Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видоспецифичный эффект производных 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 на конститутивный андростановый рецептор и гены глюконеогенеза

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Видоспецифичный эффект производных 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 на конститутивный андростановый рецептор и гены глюконеогенеза"

На правах рукописи

Ярушкин Андрей Александрович

ВИДОСПЕЦИФИЧНЫЙ ЭФФЕКТ ПРОИЗВОДНЫХ 2,4,6-ТРИФЕНИЛДИОКСАНА-1,3 НА КОНСТИТУТИВНЫЙ АНДРОСТАНОВЫЙ РЕЦЕПТОР И ГЕНЫ ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗА

03.01.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 и Г 2014

Новосибирск - 2014

005553526

005553526

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Пустыльняк Владимир Олегович

Официальные оппоненты: Покровский Андрей Георгиевич

доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»,

главный научный сотрудник

Сметанина Мария Александровна

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, младший научный сотрудник

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Защита состоится «Ж» ноября 2014 г. заседании диссертационного совета

Д001.034.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: http://wwvv.niibch.ru

Автореферат разослан « 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Глюкоза является важным и быстрым источником метаболической энергии для большинства клеток, поэтому ее содержание в крови является одним из самых регулируемых параметров в организме. При гипогликемии глюкагон активирует в печени распад гликогена и синтез глюкозы из неуглеводных предшественников (глюконеогенез), а повышение содержания глюкозы приводит к стимуляции секреции инсулина, который подавляет глюконеогенез и усиливает катаболизм глюкозы (Nelson and Сох, 2008). Ингибирование глюконеогенеза под действием инсулина происходит на уровне транскрипции генов ключевых ферментов данного процесса -фосфоенолпируват карбоксикиназы и глюкозо-6-фосфатазы (Kim et al., 2008). Нарушение этой регуляции приводит к гипергликемии, которая при хроническом течении может привести к серьезным осложнениям, поэтому исследование альтернативных способов регуляции экспрессии генов глюконеогенеза является актуальной задачей.

Недавние исследования показали, что ядерный конститутивный андростановый рецептор CAR, более изученный с точки зрения участия в регуляции метаболизма ксенобиотиков, способен подавлять экспрессию генов ключевых ферментов глюконеогенеза (Ueda et al., 2002). Стоит отметить, что активность данного рецептора изменяется под действием специфичных экзогенных активаторов (Tzameli and Moore, 2001), которые могут выступать в роли потенциальных лекарственных препаратов. Однако активаторы CAR не всегда являются его лигандами (активация рецептора происходит через косвенные механизмы) и их действие может быть видоспецифично (Пустыльняк и др., 2007). В итоге одно и то же соединение может активировать, ингибировать или вообще не оказывать никакого эффекта на активацию рецептора даже у таких филогенетически близких видов как крысы и мыши (Li and Wang, 2010). Различные способы активации рецептора под действием разнообразных активаторов приводят к тому, что физиологические ответы на

введение этих веществ могут отличаться среди видов. Данная особенность затрудняет экстраполяцию результатов активации CAR с экспериментальных животных на человека. Для решения этой проблемы необходимо универсальное соединение, способное активировать рецептор CAR многих видов, включая человека. Цис-2,4,6-трифенилдиоксан-1,3 (cTPD) - мощный активатор CAR крыс. В нашей лаборатории было показано, что данное соединение обладает несколькими преимуществами для исследования эффектов активации CAR. В отличие от классического активатора фенобарбитала, во-первых, данное соединение не оказывает плейотропный эффект на ферменты биотрансформации ксенобиотиков (Пустыльняк и др., 2006), во-вторых, эффективная доза данного соединения на порядок ниже, и однократного введения достаточно для достижения максимального индуцирующего эффекта на CYP2B (основной мишени рецептора CAR) (Pustylnyak et ah, 2005). Ввиду этих особенностей было предположено, что химическая модификация молекулы cTPD позволит получить соединение, способное эффективно активировать рецептор CAR многих видов, включая человека.

Цель работы: исследовать видоспецифичный эффект производных 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 на активацию конститутивного андростанового рецептора и экспрессию ключевых генов ферментов глюконеогенеза РЕРСК и G6Pase.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать экспрессию генов РЕРСК и G6Pase в печени крыс при введении cTPD.

2. Синтезировать набор новых структурных производных cTPD и исследовать их способность активировать рецептор CAR крыс и мышей.

3. Проверить способность новых соединений, показавших активирующий эффект на CAR, изменять экспрессию генов РЕРСК и G6Pase в печени крыс. Исследовать молекулярный механизм процесса.

4. Проверить способность производных cTPD активировать рецептор CAR

человека.

Научная новизна работы

Впервые были синтезированы замещенные производные 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 и описаны их биологические эффекты. Показан видоспецифичный эффект соединений на активацию конститутивного андростанового рецептора и, как следствие, экспрессию его г енов-мишеней.

Показана способность синтезированных соединений снижать экспрессию ключевых генов глюконеогенеза, РЕРСК и GóPase, в печени крыс. Впервые показан механизм снижения экспрессии этих генов под действием активаторов CAR in vivo. На крысах, содержащихся как на обычной, так и высокожировой диете, продемонстрирован гипогликемический эффект цис-2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 и его производного 1Ч,1Ч-диметил-4-(4,6-дифенил-1,3-диоксан-2-ил)анилина.

Впервые исследованы эффекты cTPD и его производных на рецептор CAR человека.

Научно-практическая значимость

По своему содержанию работа имеет преимущественно фундаментальный характер. Эндогенные лиганды рецептора CAR до сих пор не идентифицированы, а экзогенные активаторы CAR в большинстве случаев оказывают видоспецифичный эффект. Ввиду данных особенностей исследование эффектов активации рецептора CAR проводят с использованием видоспецифичных активаторов, причем механизм активирующего действия большинства из них неизвестен. Следствием этого является то, что эффекты активации рецептора CAR могут отличаться как среди экспериментальных животных, так и в культурах клеток различных видов. В данной работе были синтезированы производные cTPD, которые были способны активировать CAR как крыс, так и мышей с потенциальным активирующим эффектом на CAR человека. Исследование биологических эффектов данных соединений позволит повысить достоверность экстраполяции эффектов активации рецептора CAR с грызунов на человека. Результаты работы дополняют представления об

эндогенных функциях CAR, более изученного с точки зрения участия в регуляции метаболизма ксенобиотиков. Результаты показывают возможность достижения гипогликемического эффекта in vivo у экспериментальных животных под действием новых активаторов CAR, что указывает на перспективность CAR в качестве терапевтической мишени.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение заместителей в молекулу cTPD приводит к изменению активности данных соединений по отношению к рецептору CAR крыс и мышей.

2. cTPD и его производные, способные активировать CAR, снижают экспрессию ключевых генов глюконеогенеза РЕРСК и GóPase, что сопровождается снижением уровня глюкозы в крови лабораторных животных.

3. В основе снижения экспрессии генов глюконеогенеза с участием активированного рецептора CAR лежит его конкуренция с фактором транскрипции HNF-4a за связывание с участком DR1 в промоторе генов и блокированием транскрипционной активности белка FoxO 1.

4. cTPD и его производные не являются лигандами рецептора CAR человека.

Апробация работы

Результаты работы обсуждались на следующих конференциях: 16th North American Regional ISSX Meeting (г. Балтимор, США, 2009), 9th International Meeting of the ISSX (г. Стамбул, Турция, 2010), XLVIII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, Россия, 2010); International Conference on Postgenomic Technology for Biomedicine (г. Новосибирск, Россия, 2012); FEBS Advanced Lecture Course: Spetses Summer School on Nuclear Receptor Signaling in Physiology and Disease (о. Спеце, Греция, 2013).

Личный вклад автора Личный вклад автора заключается в поиске информации, обобщении и систематизации литературных данных, выполнении экспериментов и обработке

данных.

Планирование экспериментов, обсуждение, интерпретация полученных результатов, формулировка выводов работы проводилась совместно с научным руководителем. Подготовка публикаций осуществлялась совместно с соавторами и научным руководителем.

Публикации

Результаты работы изложены в 10 публикациях, из них 5 статей в зарубежных рецензируемых журналах и 5 тезисов докладов в сборниках российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, включает 30 рисунков и 5 таблиц. Библиографический список включает 208 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтез cTPD и его производных. Синтез cTPD и его аналогов проводили по методикам(Опеп§1 and Geppert, 1976; A. Mori et al., 1985) с внесением модификаций.

Обработка животных индукторами. Самцам крыс линии Wistar (110-150 г) или самцам мышей линии С57В1 (20-25 г) (питомник Института клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск) внутрибрюшинно вводили соединения в растительном масле (дозы указаны в описании результатов). Животных содержали группами по 3 особи в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище. При высокожировой диете крысы получали 45% калорий из жира, в то время как контрольные - 5%.

Введение плазмид мышам и обработка индукторами. Введение плазмид в хвостовую вену мышам (линия ICR, 20-25 г) осуществляли с использованием

системы TransIT in vivo gene delivery system («Mirus») согласно рекомендациям производителя. Смесь объемом 2 - 2,5 мл (1/10 массы мыши), содержащей 4 мкг плазмиды 2.2 kb-CYP2B6, 5 мкг плазмиды pCR3-hCAR (или без нее), 4 мкг плазмиды pRL-TK вводили в хвостовую вену в течение 7 сек. Соединения вводили мышам внутрибрюшинно дважды через 3 ч и б ч. Мышей забивали через 16 ч после последнего введения соединений. Измерение активности люцифераз в печени мышей проводили с использованием набора Dual-Luciferase Reporter Assay System («Promega») согласно рекомендациям производителя.

Выделение микросомальной фракции печени животных. Выделение проводили методом дифференциального центрифугирования гомогената печени в среде, содержащей 20 мМ трис-HCl (pH 7,4), 1,15% KCl, из расчета соотношения среды к гомогенату 3:1. В результате двух последовательных центрифугирований гомогената печени при 10000 об/мин и супернатанта при 32000 об/мин, получали осадок микросомальной фракции.

Определение активности CYP2B. Скорость О-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина в микросомальной фракции определяли флюориметрическим методом по скорости образования резоруфина (Burke et al., 1985). В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали резоруфин.

Вестерн-блот анализ. Лизис гомогената печени животных проводили с использованием буфера RIPA. Разделение белков проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в денатурирующих условиях с использованием системы Mini-PROTEAN Tetra Cell («BioRad»). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 ¡дм). Для блокировки центров неспецифической сорбции мембрану инкубировали в течение часа в 2% В SA. После мембрану инкубировали со специфичными первичными и вторичными антителами. Визуализацию проводили с использованием диаминобензидина или с помощью набора реагентов Luminata™ Western HRP Substrate («Millipore»).

ПЦР с детекцией в реальном времени. Выделение суммарной РНК из

образцов печени крыс проводили с использованием набора RNeasy® Mini Kit («Qiagen») согласно рекомендациям производителя. Обратную транскрипцию проводили в реакционном объеме 20 мкл с помощью набора iScript cDNA Synthesis Kit («BioRad») в соответствии с протоколом производителя. В реакции обратной транскрипции использовали гексануклеотидные случайные праймеры. Измерение уровня экспрессии генов CYP2B1, CYP2B2, РЕРСК1, GôPase и ISS рибосомной РНК («ген домашнего хозяйства») проводили в реальном времени с использованием iTaq SYBR Green Supermix with ROX («BioRad»), Каждая реакция ПЦР (25 мкл) содержала 1 мкл кДНК, 300 нМ специфичных праймеров, буфер для ПЦР. Условия реакции: 95°С - 3 мин; 40 циклов: 95°С - 15 с, 58°С - 20 с, 72°С - 20 с, детекция 80°С - 10 с. Относительный уровень экспрессии генов оценивали с использованием значений пороговых циклов Ct по методу 2ДО.

Иммуиопреципнтацин хроматина. К гомогенату печени в PBS, содержащим 0,4% NP-40, добавляли формальдегид до 1 %. Реакцию останавливали добавлением глицина. Лизат клеток подвергался озвучиванию для получения фрагментов ДНК ~ 500 п.п. Часть полученного лизата после очистки центрифугированием использовалась для контроля (Input). Супернатант инкубировали сначала со специфичными антителами или нормальной сывороткой кролика (IgG), а потом с суспензией агарозы (Protein G Agarose/ Salmon Sperm DNA («Millipore»)). Далее после серии очисток иммунокомплекс разрушали путем шпсубации с NaCl. Белок разрушали протеиназой К. Полученные фрагменты ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Анализ полученной ДНК проводили методом ПЦР.

Определение уровня глюкозы в крови крыс. Образцы крови отбирали из хвостовой вены крыс. Содержание глюкозы в крови животных определяли с помощью прибора One Touch Select («LifeScan») согласно рекомендациям производителя.

Определение активация hCAR in vitro. Для оценки активации hCAR использовали LanthaScreen™ TR-FRET CAR Coactivator Assay Kit

(«Invitrogen»). В 96 луночном планшете готовили серию последовательных разведений исследуемых соединений. Измерения проводили при длинах волн 520 нм и 495 нм.

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде средней величины и стандартного отклонения (М ± SD). Статистическая значимость различий между группами оценивалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным критерием Tukey (уровень значимости р < 0,05). Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA с апостериорным критерием Tukey был проведен с введением поправки Бонферрони.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВидоспецпфичныП эффект производных cTPD. Цис-2,4,6-трифенилдиоксан-1,3 является видоспецифичным активатором CAR крыс, при этом, не оказывая эффектов на активацию мышиной изоформы. Чтобы нивелировать видоспецифичный эффект данного соединения были синтезированы различные его производные с вариацией в 4-м положении 2-го фенильного заместителя. Синтез диоксанов был осуществлен по реакции Принса, в результате которого было синтезировано 5 новых соединений, в том числе два пространственных изомера TPD (2,4,6-трифенилдиоксан-1,3): цис- и транс изомеры (cTPD и tTPD), 2-(4-метоксифенил)-4,6-дифенил-1,3-диоксан (рМеО), >1,Ы-диметил-4-(4,6-дифенил-1,3-диоксан-2-ил)анилин (pDMA), 2-(4-фторфенил)-4,6-дифенил-1,3-диоксан (pF), 2-(4-нитрофенил)-4,6-дифенил-1,3-диоксан (pN02) (Рис. 1).

cTPD tTPD рМеО pDMA pF pN02

Рисунок 1. Структура синтезированных соединений.

Способность новых синтезированных соединений активировать рецептор CAR крыс и мышей оценивали по индукции фермента CYP2B. Дополнительной задачей было вычисление эффективной дозы индукторов у разных видов. Для этого самцам крыс и мышей вводили исследуемые соединения в различных дозах (от 0,5 мг/кг до 100 мг/кг), и измерялась ПРОД активность, специфичная для CYP2B (Рис.2).

ed50 (мг/кг) cTPD tTPD рМеО pDMA pF pN02

мыши - — 23,5 27,6 24,5 28,4

крысы 5,1 6,7 - 5,4 5,1 5,2

Рисунок 2. Дозо-зависмый эффект аналогов ТРЭ на активность СУР2В в печени крыс (А) и мышей (Б). Приведено изменение относительно контрольной группы. * Достоверность различий по сравнению с контролем р<0,05. #Достоверность различий между разными группами соединений р<0,05. В таблице приведены значения эффективной дозы (ЕО50) вводимых соединений.

В результате данного исследования было показано, что соединения рБМА и р1Ч02 были наиболее мощными индукторами обоих видов, при этом эффективная доза для мышей была в 5 раз выше, чем для крыс (Рис. 2). Чтобы показать, что регуляция индукции СУР2В под действием производных сТРО осуществляется на уровне транскрипции (как это происходит в случае исходного сТРБ) было оценено изменение как количества белка СУР2В, так и уровня мРНК СУР2В (Рис. 3).

□

0

понт cTPD tTFD pMeO pDIVlA pN02

CYF2B1 /2/3 Cyp2b9/10

б |f60 jse

ЗГ

f 40

|зо

I 20 ¡10

б

«СУШ! *&№Ш

Ы 'i

&

i го -

кант cTPD !TF>0 iSfeo pDMA pF

«оит ctpo iip;

pOMA pF pN02

Рисунок 3. (А) Иммуноблот микросомальной фракции печени крыс (детектировались изоформы CYP2B1/2/3) и мышей (детектировались изоформы Сур2Ь9/10). На каждую дорожку нанесено 50 мкг белка. (Б) Относительное содержание мРНК CYP2B после введения исследуемых соединений в печени крыс (CYP2B1/2) и мышей (Сур2Ы0). * Статистическая значимость различий по сравнению с контролем р < 0,05.

Изменение уровня мРНК CYP2B и ее белковых продуктов в печени крыс и

мышей хорошо соответствовала изменениям ферментативной активности, что подтверждает регуляцию на уровне транскрипции. Данные результаты говорят в пользу того, что видоспецифичные различия в индукции CYP2B опосредованы различной способностью производных cTPD активировать рецептор CAR крыс и мышей. Для подтверждения данного предположения была проверена способность рецептора CAR взаимодействовать с энхансерным участком PBREM в промоторе генов CYP2B1 и Сур2Ы0 под действием исследуемых веществ (Рис. 4).

0

0

Anft-CAR Normal IgG

™ jsss* Um ■ < dm 20% Input

sour cTPO fTPO ptfeo pF

■ " ............

■ ¡¡§§11

Щ

_____ ^^^ ШрЩйрЩрШЩ

' ****** ДОПРОС

кжг sTPO iTFD (}{>%Q pV№. fip ¡>N02

Рисунок 4. Иммунопреципитация хроматина из образцов печени крыс (А) и мышей (Б) после однократного введения соединений. Использовали антитела против CAR (anti-CAR) и нормальных IgG кролика (normal IgG). Анализировалась ДНК последовательность промотора генов CYP2BI (А) и Сур2Ы0 (Б), включающая мотив PBREM.

В контрольных образцах печени крыс детектировалась слабая амплификация фрагмента ДНК, а при введении крысам рМеО соответствующая полоса не обнаруживалась вообще. В тоже время, введение cTPD, tTPD, pDMA, pF, pN02 приводило к аккумуляции CAR на промоторе генов CYP2B в печени крыс. Взаимодействие CAR с мотивом PBREM в промоторе гена Сур2Ы0 после введения незамещенных изомеров cTPD не происходило, поскольку интенсивность полос визуально не отличалась от контрольного образца (Рис. 4Б). С помощью данного метода было подтверждено, что под действием производных cTPD происходит видоспецифичная активация рецептора CAR, причем три соединения из шести были активны по отношению как к крысам, так и мышам. Поскольку эффекты исследуемых соединений были более выражены для крыс, для оценки роли рецептора CAR в регуляции экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты глюконеогенеза, была использована крысиная модель.

Гипогликемический эффект производных cTPD. Способность исследуемых соединений ингибировать экспрессию генов РЕРСК и G6Pase, кодирующих ключевые ферменты глюконеогенеза, была оценена с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. После введения крысам производных cTPD в дозе 10 мг/кг веса наблюдалось достоверное снижение экспрессии гена РЕРСК под действием всех аналогов, в то время как экспрессия гена G6Pase подавлялась только 5-ю соединениями (Рис. 5А). Результаты исследования относительного содержания белков РЕРСК. и G6Pase хорошо согласовались с данными об изменении экспрессии их генов (Рис. 5Б,В). Содержание G6Pase в печени крыс при введении соединения pF не изменялось в сравнении с контрольными образцами.

конт cTFD tTPD р DMA pF p№32

KOHT CTPD tTPD pDMA pF pN02

Рисунок 5. (А) Относительное содержание мРНК РЕРСК и G6Pase в печени >ыс через 72 ч после однократного введения соединений. (Б) Иммуноблот анализ белков РЕРСК и G6Pase в печени крыс через 72 часа после однократного введения производных cTPD. На каждую дорожку нанесено 80 мкг белка. (В) Данные денситометрии. Содержание белков РЕРСК и G6Pase в печени крыс рассчитывали как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена РЕРСК или G6Pase к интенсивности полосы гена P-actin. Приведены средние значения ± SD *Статистическая значимость различий по сравнению с контролем (р<0,05).

Исследование механизма снижения экспрессии генов при введении производных cTPD проводили с помощью метода иммунопреципитации хроматина с использованием специфичных антител против транскрипционных факторов FoxOl, HNF-4a и CAR с целью подтверждения участия рецептора CAR. В контроле не наблюдалось взаимодействия CAR с промоторами генов РЕРСК и G6Pase (Рис. 6). При введении индукторов cTPD, tTPD, pDMA, pF и pN02 наблюдалось увеличение количества продукта амплификации в тех случаях, когда в область, ограниченную праймерами, входил участок DR1, с которым специфически взаимодействует HNF-4a. Кроме того, результаты показывали, что при усилении взаимодействия CAR с DR1, происходит одновременное снижение взаимодействия HNF-4a с DR1 (Рис 6 А,Б).

«M» w* ««том, «ко

Anti-CAR Anti-HNF-4a Anti-FOXOl Normal IgG 20% Input

в Q Q sua. S H H

0 < 3 S

1 Q

< S

Q

О

Z

1|§| All'.i ll\T-b ЩЦ Anti-CAR

Normal IgG Mm- 20% Input

о

7,

,HNF-4o (FoxOl > РЕРСК

DR1 1RS

Anti-CAR Anti-FOXOl Normal IgG 20% Input

Рисунок 6. Иммунопреципитация хроматина из образцов печени крыс после однократного введения соединений. Использовали антитела против FoxOl (Anti-FoxOl), HNF-4ct (Anti-HNF-4a), CAR (Anti-CAR) и нормальных IgG кролика (Normal IgG). А) Анализировалась ДНК последовательность промотора гена G6Pase, включающая сайты связывания транскрипционных факторов FoxOl (1RS) и HNF-4a (DR1). Б, В) Анализировалась ДНК последовательность промотора гена РЕРСК, включающая сайт связывания HNF-4a или FoxOl соответственно.

При введении соединений, активирующих рецептор CAR, также происходит снижение взаимодействия FoxOl со специфической последовательностью 1RS. При этом CAR не способен взаимодействовать с последовательностью 1RS (Рис. 6 А,В). Полученные на данном этапе работы результаты подтверждают, что производные cTPD снижают экспрессию генов глюконеогенеза путем нарушения взаимодействия основных регуляторов их транскрипции с энхансерными элементами, что подобно действию как их физиологического регулятора инсулина, так и терапевтического гипогликемического препарата метформина (Kim et al., 2008).

Известно, что ожирение связано со многими патологическими

состояниями, в том числе с диабетом 2-го типа (Kahn et al., 2006), поэтому для создания животных с метаболическими нарушениями часто используется модель высокожировой диеты (HFD). С использованием данной модели был исследован гипогликемический эффект соединения pDMA, поскольку в предыдущих экспериментах оно оказалось среди веществ, оказавших наиболее ярко выраженные эффекты, как на крыс, так и мышей. Соединения pF и pN02 также ингибировали экспрессию генов, однако, как показано на Рис. 6, они намного хуже снижали транскрипционную активность факторов FoxOl и HNF-4а. Для сравнения эффектов нового соединения pDMA, крысам также вводили PD - наиболее эффективный активатор CAR крыс.

Общепринятым показателем при нарушении метаболизма глюкозы вляется ее уровень в крови натощак. У животных, содержавшихся на высоко-кировой диете в течение 8 недель, наблюдалось достоверное повышение уровня глюкозы натощак. Хроническое введение как cTPD, так и pDMA снижало уровень глюкозы в крови животных как в случае жировой, так и стандартной диеты (Рис. 7).

о

cl

О LL X

<

S о

шш <

2 а

Рисунок 7. Результаты эксперимента с использованием модели высокожировой диеты (НРО), демонстрирующие уровень глюкозы в крови крыс. Приведены средние значения ± 50 * Статистическая значимость различий по сравнению с контролем (р<0,05). # Статистическая значимость различий по сравнению с группой (р<0,05).

Результаты измерения уровня глюкозы в крови крыс хорошо согласовывались с изменениями в экспрессии генов РЕРСК и G6Pase как на уровне мРНК, так и белка (Рис. 8 А,Б). Таким образом, оба соединения, активирующие CAR, показали способность снижать уровень глюкозы в крови при метаболических нарушениях.

В

IРЕРСК 1 G6Pase

РЕРСК

# // ■ GiiPasc

* # * * и

ш Ai-

is*

*

Ш'.

ЛА

HFD HFD

KOHT HFD cTPD cTPD pDMA pDMA HFD cTPD cTPD pDMA pDMA HFD HFD

Рисунок 8. Результаты эксперимента с использованием модели высокожировой диеты. (А) Относительное содержание мРНК РЕРСК и G6Pase в печени крыс. (Б) Иммуноблот белков РЕРСК и G6Pase печени крыс. На каждую дорожку нанесено 80 мкт белка. Приведены средние значения ± SD. * Статистическая значимость различий по сравнению с контролем (р<0,05). # Статистическая значимость различий по сравнению с группой HFD (р<0,05).

Исследование активации рецептора CAR человека. Полученные ранее результаты говорят о том, что синтезированные производные cTPD видоспецифично активируют рецептор CAR. При этом соединение pDMA активировало рецептор как крыс, так и мышей. Более того, оно оказывало гипогликемический эффект у животных с метаболическими нарушениями, индуцированными высокожировой диетой. Однако способность данных соединений оказывать подобные эффекты на человеческий организм не столь очевидна ввиду видоспецифичных особенностей активации рецептора. Исследование активации CAR человека (hCAR) под действием cTPD проводили на мышах, ввиду того что он не активирует CAR мышей (mCAR) (Pustylnyak et al., 2007), а в качестве положительного контроля использовали соединение CITCO (лиганд hCAR, также не активирует mCAR (Moore et al., 2000)). Для выполнения этой задачи мышам в хвостовую вену вводилась плазмида,

несущая ген hCAR под конститутивным промотором CMV, и плазмида, несущая ген Luc, кодирующий люциферазу, перед которым была встроена регуляторная область гена CYP2B6 человека, содержащая сайт связывания hCAR (PBREM). В результате экспрессии плазмиды с конститутивным промотором pCR3-hCAR в клетке синтезируется рецептор CAR человека, который в случае активации связывается с промотором гена люциферазы второй плазмиды. Активация промоторной области приводит к инициации транскрипции гена люциферазы, что в конечном итоге приводит к увеличению количества его белка, по изменению ферментативной активности которого )Жно судить об активации рецептора. В результате исследования было жазано увеличение относительной активности люциферазы у мышей после ведения как специфичного лиганда CITCO, так и cTPD, что говорит об штивации рецептора под действием этих соединений (Рис. 9А).

¿1

И

Относительная активность люциферазы

2.5

2 1.5 1

0.5 0

сур2Ы0 Р- актин SS-hCAR hCAR is+hCAR

.¿-400 ■4-100 <-200

в

Control CITCO cTPD

Конт

CITCO

cTPD

2

1.5

C.5

0

38-hCAK » hCAR

Конт С1ТСО сТРО

Рисунок 9. Исследование активации ЬСАЯ в печени мышей под действием С1ТСО (8 мг/кг) и сТРБ (10 мг/кг). -ЬСАЯ - образцы печени мышей, которым не вводилась плазмида рС^З-ЬСАК; +ЬСАЯ - образцы печени мышей, которым вводилась плазмида pCRЗ-hCAR. (А) Активация промотора гена СУР2В6 человека в печени мышей, оцененная по изменению активности люциферазы в печени мышей под действием соединений. (Б) Электрофоретическое разделение продуктов амплификации сур2Ы0 и Р-асПп. (В) Относительное содержание мРНК сур2Ы0 в печени мышей. Данные денситометрии рассчитывали как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена сур2Ь 10 к интенсивности полосы гена Р-асПп. Приведены средние значения ± 8Э. * Статистическая значимость различий по сравнению с контролем (р<0,05).

Поскольку регуляторная последовательность PBREM консервативна у человека и мыши и отличается всего на один нуклеотид (Sueyoshi et al., 2001), мы предположили, что активированный hCAR будет способен взаимодействовать с мотивом PBREM в промоторе гена Сур2Ы0 мышей, запуская его экспрессию. Для проверки данного предположения, которое, по сути, также является доказательством активации hCAR под действием исследуемых соединений, была проведена мультиплексная ПЦР с праймерами, З'-концы которых комплементарны кДНК только Сур2Ы0 мышей. В печени контрольных мышей наблюдалась конститутивная экспрессия гена Сур2Ы0, а при воздействии CITCO и cTPD происходит статистически значимое увеличение уровня мРНК гена Сур2Ы0 в печени мышей, экспрессирующих ген hCAR, но не у животных, которым данная плазмида не вводилась (Рис. 9Б,В).

Важно отметить, что для активации рецептора прямое связывание с акиватором не всегда является необходимым. Способность исследуемых производных cTPD выступать в качестве лигандов hCAR была проверена in vitro с помощью коммерческого набора реагентов, содержащего синтетический лиганд-связывающий домен hCAR. В качестве положительного контроля в данном эксперименте использовали лиганд рецептора CAR человека CITCO, а отрицательного - обратный агонист клотримазол. Связывание с рецептором наблюдалось лишь для двух соединений pF и pDMA (Рис. 10, данные приведены частично). По кривой зависимости детектируемого сигнала от логарифма концентрации была вычислена эффективная концентрация (ЕС50). Оказалось, что ECso Для данных соединений на 6 порядков выше положительного и отрицательного контролей, на основании чего был сделан вывод, что исследуемые соединения не являются высокоаффинными лигандами для рецептора CAR человека.

Несмотря на то, что cTPD не способен связываться с лиганд-связывающим доменом hCAR, в организме происходит его активация. Объяснением полученных различий в экспериментах in vivo и in vitro может быть тот факт, что лигандами рецептора выступают не сами соединения, а их метаболиты. С

этой точки зрения, наблюдаемая видоспецифичная разница действия активаторов CAR может быть следствием различий в субстратной специфичности метаболизирующих ферментов.

ая- V э s?

о к i,c

■3,6

i cfto-2

| №Латр№&ЗЭСЛ

. 1 TJ W «ЮН»

Л " -

• 11j и - 1 1 1* "

fWte'.....?.....н!5 8 *

fgfc)

й

41 J;

Ч 1

i

I J,e

fgici

е 2.s 5 5,8

I 1,6 2

g Я М i; 1 oj

/

" HJ

-

-3

5 i.s

I,"

S 11.«

i Я

If1'2

1 2 3 « 5 € 7

lg M

VI J I 4 r.-s»iTT

;itc;

ETp»»3=SS.1 •mnsTPQ

I—i—¿-.-If:'

-3 -2 -s e i s г 4 5 «

IgW

pDMA PF CITCO

ЕСзо (мМ) 0,25 5 7,24*10""

Рисунок 10. Кривые зависимости эффекта (отношения флуоресценции при 520 нм к флуоресценции при 495 нм) от концентрации производных сТРЭ. В таблице приведены значения эффективной концентрации ес50 исследуемых соединений после 2 ч инкубации с лиганд-связывающим доменом ИСАК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время ведутся активные исследования физиологической роли орфанового конститутивиого андростанового рецептора CAR. Первоначально данный рецептор был описан как транскрипционный регулятор экспрессии генов метаболизма ксенобиотиков, однако сейчас очевидно, что он может

i с1тсэ

I ¡«югриалзаля

принимать участие в регуляции многих важных физиологических процессов, протекающих в печени. В данной работе продемонстрирован эффект активации рецептора CAR на подавление глюконеогенеза в печени крыс под действием новых синтезированных производных 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3. Показана видоспецифичная активация рецептора под действием данных соединений. pDMA, одно из исследуемых производных cTPD, оказывало гипогликемический эффект у крыс с индуцированными метаболическими нарушениями, причем это соединение активировало также и рецептор мышей, с потенциально возможным активирующим эффектом на рецептор CAR человека.

Эффекты активации рецептора могут различаться у разных видов, что может объясняться либо различиями в регуляции исследуемых молекулярных процессов, либо видоспецифичными способами активации рецептора под действием экспериментальных соединений. Видоспецифичное действие экзогенных активаторов CAR и отсутствие детального описанного механизма активации рецептора затрудняет оценку его физиологической роли. В работе идентифицировано соединение с широкой межвидовой активностью по отношению к рецептору CAR, что создает перспективы для проведения дальнейших исследований молекулярных механизмов с участием данного рецептора.

