных онкогенов RET/PTC с помощью сравнительного анализа экспрессии внеклеточного и каталитического доменов протоонкогена RET. В 14.1% (12/85) папиллярных тиреокарцином обнаружен дисбаланс экспрессии ТК- и ЕС- доменов, указывающий на наличие перестроек RET/PTC. Среди них - 7 случаев RET/PTC1, 2 - RET/PTC3, 1 - ARFP/RET и 2 неидентифицированных онкогена RET/PTC.

3. Определена частота соматических мутаций гена BRAF в выборке папиллярных карцином ЩЖ. В 60% (55 из 91) образцов ПРЩЖ обнаружена трансверсия Т1796А. Показано достоверное преобладание мутации Т1796А у пациентов старшей возрастной группы. Впервые при ПРЩЖ описаны транзиция G1753А и делеция del 18001811.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Информация о генетических основах наследственных и спорадических форм РЩЖ, накопленная за последние годы благодаря достижениям молекулярной медицины, позволяет успешно применять методы молекулярной биологии в целях своевременной диагностики этих заболеваний. Результаты представленной работы свидетельствуют о том, что использование молекулярных маркеров может иметь практическое значение в клинической онкологии.

Исследование молекулярных нарушений протоонкогена RET позволило выполнить ДНК-диагностику наследственного МРЩЖ у больных из 64 семей. В общей сложности в 25 семьях было выявлено И различных мутаций, одна из которых описана впервые. Практическое значение ДНК-диагностики МРЩЖ связано с возможностью идентификации носителей мутации задолго до начала клинической манифестации заболевания. В настоящей работе в 4 из 13 таких случаев досимптоматическое выявление мутации RET послужило основанием для профилактической тиреоидэктомии.

При изучении соматических маркеров злокачественности были проанализированы частоты перестроек RET/PTC и мутаций гена BRAF в тканях узловых образований ЩЖ. С этой целью нами разработан метод полуколичественной RT-PCR, который позволил определять гиперэкспрессию каталитического домена RET и выявить химерные онкогены RET/PTC в 14% исследованных тканей ПРЩЖ. Среди RET/PTC-положительных опухолей идентифицировано 3 известных перестройки - RET/PTC1, RET/PTC3 и ARFP/RET, а также обнаружено два редких или не охарактеризованных онкогена RET/PTC. В 62% исследованных образцов ПРЩЖ выявлена мажорная мутация протоонкогена BRAF и описаны две новые соматические мутации. В связи с отсутствием случаев перекрывания соматических мутаций BRAF и RET/PTC сделан вывод о том, что эти генетические нарушения являются альтернативными механизмами активации RAS-RAF-MEK-ERK МАР-киназного каскада в тиреоцитах при патогенезе ПРЩЖ. Высокая суммарная частота перестроек RET/PTC и мутаций BRAF (75%), показанная в настоящей работе, и абсолютная специфичность для папиллярных карцином позволят в будущем использовать эти генетические маркеры для дооперационной диагностики ПРЩЖ, используя материал ТАБ. Проведение молекулярно-генетического исследования может быть особенно важным в случаях неоднозначного результата цитологического исследования подозрительных узлов ЩЖ.

Таким образом, на сегодняшний день очевидно, что для решения задачи ранней диагностики новообразований ЩЖ, а также разработки новых критериев оценки течения заболевания и выбора оптимальных лечебных мероприятий, необходимо объединение традиционных клинических, инструментальных и лабораторных алгоритмов диагностики с современными методами молекулярно-генетического тестирования.

Кроме того, достижения науки последних лет в области молекулярной онкологии позволяют надеяться на скорейшую разработку новых фармакологических и генотерапевтических подходов к лечению злокачественных новообразований ЩЖ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Евгений Витальевич, Москва

1. Амосенко Ф.А., Бржезовский В.Ж., Любченко Л.Н., Шабанов М.А., Козлова В.М., Ванушко В.Э., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Калинин В.Н. Анализ мутаций в протоонкогене RET у больных с медуллярным раком щитовидной железы. Генетика 2003; 39(6): 847-854.

2. Демидчик Е.П., Цыб А.Ф., Лушников Е.Ф., Аверкин Ю.И. Рак щитовидной железы у детей (последствия аварии на чернобыльской АЭС). // М.: Медицина, 1996 208 с.

3. Океанов А.Е., Демидчик Е.П., Анкундович М.А. Заболеваемость раком щитовидной железы в Республике Беларусь. Радиация и риск. 1995; 6: 236 239.

4. Adams G.E., Сох R. Radiation carcinogenesis. In: Franks L.M., Teich N.M. (eds.) Cellular and molecular biology of cancer. Third edition. Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 130-150.

5. Alberti L., Carniti C., Miranda C., Roccato E., Pierotti M.A. RET and NTRK1 Proto-oncogenes in human diseases. J. Cell. Physiol. 2003; 195: 168-186.

6. Anders J., Kjar S., Ibanez C.F. Molecular modeling of the extracellular domain of the RET receptor tyrosine kinase reveals multiple cadherin-like domains and calcium-binding site. J. Biol. Chem. 2001; 276: 35808-35817.

7. Asai N., Iwashita Т., Matsuyama M., Takahashi M. Mechanism of activation of the ret proto-oncogene by multiple endocrine neoplasia 2A mutations. Mol. Cell Biol. 1995; 15: 1613-1619.

8. Bachelot A., Lombardo F., Baudin E., Bidart J.M., Schlumberger M. Inheritable forms of medullary thyroid carcinoma. Biochimie 2002; 84: 61-66.

9. Baloh R.H., Enomoto H., Johnson E.M., Milbrandt J.Jr. The GDNF family ligands and receptors— Implications for neural development. Curr. Opin. Neurobiol. 2000; 10:103-110.

10. Bardelli A., Parsons D.W., Silliman N., Ptak J., Szabo S., Saha S., Markowitz S., Willson J.K., Parmigiani G., Kinzler K.W., Vogelstein В., Velculescu V.E. Mutational analysis of the tyrosine kinome in colorectal cancers. Science 2003; 300: 949.

11. Barnier J.V., Papin C., Eychene A., Lecoq O., Calothy G. The mouse B-raf gene encodes multiple protein isoforms with tissue-specific expression. J. Biol. Chem. 1995; 270: 23381-23389.

12. Barr F. Translocations, cancer and the puzzle of specificity. Nat. Genet. 1999; 19: 121-124.

13. Beimfohr С., Klugbauer S., Demidchik E.P., Lengfelder E., Rabes H.M. NTRK1 rearrangement in papillary thyroid carcinomas of children after the Chernobyl reactor accident. Int. J. Cancer 1999; 80: 842-847.

14. Blum H., Beier H., Gross H.J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 1987; 8: 93-99.

15. Bongarzone I., Vigneri P., Mariani L., Collini P., Pilotti S., Pierotti M.A. RET/NTRK1 rearrangements in thyroid gland tumors of the papillary carcinoma family: correlation with clinopathological features. Clin. Cancer Res. 1998; 4: 223-228.

16. Borrello M.G., Mercalli E., Perego C., Degl'Innocenti D., Ghizzoni S., Arighi E., Eroini В., Rizzetti M.G., Pierotti M.A. Differential interaction of Enigma protein with the two RET isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 296: 515-522.

17. Bos J.L. Ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res. 1989; 49: 4682-4689.

18. Brauckhoff M., Gimm O., Hinze R., Ukkat J., Brauckhoff K., Dralle H. Papillary thyroid carcinoma with RET proto-oncogene germline mutation. Thyroid 2002; 12: 557-561.

19. Brose, M.S., Volpe P., Feldman M., Kumar M., Rishi I., Gerrero R., Einhorn E., Herlyn M., Minna J., Nicholson A., Roth S.M., Albelda S.M., Davies H. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer Res. 2002; 62: 6997-7000.

20. Bullow, С., Bullow, S., Group, L.C.P. Is screening for thyroid carcinoma indicated in familial adenomatous polyposis? International Journal of Colorectal Disease 1997; 12: 240-242.

21. Bunone G., Uggeri M., Mondellini P., Pierotti M.A., Bongarzone I. RET receptor expression in thyroid follicular epithelial cell-derived tumors. Cancer Res. 2000; 60: 2845-2849.

22. Busca R. et al. Ras mediates the cAMP-dependent activation of extracellular signal-regulated kinases (ERKs) in melanocytes. EMBOJ. 2000; 19: 2900-2910.

23. Cai D., Shen Y., De Bellard M., Tang S., Filbin M.T. Prior exposure to neurotrophins blocks inhibition of axonal regeneration by MAG and myelin via a cAMP-dependent mechanism. Neuron 1999; 22: 89-101.

24. Cai W-I, Lukes Y., Burch H.B., Djuh Y-Y, Carr F., Wartofsky L., Rhooms P., D'Avis J., Baker J.R. Jr., Burman K.D. Analysis of human TSH receptor gene and RNA transcripts in patients with thyroid disorders. Autoimmunity 1992; 13: 43-50.

25. Canzian F., Amati P., Harach H.R., Kraimps J.L., Lesueur F., Barbier J., Levillain P., Romeo G., Bonneau D. () A gene predisposing to familial thyroid tumors with cell oxyphilia maps to chromosome 19pl3.2. Am. J. Hum. Genet. 1998; 63: 1743-1748.

26. Carlson K.M., Bracamontes J., Jackson C.E., Clark R., Lacroix A., Wells S.A., Goodfellow P.J. Parent-of-origin in multiple endocrine neoplasia type 2B. Am. J. Hum. Genet.\99A\ 55: 1076-1082.

27. Cartegni L., Chew S.L., Krainer A.R. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet. 2002; 3: 285-298.

28. Challeton C., Bounacer A., Du Villard J.A., Caillou В., De Vathaire F., Monier R., Schlumberger M., Suarez H.G. Pattern of ras and gsp oncogene mutations in radiation-associated human thyroid tumors. Oncogene 1995; 11: 601-603.

29. Chong H., Vikis H.G., Guan K-L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cell. Signal. 2003; 15: 463-469.

30. Ciampi R., Knauf J.A., Kerler R., Gandhi M., Zhu Z., Nikiforova M.N., Rabes H.M., Fagin J.A., Nikiforov Y.E. Oncogenic AKAP9-BRAF fusion is a novel mechanism of МАРК pathway activation in thyroid cancer. J. Clin. Invest. 2005; 115: 94-101.

31. Cohen Y., Xing M., Mambo E., Guo Z., Wu G„ Trink В., Beller U., Westra W.H., Ladenson P.W., Sidransky D. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 2003; 95: 625627.

32. Conard R.A., Knudsen K.D., Dobyns B.M. A 20-year review of medical findings in a Marshallese population accidentally exposed to radioactive fallout // BNL 50424. Upton, NY, Brookhaven National Laboratory, 1975, p. 1-154.

33. Conde E., Martin-Lacave I., Utrilla J.C., Moreno A., Gonzales-Campora R., Galera-Davidson H. Mitotic activity of the edocrine cells in rat thyroid glands during postnatal life. Endocrinology 1992; 131:436-440.

34. Corvi R., Berger N., Balczon R., Romeo G. RET/PCM-1: A novel fusion gene in papillary thyroid carcinoma. Oncogene 2000; 19: 4236-4242.

35. Corvi R., Martinez-Alfaro M., Harach H.R., Zini M., Papotti M., Romeo G. Frequent RET rearrangements in thyroid papillary microcarcinoma detected by interphase fluorescence in situ hybridization. Lab. Invest. 2001a; 81: 1639-1645.

36. Corvi R., Lesueur F., Martinez-Alfaro M., Zini M., Decaussin M., Murat A., Romeo G. RET rearrangements in familial papillary thyroid carcinomas. Cancer Lett. 2001b; 170: 191-198.

37. Daley G.Q., McLaughlin J., Witte O.N., Baltimore D. The CML-specific P210 bcr/abl protein, unlike v-abl, does not transform NIH/3T3 fibroblasts. Science 1987; 237: 532-535.

38. DeCourcy J.L., DeCourcy C.B. Phaeochromocytoma and the general practitioner. Barclay Newman, Cincinnati; 1952.

39. Delbridge L., Robinson B. Genetic and biochemical screening for endocrine disease: III. Costs and logistics. World J. Surg. 1998; 22: 1212-1217.

40. Demidchik E., Tronko M. et al. in Radiation and Thyroid Cancer (eds Thomas, G., Karaoglou, A. & Williams, E. D.) P. 51-70. (World Scientific, Singapore, 1999).

41. Di Renzo M.F., Olivero M., Ferro S., Prat M., Bongarzone I., Pilotti S., Belfiore A., Constantino A., Vigneri R., Pierotti M.A., Comoglio P.M. Overexpression of the c-MET/HGF receptor in human thyroid carcinomas. Oncogene 1992, 7: 2549-2554.

42. Dibb N.J., Dilworth S.M., Mol C.D. Switching on kinases: oncogenic activation of BRAF and the PDGFR family. Nat. Rev. Cancer 2004; 4: 718-727.

43. Donghi R., Longoni A., Pilotti S., Michieli P., Delia Porta G., Pierotti M.A. Gene p53 mutations are restricted to poorly differentiated and undifferentiated carcinomas of the thyroid gland. J. Clin. Invest. 1993; 91: 1753-1760.

44. Donis-Keller H., Dou S., Chi D. Carlson K.M., Toshima K., Lairmore T.C., Howe J.R., Moley J.F., Goodfellow P.,Wells S.A. Mutations in the RET proto-oncogene are associated with MEN 2A and FMTC. Hum. Mol. Genet. 1993; 2: 851-856.

45. Du Villard, Wicker R., Crespo P., Filetti S., Gutkind J.S., Sarasin H.G. Role of the cAMP and МАРК pathways in the transformation of mouse 3T3 fibroblasts by a TSHR gene constitutively activated by point mutation. Oncogene 2000; 19: 4896-4905.

46. Duffy B.J., Fitzerald P. Thyroid cancer in childhood and adolescence: a report on twenty-eight cases. Cancer 1950; 10: 1018 1032.

47. Dumont J.E., Maenhaut C., Pirson I., Baptist M., Roger P.P. Growth factors controlling the thyroid gland. Bailliere's Clin. Endocrinol. Metab. 1991; 5: 727-754.

48. Elisei R., Shiohara M., Koeffler H.P., Fagin J.A. Genetic and epigenetic alterations of the cycl independent kinase inhibitors pl5INK4b and pl6INK4a in human thyroid carcinoma cell lines and primary thyroid carcinomas. Cancer 1998; 83: 2185-2193.

49. Eng C. RET proto-oncogene in the development of human cancer. J. Clin. Oncol. 1999; 17: 380393.

50. Esapa С., Foster S., Johnson S., Jameson J.L., Kendall-Taylor P., Harrrris P.E. G protein and thyrotropin receptor mutations in thyroid neoplasia. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997; 82: 493496.

51. Fagin J.A. How thyroid tumors start and why it matters: kinase mutants as targets for solid cancer pharmacotherapy. J. Endocrinol. 2004,183: 249-256.

52. Fagin J.A., Matuso K., Karmakar A., Lin Chew D., Tang S-H, Koeffler H.P. High prevalence of mutations of the p53 gene in poorly differentiated human thyroid carcinoma. J. Clin. Invest. 1993; 91: 179-184.

53. Farid N.R., Shi Y., Zou M. Molecular basis of thyroid cancer. Endocr. Rev. 1994; 15: 202-232.

54. Fitze G., Schierz M., Bredow J., Saeger H.D., Roesner D., Schackert H.K. Various penetrance of familial medullary thyroid carcinoma in patients with RET protooncogene codon 790/791 germline mutations.Ann. Surg. 2002; 236: 570-575.

55. Fuhrer D. A nuclear receptor in thyroid malignancy: is PAX8/PPARy the Holy Grail of follicular thyroid cancer? Eur. J. Endocrinol. 2001; 144: 453-456.

56. Fukuda Т., Kiuchi K., Takahashi M. Novel mechanism of regulation of Rac activity and lamellipodia formation by RET tyrosine kinase. J. Biol. Chem. 2002; 211: 19114-19121.

57. Fukushima Т., Suzuki S., Mashiko M., Ohtake Т., Endo Y., Takebayashi Y., Sekikawa K., Hagiwara K., Takenoshita S. BRAF mutations in papillary carcinomas of the thyroid. Oncogene 2003; 22:6455-6457.

58. Fusco A., Grieco M., Santoro M., Berlingieri M.T., Pilotti S., Pierotti M.A., Delia Porta G., Vecchio G. A new oncogene in human papillary thyroid carcinomas and their lymph-nodal metastases. Nature 1987; 328: 170-172.

59. Gimm O. Thyroid cancer. Cancer Lett. 2001; 163: 143-156.

60. Gire V., Wynford-Thomas D. RAS oncogene activation induces proliferation in normal human thyroid epithelial cells without loss of differentiation. Oncogene 2000; 19: 737-744.

61. Goldgar D.E., Easton D.F., Cannon-Albright L.A., Skolnick M.H. Systematic population-based assessment of cancer risk in first-degree relatives of cancer probands. J. Natl. Cancer Inst. 1994; 86: 1600-1608.

62. Grant B.D., Hemmer W., Tsigelny I., Adams J.A., Taylor S.S. Kinetic analyses of mutations in the glicine-rich loop of cAMP-dependent protein kinase. Biochemistry 1998; 37: 7708-7715.

63. Greco A., Miranda C., Pagliardini S., Fusetti L., Bongarzone I., Pierotti M.A. Chromosome 1 rearrangements involving the genes TPR and NTRK1 produce structurally different thyroid-specific TRK oncogenes. Genes Chrom. Cancer 1997; 19: 112-123.

64. Hall P., Mattsson A., Boice J.D. Thyroid cancer after diagnostic administration of iodine-131. Radiat. Res. 1996; 145:86-92.

65. Hansford J.R., Mulligan L.M. Multiple endocrine neoplasia type 2 and RET: from neoplasia to neurogenesis. J. Med. Genet. 2000; 37: 817-827.

66. Harach H.R., Franssila K.O., Wasenius V.M. Occult papillary carcinoma of the thyroid. A "normal" finding in Finland. A systematic autopsy study. Cancer 1985; 56: 531-538.

67. Heldin C.H., Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol. Rev. 1999; 79: 1283-1316.

68. Herfarth K.K., Bartsch D., Doherty G.M., Wells S.A.Jr., Lairmore T.C. Surgical management of hyperparathyroidism in patients with multiple endocrine neoplasia type 2A. Surgery 1996; 120: 966-973; discussion P. 973-974.

69. Herrmann M.A., Hay I.D., Bartelt D.H., Ritland S.R., Dahl R.L., Grant C.S. Cytogenetic and molecular genetic studies of follicular and papillary thyroid cancers. J. Clin. Invest. 1991; 88: 1596-1604.

70. Hoelting Т., Tezelman S., Siperstein A.E., Duh Q-Y., Clark O.H. Thyrotropin stimulates invasion and growth of follicular thyroid cancer cells via PKC-rather than РКА-activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993; 195: 1230-1236.

71. Hoppner W., Ritter M.M. A duplication of 12 bp in the critical cysteine rich domain of the RET proto-oncogene results in a distinct phenotype of multiple endocrine neoplasia type 2A. Hum. Mol. Genet. 1997; 6: 587-590.

72. Hoppner W., Dralle H., Brabant G. Duplication of 9 base pairs in the critical cysteine-rich domain of the RET proto-oncogene causes multiple endocrine neoplasia type 2A. Hum. Mutat. 1998; Suppl 1: S128-S130.

73. Ichihara M., Murakumo Y., Takahashi M. RET and neuroendicrine tumors. Cancer Lett. 2004; 204: 197-211.

74. Ikawa S., Fukui M., Ueyama Y., Tamaoki N., Yamamoto Т., Toyoshima K. B-raf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangement. Mol. Cell Biol. 1988; 8: 2651-2654.

75. Her M.A., King D.R., Ginn-Pease M.E., O'Dorisio T.M., Sotos J.F. Multiple endocrine neoplasia type 2A: a 25-year review. J. Pediatr. Surg. 1999; 34: 92-96; discussion P. 96-97.

76. Ito Т., Seyama Т., Mizuno Т., Tsuyama N., Hayashi Т., Hayashi Y., Dohi K., Nakamura N., Akiyama N. Unique association of p53 mutations with undifferentiated but not differentiated carcinomas of the thyroid gland. Cancer Res. 1992, 52: 1369-1371.

77. Ito Т., Seyama Т., Iwamoto K.S., Hayashi Т., Mizuno T. Tsuyama N. In vitro irradiation is able to cause RET oncogene rearrangement. Cancer Res. 1993; 53: 2940-2943.

78. Ivan M., Wynford-Thomas D., Jones C.J. Abnormalities of the P16INK4A gene in thyroid cancer cell lines. Eur. J. Cancer 1996; 32A: 2369-2370.

79. Iwamoto Т., Taniguchi M., Asai N., Ohkusu K., Nakashima I., Takahasi M. cDNA cloning of mouse ret proto-oncogene and its sequence similarity to the cadherin superfamily. Oncogene 1993; 8: 1087-1091.

80. Jansen H.W., Lurz R., Bister K., Bonner T.I., Mark G.E., Rapp U.R. Homologous cell-derived oncogenes in avian carcinoma virus MH2 and murine sarcoma virus 3611. Nature 1984; 307: 281284.

81. Jindrichova S., Vcelak J., Vlcek P., Neradilova M., Nemec J., Bendlova B. Screening of six risk exons of the RET proto-oncogene in families with medullary thyroid carcinoma in the Czech Republic J. Endocrinol., Nov 2004; 183: 257 265.

82. Johnson L.N., Lowe E.D., Noble M.E., Owen D.J. The Eleventh Datta Lecture. The structural basis for substrate recognition and control by protein kinases. FEBS Lett. 1990; 430: 1-11.

83. Kacinski B.M. CSF-1 and its receptor in breast carcinomas and neoplasms of the female reproductive tract. Mol. Reprod. Dev. 1997; 46: 71-74.

84. Kawamoto Y., Takeda K., Okuno Y., Yamakawa Y., Ito Y., Taguchi R., Kato M., Suzuki H., Takahashi M., Nakashima I. Identification of RET autophosphorylation sites by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 2004; 279: 14213-14224.

85. Kazakov V.S., Demidchik E.P., Astakhova L.N. Thyroid cancer after Chernobyl. Nature 1992; 359:21.

86. Kemmer K. Corless C.L., Fletcher J.A., McGreevey L., Haley A., Griffith D., Cummings O.W., Wait C., Town A., Heinrich M.C. KIT mutations are common in testicular seminomas. Am. J. Pathol. 2004; 164: 305-313.

87. Klugbauer S., Lengfelder E., Demidchik E.P., Rabes H.M. High prevalence of RET rearrangement in thyroid tumors of children from Belarus after the Chernobyl reactor accident. Oncogene 1995; 11: 2459-2467.

88. Klugbauer S., Demidchik E.P., Lengfelder E., Rabes H.M. Detection of a novel type of RET rearrangement (PTC5) thyroid carcinomas after Chernobyl and analysis of involved RET-fused gene RFG5. Cancer Res. 1998; 58:198-203.

89. Klugbauer S., Rabes H.M. The transcription coactivator HTIF1 and a related protein are fused to the RET receptor tyrosine kinase in childhood papillary thyroid carcinomas. Oncogene 1999; 18: 4388-4393.

90. Klugbauer S., Jauch A., Lengfelder E., Demidchik E., Rabes H.M. A novel type of RET rearrangement (PTC8) in childhood papillary thyroid carcinomas and characterization of the involved gene (RFG8). Cancer Res. 2000; 60: 7028-7032.

91. Kobayashi K., Shaver J., Liang W., Siperstein A.E., Duh Q-Y, Clark O.H. Increased phospholipase С activity in neoplastic thyroid membrane. Thyroid 1993; 3: 25-29.

92. Kroll T.G., Sarraf P., Pecciarini L., Chen C.J., Mueller E., Spiegelman B.M. PAX8-PPARgammal fusion oncogene in human thyroid carcinoma. Science 2000; 289: 1357-1360.

93. La Perle K.M., Jhiang S.M., Capen C.C. Loss of p53 promotes anaplasia and local invasion in ret/PTC 1-induced thyroid carcinomas. Am. J. Pathol. 2000; 157: 671-677.

94. Lackey K., Cory M., Davis R., Frye S.V., Harris P.A., Hunter R.N., Jung D.K., McDonald O.B., McNutt R.W., Peel M.R., Rutkowske R.D., Veal J.M., Wood E.R. The discovery of potent cRafl kinase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000; 10: 223-226.

95. Lang J., Boxer M., MacKie R. Absence of exon 15 BRAF germline mutations in familial melanoma. Hum. Mutat. 2003; 21: 327-330.

96. Laugwitz K-L, Allgeier A, Offermanns S, Spicher K, Van Sande J, Dumont JE, Schultz G. The human thyrotropin receptor a heptahelical receptor capable of stimulating members of all four G protein families. Proc. Natl. Acad. Sc.i USA 1995; 93: 116-120.

97. Leboulleux S., Baudin E., Travagli J.P., Schlumberger M. Medullary thyroid carcinoma. Clin. Endocrinol. (Oxf). 2004; 61: 299-310.

98. Loh K-C. Familial nonmedullary thyroid carcinoma: a meta-review of case series. Thyroid 1997; 7: 107-113.

99. Luckett J.C., Huser M.B., Giagtzoglou N., Brown J.E., Pritchard C.A. Expression of the A-raf proto-oncogene in the normal adult and embryonic mouse. Cell Growth Differ. 2000; 11: 163-171.

100. Machens A., Holzhausen H.J., Thanh P.N., Dralle H. Malignant progression from C-cell hyperplasia to medullary thyroid carcinoma in 167 carriers of RET germline mutations. Surgery 2003; 134:425-431.

101. Malchoff C.D., Malchoff D.M. The genetics of hereditary nonmedullary thyroid carcinoma. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002; 87: 2455-2459.

102. Manie S., Santoro M., Fusco A., Billaud M. The RET receptor: function in development and dysfunction in congenital malformation. Trends in Genetics 2001; 17: 580-589.

103. Marsh D.J., Andrew S.D., Learoyd D.L., Pojer R., Eng C., Robinson B.G. Deletion-insertion mutation encompassing RET codon 634 is associated with medullary thyroid carcinoma. Hum. Mutat. 1998; Suppl. 1: S. 3-4.

104. Martin-Zanca D, Hughes SH, Barbacid M. A human oncogene formed by the fusion of truncated tropomyosin and protein tyrosine kinase sequences. Nature 1986; 319: 743-748.

105. Matsuo S.E., Martins L., Leoni S.G., Hajjar D., Ricarte-Filho J.C.M., Ebina K.N., Kimura E.T. Marcadores biologicos de tumores tiroidianos. Arq. Bras. Endocrinol. Metab. 2004; 48: 114-125.

106. Mclver В., Goellner J.R., Hay I.D. Mixed medullary-papillary thyroid carcinoma in a patient with multiple endocrine neoplasia type 2B (MEN-2B). Thyroid 1996; 6 (Suppl 1): 16.

107. Mehta R.G., Williamson E., Patel M.K., Koeffler H.P. A ligand of peroxoisome proliferator-activated receptor y, retinoids, and prevention of preneoplastic mammary lesions. J. Natl. Cancer Inst. 2000; 92:418-423.

108. Mercer K.E., Pritchard C.A. Raf proteins and cancer: B-Raf is identified as a mutational target. Biochim. Biophys. Acta 2003; 1653: 25-40.

109. Mizuno Т., Iwamoto K.S., Kyoizumi S., Nagamura H., Shinohara Т., Koyama K., Seyama Т., Hamatani K. Preferential induction of RET/PTC 1 rearrangement by X-ray irradiation. Oncogene 2000; 19: 438-443.

110. Mulligan L.M., Kwok J.B., Healey C.S., Elsdon M.J., Eng C., Gardner E., Love D.R., Mole S.E., Moore J.K., Papi L. Germ-line mutations of the RET proto-oncogene in multiple endocrine neoplasia type 2A. Nature 1993; 363: 458-460.

111. Musholt T.J., Musholt P.В., Khaladj N., Schultz D., Scheumann G.F.W., Klempnauer J. Prognostic significance of RET and NTRK1 rearrangements in sporadic papillary thyroid carcinoma. Surgery 2000; 128: 984-993.

112. Myers S.M., Eng С., Ponder B.A.J., Mulligan L.M. Characterization of RET proto-oncogene 3' splicing variants and polyadenylation sites: A novel C-terminus for RET. Oncogene 1995; 11: 2039-2045.

113. Nakamura Т., Ishizaka Y., Nagao M., Ishikawa T. Expression of the ret proto-oncogene product in human normal and neoplastic tissues of neural crest origin. J. Pathol. 1994; 172: 255-260.

114. Nakata Т., Kitamura Y., Shimizu K., Tanaka S., Fujimori M., Yokoyama S., Ito K., Emi M. Fusion of a novel gene, ELKS, to RET due to translocation t(10;12)(qll;pl3) in a papillary thyroid carcinoma. Genes Chrom. Cancer 1999; 25: 97-103.

115. Newton C. R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989; 17: 2503-2516.

116. Nikiforov Y.E., Gnepp D.R. Pathomorphology of thyroid gland lesions associated with radiation exposure: the Chernobyl experience and review of the literature. Adv. Anat. Pathol. 1999; 6: 78-91.

117. Nikiforov Y.E., Nikiforova M.N., Gnepp D.R., Fagin J.A. Prevalence of mutations of ras and p53 in benign and malignant thyroid tumors from children exposed to radiation after the Chernobyl nuclear accident. Oncogene 1996; 13: 687-693.

118. Nikiforova M.N., Stringer J.R., Blough R., Medvedovic M., Fagin J.A., Nikiforov Y.E. Proximity of chromosomal loci that participate in radiation-induced rearrangements in human cells. Science 2000; 290: 138-141.

119. O'Sullivan C.O., Barton C.M., Staddon S.L., Brown C.L., Lemoine N.R. Activating point mutations of the gsp oncogene in human thyroid adenomas. Molecular Carcinogenesis 1991; 4: 345-349.

120. Oliveira A.M., Fletcher J.A. Translocation breakpoints in cancer. Encyclopedia of the human genome 2003; http://www.ehgonline.net

121. Orita M., Suzuki Y., Sekiya T, Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polimerase chain reaction. Genomics 1989; 5: 874-877.

122. Oyama Т., Ichimura E., Sano Т., Kashiwabara K., Fukuda Т., Nakajima T. c-Met expression of thyroid tissue with special reference to papillary carcinoma. Pathol Int. 1998; 48: 763-768.

123. Pachnis V., Mankoo В., Costantini F. Expression of the c-ret proto-oncogene during mouse embryogenesis. Development 1993; 119: 1005-1017.

124. Papin C., Denouel-Galy A., Laugier D., Calothy G., Eychene A. Modulation of kinase activity and oncogenic properties by alternative splicing reveals a novel regulatory mechanism for B-Raf. J. Biol. Chem. 1998; 273: 24939-24947.

125. Perkel V.S., Gail M.H., Lubin J., Pee D.Y., Weinstein R., Shore-Freedman E., Schneider A.B. Radiation-induced thyroid neoplasms: evidence for familial susceptibility factors. J. Clin. Endocrinol Metab. 1988; 66: 1316-1322.

126. Pritchard C.A., Samuels M.L., Bosch E., McMahon M. Conditionally oncogenic forms of the A-Raf and B-Raf protein kinases display different biological and biochemical properties in NIH 3T3 cells. Mol. Cell Biol. 1995; 15: 6430-6442.

127. Qi H., Gervais M.L., Li W., DeCaprio J.A., Challis J.R., Ohh M. Molecular cloning and characterization of the von Hippel-Lindau-like protein. Mol. Cancer Res. 2004; 2: 43-52.

128. Rajagopalan, H., Bardelli A., Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelstein В., Velculescu V.E. Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status. Nature 2002; 418: 934.

129. Rapp U.R., Goldsborough M.D., Mark G.E., Bonner T.I., Groffen J., Reynolds F.H.Jr., Stephenson J.R. Structure and biological activity of v-raf, a unique oncogene transduced by a retrovirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983; 80: 4218-4222.

130. Reilly J.T. Class III receptor tyrosine kinases: role in leukaemogenesis. Br. J. Haematol. 2002; 116: 744-757.

131. Rey J.M., Brouillet J.P., Fonteneau-Allaire J., Boneu A., Bastie D., Maudelonde Т., Pujol P. Novel germline RET mutation segregating with papillary thyroid carcinomas. Genes Chromosom. Cancer 2001;32:390-391.

132. Robertson, S. С., Tynan, J. A., Donoghue, D. J. RTK mutations and human syndromes: when good receptors turn bad. Trends Genet. 2000; 16: 265-271.

133. Ron E., Lubin J.N., Shore R.E. , Mabuchi K., Modan В., Pottern L.M., Schneider A.B., Tucker M.A., Boice J.D.Jr. Thyroid cancer after exposure to external radiation: a pooled analysis of seven studies. Radiat. Res. 1995; 141: 259-277.

134. Rone J.K., Lane A.G., Grinkemeyer M.D. Papillary thyroid carcinoma, parathyroid adenoma, and unexplained hypercalcitoninemia: an unusual presentation of multiple endocrine neoplasia type 2a? Thyroid 1998; 8: 781-785.

135. Roque L., Castedo S., Clode A., Soares J. Deletion of 3p25—>pter in a primary follicular thyroid carcinoma and its metastasis. Genes Chrom. Cancer 1993; 8: 199-203.

136. Ruco L.P., Stoppacciaro A., Ballarini F., Prat M., Scarpino S. Met protein and hepatocyte growth factor (HGF) in papillary carcinoma of the thyroid: evidence for a pathogenetic role in tumourigenesis. J. Pathol. 2001; 194: 4-8.

137. Russo D., Arturi F., Shlumberger M., Caillou В., Monier R., Filetti S., Suarez H.G. Activating mutations of the TSH receptor in differentiated thyroid carcinomas. Oncogene 1995; 11: 19071911.

138. Russo D., Arturi F., Suarez H.G., Shlumberger M., Du Villard J.A., Crocetti V., Filetti S. Thyrotropin receptor gene alterations in thyroid hyperfunctioning adenomas. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996; 81: 1548-1551.

139. Said S., Shlumberger M., Suarez H.G. Oncogenes and anti-oncogenes in human epithelial thyroid tumors. J. Endocrinol. Invest. 1994; 17: 371-379.

140. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

141. Santoro M., Melillo R.M., Carlomagno F., Fusco A., Vecchio G. Molecular mechanisms of RET activation in human cancer. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002; 963:116-121.

142. Sarlis N.J. Expression patterns of cellular growth-controlling genes in non-medullary thyroid cancer: basic aspects. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders 2000; 1: 183-196.

143. Sarraf P., Mueller E., Smith W.M., Wright H.M., Kum J.B., Aaltonen L.A., de la Chapelle A., Spiegelman B.M., Eng C. Loss-of-function mutations in PPAR gamma associated with human colon cancer. Molecular Cell 1999; 3: 799-804.

144. Schimke R.N., Hartmann W.H. Familial amyloid-producing medullary thyroid carcinoma and phaeochromocytoma. A distinct genetic entity. Ann. Intern. Med. 1965; 63: 1027-1039.

145. Schmidt P.H., Dransfield D.T., Claudio J.O., Hawley R.G., Trotter K.W., Milgram S.L., Goldenring J.R. AKAP350, a multiply spliced protein kinase A-anchoring protein associated with centrosomes. J. Biol. Chem. 1999; 274: 3055-3066.

146. Schuchardt A., D'Agati V., Larsson-Blomberg L., Costantini F., Pachnis V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature 1994, 367: 380-383.

147. Segouffin-Cariou C., Billaud M. Transforming ability of MEN 2A-RET requires activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT signaling pathway. J. Biol. Chem. 2000; 275: 3568-3576.

148. Shi Y., Zou M., Farid N.R., al-Sedairy S.T. Evidence of gene deletion of p21 (WAF1/CIP1), a cyclin-dependent protein kinase inhibitor, in thyroid carcinomas. Br. J. Cancer 1996; 74: 13361341.

149. Shi Y., Zou M.J., Schmidt H., Juhasz F„ Stensky V., Robb D., Farid N.R. High rates of ras codon 61 mutation in thyroid tumors in an iodide-deficient area. Cancer Res. 1991; 51: 2690-2693.

150. Simpson N. E., Kidd К. K., Goodfellow P. J., McDermid H., Myers S., Kidd J.R., Jackson C.E., Duncan A.M., Farrer L.A., Brasch K. Assignment of multiple endocrine neoplasia type 2A to chromosome 10 by linkage. Nature 1987;328:528-530.

151. Smith D.P., Houghton C., Ponder B.A.J. Germline mutation of RET codon 883 in two cases of de novo MEN 2B. Oncogene 1997; 15: 1213-1217.

152. Soares P., Trovisco V., Rocha A.S, Lima J.,Castro P., Preto A., Maximo V., Tiago Botelho, Seruca R., Sobrinho-Simoes M. BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene 2003; 22: 4578-4580.

153. Socolow E.L., Hashizume A.,Neriishi S., Niitani R. Thyroid carcinoma in man after exposure to ionizing radiation. A summary of the findings in Hiroshima and Nagasaki. N. Engl. J. Med. 1963; 268:406-410.

154. Steiner A.L., Goodman A.D., Powers S.R. Study of a kindred with phaeochromocytoma, medullary thyroid carcinoma, hyperparathyroidism and Cushing's disease: multiple endocrine neoplasia, type 2. Medicine (Baltimore) 1968; 47: 371-409.

155. Stirewalt D.L., Radich, J.P. The role of FLT3 in haematopoietic malignancies. Nat. Rev. Cancer 2003; 3: 650-665.

156. Stork P.J.S., Schmitt J.M. Crosstalk between cAMF and MAP kinase signaling in the regulation of cell proliferation. Trends in Cell Biology 2002; 12: 258-266.

157. Storm S.M., Brennscheidt U., Sithanandam G., Rapp U.R. raf oncogenes in carcinogenesis. Crit. Rev. Oncol. 1990; 2: 1-8.

158. Studer H., Peter H.J., Gerber H. Natural heterogeneity of thyroid cells: the basis for understanding thyroid function and nodular goiter growth. Endocr. Rev. 1989; 10: 125-135.

159. Suarez H.G., du Villard J.A., Severino M., Caillou В., Schlumberger M., Tubiana M., Parmentier C., Monier R. Presence of mutations in all three ras genes in human thyroid tumors. Oncogene 1990; 5: 565-570.

160. Suarez H.G. 1998. Genetic alterations in human epithelial thyroid tumors. Clin. Endocrinol. 1998; 48:531-546.

161. Takahashi M., Ritz J., Cooper G.M. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell. 1985; 42: 581-588.

162. Tallini G., Asa S.L. RET oncogene activation in papillary thyroid carcinoma. Adv. Anat. Pathol. 2001;8:345-354.

163. Tannapfel A., Sommerer F., Benicke M., Katalinic A., Uhlmann D., Witzigmann H., Hauss J., Wittekind C. 2003. Mutations of the BRAF gene in cholangiocarcinoma but not in hepatocellular carcinoma. Gut 52: 706-712.

164. Tricoli J.V., Gumerlock P.H., Yao J.L., Chi S.G., D'Souza S.A., Nestok B.R., de Vere White R.W. Alterations of the retinoblastoma gene in human prostate adenocarcinoma. Genes Chrom. Cancer 1996;15: 108-114.

165. Trovisco V., Vieira de Castro I., Soares P., Maximo V., Silva P., Magalhaes J., Abrosimov A., Guiu X.M., Sobrinho-Simoes M. BRAF mutations are associated with some histological types of papillary thyroid carcinoma. J. Pathol. 2004; 202: 247-251.

166. Tuttle R.M., Becker D.V. The Chernobyl and its consequences: update at the millennium. Semin. Nucl. Med. 2000; 30:133-140.

167. Van Sande J., Parma J., Tonacchera M., Swillems S., Dumont J., Vassart G. Somatic and germline mutations of the TSH receptor gene in thyroid diseases. J. Clin. Endocrinol. Metab 1995; 80: 2577-2585.

168. Van Weering D.H., Bos J.L. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces Ret-mediated lamellipodia formation. J. Biol. Chem. 1997; 272: 249-254.

169. Vassart G., Dumont J.E. The thyrotropin receptor and the regulation of thyrocyte function and growth. Endocr Rev 1992; 13: 596-611.

170. Viglietto G., Chiappetta G., Martinez-Tello F.J., Fukunaga F.H., Tallini G., Rigopoulou D., Visconti R., Mastro A., Santoro M., Fusco A. RET/PTC oncogene activation is an early event in thyroid carcinogenesis. Oncogene 1995; 11: 1207-1210.

171. Wan P.T., Garnett M.J., Roe S.M., Lee S., Niculescu-Duvaz D., Good V.M., Jones C.M., Marshall C.J., Springer C.J., Barford D., Marais R. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell 2004; 116: 855-867.

172. Weir-Thompson E., Condie A., Leonard R.C., Prosser J. A familial RBI mutation detected by the HOT technique is homozygous in a second primary neoplasm. Oncogene 1991; 6: 2353-2356.

173. Williams D. Cancer after nuclear fallout: lessons from the Chernobyl accident. Nat. Rev. Cancer 2002; 2: 543-549.

174. Williams E.D. A review of 17 cases of carcinoma of the thyroid and phaeochromocytoma. J. Clin. Pathol. 1965; 18: 288-292.

175. Williams E.D. Mechanisms and pathogenesis of thyroid cancer in animals and man. Mutat. Res. 1995;333:123-129.

176. Wynford-Thomas D. Molecular basis of epithelial tumorigenesis: the thyroid model. Crit. Rev. Oncog. 1993; 4: 1-23.

177. Xu X., Quiros R.M., Gattuso P., Ain K.B., Prinz R.A. High prevalence of BRAF gene mutation in papillary thyroid carcinomas and thyroid tumor cell lines. Cancer Res. 2003; 63:4561-4567.

178. Yane K., Konishi N., Kitahori Y., Naito H., Okaichi K., Ohnishi Т., Miyahara H., Matsunaga Т., Hiasa Y. Lack of pl6/CDKN2 alterations in thyroid carcinomas. Cancer Lett. 1996; 101: 85-92.

179. Zou M., Shi Y., Farid N.R. p53 mutations in all stages of thyroid carcinomas. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 77: 1054-1058.

180. Zuo L., Weger J., Yang Q., Goldstein A.M., Tucker M.A., Walker G.J., Hayward N., Dracopoli N.C. Germline mutations in the pl6INK4a binding domain of CDK4 in familial melanoma. Nat. Genet. 1996; 12: 97-99.

181. Zurzolo C., Gentile R., Mascia A., Garbi C., Polistina C., Aloj Awedimento V.E., Nitsch L. The polarized epithelial phenotype is dominant in hybrids between polarized and unpolarized rat thyroid cell lines. J. CellSci. 1991; 98:65-73.

Информация о работе

Васильев, Евгений Витальевич
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изучение молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований щитовидной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований щитовидной железы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы