Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое изучение рака почки в Республике Башкортостан

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение рака почки в Республике Башкортостан"

На правах рукописи

оЛу/"'

КУТЛЫЕВА ЛИЛИЯ РАЗИФОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАКА ПОЧКИ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

03.02.07 - генетика

005062239

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2013

005062239

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук

Научный руководитель: Хуснутдинова Эльза Камилевна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Мустафина Ольга Евгеньевна

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики УНЦ РАН,

зав. лабораторией физиологической генетики

Карпухин Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний

Ведущая организация: Российский национальный исследовательский

медицинский университет имени Н. И. Пирогова Минздрава России

Защита состоится » июня 2013 г. в « it » часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук по адресу:

450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71),

с авторефератом - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ra/dissov.htnil e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан JjVi> ^UQ^"_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

С.М. Бикбулатова

. ОБЩАЯ ХЛРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ,. , ;

Актуальность проблемы. Рак почки (РП) или'почечно-клеточная карцинома (ПКК) представляет собой' Злокачественное новообразование почки, на долю которого приходится;, примерно 3% от всех онкологических заболеваний у взрослых, i РП ^'являете* * седьмой наиболее распространешюй формой рака у женщин и пятой - у мужчин (Jemal et al., 2011). По статистическим данным, заболеваемостьчраком почки неуклонно растет (Sun et al., 2011). Ежегодно в мире регистрируют около Д10 тыс?ч новых случаев рака почки (РП) (GLOBOCAN 2002, http://www.dep.iarc.fr/ülobocan/globocan.htm;3'). в России - более 17 тысяч (Чиссов В.И. и др., 2010), в Республике Башкортостан - 450 случаев (Чиссов В.И. и др., 2012). РаспрострайенностЬ злокачественных опухолей почек в России составляет 7-8 человек ,ца-100 тысяч^.населения в год (Пальцев М.А. и др., 2009). Прирост заболеваемости у 1йу^чйн'в течение 5 лет (2004-2009 гг.) составил 15,2%, уступив новообразованиям • предстательной и щитовидной желез, а также опухолям центральной нервной "системы, тогда как у женщин показатели прироста заболеваемости :были чгвыше • (18,5%) и уступили лишь новообразованиям центральной нервной системы (Давыдов и др., 2011).

На гистологическом уровне выделяют несколько типов ПКК: светлоклеточный, папиллярный, хромофобный, онкоцитарный, рак собирательных протоков. За этими , гистологическими различиями стоят разные молекулярно-генетические 'нарушенйя, ' которые обусловливают возникновение и развитие опухоли, а также позволяют прогнозировать течение заболевания (Курынин и др., 2008; Lujambio et al., 2008). Из всех гистологических типов РП наиболее часто встречается светлоклеточная карцинома (70-85% случаев) (Алексеев и др., 2007; Arjumand > etr al.,-. ;.2012);.'!Согласно современным представлениям, развитие светлоклеточного рака почки (СРП) связано с генетическими и эпигенетическими изменениями в гене-супрессоре опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау ( VHL, von Hippel-Lindau gene), локализованном на коротком плече хромосомы 3 в области Зр25 (Audenet et al., 2011);\а также других гснов-супрсссоров опухолей, расположенных на данной хромосоме (RASSF1, FHIT, SEDT2, PBRM1 и др.) и

инактивируемых в результате мутаций, протяженных аллельных делеций и/или метилирования CpG-островков промоторных областей.

При изучении генетической предрасположенности к спорадическому раку почки рассматриваются гены, участвующие в детерминации процессов детоксикации различных эндогенных и экзогенных токсинов, гены цитокинов, факторов роста, транскрипционных факторов. К настоящему времени в рамках полногеномных исследований (GWAS) выполнены анализы ассоциации рака почки с полиморфными вариантами нескольких сотен тысяч генов, в результате которых выявлены хромосомные области 2р21, llql3.3, 12pl 1.23, 12q24.31 тесно сцепленные с развитием заболевания (Purdue et al., 2011; Hun et al., 2012; Wu et al., 2012).

Сейчас диагностика рака почки основывается на данных анамнеза, результатах ультразвуковой диагностики (УЗИ) и гистологического исследования биопсийного материала. ПКК излечим, когда диагностируется на ранних стадиях заболевания (Battagli et al., 2003). Пациенты с метастатическим раком почки имеют плохой прогноз, их средняя продолжительность жизни составляет 6-12 месяцев и только 10-20% пациентов с ПКК живут в течение 2 лет. Известно, что РП резистентен к химиотерапии; только у 20% пациентов наблюдается частичный ответ и менее чем у 5% - полный ответ на иммунотерапию (Campbell et al., 2003).

В настоящее время не существует надежных тестов для формирования групп риска развития рака почки, раннего выявления заболевания, а также прогноза его развития, поэтому, принимая во внимание тот факт, что некоторые молекулярно-генетические нарушения возникают еще до манифестации клинических признаков заболевания, актуальным является идентификация диагностических и прогностических маркеров, позволяющих с высокой точностью предсказывать вероятность развития заболевания и разрабатывать тактику лечения с учетом индивидуальных особенностей каждого больного. Кроме того, понимание причин возникновения онкологических заболеваний и поиск методов их лечения будет способствовать формированию фундаментальных представлений о патогенезе данной группы заболеваний, позволит выявить генетические и эпигенетические факторы риска развития рака почки и разработать новые методы их терапии.

На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования - изучение генетических факторов риска развития рака почки.

Задачи исследования:

1. Провести поиск мутаций в гене фон Хиппеля-Линдау (УНЬ) в образцах ДНК из первичных опухолей почки и нормальной почечной паренхимы у больных светлоклеточным раком почки.

2. Оценить частоту потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (УНЬ), Лав-ассоциированного белка семейства 1 (11А85Р1), ломкой гистидиновой триады (7*7/77) в первичных опухолях почки и провести анализ корреляции обнаруженных аллельных делеций с клинико-патологическими параметрами опухолей почки.

3. Определить частоту метилирования Срв-островков промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (УНЬ) и ингибитора циклин-зависимой киназы 2А (СОКЫ2А) и провести анализ корреляции метилированных генов с клинико-патологическими параметрами рака почки.

4. Провести исследование полиморфных локусов генов систем клеточной детоксикации и антиоксидантной защиты (С18ТМ1,С7Р1А1,РОЫ1), цитокинов (ПА, К16), фактора роста (УЕйР) и рецептора витамина О (КОЙ) у пациентов с раком почки и в контрольной группе здоровых индивидов.

5. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов с предрасположенностью к раку почки.

6. Провести анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию рака почки.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование рака почки в Республике Башкортостан. Определен спектр и частота мутаций в гене УНЬ у больных РП из РБ. Впервые в ДНК, выделенной из опухолевой ткани почки, обнаружены 11 мутаций в гене УНЬ, не зарегистрированных в базе данных и не описанных ранее в литературе. При изучении полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков

CYP1A1, гена параоксоназы PONI и гена рецептора витамина D (VDR') выявлены генотипы/аллели, ассоциированные с риском развития ПКК. Определены оптимальные модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена рецептора витамина D, предрасполагающих к развитию РП у индивидов русской и татарской этнической принадлежности.

Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе результаты исследования расширяют имеющиеся знания о механизмах развития РП, вносят вклад в формирование представлений о генетических и эпигенетических основах данного заболевания. Полученные данные могут внести вклад в разработку новых направлений и эффективных методов лечения и ранней диагностики РП. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по медицинской генетике на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях европейского общества генетиков человека «European Human Genetics Conference» (Амстердам, 2011; Нюрнберг, 2012), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы онкогенегики» (Москва, 2011), V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт — основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012), XVI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2012), VII региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012), II и III Всероссийской школе-семинаре «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012), а также на конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний» (Стерлитамак, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 - статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 198 работ. Диссертация содержит 19 таблиц и 16 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал для исследования

В работе использованы образцы ДНК больных раком почки, находящихся на стационарном лечении в Республиканской клинической больнице им. Куватова и клинике БГМУ. Забор образцов проводился сотрудниками кафедры урологии с курсом ИПО ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» в соответствии с этическими стандартами биоэтического комитета, разработанными согласно Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека». У всех обследуемых лиц образцы тканей почки и крови были получены с их информированного согласия. Диагноз был поставлен на основании данных клинического и гистологического обследования.

Исследование было проведено на двух выборках больных РП. Первая выборка больных была представлена 110 парными образцами ДНК, выделенными из опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы, вторая содержала 190 образцов ДНК, выделенных из периферической крови пациентов с РП. Возраст больных на момент постановки диагноза варьировал от 36 до 80 лет. Наибольшее число больных находилось в возрасте 51-60 лет, что согласуется с литературными данными. Средний возраст выявления ПКК составил 55±3 года. Среди больных РП было 46% женщин и 54% мужчин.

В первой группе больных 105 пациентов имели светлоклеточный рак почки (СРП), 2 - папиллярный и 3 - смешанный. Во вторую группу пациентов, ДНК которых была доступна только из периферической крови, входили 176 больных со СРП, 7 - с папиллярным и 7 - со смешанным. Все случаи РП классифицированы по ТЫМ-классификации согласно требованиям Международного противоракового союза. В первой выборке 68 пациентов (62%) имели начальные стадии

заболевания (I-II стадии злокачественного процесса по TNM-классификации) и 42 пациента (38%) - поздние (III-IV) стадии заболевания.

По этнической принадлежности пациенты, ДНК которых была выделена из тканей, распределились следующим образом: 45% (50 пациентов из 110) русских, 32% (35/110) татар, 12% (13/110) башкир и 11% (12/110) пациентов происходили из межэтнических браков. Этнический состав второй группы пациентов был следующим: 41% (78/190) русских, 34% (65/190) татар, 13% (25/190) башкир и 12% (22/190) пациентов происходили из межэтнических браков.

Контрольная группа была сформирована из 282 практически здоровых неродственных жителей РБ, не имеющих злокачественных новообразований, которые по возрасту, полу и этнической принадлежности (русские — 98 человек, татары — 103 человек, башкиры - 61 человек) соответствовали группе больных.

Методы исследования

ДНК из образцов опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы, а также из периферической крови была выделена методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew et al., 1984). Исследование образцов ДНК на наличие мутаций в гене VHL проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP -анализа) (Orita et al., 1989). Результаты SSCP-анализа оценивали в 10%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием азотнокислым серебром. Определение нуклеотидных последовательностей образцов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems).

Анализ потери гетерозиготности для генов-супрессоров опухолевого роста, локализованных на коротком плече хромосомы 3, проводили с использованием двух микросателлитных маркеров (STR-маркеров): для гена VIIL - D3S1038 и D3S1317, гена RASSF1 - D3S966 и D3S1568, гена FHIT - D3S1234 и D3S1300. Продукты амплификации STR-маркеров разделяли в 8% полиакриламидном геле.

Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей исследуемых генов применяли метод метил-чувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). ДНК из опухолевой ткани и нормальной почечной паренхимы гидролизовали метил-чувствительными рестриктазами Hpall или Hhal, затем

гидролизованную ДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе исследования использовали разаботанные ранее многолокусные ПЦР (Михайленко и др., 2012). Анализ полиморфных вариантов генов IL4, IL16, CYP1A1, VDR, VEGF, PONI, GSTM1 осуществляли методом ПЦР и ПДРФ-анализом с последующим электрофорезом в 7-8% полиакриламидном геле.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения MS Office Excel 2003 (Microsoft). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий %2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982). Анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ выполняли с помощью программы Haploview4.2 (Barrett, 2005). Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007; Chenet al., 2011).

Для выявления ассоциации полиморфных локусов и гаплотипов сцепленных локусов в различных моделях (аддитивной, доминантной, рецессивной, модели сверхдоминирования) с учетом количественных и бинарных признаков (пол, возраст, возраст манифестации заболевания, этническая принадлежность, статус курения) применяли программу SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/). Для выбора лучшей модели использовали информационный критерий Акайке (AIC). Для каждого локуса из статистически значимых выбирались модели с наименьшим значением AIC.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск изменений иуклеотидной последовательности в гене фон Хиппеля-Линдау

В 105 парных образцах ДНК, выделенных из опухолевой и нормальной почечной паренхимы пациентов со СРП проведен поиск мутаций в трех экзонах

гена фон Хиппеля-Линдау (УНЬ). Мутации в гене VIII обнаружены в 23 образцах ДНК первичных опухолей почки, что составляет 21,9% случаев. Все выявленные мутации были соматическими, присутствовали только в опухолевой ткани почки и не обнаруживались в нормальной почечной паренхиме и периферической крови пациентов.

Результаты проведенного исследования, а также клиническая характеристика больных позволили исключить наследственный синдром фон Хиппеля-Линдау у пациентов со СРП и все случаи были отнесены к спорадическим формам РП. Характеристика выявленных мутаций приведена в таблице 1. У 23 больных обнаружено 22 мутации (рис. 1), среди которых 8 однонуклеотидных замен (35%), выявленных в гетерозиготном состоянии, 13 делеций (60%) и 1 инсерция (5%).

однонуклеотидная замена с.343С>Т (р.Н115У); Б - инсерция с.394_395тзСАСТО (р.(3132Р£з*29); В - делеция с.227_229ёе1ТСТ (р.Р76_Р76ёе1)

Впервые идентифицированы одиннадцать соматических мутаций, не описанных

в литературе ранее: с.185_195ёе1 (р.У62СГ8*66), с.216_228с!е1 (р.872РГз*83),

с.276_306<1е1 (р.С93Ыз*56) с.402_407с1е1 (р.Е 134 Р1 36с1сПпйЫ), с.394_395тзСАСТС

(р.(3132Р£8*29), с.492с1е1С (р.У165Ь£з*5), с.555_557с1е1СОА (р.У185*), c.546_559del

(р.1Л840Гз*67), с.530ёеЮ (р.К.177Ш*25), с.498_504с!е1 (р.У166УГз*1),

с.499 505с1с1. (р.Ш67(ЗГ5*3). Общая частота впервые выявленных мутаций у

пациентов со СРП составила 50% (11/22 случаев).

Таблица 1

Соматические мутации, выявленные в гене фон Хиппеля-Линдау (УНЬ) у больных

со светлоклеточным раком почки из Республики Башкортостан

Экзоны № Изменение нуклеотидной Изменение в структуре

гена VHL п/п последовательности белка

1 C.1830G Р.Р61Р

1 2 с.185 195del p.V62Gfs*66

3 С.1940Т p.S65L

4 с.216 228del p.S72Ffs*83

5 с.227 229delTCT p.F76_F76del

6 c.263G>A p.W88*

7 c.276 306dcl p.G93Lfs*56

8 C.3430T P.H115Y

9 c.349T>C p.Wl 17R

2 10 c.394 395insCACTG p.Q132Pfs*29

11 c.402 407del p.E134_F136deIinsN

12 c.461 C>T (2 случая) p.P154L

13 c.469delA p.T157Lfs*2

14 c.473T>A p.L158Q

15 c.492delG p.V165Lfs*5

3 16 c.498 504del p.V166Vfs*l

17 c.499 505del p.R167Qfs*3

18 c.530delG p.R177Nfs*25

19 c.533T>A P.L178Q

20 c.542 545delTCAG p.V181Gfs*20

21 c.546 559del p.L184Gfs*67

22 c.555 5S7delCGA P.Y185*

Примечание: все обнаруженные мутации были сопоставлены с базами данных The Universal Mutation Database (http://www.umd.be) и Human Gene Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.html). Мутации, обнаруженные впервые, выделены жирным шрифтом

Большинство выявленных мутаций в гене VHL представляли собой делеции со сдвигом рамки считывания. В отличие от однонуклеотидных замен, которые незначительно затрагивают HIF-связанный участок, делеции приводящие к полному нарушению регуляции HIF, вызывают тяжелое течение заболевания (Schraml Р. et al., 2002; Kim J.H. et al., 2005).

Мутация в 1 экзоне гена VHL c.227_229del (p.F76_F76del) приводит к делеции фенилаланина в 76 положении белка, который играет важную роль в сохранении структуры р-домена белка VHL. Радикальная дестабилизация первого домена pVHL и нарушение его взаимодействия с HIF-la, возможно, также связано с мутациями c.l85_195del (p.V62Gfs*66), c.216_228del (p.S72Ffs*83), c.276_306del

(p.G93Lfs*56), c.394_395insCACTG (p.Q132Pfs*29) и c.402_407del (p.E134_F136delinsN), выявленными в данном исследовании впервые.

Ранее неописанная делеция 7 нуклеотидов (c.498_504del) в 3 экзоне гена VHL приводит к сдвигу рамки считывания, образованию стоп кодона (p.V166Vfs*l) и синтезу неполноценного белка. Данная мутация происходит в линкерном регионе гена между а и Р-доменами и изменяет активность взаимодействия супрессора опухолевого роста с элонгином С (Leonardi Е. et al., 2011). Причинами неправильного взаимодействия белка VHL с элонгином С также могут служить делеции c.469delA (p.T157Lfs*2), c.492delG (p.V165Lfs*5), c.530delG (p.R177Nfs*25), с.542_545delTCAG (p.V181Gfs*20), c.546_559del (p.L184Gfs*67), приводящие к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодонов в белке pVHL.

Мутации, выявленные нами впервые, приводили к возникновению достаточно больших делегированных участков от 1 до 31 п.о., наиболее протяженной делецией оказалась мутация c.276_306del (p.G93Lfs*56) в 1 экзоне гена VIIL.

В данном исследовании мы не выявили ни одной мутации в кодонах 1-60, по всей видимости, мутации в данном регионе белка встречаются нечасто. На сегодняшний день описано всего около 60 мутаций, повреждающих кодоны 1-54 (Schraml P. et al., 2002).

Согласно литературным данным, соматические мутации в гене VHL у больных со спорадическим СРП варьируют в пределах 18-82% случаев (Nyhan et al., 2008; Gossage et al., 2010; Audenet et al., 2011). Возможно, что низкая частота мутаций в гене VHL у наших пациентов связана с тем, что у некоторых больных имеет место VHL-независимый путь развития спорадического СРП. Кроме того, различия в частотах мутаций в гене VHL, согласно данным разных исследователей, могут быть связаны с этноспецифичностью исследуемых больных, гистопатологией опухоли, соотношением опухолевой и нормальной ДНК в анализируемых образцах или использованием различных методов исследования (Young et al., 2009; Gossage et al., 2010).

Анализ аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста УНЬ, ЯАББР!, РН1Т, расположенных на коротком плече хромосомы 3

Нами проведен анализ аллельных делеций областей локализации генов УНЬ — Ш51/ 038 и 0351317, Л/ЮТ/ - 035966 и 0351568, РН1Т-03Б1234 и 0351300 в 110 парных образцах ДНК, выделенных из опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы с помощью ЗТЯ-маркеров (рис. 2). Информативность используемых микросателлитных локусов составила для 0351038 - 76,4% (84/110), 0351317 - 54,5% (60/110), 0351568 - 58,2% (64/110), 035966 - 63,6% (70/110), 0351234 ~ 82,7% (91/110), 0351300 - 68,2% (75/110).

DSS1317 <163Ьр)Ц

D332033 C'l27bp) D3S1317 D3S103S

I___D3S1563 <"2ье>

к

^______ M^fihol

LOH

Т N

(110Ьр) Я

D55123-*

10183319 10195354

VHL

D3S96 6 50367217 50378367

RASSF1

59735030

Рисунок 2. Примеры анализа потери гетерозиготности в локусах D3S1038, D3S1317, D3S1568, D3S966, D3S1234, D3S1300 у пациентов с раком почки. N-ДНК, выделенная из нормальной почечной паренхимы; Т- ДНК, выделенная из опухолевой ткани почки; LOH (loss of heterozygosity) - потеря гетерозиготности.

Аллельные делеции области локализации гена VHL по локусу D3S1038 обнаружены в 25% (22/84), по локусу D3S1317 - в 28,3% (17/60) информативных случаев ПКК, что сопоставимо с результатами многих работ (Yoshida et al., 2002; Chen et al., 2009; Singh et al., 2011). Общая информативность по двум вариабельным локусам для гена VHL составила 89,2% (98/110). Частота аллельных потерь по двум исследованным локусам для гена VHL в данной выборке составила 32,7% (32/98) случаев информативных образцов, что согласуется с данными как

отечественных (Михайленко и др., 2012), так и некоторых зарубежных авторов (Martinez et al., 2000).

Потеря гетрозиготности области локализации гена RASSF1 по локусу D3S966 обнаружена у 17 пациентов с ПКК, что составляет 24,3% (17/70) случаев, а по локусу D3S1568 - у 19 пациентов с ПКК, что составляет 30% (19/64) информативных случаев. Для гена FHIT ПГ выявлена в 25,3% (23/91) информативных случаев по локусу D3S1234 и в 14,7% (11/75) по локусу D3S1300.

В целом для генов RASSF1 и FHIT аллельные делеции обнаружены в 32,1% (26/81) и 29,9% (26/87) случаев информативных образцов ПКК, соответственно. При сравнении изученных генов-сулрессоров опухолевого роста, локализованных на коротком плече хромосомы 3 обнаружено, наиболее часто ПГ наблюдается в области локализации гена VHL, что доказывает его значимую роль в развитии СРП. Кроме того, возможно, что более высокая частота делеций в гене VHL связана с более близким его расположением к теломерному концу хромосомы по сравнению с генами FHIT и RASSF1, локализованными ближе к центромерным участкам короткого плеча хромосомы 3. Делеции хотя бы одного гена на коротком плече хромосомы 3 наблюдали в 49,1% (54/110) информативных случаев ПКК.

Анализ метилирования CpG-островков промоторных областей генов VHL и CDKN2A

В связи с тем, что изменение степени метилирования ДНК может вносить вклад в развитие и прогрессирование рака, а характер метилирования генов служит одним из диагностических маркеров онкологических заболеваний, нами проведен анализ статуса метилирования CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста VHL и CDKN2A, вовлеченных в патогенез ПКК (рис. 3), в 110 образцах ДНК, выделенных из опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы, а также периферической крови пациентов с РП. Метилирование CpG-островков промоторной области гена VHL выявлено в 4 из 105 образцов со светлоклеточным раком почки, что составляет 3,8% случаев. Метилирование CpG-островков промоторной области гена VHL обнаружено только в первичной опухолевой ткани почки и не выявлено в периферической крови и нормальной

почечной паренхиме. Наши данные о низкой частоте метилирования промоторного региона гена VHL в опухолевой ткани согласуются с результатами ряда работ (Clifford et al„ 1998; Nickerson et al., 2008).

1N IT 2W 2T meih Pucl

MSDI

Б

Рисунок 3. Анализ метилирования Срв-островков промоторных областей А - гена УНЬ; Ш, 214, ЗN - отсутствие метилирования; 1Т, 2Т, ЗТ - метилирование промоторной области гена УНЬ, Рис/Мэр! - маркер молекулярного веса.

Б - гена СВКИ2А; 1Ы, 2К - отсутствие метилирования; 1Т, 2Т - метилирование промоторной области гена СЖЫ2Л, теЛ - положительный контроль (негидролизованная ДНК), Рис/Мэр! - маркер молекулярного веса.

Метилирование Срв-островков промоторной области гена СОКК!2А обнаружено в 23 из 110 опухолевых образцов ПКК (20,9%).

Ген СОЮЯ2А относится к семейству генов-супрессоров опухолевого роста, кодирует белок р16ШК4А, который является основным членом семейства ингибиторов циклинзависимых киназ 1пк4, участвующих в негативной регуляции сигнального пути и отвечающего за реализацию программы клеточного цикла. Известно, что при РП частота метилирования промоторного региона гена СОКЫ2А варьирует в пределах 14-80% случаев (Запг-Саэк е1 а1., 2003; Опау ел а1., 2009). Все случаи метилирования СрО-островков промоторного региона гена СБКЫ2А были обнаружены у пациентов с начальной стадией заболевания. Возможно, что данный механизм способствует более медленному прогрессированию заболевания у этих пациентов, предотвращая развитие опухоли в сторону метастазирования.

Таким образом, не только генетические изменения, но и эпигенетические нарушения могут быть причиной инактивации генов-супрессоров опухолевого роста при ПКК.

Анализ инактивации гена УНЬ

Согласно теории двухударной модели канцерогенеза для перехода нормальной клетки в опухолевую необходимо два мутационных события. Исходя из этого, с целью выявления случаев биаллельной инктивации гена УНЬ нами проведен анализ одновременного наличия мутаций, аллельных делеций и/или метилирования промоторной области гена УНЬ у пациентов с РП.

Биаллельная инактивации гена УНЬ выявлена у 7 пациентов, что составило 30,4% (7/23) случаев. У одного пациента с мутацией р.Р154Ь в гене УНЬ обнаружены аллельные делеции в обоих микросателлитных локусах (рЗБЮЗв и 0351317) гена УНЬ, тогда как у другого пациента с мутацией р.565Ь выявлено метилирование СрО-островков промоторной области данного гена. У четырех пациентов мутации в гене УНЬ сочетались с ПГ по одному из изученных БТЯ-маркеров (0381038 и 0351317). Наличие метилирования промоторной области гена УНЬ и аллельной делеции этого же гена обнаружено лишь у одного пациента с ПКК. Все больные с биаллельной инактивацией гена УНЬ имели начальную стадию злокачественного процесса, у них отсутствовали регионарные и отдаленные метастазы.

Существуют предположения, что потеря гетерозиготности и мутации в гене УНЬ у пациентов с РП коррелируют с более благоприятным прогнозом заболевания по сравнению с теми пациентами, у которых ген УНЬ не инактивирован (Оо55а§е е1 а1., 2010). Мы провели корреляционный анализ клинико-патологических параметров опухолей, а также анализ выживаемости пациентов в зависимости от наличия или отсутствия мутаций в гене УНЬ, потери гетерозиготности или биаллельной инактивации (мутация в гене УНЬ в сочетании с потерей гетерозиготности и/или метилирования промоторной области гена УНЬ), но каких-либо статистически значимых ассоциаций выявлено не было (р>0,05).

Поиск аллельных вариантов генов-кандидатов, предрасполагающих к развитию рака почки

Нами изучено 13 полиморфных вариантов в 7 генах, которые могут формировать предрасположенность к развитию рака почки у больных и здоровых индивидов. В результате исследования статистически значимые ассоциации были

выявлены для полиморфных вариантов rs662 (с.530Т>С, p.Q192R) и rs854560 (с.163Т>А, p.L55M) гена PONI, rsl048943 (c,1384A>G, p.Ile462Val) гена CYP1A1, rs2228570 (c.2T>C. Fokl) и rs731236 (c,1056T>G, TagI) гена VDR. Анализ гомозиготной делеции 10 т.п.н. в гене GSTM1, полиморфных вариантов rs7975232 (g.48238837C>A, Apal) и rsl544410 (c.!024+283G>A, Bsml) гена VDR, rs2010936 и rs3025039 гена VEGF, rs2243250 гена IL4, Ы778889 гена IL16 не выявил каких-либо статистически значимых результатов между пациентами с РП и контролем (р>0,05).

Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена рецептора витамина D

Проведен анализ четырех полиморфных вариантов гя2228570 (с.2Т>С, Рок1), 1-57975232 ('¿.482388370А, Ара1), та731236 (с.1056Т>С, Таё1), п!544410 (с.1024+283С>А, В.$т1) гена VDR с риском развития РП у больных и здоровых индивидов. В результате анализа обнаружено, что генотип Рок1*Т/Т является маркером пониженного риска развития РП у населения РБ (%2=5,36; р=0,02; (Ж=0,61 (С195% 0,39-0,93), рис. 4).

Рисунок 4. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов гз2228570 (с.2Т>С, Рок!) и гз731236 (с.1056Т>С, Та%1) гена VDR у больных раком почки и в контрольной группе

При исследовании полиморфного варианта гя731236 (Тас/1, с.1056С>Т), расположенного в экзоне 9 гена VDR, обнаружено, что частота генотипа Тац!*С/С в группе здоровых индивидов составляет 5,13%, в то время как в группе больных РП данный генотип встречается в 2 раза чаще (11,76%). Это свидетельствует о том, что генотип Taql*G/G полиморфного локуса Тац1 гена VDR является

(VDR) с риском развития рака почки

S0% 4S\

ÍS% Vfh 25% 20% 15К 10 V. S%

больные ■контроль

маркером повышенного риска развития ПКК (х2=4,65; р=0,03; OR=2,47 (С195% 1,07-5,77), рис. 4). Анализ сцепления полиморфных вариантов rs1544410 (BsmI), rs7975232 (Apal). rs731236 (TagI), rs2228570 (Fokl) гена VDR обнаружил, что самое сильное неравновесие по сцеплению наблюдается для полиморфных локусов BsmI и TagI (D'=70%). Полиморфный вариант rs2228570 (Fokl) гена VDR оказался несцепленным с другими исследуемыми локусами (D'<30%). Учитывая обнаруженные закономерности, мы провели гаплотипический анализ трех полиморфных вариантов TagI, Apal u BsmI (rs731236, rs7975232 и vsl544410) гена VDR с использованием программы Haploview4.2. В результате анализа нами выявлены восемь гаплотипов, три из которых встречались с высокой частотой — это гаплотипы GCA (37%), GAA (24%) и TAG (21%) полиморфных вариантов TagI, Apal, BsmI (rs731236, rs7975232 и rsl544410) гена VDR. У всех больных ПКК наиболее частым был гаплотип ТСА (38%), а наиболее редким - гаплотип GCG (1%) полиморфных вариантов TagI. Apal, BsmI гена VDR. Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов между контрольной группой и группой больных РП показал, что гаплотип TAG полиморфных вариантов TagI, Apal, BsmI гена VDR является маркером повышенного риска развития ПКК (р=0,003, OR=l,74), тогда как гаплотипы ТАА (р=0,013, OR=0,39) и GCG (р=1,9606е5, OR=0,15) являются генетическими маркерами пониженного риска развития заболевания.

Таким образом, анализ полиморфных вариантов гена рецептора витамина D показал значимость исследованного гена в развитии заболевания.

Анализ ассоциаций полиморфных вариантов rs662 (с.530Т>С,p.Q192R) и rs854560 (с.163Т>А, P.L55M) гена параоксоназы-1 (PONI) с риском развития

рака почки

При анализе полиморфного варианта rs662 (с.530Т>С, p.Q192R) гена PONI у пациентов с РП и в контроле обнаружено, что аллель rs662*T и генотип rs662 Т/Т полиморфного локуса rs662 гена PONI являются маркерами повышенного риска развития РП как в целом (OR=l,49; С195% 1,07-2,08 и OR=3,23; С195% 1,40-7,65, соответственно, рис. 5), так и для женщин (OR=6,22; С195% 1,83-23,24 и OR=2,23; С195% 1,34-3,73, соответственно). Анализ у мужчин не выявил статистически значимых результатов (р>0,05).

OR=1,49 m OR-3,23

" | 1 » H |

И1 H Tí

больные Я88И ¡ЦЦ| оольные

400/ ¡ ^Йи ,4 «контроль 30% щ|1 ДН ■ контроль

- ■ ■ I I ъ

0% ВВР 9V NV

04

rs662*c rs662*T rs662'C/C rs662*C/T rs662'T/T

Рисунок 5. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs662 гена PONI у больных ГЖК и в контрольной группе

Аналогичный сравнительный анализ по полиморфному варианту rs854560 (p.L55M) гена PONI позволил выявить статистически значимые результаты между больными РП женского пола и контролем. Частота аллеля rs854560*T у женщин с РП составляла 22,22%, в контрольной группе женщин данный показатель был выше (37,06%). Следовательно, аллель rs854560*T играет протективную роль в отношении развития РП у женщин (х2=7,44; р=0,007, OR=0,49 (С195% 0,29-0,82)).

Анализ сцепления и гаплотипический анализ полиморфных вариантов rs662 и rs854560 гена PONI обнаружил, что гаплотип rs662*T/rs854560*A полиморфных вариантов rs662 и rs854560 гена PONI является маркером повышенного риска развития рака почки (OR=l,46 (С195% 1,05-2,08)).

Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к раку почки

В основе генетической предрасположенности к многофакторной патологии лежат сложные взаимодействия различных генетических факторов, которые необходимо учитывать при прогнозировании риска развития заболевания. Нами проведена оценка роли межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов генов в определении риска развития РП.

При анализе больных РП русской этнической принадлежности и контроля оптимальной моделью межгенного взаимодействия, предрасполагающей к развитию РП у русских, оказалась комбинация из ДНК-локусов двух генов -интерлейкина 4 и интерлейкина 16 (rs2243250 (!L4)-rs4778889 (IL16)). Однако, вклад данных полиморфных вариантов оказался незначительным: для rs2243250

гена 1Ь4 показатель энтропии составил 0,02%, а для локуса гх4778889 гена 1Ы6 -0,30%. В данной модели полиморфные варианты генов и 1Ы6 действуют синергично. Сбалансированная точность модели составила 68,41%, чувствительность — 60,25%, специфичность — 76,57%, повторяемость - 10/10, 011=5,00 (С195% 1,68-14,89). Выявлены статистически значимые сочетания генотипов полиморфных вариантов, входящих в состав модели. Сочетание генотипов гх4778889*Т/Т гена 1Ь16 и гз2243250*Т/С гена 1Ь4 являлось маркером пониженного риска развития ПКК у русских (р=0,05; (Ж=0,47 (С195% 0,22-1,01)), тогда как сочетание генотипов гя4778889*Т/С гена 1Ы6 и гя2243250*Т/С гена 1Ь4 оказалось маркером повышенного риска развития РП в данной этнической группе (р=0,01; (Ж=4,5 (С195% 1,33-16,78)).

Анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию РП у татар выявил статистически значимую модель межгенного взаимодействия трех полиморфных вариантов генов НА и УВК (гя73123б (УОК)-гя2243250 (1Ь4)-гя2228570 (КШ?)). Установлено, что наибольший вклад в развитие ПКК у татар вносит полиморфный вариант гя731236 гена УОК, показатель энтропии которого составил 2,97%. Для полиморфных вариантов гя2243250 гена 1Ь4 и п2228570 гена УБЯ показатели энтропии были чуть ниже (2,80% и 1,81%, соответственно). Все три полиморфных локуса, входящих в состав модели, действуют синергично. Сбалансированная точность модели составила 80,48%, показатели чувствительности и специфичности - 87,71% и 73,24%, соответственно, повторяемость — 10/10. В данной модели статистически значимых сочетаний генотипов не обнаружено (р>0,05).

В связи с небольшой выборкой больных РП и контрольной группы башкирской этнической принадлежности статистически значимых моделей межгенного взаимодействия для данной этнической группы не выявлено.

Таким образом, проведенный анализ межгенных взаимодействий позволил установить взаимосвязь между полиморфными вариантами изученных генов с риском развития рака почки в группе русских и татар. Наличие множества взаимосвязей между различными генами оказывает совокупное действие на

развитие рака почки, что свидетельствует о необходимости их учета при прогнозировании заболевания.

ВЫВОДЫ

1. В опухолевой ткани больных раком почки обнаружены аллельные делеции на коротком плече хромосомы 3 в областях локализации генов-супрессоров опухолевого роста: 32,7% - делеции гена Хиппеля-Линдау (VHL), 32,1% - гена Ras-ассоциированного белка семейства 1 (RASSF1), 29,9% - гена ломкой гистидиновой триады (FHIT). Аллельные делеции различной протяженности обнаружены в 49,1% первичных опухолей почки.

2. В гене фон Хиппеля-Линдау (VHL) выявлено 22 мутации в опухолевой ткани почки у 21,9% пациентов со светлоклеточным раком почки, 11 из которых идентифицированы впервые. Биаллельная инактивация гена фон Хиппеля-Линдау (VHL) выявлена в 30,4% случаев светлоклеточного рака почки.

3. Метилирование CpG-островков промоторной области гена фон Хиппеля-Линдау (VHL) выявлено в 3,8% случаев, гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDКN2А) - 20,9% случаев первичных опухолей почки.

4. Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов генов рецептора витамина D (VDR, rs731236) и параоксоназы 1 (PONI, rs662) с развитием рака почки. Генетическими маркерами повышенного риска развития рака почки для населения РБ являются генотип rs731236*G/G гена VDR, генотип rs662*T/T и аллель rs662*T гена PONI.

5. Маркерами повышенного риска развития рака почки являются гаплотип ТА полиморфных локусов rs662 и rs854560 гена PONI и гаплотип TAG полиморфных локусов rs731236, rs7975232 и rsl544410 гена VDR, маркерами пониженного риска - гаплотипы ТАА и GCG полиморфных локусов rs73l236, rs7975232 и rsl544410 гена VDR.

6. Показана роль межгенных взаимодействий в развитии рака почки: у русских — взаимодействие аллельных вариантов генов IL4 (rs2243259) и IL16 (rs4778889), у татар - аллельных вариантов генов IL4 (rs2243259) и VDR (rs22432250, rs731236).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева Л.Р.) Исследование ассоциаций полиморфных вариантов генов GSTMI и CYP1A1 с риском развития рака почки у жителей республики Башкортостан / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, A.A. Измайлов, В.Т. Хамзин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдинова // Креативная хирургия и онкология. - 2010. - №4. — С. 35-37.

2. Павлов, В.Н. Молекулярно-генетические маркеры прогноза при почечно-клеточной карциноме / В.Н. Павлов, Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, A.A. Загидуллин,

A.Т. Мустафин, A.A. Халиуллин, P.P. Ямалитдинова, Е.А. Климентова, Э.К. Хуснутдинова//Медицинский вестник Башкортостана. -2011. -№6. - С. 185-191.

3. Кутлыева, Л.Р. Роль метилирования ДНК в развитии почечно-клеточных карцином / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Экологическая генетика. - 2012. - Т. 10, №3. - С. 60-77.

4. Кутлыева, Л.Р. Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене фон Хиппеля-Линдау и анализ аллельных делеций в генах-супрессорах опухолевого роста у больных светлоклеточным раком почки из Республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, A.A. Загидуллин, A.A. Халиуллин, Е.А. Климентова, A.M. Шафигина, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2012. - №12. - С.27-36.

5. Павлов, В.Н. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к почечно-клеточной карциноме у жителей Республики Башкортостан / В.Н. Павлов, Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, A.A. Загидуллин, Р.И. Сафиуллин, A.A. Халиуллин, A.A. Измайлов, Е.А. Климентова, A.M. Шафигина, Э.К. Хуснутдинова // Медицинский вестник Башкортостана. - 2013. — Т.8, № 2. - С.193-197.

6. Mingazova, L.R. ( Kutlyeva, L.R.) The analysis of somatic mutations of the VHL gene in clear cell renal carcinoma patients from Bashkortostan Republic of Russia / L.R. Mingazova (L.R. Kutlyeva), I.R. Gilyazova, R.I. Khusainova, V.N. Pavlov, A.A. Zagidullin, A.A. Khaliullin, A.A. Izmaylov, E.K. Khusnutdinova // ESHG. - Amsterdam. -2011.-V.19.-P.233.

7. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева Л.Р.) Исследование инактивации гена VHL у пациентов со светлоклеточной почечно-клеточной карциномой, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ) / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, В.Н. Павлов, A.A. Загидуллин, A.A. Халиуллин, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики». - Москва. - 2011. - №10. - С. 15.

8. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева, Л.Р.) Анализ мутаций в гене VHL у больных со светлоклеточным раком почки, проживающих на территории республики Башкортостан (РБ) / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова,

B.Н. Павлов, A.A. Загидуллин, В.Т. Хамзин, A.A. Халиуллин, A.A. Измайлов, Э.К. Хуснутдинова // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Курск. - 2011. - С.77-78.

9. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева, Л.Р.) Поиск мутаций и анализ метилирования гена VHL у больных со светлоклеточным раком почки, проживающих на территории республики Башкортостан / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, A.A. Измайлов, В.Т. Хамзин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдинова // Биомика.

II Всероссийская школа-конференция молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. - Уфа. - 2011. - Т. 1. - С. 78-79.

10. Kutlyeva, L. Vitamin D receptor polymorphisms and renal cancer risk in Bashkortostan Republic of Russia / L. Kutlyeva, I. Gilyazova, R. Khusainova, A. Zagidullin, A. Khaliullin, E. Klimentova, A. Shafigina, V. Pavlov, E. Khusnutdinova // ESHG.-Nürnberg.-2012.-P. 195.

11. Кутлыева, JT.P. Анализ потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста у больных почечно-клеточной карциномой, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ) / JI.P. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, A.A. Загидуллин, A.A. Халиуллин, Е.А. Климентова, A.M. Шафигина, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдннова // Сибирский онкологический журнал. Приложение №1. Материалы конференции. - Томск. - 2012. - С.89-90.

12. Кутлыева, Л.Р. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена рецептора витамина D ( VDR') с риском развития рака почки у жителей Республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, A.A. Загидуллин, A.A. Халиуллин, Е.А. Климентова, A.M. Шафигина, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдннова // Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий: Материалы V Всероссийской конференции с международным участием. - С.-Петербург. - 2012. - С.58.

13. Кутлыева, Л.Р. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена сосудисто-эндотелиального фактора роста ( VEGF) с риском развития почечно-клеточного рака у жителей Республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, A.A. Загидуллин, A.A. Халиуллин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдннова // Материалы Российского онкологического конгресса. - Москва. - 2012. - С.ЗЗ

14. Кутлыева, Л.Р. Анализ ассоциации полиморфных вариантов Q192R и L55M гена параоксоназы-1 (PONI) с риском развития почечно-клеточного рака у жителей республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Е.А. Климентова, A.M. Шафигина, A.A. Загидуллин, A.A. Халиуллин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдннова // Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов. Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых. - Уфа.-2012.-С.81-85.

15. Кутлыева Л.Р. Анализ аллельного состояния ряда микросателлитных маркеров в локусах генов-супрессоров опухолевого роста VHL, RASSF1, FHIT, расположенных на хромосоме Зр / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, Е.А. Климентова, A.M. Шафигина, A.A. Загидуллин, A.A. Халиуллин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдннова // Биомика. - Уфа. - 2012. - Т.З, №1. - С. 64-67.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РП рак почки

пкк почечно-клеточная карцинома

СРП светлоклеточный рак почки

РБ республика Башкортостан

ПГ потеря гетерозиготности

ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР полимеразная цепная реакция

VHL ген фон Хиппеля-Линдау

CYP1A1 ген фермента цитохрома Р450 семейства Al

GSTM1 ген глутатион-8-трансферазы М1

IL4 ген интерлейкина 4

1L16 ген интерлейкина 16

VDR ген рецептора витамина D

CDKN2A ген ингибитора циклин-зависимых киназ 2А

RASSF1 ген белка, содержащего домен, гомологичный

онкогену RAS семейства 1

FH1T ген ломкой гистидиновой триады

VEGF ген сосудисто-эндотелиального фактора роста

OR (Odds Ratio) - соотношение шансов

95% CI (confidence - доверительный интервал

interval)

Отпечатано с готового оригинал - макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г.Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ №12. Подписано в печать 17.05.2013г. Формат 60x841/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Tipies». Усл. печ. л, 01,11. Уч.-изд. л. 01,50. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кутлыева, Лилия Разифовна, Уфа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201357339

КУТЛЫЕВА ЛИЛИЯ РАЗИФОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАКА ПОЧКИ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

03.02.07 - генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., профессор Э.К. Хуснутдинова

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................11

1.1. Эпидемиология рака почки...........................................................................11

1.2. Этиология и патогенез рака почки..............................................................13

1.3. Классификация рака почки...........................................................................15

1.4. Наследственные формы рака почки.............................................................18

1.5. Молекулярно-генетические аспекты рака почки........................................21

1.5.1. Роль генов-супрессоров опухолевого роста в развитии заболевания ... 22

1.5.2. Аллельные делеции.....................................................................................27

1.5.3. Аберрантное метилирование.....................................................................32

1.6. Исследования генов-кандидатов рака почки...............................................38

1.6.1. Роль полиморфных вариантов гена параоксоназы-1 в развитии рака почки.......................................................................................................................39

1.6.2. Роль полиморфных вариантов гена рецептора витамина Б в развитии рака почки..............................................................................................................41

1.6.3. Роль полиморфных вариантов генов интерлейкина-4 и интерлейкина-16 в развитии рака почки...........................................................................................44

1.6.4. Роль полиморфных вариантов гена сосудисто-эндотелиального фактора

роста в развитии рака почки................................................................................46

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................51

2.1. Клинический материал для исследования...................................................51

2.2. Забор образцов периферической крови и биопсии.....................................52

2.3. Выделение геномной ДНК............................................................................52

2.4. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК..............................................53

2.5. Рестрикционный анализ.................................................!..............................56

2.6. Метод электрофореза.....................................................................................56

2.7. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция..............................57

2.8. SSCP-анализ с щелочной денатурацией......................................................58

2.9. Определение нуклеотидной последовательности.......................................59

2.10. Микросателлитный анализ.........................................................................59

2.11. Статистическая обработка и программное обеспечение.........................60

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................61

3.1. Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене фон Хиппеля-Линдау....................................................................................................61

3.2. Анализ аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста VHL, RASSF1, FHIT, расположенных на коротком плече хромосомы 3...................69

3.3. Анализ микросателлитной нестабильности................................................72

3.4. Анализ метилирования CpG-островков промоторных областей генов VHL и CDKN2A..............................................................................................................73

3.5. Анализ инактивации гена VHL.....................................................................76

3.6. Поиск аллельных вариантов генов-кандидатов, предрасполагающих к развитию рака почки............................................................................................78

3.6.1. Анализ ассоциаций полиморфного варианта rsl048943 (c,1384A>G, p.Ile462Val) гена CYP1A1 с риском развития рака почки.................................79

3.6.2. Анализ ассоциаций делеции гена GSTM1 с риском развития рака почки .................................................................................................................................83

3.6.3. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов rs662 (с.530Т>С, p.Q192R) и rs854560 (с.163Т>А, p.L55M) гена параоксоназы-1 (PONI) с риском развития рака почки.................................................................................86

3.6.4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена рецептора витамина D (VDR) с риском развития рака почки..............................................................93

3.6.5. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов rs2243250 (-590Т>С) гена интерлейкина-4 (IL4) и rs4778889 (-295Т>С) гена интерлейкина-16 (IL16) с риском развития рака почки...............................................................................105

3.6.6. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов rs2010936 (~634C>G) и rs3025039 (-936С>Т) гена сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF) с риском развития рака почки............................................................................108

3.7. Анализ логистической регрессии изученных полиморфных вариантов с

риском развития рака почки...............................................................................112

3.8. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании

предрасположенности к раку почки..................................................................116

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................124

ВЫВОДЫ.............................................................................................................130

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................131

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................................153

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РП - рак почки

ПКК - почечно-клеточная карцинома

ПГ - потеря гетерозиготности

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

VHL - ген фон Хиппеля-Линдау

CYP1A1 - ген фермента цитохрома Р450 семейства Al

GSTM1 - ген глутатион-8-трансферазы Ml

IL4 - ген интерлейкина 4

1L16 - ген интерлейкина 16

VDR - ген рецептора витамина D

CDKN2A - ген ингибитора циклин-зависимых киназ 2А

RASSF1 - ген белка, содержащего домен, гомологичный

онкогену RAS семейства 1

PONI - ген параоксоназы 1

FHIT - ген ломкой гистидиновой триады

VEGF - ген сосудисто-эндотелиального фактора роста

OR (Odds Ratio) - соотношение шансов

95% CI - доверительный интервал (confidence interval)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Рак почки (РП) - это гетерогенная группа злокачественных опухолей,

подавляющее большинство которых представляют собой почечно-клеточные

карциномы (ПКК) различных морфологических типов. Ежегодно в мире

регистрируют около 210 тыс. новых случаев РП и 100 тыс. смертей от этого

заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем

современной онкоурологии [36]. Прирост заболеваемости в течение

последних 10 лет составил 53,66%, уступив лишь новообразованиям

предстательной и щитовидной желез. По прогнозам ВОЗ заболеваемость и

смертность от онкологических заболеваний может увеличиться к 2020 году

еще в 2 раза, что связано с поздним выявлением опухолей и отсутствием

гарантированного доступа людей к современным методам диагностики и

лечения рака. В настоящее время диагностика и прогноз течения

большинства онкологических заболеваний основываются на данных

инструментальных методов исследования, что не всегда позволяет правильно

оценить прогноз заболевания и возможности лечения, поэтому исследование

молекулярно-генетических причин их возникновения является одной из

наиболее актуальных проблем здравоохранения. Несмотря на значительный

прогресс в идентификации генов, принимающих участие в злокачественной

трансформации клеток, до сих пор не существует системы маркеров для

оценки риска развития рака почки в общей популяции. В последние годы

\

было установлено, что процесс злокачественной трансформации клеток может происходить как в результате генетических событий (делеции, точковые и миссенс-мутации, реарранжировка генов), так и в результате эпигенетических изменений, поэтому актуальным является комплексный анализ механизмов инактивации генов, вовлеченных в патогенез рака почки. Ген УНЬ инактивируется чаще всего при наиболее распространенном гистологическом типе данного заболевания — светлоклеточном раке почки

(СРП), что может быть результатом соматических мутаций, метилирования промотора и/или потери гетерозиготности. Широко изучаются вопросы о влиянии метилирования других генов-супрессоров опухолевого роста (RASSF1, FHIT, DARK-1, APAF-1, SP ARC) на прогрессию первичной опухоли и прогноз заболевания, однако результаты исследований остаются противоречивыми.

Во всем мире проводят исследования, направленные на поиск генов, отвечающих за формирование предрасположенности к ПКК. Одним из современных методов исследований, связанных с поиском ассоциаций между геномными вариантами и фенотипическими признаками является метод полногеномного анализа ассоциаций (Genome-wide Association Studies, GWAS), позволяющий генотипировать ассоциации с заболеванием сотни тысяч однонуклеотидных полиморфных вариантов. На сегодняшний день с помощью GWAS выявлены ассоциации с предрасположенностью ПКК на хромосомах 2р21 (ген EPAS1) [70, 142], llql3.3 [142], 12pl 1.23 (ген ITPR2) [185], 12q24.31 (ген SCARB1) [142]. Данные работы вносят большой вклад в понимание патогенеза заболевания и играют важную роль для подбора тактики лечения. Однако, результаты многих исследований, направленных на поиск ассоциаций полиморфных вариантов с риском развития ПКК, оказались противоречивыми и в последующих работах не воспроизводились.

Широкая вариабельность клинических проявлений заболевания и клинико-патологических параметров опухолей свидетельствует о необходимости изучения генетических факторов риска развития рака почки. В связи с этим, актуальным является идентификация диагностических и прогностических маркеров, позволяющих с высокой точностью предсказывать вероятность развития заболевания в сторону метастазирования и разрабатывать тактику лечения с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.

На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Изучение генетических факторов риска развития рака почки.

Задачи исследования

1. Провести поиск мутаций в гене фон Хиппеля-Линдау (УНЬ) в образцах ДНК из первичных опухолей почки и нормальной почечной паренхимы у больных светлоклеточным раком почки.

2. Оценить частЬту потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (УНЬ), Яаз-ассоциированного белка семейства 1 (ЯА88Р1), ломкой гистидиновой триады (ПИТ) в первичных опухолях почки и провести анализ корреляции обнаруженных аллельных делеций с клинико-патологическими параметрами опухолей почки.

3. Определить частоту метилирования СрО-островков промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (УНЬ) и ингибитора циклин-зависимой киназы 2А (СБКЫ2А) и провести анализ корреляции метилированных генов с клинико-патологическими параметрами рака почки.

4. Провести исследование полиморфных локусов генов систем клеточной детоксикации и антиоксидантной защиты (С8ТМ1, СУР1А1, РОЫ1), цитокинов (.1Ь4,1Ы6), фактора роста (УЕС!7) и рецептора витамина Э {УЭК) у пациентов с раком почки и в контрольной группе здоровых индивидов.

5. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов с предрасположенностью к раку почки.

6. Провести анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию рака почки.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование рака почки в Республике Башкортостан. Определен спектр и частота мутаций в гене VHL у больных РП из РБ. Впервые в ДНК из опухолевой ткани почки обнаружены 11 мутации в гене VHL, не зарегистрированных в базах данных и не описанных ранее в литературе. При изучении полиморфных вариантов генов CYP1A1, PONI, VDR выявлены генотипы/аллели, ассоциированные с риском развития рака почки. Определены оптимальные модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена рецептора витамина D, предрасполагающих к развитию рака почки у индивидов русской и татарской этнической принадлежности.

Научно-практическая значимость работы

Представленные в работе результаты исследования расширяют имеющиеся знания о механизмах развития ПКК, вносят вклад в формирование представлений о генетических и эпигенетических основах данного заболевания. Полученные данные могут внести вклад в разработку новых направлений и эффективных методов лечения и ранней диагностики рака почки. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по медицинской генетике на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту

1. Аллельные делеции на коротком плече хромосомы 3 в областях локализации генов фон Хиппеля-Линдау (VHL), Ras-ассоциированного белка семейства 1 (RASSF1), ломкой гистидиновой триады (FHIT) ассоциированы с развитием рака почки.

2. Мутации в гене фон Хиппеля-Линдау (VHL) обнаружены у 21,9% пациентов со светлоклеточным раком почки. Биаллельная инактивация гена

ч

фон Хиппеля-Линдау (VHL) выявлена в 30,4% случаев светлоклеточного рака почки.

3. Метилирование CpG-островков промоторной области гена фон Хиппеля-Линдау (VHL) выявлено в 3,8%, гена ингибитора циклин-зависимой киназы 2A (CDKN2A) - 20,9% случаев первичных опухолей почки.

4. Полиморфные варианты гена рецептора витамина D (VDR, rs2228570, rs731236) и параоксоназы-1 {PONI, rs662) ассоциированы с развитием рака почки.

5. Маркерами повышенного риска развития рака почки являются гаплотип ТА полиморфных локусов rs662 и rs854560 гена PONI и гаплотип TAG полиморфных локусов rs731236, rs7975232 и rsl544410 гена VDR, маркерами пониженного риска - гаплотипы ТАА и GCG полиморфных локусов rs731236, rs7975232 и rsl544410 гена VDR.

6. Межгенное взаимодействие полиморфных локусов генов интерлейкина-4, интерлейкина-16 и рецептора витамина D определяет развитие рака почки у русских и татар.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Эпидемиология рака почки

Рак почки (РП) - это гетерогенная группа злокачественных новообразований, подавляющее большинство которых представляют собой почечно-клеточные карциномы (ПКК).

Ежегодно в мире регистрируют около 210 тысяч новых случаев РП (вЬОВОСАМ 2002, http://www.dep.1агс.й-^1оЬоса^1оЬосап.Мш;3), в России -более 18 тысяч [12], в Республике Башкортостан - 450 случаев [13]. ПКК является седьмой наиболее распространенной формой рака у женщин и пятой - у мужчин [87]. Среди опухолей мочеполовой системы РП занимает третье место, а по смертности находится на первом [10, 11], что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии.

Распространенность рака почки колеблется во всем мире от 0,6 до 14,7 на 100 000 населения и характеризуется неравномерностью распространения в разных регионах земного шара [138]. Самые высокие показатели отмечаются в Северной Америке, Европе и Австралии, в то время как в странах Азии зафиксирован самый низкий показатель заболевания [166]. В России заболеваемость РП за 2010 год составила 8,78 на 100 000 населения, а смертность от данной патологии - 3,68 на 100 000 населения [13]. Ежегодно число больных РП неуклонно растет: за 2000 год зарегистрировано 7646 мужчин и 5959 женщин с установленным диагнозом «рак почки», а к 2010 году данный показатель увеличился примерно на 3 тысячи больных (10286 случаев среди мужчин и 8437 — среди женщин). Частота выявления заболевания значительно выше в урбанизированных районах по сравнению с сельской местностью.

Существенное различие РП по темпам прироста наблюдается в ряде стран Центральной и Восточной Европы (таблица 1). Например, за 2000-2002 гг. в Швеции была обнаружена тенденция уменьшения частоты заболеваемости, тогда как в Дании за этот же период численность больных

сохранилась. В других странах Северной Европы, за исключением Великобритании, зарегистрирован низкий прирост заболеваемости РП [109]. В России стандартизированный показатель прироста заболеваемости в течение последних 10 лет (2000-2010 гг.) составил 31,44% на 100 000 населения, среднегодовой прирост стандартизированного показателя равнялся 2,77%, уступив лишь новообразованиям головного мозга и других отделов нервной системы [13].

Таблица 1

Стандартизированный показатель заболеваемости и смертности от рака почки в мире за 2008 год [13, 92]

Страна Заболеваемость (на 100 населения) Смертность (на 100 населения)

мужчины женщины мужчины женщины

Россия 11,8 6,2 6,1 2,1

Греция 33,6 15,0 12,6 5,3

Латвия 26,1 13,2 12,4 4,3

Литва 24,8 11,0 12,6 5,3

Эстония 24,2 9,5 12,3 1,9

Германия 21,7 10,2 7,6 3,1

Словакия 20,6 10,5 10,4 4,3

Словения 18,2 6,4 7,3 3,2

Франция 15,9 5,7 6,3 2,5

Польша 15,5 7Д 8,7 3,4

Италия 15,2 ^ 6,1 5,0 2,0

Великобритания 13,1 6,2 6,4 зд

Дания 13,0 6,9 6,3 3,2

Болгария 12,4 6,2 4Д 1,2

Испания 12,3 4,4 4,6 1,7

К моменту постановки диагноза у 20% пациентов выявляются метастазы, в 25% случаев опухоль имеет местно-распространенный характер, а у 3% больных с РП после хирургического лечения появляются рецидивы. Как правило, опухоли почки являются одиночными, но у 6-25% пациентов

может наблюдаться мультифокальное распространение опухоли, у 4% всех больных обнаруживают двустороннюю опухоль [100, 144, 152].

Таким образом, во всем мире наблюдаются высокие показатели распространенности рака почки и смертности от данного заболевания, что превращает РП в актуальную проблему, требующего глубокого и всестороннего изучения.

1.2. Этиология и патогенез рака п