ВЫВОДЫ

1. Хроническое введение cTPD снижает уровень экспрессии генов РЕРСК и G6Pase, что сопровождается уменьшением уровня глюкозы в крови крыс.

2. Впервые синтезированные производные cTPD видоспецифично активируют CAR крыс и мышей. Соединения pDMA, pN02 и pF активируют рецептор обоих видов, причем эффективная доза для крыс в 5 раз ниже, чем для мышей.

3. cTPD, tTPD, pDMA, pN02 снижают экспрессию генов ключевых ферментов глюконеогенеза РЕРСК и G6Pase в печени крыс через активацию CAR по двум молекулярным механизмам. Во-первых, активированный CAR взаимодействует с мотивом DR1 в промоторе генов глюконеогенеза, тем самым препятствуя связыванию HNF-4a. Во-вторых, активация CAR снижает связывание FoxO 1 с IRS в промоторах генов РЕРСК и G6Pase.

4. Исследуемые соединения не являются лигандами рецептора CAR человека, при этом cTPD способен активировать hCAR in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pustylnyak V., Yarushkin A.. Kachaylo Е., Slynko N., Lyakhovich V., Gulyaeva L. Effect of several analogs of 2,4,6-triphenyldioxane-l,3 on constitutive androstane receptor activation. // Chem Biol Interact. - 2011. - V. 192. - N. 3. - P. 177-183.

2. Pustylnyak V., Kazakova Y., Yarushkin A.. Slynko N., Gulyaeva L. Effect of several analogs of 2,4,6-triphenyldioxane-l,3 on CYP2B induction in mouse liver. // Chem Biol Interact. - 2011. - V. 194.-N. 2-3.-P. 134-138.

3. Kachaylo E.M., Yarushkin A.A.. Pustylnyak V.O. Constitutive androstane receptor activation by 2,4,6-triphenyldioxane-l,3 suppresses the expression of the gluconeogenic genes. //Eur J Pharmacol. -2012,-V. 679. -N. 1-3.-P. 139-43.

4. Kachaylo E.M., Yarushkin A.A.. Pustylnyak V.O. Long-Term Constitutive Androstane Receptor Activation By 2,4,6-Triphenyldioxane-l,3 Improves Glucose Metabolism in High-Fat Diet Rats. // Biochem & Anal Biochem. - 2012. - S4-001. doi: 10.4172/2161-1009.S4-001.

5. Yarushkin A.A.. Kachaylo EM, Pustylnyak VO. The constitutive androstane receptor activator 4-[(4R,6R)-4,6-diphenyl-1,3-dioxan-2-yl]-N,N-dimethylaniline inhibits the gluconeogenic genes PEPCK and G6Pase through the suppression of HNF4a and FOXO 1 transcriptional activity. // Br J Pharmacol. - 2013. - V. 168 - N.

8.-P. 1923-1932.

6. Gulyaeva L.F., Pustylnyak V.O, Yarushkin A.A.. Slynko N.M. Structure-activity study ofCYP2B induction in rat liver // Drug Metabolism Reviews. - 2009. -V. 41. -S. 3. - P. 86 (16th North American Regional 1SSX Meeting, Baltimore, USA)

7. Pustylnyak V.O., Yarushkin A.A.. Kachaylo E.M., Slynko N.M., Gulyaeva L.F. Minor changes in 2,4,6-tryphenyldioxane-l,3 inducer structure cause changes in CAR mediated CYP2B induction // Drug Metabolism Reviews. - 2010. - V. 42 - S. 1 - P. 226 (9th International Meeting of the ISSX, Istanbul, Turkey)__

8. Ярушкин A.A. Синтез и исследование производных 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3. // Материалы XL VIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». -Россия, Новосибирск, 2010. — С. 42.

9. Yarushkin A.A., Kazakova Y.A., Pustylnyak V.O. Constitutive androstane receptor (CAR): xenosensor and target for therapy. // International Conference on Postgenomic Technology for Biomedicine. - Novosibirsk, Russia, 2012. - P. 184

10. Yarushkin A.A.. Kazantseva Y.A., Pustylnyak V.O. Novel CAR-activated compound 4-[(4R,6R)-4,6-diphenyl-l,3-dioxan-2-yl]-N,N-dimethylaniline decreases gluconeogenic genes expression. // FEBS Advanced Lecture Course. Spetses Summer School on Nuclear Receptor Signalling in Physiology and Disease. - Spetses, Greece, 2013.-P. 57.

Подписано в печать 02.10.2014 Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 1,5 Объем 24 стр. Тираж 100 экз. Заказ №214 Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ru