Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов

Фролов, Андрей Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов"

На правах рукописи

ФРОЛОВ АНДРЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ КОНСТИТУТИВНОЙ АКТИВНОСТИ РЕЦЕПТОРА С-КГГ В САРКОМАХ МЯГКИХ ТКАНЕЙ: ИЗМЕНЕНИЕ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА И ПРОФИЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского государственного медицинского университета и в группе медицинской онкологии Фокс-Чейзовского Онкологического Центра, Филадельфия, США

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Фаворовя Ольга Олеговна

профессор

Годвин Эндрю К.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Киселев Федор Львович

доктор биологических наук, профессор

Карпов Вадим Львович

Ведущая организация:

НИИ Экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Защита состоится «_»_2003 года в_часов на заседании

Диссертационного ученого совета Д 002.235.01 в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу 119991 г. Москва, ул. Вавилова д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «_»_2003 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук А.М. Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Передача сигнала рецепторными тирозинкиназами является важнейшем звеном регуляции биологических процессов клеточного роста, дифференцировки н смерти. Нерегулируемая активация этих рецепторов является ведущим и порой единственным механизмом канцерогенеза ряда опухолей и патологий развития (Hirota et al. 1998). Протоонкоген c-kit кодирует трансмембранную рецепторную тирозинхиназу типа Ш для колониестимулирующего фактора роста. Активирующие мутации в этом гене приводят к конститутивному фосфорилированию рецептора даже в отсутствие колониестимулирующего фактора роста и как следствие к туморогенезу некоторых мезенхимальных и эпителиальных новообразований (Nakahara et al. 1998). Множество фактов свидетельствует о том, что блокирование активности различных рецепторов и белков, участвующих в канцерогенезе, приводит к уменьшению размеров опухоли и продлению жизни больных. Использование новых химических соединений направленного действия, селективно воздействующих на рецепторные белки в опухолевых клетках, реально обеспечивает бблыпую эффективность лечения и меньшую токсичность по сравнению с традиционной неспецифичной химиотерапией.

Для большой группы сарком мягких тканей, самыми распространенными среди которых являются мезенхимальные новообразования желудочно-кишечного тракта, характерна экспрессия и конститутивная активация рецептора с-КГГ (Stepanova et al. 2002). В США ежегодно выявляется около 5000 новых случаев стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ). В большинстве случаев заболевание заканчивается летальным исходом в течение нескольких лет после постановки диагноза вследствие низкой эффективности традиционной химио- и радиотерапии, причины которой остаются неясными. Прогнозирование успеха лечения конкретного онкологического больного до сих пор остается нерешенной задачей. Одним из подходов к прогнозированию чувствительности к терапевтическому воздействию является поиск маркеров индивидуального ответа и изучения молекулярных эффектов воздействия лекарственного средства, однако большинство предпринятых в этом направлении попыток не обеспечило желаемого эффекта. В частности, это касается лечения СОЖКТ противоопухолевым препаратом фениламинопиримидином (Гливеком). Гливек принадлежит к новейшему классу селективных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, к которым относятся рецепторы с-КГГ, PDGFR и Всг-АЫ. Молекулярный механизм действия фениламинопиримидина был изучен в случае ингибирования рецептора Всг-АЫ при хроническом миелолейкозе (Savage et al. 2002).

Что касается с-КГГ, обладающего структурной аналогией с Всг-АЫ, то механизм его ингибирования Гливеком, а также последующий молекулярный ответ на действие этого препарата изучены лишь поверхностно. Впервые Гливек использовали для лечения сарком мягких тканей в рамках клинических испытаний №CSTI571-B2222, проведенных в США. Фаза II этих испытаний выявила большое количество положительных ответов, однако 13% пациентов не ответили на терапию, а у ряда больных наблюдали рецидив заболевания в течение нескольких месяцев после условно-положительного ответа. Вопрос о молекулярных механизмах первичной и приобретенной резистентности к Гливеку остается открытым.

Анализ дифференциальной экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов является оптимальным подходом для решения этого вопроса, а также для определения возможных маркеров устойчивости к Гливеку. Мы приняли решение изучить влияние Г ли века на дифференциальную экспрессию (профилирование) генов в клетках СОЖКТ, сравнивая «генетические портреты» обработанных и необработанных препаратом культур этих клеток. Биологическую значимость результатов профилирования проверяли на панели клинических образцов опухолей, полученных от пациентов до и во время лечения Гливеком.

Цель я задачи работы. Целью настоящей работы было исследование молекулярных механизмов ингибирования конститутивной активности рецептора с-КГГ фениламинопиримидином (Гливеком) и изучение воздействия этого селективного ингибитора тирозинкиназ на изменение передачи сигнала в клетках СОЖКТ. Ставился также цепью поиск прогностических маркеров эффективности индивидуального лечения больных СОЖКТ этим препаратом, а, возможно, и ранее неизвестных перспективных терапевтических мишеней.

В связи с этим в работе ставились следующие экспериментальные задачи:

1. Получить стабильную культуру клеток, моделирующую СОЖКТ in vitro и пригодную для изучения терапевтического воздействия Гливека. Оценить эффект Гливека на рост и пролиферацию полученной культуры клеток с использованием современных методов оценки состояния клеточного цикла, выживаемости, уровней пролиферации и апоптоза.

2. Используя технологию ДНК-микрочипов, определить биологические маркеры ответа на терапию Гливеком и вовлеченные сигнальные каскады, участвующие в генетической регуляции, исходя из изменения уровня экспрессии генов в культуре клеток под действием препарата

3. Подтвердить биологическую и клиническую значимость маркерных генов-кандидатов в условиях in vivo, используя операционный материал и биопсии больных СОЖКТ.

4. Исследовать молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора с-КГГ фениламинопиримидином, анализируя состояние активации ключевых адалтерных белков сигнальных каскадов, начинающихся от рецептора с-КЗТ.

5. Провести функциональную оценку механизмов действия белковых продуктов маркерных генов и вычленить функционально активные молекулярные каскады прохождения сигнала от рецептора с-КГГ при его активации и ингибировании в контексте СОЖКТ.

Научная новизна. Все представленные в работе результаты имеют научную новизну. Полученная в настоящей работе клеточная линия GIST882 является первой описанной стабильной культурой клеток СОЖКТ. Эта клеточная линия впервые использована нами как модель СОЖКТ для изучения биологии этого новообразования. Получив препарат Гливек с любезного разрешения компании «Новартис Онкология», мы имели возможность в рамках клинических испытаний впервые исследовать действие Гливека на культуре клеток GIST882. Впервые всесторонне оценено действие Гливека на рост, пролиферацию клеток СОЖКТ и индукцию в них апоптоза, равно как на состояние и взаимодействие каскадов прохождения сигнала от рецептора КГГ и на уровни экспрессии других генов. Нами впервые проведено генетическое профилирование ответа на действие Гливека в системе СОЖКТ in vitro. В ходе этих экспериментов впервые выявлен ряд Гливек-зависимых генов, которые потенциально могут использоваться в качестве маркеров эффективности лекарственного ответа, а для семи из них изменение экспрессии при действии Гливека подтверждено двумя независимыми методами. Эффект резкого изменения экспрессии двух генов (SPRY4A и MAFbx) под действием Гливека наблюдали также в клинических биопсийных образцах опухолей больных СОЖКТ, что является принципиально новым результатом. Впервые показано, что инсерционная соматическая мутация гена с-КГГ 1530ins6 определяет резистентность к Гливеку. Молекулярные механизмы эффектов Гливека также впервые подробно исследованы на уровне белков.

Практическое значение работы определяется тем, что она является интегральной частью клинических испытаний № CSTI571-B2222 эффективности препарата Гливек в лечении СОЖКТ. В ходе этих испытаний от пациентов до и после терапии Гливеком был получен уникальный набор биопсий СОЖКТ, который использовался в данной работе. На этих клинических образцах, как в случае благоприятного ответа на терапию

Гливеком, так и в случае резистентных СОЖКТ, подтверждена биологическая значимость полученных в культуре клеток результатов.

Анализ экспрессии генов, определяющих эффективность ответа на Гливек, позволил найти прогностические маркеры результативности лечения Гливеком, которые можно определять даже в тонкоигольных биоптатах СОЖКТ. Выявленные маркеры являются высоконадежными; действительно, предсказание совпадало с клинической картиной в 100% случаев. Разработанная модель СОЖКТ in vitro имеет большую практическую ценность, поскольку может быть использована для поиска потенциальных маркеров лекарственной эффективности других препаратов. Кроме того, на основании полученных в этой работе данных бежовые продукты генов SPRY4A и RTP801 могут рассматриваться как потенциальные мишени при разработке новых лекарственных препаратов, особенно в случаях СОЖКТ, резистентной к Гливеку.

Апробация. Материалы работы были представлены на 7-ой ежегодной научной конференции имени Эдварда Д. Ластбайдера, Филадельфия, США, 2002; 2-ой научной конференции по проблемам рака желудочно-кишечного тракта, проводимой Онкологическим центром Андерсона, Орландо, США, 2002; 5б-ой ежегодной конференции Общества хирургов-онкологов (Society of Surgical Oncology), Лос-Анджелес, США, 2003 и 94-ой ежегодной конференции Американского общества исследования рака (American Association for Cancer Research), Вашингтон, США, 2003. Диссертационная работа была апробирована на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского государственного медицинского университета и в Центре биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано S статей и 4 тезисных сообщения, 3 из которых были представлены в виде симпозиальных докладов на международных научных конференциях. Автор диссертации награжден дипломом за лучший доклад и премиями для молодых ученых научных обществ Американской ассоциации раковых исследований (AACR-ILEX Oncology) и Онкологического центра Андерсона.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждения, выводы, список

литературы. Диссертация изложена на _ страницах и включает в себя 28

рисунков и 3 таблицы. Список литературы содержит 267 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Культура клеток СОЖКТ. GIST882 является иммортализованной клеточной линией СОЖКТ, несущей гомозиготную миссенс-мутацию (К642Е) в экзоне 13 гена с-КГГ. Обработка культуры клеток СОЖКТ Гливеком и оценка пролиферации и апоптоза. Гливек (иматиниба мезилат, STI-571, класс фениламинопиримидинов) добавляли непосредственно в среду до концентрации 1 и 10 мкМ. Клетки собирали и окрашивали для оценки их количества, жизнеспособности и индукции апоптоза при помощи реагентов Guava ViaCount и Guava Nexin (Guava technology Inc.). Сортировку и подсчет клеток производили на сортере Guava Personal Cytometer. Анализ состояния клеточного цикла. Клетки фиксировали в 70%-ном этаноле при 4 С и затем ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с добавлением нодистого пропидия. Окрашенные клетки анализировали методом проточной цитофлоуриметрии на сортере FACScan и проводили математическую обработку данных с использованием пакета Cell Quest (Becton Dickinson).

Выделение суммарной фракции РНК проводили гуанидин-изотиоционат- фенол-хлороформным методом как описано ранее (Godwin et al. 1992). 100 мкг общей фракции РНК обрабатывали ДНКазой, используя набор "DNA free" (Ambion). Производство ДНК-чипов и анализ дифференциальной экспрессии. Чипы изготавливали, используя 10368 полинуклеотидов длиной от 200 до 2000 п.н., представляющих собой фрагменты известных генов человека и EST из геномной библиотеки I.M.A.G.E. consortium library (Research Genetics). Сравниваемые образцы суммарной РНК метили флуорохромами СуЗ и Су5 и их смесь гибридизовали на кДНК-чипах.

Нозерн-блоттинг анализ. Использовали 15 мкг фракции суммарной РНК для стандартного анализа (Schultz et al. 1996). Мембраны гибридизовали с 32Р-меченным зондом на кДНК гена SPRY4A размером 1454 п.н., соответствующим нуклеотидам 2594-4048 последовательности №AF227516 из базы данных GenBank. Аналогично проводили Нозерн-гибриднзацию генов MAFbx, RTP801, ARHGEF2, FLJ20898, PDE2A и FZD8, используя в качестве зондов следующие фрагменты их кДНК: для гена MAFbx - фрагмент 650 п.н. (нухлеотиды 586-1236, №AY059629), для гена RTP801 - фрагмент 449 п.н. (нуклеотиды 422-871, №NM_019058), для гена ARHGEF2 - фрагмент 617 п.н.

(нуклеотиды 2909-3617 №NM_004723), для гена FLJ20898 - фрагмент 465 п.н. (нуклеотиды 249-714 №NM_024600), для гена PDE2A - фрагмент 476 п.н. (нуклеотиды 2155-2631 №NM_002599) и для гена FZD8 - фрагмент 647 п.н. (нуклеотиды 134-781 №NM_031866).

Полимеразная цепная реакция. Для проведения ПЦР использовали следующие пары праймеров: Sprouty 4А (SPRY4A) 5'-CCGTTCTGTGGAGAGTCGATTTAC-3* и 5'-GTCCCTCAGTGGCTCTCGACT-3'; Frizzled 8 (FZD8) 54ACAGTGTTGA-TTGCTATTAGCATG-3' и 5-GTGAAATCTGTGTATCTGACTGC-3'; ARHGEF2 5'-AAGGACGGAGAAAGGGAGAA-3' и 5-CAAGACAGCAGTGACCCTGA-3'; Фосфодиэстераза 2А (PDE2A) 5'-CCGCGATCTTTCTCGTAGTC-3' и 5'-CCCACTTCTGCTACCTGCTC-3'; MAFbx 5'-GTCCTGGGGTGAAAGTGAAA-3' и 5'-TCACAGCTCACATCCCTGAG-3'; FU20898 5•-CCCGAGTGACTCTGTTTTCC-3, и 5'-ACACCCAGTTGGAGGTGAAG-3'; RTP801 5'-AGACACGGCTTACCTGGATG-3' и 5'-TTGATGACTCGGAAGCCAGT-3'; р-актин 5'-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3' и 5'-CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGT-3'. Изображения гелей получали, используя систему документации и анализа Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech). Изображения сохраняли в пределах линейного динамического диапазона с контролем насыщения белого цвета. Компьютерную обработку проводили с использованием программных пакетов Alpha Imager v5.5 и Fuji Image Gauge v3.11 (Fuji Photo Film Co.). Получение полноразмерной кДНК гена MAFbx, присоединение тус-эпитопя и клонирование в экспрессирующий лентивирусный вектор. Полноразмерную кДНК гена MAFbx получали путем ПЦР-амлификации кДНК-библиотеки клеточной линии GIST882, обработанной Гливеком в течение 48 час. Прямой праймер (5'-ATACGAATT CGCCACCATGGAACAAAAGTTGATTTCTGAAGAAGATTTGTTAAGAAAGAGACC ATTCCTCGGGCAGGACTGGCGG-3') содержал сайт рестрикции EcoRI для последующего клонирования, последовательность Kozak, яуе-эпитоп (кодирующий 14 аминокислот С-конца гена с-тус) и 24 нуклеотида гена MAFbx, соответствующим нуклеотидной позиции 4-28 гена MAFbx, номер AY059629 базы данных GenBank. Обратный праймер (5 '-ATACGGATCCTCAGAACTTGAACAAGTTGATAAAGTC -3') содержал сайт рестрикции BamHI, стоп-кодон и последние 24 нуклеотида гена MAFbx, GenBank, №AY059629. Реакцию проводили с использованием высокоточной полимеразы Pfu Turbo (Stratagene, США). Конструкцию, содержащую ген MAFbx и myc-эпитоп, клонировали в экспрессирующий лентивирусный вектор pCMV-H4; полученную конструкцию называли pLV-MAFbx.

Экзогенная экспрессия MAFbx с использованием лентивирусной системы экспрессии. Доставку вектора для экспрессии гена MAFbx в культуру клеток СОЖКТ осуществляли с помощью системы лентивирусных векторов третьего поколения (Dull et al. 1998). В качестве клеток-упаковщиков использовали клеточную линию эмбриональной почки 293Т. Для контроля трансфекшш использовали вектор, содержащий ген GFP, который кодирует зеленый флуоресцирующий белок. Трансфекцию проводили с использованием реагента Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Вирионы собирали каждые 12 час в течение 48 час. Клетки-упаковщики собирали для оценки экспрессии гена MAFbx с myc-эпитопом. Для инфекции клеток СОЖКТ вирионы стабилизировали добавлением полибрена до концентрации 5 мкг/мл и обрабатывали клетки в течение 6-10 час. Для контроля инфекции использовали вирионы, несущие ген GFP.

Получение поликлональных антител к белку SPRY4A. Две самки новозеландских белых кроликов иммунизировали 250 мкг рекомбинантного белка SPRY4A путем подкожного введения. Сыворотку кроликов, содержащую полихлональные антитела, осаждали сульфатом аммония и подвергали конечной чистке методом аффинной хроматографии.

Приготовление клеточных лизатов, белковый электорофорез и Вестерн-блоттинг.

Приготовление клеточных лизатов и Вестерн-блоттинг проводили согласно (Pan et al. 2002). В работе использовали моноклональиые антитела к ß-актину (Sigma), поликлональные антитела к фосфорилированной форме c-KIT (Tyr719) (Cell Signaling), моноклональиые антитела к с-КГГ (Santa Cruz Biotechnology), моноклональиые антитела к фосфорилированным формам ERK1/2 (Cell Signaling), поликлональные антитела к ERK1 и ERK2 (Santa Cruz Biotechnology), поликлональные антитела к АКТ, AKT/phosphoThr308 и AKT/phosphoSer473 (Cell Signaling).

Клинические образцы н биопсии СОЖКТ. Образцы тканей СОЖКТ были получены от семи пациентов, находящихся на клиническом испытании второй стадии CSTI571-В2222, спонсируемом Novartis Oncology. Тонкоигольную биопсию опухоли проводили иглой 14G под контролем ультразвука непосредственно перед началом, во время или сразу по окончании терапии Гливеком. Во время терапии повторные биопсии обычно забирали с 7 по 31 день.

Результаты и их обсуждение

AACTCGAAOTCC

Создание модели стромальньп опухолей желудочно-кишечного тракта in vitro СОЖКТ являются самыми распространенными мезенхимальными опухолями желудочно-кишечного тракта и относятся к классу сарком мягких тканей. Большинство СОЖКТ характеризуется наличием перманентно активной фосфорилированной формы рецептора KIT (CD 117), образующейся в результате мутации протоонкогена c-KIT. Пятилетняя выживаемость таких больных составляет в среднем 50% (DeMatteo et al. 2000). Пациенты с метастатическим заболеванием в подавляющем большинстве случаев имеют неблагоприятный прогноз с 6-8 месячной медианой выживаемости, так как СОЖКТ резистетнты ко всем типам традиционной химиотерапии и радиационному воздействию.

Из опухоли пациента с метастатическим характером СОЖКТ получили клеточную

линию GIST882. Эта линия является первой описанной моделью СОЖКТ in vitro и успешно пассируется нами в течение 2 лет. Действительно, линия клеток GIST882, как и первичный образец опухоли, экспрессирует аллель с-КГГ, несущий мутацию в экзоне 13, которая приводит к замене одного аминокислотного остатка К642Е в проксимальной части домена

тирозинкиназного домена. Несмотря на мутацию, такая форма c-KIT обладала постоянной, не зависимой от связывания лиганда (стволового фактора роста), тирозинкиназной активностью. Мутация носит гомозиготный характер, так как аллель с-КГГ дикого типа не был определен ни в образце опухоли, ни в линии GIST882 (Рис. 1). Таким образом, на модели GIST882 можно избирательно изучать сигнальные каскады мутантного c-KIT, причем без необходимости стимулировать культуру стволовым фактором роста. Цитогенетический анализ клеток GIST882 и исходной опухоли выявил моносомию по хромосомам 14 и 22.

bACTWAAGTCC

GIST882 c-KIT

c-KIT дикого типа

Рис. 1. Мутационный анализ гена с-КГГ ъ клетках GIST882.

Выявление маркеров эффективности лечения Гливеком стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта и молекулярные механизмы его фармокодинамнки

Изучение генетических маркеров ответа на терапию Гливеком проводили на созданной модели СОЖКТ in vitro методом генетического профилирования с использованием технологии ДНК-микрочипов. Изучая эффект Гливека на рост, пролиферацию и состояние клеточного цикла клеток GIST882, мы смогли выявить Гливек-зависимые гены, а также определить состояние активации рецептора KIT и его низлежащих эффекторов после воздействия препарата.

Эффект лекарственного СОЖКТ в системе in фармакодинамики Гливека

А. ?,

Вид сирху

м « я Часы

Вид

сверху

72 час

воздействия Гливека на рост и пролиферацию клеток vitro. Для определения молекулярных механизмов в клетках GIST882 in vitro мы сначала оценили его влияние на состояние пролиферации и возможную индукшпо апоптоза. Выявлено, что Гливек в концентрациях 1 цМ и 10 цМ ингибирует рост клеток GIST882 в течение 24 - 48 час после внесения препарата в среду (Рис. 2А). В то же время, по данным иммунофлуоресцентного окрашивания клеток на маркерные белки раннего и позднего апоптоза Annexin-V и 7-ADD (Рис. 2В), обработка Гливеком не приводила к статистически значимому (>5% от общей популяции) увеличению доли клеток в апоптозе (Рис. 2С). Доля жизнеспособных клеток на протяжении всего опыта

96 час

GO-Gl G2-M S GOCI G2-M S

Контроль 74 12Г, IS.W 74 331 10639 15 04"«

1иМ 84 31« «534 7.2К1 7929^ 7.2№

IO|iM &5.70Ч. 7 87Я 6.43» 80.87% 11.23«

Рис. 2. Анализ роста клеток GIST882 и ответа на обработку Гливеком in vitro.

A. Кривая роста клеток GIST882, обработанных 1 цМ (■) и 10 цМ (А) Гливеком, и контрольных клеток (♦).

B. Профили распределения в клеточном цикле контрольных клеток GIST882 (слева) и клеток, обработанных 10 цМ Гливеком в течение 96 час (справа), по данным проточной цитоф луориметрии.

C. Доля клеток в фазах клеточного цикла GO/1, S и G2/M без (контроль) и после обработки Гливеком (1 или 10 цМ) в течение 72 и 96 час.

составляла 93 ± 5% как в случае обработанных Гливеком, так и контрольных клеток. При добавлении Гливека в обеих концентрациях мы наблюдали значительное (более чем 50%-ное) уменьшение фракции клеток в S-фазе (15.5% против 6.6% от общего количества клеток) (Рис. 2С), причем ошибка эксперимента (по данным трех независимых определений) составляла менее 5%.

Профилирование экспрессии генов в культуре клеток СОЖКТ, обработанных Гливеком, с использованием кДНК-чипов. В поисках специфических генетических мишеней Гливека мы сравнивали уровни экспрессии генов по профилю мРНК в культурах контрольных клеток СОЖКТ и клеток, обработанных 10 мкМ Гливеком в течение 6, 12, 24 или 48 час. Сравниваемые образцы суммарной РНК метили флуорохромами СуЗ и Су5, и полученную зондовую смесь габридизовали на кДНК-чипах, содержащих 10368 фрагментов известных генов и EST человека. Статистический анализ значимости и достоверности полученных данных позволил выявить 148 генов, меняющих в результате обработки Гливеком уровень экспрессии хотя бы в одной временной точке с достоверностью 95%. При анализе данных методом иерархической группировки мы выявили один кластер генов со значительным снижением уровня экспрессии по отношению к контрольным клеткам. Этот кластер содержал 62 гена, из которых 34 гена уменьшали уровень своей экспрессии хотя бы в одной временной точке с достоверностью 95%. Этот кластер был достаточно мал и находился в непосредственной близости к корню иерархической дендограммы. Это позволяет предположить, что выявленный кластер, группирующийся независимо от других генов, имеет, вероятно, близкий механизм регуляции. Поскольку нашей основной задачей являлось выявление биологических маркеров эффективности ответа на Гливек, мы выбрали в качестве кандидатов на эту роль гены, характеризующиеся изменением уровня экспрессии на протяжении всего процесса обработки. В эту группу вошло 14 генов, показавших после обработки клеток СОЖКТ Гливеком статистически значимое интегральное изменение уровня экспрессии, по крайней мере, в 2,4 раза. Из этих 14 генов для двух наблюдалась гиперэкспрессия и для 12 - репрессия (Таблица 1). Для подтверждения полученных результатов мы сначала проверили правильность аннотации этих 14 генов. Для этого мы клонировали фрагменты ДНК, наносимые на кДНК-чипы, секвенировали полученные клоны и сравнили их последовательность с генетической базой данных GenBank. В соответствии с исходной аннотацией, 7 генов

из 14 были ранее описаны - это SPRY4A, ARHGEF2, RTP801, FU20898, FZD8, PDE2A, and MAFbx, а остальные 7 генов являлись EST без известной функции и/шш гомологии. Для дальнейшего подтверждения изменения экспрессии под действием Гливека мы решили остановиться на 7 генах с известной или предполагаемой функцией. Первым анализировали ген SPRY4A как наиболее репрессированный.

Таблица 1. Гливек-зависимые гены, меняющие уровень экспрессии на протяжении всего времени обработки клеток ОВТ882 Гливеком.__

Ген Номер GenBank log2 - значения отношений интенсивности сигнала после обработки Гливеком, час Средне« отношение KB

6 12 24 48 сигнала, 1о&

5ргоиГу-гомолог 4 (ЖРЙМ) AF227516 -3.31 -1.91 -3.73 -2.38 -2.83 ±0.83 0.29

РгкгЫ-гомолог 8 (РгОй) NM 031866 -2.22 -1.39 -2.54 -0.97 -1.78 ±0.72 0.41

Ген ответа Н1Р-1 (Я1Р801) AF335324 -2.11 -1.17 -1.67 -1.35 -1.58 ±0.41 0.26

Ген гипотетического белка ЦЧЛОЯЩ NM 024600 -1.63 -0.45 -2.5 -1.49 -1.52 ± 0.84 0.55

Ген фактора обмена Шго/Кас [АЯНвЕГ2) NM004723 -1.95 -0.8 -1.39 -1.49 -1.41 ± 0.48 034

Ген фосфодиэстеразы 2А (РйЕ2Л) NM002599 -0.45 -0.72 -2.63 -1.25 -1.26 ±0.97 0.77

Ген Р-Ъох белка мышечной атрофии \MAFbx) AY059629 1.81 1.13 1.61 0.72 132 ± 0.49 037

КВ= коэффициент вариации

Мы наблюдали значительное уменьшение экспрессии SPRY4A на протяжении всего времени обработки клеток ОГ8Т882 Гливеком и во всех опытах с ДНК-чипами. Дополнительный поиск в базе данных СгепВапк показал, что представленный на чипе пик» фрагмент гена БРЯУ4 соответствует двум его

J известным изоформам: SPRY4A и SPRY4C. Для анализа

Часы О А 12 24 4«

281 № рРНК

IKa рРНК

Рис. 3. Нозерн-блоттинг экспрессии изоформ гена БРКУ4 | Бромистый в клетках СТ8Т882, обработанных Гливеком в * концентрации 10 мкМ в течение 6-48 час. Для контроля одинаковой нагрузки суммарной РНК мембрану репрессии генов этих

изоформ методом Нозерн-блотгинга мы синтезировали кДНК-зонд для определения 5000 п.н. транскрипта SPRY4A или 7000 п.н. транскрипта SPRY4C. Этот эксперимент подтвердил полученные ранее результаты и показал значительное снижение содержания мРНК SPRY4A, но не через 6 час после обработки клеток

СОЖКТ Гливеком в концентрации 10 мкМ (Рис. 3). Мы также синтезировали пару ПЦР- праймеров, которая позволила провести различия между этими изоформами. ОТ-ПЦР реакция с аликвотой РНК, используемой в кДНК-чипах, подтвердила наши

Чаш 0 6 12 14 4»

данные о том, что именно 5РИУ4А конституционно экспрессируется в клетках СОЖКТ и претерпевает значительную репрессию после обработки Гливеком. Во время проведения ОТ-ПЦР мы контролировали насыщение реакции путем отбора образцов на различных циклах реакции совместно с использованием контрольной ПЦР-реакции на ген домашнего хозяйства для р-актина. Подобным же образом мы оценили экспрессию остальных 6 генов-кандидатов, и ОТ-ПЦР во всех случаях полностью подтвердила данные, полученные при скрининге на кДНК-чипах (Рис. 4). Уровни мРНК генов 5РЯУ4А, АЛНвЕЮ, ЯТР801, РЫ20898 и Р2Ю8 значительно уменьшались спустя жш 6 час после добавления Гливека, а гена РОЕ2А - после 12 мнет час. Уровень мРНК гена МАРЪх, в свою очередь, был

Рис. 4. ОТ-ПЦР анализ Гливек-зависимых генов. РНК получали из клеток ОКТ882, обработанных 10 мкМ Гливеком в течение 6, 12, 24 и 48 час, и контрольных клеток СТ8Т882. Показаны агарозные электрофореграммы продуктов ОТ-ПЦР для генов БРКУ4А, МАРЬх, Р208, РИЕ2А, ЯТР801, РЫ20898 и АЛНвЕР2. Ген р-актина использовали в качестве контроля, значительно выше после 6 час обработки Гливеком и далее не менялся на протяжении всего процесса обработки (Рис. 4). Мы также подтвердили изменение уровней экспрессии описанных семи генов методом Нозерн-блоттинга (Рис.

5).

В целом, изменение экспрессии 7 исследованных генов достоверно показано тремя независимыми методами. Эти данные позволили использовать метод ОТ-ПЦР для оценки экспрессии отдельных генов в дальнейших экспериментах с ничтожно малыми клиническими образцами СОЖКТ от больных, характеризующихся различной чувствительностью к Гливеку.

Глмж 10 ЦМ Чаш 0 » 12 24 41

, &кГ4Л

ф кто/

ш гиглт гам юш

28. рРНК

рРНК^

щтттт

щ Бромистый

7ТИДНЙ

Рис. 5. Нозерн-блот анализ экспрессии генов 5РЛУ4А, МАРЪх, Ш)8, РйЕ2А, ЯТР801, РШ0898 и АЯНвЕР2 в клетках СОЖКТ, обработанных Гливеком. Нижняя панель - мембрана, окрашенная бромистым эти днем в качестве контроля одинаковой нагрузки РНК.

Иигибирование рецептора с-КГТ Гливеком в клетках GIST882

На следующем этапе исследования прежде всего нужно было определить наличие конститутивно активированного с-КГГ и его низлежащих мишеней ERK1/2 и АКТ в клетках GIST882, как это имеет место в СОЖКТ. Используя антитела против фосфорилированных форм этих белков-эффекторов, мы показали, что без обработки

Гливеком в экспоненциально растущих клетках СОЖКТ белки с-КГГ, ERK1/2 and АКТ находятся в активированной

фосфорилированием форме (Рис. 6А, 0 час), и смогли приступить к оценке ингибиторного действия Гливека на активацию этих белков в культуре клеток СОЖКТ. Гливек в концентрации 1 мкМ и 10 мкМ вызывал исчезновение фосфорилированной формы с-КГГ уже после 30 мин обработки, причем это не

сопровождалось изменением общего количества с-КГГ (Рис. 6А). Как было показано с использованием антител, избирательно распознающих фосфотреоиин-308 и фосфосерин-473, Гливек ингибировал активацию АКТ в обоих положениях. Он также подавлял фофорилирование ЕРК1/2. Как и в случае с-КГГ, обработка Гливеком не влияла на общее количество АКТ и ЕРК1/2 (Рис. 6А). Уровни фосфорилирования АКТ и ЕРК1/2 изменялись в течение первых 30 минут действия препарата одновременно с ингибированием с-КГГ (Рис. 6А). Параллельно с анализом уровней фосфорилированных/дефосфорилированных белков в этом опыте мы также оценили экспрессию SPRY4A и MAFbx. Как видно на Рис. 6В, их экспрессия была нарушена через 3 час после внесения Гливека. Действительно, уровень мРНК гена SPRY4A значительно уменьшался после 3 час обработки и снижался практически до нуля к 6 час, а уровень мРНК гена MAFbx значительно увеличивался через 3 час и сохранялся в течение всего периода обработки (Рис. 6В).

Гяпаек |рм Гдицж 10 им

I • 0J 1 J * в U 1 > «

ЮкДан»*

С-Ш

C-Kil

Рис. 6. Анализ состояния каскада с-КГГ в клетках СОЖКТ, обработанных 1 мкМ и 10 мкМ Гливеком в течение указанного времени.

A. Вестерн-блот анализ белков с-КГГ, АКТ, ЕЯК1/2 и их фосфорилированных форм.

B. ОТ-ПЦР анализ уровня экспрессии 8РКГ4А, МАРЬх и гена (5-актина.

Эти результаты показывают, что Гливек в клетках СОЖКТ не влияет на общий уровень белка с-КГГ, несущего мутацию К642Е, а подавляет его киназную активность по механизму фосфорилирования. Это приводит как к снижению уровня аутофофорилирования с-КГГ, так и к подавлению активации ЕЯК1/2 и АКТ, репрессии 8РЯУ4А и гиперэкспресии МАРЬх.

Регуляция экспрессии Гливек-зависимых генов 8РЛУ4А, МАГЬх в АКНСЕ¥2 осуществляется ЕЮС1/2-зависимым путем

Ранее было показано, что каскад ЕРК обеспечивает положительную регуляцию экспрессии генов семейства Sprouty в клетках грызунов (Ozaki et al. 2001). Ограниченное число опухолей, в которых этот каскад является конститутивно активированным, также характеризуется повышенной экспрессией генов SPRY1 и/или SPRY2 (Ozaki et al. 2001). Чтобы определить влияние каскада ERK1/2 на экспрессию

Часы о 05 1 3 6

Часы 0 0.5 1 3 6

Часъ

Ptaipbo

ERK1/2

«ЯР- ли» а*» АКТЛП1Г™

Рис. 7. Ингибирование МЕК проводит к уменьшению уровня активированного ЕЮС1/2 и влияет на уровень экспрессии Гливек-зависимых генов. А.Вестерн-блот анализ с-КГГ, АКТ, ЕЮС1/2 и их фосфорюшрованных форм в клетках СОЖКТ, обработанных Ш126 в концентрации 30 мкМ. В. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов 8РЯУ4А, МАПх, Р7И8, РПЕ2А, ЯТР801, РЫ20898, АМЮЕР2 и гена Р-актина в клетках СОЖКТ, обработанных Ш126 в концентрации 30 мкМ С. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов МАРЬх, РИЕ2А, ЯТР801, РЫ20898, АШвЕП и

гена В-ахтина в клетках СОЖКТ. обработаных Гливеком гена 5РК.У4А в клетках СОЖКТ, мы использовали Ш126 - ингибитор МЕК1,

вышестоящей киназы по отношению к киназам ЕРК1/2. Обрабатывали культуру клеток

ОВТ882 препаратом Ш126 в концентрации 30 мкМ в течение 30 мин, 1, 3 и 6 час и

наблюдали полное ингибирование фосфорилирования (активации) ЕЮС1/2 уже через

30 мин (Рис. 7А). При этом Ш126 ингибирует фосфорилирование другой мишени -АКТ - сразу после начала обработки, но подобное ингибирование носит транзиторный характер, так как фосфо-АКТ возвращается на прежний уровень через 3 час после начала обработки (Рис. 7А) и не затрагивает суммарного количества АКТ.

_ „ На следующем этапе исследования мы

ЬУ294002 Гливск

чк о 1 3 6 24 6 24 определили зависимость экспрессии генов-кандидатов

MAFbx от ингибирования каскада ERK1/2 через вышестоящую киназу МЕК1. Профиль экспрессии генов SPRY4A,

SPRY4A

MAFbx and ARHGEF2 после обработки клеток СОЖКТ р-актт препаратом U0126 напоминал профиль их экспрессии

под действием Гливека (Рис. 7В,С). Рис. 8. ОТ-ПЩ анаотз уровня Изменение экспрессш PDE2A носило экспрессии генов SPRY4A, MAFbx и гена

Р-актина в клетках СОЖКТ при транзиторный характер, а экспрессия

ингибировании каскада PI3K RTP801y FU20898 и FZD8 не изменялась препаратом LY294002 в концентрации

ЗОмкМ. (Рис. 7). Изменение уровня экспрессии

исследуемых генов при добавлении U0126 было сопоставимо с изменением при обработке Гливеком, хотя эффект Гливека был более длительным, что можно объяснить меньшей устойчивостью препарата U0126 в культуральной среде. Мы также исследовали эффект препарата LY294002, являющегося ингибитором фосфоинозитол-3-киназы (PI3K) (Vlahos et al. 1994) на экспрессию маркерных генов-кандидатов и установили, что ингибирование фосфоинозитол-3-киназы оказывает минимальный эффект на экспрессию Гливек-зависимых генов (Рис. 8), Эти факты приводят к заключению, что экспрессия ряда генов зависит от активации сигнального каскада МАРК, обусловленной мутированным с-КГГ, которая и подавляется Гливеком. Однако существуют также дополнительные регуляторные механизмы изменения экспрессии генов в ответ на действие Гливека.

Определение значимости генов SPRY4A к MAFbx как непрямых маркеров ответа на Гливек в клинических образцах СОЖКТ

Четвертой задачей этого исследования являлась проверка значимости найденных маркерных генов в условиях т vivo, в клинических образцах СОЖКТ. Экспрессия двух маркеров, репрессированного SPRY4 и гиперэкспрессированного MAFbx, была изучена в тонкоигольных биоптатах СОЖКТ, полученных от пациентов до и во время лечения

»1(0) а (О) Ю(Р)»7(БОО) и «МП *5(Е0)#6(Б0) Гливек - + - + -+ + +-++- + - +

т (О)бою) «р-н) М(БО) Гливек - ++ + -++- +

ш»!

Р-вжтин

Гливеком. Данные биоптаты представляли собой столбики ткани диаметром до 1мм, извлеченные полой иглой под контролем УЗИ из толщи опухоли. Фракцию суммарной РНК выделяли из образцов ткани и синтезировали кДНК с

Рис. 9. Анализ экспрессии генов 5РЯУ4А и МАТЬх в биоптатах СОЖКТ до и после терапии Гливеком.

A. ОТ-ПЦР анализ экспрессии гена 8РЯУ4А в биоптатах СОЖКТ, полученных от пациентов с положительным клиническим ответом (О), с отрицательным клиническим ответом, «без ответа», (БО) и с начальным положительным ответом и дальнейшей прогрессией заболевания (О-П). Образец №7 получен от пациента с двумя первичными опухолями, одна из которых показала положительный клинический ответ, а другая была резистентна к терапии Гливеком.

B. ОТ-ПЦР анализ экспрессии гена МАРЬх в биоптатах четырех пациентов с

помощью обратной транскрипции с использованием олиго((1Т)-праймера. Экспрессия БРЯ¥4 была значительно снижена у пациентов №1, 2, 3 и 7, которые демонстрировали положительную динамику при лечении Гливеком (Рис. 9). Опухоли двух пациентов с отсутствием ответа на терапию (№5 и б) продолжали экспрессировать прежние уровни 5РКУ4А как в биоптатах до начала лечения, так и во время приема препарата. В случае пациента №4, у которого наблюдался положительный эффект в начале лечения, но впоследствии произошел рецидив заболевания, экспрессия 8РЯ.У4А снизилась во время клинически положительного ответа и вернулась на прежний уровень при рецидиве заболевания (Рис. 9). В клинических образцах СОЖКТ №1, 4, 6 и 7 мы также оценивали экспрессию МАРЬх. У пациентов №1 и 7, которые продемонстрировали положительный клинический ответ на Гливек, после начала лечения мы наблюдали высокий уровень транскрипта МАРЬх в опухоли. В образце опухоли пациента №4 уровень МАРЬх увеличился во время клинически положительного ответа, но, как и в случае 5РЯ¥4А, наблюдалось возвращение на прежний уровень во время рецидива заболевания. В биоптате пациента №6, который продемонстрировал отрицательную динамику на лечение Гливеком, уровень экспрессии МАРЬх не изменился по сравнению с исходным уровнем (Рис. 9).

СОЖКТ.

Таким образом, по крайней мере в исследованных клинических образцах СОЖКТ показана полная применимость анализа экспрессии генов 5РЛУЛ4 и МАРЬх для экспресс-оценки эффективности Гливека и предсказания его ближайшего терапевтического воздействия.

Л л

Анализ экспрессии с-КГГ, АКТ и ЕЮС1/2 в СОЖКТ резистентной к Гливеку

Мы обладали достаточным количеством клинического материала опухоли пациента №6, А * в ^^ резистентного к Гливеку, чтобы оценить уровни

л145кД>-»- Шат

120 р^>Ьо экспрессии белков с-КГГ, АКТ и ЕМС1/2. Данные

иммуноблоттинга образца СОЖКТ от этого 12окДа-*- . с'Кп больного показали наличие активированного с-КГГ

145 Ш-». до

В «м^Ш»^''мп/т»« Рис. 10. Экспрессия с-КГГ, ЕИС1/2 и АКТ в

клетках липосаркомы, ®8Т882 и Гливек-60 кд*"*" ••ИРлкт резистентной СОЖКТ (Пациент №6). Вестерн-

блот анализ экспрессии РЬоврЬо-с-КГГ и ^ ШТ" Щ р1мч>1» суммарного белка с-КГГ (А); РЬоврЬо-АКТ и

ЕКК|/2 суммарного АКТ (В) РЬоврЬо-ЕИСШ и 42 к Да* МШпмл суммарного ЕЯК1/2 (С) в экстрактах опухолей и

£) _____ клеточной линии ОКТ882. О. Анализ экспрессии

гена 8РКУ4А

во время приема препарата (Рис. 10А). Для сравнения в эксперимент включили лизат клеточной линии СОЖКТ ОКТ882 и образца миксоидной липосаркомы, относящейся к гистотипу сарком, резистентных к Гливеку. Как и ожидалось, экспрессия с-КГГ (как фосфорилированной, так и нефосфорилированной его формы) отсутствовала в образце липосаркомы (Рис. 10А).

Мы также оценили экспрессию АКТ и ЕЯК1/2

*вАСТтстагст*твсст*тттт»АС В ЭТИХ

образцах. Как можно было

это мо 2и

Мутантный с-Ш предположить, активированные формы АКТ и

ЕЫС1/2 экспрессировались в резистентной

ао К т*с тесс татттталс тттвср

СОЖКТ (Рис. 10В,С). Интересно заметить,

120 139 14

СК1Т дикого типа 410 в образце липосаркомы

Штгтттт

Рис. 11. Мутационный анализ гена с-К1Т у пациента №6. Показаны электрофореграммы секвенирования мутантного аллеля с-КГГ {вверху) и аллеля с-К1Т дикого типа (внизу), полученных из РНК опухоли пациента №6. Выявлена инсерция 6 нуклеотидов в положении 1560 экзона 9.

фосфорилированные формы АКТ и ЕЮС1/2 также присутствовали (Рис. 10В), и мРНК 8РЮГ4А экспрессировалась на уровне, сходном с типичным образцом СОЖКТ (Рис. 1(Ю). Эти результаты свидетельствуют об отсутствии ингибирования с-КГГ Гливеком у этого Гливек-резистентного пациента и еще раз показывают возможность оценки клинического ответа на Гливек по уровню экспрессии генов 5РЯУ4А и МАРЪх.

Для выявления причин отсутствия эффекта Гливека у пациента №6 мы провели поиск соматической мутации в его гене с-КТТ. Суммарную РНК выделяли из образца ткани опухоли, подвергали обратной транскрипции и ПЦР-амплификации всего транскрипта c-K.1T с помощью 10 пар праймеров к перекрывающимся участкам. При секвенировании всего транскрипта была обнаружена мутация в экзоне 9. Мутация представляла собой инсерцию б нуклеотидов в положение 1530 (1530им6), в результате чего происходит включение 2 дополнительных аминокислотных остатков в последовательность с-КГГ (Рис. 11). Мы секвенировали аллели 10 копий клонированного гена с-КГГ и установили, что данная мутация носит гетерозиготный характер. Можно предполагать, что отсутствие эффекта Гливека у этого пациента обусловлено тем, что эта мутация препятствует связыванию препарата с с-КГГ.

01вТ882 ♦ |ЛМЗРР

Н'^Л

Экспрессия трансгеня МАРЪх вызывает нарушение пролиферация клеток

СОЖКТ

Поскольку обработка клеток СОЖКТ ввтог * 1ллмапи Гливеком вызывает гиперэкспрессию гена МАРЪх, мы решили экспрессировать трансген

Рис. 12. Экзогенная экспрессия МАБЪх приводит к аресту роста и пролиферации клеток ОКТ882.

A. Состояние клеток ет8Т882 через 120 часов после инфекции лентивирусного экспрессирующего вектора для зеленого флуоресцирующего белка (ет-Р) (панель слева) и МАРЬх (панель справа). Увеличение 400х.

B. Вестерн-блот анализ экзогенной экспрессии МАРЬх в клетках-упаковщиках и в клетках ОБТ882

Мус-эпктоп/МАЛяс

|ЙЬ Щт

«*> Актин

МАРЬх в этих клетках, чтобы определить его функции в терапевтическом ответе и, возможно, сымитировать эффект Гливека. Поскольку антител к данному белку нет, мы решили экспрессировать

слитный белок myc-MAFbx, содержащий нонапептид белка туе - эпигон для специфических анти- туе антител и определять экспрессию MAFbx по в клетках GIST882 по тус-эпитопу. Трансфекции клеток СОЖКТ обычными методами не представлялась возможной, поэтому для доставки генетических конструкций использовали лентивирусные векторы третьего поколения (Dull et al. 1998). В качестве контроля использовали экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP). Однократная обработка клеток GIST882 вирионами обоих типов привела к заражению более 90% клеток. Клетки, инфицированные GFP и MAFbx, культивировали параллельно и затем оценивали экспрессию обоих белков через 24-48 час после инфекции (Рис. 12). Сравнение скорости роста и состояния пролиферации клеток, экспрессирующих MAFbx и GFP, выявило 30%-ное снижение количества клеток в присутствии трансгена MAFbx без изменения их жизнеспособности, а также изменение морфологии клеток, схожее с эффектом Гливека (Рис. 12).

Только геи SPRY4A из семейства генов Sprouty подвергается репрессии в клетках GIST882, обработанных Гливеком

В отличие от генома дрозофилы, содержащего единственный ген Sprouty, у человека клонировано 5 генов этого семейства. Эти гены обладают высокой степенью гомологии в области С-конца и сильно отличаются N-концевыми фрагментами.

Функции каждого из генов Sprouty человека пока достаточно плохо изучены. В дополнение к оценке экспрессии гена SPRY4, мы оценили состояние экспрессии генов SPRY1, 2 и 3 в клетках GIST882 в ответ на действие 10 мкМ Гливека во временном интервале, описанном выше. Наблюдали репрессию исключительно гена SPRY4, в то время как все остальные члены семейства значительно

гиперэкспрессировались (Рис. 13). Эти данные согласуются с высказанным ранее предположением о различной функции генов семейства Sprouty и вовлечении именно гена SPRY4A в регуляторный каскад рецептора с-КГГ.

Гливек 6 12 24 48 час

SPRY1 SPRY2

Рис. 13. ОТ-ПЦР анализ уровня экспрессии генов семейства SPRY, в клетках GIST882, обработанных Гливеком в концентрации ЮмкМ.

Гливек

0.5

Гливек

6 час ■«"*■ SPRY4

120 час

SPRY4

Получение поликлональных антител к 8Ш4 позволило выявить снижение уровня этого белка после обработки клеток С15Т882 Гливеком

Изучение свойств белкового продукта гена 5РКУ4 было затруднено вследствие

отсутствия коммерчески доступных антител к этому белку. Для изучения изменения экспрессии белка 8РЯУ4 в ответ на действие Гливека мы получили поликлональные антитела к нему. Антитела выделили методом аффинной хроматографии из сыворотки кроликов, иммунизированных

рекомбинантным белком 8РЯУ4. После успешной проверки методами ИФА на специфичность связывания и на конкурирование с ингибиторным пептидом мы использовали эти антитела для изучения поведения белка 8РЯУ4 в культуре клеток СОЖКТ. Клетки ОВТ882 обрабатывали Гливеком в концентрации 10 мкМ в течение 30 мин, 1,3,6,24,72 и 120 час, после чего проводили иммуноблоттинг. Уровень белка вРЯУ4 оставался неизменным вплоть до б час обработки Гливеком, в точке «24 часа» он значительно уменьшался и снижался ниже уровня детекции в точке «72 часа» (Рис. 14). Эти данные свидетельствуют о том, что Гливек влияет на экспрессию гена 5РЯУ4А не только на уровне транскрипта, но и на уровне его белкового продукта. Так как мРНК гена 5Р11У4А практически исчезает в течение 3 час от начала действия Гливека, мы можем косвенно оценить время полужизни белка ЭРЯУ4 как 20-24 час. Хотя этот белок можно отнести к достаточно стабильным, регуляция его функций вероятнее всего происходит на уровне посттрансляционной модификации (например, фосфорилирования), не доступной для

Рис. 14. Вестерн-блот анализ уровня белка БРИУ4 в клетках ОВТ882, обработанных 10 мкМ Гливеком, с использованием полученных антител к вРКУ4,

детекции полученными антителами.

• * •

Эта работа привела к выявлению значения активирующей мутации в гене с-КГГ как определяющей невозможность янгибирования киназной активности KIT Гливеком. Эта мутация без сдвига рамки считывания (1530ins6) в экзоне 9 была первой

описанной мутацией c-KIT за пределами околомембраного домена экзона И (Lux et al. 2000), но никогда не была ассоциирована с ответом на терапию Гливеком.

Панель маркерных генов, полученная в результате наших исследований, представляет безусловный интерес для дальнейших исследований. В настоящий момент представление о механизмах терапевтического эффекта Гливека на СОЖКТ ограничивается лишь пониманием наличия ингибирования киназной активности рецептора KIT и ряда его низл ежащих эффекторов. Наши исследования продемонстрировали, что сигнальные каскады АКТ и ERK1/2 подвергаются быстрому ингибированию в ответ на действие Гливека. Результаты наших исследований с использованием ингибиторов этих каскадов, препарата LY294002, действующего на фосфоинозитол-3-киназу (PI3K), и препарата U0126, ингибирующего вышестоящую киназу МЕК1, позволяют предполагать наличие дополнительных механизмов передачи сигнала в ответ на действие Гливека.

Мы использовали метод иерархической группировки для выделения кластера репрессированных Гливеком генов, включающего наиболее репрессированный ген SPRY4A. Нами показано, что уровни экспрессии SPRY4A и ARHGEF2 значительно снижаются в присутствии Гливека. Интересно, что белковые продукты этих двух генов вовлечены в петлю обратной связи цепи передачи сигнала белком Ras и образуют комплексы с адапторными белками, активирующими Ras (Ozaki et al. 2001). Мы получили поликлональные антитела к SPRY4, показали его репрессию и высказали предположение, что координированная репрессия генов SPRY4A и ARHGEF2 и их белковых продуктов может бьгть аргументом в пользу существования потенциального регуляторного каскада, связанного с ингибированием активации KIT Гливеком.

Обнаруженная нами репрессия транскрипта гена фосфодиэстеразы 2 (PDE2A) может быть напрямую связана с ее ролью в трансдукции клеточных сигналов. Известно, что цГМФ-зависимая фосфодиэстераза 2 контролирует концентрацию клеточного цАМФ и подвергается гиперэкспрессии в ряде опухолей (Hamdahl et al. 2002). Было показано, что некоторые рецепторные тирозинкиназы могут передавать сигнал не только через адапторные белки, но и через вторичные мессенджеры. В силу этого фосфодиэстеразы являются критическим звеном передачи сигнала вниз от рецептора и определяют клеточный ответ на различные стимулы. Действительно, в ряде последних работ выявлена ключевая роль фосфодиэстераз в прохождении сигнала от рецептора IGF-1R в клетках поджелудочной железы и репрессия PDE2A в процессе апоптоза (Ahmad et al. 2000; Thompson et al. 2000).

Обнаруженная нами гиперэкспрессии гена, кодирующего F-box белка мышечной дистрофии (MAFbx), представляет значительный интерес. MAFbx, известный также под названием Атрогин-1, является убиквитиновой лигазой - белком, связывающимся со специфическими субстратами и обеспечивающим их убиквитинизацию (Bodine et al. 2001; Gomes et al. 2001). Индукция MAFbx в клетках СОЖКТ указывает на важную роль белкового продукта этого гена в процессе развития некроза опухоли. По нашим данным, экспрессия трансгена MAFbx в клетках СОЖКТ приводит к значительному снижению числа делящихся клеток и имитирует эффект Гливека.

Экспрессия гена MAFbx до сих пор была показана только в клетках скелетной мускулатуры и кардиомиоцитах. Мы впервые показали экспрессию MAFbx в гладкомышечных клетках и частично охарактеризовали функциональное значение этого гена. Экспрессия гена MAFbx может быть следствием миогенной дифференцировки клеток-предшественников СОЖКТ. Гиперэкспрессия этого гена в ответ на действие Гливека может объяснить причину частых мышечных спазмов и судорог, которые наблюдаются как побочный эффект при приеме Гливека.

Выявленная в этой работе корреляция между экспрессией генов SPRY4A и MAFbx и клинической картиной ответа на терапию Гливеком имеет чрезвычайно достоверный характер и особенно интересна в случае пациента №4, у которого наблюдали изменение экспрессии генов SPRY4A и MAFbx во время положительного клинического ответа и возврат на прежний уровень при рецидиве заболевания. Эти данные приобретают особый интерес в связи с недавней публикацией, показывающей связь СОЖКТ и SPRY4A (Nielsen et al. 2002). Результаты этой работы продемонстрировали тот факт, что гены SPRY1, SPRY4 и с-КГГ в числе ряда других отличают СОЖКТ от сарком другого класса.

В целом, выполненное исследование выявило ряд фактов, проясняющих молекулярные механизмы индивидуальной чувствительности/устойчивости СОЖКТ к Гливеку. Однако оно поставило ряд новых вопросов, ждущих своего разрешения.

выводы

1. Впервые создана модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ) in vitro - стабильная клеточная линия GIST882, которую использовали для изучения механизмов ингибирования рецепторной тирозинкиназы с-КГГ фениламинопиримидином (Гливеком). Проведено генотипирование этой линии и мутационный анализ c-kit. Определена чувствительность и характер ответа GIST882 (по состоянию клеточного цикла, выживаемости, уровням пролиферации и апоптоза) на обработку противоопухолевым препаратом Гливек.

2. С помощью геномного подхода, основанного на анализе экспрессии генов при помощи технологии ДНК-микрочипов (10368 фрагментов кДНК), провели поиск потенциальных генетических мишеней действия Гливека в культуре клеток СОЖКТ. При воздействии Гливека наблюдали изменения экспрессии 14 генов, для семи из которых результаты подтверждены методами ОТ-ГГЦР и Нозерн-блоттинга. Наиболее выраженные эффекты Гливека состояли в репрессии гена SPRY4A и гиперэкспрессии гена MAFbx. Показано, что изменение экспрессии генов SPRY4A и MAFbx обусловлено подавлением прохождения сигнала от рецептора КГГ по МАР-киназному каскаду после воздействия Гливека.

3. Эффекты подавления экспрессии SPRY4A и гиперэкспрессии MAFbx под действием Гливека наблюдали также в клинических биопсийных образцах опухолей семи пациентов, полученных до и во время терапии Гливеком. Следовательно, анализ экспрессии генов SPRY4A и MAFbx (особенно в материале тонкоигольной биопсии опухоли с малым количеством клеточного материала) можно использовать для ранней клинической оценки ответа на терапию Гливеком.

4. С помощью иммуноблоттинга показано, что Гливек в культуре клеток и в опухолях больных ингибирует активность рецептора КГГ по механизму фосфорилирования, а также значительно снижает фосфорилирование МАР-киназ ERK1 и ERK2 и зависящего от фосфоинозитол-3-фосфаткиназы фермента АКТ, приводя к снижению их активности без изменения общего количества каждого из белков.

5. В одном из клинических образцов СОЖКТ обнаружена соматическая мутация гена c-kit, приводящая к резистентности при терапии Гливеком. Показано, что она представляет собой ранее описанную инсерционную мутацию с 6-тинуклеотидной вставкой в положении 1530 (1530ins6).

6. Получены поликлональные антитела к белку SPRY4A и с их помощью показано снижение содержания этого белка в клетках GIST882 после обработки Гливеком.

Сравнение кинетики деградации транскрипта и уровня белкового продукта гена БРЯУ4А свидетельствует об относительной стабильности этого белка в клетке. 7. Установлено, что гиперэкспрессия трансгена МАРЪх в клетках СТ8Т882, доставленного с помощью системы лентивирусов, приводит к аресту роста и пролиферации, тем самым моделируя эффект обработки этих клеток Гливеком.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Andrey Frolov, Amanda Н. Prowse, Lisa Vanderveer, Betsy Bove, Hong Wu and Andrew K. Godwin. DNA array-based method for detection of large rearrangements in the BRCA1 gene. Genes Chromosomes Cancer. 2002 Nov; 35(3):232-41.

2. Smedberg, J., Smith, E.R., Capo-chichi, C.D., Frolov, A., Yang D.-H., Godwin, A.K., Xu, XX. Ras/MAPK pathway confers basement membrane-dependency upon endoderm differentiation of embryonic carcinoma cells. J Biol Chem. 2002,0ct25;277(43):40911-8.

3. A Frolov, JP Amoletti, ZZ Pan, О Favorova, J Fletcher, M von Mehren, В Eisenberg, AK Godwin. Sprouty4A, a Novel Genetic Marker of Response to Imatinib Mesylate in Gastrointestinal Stromal Tumors; Annals of Surgical Oncology. 2003 Vol.10 (1): S8

4. Andrey Frolov, Santiago Chahwan, Michal Ochs, Juan Pablo Amoletti, Zhong-Zong Pan, Olga Favorova, Margaret von Mehren, Burton Eisenberg, Andrew K. Godwin. Response Markers and the Molecular Mechanisms of Action of Gleevec in Gastrointestinal Stromal Tumois (GISTs). Mol Cancer Ther. 2003 Aug;2(8):699-709.

5. A.E. Фролов, Э.К. Годвин, O.O. Фаворова. Анализ дифференциальной экспрессии генов на ДНК-мшсрочипах и его применение в молекулярной онкологии. Молекулярная биология 2003, Vol.37(4) 573-584

6. Andrey Frolov, Juan Pablo Amoletti, Zhong-Zong Pan, Margaret von Mehren, Michael Ochs, Burton Eisenberg, Andrew K. Godwin. Sprouty 4A; a Novel Diagnostic Marker of Response to Gleevec (ST1-571) in Gastrointestinal Stromal Tumors. Седьмая ежегодная научная конференция имени Эдварда Д. Ластбайдера. Филадельфия, США. Июнь 2002. СИМПОЗИАЛЬНЫЙ ДОКЛАД

7. Audrey Frolov, Juan Pablo Amoletti, Zhong-Zong Pan, Santiago Chahwan, Jonathan Fletcher, Olga Favorova, Margaret von Mehren, Burton Eisenberg, Andrew K. Godwin. Genocentric approach to determine response markers to Gleevec using an in vitro model for gastrointestinal stromal tumors (GISTs). 2-ая научная конференция по проблемам рака желудочно-кишечного тракта проводимая Онкологическим центром Андерсона. Орландо, США. Ноябрь, 2002

8. A Frolov, JP Amoletti, ZZ Pan, О Favorova, J Fletcher, M von Mehren, В Eisenberg, AK Godwin. Sprouty4A, a Novel Genetic Marker of Response to Imatinib Mesylate in Gastrointestinal Stromal Tumors. 56-ая ежегодная конференция общества хирургов-онкологов (Society of Surgical Oncology), Лос-Анджелес, Март, 2003. СИМПОЗИАЛЬНЫЙ ДОКЛАД

9. Andrey Frolov, Santiago Chahwan, Zhong-Zong Pan, Jonathan Fletcher, Olga Favorova, Margaret von Mehren, Burton Eisenberg, Andrew K. Godwin. Gleevec and gastrointestinal stromal tumors (GISTs): Identification of response markers and the molecular mechanisms of action. Опубликовано "Proceedings of the American Association for Cancer Research", Vol.44, p.217, Март 2003. СИМПОЗИАЛЬНЫЙ ДОКЛАД.

И 6515

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 29.09.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 602. Тел. 939-3890,928-2227,928-1042. Факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фролов, Андрей Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПЕРЕАЧА СИГНАЛА РЕЦЕПТОРОМ KIT И ЕГО БЛОКАДА СЕЛЕКТИВНЫМ ИНГИБИТОРОМ ТИРОЗИНОВЫХ КИНАЗ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ПРЕПАРАТОМ ГЛИВЕК.

1.1. Структура рецептора KIT

1.2. Лиганд рецептора KIT - стволовой фактор роста

1.3. Функции системы KIT/SCF

1.4. Молекулярные каскады, вовлеченные в передачу сигнала рецептором KIT

1.4.1. Каскад Фосфотидилинозитол 3'- Киназы

1.4.2. Каскад JAK/STAT

1.4.3. Src киназы

1.4.4. Каскад Ras/MAP киназы

1.4.5. МАРК каскад и транскрипционные факторы

1.4.6. Каскад фосфолипазы Су

1.4.7. Каскад с вовлечением адаптерных белков

1.5. Отрицательная регуляция прохождения сигнала KIT

1.5.1. Отрицательная возвратная петля протеинкиназы С (РКС)

1.5.2. Тирозиновая фосфатаза, содержащая Src~ гомологичный домен 2 (8Н2-домен)

1.6 Эффекты активирующих мутаций c-KIT на трансдукцию сигнала от рецептора внутрь клетки

1.6.1. Активирующие мутации гена c-KIT

1.6.2. Последствия активирующих мутаций гена c-KIT

1.7. Гливек - селективный ингибитор рецепторных тирозиновых киназ

Глава 2. АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА ДНК-МИКРОЧИПАХ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2.1. Эволюция методов анализа дифференциальной экспрессии генов

2.1.1. Метод дифференциального дисплея мРНК (DD)

2.1.2. Методы вычитающей гибридизации

2.1.3. Серийный анализ экспрессии генов (SAGE)

2.2. Метод гибридизации на ДНК-микрочипах

2.2.1. Производство ДНК-чипов

2.2.2. Аспекты экспериментального дизайна

2.2.3. Получение кДНК и гибридизация на ДНК-микрочипах

2.2.4. Детекция гибридизационного сигнала и количественная оценка изображений

2.2.5. Обработка и вскрытие полученных данных

2.3. Применение ДНК-микрочипов в молекулярной онкологии.

2.4. Ближайшие перспективы применения и развития технологии ДНК-чипов

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культура клеток СОЖКТ.

2. Обработка культуры клеток СОЖКТ Гливеком и оценка пролиферации и апоптоза.

3. Анализ состояния клеточного цикла.

4. Выделение суммарной фракции РНК.

5. Производство ДНК-чипов. в. Приготовление и гибридизация зондовой кДНК смеси.

7. Расчет интенсивности сигнала и математическая обработка данных.

8. Аннотация и секвенирование кДНК клонов.

9. Нозерн блоттинг анализ.

10. Обратная транскрипция РНК.

11. Полимеразная цепная реакция.

12. Обработка клеток СОЖКТ ингибитором МЕК и ингибитором PI3K.

13. Получение полноразмерной кДНК гена MAFbx, присоединение мус-эпитопа и клонирование в экспрессирующий лентивирусный вектор.

14. Экспрессия трансгена MAFbx с использованием лентивирусной системы экспрессии.

15. Дизайн и производство поликлональных антител к белку SPRY4.

16. Приготовление клеточных лизатов, белковый электрофорез и Вестерн блоттинг.

17. Клинические образцы и биоптаты СОЖКТ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание модели стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта in vitro.

2. Выявление маркеров эффективности лечения Гливеком стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ) и молекулярные механизмы его фармокодинамики.

2.1. Эффект лекарственного воздействия Гливека на рост и пролиферацию клеток СОЖКТ в системе in vitro.

2.2. Профилирование экспрессии генов в культуре клеток СОЖКТ, обработанных Гливеком, с использованием кДНК чипов.

3. Ингибирование рецептора c-KIT Гливеком в клетках GIST882.

4. Регуляция экспрессии Гливек-зависимых генов SPRY4A, MAFbx и ARHGEF2 осуществляется ERKI/2-зависимым путем.

5. Определение значимости генов SPRY4A и MAFbx как непрямых маркеров ответа на Гливек в клинических образцах СОЖКТ.

6. Анализ экспрессии с-KIT, АКТ и ERK1/2 в СОЖКТ резистентной к Гливеку.

7. Экспрессия трансгена MAFbx вызывает нарушение пролиферации клеток СОЖКТ.

8. Только ген SPRY4A из семейства генов Sprouty подвергается репрессии в клетках GIST882, обработанных Гливеком.

9. Получение поликлональных антител к SPRY4 позволило выявить снижение уровня этого белка после обработки клеток GIST882 Гливеком.

V. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов"

Передача сигнала рецепторными тирозинкиназами является важнейшем звеном регуляции биологических процессов клеточного роста, дифференцировки и смерти. Нерегулируемая активация этих рецепторов является ведущим и порой единственным механизмом канцерогенеза ряда опухолей и патологий развития. Протоонкоген c-kit кодирует трансмембранную рецепторную тирозинкиназу типа III для колониестимулирующего фактора роста. Активирующие мутации в этом гене приводят к конститутивному фосфорилированию рецептора даже в отсутствие колониестимулирующего фактора роста и как следствие к туморогенезу некоторых мезенхимальных и эпителиальных новообразований. Множество фактов свидетельствует о том, что блокирование активности различных рецепторов и белков, участвующих в канцерогенезе, приводит к уменьшению размеров опухоли и продлению жизни больных. Использование новых химических соединений направленного действия, селективно воздействующих на рецепторные белки в опухолевых клетках, реально обеспечивает ббльшую эффективность лечения и меньшую токсичность по сравнению с традиционной неспецифичной химиотерапией.

Для большой группы сарком мягких тканей, самыми распространенными среди которых являются мезенхимапьные новообразования желудочно-кишечного тракта, характерна экспрессия и конститутивная активация рецептора c-KIT. В США ежегодно выявляется около 5000 новых случаев стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ). В большинстве случаев заболевание заканчивается летальным исходом в течение нескольких лет после постановки диагноза вследствие низкой эффективности традиционной химио- и радиотерапии, причины которой остаются неясными. Прогнозирование успеха лечения конкретного онкологического больного до сих пор остается нерешенной задачей. Одним из подходов к прогнозированию чувствительности к терапевтическому воздействию является поиск маркеров индивидуального ответа и изучения молекулярных эффектов воздействия лекарственного средства, однако большинство предпринятых в этом направлении попыток не обеспечило желаемого эффекта. В частности, это касается лечения СОЖКТ противоопухолевым препаратом фениламинопиримидином (Гливеком). Гливек принадлежит к новейшему классу селективных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, к которым относятся рецепторы c-KIT, PDGFR и Всг-АЫ. Молекулярный механизм действия фениламинопиримидина был изучен в случае ингибирования рецептора Всг-АЫ при хроническом миелолейкозе. Что касается c-KIT, обладающего структурной аналогией с Всг-АЫ, то механизм его ингибирования Гливеком, а также последующий молекулярный ответ на действие этого препарата изучены лишь поверхностно. Впервые Гливек использовали для лечения сарком мягких тканей в рамках клинических испытаний №CSTI571-В2222, проведенных в США. Фаза II этих испытаний выявила большое количество положительных ответов, однако 13% пациентов не ответили на терапию, а у ряда больных наблюдали рецидив заболевания в течение нескольких месяцев после условно-положительного ответа. Вопрос о молекулярных механизмах первичной и приобретенной резистентности к Гливеку остается открытым.

Анализ дифференциальной экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов является оптимальным подходом для решения этого вопроса, а также для определения возможных маркеров устойчивости к Гливеку. Мы приняли решение изучить влияние Гливека на дифференциальную экспрессию (профилирование) генов в клетках СОЖКТ, сравнивая «генетические портреты» обработанных и необработанных препаратом культур этих клеток. Биологическую значимость результатов профилирования проверяли на панели клинических образцов опухолей, полученных от пациентов до и во время лечения Гливеком.

Целью настоящей работы было исследование молекулярных механизмов ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT фениламинопиримидином (Гливеком) и изучение воздействия этого селективного ингибитора тирозинкиназ на изменение передачи сигнала в клетках СОЖКТ. Ставился также целью поиск прогностических маркеров эффективности индивидуального лечения больных СОЖКТ этим препаратом, а, возможно, и ранее неизвестных перспективных терапевтических мишеней.

В связи с этим в работе ставились следующие экспериментальные задачи:

4. Исследовать молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора с-KIT фениламинопиримидином, анализируя состояние активации ключевых адаптерных белков сигнальных каскадов, начинающихся от рецептора с-К1Т.

5. Провести функциональную оценку механизмов действия белковых продуктов маркерных генов и вычленить функционально активные молекулярные каскады прохождения сигнала от рецептора с-KIT при его активации и ингибировании в контексте СОЖКТ.

Все представленные в работе результаты имеют научную новизну. Полученная в настоящей работе клеточная линия GIST882 является первой описанной стабильной культурой клеток СОЖКТ. Эта клеточная линия впервые использована нами как модель СОЖКТ для изучения биологии этого новообразования. Получив препарат Гливек с любезного разрешения компании «Новартис Онкология», мы имели возможность в рамках клинических испытаний впервые исследовать действие Гливека на культуре клеток GIST882. Впервые всесторонне оценено действие Гливека на рост, пролиферацию клеток СОЖКТ и индукцию в них апоптоза, равно как на состояние и взаимодействие каскадов прохождения сигнала от рецептора KIT и на уровни экспрессии других генов. Нами впервые проведено генетическое профилирование ответа на действие Гливека в системе СОЖКТ in vitro. В ходе этих экспериментов впервые выявлен ряд Гливек-зависимых генов, которые потенциально могут использоваться в качестве маркеров эффективности лекарственного ответа, а для семи из них изменение экспрессии при действии Гливека подтверждено двумя независимыми методами. Эффект резкого изменения экспрессии двух генов (SPRY4A и ШРЬл) под действием Гливека наблюдали также в клинических биопсийных образцах опухолей больных СОЖКТ, что является принципиально новым результатом. Впервые показано, что инсерционная соматическая мутация гена c-KIT 1530ins6 определяет резистентность к Гливеку. Молекулярные механизмы эффектов Гливека также впервые подробно исследованы на уровне белков.

Анализ экспрессии генов, определяющих эффективность ответа на Гливек, позволил найти прогностические маркеры результативности лечения Гливеком, которые можно определять даже в тонкоигольных биоптатах СОЖКТ. Выявленные маркеры являются высоконадежными; действительно, предсказание совпадало с клинической картиной в 100% случаев. Разработанная модель СОЖКТ in vitro имеет большую практическую ценность, поскольку может быть использована для поиска потенциальных маркеров лекарственной эффективности других препаратов. Кроме того, на основании полученных в этой работе данных белковые продукты генов SPRY4A и RTP801 могут рассматриваться как потенциальные мишени при разработке новых лекарственных препаратов, особенно в случаях СОЖКТ, резистентной к Гливеку.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Фролов, Андрей Евгеньевич

выводы

1. Впервые создана модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ) in vitro - стабильная клеточная линия GIST882, которую использовали для изучения механизмов ингибирования рецепторной тирозинкиназы c-KIT фениламинопиримидином (Гливеком). Проведено генотипирование этой линии и мутационный анализ c-kit. Определена чувствительность и характер ответа GIST882 (по состоянию клеточного цикла, выживаемости, уровням пролиферации и апоптоза) на обработку противоопухолевым препаратом Гливек.

2. С помощью геномного подхода, основанного на анализе экспрессии генов при помощи технологии ДНК-микрочипов (10368 фрагментов кДНК), провели поиск потенциальных генетических мишеней действия Гливека в культуре клеток СОЖКТ. При воздействии Гливека наблюдали изменения экспрессии 14 генов, для семи из которых результаты подтверждены методами ОТ-ПЦР и Нозерн-блоттинга. Наиболее выраженные эффекты Гливека состояли в репрессии гена SPRY4A и гиперэкспрессии гена MAFbx. Показано, что изменение экспрессии генов SPRY4A и MAFbx обусловлено подавлением прохождения сигнала от рецептора KIT по МАР-киназному каскаду после воздействия Гливека.

4. С помощью иммуноблоттинга показано, что Гливек в культуре клеток и в опухолях больных ингибирует активность рецептора KIT по механизму фосфорилирования, а также значительно снижает фосфорилирование МАР-киназ ERK1 и ERK2 и зависящего от фосфоинозитол-3-фосфаткиназы фермента АКТ, приводя к снижению их активности без изменения общего количества каждого из белков.

6. Получены поликлонапьные антитела к белку SPRY4A и с их помощью показано снижение содержания этого белка в клетках GIST882 после обработки Гливеком. Сравнение кинетики деградации транскрипта и уровня белкового продукта гена SPRY4A свидетельствует об относительной стабильности этого белка в клетке.

7. Установлено, что гиперэкспрессия трансгена MAFbx в клетках GIST882, доставленного с помощью системы лентивирусов, приводит к аресту роста и пролиферации, тем самым моделируя эффект обработки этих клеток Гливеком.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой за внимательное руководство и критицизм и проф. Эндрю Годвину за предоставленную возможность выполнения работы в его лаборатории и консультативную помощь в осуществлении проекта.

Автор выражает глубокую благодарность проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой и проф. Эрике Големис за организацию программы сотрудничества между Россиийским Государственным Медицинским Университетом и Фокс-Чейзовским Онкологическим Центром.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фролов, Андрей Евгеньевич, Москва

1. Besmer, P., et al., A new acute transforming feline retrovirus and relationship ofits oncogene v-kit with the protein kinase gene family. Nature, 1986. 320(6061): p. 415-21.

2. Qiu, F.H., et al., Primary structure of c-kit: relationship with the CSF-1/PDGFreceptor kinase family-oncogenic activation of v-kit involves deletion of extracellular domain and С terminus. Embo J, 1988.7(4): p. 1003-11.

3. Yarden, Y., et al., Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptortyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J., 1987.6(11): p. 33413351.

4. Chabot, В., et al., The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosinekinase receptor maps to the mouse W locus. Nature, 1988. 335(6185): p. 8889.

5. Reith, A.D., et al., Signal transduction by normal isoforms and W mutantvariants of the Kit receptor tyrosine kinase. Embo J, 1991.10(9): p. 24512459.

6. Blechman, J.M., et al., Soluble c-kit proteins and antireceptor monoclonalantibodies confine the binding site of the stem cell factor. J Biol Chem, 1993. 268(6): p. 4399-4406.

7. Blechman, J.M., et al., The fourth immunoglobulin domain of the stem cell factorreceptor couples ligand binding to signal transduction. Cell, 1995. 80(1): p. 103-113.

8. Lev, S., et al., Interspecies molecular chimeras of kit help define the binding siteof the stem cell factor. Mol Cell Biol, 1993.13(4): p. 2224-2234.

9. Copeland, N.G., et al., Mast cell growth factor maps near the steel locus onmouse chromosome 10 and is deleted in a number of steel alleles. Cell, 1990.63(1): p. 175-183.

10. Williams, D.E., et al., Identification of a ligandforthe c-kit proto-oncogene. Cell,1990.63(1): p. 167-174.

11. Zsebo, K.M., et al., Stem cell factor is encoded at the SI locus of the mouse andis the ligand for the c-kit tyrosine kinase receptor. Cell, 1990. 63(1): p. 213224.

12. Besmer, P., The kit ligand encoded at the murine Steel locus: a pleiotropicgrowth and differentiation factor. Curr Opin Cell Biol, 1991. 3(6): p. 939-46.

13. Nocka, K., et al., Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor:

14. KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. Embo J, 1990. 9(10): p. 3287-3294.

15. Yee, N.S., et al., Mechanism of down-regulation of c-kit receptor. Roles ofreceptor tyrosine kinase, phosphatidylinositol З'-kinase, and protein kinase C. J Biol Chem, 1994. 269(50): p. 31991-31998.

16. Dastych, J. and D.D. Metcalfe, Stem cell factor induces mast cell adhesion tofibronectin. J Immunol, 1994.152(1): p. 213-219.

17. Meininger, C.J., et al., The c-kit receptor ligand functions as a mast cellchemoattractant. Blood, 1992. 79(4): p. 958-963.

18. Blume-Jensen, P., et al., Activation of the human c-kit product by ligandinduced dimerization mediates circular actin reorganization and chemotaxis. Embo J, 1991.10(13): p. 4121-4128.

19. Besmer, P., Kit-/igand-stem cell factors, In Colony Stimulating Factors, J.

20. Garland and P. Quesenberry, Editors. 1997, Marcel Dekker: New York.

21. Pawson, Т., Protein modules and signalling networks. Nature, 1995. 373(6515):p. 573-580.

22. Rottapel, R., et al., The Steel/W transduction pathway: kit autophosphorylationand its association with a unique subset of cytoplasmic signaling proteins is induced by the Steel factor. Mol Cell Biol, 1991.11(6): p. 3043-3051.

23. Daly, R.J., The Grb7 family of signalling proteins. Cell Signal, 1998.10(9): p.613.618.

24. Tsujimura, Т., et al., Constitutive activation of c-kit in FMA3 murinemastocytoma cells caused by deletion of seven amino acids at the juxtamembrane domain. Blood, 1996. 87(1): p. 273-283.

25. Feng, G.S., et al., Grap is a novel SH3-SH2-SH3 adaptor protein that couplestyrosine kinases to the Ras pathway. J Biol Chem, 1996.271(21): p. 12129•f12132.

26. Liu, S.K. and C.J. McGlade, Gads is a novel SH2 and SH3 domain-containingadaptor protein that binds to tyrosine-phosphorylated She. Oncogene, 1998. 17(24): p. 3073-3082.

27. Cutler, R.L., et al., Multiple cytokines induce the tyrosine phosphorylation of Sheand its association with Grb2 in hemopoietic cells. J Biol Chem, 1993. 268(29): p. 21463-21465.

28. De Sepulveda, P., et al., Socsl binds to multiple signalling proteins andsuppresses steel factor-dependent proliferation. Embo J, 1999.18(4): p. 904915.

29. Carpino, N. et al., p62(dok): a constitutivelytyrosine-phosphorylated, GAPassociated protein in chronic myelogenous leukemia progenitor cells. Cell, 1997. 88(2): p. 197-204.

30. Nishida, K., etal., Gab-family adapter proteins act downstream of cytokine andgrowth factor receptors and T- and B-cell antigen receptors. Blood, 1999. 93(6): p. 1809-1816.

31. Alal, M., et al., Steel factor stimulates the tyrosine phosphorylation of the protooncogene product, p95vav, in human hemopoietic cells. J Biol Chem, 1992. 267(25): p. 18021-18025.

32. Blume-Jensen, P., et al., Modulation of Kit/stem cell factor receptor-inducedsignaling by protein kinase C. J Biol Chem, 1994. 269(34): p. 21793-21802.

33. Tang, В., et al., Tec kinase associates with c-kit and is tyrosine phosphorylatedand activated following stem cell factor binding. Mol Cell Biol, 1994.14(12): p. 8432-8437.

34. Weiler, S.R., et al., JAK2 is associated with the c-kitproto-oncogene productand is phosphorylated in response to stem cell factor. Blood, 1996. 87(9): p. 3688-3693.

35. Duronio, V., et al., p21ras activation via hemopoietin receptors and c-kitrequires tyrosine kinase activity but not tyrosine phosphorylation of p21 ras GTPase-activating protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(5): p. 15871591.

36. Tournier, C., et al., Mitogen-activated protein kinase kinase 7 is an activator ofthe c-Jun NH2-terminal kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(14): p. 7337-7342.

37. Lopez-llasaca, M., etal., Requirement of phosphatidylinositol-3 kinase foractivation ofJNK/SAPKs by PDGF. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 232(2): p. 273-277.

38. Fukunaga, R. and T. Hunter, MNK1, a new MAP kinase-activatedproteinkinase, isolated by a novel expression screening method for identifying protein kinase substrates. Embo J, 1997.16(8): p. 1921-33.

39. Ludwig, S., et al., 3pK, a novel mitogen-activated protein (MAP) kinaseactivated protein kinase, is targeted by three MAP kinase pathways. Mol Cell Biol, 1996.16(12): p. 6687-6697.

40. Timokhina, I., et al., Kit signaling through PI 3-kinase and Src kinase pathways:an essential role for Rac1 and JNK activation in mast cell proliferation. Embo J, 1998.17(21): p. 6250-6262.

41. Blume-Jensen, P., etal., Increased Kit/SCF receptor induced mitogenicity butabolished cell motility after inhibition of protein kinase C. Embo J, 1993. 12(11): p. 4199-4209.

42. Lorenz, U., et al., Genetic analysis reveals cell type-specific regulation ofreceptor tyrosine kinase c-Kit by the protein tyrosine phosphatase SHP1. J Exp Med, 1996.184(3): p. 1111-1126.

43. Paulson, R.F., et al.t Signalling by the W/Kit receptor tyrosine kinase isnegatively regulated in vivo by the protein tyrosine phosphatase Shp1. Nat Genet, 1996.13(3): p. 309-315.

44. Huber, M., et al., The src homology 2-containing inositol phosphatase (SHIP) isthe gatekeeper of mast cell degranulation. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(19): p. 11330-11335.

45. Lev, S., D. Givol, and Y. Yarden, Interkinase domain of kit contains the bindingsite for phosphatidylinositol 3'kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(2): p. 678-682.

46. Gommerman, J.L., R. Rottapel, and S.A. Berger, Phosphatidylinositol 3-kinaseand Ca2+ influx dependence for ligand-stimulated internalization of the c-Kit receptor. J Biol Chem, 1997. 272(48): p. 30519-30525.

47. Ihle, J.N. and I.M. Kerr, Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptorsuperfamily. Trends Genet, 1995.11(2): p. 69-74.

48. Darnell, J.E., Jr., STATs and gene regulation. Science, 1997. 277(5332): p.1630-1635.

49. O'Shea, J.J., Jaks, STATs, cytokine signal transduction, and immunoregulation:are we there yet? Immunity, 1997. 7(1): p. 1-11.

50. Shuai, K., et al., Interferon activation of the transcription factor Stat91 involvesdimerization through SH2-phosphotyrosyl peptide interactions. Cell, 1994. 76(5): p. 821-828.

51. Leaman, D.W., et al., Regulation of STAT-dependent pathways by growthfactors and cytokines. Faseb J, 1996.10(14): p. 1578-1588.

52. Deberry, C., S. Мои, and D. Linnekin, Statl associates with c-kit and isactivated in response to stem cell factor. Biochem J, 1997. 327 (Pt 1): p. 7380.

53. Linnekin, D., C.S. DeBerry, and S. Мои, Lyn associates with thejuxtamembrane region of c-Kit and is activated by stem cell factor in hematopoietic cell lines and normal progenitor cells. J Biol Chem, 1997. 272(43): p. 27450-27455.

54. Leon, J., I. Guerrero, and A. Pel I ice r, Differential expression of the ras genefamily in mice. Mol Cell Biol, 1987. 7(4): p. 1535-1540.

55. Umanoff, H., et al., The murine N-ras gene is not essential for growth anddevelopment. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(5): p. 1709-1713.

56. Johnson, L., et al., K-ras is an essential gene in the mouse with partialfunctional overlap with N-ras. Genes Dev, 1997.11(19): p. 2468-2481.

57. Ulsh, L.S. and T.Y. Shih, Metabolic turnover of human c-rasH p21 protein of EJbladder carcinoma and its normal cellular and viral homologs. Mol Cell Biol, 1984. 4(8): p. 1647-52.

58. Malumbres, M. and A. Pellicer, RAS pathways to cell cycle control and celltransformation. Front Biosci, 1998. 3: p. d887-912.

59. Krengel, U., etal., Three-dimensional structures of H-ras p21 mutants:molecular basis for their inability to function as signal switch molecules. Cell, 1990. 62(3): p. 539-48.

60. Scheffzek, К., et al., The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPaseactivation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science, 1997. 277(5324): p. 333-8.

61. Scheele, J.S., J.M. Rhee, and G.R. Boss, Determination of absolute amounts of

62. GDP and GTP bound to Ras in mammalian cells: comparison of parental and Ras-overproducing NIH 3T3 fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(4): p. 1097-1100.

63. Hesketh, R., The Oncogene Handbook. 1994: Academic Press. 378-413.

64. Lowy, D.R. and B.M. Willumsen, Function and regulation of ras. Annu Rev

65. Biochem, 1993. 62: p. 851-891.

66. Rodriguez-Viciana, P., et al., Activation of phosphoinositide 3-kinase byinteraction with Ras and by point mutation. Embo J, 1996.15(10): p. 24422451.

67. Katz, M.E. and F. McCormick, Signal transduction from multiple Ras effectors.

68. Curr Opin Genet Dev, 1997. 7(1): p. 75-9.

69. Leevers, S.J., H.F. Paterson, and C.J. Marshall, Requirement for Ras in Rafactivation is overcome by targeting Raf to the plasma membrane. Nature, 1994. 369(6479): p. 411-414.

70. Marais, R., etal., Differential regulation ofRaf-1, A-Raf, andB-Rafbyoncogenic ras and tyrosine kinases. J Biol Chem, 1997.272(7): p. 4378-83.

71. Hamilton, M. and A. Wolfman, Oncogenic Ha-Ras-dependent mitogen-activatedprotein kinase activity requires signaling through the epidermal growth factor receptor. J Biol Chem, 1998. 273(43): p. 28155-62.

72. Reuter, C.W., et al., Biochemical analysis of MEKactivation in NIH3T3fibroblasts. Identification of B-Raf and other activators. J Biol Chem, 1995. 270(13): p. 7644-55.

73. Berra, E., et al., Evidence for a role of MEK and МАРК during signaltransduction by protein kinase С zeta. Embo J, 1995.14(24): p. 6157-6163.

74. Nakanishi, H., K.A. Brewer, and J.H. Exton, Activation of the zeta isozyme ofprotein kinase С by phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. J Biol Chem, 1993.268(1): p. 13-16.

75. Ballester, R., M.E. Furth, and O.M. Rosen, Phorbol ester- and protein kinase Cmediated phosphorylation of the cellular Kirsten ras gene product. J Biol Chem, 1987. 262(6): p. 2688-95.

76. Diaz-Meco, M.T., et al., Evidence for the in vitro and in vivo interaction of Raswith protein kinase С zeta. J Biol Chem, 1994. 269(50): p. 31706-10.

77. Lange-Carter, C.A. and G.L. Johnson, Ras-dependent growth factor regulationof MEK kinase in PC12 cells. Science, 1994. 265(5177): p. 1458-1461.

78. Fanger, G.R., N.L. Johnson, and G.L Johnson, MEK kinases are regulated by

79. EGFand selectively interact with Rac/Cdc42. Embo J, 1997.16(16): p. 496172.

80. Albright, C.F., et al., Characterization of a guanine nucleotide dissociationstimulator for a ras-related GTPase. Embo J, 1993.12(1): p. 339-347.

81. Kikuchi, A. and L.T. Williams, Regulation of interaction of ras p21 with RalGDSand Raf-1 by cyclic AMP-dependent protein kinase. J Biol Chem, 1996. 271(1): p. 588-594.

82. Urano, Т., R. Emkey, and L.A. Feig, Ral-GTPases mediate a distinctdownstream signaling pathway from Ras that facilitates cellular transformation. Embo J, 1996.15(4): p. 810-816.

83. Jullien-Flores, V., et al., Bridging Ral GTPase to Rho pathways. RLIP76, a Raleffector with CDC42/Rac GTPase-activating protein activity. J Biol Chem, 1995. 270(38): p. 22473-22477.

84. Kapeller, R. and L.C. Cantley, Phosphatidylinositol 3-kinase. Bioessays, 1994.16(8): p. 565-576.

85. Dhand, R., et al., PI 3-kinase is a dual specificity enzyme: autoregulation by anintrinsic protein-serine kinase activity. Embo J, 1994.13(3): p. 522-33.

86. Mcllroy, J., et al., Specific activation of p85-p110 phosphatidylinositol 3'-kinasestimulates DNA synthesis by ras- and p70 S6 kinase-dependent pathways. Mol Cell Biol, 1997.17(1): p. 248-255.

87. Hu, Q., et al., Ras-dependent induction of cellular responses by constitutivelyactive phosphatidylinositol-3 kinase. Science, 1995. 268(5207): p. 100-102.

88. Klippel, A., et al., A specific product of phosphatidylinositol 3-kinase directlyactivates the protein kinase Akt through its pleckstrin homology domain. Mol Cell Biol, 1997.17(1): p. 338-344.

89. Weng, Q.P., et al., Phosphatidylinositol 3-kinase signals activation of p70 S6kinase in situ through site-specific p70 phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(12): p. 5744-8.

90. Hawkins, P.T., et al., PDGFstimulates an increase in GTP-Rac via activation ofphosphoinositide 3-kinase. Curr Biol, 1995. 5(4): p. 393-403.

91. Khosravi-Far, R. and C.J. Der, The Ras signal transduction pathway. Cancer

92. Metastasis Rev, 1994.13(1): p. 67-89.

93. Bryant, S.S., et al., Two SH2 domains ofp120 Ras GTPase-activating proteinbind synergistically to tyrosine phosphorylated p190 Rho GTPase-activating protein. J Biol Chem, 1995. 270(30): p. 17947-17952.

94. McGlade, J., et al., The N-terminal region of GAP regulates cytoskeletalstructure and cell adhesion. Embo J, 1993.12(8): p. 3073-3081.

95. Han, J., et al., Role of substrates and products of PI 3-kinase in regulatingactivation of Rac-related guanosine triphosphatases by Vav. Science, 1998. 279(5350): p. 558-560.

96. Nimnual, A.S., B.A. Yatsula, and D. Bar-Sagi, Coupling of Ras and Racguanosine triphosphatases through the Ras exchanger Sos. Science, 1998. 279(5350): p. 560-563.

97. Denhardt, D.T., Signal-transducing protein phosphorylation cascades mediatedby Ras/Rho proteins in the mammalian cell: the potential for multiplex signalling. Biochem J, 1996. 318 ( Pt 3): p. 729-747.

98. Olson, M.F., A. Ashworth, and A. Hall, An essential role for Rho, Rac, and

99. Cdc42 GTPases in cell cycle progression through G1. Science, 1995. 269(5228): p. 1270-1272.

100. Horii, Y., et al., A novel oncogene, ost, encodes a guanine nucleotide exchangefactor that potentially links Rho and Rac signaling pathways. Embo J, 1994. 13(20): p. 4776-4786.

101. Marshall, C.J., MAP kinase kinase kinase, MAP kinase kinase and MAP kinase.

102. Curr Opin Genet Dev, 1994. 4(1): p. 82-89.

103. Hill, C.S., J. Wynne, and R. Treisman, The Rho family GTPases RhoA, Rac1,and CDC42Hs regulate transcriptional activation bySRF. Cell, 1995. 81(7): p. 1159-1170.

104. Pronk, G.J. and J.L. Bos, The role ofp21ras in receptor tyrosine kinasesignalling. Biochim Biophys Acta, 1994.1198(2-3): p. 131-147.

105. Madhani, H.D. and G.R. Fink, The riddle of MAP kinase signaling specificity.

106. Trends Genet, 1998.14(4): p. 151-155.

107. Xing, J., D.D. Ginty, and M.E. Greenberg, Coupling of the RAS-MAPK pathway to gene activation by RSK2, a growth factor-regulated CREB kinase. Science, 1996. 273(5277): p. 959-963.

108. Marais, R., J. Wynne, and R. Treisman, The SRF accessory protein Elk-1 contains a growth factor-regulated transcriptional activation domain. Cell, 1993. 73(2): p. 381-393.

109. Cano, E. and L.C. Mahadevan, Parallel signal processing among mammalian MAPKs. Trends Biochem Sci, 1995. 20(3): p. 117-122.

110. Minden, A., et al., Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell, 1995. 81(7): p. 1147-1157.

111. Minden, A. and M. Karin, Regulation and function of the JNK subgroup of MAP kinases. Biochim Biophys Acta, 1997.1333(2): p. F85-104.

112. Cavigelli, M., et al., Induction ofc-fos expression through JNK-mediated TCF/Elk-1 phosphorylation. Embo J, 1995.14(23): p. 5957-5964.

113. Su, Y.C., et al., NIK is a new Ste20-related kinase that binds NCK and MEKK1 and activates the SAPK/JNK cascade via a conserved regulatory domain. Embo J, 1997.16(6): p. 1279-1290.

114. Chen, H.E., et al., Regulation of colony-stimulating factor 1 receptor signaling by the SH2 domain-containing tyrosine phosphatase SHPTP1. Mol Cell Biol, 1996.16(7): p. 3685-3697.

115. Rodrigues, G.A., M. Park, and J. Schlessinger, Activation of the JNK pathway is essential for transformation by the Met oncogene. Embo J, 1997. 16(10): p. 2634-45.

116. Clark, E.A., et al., Genomic analysis of metastasis reveals an essential role forRhoC. Nature, 2000. 406(6795): p. 532-5.

117. Medema, R.H., et al., GTPase-activating protein SH2-SH3 domains induce gene expression in a Ras-dependent fashion. Mol Cell Biol, 1992.12(8): p. 3425-3430.

118. Finco, T.S., et al., Oncogenic Ha-Ras-induced signaling activates NF-kappaB transcriptional activity, which is required for cellular transformation. J Biol Chem, 1997. 272(39): p. 24113-6.

119. Teramoto, H., et al., The small GTP-binding protein rho activates c-Jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinases in human kidney293T cells. Evidence for a Рак-independent signaling pathway. J Biol Chem, 1996. 271 (42): p. 25731 -25734.

120. Van Aelst, L., T. Joneson, and D. Bar-Sagi, Identification of a novel Rac1-interacting protein involved in membrane ruffling. Embo J, 1996.15(15): p. 3778-86.

121. Michiels, F., et al., A role for Rac in Tiaml-induced membrane ruffling and invasion. Nature, 1995. 375(6529): p. 338-340.

122. Kimura, К., et al., Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science, 1996. 273(5272): p. 245-248.

123. Westwick, J.K., et al., Rac regulation of transformation, gene expression, and actin organization by multiple, PAK-independent pathways. Mol Cell Biol, 1997.17(3): p. 1324-1335.

124. Juo, P., et al., Fas activation of the p38 mitogen-activated protein kinase signalling pathway requires ICE/CED-3 family proteases. Mol Cell Biol, 1997. 17(1): p. 24-35.

125. Raingeaud, J., et al., Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine. J Biol Chem, 1995. 270(13): p. 7420-7426.

126. Wang, Z. and M.F. Moran, Requirement for the adapter protein GRB2 in EGFreceptor endocytosis. Science, 1996. 272(5270): p. 1935-1939.

127. Tan, Y., et al., FGF and stress regulate CREB and A TF-1 via a pathway involving p38 MAP kinase and MAPKAP kinase-2. Embo J, 1996.15(17): p. 4629-4642.

128. Kovarik, P., et al., Stress-induced phosphorylation of STAT1 at Ser727 requires p38 mitogen-activated protein kinase whereas IFN-gamma uses a different signaling pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(24): p. 13956-13961.

129. Raingeaud, J., et al., MKK3- and МККб-regulated gene expression is mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. Mol Cell Biol, 1996.16(3): p. 1247-1255.

130. Lin, A., et al., Identification of a dual specificity kinase that activates the Jun kinases and p38-Mpk2. Science, 1995. 268(5208): p. 286-90.

131. Brenner, В., et al., Fas- or ceramide-induced apoptosis is mediated by a Rac1 -regulated activation of Jun N-terminal kinase/p38 kinases and GADD153. J Biol Chem, 1997. 272(35): p. 22173-22181.

132. Guay, J., et al., Regulation ofactin filament dynamics byp38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J Cell Sci, 1997.110 (Pt 3): p. 357-368.

133. Kyriakis, J.M., et al., The stress-activated protein kinase subfamily ofc-Jun kinases. Nature, 1994. 369(6476): p. 156-60.

134. Han, J., et al., A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells. Science, 1994.265(5173): p. 808-811.

135. Westwick, J.K., et al., Oncogenic Ras activates c-Jun via a separate pathway from the activation of extracellular signal-regulated kinases. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91 (13): p. 6030-4.

136. Jacobs, D., et al., Multiple docking sites on substrate proteins form a modular system that mediates recognition by ERK MAP kinase. Genes Dev, 1999. 13(2): p. 163-175.

137. Lowenstein, E.J., et al., The SH2 and SH3 domain-containing protein GRB2 links receptor tyrosine kinases to ras signaling. Cell, 1992. 70(3): p. 431-442.

138. Thommes, K., et al., Identification of Tyr-703 and Tyr-936 as the primary association sites for Grb2 and Grb7 in the c-Kit/stem cell factor receptor. Biochem J, 1999.341 ( Pt 1): p. 211-6.

139. Nishizuka, Y., Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 1992. 258(5082): p. 607-614.

140. Dekker, L.V. and P.J. Parker, Protein kinase C~a question of specificity. Trends Biochem Sci, 1994.19(2): p. 73-77.

141. Blume-Jensen, P., et al., Identification of the major phosphorylation sites for protein kinase С in kit/stem cell factor receptor in vitro and in intact cells. J Biol Chem, 1995. 270(23): p. 14192-14200.

142. Brizzi, M.F., et al., Protein kinase C-dependent release of a functional whole extracellular domain of the mast cell growth factor (MGF) receptor by MGF-dependent human myeloid cells. Oncogene, 1994. 9(6): p. 1583-1589.

143. Klingmuller, U., et al., Specific recruitment of SH-PTP1 to the erythropoietin receptor causes inactivation of JAK2 and termination of proliferative signals. Cell, 1995. 80(5): p. 729-738.

144. Yi, Т., et al., Hematopoietic cell phosphatase associates with the interleukin-3 (IL-3) receptor beta chain and down-regulates IL-3-induced tyrosine phosphorylation and mitogenesis. Mol Cell Biol, 1993.13(12): p. 7577-7586.

145. Yi, Т., et al., Hematopoietic cell phosphatase associates with erythropoietin (Epo) receptor after Epo-induced receptor tyrosine phosphorylation: identification of potential binding sites. Blood, 1995. 85(1): p. 87-95.

146. D'Ambrosio, D., et al., Recruitment and activation of PTPICin negative regulation of antigen receptor signaling by Fc gamma RIIB1. Science, 1995. 268(5208): p. 293-297.

147. Doody, G.M., etal., A role in В cell activation for CD22 and the protein tyrosine phosphatase SHP. Science, 1995. 269(5221): p. 242-244.

148. Kon-Kozlowski, M., et al., The tyrosine phosphatase PTP1C associates with Vav, Grb2, and mSosI in hematopoietic cells. J Biol Chem, 1996. 271(7): p. 3856-3862.

149. Longley, В. J., et al., Somatic c-KIT activating mutation in urticaria pigmentosa and aggressive mastocytosis: establishment of clonality in a human mast cell neoplasm. Nat Genet, 1996.12(3): p. 312-314.

150. Longley, B. J., Jr., et al., Activating and dominant inactivating c-KIT catalytic domain mutations in distinct clinical forms of human mastocytosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(4): p. 1609-1614.

151. Worobec, A.S., et al., Clinical correlates of the presence of the Asp816Val c-kit mutation in the peripheral blood mononuclear cells of patients with mastocytosis. Cancer, 1998. 83(10): p. 2120-2129.

152. Moskaluk, C.A., etal., Mutations of c-kit JM domain are found in a minority of human gastrointestinal stromal tumors. Oncogene, 1999.18(10): p. 18971902.

153. Hirota, S., et al., Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science, 1998. 279(5350): p. 577-580.

154. Fletcher, J.A., et al., KIT gene mutations in gastrointestinal stromal tumors: more complex than previously recognized? Am J Pathol, 2002.161(2): p. 737-8; author reply 738-9.

155. Heinrich, M.C., et al., Biology and genetic aspects of gastrointestinal stromal tumors: KIT activation and cytogenetic alterations. Hum Pathol, 2002. 33(5): p. 484-95.

156. Isozaki, К., et al., Germline-activating mutation in the kinase domain of KIT gene in familial gastrointestinal stromal tumors. Am J Pathol, 2000.157(5): p. 1581-5.

157. Tian, Q., et al., Activating c-kit gene mutations in human germ cell tumors. Am J Pathol, 1999.154(6): p. 1643-1647.

158. Furitsu, Т., et al., Identification of mutations in the coding sequence of the proto-oncogene c-kit in a human mast cell leukemia cell line causing ligand-independent activation of c-kit product. J Clin Invest, 1993. 92(4): p. 17361744.

159. Kitayama, H., et al., Constitutively activating mutations of c-kit receptor tyrosine kinase confer factor-independent growth and tumorigenicity of factor-dependent hematopoietic cell lines. Blood, 1995. 85(3): p. 790-798.

160. Kitayama, H., et al., Neoplastic transformation of normal hematopoietic cells by constitutively activating mutations of c-kit receptor tyrosine kinase. Blood, 1996. 88(3): p. 995-1004.

161. Mekori, Y.A., C.K. Oh, and D.D. Metcalfe, lL-3-dependent murine mast cells undergo apoptosis on removal of IL-3. Prevention of apoptosis by c-kit ligand. J Immunol, 1993.151(7): p. 3775-3784.

162. Piao, X., et al., Expression of the Kit and KitA receptor isoforms in human acute myelogenous leukemia. Blood, 1994. 83(2): p. 476-481.

163. Kozlowski, M., et al., SHP-1 binds and negatively modulates the c-Kit receptor by interaction with tyrosine 569 in the c-Kit juxtamembrane domain. Mol Cell Biol, 1998.18(4): p. 2089-2099.

164. Ma, Y., et al., Inhibition of spontaneous receptor phosphorylation by residues in a putative alpha-helix in the KIT intracellular juxtamembrane region. J Biol Chem, 1999. 274(19): p. 13399-13402.

165. Druker, B.J., et al., Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Всг-АЫ positive cells. Nat Med, 1996. 2(5): p. 561-6.

166. Buchdunger, E., et al., Ablprotein-tyrosine kinase inhibitor STI571 inhibits in vitro signal transduction mediated by c-kit and platelet-derived growth factor receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2000. 295(1): p. 139-145.

167. Druker, B. J., STI571 (Gleevec) as a paradigm for cancer therapy: Trends Mol Med, 2002. 8(4): p. S14-8.

168. Kantarjian, H., et al., Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia. N. Engl. J. Med., 2002. 346(9): p. 645-652.

169. Talpaz, M., et al., Gleevec (formerly ST1571): an active drug in patients with Ph+ chronic myeloid leukemia in accelerated phase updated results of a phase II study. Blood, 2001. 98: p. 845a.

170. Sawyers, C.L., et al., Imatinib induces hematologic and cytogenetic responses in patients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a phase II study. Blood, 2002. 99(10): p. 3530-9.

171. Heinrich, M.C., et al., Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood, 2000.96(3): p. 925-932.

172. Tuveson, D.A., et al., STI571 inactivation of the gastrointestinal stromal tumor c-KIT oncoprotein: biological and clinical implications. Oncogene, 2001. 20(36): p. 5054-5058.

173. Heldin, C.H., A. Ostman, and L. Ronnstrand, Signal transduction via platelet-derived growth factor receptors. Biochim Biophys Acta, 1998.1378(1): p. F79-113.

174. Rosell, R., et al., Determinants of response and resistance to cytotoxics. Semin. Oncol., 2002. 29(1 Suppl 4): p. 110-118.

175. Paik, S., Incorporating genomics into the cancer clinical trial process. Semin Oncol, 2001. 28(3): p. 305-9.

176. Celis, J.E., et al., Gene expression profiling: monitoring transcription and translation products using DNA microarrays and proteomics. FEBS Lett, 2000. 480(1): p. 2-16.

177. Rubina, A., et al., Protein microchips. Dokl Biochem Biophys, 2001. 381: p. 419-22.

178. Mirzabekov, A. and A. Kolchinsky, Emerging array-based technologies in proteomics. Curr Opin Chem Biol, 2002. 6(1): p. 70-5.

179. Liang, P. and A.B. Pardee, Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992. 257(5072): p. 967-71.

180. Hedrick, S.M., et al., Isolation of cDNA clones encoding Tcell-specific membrane-associated proteins. Nature, 1984. 308(5955): p. 149-53.

181. Diatchenko, L., et al., Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(12): p. 6025-30.

182. Velculescu, V.E., et al., Serial analysis of gene expression. Science, 1995. 270(5235): p. 484-7.

183. Stein, J. and P. Liang, Differential display technology: a general guide. Cell Mol Life Sci, 2002. 59(8): p. 1235-40.

184. Wang, W.L., et al., Growth inhibition and modulation of kinase pathways of small cell lung cancer cell lines by the novel tyrosine kinase inhibitor STI571. Oncogene, 2000.19(31): p. 3521-3528.

185. Luk'ianov, K.A., et al., Selective suppression of polymerase chain reaction. Bioorg Khim, 1999. 25(3): p. 163-70.

186. Section III Patterns of mRNA expression. Methods Enzymol, 1999. 303: p. 165-411.

187. Nat Genet, 1999. 21(1 Suppl).

188. Cho, Y.J., V.R. Prezioso, and P. Liang, Systematic analysis of intrinsic factors affecting differential display. Biotechniques, 2002. 32(4): p. 762-4, 766.

189. Matz, M.V. and S.A. Lukyanov, Different strategies of differential display: areas of application. Nucleic Acids Res, 1998. 26(24): p. 5537-43.

190. Bertioli, D. J., et al., An analysis of differential display shows a strong bias towards high copy number mRNAs. Nucleic Acids Res, 1995. 23(21): p. 4520-3.

191. Ito, Т. and Y. Sakaki, Fluorescent differential display. Methods Mol Biol, 1997. 85: p. 37-44.

192. Lievens, S., S. Goormachtig, and M. Holsters, A critical evaluation of differential display as a tool to identify genes involved in legume nodulation: looking back and looking forward. Nucleic Acids Res, 2001. 29(17): p. 345968.

193. Mills, J.C., et al., DNA microarrays and beyond: completing the journey from tissue to cell. Nat Cell Biol, 2001. 3(8): p. E175-8.

194. Duguid, J.R. and M.C. Dinauer, Library subtraction of in vitro cDNA libraries to identify differentially expressed genes in scrapie infection. Nucleic Acids Res, 1990.18(9): p. 2789-92.

195. Нага, E., et al., Subtractive cDNA cloning using oligo(dT)30-latex and PCR: isolation of cDNA clones specific to undifferentiated human embryonal carcinoma cells. Nucleic Acids Res, 1991.19(25): p. 7097-104.

196. Siebert, P.D., et al., An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995. 23(6): p. 1087-8.

197. Stollberg, J., et al., A quantitative evaluation of SAGE. Genome Res, 2000. 10(8): p. 1241-8.

198. Lipshutz, R.J., et al., High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet, 1999. 21(1 Suppl): p. 20-4.

199. Frolov, A., et al., DNA array-based method for detection of large rearrangements in the BRCA1 gene. Genes Chromosomes Cancer, 2002. 35(3): p. 232-41.

200. Ivanov, I.B., et al., Diagnosis of genetic mutations using oligonucleotide microchips. Mol Biol (Mosk), 1997. 31(1): p. 159-67.

201. Sverdlov, E.D., Prospects of medicinal use of achievements in genomics: the beginning of era of complete genome medical genetics. Patol Fiziol Eksp Ter, 2001(1): p. 3-22.

202. Pollack, J. R., et al., Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet, 1999. 23(1): p. 41-6.

203. Tiilib, S.V. and A.D. Mirzabekov, Advances in the analysis of DNA sequence variations using oligonucleotide microchip technology. Curr Opin Biotechnol, 2001.12(1): p. 53-8.

204. Kolchinsky, A. and A. Mirzabekov, Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips. Hum Mutat, 2002.19(4): p. 343-60.

205. Haab, B.B., Advances in protein microarray technology for protein expression and interaction profiling. Curr Opin Drug Discov Devel, 2001. 4(1): p. 116-23.

206. Schena, M., et al., Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science, 1995. 270(5235): p. 467-70.

207. Proudnikov, D., E. Timofeev, and A. Mirzabekov, Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips. Anal Biochem, 1998. 259(1): p. 34-41.

208. Vasiliskov, A.V., et al., Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. Biotechniques, 1999. 27(3): p. 592-4, 596-8, 600 passim.

209. Chechetkin, V.R., et al., Sequencing by hybridization with the generic 6-mer oligonucleotide microarray: an advanced scheme for data processing. J Biomol Struct Dyn, 2000.18(1): p. 83-101.

210. Hoon, D.S., et al., Assessment of genetic heterogeneity in tumors using laser capture microdissection. Methods Enzymol, 2002. 356: p. 302-9.

211. Ohyama, H., et al., Use of laser capture microdissection-generated targets for hybridization of high-density oligonucleotide arrays. Methods Enzymol, 2002. 356: p. 323-33.

212. Brazma, A., et al., Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet, 2001. 29(4): p. 365-71.

213. Eisen, M.B., et al., Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(25): p. 14863-8.

214. Tavazoie, S., et al., Systematic determination of genetic network architecture. Nat Genet, 1999. 22(3): p. 281-5.

215. Tamayo, P., et al., Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: methods and application to hematopoietic differentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(6): p. 2907-12.

216. Shannon, W., R. Culverhouse, and J. Duncan, Analyzing microarray data using cluster analysis. Pharmacogenomics, 2003. 4(1): p. 41-52.

217. Su, A.I., et al., Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Res, 2001.61(20): p. 7388-93.

218. Golub, T.R., et al., Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science, 1999. 286(5439): p. 531-7.

219. Macgregor, P.F. and J.A. Squire, Application of microarrays to the analysis of gene expression in cancer. Clin Chem, 2002. 48(8): p. 1170-7.

220. Sreekumar, A. and A.M. Chinnaiyan, Using protein microarrays to study cancer. Biotechniques, 2002. Suppl: p. 46-53.

221. Rhodes, D.R. and A.M. Chinnaiyan, DNA microarrays: implications for clinical medicine. J Invest Surg, 2002.15(5): p. 275-9.

222. Mohr, S., et al., Microarrays as cancer keys: an array of possibilities. J Clin Oncol, 2002. 20(14): p. 3165-75.

223. Chung, C.H., P.S. Bernard, and C.M. Perou, Molecular portraits and the family tree of cancer. Nat Genet, 2002. 32(Suppl): p. 533-40.

224. Sorlie, Т., et al., Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(19): p. 10869-74.

225. Bittner, M., et al., Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature, 2000. 406(6795): p. 536-40.

226. Bhattacharjee, A., et al., Classification of human lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(24): p. 13790-5.

227. Kudoh, K., et al., Monitoring the expression profiles of doxorubicin-induced and doxorubicin-resistant cancer cells by cDNA microarray. Cancer Res, 2000. 60(15): p. 4161-6.

228. Bayani, J., et al., Parallel analysis of sporadic primary ovarian carcinomas by spectral karyotyping, comparative genomic hybridization, and expression microarrays. Cancer Res, 2002. 62(12): p. 3466-76.

229. Hegde, P., et al., Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray. Cancer Res, 2001. 61(21): p. 7792-7.

230. Luo, J., et al., Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasia: molecular dissection by gene expression profiling. Cancer Res, 2001.61 (12): p. 4683-8.

231. Kim, J.H., et al., Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. Jama, 2002. 287(13): p. 1671-9.

232. Godwin, A.K., et al., High resistance to cisplatin in human ovarian cancer cell lines is associated with marked increase of glutathione synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(7): p. 3070-4.

233. Kerr, M.K., et al., Statistical analysis of a gene expression microarray experiment with replication. Statistica Sinica, 2002.12(1): p. 203-218.

234. Ideker, Т., et al., Testing for differentially-expressed genes by maximum-likelihood analysis of microarray data. J Comput Biol, 2000.7(6): p. 805-17.

235. Schultz, D.C., et al., Identification of two candidate tumor suppressor genes on chromosome 17p13.3. Cancer Res, 1996. 56(9): p. 1997-2002.

236. Dull, Т., et al., A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol, 1998. 72(11): p. 8463-71.

237. Burns, J.C., et al., Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotypedretroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transferinto mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(17): p. 8033-7.

238. Emi, N., T. Friedmann, and J.K. Yee, Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J Virol, 1991. 65(3): p. 1202-7.

239. Pan, Z.Z., et al., Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating МАРК pathways. J Biol Chem, 2002. 277(38): p. 35050-60.

240. Jemal, A., et al., Cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin, 2002. 52(1): p. 23-47.

241. Russell, W.O., et al., A clinical and pathological staging system for soft tissue sarcomas. Cancer, 1977. 40(4): p. 1562-70.

242. Ruka, W., et al., Prognostic significance of lymph node metastasis and bone, major vessel, or nerve involvement in adults with high-grade soft tissue sarcomas. Cancer, 1988. 62(5): p. 999-1006.

243. Heinrich, M.C., et al., PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors. Science, 2003. 299(5607): p. 708-10.

244. Miettinen, M., M. Sarlomo-Rikala, and J. Lasota, Gastrointestinal stromal tumors: recent advances in understanding of their biology. Hum. Pathol., 1999. 30(10): p. 1213-1220.

245. DeMatteo, R.P., et al., Tivo hundred gastrointestinal stromal tumors: recurrence patterns and prognostic factors for survival. Ann. Surg., 2000. 231(1): p. 51-58.

246. Graadt van Roggen, J.F., M.L. van Velthuysen, and P.C. Hogendoorn, The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumours. J Clin Pathol, 2001. 54(2): p. 96-102.

247. Daniel, E.E., et al., Do gap junctions couple interstitial cells of Cajal pacing and neurotransmission to gastrointestinal smooth muscle? Neurogastroenterol Motil, 2001.13(4): p. 297-307.

248. Langton, P., et al., Spontaneous electrical activity of interstitial cells of Cajal isolated from canine proximal colon. Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86(18): p. 7280-4.

249. Barajas-Lopez, C., et al., Pacemaker activity recorded in interstitial cells of Cajal of the gastrointestinal tract. Am J Physiol, 1989. 257(4 Pt 1): p. C830-5.

250. Altdorfer, K.t et al., Nitric oxide synthase immunoreactivity of interstitial cells of Cajal in experimental colitis. Inflamm Res, 2002. 51(12): p. 569-71.

251. Wu, J.J., T.P. Rothman, and M.D. Gershon, Development of the interstitial cell of Cajal: origin, kit dependence and neuronal and nonneuronal sources of kit ligand. J Neurosci Res, 2000. 59(3): p. 384-401.

252. Streutker, C.J., et al., Loss ofCD117 (c-kit)- and CD34-Positive ICC and Associated CD34-Positive Fibroblasts Defines a Subpopulation of Chronic Intestinal Pseudo-obstruction. Am J Surg Pathol, 2003. 27(2): p. 228-35.

253. Faussone-Pellegrini, M.S., P. Matini, and W. Stach, Differentiation of enteric plexuses and interstitial cells of Cajal in the rat gut during pre- and postnatal life. Acta Anat (Basel), 1996.155(2): p. 113-25.

254. Ozaki, K., et al., ERK pathway positively regulates the expression of Sprouty genes. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 285(5): p. 1084-8.

255. Lux, M.L., et al., KIT extracellular and kinase domain mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am. J. Pathol., 2000.156(3): p. 791-795.

256. Blanke, C.D., et al., High incidence of durable responses induced by imatinib mesylate (Gleevec) in patients with unresectable and metastatic gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Prog. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 2002. 21: p. 1608a.

257. Harndahl, L., et al., Important role of phosphodiesterase 3B for the stimulatory action of cAMP on pancreatic beta-cell exocytosis and release of insulin. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37446-55.

258. Thompson, W.J., et al., Exisulind induction of apoptosis involves guanosine 3',5'-cyclic monophosphate phosphodiesterase inhibition, protein kinase G activation, and attenuated beta-catenin. Cancer Res, 2000. 60(13): p. 333842.

259. Ahmad, M., et al., The role of the cyclic GMP-inhibited cyclic AMP-specific phosphodiesterase (PDE3) in regulating clonal BRIN-BD11 insulin secreting cell survival. Cell Signal, 2000.12(8): p. 541-8.

260. Bodine, S.C., et al., Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy. Science, 2001. 294(5547): p. 1704-8.

261. Gomes, M.D., et al., Atrogin-1, a muscle-specific F-boxprotein highly expressed during muscle atrophy. Proc Natl Acad Sci USA, 2001.98: p. 14440-14445.

262. Nielsen, Т.О., et al., Molecular characterisation of soft tissue tumours: a gene expression study. Lancet, 2002. 359(9314): p. 1301-7.

263. Lux, M.L., et al., KIT extracellular and kinase domain mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am J Pathol, 2000.156(3): p. 791-5.

264. Manley, P.W., et al., Imatinib: a selective tyrosine kinase inhibitor. Eur J Cancer, 2002. 38 Suppl 5: p. S19-27.

265. Allander, S.V., et al., Gastrointestinal stromal tumors with KIT mutations exhibit a remarkably homogeneous gene expression profile. Cancer Res., 2001. 61 (24): p. 8624-8628.

266. Bian, J.S., et al., The role of phosphodiesterase in mediating the effect of protein kinase С on cyclic AMP accumulation upon kappa-opioid receptor stimulation in the rat heart. J Pharmacol Exp Ther, 2000. 292(3): p. 1065-70.

267. Sanders, K.M., A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology, 1996.111(2): p. 492-515.

268. Glass, D. J., Signalling pathways that mediate skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Nature Cell Biology, 2003. 5: p. 87-90.1. NH21. Ли ганд-связывающий домен1. Димеризаиионный домен1. Экстрацеллюлярный регион

269. Трансмембранный домен Юкстамембранный домен

270. Киназный домен АТФ-связывающая область Киназная вставка

271. Киназный домен Фосфотрансферазная область1. Цитоплазматический регионсоон

272. Рис. 1. Схема доменной организации рецептора KIT.

273. Цитозольные/цитоскелетные мишени: Фосфолипаза Аг1. Транскрипционные факторы1. Транскрипция генов

274. Прогрессия клеточного цикла/ Апоптоз

275. Рис. 2. Сеть каскадов трансдукции сигнала внутрь клетки от рецептора KIT.1. KITэцд17,3%тмд1. ЮМДкд

276. Соматические дупликации Ala-502 иТуг-503 в спорадических СОЖКТ

277. Различные соматические мутации между Lys-550 и Asp-579 в соматических СОЖКТ

278. Различные терминальные мутации между Lys-550 и Asp-579 в наследственых и множественных СОЖКТ

279. Соматическая точечная мутация Lys-642 в спорадических СОЖКТ

280. Герминальная точечная мутация Lys-642 в наследственых и множественных СОЖКТ

281. Соматическая точечная мутация Asp-816 в новообразованиях тучных клеток

282. Рис 3. Частота встречаемости и характеристика мутаций KIT при спорадических и наследственных формах СОЖК. ЭЦД, экстрацеллюлярный домен; ТМД, трансмембранный домен; ЮМД, юкстамембранный домен; КД, киназный домен; KB, киназная вставка1. Иматиниба мезилат

283. Молекулярный вес 589.7 Формула C30H36N7SO4

284. Рис. 4. Структурная формула и непатентованное название препарата Гливек.

285. ДНКюриоаыхттм «ДНК н нормальныхтестер) (яра йир)с«шфоааииым Адаптером 1 ваятая а избыта1. ДНК и ра«о«ы> 1ЛГГО»тестер) с пишроиниьш Адаптером 2b,c,d +Iвторой цикл гибридизации с добавлением свежей порции драйверазаполнение концевых брешей

286. Добавление праймеров М w ПЦР амплификацияa. d отсутствие амплификации

287. Ь-*Ь' отсутствие амплификациис линейная амплификация, « экспоненциальная амплификация

288. Энзиматическое фрагментирование якорной эндонуклеазой (ЯЭ) и связывание со стрптавидиновыми бусами1. GATC GATC QATC

289. Разделение реакции пополам и лигирование линкеров А и В1. ПСТАв GATC1. CTAG GATC

290. Рестрикция "тэг'-эндонуклеаздй (ТЭ)

291. ТЭ ЯЭ Тэг (микрофрагмент) ТЭ ЯЭ Тэг (микрофрагмент)

292. GATGCTAGXXXXXXXXX | | CTAGYYYYYYYYY

293. СТAGGAT СХХХХХХХХХ II GAT CYYYYYYYYY

294. Лигирование и амплификация

295. Лигирование и амплификация /с использованием якорных праймеров А и ъ /

296. Двойной микрофрагмент IGGATG CTAGXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTAG ICCTAGGATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATC

297. Рестрикция якорной эндонуклеазой, Выделение и объединение двойных микрофрагментов, Клонирование

298. CTAGXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTACXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTACXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTAC GATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATG

299. Двойной микрофрагмент Двойной микрофрагмент Двойной микрофрагмент

300. Рис. 6. Схематическое изображение метода серийного анализа экспрессии генов (SAGE).1. Выбор клонова*

Информация о работе

Фролов, Андрей Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы