Роль хромосомных нарушений и аберрантного метилирования ДНК в развитии геномной нестабильности при раке молочной железы

Скрябин, Николай Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль хромосомных нарушений и аберрантного метилирования ДНК в развитии геномной нестабильности при раке молочной железы
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль хромосомных нарушений и аберрантного метилирования ДНК в развитии геномной нестабильности при раке молочной железы"

На правах рукописи 005003484

СКРЯБИН Николай Алексеевич

РОЛЬ ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИИ И АБЕРРАНТНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В РАЗВИТИИ ГЕНОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 1 ДЕК 2011

Томск-2011

005003484

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинской генетики Сибирского отделения РАМН, г. Томск

Научные руководители:

доктор биологических наук Лебедев Игорь Николаевич доктор медицинских наук, профессор Завьялова Марина Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Уразова Людмила Николаевна кандидат медицинских наук Назаренко Мария Сергеевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН

Защита состоится «/¿?»^¿е-'ч^/и? 2011 года в ■/(? часов на заседании диссертационного совета ДМ 001.045.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинской генетики Сибирского отделения РАМН по адресу: 634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики Сибирского отделения РАМН.

Автореферат разослан « /т^^^/е-^- 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета /лу

доктор биологических наук, профессор —Г Кучер А.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Высокая частота заболеваемости и смертности от рака молочной железы (РМЖ) женщин во всем мире обуславливает повышенный интерес исследователей к данной патологии (Комарова, 2008; Давыдов, Аксель, 2009). Однако как этиология, так и патогенез данного заболевания до сих пор остаются не до конца изученными, поскольку генетически обусловленные случаи РМЖ ограничиваются только 5-8 % (Карпухин и др., 2002; Любченко и др., 2007; Коваленко и др., 2008; Foulkes, 2008). На данный момент общепринятой является мутационная концепция канцерогенеза, которая подразумевает, что за инициацию и прогрессию опухоли ответственны генные мутации. При этом другие нарушения генетического аппарата клеток, такие как хромосомные аберрации и эпигенетические аномалии, отходят на второй план, рассматриваясь как следствие возрастающей геномной нестабильности, хотя они, также как и генные мутации, являются неотъемлемым компонентом неопластической трансформации.

На сегодняшний день встречаются различные мнения по поводу роли хромосомных аберраций в процессах малигнизации. В 1999 году Питер Дьюсберг сформулировал анеуплоидную гипотезу канцерогенеза, согласно которой возникновение и рост опухоли в большей степени связаны с ошибками в распределении хромосом, чем с накоплением генных мутаций (Duesberg, 1999). Основные положения данной гипотезы подтверждаются рядом исследований, в которых продемонстрировано, что хромосомные аномалии являются одними из ранних генетических нарушений, приводящих к индукции нестабильности генома клетки и, как следствие, к её злокачественной трансформации (Sneige et al., 2006; Lv et al., 2008; Gao et al., 2009).Существует обширная база данных «Progenetix» (www.progenetix.com), в которой на настоящий момент (ноябрь 2011 г.) собраны результаты 954 молекулярно-цитогенетических исследований 29069 опухолей различной локализации, в том числе 2127 случаев РМЖ, демонстрирующие существенный вклад хромосомных аберраций в развитие онкологических заболеваний. В то же время, в ряде случаев хромосомные аномалии рассматриваются как следствие различных генетических и эпигенетических нарушений, таких как аномалии сегрегации центросом и дисфункции теломер, точковые мутации в различных онкогенах и онкосупрессорах, гиперметилирование генов, ответственных за репарацию ДНК и регуляцию клеточного цикла (Соколенко и др., 2008;Salisbuiy, 2001; Donate, Blasco, 2011).

В последнее время в мировой литературе начинают накапливаться данные, указывающие на значительный вклад и эпигенетических аберраций в инициацию и развитие злокачественного процесса (Залетаев и др., 2004; Kuznetsova et al., 2007; Esteller, 2008; Feinberg, 2010; Vlassov et al., 2010). В 2006 году Эндрю Фейнберг с соавторами выдвинули гипотезу, согласно которой фундаментальной основой рака являются эпигенетические нарушения генов-инициаторов опухоли в стволовых клетках или {слетках-предшественниках (Feinberg et al., 2006). Не вызывает сомнения и тот факт, что эпигенетические нарушения являются важнейшими атрибутами клетки с уже инициированным злокачествен-

ным процессом. Следовательно, изучение эпигенетического статуса генома при раке является необходимым элементом для более глубокого понимания механизмов злокачественной трансформации и для выявления нового поколения биомаркеров с целью ранней диагностики онкологических заболеваний. В основе эпигенетических изменений генной экспрессии лежат стабильные, наследуемые, но потенциально обратимые ковалентные модификации хроматина, такие как метилирование цитозиновых оснований ДНК и химические изменения гистонов (ацетилирование, метилирование, убиквитинирование, фосфорилиро-вание). Аномалии метилирования ДНК при раке представлены в основном гиперметилированием промоторных регионов онкосупрессорных генов, а так же глобальным гипометшшрованием всего генома. Согласно результатам некоторых исследований, нарушения статуса метилирования возникают задолго до развития клинически выраженного рака (Euhus et al., 2008; Park et al., 2011).Актуальность изучения эпигенетических аномалий обуславливается также работами, которые свидетельствуют о большом диагностическом потенциале аберрантного метилирования внеклеточной циркулирующей ДНК в периферической крови больных с онкологическими заболеваниями (Рыкова и др., 2008; Тамкович и др., 2008; Vlassov et al., 2010).

Вопросы о первичности и взаимосвязи генных, хромосомных, либо эпигенетических аномалий в индукции геномной нестабильности в процессе развития онкологических заболеваний, в том числи и РМЖ, остаются открытыми и являются предметом дискуссий (Имянитов, 2010; Lotem, Sachs, 2002; Slattery et al., 2011). Также возникают вопросы, касающиеся роли вышеуказанных нарушений генома в развитии определенных признаков злокачественной трансформации клеток, например, метастазирования. Все вышесказанное указывает на актуальность исследований, которые раскрывают вопросы патогенетики РМЖ как с цитогенетических, так и с эпигенетических позиций.

Цель исследования: Оценить вклад хромосомных нарушений и аномалий метилирования ДНК в развитие геномной нестабильности при раке молочной железы.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ спектра несбалансированных хромосомных аберраций в тканях молочной железы с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, а также в регионарных лимфатических узлах с метастазами.

2. Определить связь наиболее частых хромосомных аберраций с клиническими параметрами у больных раком молочных желез.

3. Выявить спектр дифференциально метилированных последовательностей ДНКв тканях молочной железы с доброкачественными и злокачественными новообразованиями и регионарных лимфатических узлах с метастазами.

4. Изучить статус метилирования генов ретинобластомного пути регуляции клеточного цикла в тканях молочной железы в зависимости от уровня хромосомных аберраций.

Научная новизна исследования: В ходе настоящего исследования впервые определены особенности цитогенетических и эпигенетических нарушений, обуславливающих развитие геномной нестабильности при раке молочной железы. Выявлено, что существенное увеличение частоты хромосомных аберраций происходит после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные. Показана протективная роль делеции хромосомного субсегмента 16ql2.1 для больных раком молочной железы. С помощью широкогеномного анализа эпигенетического статуса 807 онкогенов и опухолесупрессорных генов впервые установлено, что ткани молочной железы с доброкачественными про-лиферативными процессами и метастазы в регионарные лимфатические узлы являются сходными по профилю метилирования ДНК, что указывает на обособление клона клеток с метастатическим фенотипом на ранних этапах злокачественной трансформации.

Практическая значимость: Полученные результаты расширяют представления о цитогенетических и эпигенетических механизмах прогрессии рака молочной железы. Комбинированное использование методов широкогеномного анализа профиля метилирования ДНК и молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных аберраций может быть применено при комплексных моле-кулярно-генетических исследованиях злокачественных новообразований других локализаций. На основании результатов анализа связи цитогенетических и эпигенетических аномалий в опухолевой ткани с патогенетически значимыми характеристиками злокачественного процесса могут быть разработаны дополнительные критерии оценки клинического течения рака молочной железы. Положения, выносимые на защиту:

1. Установление специфичного профиля метилирования ДНК в клетках, ответственных за возникновение лимфогенных метастазов при раке молочной железы, происходит на начальных этапах процесса малигнизации.

2. Усиление хромосомной нестабильности при развитии рака молочной железы происходит после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные.

3. Делеция хромосомного субсегмента ^12.1 в неопластических клетках у больных раком молочной железы ассоциирована с опухолями меньших размеров.

Апробация работы: Основные результаты диссертационного исследования были представлены на Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы» (Томск, 2008), IV и VI региональных конференциях молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009 и 2011), Международном симпозиуме в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития и сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии» (Томск, 2009), научно-практической кон-

ференции с международным участием «Актуальные проблемы медицинской генетики на крайнем севере» (Якутск, 2009),VI и VII Российских конференциях по фундаментальной онкологии «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2010 и 2011), Европейской конференции по генетике человека (European Human Genetics Conference) (Амстердам, Нидерланды, 2011), IX научной конференции памяти профессора С.А. Назаренко «Генетика человека и патология: Актуальные проблемы современной цигогенетики» (Томск, 2011), межлабораторном научном семинаре Учреждения РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2011).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 в журналах перечня ВАК.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Данные проиллюстрированы 21 таблицей, 17 рисунками и 1 приложением. Библиографический указатель включает 173 источника, из них 23 работы отечественных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал для исследования был получен от 41 женщины, больной РМЖ. Всего было обследовано 7 образцов ткани молочной железы с проявлениями доброкачественных пролиферативных процессов, 40 образцов опухолевой ткани, 6 образцов ткани регионарных лимфатических узлов (РЛУ) с метастазами и 6 условно-контрольных образцов, которые представляли собой образцы тканей молочной железы без гистологических изменений (рис. 1).

Рис. 1. Структура и объем обследованных выборок

Молекулярно-цитогенетический анализ проводили с помощью сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения (HR-CGH, High Resolution Comparative Genomic Hybridization). Образцы ДНК были выделены с использованием стандартного фенол-хлороформного метода. Значимость различий между числом несбалансированных хромосомных аберраций в исследованных группах, а также корреляцию частоты наиболее частых хромосомных перестроек с размером опухоли, менструальным статусом и статусом рецепторов ER, PR, HER2 оценивали с помощью точного критерия Фишера. U-критерий Манна-Уитни использовался для анализа корреляции частоты хромосомных аномалий с возрастом обследованных индивидов и числом пораженных лимфатических узлов.

Анализ профиля метилирования ДНК был выполнен с помощью метило-чипа «Golden Gate Methylation Cancer Panel I» («Illumina», США), включающего 1505 CpG-динуклеотидов, локализованных в 807 опухолесупрессорных генах и онкогенах. Мечение, гибридизация ДНК и детекция сигналов были проведены на базе ЗАО «Геноаналитика» (г. Москва).Для выявления дифференциально метилированных генов использовали значение индекса метилирования ß = 17 %, что соответствует уровню разрешения метода (O'Riain et al., 2009).

Для группировки исследованных образцов тканей по профилю метилирования ДНК применяли иерархический кластерный анализ с использованием Евклидова расстояния и метода полных связей. Представленность образцов в кластерах рассчитывалась с помощью точного теста Фишера. Гены, дифференциально метилированные между разными кластерами, выявляли с помощью U-критерия Манна-Уитни с поправкой на множественность сравнения (FDR). Функциональная классификация дифференциально метилированных генов была проведена с помощью веб-ресурса Gene Set Analysis Toolkit V2 (http://bioiiifo.vanderbilt.edu/webgestalt/), в котором оценивается представленность генов, группированных согласно базе данных «Gene Ontology».

Анализ статуса метилирования ДНК промоторых областей генов, участвующих в ретинобластомном пути регуляции клеточного цикла (RBI, pl4ARF, CDKN2B), проводили с помощью метилспецифической-ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров и условий, описанных в литературе (Esteller et al., 2001; Roncalli et al., 2002;Gonzalez-Gomez et al., 2003). Связь уровня хромосомных аберраций со статусом метилирования генов RBI, pl4ARF, CDKN2B оценивали с помощью точного теста Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-цитогенетический анализ тканей молочной железы и регионарных лимфатических узлов. В образцах тканей нормального эпителия молочной железы число хромосомных аберраций варьировало от 2 до 10 на образец ткани, в среднем на один образец приходилось 6,5 различных хромосомных нарушений. Число амплификаций в некоторых образцах достигало 10, а число делеций - 7. Среднее число амплификаций составило 3,7, а делеций - 2,7 на образец. Среднее число хромосомных сегментов, затронутых хромосомными

нарушениями, составило 18,7 на образец ткани. Хромосомные аномалии были выявлены во всех образцах. Чаще всего встречались такие аберрации, как амплификация 2р13 и делеция 19ql3.3-ql3.4. Наличие хромосомных перестроек в тканях с нормальным эпителием может быть обусловлено тем, что все образцы были получены от женщин с верифицированным РМЖ, также необходимо учитывать то, что всем пациенткам, от которых был получен данный материал, была проведена неоадъювантная химиотерапия.

В тканях с доброкачественными пролиферативными процессами число хромосомных аберраций варьировало от 5 до 18 на образец ткани, в среднем на один случай приходилось 10 различных хромосомных нарушений. Число амплификации в некоторых образцах достигало 6, а число делеций - 12. Среднее число амплификаций составило 3, а делеций - 7 на образец. Среднее число хромосомных сегментов, затронутых хромосомными нарушениями, составило 32,5 на образец ткани. Был выявлен всего один хромосомный сегмент с амплификацией (14q21), который встречался более чем у одного пациента. Число сегментов с делециями, которые встречались более чем у одного пациента, составило 28: 1р35-р36.2 (включагощийЗ сегмента: 1р35, 1р36.1 и 1р36.2), 9ql2-q21, llql3, 16pl 1.2-р12,16ql2.1-q22, 17pll.2-pl3, 19p, 19ql3.1-ql3.2 и 20qll.2-ql3.2. Также частой аномалией являлась моносомия хромосомы 22.

