Исследование механизмов индукции цитохрома Р450 подсемейства 2В в печени экспериментальных животных

Пустыльняк, Владимир Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизмов индукции цитохрома Р450 подсемейства 2В в печени экспериментальных животных
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов индукции цитохрома Р450 подсемейства 2В в печени экспериментальных животных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

Пустыльняк Владимир Олегович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИНДУКЦИИ ЦИТОХРОМА Р450 ПОДСЕМЕЙСТВА 2В В ПЕЧЕНИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2006

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Л.Ф. Гуляева Научный консультант:

акад. РАМН В.В. Ляхович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г.М. Дымшиц

доктор биологических наук А.Б. Беклемишев

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицыны СО РАН (Новосибирск).

Защита диссертации состоится «_»_2006 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (3832) 33-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

:СГРусских

1006я f/6£

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Цитохром Р450 (CYP), представленный мультигенным суперсемейством, является одним из ключевых ферментов микросомальной монооксигеназной системы, ответственной за метаболизм ксенобиотиков и эндогенных соединений в живых организмах (Ляхович, Цырлов, 1978). Важнейшим свойством множественных форм цитохрома Р450 является их способность к индукции, то есть к усилению ферментативной активности фермента при воздействии соответствующего ксенобиотика. В целом, индукция цитохрома Р450 представляет собой механизм защиты клетки от чужеродных соединений, обычно приводящий к детоксификации ксенобиотиков (Poster, Coon, 1991). Однако существует и другой результат такого процесса. Так, метаболизм лекарств, а также многих эндогенных соединений, включая простагландины, жирные кислоты и гормоны, может драматично меняться из-за индукции различных форм цитохрома Р450.

В настоящее время изучение механизмов индукции молекулярных форм CYP является одним из активно развивающихся направлений в современной молекулярной биологии, биохимии, токсикологии и фармакологии. Однако знания, касающиеся механизмов индукции, ограничены несколькими членами суперсемейства цитохрома Р450, хотя транскрипционный механизм активации показан для большинства подсемейств (Whitlock, 1990).

Среди множества форм этого фермента выделяют подсемейство CYP2B, которое участвует в биотрансформации лекарств, таких как циклофосфамиды (Chang et al., 1997), а также в метаболизме пестицида метоксихлора (Dehal, Kupfer, 1994) и некоторых промутагенов, в том числе афлатоксина В1 и специфичных для табака нитрозоаминов (Code et al., 1997). Большинство проведенных исследований свидетельствует о том, что индукция CYP2B преимущественно регулируется на транскрипционном уровне (Waxman, 1999; Honkakoski, Negishi, 2000), хотя показана возможность посттрансляционной модификации белковой молекулы, вызванной воздействием индуктора (Bartlomowicz et al., 1989; Oesch-Bartlomowicz et al., 2001). Известно, что регуляция транскрипции осуществляется за счет взаимодействия специфичных ядерных белков с различными регуляторными зонами CYP2B генов. В составе регуляторных последовательностей генов CYP2B были идентифицированы так называемые проксимальный и дистальный промоторы, участвующие в индукции под действием фенобарбитала (ФБ), классического индуктора этого подсемейства (Czekaj, 2000).

фенобарбиталом было показано, что в цитопла^лчгоЮВДВДНШШпВРОисходит

БИБЛИОТЕКА ]

С. 08

активация CAR-рецептора, после чего он транслоцируется в ядро, где связывается с ядерным белком RXR (ретиноидный X рецептор). Сформировавшийся гетеродимерный комплекс взаимодействует с PBREM-элементом дистального промотора, что является необходимым для инициации транскрипции (Pascussi et al., 2004). Такой механизм индукции CYP2B генов фенобарбиталом является на сегодняшний день общепринятым. Однако несмотря на интенсивные исследования, детально механизм, по которому индукторы инициируют транслокацию CAR в ядро, на сегодняшний день до конца не ясен, хотя показано, что прямое связывание рецептора с лигандом не является необходимым для ядерной транслокации рецептора (Moore et al., 2000). Было выдвинуто предположение, что транслокация рецептора в ядро контролируется запуском процессов фосфорилирования/ дефосфорилирования белков, но единой картины о роли этих процессов пока не сложилось (Coreos, Lagadic-Gossman, 2001).

В лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза ИМББ СО РАМН (г. Новосибирск) ведутся исследования индуцирующего действия 2,4,б-трифенилдиоксана-1,3 (ТФД). Преимущество этого соединения состоит в том, что его эффективная доза на порядок меньше, чем у фенобарбитала. В экспериментах in vitro было показано, что 2,4,6-трифенилдиоксан-1,3 и фенобарбитал активируют разные ядерные белки, способные взаимодействовать с последовательностью Барби-бокс проксимального промотора (Grigorieva et al., 2002). Однако значение и взаимное влияние различных ядерных белков, активирующихся под действием индукторов ФБ-типа in vivo, на данный момент не известны. Кроме того, эффект ТФД видоспецифичен: он активирует CYP2B у крыс, но не у мышей (Мишин и др., 1990). Причина видоспецифичных различий в индукции этого цитохрома Р450 остается неизвестной.

Целью настоящей работы является исследование молекулярных механизмов индукции CYP2B в печени экспериментальных животных, обработанных индукторами фенобарбиталового типа.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Изучить индуцирующее действие ТФД на монооксигеназную систему печени крыс и кроликов.

2. Определить относительное содержание мРНК CYP2B и сур2Ь в печени крыс и мышей, обработанных индукторами ФБ-типа: ФБ, ТФД и ТСРОВОР

3. Исследовать образование комплексов ядерных белков с элементом NR1 регуляторной последовательности PBREM гена CYP2B в печени крыс и мышей при индукции ФБ, ТФД и ТСРОВОР.

4. Исследовать динамику образования комплексов ядерных белков с последовательностью Барби-бокс проксимального промотора и относительное содержание мРНК CYP2B в печени крыс при индукции 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом in vivo (40 мин, Зч, 6ч, 18ч).

5. Исследовать влияние ингибиторов Ser/Thr протеинкиназ и протеинфосфатаз на ферментативную активность и содержание белков CYP2B в печени крыс при индукции 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом.

6. Определить относительное содержание мРНК CYP2B, CAR и исследовать образование комплексов ядерных белков с элементом NR1 регуляторной последовательности PBREM в печени крыс при совместном и раздельном введении ингибиторов и индукторов.

Научная новизна работы

Показаны видоспецифичные различия в индукции ТФД СУР2В у крыс и кроликов. ТФД является высокоспецифичным индуктором СУР2В изоформы у крыс и СУР2С изоформы у кроликов.

Показано, что основой межвидовых особенностей в индукции СУР2В являются различия в механизмах активации транскрипции у крыс и мышей.

Показано, что на ранних этапах индукции происходит активация ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов СУР2В в печени крыс. В течение первых 6-ти часов индукции наблюдаются различия в динамике образования ДНК-белковых комплексов для каждого соединения. К 18-ти часам картина интенсивности комплексов становится одинаковой как при индукции ФБ, так и ТФД. Несмотря на то, что индукторы различной химической структуры по-разному активируют такое связывание, этот процесс сопровождается включением транскрипции генов.

В результате данного исследования показано существование зависимых от индуктора путей активации генов СУР2В в печени экспериментальных животных. Впервые показано, что ингибирование Са2+/кальмодулин-зависимого сигнального пути существенно усиливает ферментативную активность и содержание белков СУР2В при индукции ТФД, но не ФБ в печени крыс, причем этот эффект реализуется на уровне транскрипции генов.

Научно-практическая значимость

По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярных механизмов индукции СУР2В в печени экспериментальных животных под действием индукторов ФБ-типа. Полученные результаты показали, что при исследовании механизмов активации генов важно рассматривать не только рецепторный механизм, но и участие специфических сигнальных путей. Этот вывод имеет фундаментальное значение для понимания механизмов активации экспрессии генов у эукариот.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ТФД является высокоспецифичным индуктором СУР2В изоформы в печени крыс и СУР2С изоформы в печени кроликов.

2. В основе межвидовых особенностей индукции СУР2В лежат различия в механизмах активации транскрипции генов у крыс и мышей.

3. На ранних этапах индукции ТФД и ФБ наблюдаются различия в активации ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов СУР2В в печени крыс.

4. Активность СУР2В в печени крыс, обработанных ТФД и ФБ, меняется под воздействием ингибиторов путей сигнальной трансдукции.

5. Ингибирование Са2+/кальмодулин-зависимого сигнального пути усиливает экспрессию генов СУР2В и приводит к усилению интенсивности комплекса ядерных белков с элементом N111 при индукции ТФД. Этот эффект не наблюдается при индукции ФБ.

Апробация работы

Результаты работы были представленны и обсуждены на VIII Европейской конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Dijon, France, 2003; на VII Международной конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Vancouver, Canada, 2004; на VIII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, Россия, 2004); на XIII Североамериканской конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Maui, Hawaii, 2005.

Публикации. По материалам диссертации имеется 8 печатных работ.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 3 таблицы и 23 рисунка и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 7 отечественных и 133 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования межвидовых различий в индукции микросомальной монооксигеназной системы в печени животных под действием 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 использовали самцов крыс линии Spraque-Dawley (170 - 200 г) и кроликов линии New Zealand (3 - 3,5 кг). Индуктор вводили внутрибрюшинно из расчета - 10 мг/кг веса в растительном масле. Для исследования межвидовых различий в активации генов CYP2B использовали самцов крыс линии Wistar (150 - 170 г) и мышей линии C57BL/6 (30 - 35 г). Крысам и мышам индукторы вводили внутрибрюшинно из расчета: ТФД - 10 мг/кг веса в растительном масле, ТСРОВОР - 3 мг/кг веса в растительном масле, ФБ - 80 мг/кг веса в 0.9%-ном растворе NaCl. Для исследования влияния протеинкиназ и протеинфосфатаз на индукцию CYP2B индукторы вводили внутрибрюшинно самцам крыс линии Wistar из расчета: ТФД - 10 мг/кг веса в растительном масле, ФБ - 80 мг/кг веса в 0.9%-ном растворе NaCl. Ингибиторы протеинкиназ и протеинфосфатаз вводили внутрибрюшинно в 0.9%-ном растворе NaCl за 30 мин до введения индукторов из расчета: Wortmannin - 100 мкг/кг, бисиндолилмалеимид I - 1 мг/кг, W-7 - 100мкг/кг, окадаевая кислота - 50 мкг/кг. Контрольным животным вводили растительное масло или 0.9%-ный раствор NaCl.

Микросомы печени выделяли при температуре +4°С общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Количество белка в микросомах определяли по методу Лоури, общее содержание цитохрома Р450 измеряли как описано Омура Т. и Сато P. (Omura, Sato, 1964). Скорости О-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина (ПРОД) (высокоспецифичного субстрата для CYP2B) определяли в микросомах печени флюориметрическим методом по скорости образования резоруфина (Burke et al., 1985). Каталитическую активность, специфичную для подсемейства CYP3A определяли с использованием высокоспецифичного субстрата -эритромецина. Скорость N-деметилирования эритромицина определяли по образованию формальдегида (Tu, Yang, 1983). Скорость гидроксилирования тестостерона определяли согласно методу Лонго с соавт. (Longo et al., 1991) по образованию гидроксиметаболитов тестостерона.

Для детекции белков CYP2B, CYP3A и CYP2C микросомальные белки разделяли диск-электрофорезом (Laemmli, 1970), переносили на нитроцеллюлозную мембрану полусухим способом в буфере 25 мМ Трис-НС1, 195 мМ глицин, 20% этанол на приборе Fastblot "Biometra" (Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Мембрану инкубировали с поликлональными антителами против CYP2B, CYP3A и CYP2C крысы (Sigma). Визуализацию иммунореактивных полос проводили с использованием системы для детекции ECL (Amersham) и рентгеновской пленки. На каждую дорожку геля наносили одинаковое суммарное количество белка микросом.

Суммарную РНК клеток печени выделяли с использованием реагента TRIZOL (Life Technologies) согласно рекомендациям производителя. Относительное содержание мРНК CYP2BI/2, сур2Ь9/10 и CAR определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР (Wong et al., 1994). В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось выравнивание продуктов амплификации исследуемых генов, были выбраны гены «домашнего хозяйства» (3-актин для сур2Ь9/10 и GAPDH для CYP2B1/2 и CAR. Для синтеза кДНК in vitro брали по 1 мкг РНК на пробу. ПЦР предварительно оптимизировали по числу циклов, концентрации Mg2+, количеству праймеров. Каждая проба ПЦР содержала 2 мкл кДНК, 1х буфер для ПЦР, 0,2 мМ dNTP, 20 пкмоль праймеров для CYP2B1/2, сур2Ь9/10 или CAR и 2 ед. ак. Taq ДНК-полимеразы. Праймеры для амплификации генов «домашнего хозяйства» GAPDH шт р-актина (20 пкМ) были добавлены через несколько циклов. В наших условиях наиболее подходящее число циклов для CYP2B1/2 - 31, CAR - 37, GAPDH - 30, сур2Ь9/10 - 26 и р-актина - 25. Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5 - 2% агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием, сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва) и денситометрировали с помощью программы "Total Lab". Относительное содержание мРНК CYP2B1/2, сур2Ь9/10 и CAR оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы генов к интенсивности полосы гена «домашнего хозяйства» р-актина или GAPDH.

Выделение ядер клеток печени крыс проводили в соответствии с методом, описанным ранее (Carey et al., 1987). Выделение ядерных белков проводили по методу Gorski К. (Gorski et al., 1986). Определение белка в ядерных белковых экстрактах проводили методом Брэдфорда М.М. (Bradford, 1976).

Для получения двуцепочечных зондов последовательности Barbie-box и NR1 метили [у-Р32] (Amersham) в реакции фосфорилирования (Маниатис и др, 1984) и гибридизовали. ДНК/белковые комплексы анализировали методом задержки в 10% полиакриламидном геле.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ STATISTICA 6.0 и ORIGIN 6.0. Результаты представлены в виде М ± ш, где М - среднее, m - ошибка среднего. Для оценки достоверности различий между выборками использовался t -критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Межвидовые различия в индукции микросомальной монооксигеназной системы в печени крыс и кроликов под действием 2,4,6- трифенилдиоксана-1,3

Для изучения видоспецифичного действия ТФД было исследовано его влияние на активность ферментов микросомальной монооксигеназной системы в печени крыс линии Spraque-Dawley и кроликов линии New Zealand. В таблице 1 представлены данные о содержании общего количества Р450, определенного спектрально, а также результаты определения специфичных каталитических активностей различных форм CYP в печени контрольных и обработанных ТФД животных. Введение крысам индуктора сопровождается увеличением как общего количества CYP (в 2 раза), так и ПРОД (CYP2B специфичной) активности (в 12 раз), в то время как при введении этого индуктора кроликам не происходит значительных изменений этих параметров по сравнению с контролем. Индукция ТФД не повлияла на скорость N-деметилирования эритромицина (ЭМД, CYP3 А-специфичная активность) в печени, как крыс, так и кроликов.

Таблица 1. Влияние ТФД на активность ферментов I фазы метаболизма ксенобитиков в печени крыс и кроликов.

Р450 ПРОД эдм Скорость гидроксилирования тестостерона

(нмоль (пмоль/ (нмоль (нмоль/мин/мг белка)

/мг мин/мг /мин/

белка) белка) мг

белка) 16Р-ОНТ 16а-ОНТ 6р-ОНТ 17-ОТ

Крысы (Копт) 0,6±0,2 П±6 2,3±0,2 но 0,53±0,11 0,95±0,03 0,18±0,05

Крысы (ТФД) 1,2±0,4* 133±32'" 3,8 ±0,9 0,18±0,09 0,43±0,03 1,0±0,1 0,14±0,07

Кролнки(Конт) 0,9±0,4 5±4 1,3±0,4 0,08±0,01 0,06±0,01 0,35±0,06 0,14±0,03

Кролики(ТФД) 1,0±0,3 8,2±5,3 0,8±0,4 0,15±0,04' 0,94±0,15"" 0,68±0,07* 0,68±0,Г"

Приведены средние значения ± БО. Достоверность различий по сравнению с контролем: *** (р<0,001); * (р<0,05). И.О. - не определяется. Конт - контрольная группа животных; ТФД - группа животных, обработанных ТФД.

При определении скоростей гидроксилирования тестостерона в разных положениях можно видеть существенное увеличение 16Р-гидроксилазной активности, специфичной для СУР2В изоформы при введении ТФД крысам,

которая не детектируется в контроле. Исходные уровни 6(3-, 16а- и 17-гидроксилазных активностей достаточно высоки, что свидетельствует о высоком конститутивном уровне СУРЗА и СУР2С белков в печени крыс. Индукция крыс ТФД не оказывает значительного влияния на скорости 6(3-, 16а- и 17-гидроксилирования тестостерона. В печени кроликов наблюдается иная картина. При ТФД-индукции происходит значительное увеличение 16а-и 17-гидроксилазных активностей (15,5 и 5 раз, соответственно), тогда как 160- и 6|3- гидроксилазные активности увеличиваются менее чем в 2 раза.

Индукция СУР изоформ была оценена также с помощью иммуноблот анализа микросомальных препаратов печени животных с использованием поликлональных антител против СУР2В, СУРЗА и СУР2С крыс. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 1.

А) Б)

Конт ТФД Конт ТФД

СУР2С «к СУРЗА

. о *

СУР2В

Рисунок 1. Иммуноблот анализ СУР белков в микросомах печени кроликов (А) и крыс (Б). Конт - контрольная группа животных; ТФД - группа животных, обработанных ТФД.

Воздействие ТФД значительно повышало содержание СУР2В белков в печени крыс (рис. 1 Б) по сравнению с контролем, тогда как этот индуктор не оказал значительного влияния на содержание иммунореактивных белков СУР2С и СУРЗА. В печени кроликов (рис. 1А) при индукции ТФД происходит значительное увеличение содержания лишь СУР2С апофермента. Таким образом, увеличение специфичных активностей СУР2В (ПРОД и 16(3-гидроксилазная активности) в микросомах печени крыс и специфичных активностей СУР2С (16а- и 17-гидроксилазные активности) в микросомах печени кроликов, вызванное введением ТФД, обусловлено увеличением содержания апоферментов. Полученные результаты свидетельствуют о видоспецифичном действии ТФД, однако до сих пор остается неясным, почему одно и то же химические соединение по-разному влияет на индукцию СУР2В в печени разных лабораторных животных.

Экспрессия генов СУР2В в печени крыс и мышей под действием индукторов фенобарбиталового типа

Для того чтобы ответить на вопрос, какие молекулярные механизмы лежат в основе межвидовых различий в изменении ферментативной активности СУР2В было определено относительное содержание мРНК СУР2В в печени крыс и сур2Ь в печени мышей. В качестве индукторов были выбраны индукторы цитохрома Р450 подсемейства 2В: ФБ, индуцирующий СУР2В в печени крыс и мышей, ТСРОВОР (1,4-бис[2-(3,5-дихлоро)пиридилокси] бензол), индуцирующий СУР2В только у мышей и менее изученный индуктор подсемейства 2В в печени крыс, но не мышей -ТФД.

Экспрессия генов под действием индукторов ФБ-типа была измерена методом мультиплексной ОТ-ПЦР. В виду высокой гомологии нуклеотидных последовательностей между генами СУР2В1 и СУР2В2 у крыс, сур2Ъ9 и сур2Ы0 у мышей, использовали одну пару праймеров для амплификации обеих изоформ у соответствующего вида животного. Суммарную РНК из печени животных получали через 18 ч после введения индукторов. Результаты мультиплексной ОТ-ПЦР представлены на рисунке 2.

Крысы Мыши

Копт ФБ ТФД ТСРОВОР Каш «Б Т*Д ТСРОВОР

Рисунок 2. Эффект индукторов ФБ-типа на относительное содержание мРНК СУР2В в печени крыс и мышей Конт - контрольная группа животных; ФБ - группа животных, обработанных ФБ; ТФД - группа животных, обработанных ТФД; ТСРОВОР - группа животных, обработанных ТСРОВОР. Приведены средние значения ± БЭ (п=9). ***Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,001).

Видно, что в печени контрольных животных наблюдается низкое содержание мРНК СУР2В и сур2Ь. Введение ФБ приводит к увеличению содержания мРНК как у крыс (в 3,5 раза), так и у мышей (в 12 раз). Ведение ТФД сопровождается значительным увеличением содержания мРНК СУР2В

только в печени крыс (в 3 раза). Введение индуктора ТСРОВОР мышам приводит к многократному усилению экспрессии гена сур2Ь (в 16 раз), в то время как при введении этого индуктора крысам происходит уменьшение содержания мРНК по сравнению с контролем (в 2,5 раза).

Эти результаты дают нам основание сделать вывод о том, что основой межвидовых особенностей в индукции СУР2В являются различия в механизмах активации транскрипции у крыс и мышей.

Исследование влияния индукторов на образование комплексов ядерных белков с регуляторным элементом NR1 PBREM

Дальнейшим шагом в изучении видоспецифичной индукции CYP2B было исследование образования комплексов ядерных белков с си-элементом дистального промотора в регуляторной области генов-мишеней. Эксперименты по "задержке ДНК в геле" проводились с использованием олигонуклеотида, соответствующего NR1-сайту регуляторной последовательности PBREM, как наиболее консервативному элементу энхансерной области генов CYP2B у крыс и мышей, с которым взаимодействует гетеродимерный комплекс CAR.RXR (Goodwin, Moore, 2004). Белки ядерных экстрактов были получены из печени контрольных и обработанных ФБ, ТФД, ТСРОВОР животных спустя 6 ч после введения индукторов. Полученные результаты продемонстрировали различия в активации ядерных белков (предполагаемых факторов транскрипции) под действием разных индукторов у крыс и мышей. Видно, что в отсутствии индукторов инкубация NR1 с ядерными экстрактами печени контрольных крыс сопровождается формированием ДНК-белкового комплекса II (рис. 3, дорожка AI), тогда как при инкубации NR1 с ядерными экстрактами печени контрольных мышей не происходит формирования комплексов (рис. 3, дорожка Б1). ФБ активирует формирование ДНК-белковых комплексов в печени, как крыс, так и мышей, ТФД - лишь в печени крыс, а ТСРОВОР -лишь в печени мышей. Следует отметить, что при введении ФБ и ТФД крысам формируется два комплекса. Основываясь на литературных данных, можно предположить, что в состав регистрируемых ДНК-белковых комплексов входит ядерный рецептор CAR. Возможно, что в комплексе I (рис. ЗА) CAR присутствует в виде гетеродимера с RXR рецептором, а в комплексе II в виде мономерного белка.

Такая картина формирования комплексов ядерных белков с элементом NR1 хорошо сочетается с профилем транскрипции генов-мишеней, что подтверждает предположение о транскрипционной природе межвидовых особенностей в индукции CYP2B.

Яа*рны* бижи ♦ + ♦ * ♦ + + ♦+ + + *♦. Конкурент ..♦.+.♦.

1 2 3 4 5 9 12345078

(А) 16)

Рисунок 3. Радиоавтограф электрофоретического разделения комплексов олигонуклеотида N111 с ядерными белками печени крыс (А) и мышей (Б), обработанных индукторами ФБ-типа. Представлены результаты задержки ДНК-белковых комплексов в ПААГ, образованных олигонуклеотидом [32Р]ЫЯ1 и ядерными белками из печени контрольных (К) и индуцированных (И) животных. Время инкубации 30 мин. В качестве конкурента использовали немеченый олигонуклеотид N111. Дорожки А1, Б1 - К; А2, Б2 - ИФВ; АЗ, БЗ - ИФБ+ немеченый Ш1; А4, Б4 - ИТФД; А5, Б5- Итфд+ немеченый N111; А6, Б6 - Итсровор; Б7 - Итсровор+ немеченый N111. [32Р] N111 присутствует во всех дорожках.

Динамика образования ДНК-белковых комплексов с последовательностью Барби-бокс в печени крыс при индукции 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом

Известно, что помимо регуляторных элементов дистального промотора РВЯЕМ в активации генов СУР2В участвуют си-элементы проксимального промотора, в том числе последовательность Барби-бокс. Для выяснения роли регуляторного элемента Барби-бокс проксимального промотора в механизме индукции СУР2В генов, было исследовано влияние ФБ и ТФД на образование комплексов ядерных белков с элементом Барби-бокс методом "задержки ДНК в геле". В данных экспериментах использовались ядерные экстракты печени контрольных крыс, а также экстракты из печени крыс, выделенные спустя 40 минут, 3, 6 и 18 часов после введения индукторов.

В отсутствии индукторов при инкубации Барби-бокс с ядерными экстрактами печени контрольных крыс регистрировалось два комплекса (I и

И) (рис. 4, дорожка 2; рис. 5, дорожка 2). При взаимодействии ядерных белков печени индуцированных крыс с Барби-бокс последовательностью было показано, что введение ФБ и ТФД ведет как к изменению интенсивности связывания, так и к формированию нового комплекса.

Ядерные белки - + + + + + + Конкурент - - хЮО - - - -1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 4. Радиоавтограф электрофоретического разделения комплексов олигонуклеотида Барби-бокс с ядерными белками печени крыс, обработанных ФБ. Представлены результаты задержки ДНК-белковых комплексов в 10% ПААГ, образованных [32Р] Барби-бокс и ядерными белками из печени контрольных (К) и обработанных ФБ (ИФБ) крыс. Время инкубации 30 мин. В качестве конкурента использовали немеченый олигонуклеотид Барби-бокс. Дорожки 2 - К, 3 - ИфБ Зч + немеченый Барби-бокс, 4 - ИФБ 40 мин, 5 - ИФБ Зч, 6 - ИФБ 6ч, 7 - ИфБ 18ч. [32Р] Барби-бокс присутствует во всех дорожках.

В экспериментах с ядерными экстрактами печени крыс, обработанных ФБ, было показано, что в случае 40 мин индукции наблюдается образование нового комплекса III, имеющего более низкую молекулярную массу (рис. 4, дорожка 4). Интенсивность связывания белков при образовании всех трех комплексов увеличивается уже при трехчасовой продолжительности воздействия индуктора (рис. 4, дорожка 5) и сохраняется до 18-ти часов (рис. 5, дорожка 7). Аналогичные результаты, демонстрирующие образование трех комплексов при 6-ти и 24-х часовой ФБ-индукции, были получены в лаборатории Падманабана П. Н. (Upadhya et al., 1992; Ram et al., 1995; Prabhu et al., 1995).

Следует заметить, что образование этих комплексов конкурентно ингибируется холодной пробой ДНК, содержащей немеченую Барби-бокс последовательность (рис. 4, дорожка 3). Помимо этого, ранее было показано, что формирование комплексов ядерных белков с Барби-бокс последовательностью не ингибируется добавлением 100-кратного избытка немеченых олигонуклеотидов, соответствующих другим регуляторным элементам, таким как DRE и NE (Дужак и др., 2002).

Ядерные белки - +++++ +

Конкурент .....хЮО -

1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 5. Радиоавтограф электрофоретического разделения комплексов олигонуклеотида Барби-бокс с ядерными белками печени крыс, обработанных ТФД Представлены результаты задержки ДНК-белковых комплексов в 10% ПААГ, образованных [ Р]Барби-бокс и ядерными белками из печени контрольных (К) и обработанных ТФД (ИХФД) крыс. Время инкубации 30 мин. В качестве конкурента использовался немеченый олигонуклеотвд Барби-бокс. Дорожки 2 - К, 3 - ИТФД 40мин, 4 - ИТФД Зч, 5 - ИТФД 6ч, 6 - ИТФД 6ч + немеченый Барби-бокс, 7 - ИТФД 18ч. [32Р] Барби-бокс присутствует во всех дорожках.

При инкубации ядерных экстрактов печени крыс, обработанных ТФД с последовательностью Барби-бокс также образовывались различные ДНК-белковые комплексы, число и интенсивность которых, зависела от времени воздействия индуктора. В течение первого часа индукции (40 мин) формировался только комплекс I (рис. 5, дорожка 3), который соответствовал

одному из двух комплексов, регистрируемых в случае использования ядерных экстрактов контрольных животных (рис. 5, дорожка 2). При инкубации ядерных экстрактов, полученных из печени крыс через 3, 6 и 18 ч после введения индуктора, с элементом Барби-бокс генов CYP2B, формировалось три комплекса (I, II и III') (рис. 5, дорожки 4, 5, 7). Для доказательства специфичности образования этих комплексов также проводилось добавлением 100-кратного избытка немеченого Барби-бокс, что приводило к практически полному исчезновению комплексов I, II и ПГ (рис. 5, дорожка 6).

Неодинаковая картина формирования комплексов ядерных белков с последовательностью Барби-бокс при введении ФБ и ТФД может отражать процессы активации ядерных и цитозольных белков с последующей транслокацией последних в ядро. Можно также предположить, что в течение исследуемого интервала времени под действием индукторов меняется конформация специфических ядерных белков - рецепторов.

Выявленные нами различия в динамике образования ДНК-белковых комплексов могут свидетельствовать о существовании специфических ядерных рецепторов для каждого индуктора. В пользу этого предположения говорят полученные ранее в нашей лаборатории результаты, показывающие, что инкубация ядерных белков печени крыс с Барби-бокс последовательностью с добавлением ФБ in vitro сопровождалась образованием трех комплексов, тогда как ТФД стимулировал формирование пяти комплексов (Grigorieva et al., 2002).

Экспрессия генов CYP2B в печени крыс в зависимости от времени действия 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 и фенобарбитала

Для доказательства того факта, что связывание ядерных белков с Барби-бокс имеет функциональное значение в регуляции экспрессии генов CYP2B, было измерено относительное содержание мРНК CYP2B. Суммарную РНК из печени получали через 40 минут, 3, 6 и 18 часов после введения 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 или фенобарбитала. Результаты ОТ-ПЦР представлены на рис. 6. Видно, что образование новых ДНК-белковых комплексов сопровождалось усилением транскрипции генов CYP2B.

Действительно, в контроле наблюдается слабая конститутивная экспрессия гена СУР2В. Через 40 мин после введения крысам фенобарбитала, но не 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3, происходит повышение уровня мРНК в 3,5 раза, что совпадает с уменьшением числа ДНК-белковых комплексов при ТФД-индукции (рис. 5, дорожка 3). Отчетливая тенденция к росту была отмечена через 3 часов после введения обоих индукторов, которая сохранялась к 18-ти часам. Следует отметить, что содержание мРНК CYP2B в случае 3-х, 6-ти и 18-ти часов после введения как фенобарбитала, так и 2,4,6-

трифенилдиоксана-1,3 достоверно увеличилось по сравнению с контрольным уровнем.

Рисунок 6. Зависимая от времени после введения ФБ- и ТФД- индукция накопления мРНК СУР2В в печени крыс. Суммарную мРНК выделяли из печени контрольных и обработанных ФБ и ТФД крыс через 40 мин, 3, 6 и 18 ч после введения индуктора. В качестве контроля использовали ген р-актина. Приведены средние значения ± вО (п=9). * Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,001), ** достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,01), *** достоверность различий по сравнению с контролем (р<0.05).

Таким образом, мы впервые показали, что на ранних этапах индукции (через 40 мин после введения крысам ФБ и 3 ч после введения ТФД) происходит активация ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс генов СУР2В. Несмотря на то, что индукторы различной химической структуры по-разному активируют такое связывание, проведенные эксперименты наглядно свидетельствуют о том, что этот процесс сопровождается включением транскрипции гена.

Влияние ингибиторов вег/ТЬг протеинкиназ и протеинфосфатаз на индукцию СУР2В 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом в

печени крыс

Известно, что в регуляции экспрессии многих генов, в том числе цитохрома Р450, существенную роль играют процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования белков. Для исследования участия некоторых Бег/ТЬг протеинкиназ и протеинфосфатаз в механизме индукции СУР2В были использованы ингибиторы фосфатидилинозитол-3 киназы (\Уогйпапшп), протеинкиназы С (В1зт<1о1у1та1ентс1е I), Са2+/кальмодулин-зависимой киназы И (\У-7), а также ингибитор протеинфосфатаз РР1, РР2А (окадаевая кислота). Влияние ингибиторов на ферментативную активность СУР2В при

индукции изучалось по скорости О-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина, субстрата, высокоспецифичного для этой формы цитохрома. На рис. 7 показан эффект этих ингибиторов на ПРОД активность в микросомах печени крыс.

Кент Т W T+W В» Т*В* W7 T*W7 ФБ <№Н№7

Рисунок 7. Влияние ингибиторов протеинкиназ на скорость О-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина (ПРОД). Конт - активность CYP2B в печени контрольных крыс; Т - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных ТФД; W - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных Wortmannin; T+W - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных Wortmannin до введения ТФД; Bis - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных Bisindolylmaleimide I; T+Bis - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных Bisindolylmaleimide I до введения ТФД; W-7 - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных W-7; T+W7 - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных W-7 до введения ТФД; ФБ - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных ФБ; ФБ+\У7 - активность CYP2B в микросомах печени крыс, обработанных W-7 до введения ФБ. Приведены средние значения ± SD (п=9). *** Достоверность различий по сравнению с группой контрольных животных (р<0 001); w достоверность различий по сравнению с группой животных, обработанных ТФД (р<0.001).

Видно, что в микросомах печени контрольных крыс наблюдается низкая активность СУР2В (~25 пмоль/мин/мг белка). При введении ТФД и ФБ происходит значительное увеличение ПРОД активности (в 18 и 24 раз, соответственно). Ингибиторы фосфатидилинозитол-3 киназы ^оПтапшп) и протеинкиназы С (В1зт(1о1у1та1е11ш<1е I) не оказали существенного эффекта на ПРОД активность при совместном введении с ТФД, тогда как при введении только одного В1зтс1о1у1та1еишс1е I, но не \¥огйпаппт, наблюдается достоверное увеличение специфичной активности СУР2В. Введение крысам \¥-7, ингибитора Са2+/кальмодулин-зависимой киназы И, с последующей индукцией ТФД значительно повышало ПРОД активность (в 6 раз) по

сравнению с ведением только одного ТФД. Для сравнения были проведены эксперименты, когда ингибитор Са2+/кальмодулин-зависимой киназы II вводился до индукции ФБ. Как видно из рисунка 7, не оказал

значительного влияния на ПРОД при индукции ФБ. Стоит отметить, что при введении только одного не наблюдалось достоверных отличий от контрольного уровня.

На рис. 8 показано влияние окадаевой кислоты (ОА), ингибитора протеинфосфатаз РР1, РР2А на индукцию ТФД и ФБ. Видно, что ОА снижала индуцирующий эффект ТФД и ФБ (в 8 и 2,5 раз, соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о различном влиянии процессов фосфорилирования белков на индукцию СУР2В ТФД и ФБ, тогда как процессы дефосфорилирования белков являются общими для обоих индукторов.

Квит ОА Т Т+ОА ФБ Фб+ОА

Рисунок 8. Влияние ингибитора протеинфосфатаз на скорость 0-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина (ПРОД). Конт - активность СУР2В в печени контрольных крыс; ОА - активность СУР2В в микросомах печени крыс, обработанных окадаевой кислотой; Т - активность СУР2В в микросомах печени крыс, обработанных ТФД; Т+ОА - активность СУР2В в микросомах печени крыс, обработанных окадаевой кислотой до введения ТФД; ФБ - активность СУР2В в микросомах печени крыс, обработанных ФБ; ФБ+ОА - активность в микросомах печени крыс, обработанных окадаевой кислотой до введения ФБ. Приведены средние значения ± ЯО (п=9). *** Достоверность различий по сравнению с группой контрольных животных (р<0 001); +++ достоверность различий по сравнению с группой ТФД-индуцированных животных (р<0.001)\ * достоверность различий по сравнению с группой РВ-индуцированных животных (р<0.01).

Чтобы понять, на каком уровне осуществляется влияние ингибиторов сигнальных путей на ферментативную активность СУР2В, был проведен иммуноблот-анализ с использованием поликлональных антител против СУР2В1 крыс и оценен уровень экспрессии генов СУР2В1/2. Для количественной оценки иммуноблот-анализа было проведено

денситометрирование полос иммунопреципитации. Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 9.

А)

^юим^

Кохт Т Ф т Т*Ш4К«Т ОА Т«ОАФ«ОА Стаюорт

Б)

Кокг Т ♦ М Т+т ОА Т+ОА Ф+ОА

Рисунок 9. Иммуноблот анализ СУР2В белков в микросомах печени крыс.

А). Иммунодетекцию проводили с использованием поликлональных антител против СУР2В1. Конт - контрольная группа животных; Т - группа животных, обработанных ТФД; Ф - группа животных, обработанных ФБ; У/7 - группа животных, обработанных \V-7j Т+\У7 - группа животных, обработанных \У-7 до введения ТФД; Ф+\У7 - группа животных, обработанных XV-7 до введения ФБ; ОА -группа животных, обработанных окадаевой кислотой; Т+ОА - группа животных, обработанных окадаевой кислотой до введения ТФД; Ф+ОА - группа животных, обработанных окадаевой кислотой до введения ФБ. На все дорожки нанесено 20 мкг микросомального белка. Для доказательства специфичности иммунореактивных полос использовалось 500 яг СУР2В1 белка, очищенного из микросомальной фракции крыс (Стандарт). Б). Денситометрические значения интенсивности иммунореактивных полос СУР2В. Контроль соответствует 100%. Достоверность различий по сравнению с группой контрольных животных: ** (р<0.01), * (р<0.05); достоверность различий по сравнению с группой животных, обработанных ТФД: ++ (р<0 01), + (р<0 05); достоверность различий по сравнению с группой животных, обработанных ФБ: **(р<0 01).

Проведенный анализ показал, что в микросомах печени контрольных крыс регистрируется невысокое содержание белков СУР2В. Введение ТФД,

ФБ и сопровождалось 2-3-х кратным увеличением содержания белков СУР2В по сравнению с контролем. Воздействие ОА приводило к снижению как конститутивного, так и ТФД- / ФБ- индуцированного количества белков СУР2В. Введение крысам АУ-7 с последующей индукцией ТФД значительно повышало содержание белков СУР2В по сравнению с ведением только одного ТФД, тогда как ингибитор не оказал значительного влияния на содержание белков СУР2В при индукции ФБ.

Чтобы оценить уровень экспрессии генов СУР2В1/2 при исследовании действия ингибиторов АУ-7 и ОА, было определено содержание мРНК, кодируемых генами СУР2В1/2. Для этой цели был применен метод мультиплексной ОТ-ПЦР. Ген домашнего хозяйства, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (ОАРИН), был использован как эндогенный внутренний стандарт, относительно которого производилась нормализация количества продуктов амплификации мРНК СУР2В. Результаты мультиплексной ОТ-ПЦР представлены на рис. 10 и 11.

А)

м Кип <N1 ФБ ТФД ФБ»У<П ТФД«¥¥7

Рисунок 10. Влияние 1^-7 на относительное содержание мРНК СУР2В1/2 в печени крыс. А). Разделение продуктов амплификации СУР2В1/2 и С АРОН. Конт -контрольная группа животных; W7 - группа животных, обработанных \V-7j ФБ -группа животных, обработанных ФБ; ТФД - группа животных, обработанных ТФД; ФБ+Х^^ - группа животных, обработанных \У-7 до введения ФБ; ТФД+\¥7 - группа животных, обработанных \¥-7 до введения ТФД Б). Относительное содержание мРНК СУР2В в печени крыс. Приведены средние значения ± вБ (п=9). *** Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,001), ^ достоверность различий по сравнению с индукцией ТФД (р<0,001).

Как видно из рисунка 10, в печени контрольных животных регистрировалась низкая конститутивная экспрессия генов СУР2В. Введение как ТФД, так и ФБ вызывало 2-х кратное усиление экспрессии генов. Это позволяет сделать вывод о транскрипционном механизме индукции СУР2В. Данный вывод подтверждается и введением ингибиторов \У-7 и ОА, которые вызывали изменение экспрессии генов, сопровождающиеся изменением ферментативной активности ПРОД и содержания белка.

Следует заметить, что сам ингибитор W-7 показал способность усиливать экспрессию генов СУР2В в 2 раза (рис. 10). Этот эффект может быть напрямую связан с активацией специфичных сигнальных путей, усиливающих конститутивную экспрессию генов. При совместном введении W-7 и ТФД, но не ФБ, наблюдается аддитивный эффект, приводящий к увеличению уровня мРНК СУР2В в 1,5 раза по сравнению с индукцией ТФД. Этот эффект, с одной стороны, подтверждает стимулирующий эффект ингибитора Са2+/кальмодулин-зависимой киназы II на индукцию СУР2В, и, с другой стороны, говорит о том, что этот эффект реализуется на уровне транскрипции.

А)

Кош 0« ФБ ТФД Ф6НМ ТФД»}*

б)

l.llll

и • I * 1 ' I ' 1* I I J 1

Кош он ФБ ТФЯ ф64» ТФДМЗ»

Рисунок 11. Эффект окадаевой кислоты на относительное содержание мРНК CYP2B в печени крыс. А). Разделение продуктов амплификации CYP2B1/2 и GAPDH. Конт - контрольная группа животных; ОА - группа животных, обработанных окадаевой кислотой; ФБ - группа животных, обработанных ФБ; ТФД - группа животных, обработанных ТФД; ФБ+ОА - группа животных, обработанных окадаевой кислотой до ввдедения ФБ; ТФД+ОА - группа животных, обработанных окадаевой кислотой до введения ТФД. Б). Относительное содержание мРНК CYP2B в печени крыс. Приведены средние значения ± SD (п=9). ***Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,001), ** достоверность различий по сравнению с индукцией ФБ или ТФД (р<0,01).

При исследовании эффекта окадаевой кислоты на индукцию экспрессии генов CYP2B показано, что ее введение крысам вызывало заметное уменьшение конститутивного содержания мРНК (рис. 11). Этот же эффект отмечался при совместном введении OA с ТФД или ФБ: относительное содержание мРНК CYP2B снижалось на 44% и 33% соответственно.

Полученные результаты подтверждают существование индуктор-специфичных сигнальных путей. В пользу этого вывода говорит факт индукции CYP2B под действием ТФД с участием Са2+/кальмодулин-зависимой киназы II, тогда как для ФБ этого не показано. Результаты по влиянию окадаевой кислоты подтверждают имеющиеся в литературе данные об участии процессов дефосфорилирования в индукции CYP2B (Sidhu, Omiecinski, 1997; Honkakoski, Negishi, 1998), причем этот эффект не зависел от типа применяемого индуктора (рис. 8, 9, 11).

Уровень экспрессии гена рецептора CAR в печени крыс при совместном введении животным ингибиторов и индукторов

Важным этапом в процессе индукции является активация рецепторов лигандом. Для выяснения молекулярных механизмов активации транскрипции исследуемых генов под действием индукторов и ингибиторов была исследована экспрессия гена CAR, фактора транскрипции, регулирующего экспрессию CYP2B. Наряду с этим, была изучена способность активирующихся ядерных белков связываться с регуляторными последовательностями генов CYP2B. Известно, что CAR конститутивно синтезируется на значительном уровне в клетках печени крыс, мышей и человека (Pascussi et al., 2004). ФБ не влияет на экспрессию его гена. Этот факт говорит о том, что исходное количество этого рецептора достаточно для осуществления индукции (Yoshinari et al., 2001.; Chirulli et al., 2005).

Действительно, наши эксперименты показали, что в печени контрольных крыс регистрировалось значительное количество мРНК CAR, при этом индукция ФБ существенно не влияла на уровень экспрессии (рис. 12). Напротив, при индукции ТФД происходило почти 2-х кратное увеличение относительного содержания мРНК CAR. Эти результаты также говорят в пользу существования различий в механизме индуцирующего действия ТФД и ФБ в печени крыс и, возможно, свидетельствуют о специфичности действия ТФД на CAR. Более того, оказалось, что уровень конститутивной экспрессии этого гена зависел от процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков. Введение животным W-7, ингибитора Са2+/кальмодулин - зависимой протеин киназы II, сопровождалось усилением экспрессии CAR в 2,8 раза. Окадаевая кислота,

ингибитор протеин фосфатаз РР1 и РР2А, вызывала снижение уровня мРНК в 2,5 раза относительно контроля. Эти результаты позволяют предположить, что дефосфорилирование белков усиливают экспрессию гена CAR.

При введении ингибиторов до применения индукторов не происходило значительного изменения относительного содержания мРНК CAR по сравнению с группами животных, индуцированных ФБ и ТФД. Эти результаты говорят в пользу того, что для активации экспрессии генов CYP2B необходимо либо наличие индуктора, либо ингибирование процессов фосфорилирования.

Рисунок 12. Эффект индукторов и ингибиторов на относительное содержание мРНК CAR в печени крыс. Конт - контрольная группа животных; ФБ - группа животных, обработанных ФБ; Т - группа животных, обработанных ТФД; W7 - группа животных, обработанных W-7; ®B+W7 - группа животных, обработанных W-7 до введения ФБ; T+W7 - группа животных, обработанных W-7 до введения ТФД; OA -группа животных, обработанных окадаевой кислотой; ФБ+ОА - группа животных, обработанных окадаевой кислотой до введения ФБ; Т+ОА - группа животных, обработанных окадаевой кислотой до введения ТФД. Приведены средние значения ± SD (п=9). Достоверность различий по сравнению с контролем: *** (р<0,001), (р<0,01), * (р<0,05).

Этот вывод подтверждается стабильной экспрессией как CAR, так и CYP2B при совместном введении W-7 с индукторами (рис. 10, 12). Эксперименты по определению влияния OA на относительное содержание мРНК CAR и CYP2B также показали наличие корреляции между этими показателями: ингибирующий эффект OA сопровождался снижением экспрессии CAR и CYP2B (рис. 11, 12), а введение индукторов снимало этот

эффект. Этот факт также свидетельствует о том, что индукторы, возможно, активируют дополнительные сигнальные пути. Действительно в литературе имеются сообщения о вовлечение в индукцию CYP2B других сигнальных путей с участием сАМР/РКА, РКС, ERK1/2 (Sidhu, Omiecinski, 1995; Joannard et al., 2000; Coreos, Lagadic-Cossmann, 2001; Joannard et al., 2006).

Образования комплексов ядерных белков с N1*1 регуляторным элементом генов СУР2В

Выявленные различия в индукции СУР2В ФБ и ТФД могут объясняться изменением связывания факторов транскрипции с регуляторными элементами генов. Дальнейшим шагом было исследование образования комплексов ядерных белков с элементом N111 последовательности РВЯЕМ дистального промотора. Для этой цели был применен метод "задержки ДНК в геле". Ядерные экстракты были получены из печени контрольных и обработанных ФБ, ТФД крыс, а также крыс, которым вводился \¥-7 до введения ФБ и ТФД.

Видно, что в отсутствии индукторов инкубация N111 с ядерными экстрактами печени контрольных крыс не сопровождалась формированием комплексов (рис. 13, дорожка 2).

Введение ФБ и ТФД приводило к формированию ДНК-белкового комплекса, причем степень связывания в случае ФБ-индукции (рис. 13, дорожка 4) была выше, чем при ТФД-индукции (рис. 13, дорожка 5). Образование этого комплекса конкурентно ингибировалось холодной пробой ДНК, содержащей немеченый N111 олигонуклеотид (рис. 13, дорожка 8; дорожка 9). Введение также активировало формирование комплекса, однако его интенсивность была ниже, чем при ФБ- и ТФД-индукции (рис. 13, дорожка 3). Более того, \У-7 вызывал значительное увеличение связывания ядерных белков с N111 элементом при ТФД-индукции, однако при ФБ-индукции интенсивность связывания снижалась. Возможно, что активация ядерных белков к взаимодействию с N111 при ФБ-индукции является избыточной, и оставшийся после ингибирования уровень достаточен для активации генов СУР2В. Эти результаты также говорят в пользу того, что процессы фосфорилирования/дефосфорилирования белков играют существенную роль в активации ядерных белков, приводящей к их взаимодействию с N111.

Ядарны* белки - + + + + ♦+ + + Конкурент • -.....+ ♦

Рисунок 13. Влияние индукторов ФБ-типа и ингибитора Са2+/кальмодулин-зависимой киназы II на NR1-связывающую активность в экстрактах ядер клеток печени крыс Представлены результаты задержки ДНК-белковых комплексов в 8% ПААГ, образованных олигонуклеотидом [32P]NR1 и ядерными белками из печени крыс. Время инкубации 30 мин. Конт - контрольная группа животных; W7 - группа животных, обработанных W-7; ФБ - группа животных, обработанных ФБ; Т - группа животных, обработанных ТФД; ФБ+\У7 - группа животных, обработанных W-7 до введения ФБ; T+W7 - группа животных, обработанных W-7 до введения ТФД. В качестве конкурента использовался немеченый олигонуклеотид NR1.

Однако вопрос о том, сам CAR или ассоциированные с ним белки подвергаются фосфорилированию/дефосфорилированию, пока остается открытым. Негиши с сотрудниками показали, что транслокация CAR в ядро и его взаимодействие с элементом NR1 находится под контролем процессов дефосфорилирования (Kawamoto et al., 1999). Кроме того, показано, что в цитоплазме под воздействием индукторов ФБ-типа происходит образование комплекса протеинфосфатазы 2А с CAR:HSP90 гетеродимером (Yoshinari et al., 2003). Отсюда можно предположить, что в нашем случае мы, возможно, регистрируем этот белок.

Таким образом, из представленных данных следует, что индукторы CYP2B специфично запускают серию реакций фосфорилирования/ дефосфорилирования белков, причем при ТФД-индукции немаловажную роль, по-видимому, играет Са2+/кальмодулин - зависимый путь. Эти

результаты представлены в виде схемы (рис. 23). На схеме продемонстрированы пути сигнальной трансдукции, которые могут быть вовлеченные в активацию генов-мишеней (Ко1сИ, 2000). Эти пути регулируются протеинкиназами, ингибиторы которых использовались в нашей работе.

Рисунок 14. Возможные сигнальные пути, участвующие в активации транскрипции генов CYP2B при индукции ТФД. РКС - протеинкиназа С, PI-3 К -фосфатидилинозитол-3-киназа, Са/СМ РК - Са2+/кальмодулин- зависимая протеинкиназа II, РР1/РР2А - протеинфосфатазы РР1 и РР2А, SOS - son of sevenless, Ras - GTP-связывающий белок, регулирующий клеточный рост и дифференцировку, МЕК 1,2 - киназы митоген-активированных белков, ERK 1,2- киназы, относящиеся к классу МАР-киназ, Raf-1 - белок, активирующий МЕК 1,2, Rae - небольшой GTP-связывающий белок, относящийся к Rho-семейству, РАК - киназа, относящаяся к классу серин/треониновых киназ, TF - факторы транскрипции.

Как видно, Ras/MАРК-путь сигнальной трансдукции с участием Raf-1 белка, который активируется протеинкиназой С, и трансмембранного рецептора, являющегося молекулой - мишенью для внеклеточного сигнала, не оказывает влияния на гены CYP2B при индукции ТФД. Однако существуют данные, что РКС оказывает негативное действие на активацию транскрипции генов CYP2B фенобарбиталом (Joannard et al., 2000). Второй сигнальный путь через фосфолипиды, с участием Raf-1 белка и МАР-киназ,

по-видимому, также не влияет на транскрипцию генов CYP2B. Этот вывод подтверждается литературными данными, полученными при исследовании влияния ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы на индукцию CYP2B ФБ (Posti et al., 1999). Как следует из нашей работы, в механизме активации генов CYP2B ТФД, значительная роль принадлежит Са2+/кальмодулин-зависимому каскаду сигналов. Этот процесс, скорее всего, сопряжен с классическим путем активации генов CYP2B с участием рецептора CAR. Влияние на эти пути процессов дефосфорилирования протеинфосфатазами РР1/РР2А очевидно, однако разграничить их действие с протеинкиназами пока остается трудно решаемой задачей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование видоспецифичных особенностей индукции показало, что ТФД является высокоспецифичным индуктором СУР2В в печени крыс, однако его эффект отличен от действия ФБ - классического индуктора микросомальной монооксигеназной системы. Несмотря на то, что транскрипционный механизм индукции СУР2В показан для обоих индукторов, были зарегистрированы различающиеся сигнальные пути активации генов СУР2В. Так, ингибирование Са2+/кальмодулин-зависимого сигнального пути специфично активирует лишь индукцию СУР2В ТФД. В пользу этого вывода говорят и результаты активации этим соединением специфичных ядерных белков, способных связываться с Барби-бокс последовательностью проксимального промотора. Что касается ФБ-зависимой индукции СУР2В, то данных о вовлечении каких-либо специфичных сигнальных путей пока не получено. Чтобы ответить на этот вопрос необходимо исследование других сигнальных путей активации исследуемых генов. В тоже время, процессы дефосфорилирования белков являются общими для ТФД и ФБ. В целом, результаты говорят в пользу существования специфических сигнальных путей активации генов СУР2В для каждого индуктора с различной химической структурой. Таким образом, при исследовании механизма индукции СУР2В выявлены индуктор- и видоспецифичные особенности. Эти особенности обусловлены изменениями в транскрипции генов СУР2В, что, скорее всего, контролируется процессами фосфорилирования/ дефосфорилирования белков.

выводы

1. 2,4,6-Трифенилдиоксан-1,3 индуцирует специфичные активности СУР2В в печени крыс (в 12 раз) и СУР2С в печени кроликов (15,5 раз).

2. Межвидовые особенности в индукции СУР2В печени крыс и мышей ТФД, ФБ и ТСРОВОР обусловлены различиями в активации транскрипции генов с участием N111 -элемента дистального промотора.

3. На ранних этапах индукции крыс (от 40 мин до 18 ч) формируются специфичные ДНК-белковые комплексы с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов СУР2В, различающиеся по электрофоретической подвижности в зависимости от применяемого индуктора. Формирование таких комплексов сопровождалось увеличением относительного содержания мРНК СУР2В.

4. Ингибиторы протеинкиназы С и фосфатидилинозитол-3-киназы не оказывают влияния на индукцию СУР2В ТФД. Ингибитор Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II значительно усиливает О-деалкилазную активность цитохрома Р450 2В в микросомах печени крыс, обработанных 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3, но не фенобарбиталом, что говорит в пользу существования зависимого от индуктора механизма активации генов СУР2В.

5. Усиление индуцирующего эффекта 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 на активность цитохрома Р450 2В под действием ингибитора сопровождается увеличением относительного содержания мРНК, что говорит о вовлечении Са27кальмодулин-зависимого протеинкиназного пути в индукцию.

6. Окадаевая кислота вызывает снижение индуцирующего эффекта как 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3, так и фенобарбитала на экспрессию генов СУР2В, что свидетельствует о вовлечении протеинфосфатаз РР1 и РР2А в процесс активации этих генов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Zacharova L., Pustylnyak V., Gulyaeva L., Lyakhovich V. Time-dependent effect of inducers on formation of complexes between liver nuclear proteins and regulatory elements of rat CYP2B gene. // Drug Metabolism Reviews, 8th European ISSX Meeting. - 2003. - Dijon, France. - V. 35. - P. 86.

2. Пустыльняк В.О., Захарова Л.Ю. Изучение роли серин/треониновых протеин киназ в индукции цитохрома Р450 2В подсемейства трифенилдиоксаном и фенобарбиталом. // 8-ая Международная Пущинская школа- конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века",- Сб. докладов. - 2004. - Пущино, Россия. - С. 29.

3. Пустыльняк В.О., Захарова Л.Ю., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В., Слынько Н.М. Динамика образования ДНК-белковых комплексов в печени

крыс при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном. // Биохимия. -2004.-Т.69.-С. 1365- 1370.

4. Pustylnyak V., Zacharova L., Gulyaeva L., Lyakhovich V. The role of Serine/Threonine protein kinases in induction of CYP2B in rat liver. // Drug Metabolism Reviews, 7th International ISSX Meeting. - 2004. - Vancouver, Canada.-V. 36.-P. 182.

5. Pustylnyak V.O., Zakharova L.Y., Mikhailova O.N., Rice R.H., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. In vivo effects of protein kinase and phosphatase inhibitors on CYP2B induction in rat liver. // Toxicology. - 2005. - V. 207. - P. 315-322.

6. Pustylnyak V.O., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. CAR expression and inducibility of CYP2B in liver of rats treated by PB-like inducers. // Drug Metabolism Reviews, 13th North American ISSX Meeting. - 2005. - Maui, Hawaii. -V.37.-P. 354.

7. Pustylnyak V.O., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. CAR expression and inducibility of CYP2B genes in liver of rats treated by PB-like inducers. // Toxicology. -2005. - V. 216. - P. 147-153.

8. Пустыльняк B.O., Ширшова A.H., Гуляева Л.Ф., Каледин В.И., Николин В.П., Каурова Г.И., Маталин В.А., Шмаков А. Г., Шварцберг В.М., Коробейничев О.П. Гипериндукция CYP2B И CYP2C печени мышей продуктами электрохимического фторирования трибутилфосфата. // Бюлл. СО РАМН. - 2005. - Т.4. - Р. 79-84.

Список используемых сокращений:

CAR конститутивный андростановый рецептор

CYP цитохром Р450

CYP2B цитохром Р450 2В подсемейства

GAPDH глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа

NR1 сайт связывания ядерных белков в дистальном промоторе

PBREM фенобарбитал-чувствительный энхансерный модуль

RXR ретиноидный X рецептор

W-7 ингибитор Са2+/кальмодулин-зависимой киназы II

OA окадаевая кислота

ПРОД пентоксирезоруфин-О-деалкилазная активность

ТСРОВОР 1,4-бис[2-(3,5-дихлорпиридилокси]бензол

ТФД 2,4,6-трифенилдиоксан-1,3

ФБ фенобарбитал

Соискатель В.О. Пустыльняк

Подписано к печати 11 апреля 2006 г. Тираж 100 экз. Заказ № 1742. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

It-8 1 62

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пустыльняк, Владимир Олегович

Введение.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Цитохром Р450 - ключевой фермент микросомальной монооксигеназной системы. 12 ® 1.1.1 Способность цитохромов Р450 к индукции.

1.2 Цитохромы Р450 подсемейства 2В.

1.3 Индукция генов CYP2B под действием фенобарбитала.

1.3.1 Механизм активации генов CYP2B под действием фенобарбитала.

1.3.2 Характеристика дистального промотора генов CYP2B.

1.3.3 CAR и другие белки, взаимодействующие с элементами дистального промотора генов СУР2В.

1.3.4 CAR рецептор-опосредованная сигнальная трансдукция и индукция генов CYP2B.

1.3.5 Участие коактиваторов в CAR-опосредованной активации экспрессии генов

CYP2B.

1.3.6 Характеристика проксимального промотора генов CYP2B.

Ф 1.3.7 Белок, взаимодействующий с проксимальным промотором генов CYP102 и

CYP106 Bacillus megaterium.

1.3.8 Белки, взаимодействующие с проксимальным промотором генов CYP2B млекопитающих.

1.3.9 Вклад проксимального и дистального промоторов в общий механизм индукции генов CYP2B.

1.3.10 Другие регуляторные элементы генов CYP2B. ft 1.4 Индукция активности CYP2B под действием индукторов ФБ-типа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов индукции цитохрома Р450 подсемейства 2В в печени экспериментальных животных"

Цитохром Р450 (CYP), представленный мультигенным суперсемейством, является одним из ключевых ферментов микросомальной монооксигеназной системы, ответственной за метаболизм ксенобиотиков и эндогенных соединений в живых организмах (Ляхович, Цырлов, 1978). Важнейшим свойством множественных форм цитохрома Р450 является их способность к индукции, то есть к усилению ферментативной активности фермента при воздействии соответствующего ксенобиотика. В целом, индукция активности цитохрома Р450 представляет собой механизм защиты клетки от чужеродных соединений, обычно приводящий к детоксификации ксенобиотиков (Poster, Coon, 1991). Однако существует и другой результат такого процесса. Так, метаболизм лекарств, а также многих эндогенных соединений, включая простагландины, жирные кислоты и гормоны, может драматично меняться из-за индукции аюпвности различных форм цитохрома Р450.

В настоящее время изучение механизмов индукции аетивности молекулярных форм CYP является одним из аетивно развивающихся направлений в современной молекулярной биологии, биохимии, токсикологии и фармакологии. Однако знания, касающиеся механизмов индукции, ограничены несколькими членами суперсемейства цитохрома Р450, хотя транскрипционный механизм агапвации показан для большинства подсемейств (Whitlock, 1990). Известно, что гены этих ферментов активируются с участием различных ядерных рецепторов, которые под действием ксенобиотика-лиганда, как правило, либо транслоцируются из цитоплазмы в ядро, либо агаивируются в ядре, где они, образуя гетеродимеры со своими ядерными партнерами, взаимодействуют с генами-мишенями (Handschin, Meyer, 2003).

Среди множества форм этого фермента выделяют подсемейство CYP2B, которое участвует в биотрансформации лекарств, таких как циклофосфамиды (Chang et al., 1997), а также в метаболизме пестицида метоксихлора (Dehal, Kupfer, 1994) и некоторых промутагенов, в том числе афлатоксина В1 и специфичных для табака нитрозоаминов (Code et al., 1997). Большинство проведенных исследований свидетельствует о том, что индукция CYP2B преимущественно регулируется на транскрипционном уровне (Waxman, 1999; Honkakoski, Negishi, 2000), хотя показана возможность постгрансляционной модификации белковой молекулы, вызванной воздействием индуктора (Bartlomowicz et al., 1989; Oesch-Bartlomowicz et al., 2001). Известно, что регуляция транскрипции осуществляется за счет взаимодействия специфичных ядерных белков с различными регуляторными зонами генов CYP2B. В составе регуляторных последовательностей генов CYP2B были идентифицированы так называемые проксимальный и дисталыгый промоторы, участвующие в индукции экспрессии этих генов под действием фенобарбитала (ФБ), классического индуктора этого подсемейства (Czekaj, 2000).

Значительный прогресс в понимании механизмов активации генов CYP2B был достигнут с идентификацией конститутивного андростанового рецептора (CAR). Так, при исследовании механизма индукции активности CYP2B фенобарбиталом было показано, что в цитоплазме гепатоцитов происходит активация рецептора CAR, после чего он транслоцируется в ядро, где связывается с ядерным белком RXR (ретиноидный X рецептор). Сформировавшийся гетеродимерный комплекс взаимодействует с элементом PBREM дистального промотора, что является необходимым для инициации транскрипции (Pascussi et al., 2004). Такой механизм индукции экспрессии генов CYP2B фенобарбиталом является на сегодняшний день общепринятым. Однако, несмотря на интенсивные исследования, детально механизм, по которому индукторы инициируют транслокацию CAR в ядро, на сегодняшний день до конца не ясен, хотя показано, что прямое связывание рецептора с лигандом не является необходимым для транслокации рецептора в ядро (Moore et al., 2000). Было выдвинуто предположение, что транслокация рецептора в ядро контролируется запуском процессов фосфорилирования/ дефосфорилирования белков, но единой картины о роли этих процессов пока не сложилось (Corcos, Lagadic-Gossman, 2001). Наряду с этим, в литературе есть данные о вовлечении в механизм индукции проксимального промотора через активацию не идентифицированных пока ядерных белков (Honkakoski, Negishi, 1998).

В лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза ИМББ СО РАМН (г. Новосибирск) ведутся исследования индуцирующего действия 2,4,6трифенилдиоксана-1,3 (ТФД). Преимущество этого соединения состоит в том, что его эффективная доза на порядок меньше, чем у фенобарбитала. В экспериментах in vitro было показано, что 2,4,6-трифенилдиоксан-1,3 и фенобарбитал активируют разные ядерные белки, способные взаимодействовать с последовательностью Барби-бокс проксимального промотора (Grigorieva et al., 2002). Однако значение и взаимное влияние различных ядерных белков, активирующихся под действием индукторов ФБ-типа in vivo, на данный момент не известны. Кроме того, эффект ТФД видоспецифичен: он активирует CYP2B у крыс, но не у мышей (Мишин и др., 1990). Причина видоспецифичных различий в индукции активности этого цитохрома Р450 остается неизвестной.

Изложенное выше определило цель работы: исследовать молекулярные механизмы индукции CYP2B в печени экспериментальных животных, обработанных индукторами фенобарбиталового типа.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Изучить индуцирующее действие ТФД на монооксигеназную систему печени крыс и кроликов.

Научная новизна работы

Показаны видоспецифичные различия в индукции ТФД CYP2B у крыс и кроликов. ТФД является высокоспецифичным индуктором CYP2B изоформы у крыс и CYP2C изоформы у кроликов.

Показано, что основой межвидовых особенностей в индукции CYP2B являются различия в механизмах активации транскрипции у крыс и мышей.

Показано, что на ранних этапах индукции происходит активация ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов CYP2B в печени крыс. В течение первых 6-ти часов индукции наблюдаются различия в динамике образования ДНК-белковых комплексов для каждого соединения. К 18-ти часам картина интенсивности комплексов становится одинаковой как при индукции ФБ, так и ТФД. Несмотря на то, что индукторы различной химической структуры по-разному активируют такое связывание, этот процесс сопровождается включением транскрипции генов.

В результате данного исследования показано существование зависимых от индуктора путей активации генов CYP2B в печени экспериментальных животных. Впервые показано, что ингибирование Са2+/кальмодулин-зависимого сигнального пути существенно усиливает ферментативную активность и содержание белков CYP2B при индукции ТФД, но не ФБ в печени крыс, причем этот эффект реализуется на уровне транскрипции генов.

Научно-практическая значимость

По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярных механизмов индукции CYP2B в печени экспериментальных животных под действием индукторов ФБ-типа. Полученные результаты показали, что при исследовании механизмов активации генов важно рассматривать не только рецепторный механизм, но и участие специфических сигнальных путей. Этот вывод имеет фундаментальное значение для понимания механизмов активации экспрессии генов у эукариот.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ТФД является высокоспецифичным индуктором CYP2B изоформы в печени крыс и CYP2C изоформы в печени кроликов.

2. В основе межвидовых особенностей индукции CYP2B лежат различия в механизмах активации транскрипции генов у крыс и мышей.

3. На ранних этапах индукции ТФД и ФБ наблюдаются различия в активации ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов CYP2B в печени крыс.

4. Активность CYP2B в печени крыс, обработанных ТФД и ФБ, меняется под воздействием ингибиторов путей сигнальной трансдукции.

5. Ингибирование Са2+/кальмодулин-зависимого сигнального пути усиливает экспрессию генов CYP2B и приводит к усилению интенсивности комплекса ядерных белков с элементом NR1 при индукции ТФД. Этот эффект не наблюдается при индукции ФБ.

Апробация работы

Результаты работы были представленны и обсуждены на VIII Европейской конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Dijon, France, 2003; на VII Международной конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Vancouver, Canada, 2004; на VIII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, Россия, 2004); на XIII Североамериканской конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Maui, Hawaii, 2005.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пустыльняк, Владимир Олегович

выводы

1. 2,4,6-Трифенилдиоксан-1,3 индуцирует специфичные активности CYP2B в печени крыс (в 12 раз) и CYP2C в печени кроликов (15,5 раз).

2. Межвидовые особенности в индукции CYP2B печени крыс и мышей ТФД, ФБ и ТСРОВОР обусловлены различиями в активации транскрипции генов с участием NR1-элемента дистального промотора.

3. На ранних этапах индукции крыс (от 40 мин до 18 ч) формируются специфичные ДНК-белковые комплексы с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов CYP2B, различающиеся по электрофоретической подвижности в зависимости от применяемого индуктора. Формирование таких комплексов сопровождалось увеличением относительного содержания мРНК CYP2B.

4. Ингибиторы протеинкиназы С и фосфатидилинозитол-3-киназы не оказывают влияния на индукцию CYP2B ТФД. Ингибитор Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II значительно усиливает О-деалкилазную активность цитохрома Р450 2В в микросомах печени крыс, обработанных 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3, но не фенобарбиталом, что говорит в пользу существования зависимого от индуктора механизма активации генов CYP2B.

5. Усиление индуцирующего эффекта 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 на активность цитохрома Р450 2В под действием ингибитора W-7 сопровождается увеличением относительного содержания мРНК, что говорит о вовлечении Са2+/кальмодулин-зависимого протеинкиназного пути в индукцию.

6. Окадаевая кислота вызывает снижение индуцирующего эффекта как 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3, так и фенобарбитала на экспрессию генов CYP2B, что свидетельствует о вовлечении протеинфосфатаз РР1 и РР2А в процесс активации этих генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование видоспецифичных особенностей индукции активности CYP2B показало, что ТФД является высокоспецифичным индуктором CYP2B в печени крыс, однако его эффект отличен от действия ФБ - классического индуктора микросомальной монооксигеназной системы. Несмотря на то, что транскрипционный механизм индукции CYP2B показан для обоих индукторов, были зарегистрированы различающиеся сигнальные пути активации экспрессии генов CYP2B. Так, ингибирование Са2+/кальмодулин-зависимого сигнального пути специфично активирует лишь индукцию CYP2B ТФД. В пользу этого вывода говорят и результаты активации этим соединением специфичных ядерных белков, способных связываться с последовательностью Барби-бокс проксимального промотора. Что касается ФБ-зависимой индукции CYP2B, то данных о вовлечении каких-либо специфичных сигнальных путей пока не получено. Чтобы ответить на этот вопрос необходимо исследование других сигнальных путей активации исследуемых генов. В тоже время, процессы дефосфорилирования белков являются общими для ТФД и ФБ. В целом, результаты говорят в пользу существования специфических сигнальных путей активации экспрессии генов CYP2B для каждого индуктора с различной химической структурой. Таким образом, при исследовании механизма индукции CYP2B выявлены индуктор- и видоспецифичные особенности. Эти особенности обусловлены изменениями в транскрипции генов CYP2B, что, скорее всего, контролируется процессами фосфорилирования/ дефосфорилирования белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пустыльняк, Владимир Олегович, Новосибирск

1. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1978.-238 с.

2. Мишин В. М., Гуткина Н. И., Ляхович В.В., Поспелова Л. Н., Чистяков В.В. Сравнение индуцирующего действия трифенилдиоксана, бис* (дихлорпиридилокси)бензола и фенобарбитала на монооксигеназу печени. //

3. Биохимия. 1990. - Т. 55. - С. 29-36. ® 4. Мишин В. М., Гуткина Н. И., Ляхович В.В., Поспелова Л. Н., Чистяков В.В.

4. Сравнение индуцирующего действия трифенилдиоксана, бис-(дихлорпиридилокси)бензола и фенобарбитала на монооксигеназу печени. // Биохимия. 1990. - Т. 55. - С. 29-36.

5. Мишин В. М., Ляхович В. В. Множественные формы цитохрома Р450. Н.:• Наука. Сиб. отделение, 1985. 181 с

6. Чистяков В. В., Поспелова Л. Н. Трифенилдиоксан новый мощный индуктор цитохрома Р-450. // Доклады Академии наук СССР. - 1987. - Т. 296. - С. 467-469.

7. Baes M., Gulick Т., Choi H. S., Martinoli M. G., Simha D., Moore D. D. A new orphan member of the nuclear hormone superfamily that interacts with a subset of retinoic acid response elements. // Mol. Cell. Biol. 1994. - V. 14. - P. 15441551.

8. Biola A, Pallardy M. Mode of action of glucocorticoids. // Press. Med. 2000. -V. 29.-P. 215-23.

9. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilazing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

10. Carey D. J., Rafferty С. M., Schramm M. M. Association of heparan sulfate proteoglycan and laminin with the cytoskeleton in rat liver. // J. Biol. Chem. -1987. V. 262. - P. 3376-3381.

11. Chawla A., Repa J. J., Evans R. M., Mangelsdorf D. J. Nuclear resceptors and Lipid physiology: opening the X-files. // Science. 2001. V. - 294. - P. 18661870.

12. Chiralli, V., Longo, V., Marini, S., Mazzaccaro, A., Fiorio, R., Gervasi, P.G. CAR and PXR expression and inducibility of CYP2B and CYP3A activities in rat and rabbit lungs. // Life Sciences. 2005. V. 76. - P. 2535-2546.

13. Choi H.S., Chung M., Tzameli I., Simha D., Lee Y.-K., Seol W., Moore D.D. Differential transactivation by two isoforms of the orphan nuclear hormone receptor CAR // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 23565-23571.

14. Code E.L., Crespi C.L., Penman B.W., Gonzalez F.J., Chang Т., Waxman D.J. Human cytochrome P450 2B6. Interindividual hepatic expression, substrate specificity and role in procarcinogen activation. // Drug Metab. Dispos. 1997. -V. 25.-P. 985-993.

15. Conney A.H. Induction of microcomal enzymes by foreign chemicals and carcinogenesis by polycyclic aromatic hydrocarbons. // Cancer Res. 1982. - V. 42.-P. 4875-4917.

16. Corcos L., Lagadic-Gossman D. Gene induction by phenobarbital: an update on an old question that receieves key novel answers. // Pharmacol. Toxicol. 2001. -V. 89.-P. 113-122.

17. Czekaj P. Phenobarbital-induced expression of cytochrome P450 genes // Acta Biochem. Polonica. 2000. - V. 47. - P. 1093-1105.

18. DeFranco D.B. Regulation of steroid receptor subcellular trafficking. // Cell Biochem. Biophys. 1999. - V. 30. - P. 1-24.

19. Dehal S.S., Kupfer D. Metabolism of the proestrogenic pesticide methoxychlor by hepatic P450 monooxygenases in rat and humans. Dual pathways involving novel orthoring-hydroxylation by CYP2B. // Drug Metab. Dispos. 1994. - V. 22. - P. 937-946.

20. Denison M., Whitlock J. Xenobiotic-inducible transcription of cytochrome P450 genes. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 18175-18178.

21. Dunn T.J., Koleske A.J., Lindahl R., Pitot H.C. Phenobarbital-inducible aldehyde dehydrogenase in the rat. cDNA sequence and regulation of the mRNA by phenobarbital in responsive rats. // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 1305713065.

22. Dusso A.S., Brown A.J. Mechanism of vitamin D action and its regulation. // Am. J. Kidney Dis. 1998. - V. 32. - P. 13-24.

23. Estabrook R.W., Hildebrandt A., Ullrich V. Oxygen interaction with reduced ф cytochrome P-450. // Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1968. - V. 349. - P.1605-1608.

24. Forman B.M., Tzameli I., Choi H.S., Chen J., Simha D., Seol W., Evans R.M., Moor D.D. Androstane metabolites bind to and deactivate the nuclear receptor CAR-p. // Nature. 1998. - V. 395. - P. 612-615.

25. Fruech F.W., Zanger U.A., Meyer U.A. Extent and character of phenobarbital-mediated changes in gene expression in the liver. // Mol. Pharmacol. 1997. - V.51.-P. 363-369.

26. Gerbal-Chaloin S., Pascussi J.M., Pichard-Garcia L., Daujat M., Waechter F., ® Fabre J. M., Carrere N., Maurel P. Induction of CYP2C genes in humanhepatocytes in primary culture. // Drug Metab. Dispos. 2001. - V. 29. - P. 242251.

27. Gonzalez F.J. The molecular biology of cytochrome P450s. // Pharmacol. Rev. -1988. V. 40.-P. 243-285.

28. Gonzelez F.J., Liu S.Y., Yano M. Regulation of cytochrome P-450 genes:molecular mechanisms. // Pharmacogenetics. 1993. - V. 3. - P. 51-57.

29. Goodwin В., Moore J.T. CAR: detailing new models. // TRENDS in Pharmacological Sciences. 2004. - V. 25. - P. 437-441.

30. Gorski K., Carniero M., Schilber U. Tissue-specific in vitro transcription from the• mouse albumen promoter. // Cell. 1986. - V. 47. - P. 767-776.

31. Grigorieva E., Soshilov A., Surovtseva Y., Schwartz E.L., Duzhak T.G., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Induction of the CYP2B genes by• triphenyldioxane treatment in the rat liver. // Toxicol, in Vitro. 2002. - V. 16. P. -467-473.

32. Handschin C., Meyer U.A. Induction of Drug Metabolism: The role of nuclear receptors. // Phamacol. Rev. 2003. - V. 55. - P. 649-673.

33. He J. S., Fulco A. J. A barbiturate-regulated protein binding to a common sequences in in the cytochrome P-450 genes of rodents and bacteria. // J. Biol. Chem. 1991. -V. 266. - P. 7864-7869.

34. Honkakoski P., Moore R., Gynther J., Negishi M. Characterization of phenobarbital-inducible mouse Cyp2bl0 gene transcription in primary hepatocytes. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 9746-9753.

35. Honkakoski P., Negishi M. Protein serine/threonine phosphatase inhibitors suppress phenobarbital-induced Cyp2bl0 gene transcription in mouse primary hepatocytes. // Biochem. J. 1998a. - V. 330. - P. 889-895.

36. Honkakoski P., Negishi M. Regulatory DNA elements of phenobarbital-responsive cytochrome P-450 CYP2B genes. // J. Biochem. Mol. Toxicol. 1998. -V. 12.-P. 3-9.

37. Honkakoski P., Negishi M. Regulatory DNA elements of phenobarbital-responsive cytochrome P-450 CYP2B genes. // J. Biochem. Mol. Toxicol. -1998b.-V. 12.-P. 3-9.

38. Honkakoski P., Zelko I., Sueyoshi Т., Negishi M. The nuclear orphan receptor CAR-retinoid X receptor heterodimer activates the phenobarbital-responsive enhancer module of the CYP2B gene. // Mol. Cell. Biol. 1998. - V. 18. - P. 5652-5658.

39. Honkakoski P., Zelko I., Sueyoshi Т., Negishi M. The nuclear orphan receptor CAR-retinoid X receptor heterodimer activates the phenobarbital-responsive enhancer module of the CYP2B gene. // Mol. Cell. Biol. 1998. - V. 18. - P. 5652-5658.

40. Honkakoski, P Negishi, M. Regulation of cytochrome P450 (CYP) genes by nuclear receptors. // Biochem. J. 2000. - V. 347. - P. 321-337.

41. Jones C. R., Lubet R. A. Induction of a pleiotropic response by phenobarbital and related compounds. // Biochem. Pharmacol. 1992. - V. 44. - P. 1651-1660.

42. Kakizaki S., Karami S., Negishi M. Retinoic acid repress constitutive active receptor-mediated induction by l,4-bis2-(3,5-dichloropyridyloxy).benzene of the Cyp2blO gene in mouse primary hepatocytes. // Drug Metab. Dispos. 2002. -V.30.-P. 208-211.

43. Kawamoto Т., Sueyoshi Т., Zelko I., Moore R., Washburn K., Negishi M. Phenobarbital-responsive nuclear translocation of the receptor CAR in induction of the CYP2B2 gene. // Mol. Cell. Biol. 1999. - V. 19. - P. 6318-6322.

44. Kim J., Kemper B. Phenobarbital alters protein binding to the CYP2B1/2 phenobarbital-responsive unit in native chromatin. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272.-P. 29423-29425.

45. Kim J., Rivera-Rivera I., Kemper B. Tissue-specific chromatin structure of the phenobarbital-responsive unit and proximal promoter of CYP2B1/2 and modulation by phenobarbital. // Nucl. Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 11261132.

46. Ф McKee D. D., Oliver В. В., Willson Т. M., Zetterstrom R. H., Perlmann Т.,1.hmann J. M. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. // Cell. 1998. - V. 92. - P. 73-82.

47. Kocarek T. A., Reddy A. B. Negative regulation by dexamethasone of fluvastatin-inducible CYP2B expression in primary cultures of rat hepatocytes: role of CYP3A. II Biochem. Pharmacol. 1998. - V. 55. - P. 1435-1443.

48. Kolch W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERKpathway by protein interactions. // Biochem. J. 2000. - V. 351. - P. 289-305

49. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

50. Lee S. H., Wang X., DeJong J. Functional interaction between atypical NF-kB site from the rat CYP 2B1 promotor and the transcriptional repressor RBP-Jk/CBFI. // Nucl. Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 2091-2098.

51. Biol.- 1995. V.- 15.-P. 3012-3022.

52. Leighton J.K., Kemper B. Differential induction and tissue-specific expression of closely related members of the phenobarbital-inducible rabbit cytochrome P-450 gene family. // J Biol Chem. 1984. - V. 259. - P. 11165-11168.

53. Liang Q., He J.S., Fulco A.J. The role of barbie box sequences as cis-acting elements involved in the barbiturate-mediated induction of cytochromes

54. Р450ВМ-1 and P450BM-3 in Bacillus Megaterium. II J. Biol. Chem. 1995. - V. 270.-P. 4438-4450.

55. Longo V., Mazzaccaro A., Naldi F., Gervasi P.G. Drug metabolizing enzymes in ф liver olfactory and respiratory epithelium of cattle. // J. Biochem. Toxicol. 1991.-V. 6.-P. 123-128.

56. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.

57. Luc P.-V.T., Adesnik M., Ganguly S., Shaw P.M. Transcriptional regulation of the CYP2B1 and CYP2B2 genes by C/EBP-related proteins. // Biochem. Parmacol. 1996. - V. 51. - P. 345-356.ц

58. Mangelsdorf D.J., Thummel C., Beato M., Herrlich P., Schutz G., Umesono K., Blumberg В., Kasner P., Mark M., Chambon P., Evans R.M. The nuclear receptor• superfamily: the second decade. // Cell. 1995. - V. 83. - P. 835-839.

59. Min G., Kemper J.K., Kemper B. Glucocorticoid receptor- interacting protein 1 mediates ligand-independent nuclear translocation and activation of constitutive androstane receptor in vivo. // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 26356-26363.

60. Moore L.B., Parks D.J., Jones S.A., Bledsoe R.K., Consler T.G., Stimmel J.B.,

61. Goodwin В., Liddle C., Blanchard S.G., Willson T.M., Collins J., Kliewer S.A. Orphan nuclear receptors CAR and PXR share xenobiotic and steroid ligands. // J. Biol. Chem.-2000.-V. 275.- P. 15122-15127.

62. Moore L.B., Parks D.J., Jones S.A., Bledsoe R.K., Consler T.G., Stimmel J.B., Goodwin В., Liddle C., Blanchard S.G., Willson T.M., Collins J.L., Kliewer S.A.

63. Orphan nuclear receptors CAR and PXR share xenobiotic and steroid ligands. // J.

64. Biol. Chem.-2000.- V.275.-P. 15122-15127.

65. Nash T. The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsch reaction. // Biochem. J. 1953. - V. 55. - P. 416-421.

66. Nebert D.W., Nelson D.R., Coon M.J., Estabrook R.W., Feyereisen R. et al. The P-450 superfamily: update of new sequences, gene mapping and recommended nomenclature. // DNA Cell Biol. 1991.-V. 10.-P. 1-14.

67. Nelson D.R., Strobel H.W. Evolution of cytochrome P-450 proteins. // Mol. Biol. Evol. 1987. - V. 4. - P. 572-593.

68. Nishimura M., Naito S., Yokoi T. Tissue-specific mRNA expression profiles of human nuclear receptor subfamilies. // Drug. Metab. Pharmacokin. 2004. - V. 19.-P. 135-149.

69. Park Y., Kemper B. The CYP2B1 proxymal promoter contains a functional C/EBP regulatory element. // DNA Cell Biol. 1996. - V. 15. - P. 693-701.

70. Park Y., Li H., Kemper B. Phenobarbital induction mediated by a distal CYP2B2 sequence in rat liver transiently transfected in situ. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271.-P. 23725-23736.

71. Patel N.V., Omer C.A. Phenobarbital and sulfonilurea-inducible operons incoding herbicide-metabolizing cytochromes P450 in Streptomyces griseolus. II Gene. -1992.-V. 112.-P. 67-76.

72. Pickett C.B, Lu A.Y. Glutathione S-transferases: gene structure, regulation, and biological function. // Annu. Rev. Biochem. 1989. - V. 58. - P. 743-746.

73. Poland А., Мак I., Glover E., Boatman R. J., Ebetino F.H., Kende A.S. 1,4-Bis2-(3,5-dichloropyridyloxy.-benzene, a potent phenobarbital-like inducer of microsomal monooxigenase activity. // Mol. Pharmacol. 1980. - V. 18. - P. 571-580.

74. Poster T.D., Coon M.J. Cytochrom P450. Multiplicity of isoforms, substrates and catalytic and regulatory mechanisms. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 13469-13472.

75. Poster T.D., Coon M.J. Cytochrom P450. Multiplicity of isoforms, substrates and catalytic and regulatory mechanisms. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 13469-13472.

76. Posti K., Leinonen S., Tetri S., Viitala P., Pelkonen O., Raunio H. Modulation of murine phenobarbital-inducible CYP2A5, CYP2B10 and CYP1A enzymes by inhibitors of protein kinases and phosphatases. // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 264.-P. 19-26.

77. Pratt W.B., Silverstein A.M., Galigniana M.D. A model for the cytoplasmic trafficking of signalling proteins involving the hsp90-binding immunophilins andp 50cdc37 Ц Cell gignal 1999 ул j p 839.851.

78. Ram N., Rao M.V., Prabhu I., Nirodi C.S., Sultana S., Vatsala P.G., Padmanaban G. Characterization of a negative cis-acting DNA element regulating the transcription of CYP2B1/2B2 gene in rat liver. // Arch. Biochem. Biophys. -1995.-V. 317.-P. 39-45.

79. Ramsden R., Beck N.B., Sommer K.M., Omiesinski C.J. Phenobarbital responsiveness, conferred by the 5'-flanking region of the rat CYP2B2 gene in transgenic mice. // Gene. 1999. - V. 228. - P. 169-179.

80. Ramsden R., Sommer K.M., Omiesinski C.J. Phenobarbital induction and tissue-specific expression of the rat CYP2B2 gene in transgenic mice. // J. Biol. Chem. 1993. -V. 268. - P. 21722-21726.

81. Robinson-Rechavi M., Carpentier A., Duffraisse M., Laudet V. How many nuclear hormone receptors are there in the human genome? // Trends. Genet. -2001.-V. 17.-P. 554-556.

82. Roe A.L., Blouin R.A., Howard G. In vivo phenobarbital treatment increases protein binding to a putative API site in the CYP2B2 promoter. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 228. - P. 110-114.

83. Rosenfeld M.C., Glass C.K. Coregulator codes of transcriptional regulation by nuclear receptor. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. P. 36865-36868.

84. Ryan D.E., Levin W. Purification and characterization of hepatic microsomal cytochrome P-450. // Pharmacol. Ther. 1990. - V. 45. - P. 153-239.

85. Schlichting I., Berendzen J., Chu K., Stock A. M., Maves S.A., Benson D.E., Sweet R.M., Ringe D., Petsko G.A., Sligar S.G. The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomic resolution. // Science. 2000. - V. 287. - P. 1615-1622.

86. Schuetz E.G., Wrighton S.A, Safe S.H., Guzelian P.S. Regulation of cytochrome P-450 by phenobarbital and phenobarbital-like inducers in adult rat hepatocytes in primary monolayer culture and in vivo. II Biochemistry. 1986. -V. 25. - P. 1124-1233.

87. Sidhu J.S., Omiecinski C.J. An okadaic acid-sensitive pathway involved in the phenobarbital-mediated induction of CYP2B gene expression in primary rat hepatocyte cultures. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. - V. 282. - P. 11221129.

88. Sidhu J.S., Omiecinski C.J. cAMP associated inhibition of phenobarbital-inducible cytochrome P450 gene expression in primary rat hepatocyte cultures. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 12762-12773.

89. Smirlis D., Muangmoonchai R., Edwards M., Phillips I. R., Shephard E. A. Orphan receptor promiscuity in the induction of cytochromes P450 by xenobiotics. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 12822-12826.

90. Smith G., Henderson C.J., Parker M.G., White R., Bars R.G., Wolf R. 1,4-Bis2-(3,5-dichloropyridyloxy.-benzene, an extremely potent modulator of mouse hepatic cytochrome P-450 gene expression. // Biochem. J. 1993. - V. 289. P. 807-813.

91. Sogawa К, Fujii-Kuriyama Y. Ah receptor, a novel ligand-activated transcription factor. // J. Biochem (Tokyo). 1997. - V. 122. - P. 1075-1079.

92. Sommer K.M., Ramsden R., Sidhu J., Costa P., Omiecinski C.J. Promoter region analysis of the rat CYP2B1 and CYP2B2 genes. // Pharmacogenetics. -1996.-V. 6.- P. 369-374.

93. Sueyoshi Т., Kawamoto Т., Zelko I., Honkakoski P., Negishi M. The repressed nuclear receptor CAR responds to phenobarbital in activating the human CYP2B6 gene. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 6043-6046.

94. Sueyoshi Т., Negishi M. Phenobarbital response elements of cytochrome P-450 genes and nuclear receptors. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001. - V. 41. -P. 123-143.

95. Sultana S., Nirodi C., Ram N., Prabhu L., Padmanaban G. A 65-kDa protein mediated the positive role of heme in regulating the transcription of CYP2B1/B2 gene in rat liver. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 8895 - 8900.

96. Swales K., Negishi M. CAR, driving into the future. // Mol. Endocrinol. 2004. -V. 18.-P. 1589-1598.

97. Trottier E., Belzil A., Stoltz C., Anderson A. Localization of a phenobarbital-responsive element (PBRE) in the 5'-flanking region of the rat CYP2B2 gene. // Gene. 1995. - V. 158. - P. 265-268.

98. Tu Y.Y., Yang C.S. High-affinity nitrosamine dealkylase system in rat liver microsomes and its induction by fasting. // Cancer Res. 1983. - V. 43. - P. 623629.

99. Tzameli I., Pissios P., Schuetz E.G., Moore D.D. The xenobiotic compound 1,4-bis2(3,5-dichloropyridylloxy).benzene is an agonist ligand for the nuclear receptor CAR. // Mol. Cell. Biol. 2000. - V. 20. - P. 2951-2958.

100. Ueda A., Hamadeh H. K., Webb H. K., Yamamoto Y., Sueyoshi Т., Afshari C.A., Lehmann J.M., Negishi M. Diverse roles of the nuclear orphan receptor CAR in regulating hepatic genes in response to phenobarbital. // Mol. Pharmacol. -2002.- V. 61.- P. 1-6.

101. Upadhya P., Venkateswara Rao M., Venkateswara V., Ranjarajan P. N., Padmanaban G. Identification and functional characterization of a c/.s-acting

102. DNA element regulating CYP2B1/2B2 gene transcription in rat liver. // Nucl. Acids Res. 1992. - V. 20. - P. 557-562.

103. Waxman D.J. Interactions of hepatic cytochromes P-450 with steroid hormones. Regioselectivity and stereospecificity of steroid metabolism and hormonal regulation of rat P-450 enzyme expression. // Biochem. Pharmacol. 1988. - V. 37.-P. 71-84.

104. Waxman D.J. P-450 gene induction by structurally diverse xenochemicals: central role of nuclear receptors CAR, PXR, and PPAR. // Arch. Biochem. Biophys.- 1999.-V. 369.-P. 11-23.

105. Waxman D.J., Azaroff L. Phenobarbital induction of cytochrome P-450 gene expression. // Biochem. J. 1992. -V. 281. - P. 577-592.

106. Waxman D.J., Dannan G.A., Guengerich F.P. Regulation of rat hepatic cytochrome P-450: age-dependent expression, hormonal imprinting, and xenobiotic inducibility of sex-specific isoenzymes. // Biochemistry. 1985. - V. 24,- P. 4409-4417.

107. Waxman D.J., Walsh C. Phenobarbital-induced rat liver cytochrome P-450. Purification and characterization of two closely related isozymic forms. // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 10446-10457.

108. Wei P., Zhang J., Egan-Hafley M., Liang S., Moore D.D. The nuclear receptor CAR mediates specific xenobiotic induction of drug metabolism. // Nature (Lond). 2000. - V. 407. - P. 920-923.

109. Whitlock J. P. Jr. Genetic and molecular aspects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin action. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1990. - V. 30. - P. 251-277.

110. Wong H., Anderson W. D., Cheng Т., Riabowol К. T. Monitoring mRNA expression by polymerase chain reaction: The "primer-dropping" method.// Anal. Biochem. 1994.-V. 223-P. 251-258.

111. Wood A.D., Ryan D.E., Thomas P.E., Levin W. Regio- and stereo selective metabolism of two C-19 steroids by five highly purified and reconstituted rat hepatic cytochrome P-450 isozymes. // J. Biol. Chem. 1983. - V. 158. - P. 8839-8847.

112. Yamamoto Y., Kawamoto Т., Negishi M. The role of the nuclear receptor CAR as coordinate regulator of hepatic gene expression in defense against chemical toxicity. // Arch. Biochem. Biophys. 2003. - V. 409. - P. 207-211.

113. Yamamoto Y., Kawamoto Т., Negishi M. The role of the nuclear receptor CAR as coordinate regulator of hepatic gene expression in defense against chemical toxicity. // Arch. Biochem. Biophys. 2003. - V. 409. - P. 207-211.

114. Yoshinari K., Kobayashi K., Moore R., Kawamoto Т., Negishi M. Identification of the nuclear receptor CAR:HSP90 complex in mouse liver and recruitment of protein posphatase 2A in response to Phenobarbital. // FEBS Lett. 2003. - V. 548. - P. 17-20.

115. Yoshinari K., Sueyoshi Т., Moore R., Negishi M. Nuclear receptor CAR as a regulatory factor induction of CYP2B1 gene by phenobarbital in rat livers. // Mol. Pharmacol. 2001. - V. 59. - P. 278-284.

116. Zelko I., Negishi M. Phenobarbital-elicited activation of nuclear receptor CAR in induction of cytochrome P-450 genes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2000. V. 277. - P. 1-6.

Информация о работе

Пустыльняк, Владимир Олегович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование механизмов индукции цитохрома Р450 подсемейства 2В в печени экспериментальных животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы