Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов активации генов CYP2В в печени крыс при индукции трифенилдиоксаном и фенобарбиталом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов активации генов CYP2В в печени крыс при индукции трифенилдиоксаном и фенобарбиталом"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

РГБ ОД

ШВАРЦ

Елена Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ АКТИВАЦИИ ГЕНОВ СУР2В В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ ТРИФЕНИЛДИОКСАНОМ И ФЕНОБАРБИТАЛОМ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 2000

Работа выполнена п Институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН г. Новосибирск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Л.Ф. Гуляева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Л. М. Поляков кандидат биологических наук О. И. Спшщшш

Ведущее учреждение:

Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН

Защита диссертации состоится апреля 2000 г. в /V часов

на заседании диссертационного совета (Д. 001. 37. 01.) при Научно-исследовательском Институте биохимии СО РАМН по адресу: 6300117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биохимии СО

РАМН

Автореферат разослан « Ь »

Ученый секретарь

Специализированного Ученого Совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микросомная монооксигеназная система, локализованная в эндоплазматических мембранах различных органов и тканей, метаболизирует различные химические компоненты биологического и антропогенного происхождения (лекарств, ядов, химических факторов загрязнения окружающей среды, пищевых добавок, гормонов и т.д.), содержащихся в воде, воздухе, почве, пищевых продуктах. Способность этой системы окислять огромное число ксенобиотиков (КС) и эндогенных субстратов обусловлена функционированием множественных форм ее ключевого фермента - цитохрома Р450 (CYP) (Nelson & Strobel, 1987). Ксенобиотики претерпевают в организме метаболическую активацию, превращаясь в промежуточные электрофильные продукты. Эти метаболиты либо удаляются из организма, либо взаимодейств}тот с макромолекулами клетки (ДНК, РНК, белки), что приводит, в конечном счете, к развитию процессов канцерогенеза.

Функционирование множественных форм CYP определяет различные эффекты ксенобиотиков, в связи с чем становится очевидной необходимость изучения механизмов, регулирующих их активность.

Цитохромы Р450 подсемейства 2В участвуют в метаболизме лекарственных препаратов, а также осуществляют детоксикацию многих ксенобиотиков с самой разнообразной химической структурой (Nelson & Strobel, 1987; Nebert et al., 1991). Эти ферменты индуцируются большой группой структурно неродственных индукторов (органические растворители, пестициды, хлорированные бифенилы и лекарства). Основным индуктором этой группы является фенобарбитал (ФБ), к этой группе также относится трифе-нилдиоксан (ТФД) (Мишин и др., 1990). Механизм активации генов CYP2B в печени крыс при индукции фенобарбиталом до конца неясен и широко дискутируется в специальной литературе (Waxman & Azaroff, 1992; Waxman, 1994). Не определена до конца роль позитивного и негативного регуляторных элементов промотора генов CYP2B в инициации транскрипции. Не показано, как осуществляется их взаимодействие с ядерными белками во время транскрипции генов CYP2B. Кроме того, не известно, является ли действие индукторов ФБ-типа универсальным, как это описано для полициклических ароматических углеводородов, или каждый индуктор запускает особенный механизм активации генов CYP2B.

Целыо настоящей работы являлось изучение механизмов активации генов CYP2B1/2B2 в печени крыс при индукции трифенилдиоксаном и фенобарбиталом.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить активность цитохромов Р4502В1 в метаболизме специфичного субстрата пентоксирезоруфина в печени крыс, индуцированных фенобарбиталом или трифенилдиоксаном.

2. Определить динамику накопления мРНК генов CYP2B при индукции фенобарбиталом и трифениддиоксаном.

3. С помощью гель-ретардацио иного анализа исследовать взаимодействие позитивного и негативного элементов проксимального участка про-моторной области генов CYP2BM2 с ядерными белками, изолированными из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом или трифенилдиоксаном в интервале от 6 до 72 часов после их введения.

4. Провести анализ ДНК-белковых взаимодействий позитивного и негативного участков проксимального промотора генов CYP2B1/2 с ядерными белками, изолированными из печени неиндуцированных животных при добавлении индукторов ФБ-типа в системе in vitro.

Научная новизна. Впервые с помощью гель-ратардационного анализа было исследовано формирование комплексов позитивного и негативного элементов гена CYP2B2 с ядерными белками от старта транскрипции до её завершения (от б до 72 часов от начала введения индукторов). Показано, что в первые 6-9 часов после индукции оба исследу емых цис-активных элемента ведут себя согласно классической модели активации транскрипции генов СУР2В, описанной группой Падманабана (Rangarajan et al., 1995). В более поздние интервалы времени после индукции ТФД или ФБ (с 18 по 72 час.), когда ген СУР2В транскрибируется, эта картина меняется. Негативный элемент начинает функционировать как позитивный элемент транскрипции, о чем свидетельствует динамика его взаимодействия с ядерными белками.

Продемонстрировано влияние ивдукторов ФБ-типа на формирование ДНК-белковых комплексов в системе in vitro. Впервые был зарегистрирован новый комплекс (N1), образованный позитивным элементом транскрипции и ядерными белками.

Впервые выявлено два новых ДНК-белковых комплекса (N11 и NIII), образованных под влиянием ТФД. Кроме этого, показано, что это соединение может напрямую взаимодействовать с позитивным элементом. На основа-кии экспериментальных данных предложена гипотетическая схема активации гена CYP2B2 при индукции ТФД.

Впервые при индукции ФБ и ТФД была продемонстрирована различающаяся динамика накопления мРНК для генов цитохромов Р450.

Обнаружены количественные различия в ферментативных активностях цитохромов Р450 подсемейства 2В в печени крыс, индуцированных ФБ и ТФД.

Практическая значимость. Использование в качестве индуктора лекарственного препарата ФБ уточняет представления о механизмах его действия. Обнаруженный факт взаимодействия ТФД с позитивным элементом гена CYP2B открывает новые перспективы для изучения активации генов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность CYP2B1 в метаболизме пентоксирезоруфина в печени крыс при индукции фенобарбиталом выше, чем при индукции трифенилдиоксаном.

2. Динамика накопления мРНК генов CYP2B при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном различается.

3. Интенсивность связывания позитивного и негативного элементов генов CYP2B с ядерными белками печени крыс, обработанных как ФБ, так и ТФД. не зависит от применяемого индуктора.

4. В течение длительного времени (с 9 до 72 часов после введения индукторов) интенсивность связывания негативного элемента с ядерными белками падает, затем возрастает, а к 72 часам достигает исходного уровня.

5. При индукции ТФД регистрируется пять ДНК-белковых комплексов, тогда как при ФБ - индукции только три.

6. ТФД инициирует образование ДНК-белковых комплексов, взаимодействуя с позитивным элементом.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на 11 международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Лос-Анжелес, США, 1996), VII Североамериканской конференции общества изучения чужеродных соединений (Сант-Диего, США, 1996), 10 Интернациональной конференции по изучению цитохрома Р450 (Сант-Франциско, США, 1997), на VIII конференции общества изучения чужеродных соединений (Южная Каролина, США, 1997), на 12 международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Монпелье, Франция, 1998), на 5 общей международной конференции общества изучения чужеродных соединений (Каирнс, Австралия, 1998).

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6-ти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методы исследований, собственные результаты, выводы и список литературы из 5 отечественных и 74 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 90 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 26 рисунками.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для определения ферментативной активности цитохрома Р450 индукторы микросомальных монооксигеназ вводили следующим образом: фенобарбитал - внутрибрюшинно в течение 4-х дней ежедневно по 80 мг на кг веса в 0.9% МаС1; 2,4,6-трифенилдиоксан-1,3 (ТФД) - (10 мг/кг) в растительном масле - однократно внутрибрюшинно. Контролем служили животные, получавшие 0,9% раствор №С1 или растительное масло. Для определения количества мРНК индукторы вводили однократно следующим образом: фено-

барбитал - 80 мг на кг веса в 0.9% NaCl; ТФД - 10 мг/кг в растительном масле. Для выделения белковых ядерных экстрактов индукторы вводили так же, как и для определеня мРНК.

Выделение микросом из печени крыс проводили через сутки после 4-й инъекции фенобарбитала, через 3 суток после однократного введения ТФД.

Микросомальн}то фракцию печени выделяли при температуре 4°С традиционным методом дифференциального центрифугирования.

Концентрацию белка определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951), определение количества цитохромов Р450 и Ь5 - методом Омура и Сато (Omura and Sato., 1964).

Определение каталитической активности цитохрома Р4502В проводили по скорости О-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина, которую определяли флюориметрическим методом (Burke et al., 1983).

Выделение РНК проводили через 18, 48, 72 часа после введения индуктора. Суммарную РНК получали согласно методу, описанному ранее (Chromczynski and Sachi., 1987)

Дот-гибридизацию проводили, как описано ранее (Маниатис с соавт., 1984).

Мочение ДНК проводили методом рассеянной затравки, как описано ранее (Маниатис с соавт., 1984). Введение 3Н метки в ТФД произведено в Институте биоорганической химии (Новосибирск).

Белки ядерных экстрактов получали через 6, 9, 18, 24, 48, 56, 64 и 72 ч после введения индукторов, согласно (Upadhya et al., 1992).

Анализ ДНК-белковых комплексов методом задержки ДНК в теле, в случае использования белков ядерных из печени крыс, индуцированных ксенобиотиками, проводили как описано ранее Уптадхуа и соавт. (Upadhya et al., 1992).

Анализ ДНК-белковых комплексов методом задержки ДНК в геле, в случае использования белков ядерного экстракта из печени контрольных крыс при добавлении индукторов в условиях in vitro индукторы проводили согласно (Не and Fulco., 1991). Белковые ядерные экстракты инкубировали с индукторами в течение 30 или 120 минут при комнатной температуре.

При использовании в качестве радиоактивного зонда 3Н-меченного ТФД инкубационная смесь (конечный объем 25 мкл) состояла из 3-5 мкг белковых ядерных экстрактов; 300 нг - 1 мкг Поли (dl/dC); 3Н-ТФД (21 пмоль/мкл) и нерадиоактивных зондов Барби-бокса или негативного элемента (0.5-10 нг). Все компоненты, за исключением радиоактивных проб, были смешаны и преинкубированы при 37°С в течение 20 минут. После добавления меченых проб смесь инкубировали 100 минут при комнатной температуре. Пробы анализировали в 10%ПААГ. По окончании электрофореза гель высушивали при 80°С и после этого экспонировали с рентгеновской пленкой (Kodak SB-5) 5-30 суток при комнатной температуре.

Статистическая обработка результатов: среднее, ошибка среднего, достоверность различий между двумя параметрами (по критерию Стьюдента) рассчитывались с использованием компьютерной программы БТАТСЛАР.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование экспрессии генов цитохромов Р4502В в печени крыс при воздействии ксенобиотиков с различной химической структурой

Чтобы охарактеризовать ферментативную активность микросомальной системы окисления при индукции этими веществами в качестве субстрата использовали 7-пентоксирезоруфин. В таблице 1 представлены данные о содержании общего количества СУР, определенного спектрально, а также результаты определения активностей СУР2В1 в печени крыс, индуцированных ФБ или ТФД. Введение животным этих индукторов сопровождается увеличением как общего количества СУР, так и ПРОД- активности, которая достоверно различалась в зависимости от используемого индуктора. Таким образом, зарегистрированы количественные различия в ферментативной активности СУР2В1 в печени крыс в зависимости от используемого индуктора ФБ-типа.

Таблица 1.

Содержание СУР и ПРОД актлвность СУР21!1 в печени крыс, получавших ФБ и ТФД

Индуктор Содержание Р450 нмоль х мг"' белка ПРОД пкмоль/мин на 1 мг белка

без индуктора 0,6+0,1 11+1

ФБ 2,5+0,4 348+7

ТФД 1,9±0,3 160+21

Примечание: п(количество крыс) = 5-7; для ПРОД Р < 0,03.

Изучение динамики накопления РНК генов СУР2В крыс при индукции ФБ-типа

Для оценки уровня транскрипции генов СУР2В и выявления различий в действии ТФД и ФБ была исследована динамика накопления мРНК соответствующих генов (через 18, 48 и 72 часов после введения индуктора) при индукции ФБ и ТФД. Дот-гибридизация суммарной РНК, выделенной из печени крыс, индуцированных ФБ и ТФД была проведена с [32Р]кДНК СУР2В (клон е91) (рис.1) и кДНК гена (5-актина (клон рА1) В печени крыс ген Р-актина экспрессируется конститутивно, и уровень его не зависит ни от

времени введения индуктора, ни от самого индуктора (данные не приведены). Это позволяет использовать дот-гибридизацию с клоном РА1 в качестве контроля препаратов мРНК. У крыс, обработанных ФБ или ТФД, зарегистрированы отчетливые различия в динамике накопления мРНК. Так, у крыс, индуцированных ФБ, уровень мРНК достигает максимального значения к 18, а при введении ТФД - к 48 часам (рис. 1).

К 1

ТФД

ФБ -Ц

Рис. 1. Радиоавтограф сигналов, полученных при дот-гибридизации РНК из печени крыс с '"Р-меченной рекомбинантной илазмидой pBR322-e91

К - контроль, 1-18 часов, 2-48 часов, 3-72 часа. Время от начала введения соответственного индуктора, обозначено в часах. ФБ - индукция фенобарбиталом, ТФД - индукция трифенилдиоксаном. Представлены данные одного из трех экспериментов.

Изучение роли минимального промоторного элемента

в индуцируемой ФБ или ТФД экспрессии генов CYP2B

Эксперименты по задержки ДНК в геле показали, что при инкубации негативного элемента с белками ядерных экстрактов, полученных из печени контрольных крыс, регистрируется один комплекс (III), тогда как с Барби-боксом - два (И и Ш). Согласно результатам, полученным в лаборатории Падманабана (Prabhu et al., 1995), данная ситуация соответствует базальной транскрипции гена СУР2В. Инкубация исследуемых цис-активных элементов с ядерными белками из индуцированной печени принципиально не изменила картину ретардации: количество образовавшихся комплексов было таким же, как при инкубации с белками из контрольной печени. Однако интенсивность радиоактивного сигнала комплексов, регистрируемого при индукции, заметно менялась. Так, результаты инкубации негативного элемента с белками ядерных экстрактов, полученных из печени крыс через б и 9 часов после введения животным ТФД или ФБ, отчетливо свидетельствуют о снижении интенсивности ДНК-белковых взаимодействий (рис. 2,3). Это, казалось бы, соответствует самой природе негативной регуляции - удалению белков-репрессоров с одного из участков регуляторной области гена (Ram et al., 1995). Однако в наших экспериментах достаточно неожиданньш оказалось усиление интенсивности связывания негативного элемента с

ядерными белками, выделенными через 18 часов от начала индукции. Этот эффект отмечен для длительного временного интервала: с 18 до 54 часов от введения индуктора (рис.2,3 - индукция ФБ, для ТФД получена аналогичная картина). Объяснение этого факта требует дальнейших экспериментальных исследований, связанных с выяснением природы белковых факторов транскрипции. Тем не менее, можно утверждать, что мы имеем дело не с типичным элементом негативной регуляции, а, скорее, с составной частью единого позитивного элемента промоторной области гена СУР2В.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

«Ч» «Яг * ~ **

Рис. 2. Радиоавтограф электрофоретнческого распределения в 10% ПААГ 3*Р-мечеш/ого негативного элемента, инкубированного с белками ядер клеток печени контрольных и индуцированных ФБ животных

32Р-ыечешшй негативного элемента присутствует во всех дорожках. К - белки вдерного экстракта из печени неиндуцированных крыс. ИН - белки ядерного экстракта из печени индуцированных крыс.

Дорожки: 1 - 32Р-меченннй НЭ; 2, И - К;3 - ИНйфв (цифрой обозначено время от начало введения индуктора, буквами сокращенное название соответственного индуктора); 4 - ИНм>б; 5 - ИН,8ФБ; 6 - ИН24ФБ; 7 - ИН«фв ; 8 - ИН5бФБ; 9 - ИНЫФЕ ; 10 - ИН72Фб ; 12 - К + 100-кратный молярный избыток «холодной» ДНК, соответствующей негативному элементу гена СУР2В2

200 180 160 МО 12) 100 80 60 40 20 О

9 18 34 48 95 Ерешгшв введен« <Ж

6»

72

Рис. 3. Зависимость интенсивности сигнала связывания Р-меченного негативного элемента с белками ядерного экстракта, выделенных из клеток печени индуцированных ФБ крыс от времени введения индуктора К - белки ядерного экстракта из печени неиндуцированных крыс.

ИН - белки ядерного экстракта из печени индуцированных крыс. Денситометрическое значение интенсивности сигнала гибридизации 32Р-меченного НЭ с К соответствует 100%.

1

2

3 4 5 6 7 8

9 10 11

Рис. 4. Радиоавтограф электрофоретического распределения в 10% ПААГ геле 32Р-меченного Барби-бокса, инкубированного с белками ядер клеток печени контрольных и индуцированных ФБ или ТФД животных

32Р-меченный Барби-бокс присутствует во всех дорожках.

Дорожки: 1 - 32Р-меченный Барби-бокс, 2,9 - К, 3 - ИН18ФБ (цифрой обозначено время от начала введения индуктора, буквами сокращенное название соответственного индуктора); 4 -ИНцзфб ; 5 - ИН72ФБ; б - ИНтад; 7 - ИНетвд ; 3 - ИН72ТФД ; 10 - К + 100-кратный молярный избыток "холодной" ДНК (Барби-бокс)..

450 400 350 300

I 2И | 200

150 100 50 0

Пфб Птфд

Ё 500

о

о.

£ 450 о

^ 400 о

£.350 о:

х 300

то

1250 Ц 200

л

Й 150

0

1 Ю0 | 50 * 0

Вфб □тфд —

ГР1

г

1

п

11

0 18 48 72

время после введения индуктора

0 18 48 72

время после введения индуктора

Рис. 5. Зависимость интенсивности сигнала связывания 32Р-меченного Барби-бокса с белками ядерного экстракта из клеток печени индуцированных ФБ или ТФД крыс, от времени после введения индуктора

Денситометрическое значение интенсивности сигнала гибридизации 32Р-меченного НЭ с К соответствует 100%. А. Диаграмма для комплекса II; Б. Диаграмма для комплекса Ш.

При взаимодействии ядерных белков с Барби-боксом в исследуемом интервале времени наблюдается постепенное усиление сигнала ретардации с 18 до 48 часов и последующее возвращение интенсивности сигнала до контрольного уровня к 72 часам (рис. 4,5). Можно предположить, что усиление интенсивности сигнала образующихся ретардационных комплексов соответствует увеличению концентрации индуцированных или активированных факторов транскрипции. Их синтез происходит при активно транскрибируемом гене в течение достаточно длительного времени: с 18 до 48 часов. Следует отметить, что увеличение интенсивности сигнала выявленных ретардационных комплексов в этот период коррелирует с увеличение количества мРНК. Этот факт дает основания предполагать, что регистрируемые комплексы могут являться составными элементами транскрипционных комплексов.

Следует отметить, что в группу индукторов ФБ типа входят вещества с самой разнообразной химической структурой. Известно, что универсального рецептора, с которым бы связывались все индукторы ФБ-типа (подобно рецептору для полициклическим ароматических углеводородов) обнаружить не удалось. Скорее всего, каждый индуктор запускает свой механизм

активации генов СУР2В. Что может быть возможной причиной разницы в динамике накопления мРНК генов СУР2В в ответ на введение ФБ и ТФД. Результаты определения ферментативных активностей соответствующего белка (таблица 1) также могут говорить в пользу этих предположений. Кроме этого, не известно существуют ли различия между этими индукторами в тот момент, когда вещество попадает в клетку, а транскрипционные комплексы еще не сформированы. Моделью такого состояния могут служить эксперименты с добавлением индукторов к изолированным ядерным экстрактам.

Влияние индукторов ФБ-типа на формирование белковых комплексов с участками минимального промоторного элемента

Была исследована роль индукторов ФБ-типа в формировании транскрипционных комплексов, образованных белками ядерного экстракта, выделенного из печени контрольных животных, и участками минимального промоторного элемента. Как уже описано выше, методом задержки в геле было показано, что инкубация белков ядерных экстрактов из печени контрольных животных с участками минимального промотора характеризуется формированием двух комплексов II и III для Барби-бокса и одного комплекса III для НЭ, что хорошо согласуется с данными других авторов (ирасШуа й а1., 1992). Взаимодействие Барби-бокса и НЭ с белками ядерного экстракта в данном случае может косвенным образом свидетельствовать об их участии в обеспечении базального уровня транскрипции генов СУР2В1/2В2. Интенсивность образования комплексов II и III значительно возрастает при инкубации Барби-бокса с белками ядерного экстракта из печена животных индуцированных ФБ или ТФД. Однако при использовании ядерных экстрактов из печени животных, получавших ДХПОБ, регистрируемых изменений в интенсивности регардационных .комплексов II и III не наблюдалось. Это вещество относится к индукторам ФБ-типа, но не индуцирует СУР2В у крыс. Таким образом, возрастание интенсивности сигналов комплексов Барби-бокс-белки характерно для белков ядерных экстрактов из печени животных, получавших типичный индуктор подсемейства цитохромов Р4502В у крыс - ФБ или ТФД. Проведенные нами эксперименты по показали, что модификация белков, участвующих в формировании комплексов II и III, является обратимой. Интенсивность регистрируемых комплексов II и III при инкубации Барби-бокса и белков контрольных ядерных экстрактов в присутствии ФБ, ТФД и ДХПОБ возрастает, и при этом регистрируется новый комплекс N1 с меньшей электрофоретической подвижностью (рис. 6). Несмотря на то, что ДХПОБ не является индуктором для крыс, его действие (в описанных экспериментах) схоже с ФБ и ТФД.

Исследование специфичности формирования комплексов Барби-бокса с белками ядерного экстракта показало, что если в формировании комплексов II и III Барби-боксом и негативным элементом, участвуют одни и те же белки, то образование комплекса N1 специфично именно для Барби-бокса (данные не приведены)

1 2 3456789 10

NI

Рис. б. Радиоавтограф элехтрофоретического распределения в 10% ПААГ геле 32Р-меченного Барби-бокса, инкубированного с белками ядер клеток печени контрольных и индуцированных животных в присутствии индукторов ФБ-типа

32Р-мечгнный Барби-бокс присутствует во всех дорожках. Дорожки: 1 - 32Р-меченный Бар-би-бокс (32Р-Барби-бокс), 2,9 - К; 3 - К + ФБ; 4 - ИНФИ8; 5 - К + ТФД; 6 - ИНТфД48 ; 7 - К + ДХПОБ; 8 - Ш1ДШ0Б18; 10 - К + ФБ + протеиназа К

Образование нового комплекса, как и комплексов II и III, находится в прямой зависимости от присутствия в инкубационной среде индукторов. Предполагаемая модификация транскрипционных факторов под влиянием индукторов носит выраженный обратимый характер, как для ФБ, так и для ТФД и ДХПОБ. Другие химические соединения, не относящиеся к ФБ-типу, такие как метилхолантрен, бензопирен, дехсаметазон не приводят к каким-либо регистрируемым изменения интенсивности комплексов II и III и не инициируют формирование комплекса №(данные не приведены).

Таким образом, в присутствии индукторов ФБ-типа, возможно, происходит обратимая модификация ядерных белков и, как следствие, формирование специфичного ДНК-белкового комплекса (комплексов). Немаловажным является то, что ФБ, ДХПОБ, и ТФД инициируют образование комплексов „ ядерных белков именно с позитивным элементом регуляторной области генов CYP2B. Обращает на себя внимание и тог факт, что образование нового комплекса происходит как под воздействием типичных индукторов подсемейства цитохромов Р4502В у крыс (ФБ, ТФД), так и под воздействием ДХПОБ, неспособного активировать экспресс™ генов данного подсемейства. Можно предположить, что модификация белков под воздействием индукторов ФБ-типа и их взаимодействие с Барби-боксом является достаточно универсальным в многоэтапном механизме активации генов CYP2B.

В аналогичных экспериментах негативный элемент не формирует дополнительных комплексов с ядерными белками (данные не приведены).

Индуктор-опосредованное формирование комплекса Барби-бокса с ядерными белками закономерно поднимает вопрос о возможности контакта или связывания индуктора со специфическими белковыми факторами. Высокая индуцирующая эффективность ТФД в низких дозах позволяет использовать это химическое соединение в экспериментах in vitro для определения отдельных этапов участия индукторов ФБ-типа в образовании транскрипционных комплексов. Была проведена серия экспериментов по связыванию 3Н-меченного ТФД (3Н-ТФД) с Барби-боксом с добавлением белкового ядерного экстракта при инкубации от 30 мин. до 6 ч. Визуально регистрируемые сигналы были выявлены только после двух-часовой инкубации Н-ТФД с Барби-боксом и белковым ядерным экстрактом (рис. 7, дорожка 5). Регистрируемые сигналы представляют собой два комплекса с разной элек-трофоретической подвижностью, верхний комплекс был обозначен как N11, а нижний - NIII. После внесения в инкубационную смесь протеиназы К эти комплексы не регистрируются, что подтверждает их белковую природу (дорожка б). Конкурентное добавление в инкубационную смесь ФБ не влияет на образование комплексов N11 и NIII (дорожка 7). При двухчасовой инкубации 3Н-ТФД с негативным элементом и белковым ядерным экстрактом сигналов ретардации обнаружено не было (дорожка 9). Кроме этого был зарегистрирован радиоактивный сигнал при взаимодействии 3Н-ТФД с Барби-боксом в отсутствии белкового ядерного экстракта (дорожка 3). Исходя из схожей электрофоретической подвижности этого комплекса с подвижностью для 32Р Барби-бокса (дорожка 1), можно предположить, что данный радиоактивный сигнал соответствует комплексу ТФД-Барби-бокс. Возможно, в нашем случае инициация формирования транскрипционного комплекса происходит без участия белков. Можно предположить, что ТФД вызывает либо конформационные изменения в структуре ДНК, либо непосредственно связывается с ДНК (эксперименты с 3Н-ТФД). Введение в инкубационную смесь (3Н-ТФД+Барби-бокс) ФБ, предполагаемого конкурента для

ТФД за связывание с ДНК, не приводит к изменениям наблюдаемого сигнала (дорожка 4). Кроме того, ТФД не взаимодействует с НЭ (дорожка 8). Следует заметить, что все описанные выше результаты получены при двухчасовой инкубации системы, содержащей Н-ТФД. Эксперименты, с 32Р Барби-боксом, проводили после 30-минутной инкубации. Для того, чтобы подтвердить специфичность действия ТФД на образование комплексов N11 и NIII, было увеличено время инкубации 32Р-меченного Барби-бокса с ядерными белками до двух часов. Такая модификация приводит к появлению двух дополнительных комплексов, образованных Барби-боксом и ядерными белками (рис. 8, дорожка 2). Исходя из результатов с 3Н-ТФД, мы предполагаем, что эти комплексы соответствуют комплексам N11 и NIII. Таким образом, при двух-часовой инкубации Барби-бокса с белками контрольных ядерных экстрактов в присутствии ТФД регистрируется пять комплексов, причем в состав N11 и NIII входит ТФД. Надо отметить, что при добавлении ФБ образование комплексов N11 и NIII не происходит (дорожка 7).

1 2

3 4 5 6 7 8 9

■m»

NI

III

Nil NIII

Рис, 7. Изучение связывания 3Н-меченного ТФД

Реакцию инкубации проводили 120 минут при комнатной температуре. Нерадиоактивные Барби-бокс и ПЭ были использованы в 100 кратном избытке. Во всех дорожках присутствует 3Н-меченный ТФД (3Н -ТФД), кроме дорожек 1 и 2, где присутствует 32Р-меченный Барби бокс (32Р Барби-бокс).

Дорожки: 1 -32Р Барби бокс; 2 - 32Р Барби-бокс + К + ТФД; 3-3НТФД + Барби-бокс; 4 - 3Н -ТФД + Барби бокс + ФБ; 5 - 3Н -ТФД + Барби-бокс + К; 6 - 3Н -ТФД + Барби-бокс + К + протеиназа К; 7 - 3Н -ТФД + Барби-бокс + К + ФБ; 8 - 3Н -ТФД + НЭ; 9 - 3Н -ТФД + НЭ + К.

Образование комплексов N11 и NIII может свидетельствовать о наличии некого инициирующего сигнального этапа в активации генов CYP2B. В пользу данного предположения говорит и тот факт, что инкубация уже индуцированных ядерных экстрактов в присутствии ТФД не приводит к образованию комплексов N11 и NIII. ФБ и ДХПОБ не инициируют формирование высокомолекулярных комплексов ядерных белков и Барби-бокса (рис.8).

Таким образом, показано, что только под действием ТФД формируется два ДНК-белковых комплекса (N11 и NIII), в состав которых входит индуктор. В связи с этим кажется привлекательной гипотеза, что Барби-бокс является местом посадки, напрямую или опосредовано через белки, именно для ТФД. Возможно, что ФБ и ДХПОБ также имеют такие участки внутри минимального промоторного элемента. Последняя гипотеза подтверждается тем, что Барби-бокс гена сур2Ы0 разделен вставкой в 42 нуклеотида, что может быть причиной того, что ТФД не является индуктором подсемейства Р4502В у мышей. Взаимодействие индуктора с ДНК приводит к быстрому формированию мультикомпонентного комплекса, являющегося сигналом к активации транскрипции.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13

МП N111

N1;

II

III

■ »•*» тфф — < -г

Рис. 8. Радиоавтограф электрофоретического распределения в 10% ПААГ геле 32Р-меченного Барби-бокса, инкубированного с белками ядер клеток печени контрольных и индуцированных животных в присутствии индукторов ФБ-типа

• 32Р-мечеиный Еарби-бокс присутствует во всех дорожках. Реакцию инкубации проводили 120 минут при комнатной температуре.

Дорожки: 1,13 - 32Р-меченный Барби-бокс (32Р Барби-бокс); 2 - К + ТФД; 3 - ИН«тфд (цифрой обозначено время от начало введения индуктора, буквами сокращенное название соответственного индуктора) + ТФД; 4 -ИН18тфд+ТФД;5 - ИНцтфд+ТФД; 6 - ИН7;т<ад +ТФД; 7 - К + ФБ;8 - ИНЙФБ +ФБ; 9 -ИН,8ФБ+ФБ; 10 -ИН,8фь+ФБ; II - ИН72ФБ+ФБ; 12-ИНЯ-ФД+БП.

Схематическое изображение гипотетической схемы формирования ДНК-белковых комплексов при индукции ТФД представлено на рис. 9. Вполне вероятно, что весь многоступенчатый каскадный механизм активации генов СУР2В1/2В2 берет свое начало с дерепрессии генов, но как осуществляется это процесс, пока не известно.

a fit

s e

3 H u _

O» И ü

я

В >> H 4

a s и я

Cn ** Н Г1 В EQ

Я Г)

n

V

Я

et

8

и ö

12 j?

Й <4

CLi

а >

я и

'Т-

Рис. 9. Гипотетическая схема актилации гена CYP2B2 при индукции ТФД Контроль - с ПЭ и соответственно с участком Барби-бокс связаны белки, образующие два комплекса II и III.

Введение ТФД - молекула ТФД взаимодействует с Барби-боксом. По-видимому, белки не принимают участие в этом взаимодействии.

Через 30 минут от момента введения ТФД - неизвестный ранее белок N1 связывается с участком Барби-бокс, после чего образуется сложный комплекс - ДНК-индуктор-белок.

Через 2 часа от момента введения ТФД - белок N1, возможно, претерпевает какие-то изменения или модификации, и два новых белка N11 и NIII, также неизвестных ранее, связываются с Барби-боксол. Таким образом, с этим участком образуется уже пять ДНК-белковых комплексов, три из которых (N1, N11 и NIII) зарегистрированы впервые.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ферментативная активность цитохрома Р4502В1 в метаболизме пентоксирезоруфина в печени крыс при индукции фенобарбиталом в 1,5 раза выше, чем при индукции трифенилдиоксаном.

2. При индукции фенобарбиталом максимальное количество мРНК генов CYP2B1/2B2 регистрируется к 18 часам от начала введения индуктора, а при инду кции трифенилдиаксаном - к 48 часам.

3. Интенсивность связывания негативного элемента с белками ядерного экстракта через 6-9 часов от начала введения индукторов уменьшается, к 48-56 часам увеличивается, а к 72 часам возвращается к исходному состоянию.

4. Интенсивность связывания Барби-бокса с ядерными белками при индукции крыс трифенилдиоксаном или фенобарбиталом максимальна к 18 часам, затем снижается, возвращаясь к 72 часам на исходный контрольный уровень.

5. Введение индукторов фенобарбиталового-типа in vitro инициирует образование трех комплексов Барби-бокс-ядерныс белки, один из которых (N1) выявлен впервые, что свидетельствует о вовлечении позитивного элемента в процесс регуляции транскрипции генов CYP2B .

6. Трифенидциоксан, в отличие от фенобарбитала, инициирует образование пяти ДНК-белковых комплексов, в два из которых (N11 и NIII) входит сам индуктор.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Schwartz E.I., Gulyaeva L.F. Interstrain differences in rat CYP2B gene activation. // Xth INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON MICROSOMES AND DRUG OXIDATIONS, Los-Angeles, USA, June 21-24, 1996.V. 10. P. 168

2. Schwartz E.I., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Interstrain differences of expression CYP2B gene in rat liver. // North American International Society for Study of Xenobiotics (ISSX) Meeting, Sant-Diego, USA, October 20-24, 1996, V. 10, P. 234-234.

3. Schwartz E.I., Duzhak T.G., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Inducer -and time-dependent activation of CYP2B1/2 gene transcription in liver of Wistar rats.// 10th International Conference on Cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, San-Francisco, USA, August 21-26, 1997. V. 8. P. 124-125.

4. Schwartz E.I., Duzhak T.G., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Positive negative regulation of CYP2B2 induction in rat liver // 8th North American ISSX Meeting, Hilton Head, South Carolina, USA, October 26-30, 1997. V.12. - P.303.

5. Schwartz E.I., Duzhak T.G., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V Time-dependent activation of minimal CYP2B promotor element // 12lh International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation, Monpellier, France, July 20-24, 1998. P.24.

6. Schwartz E.I., Duzhak T.G., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V New aspects in inducer-dependent activation of minimal CYP2B promotor element // 5,h International ISSX Meeting, Cairns, Australia, October 20-24, 1998, P. 284.

7. Шварц Е.И., Дужак Т.Г., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В. Динамика накопления мРНК для генов CYP2B в печени крыс различных линий во время индукции ксенобиотиками. // Вопр. мед. химии. - 1999. - Т. 44, № 2. - С. 167-171.

8. Шварц Е.И., Дужак Т.Г., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В. Межлинейные различия в ферментативной активности CYP2B1 и экспрессии его гена в печени крыс при индукции. И Вопр. мед. химии. - 1999. - Т.45 , № 1. - С. 133-140.

Соискатель Е.И.Шварц

Заказ № 22 Тираж 100 экз Печ. л. 1,0 Формат 60x84/16. Бумага офсетная № 1.

Типография СО РАМН, 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 9, 2000 г.