Во всех 20 образцах опухолевой ткани были обнаружены множественные хромосомные аберрации: число аномалий варьировало от 1 до 27, в среднем на один случай приходилось 14,1 различных хромосомных нарушений. Число амплификаций в некоторых образцах достигало 26, а число делеций -14. Среднее число амплификаций составило 8,9, а делеций - 5,2 на образец. Среднее число хромосомных сегментов, затронутых хромосомными перестройками, составило 48,7 на образец ткани. Наиболее частыми являлись амплификации в сегментах 1р31, lq23, Iq24-q25, lq31, lq32, lq41, lq42, Iq43-q44, 3q24, 8q22, 8q23, 10q22 и делеции в сегментах 9ql3, 9q21, 16ql2.1, 16ql2.2-ql3, 16q21.B целом спектр хромосомных аберраций в образцах опухолей молочной железы, выявленный в настоящем исследовании, соответствует описанным в литературе и является характерным для опухолей данной локализации (Baudis, 2007; Heim, Mitelman, 2009). Самой частой аномалией оказалась делеция в субсегменте 16ql2.1, зарегистрированная в 47 % обследованных образцов, что также соответствует данным литературы (Xu et al., 2008; Green et al„ 2009; Natrajan et al. 2009).

В группе образцов с метастазами в регионарные лимфатические узлы также обнаружены множественные хромосомные аберрации: число аберраций варьировало от 6 до 20, в среднем на один случай приходилось 12,2 различных хромосомных нарушений. Число амплификаций в некоторых образцах достигало 13, а число делеций - 7. Среднее число амплификаций составило 10, а делеций - 2,2 на образец. Среднее число хромосомных сегментов, затронутых хромосомными перестройками, составило 33,8 на образец. Хромосомные аномалии наблюдались во всех исследованных образцах. Наиболее частыми являлись амплификации в сегментах 2р22, Зр14-р21, 3q22-q26.1, 4q28, 5q21, 6q22, 8q21-q24.1, 13q21-q22, 20ql3.1-ql3.3 и делеции в сегментах Ilql2-ql3.

В группах образцов с РМЖ и метастазами в РЛУ отмечается значительное превалирование амплификаций над делениями, в то время как в группе образцов с доброкачественными пролиферативными процессами наблюдается противоположная картина. Соотношение амплификаций и делеций в группе с доброкачественными новообразованиями статистически значимо отличается от групп с РМЖ (СЖ = 3,96; 95 % С1: 1,84-8,64; р = 0,0001) и метастазами в РЛУ (СЖ= 10,61; 95 % С1: 3,78-30,67; р<0,0001) (табл. 1).

Таблица 1

Число хромосомных аберраций в исследованных группах_

Образцы Число хромосомных аберраций

Амплификации Делеции

Нормальный эпителий 15 И

Доброкачественные новообразования 12 28

РМЖ 178 105

Метастазы в РЛУ 50 11

Похожие результаты были выявлены в другом исследовании, где было обнаружено превалирование амплификаций над делениями в образцах со злокачественными новообразованиями молочной железы (114 амплификаций и 35 делеций), в то время как в образцах с доброкачественными новообразованиями наблюдалось превалирование делеций над амплификациями (30 амплификаций и 37 делеций) (Ьу й а1., 2008). По мнению авторов, это свидетельствует о значительной роли амплификаций в процессах злокачественной трансформации.

При сравнении образцов из различных групп у одних и тех же пациенток больше всего одинаковых сегментов с хромосомными аберрациями было зарегистрировано между опухолевыми тканями и метастазами в регионарные лимфатические узлы (п = 28), затем между тканями с доброкачественными и злокачественными новообразованиями (п= 10) и меньше всего одинаковых хромосомных сегментов с аномалиями было выявлено между образцами с доброкачественными новообразованиями и метастазами в РЛУ (п = 3). В целом, в образцах с РМЖ и метастазами в РЛУ число общих хромосомных сегментов затронутых аберрациями, оказалось статистически значимо выше, чем в образцах с доброкачественными и злокачественными новообразованиями ((Ж = 2,98;95 % С1: 1,36-6,70;р = 0,002).0бщие цитогенетические аномалии, выявленные в тканях с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, возможно, возникли до разделения клона клеток со злокачественным фенотипом. Следовательно, общие хромосомные аберрации, детектированные в образцах с РМЖ и метастазами в РЛУ, могли возникнуть только после образования клеток с фенотипом злокачественной опухоли. Данная находка может указывать на то, что вероятность возникновения хромосомных аберраций увеличивается после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные.

Корреляция хромосомных аберраций с клиническими параметрами у больных раком молочной железы. В проведенном нами исследовании амплификации сегментов 1р31 и ^24^25 коррелировали с опухолями, соответст-

вующими Т2.4 по TNM-классификации (опухоли более 2 см) (Виггекинд и др., 2007), т.е. были ассоциированы с большими размерами опухоли (р = 0,022 и р = 0,028, соответственно), в то время как делеция субсегмента 16ql2.1 коррелировала с опухолями, соответствующими Т] (опухоль менее 2 см) (р = 0,028).Можно предположить, что в амплифицированных сегментах локализованы онкогены, играющие значительную роль в накоплении клеточной массы. Так, например, было показано, что амплификация субсегментов 1р31.3-р32.3 встречается во всех образцах синхронных спорадических опухолей молочной железы, исследованных при помощи матричной CGH (Ghazani et al., 2007).

У женщин с делецией 16ql2.1 в проведенном нами исследовании чаще выявлялись опухоли, размеры которых были менее двух сантиметров, что может быть свидетельством медленного роста опухоли в данной группе пациентов. Протективная роль делеции хромосомного субсегмента может быть результатом наличия в нем онкогена, утрата которого и обусловливает медленное накопление клеточной массы. При анализе сегмента 16ql2.1 на предмет наличия в нем онкогенов обратил на себя внимание локус, содержащий гены - TNRC9 и LOC643714. В рамках полногеномного ассоциативного исследования (GWAS -Genome-wide association study), проведенного в Европейских странах и охватившего 4398 пациентов с РМЖ и 4316 индивидов контрольной группы, в пределах данного локуса был выявлен однонуклеотидный полиморфизм (SNP) rs3803662: С>Т, связанный с риском развития РМЖ (OR = 1,20; 95 % CI: 1,161,24; р = 10'36) (Easton et al., 2007). Ген TNRC9 кодирует белок, содержащий высокомобильную группу (HMG - high mobility group), которая участвует в спи-рализации ДНК и изменении структуры хроматина. Так же имеются данные, свидетельствующие о том, что данная группа может выступать в качестве транскрипционного фактора, обладающего онкогенными свойствами (Easton et al., 2007; Liang et al., 2010;Ruiz-Narvaez et al., 2010). Можно предположить, что делеция субсегмента 16ql2.1, содержащего полиморфизм rs3803662: С>Т, ассоциированный с высокопенетрантным онкогеном, может ингибировать процессы злокачественной трансформации и роста опухоли.

Была найдена корреляция амплификации сегментов lq42 и Iq43-q44 с сохраненным менструальным статусом (р = 0,009 и р = 0,015, соответственно). В пределах сегментов Iq42.1-q43 локализован ген BRCAA1 (breast cancer associated antigen 1), для которого показано повышение экспрессии при РМЖ, что, в свою очередь, ассоциировано с увеличением уровня рецепторов эстрогена (Cui et al., 2004). Как известно, эстроген является сильным внеклеточным пролифе-ративным фактором, следовательно, у женщин с сохраненным менструальным статусом, наличие рецепторов к эстрогену в опухолевых тканях стимулирует клеточную пролиферацию. Также была выявлена отрицательная корреляция амплификации lq41 с числом пораженных лимфатических узлов (р = 0,034). Амплификация lq41 является частой хромосомной перестройкой при злокачественных новообразованиях молочной железы, к тому же в литературе имеются факты, свидетельствующие о протективной роли амплификации данного сег-

мента при РМЖ (Mollerstrom et al., 2010).Других корреляций частых хромосомных аберраций с числом пораженных лимфатических узлов, а также с возрастом пациенток и статусом рецепторов ER, PR и НЕК2обнаружено не было.

Межгрупповой анализ дифференциального метилирования генов в тканях молочной железы и регионарных лимфатических узлах с метастазами. В результате проведенного анализа были получены профили метилирования 1505 CpG-сайтов, однако в дальнейший анализ нами были включены 1260 CpG-сайтов, относящихся к 730 генам. Остальные 245 были либо с низким уровнем достоверности детекции, либо были локализованы на X хромосоме, случайная инактивация которой осуществляется за счет тотального метилирования. При сравнении образцов с доброкачественными новообразованиями молочной железы и образцов с гистологически нормальным эпителием из 1260 CpG-сайтов дифференциально метилированными оказались 26 (2,06 %). Из них гиперметилированными и гипометилированными оказались по 13 CpG-сайтов. Гиперметилированные гены, выявленные в группе доброкачественных новообразований, были представлены в 3 группах генов по классификации «Gene Ontology»: гены, ответственные за регуляцию адгезии клеток (п = 2), гены, участвующие в остановке клеточного цикла (п = 2), и гены иммунного ответа (п = 4).Поскольку в результате молекулярно-цитогенетического исследования было выявлено, что большая часть хромосомных аберраций возникает после разделения доброкачественных и злокачественных новообразований, можно предположить, что геномная нестабильность инициируется в тканях с доброкачественными новообразованиями. С этой точки зрения, выявленное гиперметилирование генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, может быть частью комплекса аномалий, приводящих к геномной нестабильности, и заслуживает особого внимания. Гипометилированные гены, выявленные в образцах тканей с доброкачественными новообразованиями, относились к 3 группам: гены, ответственные за межклеточную адгезию (п = 2), подвижность клеток (п = 2) и регуляцию роста клеток (п = 2).

Из 1260 исследованных CpG-сайтов в группе образцов со злокачественными новообразованиями по сравнению с группой образцов с нормальным эпителием было выявлено 318 дифференциально метилированных CpG-сайтов (25,2 %), из которых 252 (79,2 %) показали увеличение, а 66 (20,8 %) снижение уровня метилирования. В данной группе большинство дифференциально метилированных CpG-сайтов встречались в единичных образцах, что свидетельствует об усилении эпигенетической нестабильности, которая приводит к увеличению частоты неспецифического метилирован™. Дифференциальное метилирование в более чем 30 % обследованных образцов было выявлено только в 62 CpG-сайтах (19,4 %), 46 из которых оказались гиперметилированными (74,1 %), а 16 - гипометилированными (25,9%). Гиперметилированные гены, выявленные в злокачественных новообразованиях, были представлены в 2 группах: гены, ответственные за позитивную регуляцию клеточной дифференциации (п = 8), и за регуляцию клеточной пролиферации (п = 12). Гипометилированные гены, выявленные в опухолевой ткани, относились к 2 группам: гены, регули-

рующие миграцию клеток (п = 2), и гены, ответственные за фосфорилирование белков (п = 3).

При сравнении образцов с метастазами в регионарные лимфоузлы и образцов из контрольной группы из 1260 исследованных СрО-сайтов было выявлено 93 дифференциально метилированных СрО-сайта (7,3 %), из которых 64 (68,8 %) показали увеличение, а 29 (31,2 %) снижение уровня метилирования. В группе образцов с метастазами в регионарные лимфатические узлы гипермети-лированные гены были представлены в 4 функциональных группах: регуляция адгезии клеток (п = 2), формирование анатомических структур, вовлеченных в морфогенез (п = 2), развитие кровеносных сосудов (п = 2), иммунный ответ (п = 3). Гипометилированные гены были представлены в двух группах: транс-дукция сигналов (п = 4) и фосфорилирование белков (п = 4).

При сравнении исследованных групп по соотношению числа гиперметили-рованных и гипометилированных СрО-динуклеотидов было выявлено статистически значимое отличие злокачественных новообразований от доброкачественных (СЖ = 3,82; 95% С1: 1,57-9,27; р = 0,001), обусловленное увеличением числа гиперметилированных СрО-сайтов в образцах с РМЖ. Также статистически значимое отличие наблюдалось и при сравнении образцов со злокачественными новообразованиями и метастазами в регионарные лимфоузлы ((Ж= 1,73; 95 % С1: 1,00-2,99; р = 0,03), которое было обусловлено увеличением числа гипометилированных СрО-сайтов в тканях регионарных лимфоузлов с метастазами. Между доброкачественными новообразованиями и метастазами в регионарные лимфатические узлы статистически значимых отличий по соотношению числа гипер- и гипометилированных СрО-сайтов не выявлено ((Ж = 0,45; 95 % СГ. 0,17-1,20; р = 0,06).

В целом, число всех дифференциально метилированных генов в опухолевых тканях увеличивается по сравнению с группой образцов с доброкачественными новообразованиями (р<0,0001). Однако при сравнении образцов с РМЖ и метастазами в РЛУ, напротив, наблюдается снижение числа дифференциально метилированных генов (р<0,0001), что может указывать на общность эпигенетического профиля доброкачественных новообразований и метастазов в РЛУ. С целью проверки данного предположения был использован кластерный анализ. В результате была выявлена группа образцов с высокой степенью сходства по профилю метилирования ДНК, в которой представленность тканей с доброкачественными пролиферативными процессами и регионарными лимфогенными метастазами была статистически значимо выше, чем во всей выборке (р<0,001) (рис. 2). Это означает что данный кластер, за исключением одного образца с РМЖ и одного образца с нормальным эпителием, состоит из образцов тканей молочной железы с доброкачественными пролиферативными процессами и регионарных лимфатических узлов с метастазами. Большинству других первичных опухолей и нормальных тканей был присущ другой спектр метилирования. В данных группах тканей профиль метилирования ДНК характеризовался

-П

а го

о II II II II II II II II II II II II

^соооа^отю^спдас^КююслюстосЛ'^юсот^сососоюсоотсмсдт-Т V Т V *? V *7 CL 7 *? 'У CL Т т ^ Т ^ п. m ^ i tLrO.5riQ.ILD. XXO-icL cJCCctS S CtX Й cjct ¿¿¿CL

Рис. 2. Иерархическая кластеризация исследованных тканей по профилю метилирования ДНК. Р - образцы с раком молочной железы; Д - образцы с доброкачественными пролиферативными процессами; М - образцы с метастазами в регионарные лимфатические узлы; Н - образцы с гистологически нормальным эпителием молочной железы. Цифрами обозначены номера пациентов

высокой гетерогенностью. Полученные результаты свидетельствуют о том, что группы тканей с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в регионарные лимфоузлы являются относительно близкими с точки зрения рисунка метилирования, хотя и являются разными по гистологической характеристике и локализации.

В результате анализа дифференциально метилированных генов, обусловивших разделение тканей при кластерном анализе, была выявлена всего лишь одна группа генов, которые по молекулярным функциям относились к рецепторам, связанным с G-белками (GPCR): HTR1B, PTH1R, OPCML, MASI, NPR2, FZD9, EDNRB, GPR116, GALR1, CCKAR, PDGFRB и EMR3 (р = 0,023). Для инициации многих клеточных процессов необходима внешняя стимуляция, и процессы, приводящие к злокачественной трансформации клетки, не являются исключением. Так, для запуска клеточной миграции и инвазии необходима стимуляция клетки такими факторами как матриксные металлопротеиназы, ростовые факторы, хемокины и др. Данные внеклеточные факторы взаимодействуют с рецепторами на поверхности раковых клеток, такими как интегрины,

рецепторы тирозин киназ и GPCR-белки (Kirui et al., 2010). При раке молочной железы показано изменение экспрессии GPCR и подавление белков, регулирующих G-сигнальные пути (Xie et al., 2009). Исследования нейтрофилов периферической крови и амебы Dictyostelium discoideum показали, что рецепторы, связанные с G-белками, играют важную роль в регуляции клеточной миграции, обусловленной градиентным хемотаксисом (Van Haastert, Devreotes, 2004). Миграция к хемоаттрактантам за счет реструктуризации цитоскелета показана и для клеток РМЖ (Yamazaki et al., 2005).

Оценка статуса метилирования генов контроля клеточного цикла RBI. v!4ARF. CDKN2B. В результате анализа статуса метилирования ДНК с помощью микрочипа было выявлено, что в образцах с доброкачественными новообразованиями наблюдается гиперметилирование генов, регулирующих клеточный цикл. К тому же межгрупповое сравнение хромосомных аномалий показало, что хромосомные аберрации начинают накапливаться после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные. Данные находки свидетельствуют о том, что аномалии метилирования генов контроля клеточного цикла могут бьггь задействованы в развитии геномной нестабильности. Следовательно, необходимо более глубокое изучение данной группы генов. Аберрантное метилирование онкосупрессорных генов pl4ARF и CDKN2Bb проведенном нами исследовании было зарегистрировано с частотой 70,2 % и 13,5 %, соответственно, тогда как метилирования RB1 отмечено не было. В большинстве случаев в исследованных образцах выявлялись и метилированные и немети-лированные последовательности локусов. Наличие только метилированных аллелей было зарегистрировано в генеpl4ARFв 13,5 % случаев.

В 9 из 37 образцов опухолевой ткани (24,3 %) промоторы всех 3 генов находились в неметилированном состоянии. В литературе обнаружены результаты единичных исследований, в которых одновременно оценивался статус метилирования данных генов при РМЖ. Что касается других типов опухолей, то частоты метилирования RBI, pl4ARF и CDKN2B варьируют в широком диапазоне - от 5 до 83 % (Dong et al., 2005; Murao et al., 2006).Сравнительный анализ статуса метилирования RBl,pl4ARF и CDKN2B в опухолевых тканях, полученных от пациенток с раком молочных желез, демонстрирует высокую частоту аномального метилирования pl4ARF и CDKN2B при нормальном эпигенетическом статусе гена RB1. Анализ литературных данных, доступных в отношении других форм рака, свидетельствует о том, что, по крайней мере, при лимфомах и при эпидермальном раке, наблюдается аналогичная ситуация (табл. 2). Не исключено, что такая комбинация эпигенотипов исследованных генов, с одной стороны, может объясняться более высокой частотой метилирования генов ингибиторов циклин-зависимых киназ, по сравнению с геном RB1. С другой стороны, выявленная особенность может указывать на существование особых эпигенетических механизмов дизрегуляции клеточного цикла и поддержания стабильности генома при канцерогенезе, которые запускаются уже на уровне ингибиторов циклин-зависимых киназ.

Таблица 2

Комбинации статуса метилирования генов pl4ARF, CDKN2B и RB1 _при различных типах опухолей__

РМЖ Лимфома Эпидермальный рак

Всего образцов 37 22 20

Одновременное метилирование генов CDKN2B, pl4ARF и RB1 0 0 0

Одновременное метилирование TenoapMARFuRBl 0 1 (4,5%) 1 (5%)

Одновременное метилирование генов CDKN2Bn RB1 0 0 0

Одновременное метилирование генов pl4ARF и CDKN2B 3 (8,1%) 6 (27,2%) 0

Метилирование только pl4ARF 23 (62,1%) 6 (27,2%) 2 (10%)

Метилирование только CDKN2B 2 (5,4%) 2 (9%) 0

Метилирование только RB1 0 1 (4,5%) 0

Отсутствие метилирования всех трех генов 9 (24,3%) 6(27,2%) 17(85%)

Источник информации Настоящее исследование Linda et al., 2006 Murao et al., 2006

На частоту хромосомных аномалий могут влиять различные факторы, в том числе и нарушения функционирования генов регулирующих клеточный цикл. Поскольку в ходе настоящего исследования было выявлено, что нарушения ЯВ-зависимого пути регуляции клеточного цикла могут быть обусловлены аномалиями метилирования генов рМАШ?и СБШ2В, была изучена связь частоты хромосомных аберраций со статусом метилирования данных генов. В тканях пациенток с РМЖ, у которых было выявлено метилирование гена р14АКР, среднее число хромосомных аберраций составило 14,2 ± 2,0, в то время как в тканях без аномалий метилирования данного гена было выявлено в среднем 19,5 ± 1,5 хромосомных перестроек (р = 0,46). В опухолевых образцах с метилированием промоторной области гена СИКМ2В среднее число хромосомных перестроек составило 8,0 ± 1,0, а в образцах без аномалий метилирования было выявлено 15,5 ± 1,9 хромосомных аберраций (р = 0,20). Отсутствие статистически значимых различий по частоте хромосомных перестроек между образцами тканей с нормальным и аберрантным эпигенетическим статусом исследованных генов регуляции клеточного цикла указывает на то, что их гиперметилирование не оказывает существенного влияния на увеличение частоты хромосомных аберраций при раке молочной железы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хромосомные аномалии и нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов являются одними из характерных признаков злокачественной трансформации клеток при раке молочной железы (Рубцов, Карамышева, 2000; Зале-таев и др., 2004; Feinberg, 2010; Vlassov et al., 2010). Проведенное нами исследование было направлено на сравнительную цитогенетическую и эпигенетическую характеристику тканей молочной железы с доброкачественными проли-феративными процессами и злокачественными новообразованиями, а также тканей регионарных лимфатических узлов с метастазами с целью выявления особенностей динамики накопления различных мутационных событий в ходе развития онкологического процесса. Выбор данного направления исследования был обусловлен развитием представлений о роли хромосомных аберраций и аномалий метилирования ДНК в индукции ранних этапов злокачественной трансформации клеток, а также противоречивостью имеющихся в литературе данных относительно значимости различных генетических механизмов вини-циации нестабильности генома (Имянитов, 2010; Duesberg, 1999; Lotem, Sachs, 2002; Feinberg et al., 2006; Easton et al., 2007; Slattery et al., 2011).

В ходе первого этапа исследования с помощью сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения были оценены спектр и частота несбалансированных хромосомных аберраций в тканях с нормальным эпителием, доброкачественными и злокачественными новообразованиями, а также в тканях регионарных лимфатических узлов с метастазами. В результате во всех обследованных группах был выявлен широкий спектр хромосомных аберраций. В группах с РМЖ и метастазами в РЛУ отмечалось значительное превалирование амплификаций над делециями, в то время как в группе образцов с доброкачественными пролиферативными процессами наблюдалась противоположная картина. Данная находка может быть объяснена с точки зрения гипотезы, свидетельствующей о значительной роли полиплоидизации клеток в развитии геномной нестабильности при злокачественных новообразованиях. Согласно данной гипотезе, полиплоидизация положительно влияет на развитие неоплазий, т.к. увеличивается выживаемость клеток с хромосомной нестабильностью за счет компенсации различных летальных мутаций (Storchova, Pellman, 2004; Merlo et al.,2010). Амплификация, по сути, является тем же самым увеличением генетического материала, только на ограниченных участках генома. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что в клонах клеток с признаками доброкачественных пролиферативных процессов, изначально превалировали делеции. Именно это явление могло лежать в основе того, что их геном был более стабилен по сравнению со злокачественными клонами, поскольку клоны клеток с доминированием делеций и высоким уровнем хромосомной нестабильности погибали вследствие возникновения различных летальных мутаций.

Кроме того, при внутрииндивидуальном сравнительном анализе общих хромосомных сегментов с аномалиями в разных тканях, было показано, что в тканях со злокачественными новообразованиями и метастазами в РЛУ число общих хромосомных перестроек значимо выше, чем в образцах с доброкачест-

венными и злокачественными новообразованиями ((Ж = 2,98; 95 % С1: 1,36-6,70; р = 0,002). Этот факт может указывать на то, что вероятность возникновения хромосомных аномалий увеличивается после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные.

Далее нами был проведен анализ ассоциаций выявленных хромосомных аномалий с клиническими характеристиками больных РМЖ. Амплификации сегментов 1р31 и Ц24^25 коррелировали с опухолями, соответствующими Т^л по ТТЧМ-классификации, т.е. были ассоциированы с большими размерами опухоли (р = 0,022 и р = 0,028, соответственно), в то время как у пациенток с деле-цией субсегмента 16ql2.1 чаще наблюдались опухоли меньших размеров (ТО по сравнению с больными без делеции (р = 0,028).Корреляция амплификации сегментов 1р31 и Ц24ч}25 может указывать на то, что в данных сегментах локализованы онкогены, играющие значительную роль в накоплении клеточной массы. Что касается ассоциации делеции 16д12.1 с опухолями малых размеров, то в данном случае возникает вопрос о возможной протективной роли данной хромосомной аномалии в динамике развития злокачественного процесса. Про-тективный эффект может быть результатом наличия в данном регионе высоко-пенетрантного онкогена, делеция которого и обусловливает медленное накопление клеточной массы. Кандидатные гены с предполагаемыми онкогенными свойствами - ШЯС9 и ЮС643714, локализованные в данном субсегменте, были выявлены в результате полногеномного ассоциативного исследования рака молочной железы (Еа$1оп а а1., 2007).

В проведенном нами исследовании также были выявлены ассоциации ам-плификаций сегментов Ц42 и Ц43ч}44 с сохраненным менструальным статусом (р = 0,009 и р = 0,015, соответственно). Обнаруженная связь, возможно, опосредована влиянием эстрогена на пролиферацию клеток. Эти данные говорят о том, что хромосомные аберрации играют значительную роль в процессах злокачественной трансформации эпителия молочной железы.

В результате анализа с помощью биологического микрочипа были получены профили метилирования 1260 Срв-сайтов, относящихся к 730 генам. Нами был проведен межгрупповой сравнительный анализ дифференциально метилированных генов. В группе доброкачественных новообразований дифференциально метилированными по отношению к контрольной группе оказались гены, регулирующие клеточную пролиферацию и мобильность клеток. В тканях со злокачественным фенотипом дифференциальное метилирование по сравнению с контрольной группой наблюдалось в генах, ответственных за клеточную дифференциацию и пролиферацию, а также за фосфорилирование белков и мобильность клеток. Полученные результаты являются ожидаемыми, так как изменение эпигенетического статуса выявленных генов обуславливает развитие характерных признаков злокачественных клеток. При сравнении доброкачественных и злокачественных новообразований выявлено, что образцы из группы с РМЖ характеризуются высоким уровнем эпигенетической нестабильности. При сравнении тканей молочной железы с доброкачественными пролифератив-ными процессами и тканей регионарных лимфоузлов с метастазами обнаружена

высокая сходность образцов, входящих в данные группы. Исходя из вышеперечисленных данных можно предположить, что ткани с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в регионарные лимфоузлы характеризуются относительно низким уровнем эпигенетической нестабильности по сравнению с опухолевыми тканями. Кроме того, нами было обнаружено увеличение числа дифференциально метилированных CpG-сайтов в группе злокачественных новообразований по сравнению с доброкачественными (р < 0,0001), тогда как при сравнении опухолевых тканей с метастазами в регионарные лимфатические узлы, напротив, было выявлено уменьшение числа дифференциально метилированных локусов (р< 0,0001). Полученные данные указывают на возможную общность профиля метилирования ДНК в тканях с доброкачественными пролиферативными процессами и регионарных лимфатических узлах с метастазами.

С целью проверки данного предположения был проведен иерархический кластерный анализ. В результате был выявлен кластер образцов с высокой степенью сходства по профилю метилирования ДНК, в которой представленность тканей с доброкачественными пролиферативными процессами и регионарными лимфогенными метастазами оказалась статистически значимо выше, чем во всей остальной выборке (р < 0,001). Полученные данные свидетельствуют о том, что ткани с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в регионарные лимфоузлы являются относительно близкими с точки зрения рисунка метилирования ДНК, хотя и являются разными по гистологической характеристике и локализации.

Объяснить данный факт с позиций традиционной линейной гипотезы ме-тастазирования (Fidler, Kripke, 1977) не представляется возможным, поскольку в этом случае должна была наблюдаться относительная общность профиля метилирования между группами с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, а также между группами со злокачественными новообразованиями и метастазами. Если исходить из линейной гипотезы, то весь спектр дифференциально метилированных генов, выявленных при сравнении вышеперечисленных групп, должен наблюдаться при сравнении доброкачественных новообразований и метастазов, чего не было зарегистрировано в проведенном нами исследовании.

В то же время, полученные результаты находятся в хорошем соответствии с гипотезой параллельного метастазирования (Schmidt-Kittler et al., 2003), объясняющей возможность обособления клонов клеток с метастатическим потенциалом на начальных этапах злокачественной трансформации. Эта гипотеза уже нашла подтверждение на цитогенетическом (Klein, Holzel, 2006) и экспрес-сионном (Ramaswamy et al., 2003) уровне. В проведенном нами исследовании впервые получено эпигенетическое свидетельство в пользу гипотезы параллельного метастазирования. Интересно, что отличие выделенного кластера тканей от всей остальной группы обследованных образцов было обусловлено дифференциальным метилированием всего одной группы генов, продукты ко-

торых являются рецепторами, связанными с в-белками, и существенными для миграционной активности клеток.

Обобщая результаты цитогенетического и эпигенетического разделов проведенного исследования, логично предположить, что на начальных стадиях канцерогенеза клетки-предшественники опухоли обладают фенотипом доброкачественного новообразования, однако уже имеют некоторое селективное преимущество перед окружающими нормальными тканями, что приводит к постепенному накоплению данного клона в органе. Это подтверждается экспериментальными данными. Так, например, показано существование вокруг первичной опухоли так называемых «полей канцеризации», являющихся гистологически нормальными тканями молочной железы, клетки которых имеют генетические нарушения, ассоциированные с раком (ВгаакИш е1 а1., 2003). В определенный момент времени возникает субклон, у которого за счет какого-либо генетического и/или эпигенетического нарушения происходит инициация геномной нестабильности, что приводит к ускорению процессов малигнизации

клона клеток клона клеток забора

с раковым с метастатическим материала

фенотипом фенотипом

Рис. 3. Динамика развития геномной нестабильности при раке молочной железы

Скорее всего, обособление клона клеток, ответственных за развитие метастазов в регионарные лимфатические узлы происходит спустя относительно небольшой промежуток времени после возникновения клона злокачественных клеток. В пользу непродолжительности данного отрезка времени -12) свидетельствует тот факт, что рисунок метилирования ДНК тканей из группы с

лимфогенными метастазами схож с рисунком метилирования в группе образцов с доброкачественными изменениями, т.е. обособление клона клеток с метастатическим потенциалом происходит до кардинального изменения рисунка метилирования в первичном опухолевом узле вследствие различных аберрантных эпигенетических модификаций.

В результате проведенных цитогенетических исследований было показано, что в образцах с РМЖ и метастазами в РЛУ число общих хромосомных перестроек значимо выше, чем в образцах с доброкачественными и злокачественными новообразованиями. Это может указывать на то, что вероятность возникновения хромосомных аномалий увеличивается после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные. Напротив, в результате анализа статуса метилирования было выявлено, что группы образцов с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в регионарные лимфатические узлы являются относительно близкими с точки зрения рисунка метилирования ДНК. Это свидетельствует о том, что выявленные в данных группах аномалии метилирования образуются до разделения клеточных клонов с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами.

Таким образом, полученные в результате проведенного молекулярно-цитогенетического и эпигенетического исследования данные позволяют сделать предположение о том, что эпигенетические аномалии являются первичными по отношению к хромосомным аберрациям при развитии геномной нестабильности при раке молочной железы. Основанием для такого предположения является тот факт, что аномалии метилирования, характерные для метастатических клонов, возникают еще в доброкачественных новообразованиях, тогда как большинство хромосомных перестроек, характерных для образцов с РМЖ и метастазами, образуются уже после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные.

ВЫВОДЫ

1. В тканях молочной железы с доброкачественными пролиферативными процессами наблюдается превалирование делеций над амплификациями по сравнению со злокачественными новообразованиями(ОК = 3,96; 95 % CI: 1,84-8,64; р = 0,0001) и метастазами в регионарные лимфатические узлы (OR= 10,61; 95 % CI: 3,78-30,67; р < 0,0001).

2. Число общих хромосомных сегментов, затронуть« хромосомными аберрациями, в опухолевых тканях и регионарных лимфатических узлах с метастазами статистически значимо выше, чем в тканях молочной железы с доброкачественными и злокачественными новообразованиями (OR = 2,98; 95 % CI 1,36-6,70; р = 0,002).

3. Амплификации сегментов 1р31 и Iq24-q25 при раке молочной железы статистически значимо чаще регистрируются в опухолях Т2-Т4 (р = 0,022 и р = 0,028, соответственно), тогда как делеция 16ql2.1 - в опухолях Ti по TNM-классификации (р = 0,028). У женщин с сохраненным менструальным статусом при раке молочной железы чаще выявляются амплификации сегментов lq42 и Iq43-q44 по сравнению с пациентками, находящимися в менопаузе (р = 0,009 и р = 0,015, соответственно).

4. Число дифференциально метилированных CpG-сайтов в опухолевой ткани статистически значимо увеличивается по сравнению с группой образцов с доброкачественными новообразованиями (р < 0,0001) за счет усиления процессов гиперметилирования ДНК. В то же время, при сравнении образцов с РМЖ и метастазами в РЛУ наблюдается снижение числа дифференциально метилированных CpG-сайтов (р < 0,0001).

5. Впервые установлено, что у больных раком молочной железы ткани молочной железы с доброкачественными пролиферативными процессами и ткани регионарных лимфоузлов с метастазами являются относительно близкими по профилю метилирования ДНК. Отличие доброкачественных новообразований молочной железы и метастазов в регионарные лимфатические узлы от опухолевых тканей обусловлено дифференциальным метилированием генов, относящихся по молекулярным функциям к рецепторам, связанным с G-белками.

6. Метилирование промоторных регионов генов ингибиторов циклин-зависимых киназ {pl4ARF и CDKN2B) является одним из механизмов эпигенетической инактивации ретинобластомного пути регуляции клеточного цикла при раке молочной железы, при этом зависимости уровня хромосомных аберраций от статуса метилирования генов RBI, p!4ARF и CDKN2B не обнаруживается.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Скрябин H.A., Лебедев И.Н., Толмачёва E.H., Чердынцева Н.В. Роль метилирования генов ингибиторов циклин-зависимых киназ в эпигенетической инактивации ретинобластомного пути регуляции клеточного цикла при раке молочной железы // Якутский медицинский журнал. 2009. Т. 26. №2. С. 89-91.

2. Скрябин H.A., Лебедев И.Н., Черемных А.Д., Суханова H.H., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Анализ хромосомных нарушений при доброкачественных и злокачественных новообразованиях молочных желез с помощью сравнительной геномной гибридизации // Сибирский онкологический журнал. 2010. Т. 41. №5. С. 22-26.

3. Скрябин H.A., Лебедев И.Н., Толмачева E.H., Чердынцева Н.В. Эпигенетический аспект возможности раннего лимфогенного метастазирования при раке молочной железы // Вопросы онкологии. 2011. Т. 57. № 6. С. 717-721.

4. Скрябин H.A., Лебедев И.Н., Толмачева E.H., Вторушин С.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Хромосомные аномалии как возможные прогностические маркеры при раке молочной железы // Генетика человека и патология: актуальные проблемы современной цитогенетики. Сборник научных трудов / Под ред. В.П. Пузырёва. Выпуск 9. Томск: «Печатная мануфактура». 2011. С. 126-131.

5. Скрябин H.A., Толмачёва E.H., Москвичёв И.И., Лебедев И.Н., Чердынцева Н.В. Взаимодействие хромосомных и эпигенетических нарушений при раке молочной железы // Опыт научно-технического и инновационного сотрудничества Томской области и Тайваня: Сборник материалов Сибирско-Тайваньского Форума: В 2 т. Томск, 16-17 сентября 2009 г. Т. 2. Томск: Томский государственный университет. 2009. С. 128-129.

6. Скрябин H.A., Черемных А.Д., Лебедев И.Н., Чердынцева Н.В. Цитогене-тические маркеры рака молочной железы // Вопросы онкологии. 2010. Т. 56. № 2. Приложение. С. 42.

7. Скрябин H.A., Черемных А.Д., Лебедев И.Н., Стахеева М.Н., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Сравнительная геномная гибридизация в диагностике хромосомных аберраций при доброкачественных пролиферативных процессах и злокачественных новообразованиях молочной железы // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». Под редакцией В.И. Покровского. Москва. 2010. Т. 4. С. 123-125.

8. Скрябин H.A., Лебедев И.Н., Толмачева E.H., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Профиль метилирования ДНК при доброкачественных пролиферативных процессах и злокачественных новообразованиях молочной железы // Вопросы онкологии. Материалы VII Российской конференции по фундаментальной онкологии. 2011. № 2. Т. 57. С. 58-59.

9. Скрябин H.A., Лебедев И.Н., Чердынцева Н.В. Эпигенетический компонент возможности раннего лимфогенного метастазирования при раке молочной железы // Медицинская генетика. Материалы конференции «Актуальные проблемы онкогенетики». 2011. Т. 10 №10. С. 21-22.

10. Скрябин H.A., Малиновская Е.А. Однородность профиля метилирования ДНК в тканях с доброкачественными пролиферативными процессами молочных желез и метастазами в регионарные лимфатические узлы // Сибирский онкологический журнал. 2011. Приложение 1. С. 106-107.

11. Skryabin N.A., Lebedev I.N., Cherdyntseva N.V. Similarity of DNA methyla-tion profile in tissues with benign breast disorders and lymph nodes metastasis in patients with breast cancer // European Journal of Human Genetics. 2011. V. 19. Suppl. 2. P. 239.

Тираж 120 экз. Заказ 1121. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел.(3822) 533018.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Скрябин, Николай Алексеевич

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Канцерогенез.

1.2 Генетические концепции канцерогенеза.

1.2.1 Мутационная концепция канцерогенеза.

1.2.2 Анеуплоидная концепция канцерогенеза.

1.2.3 Эпигенетическая концепция канцерогенеза.

1.3 Хромосомные аномалии при раке молочной железы.

1.4 Метилирование ДНК при раке молочной железы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материал.

2.2 Морфологическое исследование.

2.3 Выделение ДНК.

2.4 Сравнительная геномная гибридизация.

2.4.1 Получение препаратов метафазных хромосом.

2.4.2 Мечение тестируемой и контрольной ДНК.

2.4.3 Постановка гибридизации.

2.4.4 Детекция гибридизационных сигналов.

2.5 Анализ статуса метилирования ДНК с помощью биологического микрочипа.

2.6 Метилспецифическая ПЦР с бисульфитной модификацией ДНК.

2.6.1 Бисульфитная модификация ДНК.

2.6.2 Метилспецифическая ПЦР.

2.6.3 Обработка ДНК СрО-метилазой.

2.7 Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Молекулярно-цитогенетический анализ тканей молочной железы и регионарных лимфатических узлов.

3.1.1 Спектр и частота хромосомных аномалий тканей молочной железы и регионарных лимфатических узлов.

3.1.2 Корреляции хромосомных аберраций и клинических параметров у больных раком молочной железы.

3.2 Изучение статуса метилирования ДНК в тканях молочной железы и регионарных лимфатических узлов.

3.2.1 Межгрупповой анализ дифференциального метилирования генов в тканях молочной железы и регионарных лимфатических узлов с метастазами.

3.2.2 Оценка статуса метилирования генов контроля клеточного цикла ЯВ1, рМАШ? СОШ2В.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль хромосомных нарушений и аберрантного метилирования ДНК в развитии геномной нестабильности при раке молочной железы"

Высокая частота заболеваемости и смертности от рака молочной железы (РМЖ) женщин во всем мире обуславливает повышенный интерес исследователей к данной патологии (Комарова, 2008; Давыдов, Аксель, 2009). Однако как этиология, так и патогенез данного заболевания до сих пор остаются не до конца изученными, поскольку генетически обусловленные случаи РМЖ ограничиваются только 5-8 % (Карпухин и др., 2002; Любченко и др., 2007; Коваленко и др., 2008; Foulkes, 2008). На данный момент общепринятой является мутационная концепция канцерогенеза, которая подразумевает, что за инициацию и прогрессию опухоли ответственны генные мутации. При этом другие нарушения генетического аппарата клеток, такие как хромосомные аберрации и эпигенетические аномалии, отходят на второй план, рассматри-ваясь как следствие возрастающей геномной нестабильности, хотя они, также как и генные мутации, являются неотъемлемым компонентом неопластической трансформации.

Нарушение экспрессии генов, ответственных за репарацию ДНК, является одним из ранних событий канцерогенеза. Репарация ДНК осуществляется двумя основными системами: пострепликативной репарацией и репарацией двухцепочечных разрывов. С этой точки зрения, все опухоли классифицируются на RER+ и RER- (RER - аббревиатура от слов «Replication Error») (Новик и др., 2004). К RER+ относятся раки, которые обусловлены нарушениями пострепликативной репарации. В этом случае наблюдается микроса-теллитная нестабильность. Клетки опухолей с фенотипом RER+ в большинстве случаев диплоидны и хромосомные аберрации не являются для них характерными. При RER- раках, напротив, наблюдается высокая частота хромосомных аберраций, которая обусловлена ошибками репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Моделью RER+ неоплазий является колоректальный рак, тогда как моделью RER- - злокачественные новообразования молочной железы (Новик и др., 2004). Исходя из этого, можно предположить, что нарушения

J « «и структуры и активности генов, ответственных за репарацию двуцепочечных разрывов, могут приводить к развитию хромосомной нестабильности при новообразованиях молочных желез.

На сегодняшний день встречаются различные мнения по поводу роли хромосомных аберраций в процессах малигнизации. В 1999 году Питер Дью-сберг сформулировал анеуплоидную гипотезу канцерогенеза, согласно которой возникновение и рост опухоли в большей степени связаны с ошибками в распределении хромосом, чем с накоплением генных мутаций (Duesberg, 1999). Основные положения данной гипотезы подтверждаются рядом исследований, в которых продемонстрировано, что хромосомные аномалии являются одними из ранних генетических нарушений, приводящих к индукции нестабильности генома клетки и, как следствие, к её злокачественной трансформации (Sneige et al., 2006; Lv et al., 2008; Gao et al., 2009). Существует обширная база данных «Progenetix» (www.progenetix.com), в которой на настоящий момент (ноябрь 2011 г.) собраны результаты 954 молекулярно-' цитогенетических исследований 29069 опухолей различной локализации, в том числе 2127 случаев РМЖ, демонстрирующие существенный вклад хромосомных аберраций в развитие онкологических заболеваний. В то же время, в ряде случаев хромосомные аномалии рассматриваются как следствие различных генетических и эпигенетических нарушений, таких как аномалии сегрегации центросом и дисфункции теломер, точковые мутации в различных онкогенах и онкосупрессорах, гиперметилирование генов, ответственных за репарацию ДНК и регуляцию клеточного цикла (Соколенко и др., 2008; Salisbury, 2001; Donate, Blasco, 2011).

6 ь инициаторов опухоли в стволовых клетках или клетках-предшественниках (Feinberg et al., 2006). Не вызывает сомнения и тот факт, что эпигенетические нарушения являются важнейшими атрибутами клетки с уже инициированным злокачественным процессом. Следовательно, изучение эпигенетического статуса генома при раке является необходимым элементом для более глубокого понимания механизмов злокачественной трансформации и для выявления нового поколения биомаркеров с целью ранней диагностики онкологических заболеваний. В основе эпигенетических изменений генной экспрессии лежат стабильные, наследуемые, но потенциально обратимые ковалентные модификации хроматина, такие как метилирование цитозиновых оснований ДНК и химические изменения гистонов (ацетилирование, метилирование, убиквити-нирование, фосфорилирование). Аномалии метилирования ДНК при раке представлены в основном гиперметилированием промоторных регионов он-косупрессорных генов, а так же глобальным гипометилированием всего генома. Согласно результатам некоторых исследований, нарушения статуса метилирования возникают задолго до развития клинически выраженного рака (Euhus et al., 2008; Park et al., 2011). Актуальность изучения эпигенетических аномалий обуславливается также работами, которые свидетельствуют о большом диагностическом потенциале аберрантного метилирования внеклеточной циркулирующей ДНК в периферической крови больных с онкологическими заболеваниями (Рыкова и др., 2008; Тамкович и др., 2008; Vlassov et al., 2010).

Вопросы о первичности и взаимосвязи генных, хромосомных, либо эпигенетических аномалий в индукции геномной нестабильности в процессе развития онкологических заболеваний, в том числи и РМЖ, остаются открытыми и являются предметом дискуссий (Имянитов, 2010; Lotem, Sachs, 2002; Slattery et al., 2011). Также возникают вопросы, касающиеся роли вышеуказанных нарушений генома в развитии определенных признаков злокачественной трансформации клеток, например, метастазирования. Все вышесказанное указывает на актуальность исследований, которые раскрывают вопро7 сы патогенетики РМЖ как с цитогенетических, так и с эпигенетических позиций.

Цель работы: Оценить вклад хромосомных нарушений и аномалий метилирования ДНК в развитие геномной нестабильности при раке молочной железы.

Задачи исследования:

3. Выявить спектр дифференциально метилированных последовательностей ДНК в тканях молочной железы с доброкачественными и злокачественными новообразованиями и регионарных лимфатических узлах с метастазами.

Научная новизна:

В ходе настоящего исследования впервые определены особенности цитогенетических и эпигенетических нарушений, обуславливающих развитие геномной нестабильности при раке молочной железы. Выявлено, что существенное увеличение частоты хромосомных аберраций происходит после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные. Показана протективная роль делеции хромосомного субсегмента ^12.1 для больных раком молочной железы. С помощью широкогеномного анализа эпигенетиче8 ского статуса 807 онкогенов и опухолесупрессорных генов впервые установлено, что ткани молочной железы с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазы в регионарные лимфатические узлы являются сходными по профилю метилирования ДНК, что указывает на обособление клона клеток с метастатическим фенотипом на ранних этапах злокачественной трансформации.

Теоретическая и практическая значимость: Полученные результаты расширяют представления о цитогенетических и эпигенетических механизмах прогрессии рака молочной железы. Комбинированное использование методов широкогеномного анализа профиля метилирования ДНК и молекуляр-но-цитогенетического анализа хромосомных аберраций может быть применено при комплексных молекулярно-генетических исследованиях злокачественных новообразований других локализаций. На основании результатов анализа связи цитогенетических и эпигенетических аномалий в опухолевой ткани с патогенетически значимыми характеристиками злокачественного процесса могут быть разработаны дополнительные критерии оценки клинического течения рака молочной железы.

Положения, выносимые на защиту:

3. Делеция хромосомного субсегмента 16ql2.1 в неопластических клетках у больных раком молочной железы ассоциирована с опухолями меньших размеров.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Скрябин, Николай Алексеевич

выводы

1. В тканях молочной железы с доброкачественными пролиферативными процессами наблюдается превалирование делеций над амплификациями по сравнению со злокачественными новообразованиями (OR = 3,96; 95 % CI: 1,84-8,64; р = 0,0001) и метастазами в регионарные лимфатические узлы (OR= 10,61; 95 % CI: 3,78-30,67; р<0,0001).

2. Число общих хромосомных сегментов, затронутых хромосомными аберрациями, в опухолевых тканях и регионарных лимфатических узлах с метастазами статистически значимо выше, чем в тканях молочной железы с доброкачественными и злокачественными новообразованиями (OR = 2,98; 95 % CI: 1,36-6,70; р = 0,002).

6. Метилирование промоторных регионов генов ингибиторов циклин-зависимых киназ (pl4ARF и CDKN2B) является одним из механизмов эпигенетической инактивации ретинобластомного пути регуляции клеточного цикла при раке молочной железы, при этом зависимости уровня хромосомных аберраций от статуса метилирования генов RBI, pl4ARF и CDKN2B не обнаруживается.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своим научным руководителям - заведующему лабораторией цитогенетики НИИ медицинской генетики СО РАМН, доктору биологических наук Игорю Николаевичу Лебедеву и профессору кафедры паталогической анатомии СибГМУ, доктору медицинских наук Марине Викторовне Завьяловой за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах выполнения диссертационной работы.

Автор искренне признателен научным сотрудникам лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики к.б.н. Екатерине Николаевне Толмачёвой за помощь в освоении метода метилспецифической ПЦР, м.н.с. Александру Дмитриевичу Черемных за обучение методике СвН, к.б.н. Елене Александровне Саженовой, к.б.н. Татьяне Владимировне Никитиной, к.б.н. Владимиру Анатольевичу Тимошевскому, к.б.н. Станиславу Анатольевичу Васильеву, к.б.н. Кашеваровой Анне Александровне за помощь в проведении экспериментальной части работы, за участие в обсуждении результатов и за моральную поддержку. Автор благодарен врачу-генетику Генетической клиники института к.б.н. Наталье Нестеровне Сухановой за помощь в проведении цито-генетического анализа, сотрудникам лаборатории иммунологии, отделения общей онкологии, отделения патологической анатомии НИИ онкологии СО РАМН за помощь в наборе и характеристике клинического материала, а также сотрудникам ЗАО «Геноаналитика» за помощь в проведении гибридизации на метилочипе и статистическую обработку первичных результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хромосомные аномалии и нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов являются одними из характерных признаков клеток рака молочной железы (Рубцов, Карамышева, 2000; Залетаев и др., 2004; Feinberg, 2010; Vlassov et al., 2010). Настоящая работа была направлена на цитогенети-ческую и эпигенетическую характеристику тканей с доброкачественными пролиферативными процессами, злокачественными новообразованиями молочной железы и тканей регионарных лимфоузлов с метастазами. Выбор данного направления был обусловлен развитием представлений о роли хромосомных аберраций и аномалий метилирования ДНК в ранних процессах канцерогенеза, а также противоречивостью представленных в литературе данных относительно значимости различных механизмов в инициации процессов злокачественной трансформации (Соколенко и др., 2008; Duesberg, 1999; Lotem, Sachs, 2002; Feinberg et al., 2006; Easton et al., 2007; Slattery et al., r

2011). Также актуальность изучения хромосомных и эпигенетических аномалий обуславливается тем, что остается не до конца понятной их роль в прогрессии канцерогенеза, в частности относительно их вклада в развитие определенных признаков злокачественной трансформации, например, в развитие процессов метастазирования. Представленные в литературе данные по этим вопросам противоречивы и неоднозначны для формулирования каких-либо выводов. Поэтому необходимо проведение анализа, который направлен на выявление как цитогенетических, так и эпигенетических аномалий в тканях с различной гистологической картиной, что может позволить выявить их воздействие на генетический аппарат клетки в ходе процессов канцерогенеза.

Для анализа хромосомных аномалий нами был выбран метод сравнительной геномной гибридизации, поскольку использование классических цитогенетических методов в изучении солидных опухолей ограничено в силу ряда объективных причин. Для изучения профиля метилирования ДНК был выбран биологический микрочип «GoldenGate Methylation Cancer Panel I», который позволяет одномоментно анализировать 1505 СрО сайтов, принадлежащих 807 генам. Далее мы анализировали гены, участвующие в регуляции клеточного цикла {КВ1, рМАЛД СОКЫ2В) с помощью метилспецифической-ПЦР.

В ходе первого этапа с помощью сравнительной геномной гибридизации были оценены спектр и частота хромосомных аберраций в тканях с нормальным эпителием, доброкачественными и злокачественными новообразованиями, а также в регионарных лимфатических узлах с метастазами. В результате был выявлен широкий спектр хромосомных аберраций. Кроме того, при внутрииндивидуальном сравнительном анализе общих хромосомных сегментов с аномалиями между разными комбинациями тканей было показано, что в образцах с РМЖ и метастазами в РЛУ число общих хромосомных перестроек значимо выше, чем в образцах с доброкачественными и злокачественными новообразованиями (СЖ=2,98; 95% С1: 1,36-6,70; р=0,002). В данном случае возможность случайного совпадения минимальна, поскольку образцы различных тканей были взяты у одних и тех же пациентов, что позволяет рассматривать данные ткани как разные ветви одного эволюционного процесса. То, что в образцах с РМЖ и метастазами в РЛУ число общих хромосомных аберраций выше, может указывать на то, что вероятность возникновения хромосомных аномалий увеличивается после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные.

Далее нами был проведен анализ ассоциаций выявленных хромосомных аномалий с клиническими характеристиками больных РМЖ. Наибольшее количество ассоциаций было выявлено при сравнении распределения частоты хромосомных аномалий между больными со степенью рака Т1 и Т2-4. Амплификации сегментов 1р31 и \q24-q25 коррелировали с опухолями, соответствующими Т2.4 по ТММ классификации, т.е. были ассоциированы с большими размерами опухоли (р = 0,022 и р = 0,028, соответственно), в то время как у пациенток с делецией субсегмента ^12.1 чаще наблюдался клинически благоприятный локализованный процесс заболевания по сравнению с боль

136 ными без делеции (р = 0,028). Наличие корреляции амплификации сегментов 1р31 и Iq24-q25 может указывать на то, что в них локализованы онкогены, играющие значительную роль в накоплении клеточной массы. Что касается ассоциации делеции 16ql2.1 с опухолями малых размеров, то в данном случае возникает вопрос о возможной протективной роли данной хромосомной аномалии в динамике развития злокачественного процесса. Протективный эффект может быть результатом наличия в данном субсегменте высокопене-трантного онкогена, делеция которого и обусловливает медленное накопление клеточной массы. Кандидатные гены с предполагаемыми онкогенными свойствами - TNRC9 и LOC64S714, локализованные в данном субсегменте, были выявлены в результате полногеномного ассоциативного исследования рака молочной железы (Easton et al., 2007).

В проведенном нами исследовании также были выявлены ассоциации амплификаций сегментов lq42 и Iq43-q44 с сохраненным менструальным статусом (р = 0,009 и р = 0,015, соответственно). Обнаруженная связь, возможно, опосредована влиянием эстрогена на пролиферацию клеток. Эти данные говорят о том, что хромосомные аберрации играют значительную роль в процессах злокачественной трансформации эпителия молочной железы

В результате анализа с помощью биологического микрочипа были получены профили метилирования 1260 CpG-сайтов, относящихся к 730 генам. Нами был проведен межгрупповой сравнительный анализ дифференциально метилированных генов. В результате проведенного анализа были выявлены гены, дифференциально метилированные в исследованных группах, а также проведена их группировка по биологическим функциям, согласно базе данных «Gene Ontology». В группе доброкачественных новообразований дифференциально метилированными по отношению к контрольной группе оказались гены, регулирующие клеточную пролиферацию и мобильность клеток. При этом наблюдается неоднозначное влияние на данные процессы, что может объясняться тем, что в тканях с доброкачественными новообразованиями могут присутствовать мигрирующие клетки со злокачественным фенотипом.

137

В группе образцов со злокачественным фенотипом дифференциальное метилирование в сравнении с контрольной группой наблюдалось в генах, ответственных за клеточную дифференциацию и пролиферацию, а также за фосфорилирование белков и мобильность клеток. Полученные результаты являются ожидаемыми, так как метилирование или гипометилирование выявленных генов обуславливает развитие характерных признаков злокачественных клеток.

При сравнении доброкачественных и злокачественных новообразований выявлено, что образцы из группы с РМЖ характеризуются высоким уровнем эпигенетической нестабильности. При сравнении тканей молочной железы с доброкачественными пролиферативными процессами и тканей регионарных лимфоузлов с метастазами обнаружена высокая сходность образцов, входящих в данные группы. Исходя из вышеперечисленных данных можно предположить, что ткани с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в регионарные лимфоузлы характеризуются относительно низким уровнем эпигенетической нестабильности по сравнению с опухолевыми тканями. Кроме того, нами было обнаружено увеличение числа дифференциально метилированных Срв-сайтов в группе злокачественных новообразований по сравнению с доброкачественными (р < 0,0001), тогда как при сравнении опухолевых тканей с метастазами в регионарные лимфатические узлы, напротив, было выявлено уменьшение числа дифференциально метилированных локусов (р < 0,0001). Полученные данные указывают на возможную общность профиля метилирования ДНК в тканях с доброкачественными пролиферативными процессами и регионарных лимфатических узлах с метастазами.

138 выше, чем во всей выборке (р < 0,001). В образцах с РМЖ и нормальным эпителием профиль метилирования характеризовался высокой гетерогенностью. Полученные данные свидетельствуют о том, что группы образцов с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в регионарные лимфоузлы являются относительно близкими с точки зрения рисунка метилирования, хоть и являются разными по гистологической характеристике и локализации.

Далее нами проведен анализ генов, дифференциальное метилирование которых обусловило разделение образцов при кластерном анализе, в результате которого был выбран список генов, обусловивших разделение данных кластеров. В данной группе генов были широко представлены гены, по молекулярным функциям относящиеся к рецепторам, связанным с G-белками (р = 0,023). Аномалии метилирования данной группы генов показаны для клеток, обладающих способностью к миграции, т.е. для клеток с метастатическим потенциалом. То, что клетки с доброкачественным фенотипом оказались сходны с метастатическими клетками по профилю метилирования генов, ответственных за клеточную миграцию, может указывать на присутствие в тканях с доброкачественными пролиферативными процессами мигрирующих клеток со злокачественным фенотипом. Либо данная находка может указывать на то, что клетки доброкачественных новообразований могут обладать хемотаксическими свойствами.

Объяснить полученный результат с позиций традиционной линейной гипотезы метастазирования (Fidler, Kripke, 1977) не представляется возможным, поскольку в этом случае должна была наблюдаться относительная общность профиля метилирования между группами с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, а также между группами со злокачественными новообразованиями и метастазами. Если исходить из линейной гипотезы, то весь спектр дифференциально метилированных генов, выявленных при сравнении вышеперечисленных групп, должен наблюдаться при сравнении доброкачественных новообразований и метастазов, чего не было зарегистрировано в проведенном нами исследовании.

В то же время, полученные данные находятся в хорошем соответствии с гипотезой параллельного метастазирования (Schmidt-Kittler et al., 2003), объясняющей возможность обособления клонов клеток с метастатическим потенциалом на начальных этапах злокачественной трансформации. Эта гипотеза уже нашла подтверждение на цитогенетическом (Klein, Holzel, 2006) и экспрессионном (Ramaswamy et al., 2003) уровне. В проведенном нами исследовании впервые получено эпигенетическое свидетельство в пользу гипотезы параллельного метастазирования. Интересно, что отличие выделенного кластера тканей от всей остальной группы обследованных образцов было обусловлено дифференциальным метилированием всего одной группы генов, продукты которых являются рецепторами, связанными с G-белками, и существенными для миграционной активности клеток.

Обобщая результаты цитогенетического и эпигенетического разделов проведенного исследования, логично предположить, что на начальных стадиях канцерогенеза клетки-предшественники опухоли обладают фенотипом доброкачественного новообразования, однако уже имеют некоторое селективное преимущество перед окружающими нормальными тканями, что приводит к постепенному накоплению данного клона в органе. Это подтверждается экспериментальными данными. Так, например, показано существование вокруг первичной опухоли так называемых «полей канцеризации», являющихся гистологически нормальными тканями молочной железы, клетки которых имеют генетические нарушения, ассоциированные с раком (Braakhuis et al., 2003). В определенный момент времени (tj) возникает субклон, у которого за счет какого-либо генетического и/или эпигенетического нарушения происходит инициация геномной нестабильности, что приводит к ускорению процессов малигнизации (рис. 16).

Скорее всего, обособление клона клеток, ответственных за развитие метастазов в регионарные лимфатические узлы (t2), происходит спустя относи

140 тельно небольшой промежуток времени после возникновения клона злокачественных клеток. В пользу непродолжительности данного отрезка времени (tj -12) свидетельствует тот факт, что рисунок метилирования ДНК тканей из группы с лимфогенными метастазами схож с рисунком метилирования в группе образцов с доброкачественными изменениями, т.е. обособление клона клеток с метастатическим потенциалом происходит до кардинального изменения рисунка метилирования в первичном опухолевом узле вследствие различных аберрантных эпигенетических модификаций.

Поскольку в результате анализа статуса метилирования ДНК с помощью микрочипа было выявлено, что в образцах с доброкачественными пролифера-тивными процессами наблюдается дифференциальное метилирование генов, регулирующих клеточный цикл, а в результате цитогенетического анализа показано, что хромосомные аберрации начинают накапливаться после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные, нами был проведен более глубокий анализ ряда генов регулирующих клеточный цикл (RB1, pMARF и CDKN2B). Аберрантное метилирование онкосупрессорных генов pl4ARF и CDKN2B было зарегистрировано с частотой 70% и 13,5%, соответственно, тогда как метилирования RB1 отмечено не было. В большинстве случаев в исследованных образцах выявлялись и метилированные и немети-лированные последовательности локусов. Наличие только метилированных аллелей было зарегистрировано в гене pl4ARF в 13,5% случаев. По клинической характеристике группы с аномалиями метилирования не отличались от групп без эпимутаций.

Отсутствие метилирования гена RB1 и достаточно высокая частота аномального метилирования генов pl4ARF и CDKN2B соответствует результатам аналогичных исследований статуса метилирования этих генов при эпи-дермальном раке и лимфоме (Linda et al., 2006; Murao et al., 2006). Не исключено, что такая комбинация эпигенотипов исследованных генов, с одной стороны, может объясняться более высокой частотой метилирования генов ингибиторов циклин-зависимых киназ, по сравнению с геном RB1. С другой сто

141 роны, выявленная особенность может указывать на существование особых эпигенетических механизмов дисрегуляции клеточного цикла и поддержания стабильности генома при канцерогенезе, которые запускаются уже на уровне ингибиторов циклин-зависимых киназ.

В ходе проведенного исследования нами была изучена связь частоты хромосомных аберраций со статусом метилирования генов ретинобластомно-го пути регуляции клеточного цикла. Однако в результате проведенного исследования статистически значимых результатов не было выявлено. Отсутствие статистически значимых различий по частоте хромосомных перестроек между образцами тканей с аберрантным метилированием генов рМАШ? и СВКИ2В и образцами тканей без аномалий метилирования данных генов, может быть обусловлено тем, что гиперметилирование исследованных генов не оказывает существенного влияния на число хромосомных аберраций.

142 стабильности при раке молочной железы. Основанием для такого предположения является тот факт, что аномалии метилирования, характерные для метастатических клонов, возникают еще в доброкачественных новообразованиях, тогда как большинство хромосомных перестроек, характерных для образцов с РМЖ и метастазами, образуются уже после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Скрябин, Николай Алексеевич, Томск

1. Виттекинд К., Грин Ф.Л., Хаттер Р.В.П., и др. TNM Атлас // М.: МИА.2007.-С. 207-223.

2. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2007 г. // Вестник РОНЦ. 2009. -Т. 20. - № 3. - Прил. 1.-С. 1-156.

3. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельникова В.В., и др. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // Молекулярная биология. 2004. - Т. 38. - № 2. - С. 213223.

4. Землякова В.В., Жевлева А.И., Стрельников В.В., и др. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы // Молекулярная биология. 2003. - Т. 37. - № 4. - С. 696-703.

5. Имянитов E.H. Наследственный рак молочной железы // Практическая онкология. 2010. - Т. 11. - № 4. с. 258-266.

6. Карпухин A.B., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Поспехова Н.И. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы // Медицинская генетика. 2002. - Т. 1. -№ 6. - С. 254-261.

7. Комарова Л.Е. Скрининговая маммография рака молочной железы. За и против? // Сибирский онкологический журнал. — 2008. Приложение № 2.-С. 9-14.

8. Копнин Б.П. Неопластическая клетка: основные свойства и механизмы их возникновения // Практическая онкология. 2002. - Т. 3. - № 4. — С. 229-235.

9. Любченко JI.H., Портной С.М., Брюзгин В.В., Поспехова Н.И., Лушни-кова A.A., Карпухин A.B., Гарькавцева Р.Ф. Клинико-молекулярные аспекты наследственного рака молочной железы // Молекулярная медицина.-2007.-№ 1.-С. 8-15.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. -480 с.

11. Моисеенко В.М. «Естественная история» роста рака молочной железы // Практическая онкология. 2002. - Т. 3. - № 1. - С. 6-14.

12. Моисеенко В.М., Семиглазов В.Ф. Кинетические особенности роста рака молочной железы и их значение для раннего выявления опухоли // Маммология. 1997. -№ 3. - С. 3-12.

13. Назаренко С.А. Эпигенетические модификации генома и болезни человека // Медицинская генетика. 2004. - № 2. - С. 70-77.

14. Новик A.A., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза // М: ГЭОТАР МЕД. - 2004. - 224 с.

15. Новик A.B., Моисеенко В.М. Теоретические предпосылки адъювантной терапии злокачественных опухолей // Практическая онкология. 2007. -Т. 8. — №3.-С. 109-117.

16. Пендина A.A., Гринкевич В.В., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Метилирование ДНК универсальный механизм регуляции активности генов // Экологическая генетика. - 2004. - Т. 2. - С. 27-37.

17. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В. Цитогенетическая диагностика онкологических заболеваний // Клиническая онкология и гематология. 2000. -Т. 2.-С. 7-21.

18. Рыкова Е.Ю., Скворцова Т.Э., Хоффман А.Л., и др. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы. // Биомед. химия. 2008. - Т. 54. - № 1. - С. 94-103.148

19. Соколенко А.П., Розанов М.Е., Митюшкина Н.В., и др. Наследственные мутации при ранних, семейных и билатеральных формах рака молочной железы у пациенток из России // Сибирский онкологический журнал. 2008. -№ 3(27). - С. 43-49.

20. Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. Циркулирующие дезокси-рибонуютеиновые кислоты крови и их использование в медицинской диагностике // Молекуляр. биология. 2008. - Т. 42. - № 1. - С. 12-23.

21. Черезов А. Е. Общая теория рака: тканевый подход //М: Изд-во МГУ. -1997.-252 с.

22. Чойнзонов Е.Л., Писарева Л.Ф., Чердынцева Н.В., и др. Заболеваемость злокачественными новообразованиями в регионе Сибири и Дальнего Востока. Состояние онкологической службы и пути ее улучшения // Бюллетень СО РАМН. 2004. - № 2. - С. 41-47.

23. Amara K., Trimeche M., Ziadi S. et al. Prognostic significance of aberrant promoter hypermethylation of CpG islands in patients with diffuse large B-cell lymphomas //Ann. Oncol. 2008. - Vol. 19. - P. 1774-1786.

24. Axelrod R., Axelrod D.E., Pienta K.J. Evolution of cooperation among tumor cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006. Vol. 103(36). - P. 1347413479.

25. Barker P.E., Lau Y-F., Hsu T.C. A heterochromatic homogeneously staining region (HSR) in the karyotype of a human breast carcinoma cell line // Cancer Genet Cytogenet. 1980. - Vol. 1. - P. 311-319.

26. Baudis M. Genomic imbalances in 5918 malignant epithelial tumors: an explorative meta-analysis of chromosomal CGH data // BMC Cancer. 2007. -Vol. 7.-P. 226.

27. Bernards R., Weinberg R.A. A progression puzzle I I Nature. 2002. - Vol. 418.-P. 823.

28. Birgisdottir V., Stefansson O.A., Bodvarsdottir S.K., et al. Epigenetic silencing and deletion of the BRCA1 gene in sporadic breast cancer // Breast Cancer Research. 2006. - Vol. 8(4). - R38.

29. Blasco M.A., Funk W., Villeponteau B., et al. Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA //Science. 1995. -Vol. 269.-P. 1267-1270.

30. Boveri T. Zur Frage der entstehung maligner tumoren // Gustav Fischer Verlag. Jena, Germany. - 1914.

31. Braakhuis B.J.M., Tabor M.P., Kummer J.A., et al. A genetic explanation of slaughter's concept of field cancerization: evidence and clinical implications // Cancer Research. -2003. Vol. 63. -P. 1727-1730.

32. Brakensiek K., Langer F., Kreipe H., et al. Absence of p21CIPl, p27KIPl and p57KIP2 methylation in MDS and AML // Leukemia Research. 2005. -Vol. 29.-P. 1357-1360.

33. Brito-Babapulle V., Atkin N.B. Breakpoints in chromosome 1 abnormalities of 218 human neoplasms // Cancer Genet. Cytogenet. 1981. - Vol. 4. - P. 215-216.

34. Burbano R.R., Lima E.M., Khayat A.S., et al. Cytogenetic description of breast fibroadenomas: alterations related solely to proliferation? // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2001. - Vol. 34. - P. 10031006.

35. Costello J.F., Plass C. Methylation matters // J. Med. Genet. 2001. - Vol. 38.-P. 285-303.

36. Crawford N.P.S., Hunter K.W. Emerging concepts in metastasis / Genomic and Personalized Medicine / Ed. Willard H.F, Ginsburg G.S. San Diego.: Elsevier, 2009. Chapter 81. - P. 977-989.

37. Cui D., Jin G., Gao T., et al. Characterization of BRCAA1 and its novel antigen epitope identification // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2004. -Vol. 13(7).-P. 1136-1145.

38. Di Vinci A., Perdelli L., Banelli B., et al. pl6INK4a promoter methylation and protein expression in breast fibroadenoma and carcinoma // Int. J. Cancer.-2005.-Vol. 114.-P. 414-421.

39. Donate L.E., Blasco M.A. Telomeres in cancer and ageing // Phil. Trans. R. Soc. B 2011. - Vol. 366. - P. 76-84.

40. Dong S.M., Lee E.J., Jeon E.S., et al. Progressive methylation during the serrated neoplasia pathway of the colorectum // Mod. Pathology. 2005. -Vol. 18.-P. 170-178.

41. Duesberg P. Are centrosomes or aneuploidy the key to cancer? // Science. -1999. Vol. 284(5423). - P. 2091-2092.

42. Duesberg P., Rasnick D. Aneuploidy, the somatic mutation that makes cancer a species of its own // Cell Motility and the Cytoskeleton. 2000. - Vol. 47. -P. 81-107.

43. Dupont W.D., Page D.L., Pari F.F. et al. Long-term risk of breast cancer in women with fibroadenoma // N. Engl. J. Med. 1994. - Vol. 331(1). - P. 1015.

44. Dworkin A.M., Spearman A.D., Tseng S.Y., et al. Methylation is not a frequent "second hit" in tumors with germline BRCA mutations // Fam. Cancer. 2009. - Vol. 8(4). - 339-346.

45. Easton D.F., Pooley K.A., Dunning A.M. et al. Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci // Nature. 2007. -Vol. 447(7148).-P. 1087-1093.

46. Ehrlich M. DNA methylation in cancer: too much, but also too little // Oncogene. 2002. - Vol. 21. - P. 5400-5413.

47. Esteller M. Epigenetics in cancer // N. Engl. J. Med. 2008. - Vol. 358. - P. 1148-1159.

48. Esteller M., Cordon-Cardo C., Corn P.G., et al. pl4ARF silencing by promoter hypermethylation mediates abnormal intracellular localization of MDM2 // Cancer Res. 2001. - Vol. 61. - P. 2816-2821.

49. Euhus D.M., Bu D., Milchgrub S., et al. DNA methylation in benign breast epithelium in relation to age and breast cancer risk // Cancer Epidemiol. Bi-omarkers Prev. 2008. -Vol. 17(5).-P. 1051-1059.

50. Feil R., Charlton J., Bird A.P., et al. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing // Nucleic Acids Res. 1994. - Vol. 22(4). - P. 695-696.

51. Feinberg A.P. Genome-scale approaches to the epigenetics of common human disease // Virchows Arch. 2010. - Vol. 456. - P. 13-21.

52. Feinberg A.P., Cui H., Ohlsson R. DNA methylation and genomic imprinting: insights from cancer into epigenetic mechanisms // Seminars in Cancer Biol. 2002. - Vol. 12. - P. 389-398.

53. Feinberg A.P., Ohlsson R., Henikoff S. The epigenetic progenitor origin of human cancer // Nature Reviews. 2006. - Vol. 7. - P. 21-33.

54. Feinberg A.P., Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts // Nature. 1983. - Vol. 301(5895).-P. 89-92.

55. Feria R., Calo V., Cascio S., et al. Founder mutations in BRCA1 and BRCA2 genes //Annals of Oncology. -2007. Vol. 18. - P. 93-98.

56. Fidler I.J. Selection of successive tumour lines for metastasis // Nature New Biol.-1973.-Vol. 242.-P. 148-149.

57. Fidler I.J., Kripke M.L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumour // Science. 1977. - Vol. 197. - P. 893-895.

58. Foulkes W.D. Inherited susceptibility to common cancers // N. Engl. J. Med. -2008. Vol. 359, № 20. - P. 2143-2153.

59. Futreal P.A., Liu Q., Shattuck-Eidens D., et al. BRCA1 mutations in primary breast and ovarian carcinomas // Science. 1994. - Vol. 266(5182). - P. 120122.

60. Gao Y., Niu Y., Wang X., et al. Genetic changes at specific stages of breast cancer progression detected by comparative genomic hybridization // J. Mol. Med.-2009.-Vol. 87.-P. 145-152.

61. Geigl J.B., Obenauf A.C., Schwarzbraun T., et al. Defining "chromosomal instability" // Trends Genet. 2008. - Vol. 24(2). - P. 64-69.

62. Ghazani A.A., Arnesony N., Warren K., et al. genomic alterations in sporadic synchronous primary breast cancer using array and metaphase comparative genomic hybridization // Neoplasia. 2007. - Vol. 9(6). - P. 511-520.

63. Gonzalez-Gomez P., Bello M.J., Alonso M.E. et al. CpG island methylation status and mutation analysis of the RBI gene essential promoter region and protein-binding pocket domain in nervous system tumours // Br. J. Cancer. -2003.-Vol. 88(1).-P. 109-114.

64. Gray J.W. Evidence emerges for early metastasis and parallel evolution of primary and metastatic tumors / Cancer Cell. 2003. - Vol. 4. - P. 4-6.

65. Green A.R., Krivinskas S., Young P., et al. Loss of expression of chromosome 16q genes DPEP1 and CTCF in lobular carcinoma in situ of the breast // Breast Cancer Res. Treat. 2009. - Vol. 113. - P. 59-66.

66. Greenberg R.A. Recognition of DNA double strand breaks by the BRCA1 tumor suppressor network // Chromosoma. 2008. - Vol. 117(4). - P. 305317.

67. Greider C.W., Blackburn E.H. Identification of specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. // Cell. 1985. - Vol. 43. - P. 405-413.

68. Grunau C., Clark S.J., Rosenthal A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters // Nucl. Acids Res. -2001.-Vol. 29(13). -e65.

69. Hall J.M., Lee M.K., Newman B., et al. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21 // Science. 1990. - Vol. 250(4988). -P. 1684-1689.

70. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer // Cell. 2000. - Vol. 100(1).-P. 57-70.

71. Hansemann D. Ueber asymmetrische zelltheilung in epithelkrebsen und deren biologische bedeutung // Virchows Archiv. 1890. - Vol. 119(2). - P. 299-326.

72. Herman J.G., Jen J., Merlo A., et al. Hypermethylation-associated inactiva-tion indicates a tumor suppressor role for pi5 II Cancer Res. 1996. - Vol. 56.-P. 722-727.

73. ISCN (2009): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, L.G. Shaffer, M.L. Slovak, L.J. Campbell (eds); S. Karger, Basel 2009.

74. Jones C., Merrett S., Thomas V.A., et al. Comparative genomic hybridization analysis of bilateral hyperplasia of usual type of the breast // J. Pathol. -2003.-Vol. 199.-P. 152-156.

75. Jones P.A., Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer // Nat. Rev. Genet. 2002. - Vol. 3. - P. 415-428.

76. Kaiser U., Auerbach B., Oldenburg M. The neural cell adhesion molecule NCAM in multiple myeloma // Leuk. Lymphoma. 1996. - Vol. 20(5-6). -P. 389-395.

77. Karpf A., Jones D. Reactivating the expression of methylation silenced genes in human cancer // Oncogene. 2002. - Vol. 21. - P. 5496-5503.

78. Karray-Chouayekh S., Trifa R, Khabir A., et al. Aberrant methylation of RASSF1A is associated with poor survival in Tunisian breast cancer patients // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2010. - Vol. 136(2). - P. 203-210.

79. Kirui J.K., Xie Y., Wolff D.W., et al. G(3y signaling promotes breast cancer cell migration and invasion // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2010. - Vol. 333(2). -P. 393-403.

80. Kitazumi I., Tsukahara M. Regulation of DNA fragmentation: the role of caspases and phosphorylation // FEBS Journal. 2011. - Vol. 278. - P. 427441.

81. Klein С.A., Holzel D. Systemic cancer progression and tumor dormancy: Mathematical models meet single cell genomics // Cell Cycle. 2006. - Vol. 5.-P. 1788-1798.

82. Knudson A. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // Proc. Natl. Acad. Sci. 1971. - Vol. 68(4). - P. 820-823.

83. Kouniavsky G., Zeiger M.A. The role of telomeres and telomerase in endocrine tumors // Discov. Med. 2010. - Vol. 10(53). - P. 340-347.

84. Krop I., Maguire P., Lahti-Domenici J., et al. Lack of HIN-1 methylation in BRCA1-linked and "BRCAl-like" breast tumors // Cancer Res. 2003. -Vol. 63(9).-P. 2024-2027.

85. Kuznetsova E.B., Kekeeva T.V., Larin S.S., et al. Methylation of the BIN1 gene promoter CpG island associated with breast and prostate cancer // J. Carcinog. 2007. - Vol. 6. - P. 9.

86. Landis M.W., Pawlyk B.S., Li Т., et al. Cyclin Dl-dependent kinase activity in murine development and mammary tumorigenesis // Cancer Cell. 2006. -Vol. 9.-P. 13-22.

87. Larramendy M.L., Lushnikova Т., Bjorkqvist A.-M., et al. Comparative genomic hybridization reveals complex genetic changes in primary breast cancer tumors and their cell lines // Cancer Genet. Cytogenet. 2000. - Vol. 119.-P. 132-138.

88. Lewis C.M., Cler L.R., Bu D.W., et al. Promoter hypermethylation in benign breast epithelium in relation to predicted breast cancer risk // Clin. Cancer Res.-2005.-Vol. 11(1).-P. 166-172.

89. Li G., Su Q., Liu G-Q., et al. Skewed X chromosome inactivation of blood cells is associated with early development of lung cancer in females // Oncology Reports. 2006. - Vol. 16. - P. 859-864.

90. Li J., Wang K., Jensen T.D., et al. Tumor heterogeneity in neoplasms of breast, colon, and skin // BMC Research Notes. 2010. - Vol. 3. - P. 321.

91. Liang J., Chen P., Hu Z., et al. Genetic variants in trinucleotide repeatcontaining 9 (TNRC9) are associated with risk of estrogen receptor positive155breast cancer in a Chinese population // Breast Cancer Res. Treat. 2010. -Vol. 124.-P. 237-241.

92. Linda C.C., Charles G.E., Grossman S.A., et al. Epigenetic silencing of multiple genes in primary CNS lymphoma // Int. J. Cancer. 2006. - Vol. 119. -P. 2487-2491.

93. Liu Z., Yang L., Cui D.X., et al. Methylation status and protein expression of adenomatous polyposis coli (APC) gene in breast cancer // Chinese Journal of Cancer. -2007. Vol. 26(6). - P. 586-590.

94. Llambi F., Green D.R. Apoptosis and oncogenesis: give and take in the BCL-2 family // Curr. Opin. Genet. Dev. -2011. Vol. 21(1). - P. 12-20.

95. Loeb L.A., Springgate C.F., Battula N. Errors in DNA replication as a basis of malignant changes // Cancer Res. 1974. - Vol. 34(9). - P. 2311-2321.

96. Long J., Cai Q., Shu X., et al. Identification of a functional genetic variant at 16ql2.1 for breast cancer risk: results from the Asia Breast Cancer Consortium // PLoS Genet. 2010. - Vol. 6(6). - el001002.

97. Lose F., Duffy D.L., Kay G.F., et al. Skewed X Chromosome Inactivation and Breast and Ovarian Cancer Status: Evidence for X-Linked Modifiers of BRCA1 // J.Natl. Cancer Inst.-2008.-Vol. 100.-P. 1519-1529.

98. Lotem J., Sachs L. Epigenetics wins over genetics: induction of differentiation in tumor cells // Semin. Cancer Biol. 2002. - 12(5). - P. 339-346.

99. Lv S., Niu Y., Wei L., et al. Chromosomal aberrations and genetic relations in benign, borderline and malignant phyllodes tumors of the breast: a comparative genomic hybridization study // Breast Cancer Res. Treat. 2008. -Vol. 112.-P. 411-418.

100. MacDonald V.E., Howe L.J. Histone acetylation: where to go and how to get there // Epigenetics. 2009. - V. 4(3). - P. 139-143.

101. Merlo L.M.F., Wang L., Pepper J.W., et al. Polyploidization and Cancer // NY.: Springer Science. -2010. P. 1-10.

102. Miki Y., Katagiri T., Kasumi F., et al. Mutation analysis in the BRCA2 genein primary breast cancers // Nat. Genet. 1996. - Vol. 13. - P. 245-247.156

103. Miki Y., Nishido I., Horii A., et al. Disruption of the APC gene by a re-trotransposal insertion of LI sequence in a colon cancer // Can. Res. — 1992. -Vol. 52.-P. 643-645.

104. Montagna M., Santacatterina M., Torri A., et al. Identification of a 3 kb Alumediated BRCA1 gene rearrangement in two breast ovarian cancer families // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 4160-4165.

105. Morse B., Rotherg P.G., South V.J., et al. Insertional mutagenesis of the myc locus by a LINE-1 sequence in a human breast carcinoma // Nature. 1988. -Vol. 333.-P. 87-90.

106. Murao K., Kubo Y., Ohtani N., et al. Epigenetic abnormalities in cutaneous squamous cell carcinomas: frequent inactivation of the RBl/pl6 and p53 pathways //Brit. J. Dermatology. 2006. - Vol. 155. - P. 999-1005.

107. Narayan A., Ji W., Zhang X.Y., Marrogi A., et al. Hypomethylation of peri-centromeric DNA in breast adenocarcinomas // Int. J. Cancer. 1998. - Vol. 77.-P. 833-838.

108. Natrajan R, Lambros M.B., Geyer EC., et al. Loss of 16q in high grade breast cancer is associated with estrogen receptor status: Evidence for progression in tumors with a luminal phenotype? // Genes Chromosomes Cancer. 2009. - Vol. 48. - P. 351-65.

109. Nowell P.C., Hungerford D.A. Chromosome studies on normal and leukemic human leukocytes // J. Natl. Cancer Inst. 1960. - Vol. 25. - P. 85-109.

110. Nystromlahty M., Kristo P., Nicolaides N.C., et al. Founding mutations and Alu-mediated recombination in hereditary colon cancer // Nat. Med. 1995. -Vol. l.-P. 1203-1206.

111. Olumi A.F., Grossfeld G.D., Hayward S.W., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium // Cancer Res.- 1999.-Vol. 59-P. 5002-5011.

112. O'Reilly M.S., Holmgren L., Shing Y., et al. Angiostatin: A novel angiogene-sis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a lewis lung carcinoma // Cell. 1994. - Vol. 79(2). - P. 315-328.157

113. O'Riain C., O'Shea D.M., Yang Y., et al. Array-based DNA methylation profiling in follicular lymphoma // Leukemia. 2009. - Vol. 23(10). - P. 185866.

114. Otto S.P., Whitton J. Polyploid incidence and evolution // Annu. Rev. Genet. 2000. - Vol. 34. - P. 401-437.

115. Park S.Y., Kwon H.Y., Lee H.E., et al. Promoter CpG island hypermethyla-tion during breast cancer progression // Virchows Arch. 2011. - Vol. 458. -P. 73-84.

116. Pei X-H., Bai F., Smith M.D., et al. CDK inhibitor pl8INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis // Cancer Cell. 2009. - Vol. 15(5). - P. 389401.

117. Petersson C., Pandis N., Rizou H., et al. Karyotypic Abnormalities In Fibroadenomas Of The Breast // Int. J. Cancer. 1997. - Vol. 70. - P. 282-286.

118. Plass C., Soloway P.D. DNA methylation, imprinting and cancer // Eur. J. Hum. Genet. 2002. - Vol. 10. - P. 6-16.

119. Pogribny I.P., Beland F.A. DNA hypomethylation in the origin and pathogenesis of human diseases // Cell. Mol. Life Sci. 2009. - Vol. 66. - P. 2249-2261.

120. Pu R.T., Laitala L.E., Alii P.M., et al. Methylation Profiling of Benign and Malignant Breast Lesions and Its Application to Cytopathology // Mod. Pathol.-2003.-Vol. 16(11).-P. 1095-1101.

121. Qu G.Z., Grundy P.E., Narayan A., Ehrlich M. Frequent hypomethylation in Wilms tumor of pericentromeric DNA in chromosomes 1 and 16 // Cancer Genet. Cytogenet. 1999. - Vol. 109. - P. 34-39.

122. Ramaswamy S., Ross K.N., Lander E.S., Golub T.R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors // Nature Genetics. 2003. - Vol. 33. -P. 49-54.

123. Ramos E.AS., Camargo A.A., Braun K., et al. Simultaneous CXCL12 and ESR1 CpG island hypermethylation correlates with poor prognosis in sporadic breast cancer // BMC Cancer. 2010. - Vol. 10. - R 23.

124. Ravid K., Lu J., Zimmet J.M., Jones M.R. Roads to polyploidy: the megakaryocyte example // J. Cell Physiol. 2002. - Vol. 190(1). - P. 7-20.

125. Renwick A., Thompson D., Seal S., et al. ATM mutations that cause ataxia-telangiectasia are breast cancer susceptibility alleles // Nat. Genet. 2006. -Vol. 38.-P. 873-875.

126. Roncalli M., Bianchi P., Bruni B., et al. Methylation framework of cell cycle gene inhibitors in cirrhosis and associated hepatocellular carcinoma // Hepa-tology. 2002. - Vol. 36(2). - P. 427-432.

127. Rooney D.E., Czepulkowski B.H. Human cytogenetics. A practical approach // N-Y.: Oxford University Press. 1992. - Vol. 1. - P. 274.

128. Roylance R., Gorman P., Papior T., et al. A comprehensive study of chromosome 16q in invasive ductal and lobular breast carcinoma using array CGH // Oncogene. 2006. - Vol. 25. - P. 6544-655.

129. Ruiz-Narvaez E.A., Rosenberg L., Cozier Y.C., et al. Polymorphisms in the TOX3/LOC643714 locus and risk of breast cancer in African-American women // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2010. - Vol. 19(5). - P. 1320-1327.

130. Schmidt-Kittler O., Ragg T., Daskalakis A. From latent disseminated cells to overt metastasis: Genetic analysis of systemic breast cancer progression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003. Vol. 100(13). P. 7737-7742.

131. Schneider B.P., Miller K.D. Angiogenesis of Breast Cancer // J. Clin. Oncol. -2005.-Vol. 23.-P. 1782-1790.

132. Seal S., Thompson D., Renwick A., et al. Truncating mutations in the Fan-coni anemia J gene BRIP1 are low-penetrance breast cancer susceptibility alleles // Nat. Genet. 2006. - Vol. 38. - P. 1239-1241.

133. Secchiero P., Bertolaso L., Casareto L., et al. Human herpesvirus 7 infectioninduces profound cell cycle perturbations coupled to disregulation of cdc2159and cyclin B and polyploidization of CD4(+) T cells // Blood. 1998. - Vol. 92.-P. 1685-1696.

134. Sharma G., Mirza S., Parshad R., et al. CpG hypomethylation of MDR1 gene in tumor and serum of invasive ductal breast carcinoma patients // Clin. Biochem. -2010. Vol. 43(4-5). - P. 373-379.

135. Shetty P.J., Mowa S., Pasupuleti N., et al. Regulation of IGF2 transcript and protein expression by altered methylation in breast cancer // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2011. - Vol. 137(2). - P. 339-345.

136. Silva J., Domínguez G., Silva J.M., et al. Analysis of genetic and epigenetic processes that influence pl4ARF expression in breast cancer // Oncogene. -2001. Vol. 20. - P. 4586-4590.

137. Silver D.P, Dimitrov S.D, Feunteun J. Further evidence for BRCA1 com-munica-tion with the inactive X chromosome // Cell. 2007. - Vol. 128. - P. 991-1002.

138. Simpson D. J., Hibberts N. A., McNicol A. M., et al. Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RBI CpG island // Cancer Res. -2000. Vol. 60. - P. 1211-1216.

139. Sinha S., Chunder N., Mukherjee N., et al. Frequent Deletion and Methylation in SH3GL2 and CDKN2A Loci are Associated with Early- and Late-onset Breast Carcinoma // Annals of Surgical Oncology. 2008. - Vol. 15(4).-P. 1070-1080.

140. Smith L.E., Denissenko M.F., Bennett W.P., et al. Targeting of lung cancer mutational hotspots by polycyclic aromatic hydrocarbons // J. Nat. Cancer Inst. -2000. Vol. 92. - P. 803-811.

141. Soares J., Pinto A.E., Cunha C.V., et al. Global DNA Hypomethylation in Breast Carcinoma. Correlation with Prognostic Factors and Tumor Progression//Cancer. 1999.-Vol. 85(1).-P. 112-118.

142. Steinarsdottir M., Jonasson J.G., ViSarsson H., et al. Cytogenetic Changes in Nonmalignant Breast Tissue // Genes, Chromosomes & Cancer. 2004. -Vol. 41.-P. 47-55.

143. Stone C., McCabe N., Ashworth A. X-Chromosome Inactivation: X Marks the Spot for BRCA1 // Current Biology. 2003. - Vol. 13(2). - P. 63-64.

144. Storchova Z., Kuffer C. The consequences of tetraploidy and aneuploidy // Journal of Cell Science. -2008. Vol. 121(23). - P. 3859-3866.

145. Storchova Z., Pellman D. From Polyploidy To Aneuploidy, Genome Instability And Cancer // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. - Vol. 5(1). - P. 45-54.

146. Taneja P., Maglic D., Kai F., et al. Classical and Novel Prognostic Markers for Breast Cancer and their Clinical Significance // Oncology. 2010. - Vol. 4.-P. 15-34.

147. Tavassoli F.A., Devilee P. (Eds.): World Health Organization Classification of Tumours Pathology and Genetics of Tumours of the breast and female genital organs. IARC Press: Lyon 2003.

148. Thakur A., Rahman K.M.R., Wu J., et al. Aberrant Expression of X-Linked Genes RbAp46, Rsk4, and Cldn2 in Breast Cancer // Mol. Cancer Res.2007. — Vol. 5(2). P. 171-181.

149. Trent J.M. Cytogenetic and molecular biologic alterations in human breast cancer: a review // Breast Can. Res. and Treat. 1985. - Vol. 5. - P. 221229.

150. Trimis G., Chatzistamou I., Politi K., et al. Expression of p21wafl/Cipl in stromal fibroblasts of primary breast tumors // Human Molecular Genetics.2008. Vol. 17(22). - P. 3596-3600.

151. Vallian S., Sedaghat M., Nassiri I., et al. Methylation status of pl6INK4A tumor suppressor gene in Iranian patients with sporadic breast cancer // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2009. - Vol. 135(8). - P. 991-996.

152. Van Haastert P.J., Devreotes P.N. Chemotaxis: signalling the way forward // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2004. Vol. 5(8). - P. 626-634.

153. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Circulating nucleic acids as a potential source for cancer biomarkers. // Curr Mol Med. 2010. - Vol. 10(2). -P. 142-165.

154. Wang L., Hoque A., Luo R.Z., et al. Loss of the expression of the tumor suppressor gene ARHI is associated with progression of breast cancer // Clin. Cancer Res. -2003. Vol. 9. - P. 3660-3666.

155. Wei M., Xu J., Dignam J., et al. Estrogen receptor a, BRCA1, and FANCF promoter methylation occur in distinct subsets of sporadic breast cancers // Breast Cancer Res. Treat.-2008.-Vol. 111.-P. 113-120.

156. Weigelt B., Peterse J.L., Veer L.J. Breast cancer metastasis: Markers and Models // Nature Reviews. 2005. - Vol. 5. - P. 591-602.

157. Weischer M., Bojesen S.E., Tybjaerg-Hansen A., et al. Increased risk of breast cancer associated with CHEK2* 11 OOdelC // J. Clin. Oncol. 2007. -Vol. 25.-P. 57-63.

158. Widschwendter M., Jones P.A. DNA methylation and breast carcinogenesis // Oncogene. 2002. - Vol. 21. - P. 5462-5482.

159. Wu J., Lu L-Y., Yu X. The role of BRCA1 in DNA damage response // Protein Cell.-2010.-Vol. 1(2).-P. 117-123.

160. Xie Y., Wolff D.W., Wei T., et al. Breast cancer migration and invasion depend on proteasome degradation of regulator of G-protein signaling 4 // Cancer Res.-2009.-Vol. 69(14).-P. 5743-5751.

161. Xu S., Wei B., Zhang H., et al. Evidence of chromosomal alterations in pure usual ductal hyperplasia as a breast carcinoma precursor // Oncology Reports. 2008. - Vol. 19.-P. 1469-1475.

162. Yamazaki D., Kurisu S., Takenawa T. Regulation of cancer cell motility through actin reorganization // Cancer Sci. 2005. - Vol. 96. - R 379-386.

163. Yoshino A., Katayama Y., Ogino A., et al. Promoter hypermethylation profile of cell cycle regulator genes in pituitary adenomas // J. Neurooncol. 2007. -Vol. 83-P. 153-162.

164. Yu Y., Fujii S., Yuan J., et al. Epigenetic regulation of ARHI in breast and ovarian cancer cells // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. - Vol. 983. - P. 268-277.

165. Yuan J., Luo R.Z., Fujii S., et al. Aberrant methylation and silencing of ARHI, an imprinted tumor suppressor gene in which the function is lost in breast cancers // Cancer Res. 2003. - Vol. 63. - P. 4174-4180.

166. Zheng Y-L., Zhou X., Loffredo C.A., et al. Telomere deficiencies on chromosomes 9p, 15p, 15q and Xp: potential biomarkers for breast cancer risk // Hum. Mol. Gen. -2011. Vol. 20(2). -P. 378-386.

167. Zou Ch-F., Jia L., Jin H., et al. Re-expression of ARHI (DIRAS3) induces au-tophagy in breast cancer cells and enhances the inhibitory effect of paclitaxel // BMC Cancer. 2011. - Vol. 11. - P. 22.

168. Zuo T., Wang L., Morrison C., et al. FOXP3 is an X-linked breast cancer suppressor gene and an important repressor of the HER-2/ErbB2 oncogene // Cell.-2007.-Vol. 129(7).-P. 1275-1286.

169. Zurita M., Lara P., del Moral R., et al. Hypermethylated 14-3-3-a and ESR1 gene promoters in serum as candidate biomarkers for the diagnosis and treatment efficacy of breast cancer metastasis // BMC Cancer. 2010. - Vol. 10.-P. 217.

Информация о работе

Скрябин, Николай Алексеевич
кандидата медицинских наук
Томск, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Роль хромосомных нарушений и аберрантного метилирования ДНК в развитии геномной нестабильности при раке молочной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы