Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности цитохромов Р450 2В и 1А и экспрессии их генов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности цитохромов Р450 2В и 1А и экспрессии их генов"

/л

РГВ од

1 2 С£Н ? тг

л. 'л

На правах, рукописи

ГУЛЯЕВА Людмила Федоровна

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМОВ Р450 2В И 1А И ЭКСПРЕССИИ ИХ ГЕНОВ

03.00.03 - молекулярная биология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцове 2000

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Научный консультант:

академик РАМН В. В. Ляхович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г. М. Дымшиц доктор биологических наук А. Г. Покровский доктор биологических наук И. Ф. Усынин

Ведущая организация

Новосибирский Институт биоорганической химии СО РАН

диссертационного совета Д 074.20.01 Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: 630559 Новосибирская область, п. Кольцово

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор" Автореферат разослан " ^/¿¿Г^х^ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного

2000

г. в 9Ш-на заседании

совета

Т. Н. Шубина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С интенсивным развитием промышленности увеличивается число вредных факторов, влияющих на организм человека. К таким факторам прежде всего относятся пестициды, пищевые добавки, канцерогены, отходы производства и другие соединения химического происхождения. В связи с этим трудно переоценить значение ферментативных систем, обеспечивающих защиту от перечисленных выше факторов. Было сформулировано и экспериментально обосновано представление о том, что в клетке фушщионнрует система ферментов, окисляющая чужеродные соединения, названная мнкросомной moho оксигеназнон системой со смешанными функциями (МОС) (Omura, Sato, 1964; Арчаков, 1975; Estabrook, 1979;'Ляхович, Цырлов, 1981). Моноокснгеназы не только превращают чужеродные соединения (ксенобиотики) в более полярные, легко удаляемые из организма, но и активно участвуют в обмене различных эндогенных соединений, таких как холестерин, простагландины, витамины, стероидные гормоны и др. Столь широкая субстратная специфичность ферментов микросомной моноокенгеназной системы обеспечивается фушщионированием множественных форм цитохрома Р450 (CYP) - терминального акцептора электронов этой системы (Porter, Coon, 1991). К настоящему времени известно более 400 различных форм этого гемопротеида, описанных для бактерий, растений и животных (Nelson et al., 1996). Таким образом, цитохромы Р450, представленные столь разнообразными ферментами, осуществляют огромное число метаболических превращении химических соединений как экзо-, так и эндогенного происхождения. Эффективность метаболизма ксенобиотиков прежде всего определяется возможностью данных ферментов к индукции, т.е. увеличению количества фермента с уенлешгем его каталитических способностей. К настоящему времени внимание исследователей направлено на изучение механизмов активации генов цитохрома Р4501 А, индуциру емого полициклическими ароматическими углеводородами, и цитохрома Р4502В, индуцируемого фенобарбиталом и другими соединениями. Интерес к данным ферментам обусловлен прежде всего тем, что первый из mix осуществляет метаболическую активацию многих соединений в активные канцерогены, тогда как второй в большинстве случаев выполняет функцию детоксификации. Доказано, что для активации гена CYP1A необходимо взаимодействие цнтозольного белка - Ah-рецептора с ксенобиотиком, транслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и, наконец, взаимодействие вновь образованного комплекса Ali-рецептор- ARNT с цис-активными элементами гена (Whitlock , 1999). О механизмах активации генов CYP2B известно меньше. В регуляторной области этих генов найдены функционально значимые районы, с которыми связываются фак-

торы транскрипции (Trottier ЕТ AL., 1995). Однако, последовательность событий, приводящая к активации транскрипции гена, пока остается неизвестной. Таким образом, изучение механизмов индукции цитохро-мов Р450 является важнейшей составляющей в понимании регуляции активности этих ферментов.

Активность молекулярных форм цитохрома Р450 зависит не только от наличия индуктора, но и от типа ткани, где экспрессируются его гены (de Waziers et al., 1990), а также от возраста (Rich et al., 1997). Для окислительного метаболизма лекарств и других ксенобиотиков характерны генетические вариации, как в популяции людей, так и грызунов. В последнее время проводятся исследования молекулярных основ такого полиморфизма. Значительный вклад в полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков вносят аллельные вариации структурной области генов CYP (Nebert et al., 1996).

Цель н задачи исследования. Целыо данной работы является исследование механизмов, регулирующих активность молекулярных форм CYP подсемейств 1А и 2В в печени крыс и мышей.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать цитохромы Р450 1А и 2В по субстратной специфичности. В связи с эти представляется необходимым изолировать эти ферменты из мнкросомалыюй мембраны, определить их активность в метаболизме специфичных субстратов с использованием реконструированной мембранной системы. Для определения активности фермента в мнкросомалыюй фракции печени необходимо определить его количество. Одним из перспективных подходов количественного определения ферментов в печени является иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител против исследуемых цитохромов Р450. С другой стороны, ингибирование их активности в микросомальной фракции антителами позволит определить специфическую активность изоформ цитохрома Р450.

2. Методами нммуноферментного анализа исследовать особенности функционирования МОС печени крыс в ранний неонатальный период развития, оценить активность и индуцибельность CYP1A и CYP2B

3. Исследовать специфичность действия ксенобиотиков на активацию CYP1А и 2В в различных органах крыс. Применение фенобарбитала н ПАУ-соединений (бензо[а]пирен, метилхолантрен, (З-нафтофлавон, Арохлор 1254) в качестве индукторов монооксигеназ позволит оценить количественные аспекты индуцибелыюсги генов CYP1A и 2В, играющей определяющую роль в развитии токсического ответа клетки на эти соединения. Для решения этой проблемы предполагается использовать как методы определения специфической активности ферментов, так и определение уровня мРНК.

4. Изучить влияние шгдуктороп ФБ-типа (фенобарбитал, трнфенил-диокеан) и смешанного типа (Арохлор 1254, ппрпднп) на активацию генов цитохрома Р450 2В подсемейства. Использование методов биохимии (специфические ферментативные реакции) и молекулярной биологии (методы гибридизации нуклеиновых кислот, ПЦР анализ, метод задержки ДНК в геле) позволит выявить некоторые аспекты механизма действия этих соединении на клетку.

5. Исследовать межгашейные вариации в активности цптохромов Р450 подсемейств 2В н 1А в печени крыс и мышей.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Активность цито хрома Р450 зависит от возраста животных: у новорожденных его содержание невелико, однако, каталитическая активность некоторых его форм (СУР1А1) значительно выше, чем у взрослых.

2. Экспрессия генов цптохромов Р450 подсемейств 1А и 2В зависит от типа ткани. В печени крыс регистрируется их максимальная экспрессия, тогда как в почках и легких уровень мРНК и активность ферментов существенно ниже.

3. Экспрессия генов СУР1А и СУР2В в печени крыс и мышеи, подвергавшихся действию индукторов, зависит от линии экспериментальных животных.

4. В печени крыс, помимо мРНК для СУР2В1 и СУР2В2, независимо от типа применяемого индуктора, регистрируется альтернативно сплан-сированный вариант мРНК.

5. Экспрессия генов СУР1А и СУР2В в печени крыс регулируется типом индуктора и временем его действия.

Научная новизна и практический значимость работы. Исследование цитохром Р450-содержащей микросомной моноокспгеназной системы печени экспериментальных животных позволило сделать ряд новых заключений о механизмах регуляции активности и экспрессии генов СУР1А и СУР2В.

Проведена идентификация и дана характеристика основных ФБ- и МХ-нндуцнрованных молекулярных форм цитохрома Р450 в печени крыс Внстар. Показано, что в печени новорожденных крыс активность СУР1А1 в метаболизме специфических субстратов более чем в 10 раз, превышает таковую для взрослых, что можно рассматривать как особый механизм защиты от чужеродных соединений.

Впервые показано, что под действием индукторов смешанного типа в легких индуцируется СУР1А2, обычно экспресснруемый в печени. Увеличение активности этого фермента в печени и легких не коррелирует с увеличением уровня мРНК, что позволяет сделать вывод о по-сттранскрнпцпонных механизмах его регуляции.

Для СУР2В2 доказано существование альтернативного варианта мРНК в печени, причем ее наличие не зависит от типа применяемых

индукторов цитохрома Р450. Выявлены межлинейные различия в активности СУР1а мышей, индуцированных канцерогенным о-аминоазотолуолом, что может быть важным фактором в развитии гепа-токанцерогенного процесса, индуцированного этим соединением. Выявлены различия в способности к индукции фенобарбиталом и трифе-нилдиоксином у крыс различных линий, причиной которых могут быть изменения в экспрессии гена СУР2В.

Показана различающаяся динамика накопления мРНК в печени крыс при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном. Исследованы механизмы действия этих индукторов на экспрессию гена СУР2В2. Впервые показано, что взаимодействие негативного регуляторного элемента гена СУР2В2 с ядерными белками сопровождается сначала уменьшением, а затем усилением интенсивности его связывания с белками, что дает основание пересмотреть природу негативной регуляции данного гена. Установлено, что фенобарбитал инициирует образование 3-х, а трифеннлдноксан - 5-ти ДНК-белковых комплекса, что говорит в пользу существования индуктор-специфичных путей инициации транскрипции СУР2В2 гена.

В данной работе представлен обобщающий материал по регуляции активности СУР1А и СУР2В форм щггохрома Р450, участвующих в метаболизме различных ксенобнотиков, включая канцерогены и лекарства. Это дает возможность оценить действие таких соединений на живые организмы, установить факторы риска развития токсических процессов, включая канцерогенез.

Разработаны методы оценки метаболизнрующей способности печени экспериментальных животных, индуцированных различными ксенобиотиками. Такая стратегия может быть использована для решения задач, связанных как с биомониторингом окружающей среды, так и с изучением процессов биоактивации и метаболизма чужеродных соединений. Результаты, полученные по изучению индуктор-специфической активации генов СУР2В, открывают новые возможности для исследования механизмов активации генов у эукариот.

Личный вклад соискателя

Большая часть результатов получена автором самостоятельно. Часть исследований выполнена совместно с сотрудниками ИМБиБ СО РАМН (Гришанова А.Ю., Гугкина Н.И., Дужак Т.Г., Коваленко С.П., Шварц Е.И., Шарипова Г.А.), часть - в сотрудничестве со старшим научным сотрудником Института цитологии и генетики СО РАН Калединым В.И.

Я искренне благодарна всем соавторам. Особую признательность выражаю академику РАМН Ляховичу Вячеславу Валентиновичу за постоянную поддержку и консультации.

Работа выполнена в лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на следующих конференциях:

- 6th International Conference on Biochemistry, Biophysics of Cytochrome P450, 1988, Vienna, Austria

- 5-ая Всесоюзная конференция "Цитохром Р450 и модификация макромолекул", 15-21 октября 1989 г., г. Ялта

- 3d European ISSX Symposium on Foreign Compound Metabolism, 1989, London, England

- 8th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation, 1990, Stockholm, Sweden

- Международная конференция "Isozymes: Organization and Roles in Evolution, Genetics and Physiology", 6-13 сентября 1991 г., г. Новосибирск

- 7-ая Международная конференция "Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P-450", 28 шоля-2 августа 1991 г., г. Москва

- 3d International ISSX Meeting "Drug Metabolism", June 6-11, 1991, Amsterdam, Holland

- International Symposium "Recent Progress in Extrahepatic Drug Metabolism", May 17-21, 1991, Ronneby, Sweden

- 8th International Conference on Cytochrome P-450, 1993, Lisbon, Portugal

- 5th European ISSX Meeting, 1993, Tours, France

- 6'h North American ISSX Meeting, October 23-27, 1994, Raleigh, NC, USA

- 8th North American ISSX Meeting, October 23-26, 1996, Hilton Head, SC, USA

- International Conference "Microsomes and Drug Oxidation", July 1116, 1998, Montpellier, France

- 5th International ISSX Meeting, 1998, Cairns, Australia.

По материалам исследований опубликовано 44 работы, из них 24 журнальных статьи.

CTpjKTjpa работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, главы "Материалы и методы", 8 глав собственных исследовании, обсуждения, заключения и выводов. Она изложена на 209 страницах машинописного текста, включая 18 таблцц и 26 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 315 источников.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Идентификация молекулярных форм цитохрома Р450, изолированных из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом (ФБ) и 3-метилхолантреном (МХ)

Индивидуальные формы цитохрома Р450 из печени фенобарбитал (ФБ)- и 3-метилхолантрен (МХ) -индуцированных крыс получены по достаточно широко используемой схеме:

1. Аффинная хроматоцэафня солюбилизированных микросом на 1,8-диаминооктилсефарозе;

2. Хроматография суммарной фракции цитохрома Р450 на ДЭАЭ-сефацеле;

3. Хроматография отдельных фракций на гидроксилапатите.

Для идентификации этих ферментов из печени крыс, индуцированных ФБ, исследовалась их активность в метаболизме андростендиона (АД), бензфетамина (БФ) и 7-этокснрезоруфнна (ЭР) (табл. 1). Общая фракция Р450, полученная аффинной хроматографией, деметшшрует БФ и гндроксилирует АД с образованием трех метаболитов: - 7а-, 16а-и 16(3-ОН-АД. При разделении этой фракщш ионообменной хроматографией наблюдалось и разделение активностей. Оба Р450 фракции ДЭАЭ-1, не связавшиеся с нонообменником, не метаболнзируют АД и обладают низкой БФ -И-дем етилаз н он активностью. Цитохром Р450 ДЭАЭ-2 гндроксилирует АД с образовашюм двух метаболитов: 7а-, 16а-ОН-АД. После разделения на гидроксилапатите лишь один Р450 (ДЭАЭ-2-ГАП) обладал 16а-гидроксилазной активностью, тогда как ни в одной из фракщш 7а-п1дроксилазная активность не была зарегистрирована. Цитохром Р450 ДЭАЭ-3 метаболизирует БФ со скоростью, превышающей таковую для других Р450. БФ -]Ч-д сметала31тя активность цитохрома Р450 ДЭАЭ-4-ГАП существенно ниже. При исследовании метаболизма АД оказалось, что щггохромШ Р450 ДЭАЭ-3 окисляет этот гормон с образованием лишь одного метаболита - 16Р-ОН-АД. Другие фракщш Р450 неактивны в этом метаболизме.

Использование специфических реакций окисления ксенобиотиков представляется на сегодняшний день наиболее информативным и перспективным методом оценки и идентификации множественных форм цитохрома Р450. Исследования, проведенные на изолированных из мембраны ферментах, показали, что одна из фракщш ФБ-индуцированного цитохрома Р450, а именно ДЭАЭ-3, в отличие от других, с высокой скоростью деметшшрует БФ (табл.1). Эти результаты могут служить основанием для того, чтобы идентифицировать этот Р450, как СУР2В1. При исследовании изолированных ферментов лишь одна фракция ДЭАЭ-3 была активна в данной реакции. Цитохром Р450

Таблица 1.

Характеристика изолированных форм СУР из ФБ- и МХ-мпкросом псчспп крыс Иистар

Индукция Фракция СУР Содержание СУР нмоль на мг АКТИВНОСТЬ Фракций СУР в метаболизме субстратов (нмоль продукта в 1 тмин на нмоль цитохрома Р450) Идентификация форм СУР

БФ ЭР 7 а-АД 1ба-АД 1 бр-АД

ФБ 1,8-ДАО 5,8 10 и.о.* 0,31 1,48 16,6

ДЭАЭ-1-ГАП-1 14,4 8,1 И.о. н.о. н.о. н.о. СУР2СЗ

ДЭАЭ-1-ГАП-2 15,1 10,1 и.о. н.о. н.о. н.о. СУРЗА1

ДЭАЭ-2 10,6 4,7 и.о. 0,74 3,7 н.о. СУР2С11 + СУР2А1

ДЭАЭ-2-ГАП 15,5 и.о. и.о. н.о. 4,36 н.о. СУР2С11

дэлэ-з 15,1 70 и.о. н.о. 1,9 20 СУР2131

ДЭАЭ-4-ГАП 16,0 7,2 и.о. и.о. н.о. и.о. СУР2В2

МХ 1,8-ДАО 4,5 п.о. 4,5 0,7 1,3 0.31

ДЭАЭ-1 7,2 и.о. н.о. н.о. н.о. и.о.

ДЭАЭ-2 6,4 и.о. и.о. 0,89 2,6 н.о. СУР2А1 + СУР2С11 + СУР1А2

ДЭАЭ-3-ГАП 13,4 и.о. н.о. 6,8 н.о. н.о. СУР2А1

ДЭАЭ-4 14,4 И.о. 14,0 н.о. н.о. н.о. СУР 1А1

"Активность не определяется

из фракции ДЭАЭ-ГАП-4 с высокой степенью вероятности можно соотнести с CYP2B2, так как этот Р450 неактивен в метаболизме исследуемых субстратов. Кроме того, в реакциях двойной иммунодиффузии антитела против CYP2B1 реагировали с этим белком.

Среди цнтохромов Р450, изолированных из печени МХ-нндуцированных крыс, был выявлен цнтохром Р450 1А1, активно мета-болизирующий ЭР (фракция ДЭАЭ-4). Другая форма CYP, индуцируемая ПАУ-соединениями - CYP1A2, отличительной особенностью которой является ее высокоспиновое состояние (Ryan, Levin, 1990). Этим свойством обладал CYP фракции ДЭАЭ-1. Позднее было показано, что специфическим субстратом для этого фермента является MP. Следует заметить, что идентификация основных ФБ- и МХ-индуцированных форм CYP существенно облегчается не только наличием специфических субстратных реакций, но и благодаря другим параметрам - спектральным характеристикам, изменению относительного количественного содержания в микросомах. Гораздо сложнее обстоит дело с идентификацией так называемых конститутивных форм цитохрома Р450, присутствующих в печени интактных животных. При использовании классических индукторов мнкросомных монооксигеназ их содержание не меняется и лишь наличие специфических субстратных реакций позволяет выявить их среди других, гемопротеидов. Известно, что CYP2C11, экспресснруемый лишь в печени самцов, окисляет АД в 16а-положешш (Wood et al., 1983). При анализе щггохрома Р450 как MX-, так и ФБ-микросом, во фракции 2 регистрируется АД-16а-гндроксилазная активность, причем его активность сопоставима с таковой, полученными другими исследователями. Цигохром Р4502А, также являющийся конститутивной формой, обладает бос-АД-пщроксилазнои активностью (Ryan et al., 1984). Этой активностью обладал CYP из фракции ДЭАЭ-3-ГАП, полученной из МХ-микросом (табл.1). Следует отметить, что небольшой выход этого фермента (< 0,1%) свидетельствует о малом содержании его в печени. Таким образом, были получены электрофорети-ческн гомогенные формы цитохрома Р450: CYP2B1, CYP2B2, CYP1A1, CYP 2С11 н CYP2A1, идентифицированные по специфическим активностям. Были получены поли- и моноклональные антитела против CYP2B1 и CYP1A1, использование которых позволяет оценить содержание ферментов в печени при различных экспериментальных условиях. Применение антител для ингабирования реакций, осуществляемых ферментами микросомальной фракции печени, позволит выяснить роль определенной формы цитохрома Р450 в метаболизме выбранного субстрата.

Были проведены эксперименты по определению каталитической активности изолированных CYP с применением реконструированной системы. Эти данные представлены в табл. 2. Как следует из приведенной таблицы, субстраты, используемые в данной работе, достаточно специ-

фичио окисляются исследуемыми формами СУР. Так, активность СУР2В1 в метаболизме БФ и АД превышала таковую для СУР1А1 в 70 и 50 раз соответственно. С другой стороны, СУР1А1 с большей скоростью окисляет БП и ЭР, в 12 и 70 раз соответственно.

Таблица 2.

Каталитическая активность С\'Р2В1 и СУР 1А1 п мпкросомах ■i реконструированной системе

Исследуемая система АКТИВНОСТ 1-Г

бензфетамин-М-деметилаза з-он- бензпиреп-гндроксилаза 7-этоксирезору-фин -О-деэтилаза 1бР-андро-стенднон-гндрокенлаза

ФБ-микросомы 17.0014.05 1,00+0,33 0,10±0,04 7,57+0.52

СУР2В1 70.50±20.11 1,40+0,14 0,11 ±0.02 9,83±2,12

МХ-мпкросомы 4.00±2.08 4,50+1,04 7.5±2.52 0,75+0.78

СУР1А1 1,01 ±0.05 18,30±4,43 7,20±3,11 0,18±0,10

" активности выражены в нмоль продукта п мин на мг белка.

Специфичность этих субстратов была подтверждена в экспериментах по ипгпбнрованшо активностей антителами. Антп-СУР2В почти полностью ннгибировалн метаболизм БФ и АД в ФБ-микросомах печени крыс, а анти-СУР1 А1 - окисление БП и ЭР.

2.2. Активность цитохромов Р4501А и 2В в печени новорожденных крыс

Мнкросомная монооксигеназная система новорожденных как качественно, так и количественно отличается от взрослых. Ранний неона-тальный период, охватывающий несколько недель после рождения, является критическим в развитии многих монооксигеназных активностей. Для исследования активности и индуцибельности СУР1А и СУР2В были выбраны следующие временные точки раннего неонатального периода:

- 3-х дневные крысята, которые сразу после рождения в первый день постнатальной жизни подвергались воздействию индукторов. Этот срок характеризует начало раннего неонатального периода.

- 6-ти дневные особи - животные, индуцируемые ксенобиотиками со 2-го дня после рождения. Этот срок приходится на середину исследуемого периода жизни крыс.

- 16-ти дневные - окончание раннего неонатального периода

Выбранные сроки исследования, по данным некоторых исследователей, являются критическими в развитии монооксигеназной системы, когда активность ферментов не коррелирует с содержанием цитохрома Р450. Следует заметить, что в указанный интервал времени (3-16 дни

после рождения) половых различий в активности ферментов, метаболи-зирующнх ксенобнотшш, не наблюдается (Ката1ак1 й а1., 1983).

В табл. 3 представлены общие данные о микросомальных переносчиках электронов, участие которых в метаболизме ксенобиотиков считается доказанным. Как вндно, у 3-х дневных крысят регистрируется достаточно высокая (50% от уровня взрослых) активность НАДФН-цитохром Р450 редуктазы, в то время как содержание цитохрома Р450 составляет около 20%. У 6-ти дневных особей его содержание увеличивается почти вдвое по сравнешпо с 3-х дневными, и у 16-ти дневных содержание исследуемых белков приближается к уровню взрослых. Введение крысятам исследуемых возрастов как ФБ, так и МХ не вызывает существенного увеличешш НАДФН-цитохром Р450 редуктазы, тогда как содержание СУР заметно увеличивается. У 3-х дневных это увеличение незначительно, но, начиная с 6-ти дневного срока, регистрируется существенное увеличение СУР. Следует отметать, что в первую неделю жизни более эффективным индуктором для СУР является МХ, а после этого срока - ФБ. Таким образом, из данных по содержанию основных компонентов МОС следует, что первые две недели постнатального развития крыс являются периодом развития компонентов МОС, содержание которых у 16-тн дневных особей приближается к уровню взрослых.

Таблица 3.

Характеристика микросомнон моноокенгеназпон системы печени крыс разнога возраста

Возраст, дни Обработка индуктором Активность НАДФН-СУР редуктазы, (мкмоль в 1 мин на 1 мг белка) Содержание СУР, (нмоль на 1 мг белка) Содержание форм цнтохрома Р-450, (нмоль на 1 мг белка) (в скобках - % содержания от общего СУР)

СУР2В СУР 1А1

3 К ФБ МХ 0,10 ± 0,02 0,09 ± 0,01 0,10+ 0,02 0,15 ± 0,02 0,35 ± 0,05 0,40 + 0,08 0,014(4) 0,020 (5)

6 К ФБ МХ 0,11 ± 0,03 0,14+ 0,02 0,13+ 0,04 0,42+ 0,01 0,65+ 0,01 0,73 ± 0,09 0,065 (10) 0,102(14)

16 К ФБ МХ 0,19 ± 0,02 0,24+ 0,01 0,21 + 0,01 0,54 + 0,04 1,30+ 0,08 0.84+ 0,01 0,221 (17) 0,420 (50)

Взрослые К ФБ МХ 0,15 ± 0,02 0,22 ±0,03 0,14 + 0,02 0,64 ± 0,02 2,30 + 0,05 1,71 ±0,04 0,924 (42) 1,190(70)

В каждый эксперимент взято по 3 помета крысят, для взрослых п=3

Для оценки индуцированных форм СУР был использован метод ракетного иммуноэлектрофореза, позволяющий определить количество индуцированной формы, микросом печени неонатальных крыс. В табл. 3 представлены данные по содержашпо общего СУР, определенного спектрально, а также по количеству его индуцированных форм. У крыс первой недели жизни их содержание невелико - 5-8% от суммарного СУР, хотя количество последнего у новорожденных существенно увеличивается по сравнению с контролем. Тогда содержание других, нежели СУР1А1 или СУР2В форм, у 3-х дневных крысят достаточно велико. Количество неидентифицнрованных СУР остается большим и у 6-тн дневных крысят. Соотношение индуцированных форм СУР, пммуноло-гнчески идентичных взрослым, и неизвестных меняется у 16-ти дневных крыс: количество СУР2В и СУР1А в микросомах при индукции ФБ и МХ увеличивается до 20% и 50% соответственно, что приближается к их содержашпо у взрослых особен. Столь резко выраженные различия в соотношении индуцированных форм СУР и неидентифицированных в печени крыс разного возраста демонстрирует количественное перераспределение данных ферментов в онтогенезе.

Для исследования активности МОС печени крыс разного возраста при ФБ- и МХ-индукцин использовались специфичные субстраты для СУР2В1 - алдрнн и бензфетамнн и для СУР1А1 - БП и ЭР. В табл. 4 представлены максимальные скорости метаболизма указанных субстратов, определенные в печени как неиндуцированиых, так и индуцированных крыс разного возраста. Следует отметить, что исходный уровень исследуемых активностей у крыс раннего неонаталъного возраста в отличие от взрослых особей достаточно низок. Введение индукторов вызывает увеличите исследуемых активностей цитохрома Р450. Так, при МХ-индукцин во всех случаях заметно усиление БП-гндрокснлазной и ЭР-О-деэтнлазной активностей. Кроме этого, у новорожденных крысят наблюдается усиление БП-гидрокснлазы и при ФБ-индукцнн, хотя оно не столь значительно, как при индукции МХ. При исследовании БФ и алдрнна, субстратов для СУР1В1, оказалось, что скорости этих реакций заметно ниже в печени неонатальных крыс. Индуцирующее действие БФ на активности в этот период развития также снижено.

Вопрос о каталитической активности исследуемых форм СУР остается до конца невыясненным, когда не известно, действительно ли СУР1А1 участвует в метаболизме БП и ЭР у новорожденных животных, а СУР2В1 - в метаболизме БФ и алдрнна. Для решения этой задачи был применен метод иншбнрования антителами. Реакции гидроксилирова-ния БП и О-деалкнлировання ЭР в микросомах печени всех исследуемых возрастов почти на 100% ннгибируготся анти-СУР1А1. Анти-СУР2В не ннгибнруют эти реакции. Аналогичные результаты получены и для других возрастов. В целом картина ингибировання не отличается

Таблица 4.

Активность мнкросомнон монооксигсназнон в печени крыс разного возраста

А К 1 И В Н О С Т И*

Индукция 3-ОН- 7-этоксн- Бензфета- Алдрин-

Возраст бензпирен- резоруфин - мпн- Эпоксидаза

(дни) гидроксилаза О-деэтилаза N.

деметнлаза

К 0,17+0,02 0,0510,01 0,510,1 0,9+0,1

3 ФБ 0,35+0,03 0,0510,01 1,510,2 1,110,1

МХ 2.50+0,05 3,7010,53 0.510,1 0,710,2

К 0,25+0,03 0,0510,01 0,610,1 1,310,2

б ФБ 0,70+0,29 0,0510,03 1,710,1 1,510,1

МХ 2,60±0,16 4,7010,33 1.010.1 0,810,

К 0,25±0,05 0,5010,02 0,910,2 1,010,3

16 ФБ 1,10±0,10 0,4010,33 1,810,3 2,110,1

МХ 3,9010,10 6,0010,50 1,010,1 0,710,1

Взрослые К 0,5010,11 0,2010,01 1,510,5 2,010,4

ФБ 0,7010,23 0,1310,08 17,010,6 5,210,8

МХ 4.5010,30 7.5010,68 1,210,2 1,510,2

* активности выражены в нмоль продукта в 1 мин намг белка. В каждый эксперимент взято по 3 помета крысят, для взрослых п=3

от взрослых. Следовательно, у новорожденных крыс, также как и у взрослых, метаболизм ЭР и БП катализируется СУР1А1. Анализ инги-бировання метаболизма БФ анти-СУР2В показал, что степень ингаби-рования зависит, от возраста: данные антитела практически не ингиби-руют эту реакцию в ФБ-микросомах печени 3-х дневных крыс, а у 6-ти и 16-ти дневных эффект достигает 10-20% . Несмотря на то, что при ФБ-нндукции происходит 2-3-х кратное увеличение скорости деметилиро-вания БФ, а в печени регистрируется СУР2В1, эффект ингибирования выражен не столь четко. Можно предположить, что другие, нежели СУР2В1, формы СУР участвуют в метаболизме БФ. Используя эти данные, можно оценить каталитическую активность исследуемых форм СУР в печени животных разного возраста. Если 100% ингибирование активности СУР антителами против определенной формы СУР принять за 100 участие ее в метаболизме, то можно рассчитать максимальную скорость реакции на количество формы СУР. Полученная при таком расчете активность может отражать число оборотов данного фермента.

Выявлены существенные различия в активности исследуемых молекулярных форм СУР. Так, в печени 6-ти, а особенно 3-х дневных крысят, в отличие от 16-ти дневных и взрослых, число оборотов СУРА1А1 в метаболизме как БП, так и ЭР чрезвычайно велико. Столь высокая активность этого СУР у крысят первой недели жизни, является качественным отличием от взрослых и отражает высокую способность новорожденного организма к метаболизму ксенобиотиков, относящихся к

классу ПАУ. Каталитическая активность СУР2В1 печени новорожденных крыс не отличается от таковой у взрослых животных.

Таблица 5.

Каталитическая активность* CYP мпкросом псчснп новорожденных к-pi.ic

Возраст (дни) Бенз[а]ппрен МХ-нндукцпя I II III 7-этоксирезо- руфин МХ-шщукцня I II III Бензфетамнн ФБ-шщукцня I II III Алдрнн ФБ-шщукцня I II III

3 2.5 6.2 116,0 3,7 9,2 184,0 1.5 4.2 10,5 1,1 3,1 3,8

б 2,6 3.5 22.5 4,7 6,4 45,7 1.7 2,6 10,5 1,5 2.3 2,3

16 3,9 4.7 9,4 6,0 7.1 14,2 1,8 1,3 7,8 2,1 1,6 1,1

Взрослые 4,5 2,6 3,3 7.0 4,1 5,8 17,0 8,1 7,3 5,0 2,3 2,5

"Активность выражена в нмоль продукта:

I - на мг белка

II - на нмоль CYP, определенного спектрально.

III - на нмоль специфической формы CYP, определенной нммунологнчески.

Таким образом, характерной особенностью неонатальных животных является высокая каталитическая активность цитохрома Р450, что можно рассматривать как адаптивную реакцию в ответ на введение чужеродных соединений. Это свойство позволяет новорожденным особям эффективно метаболизировать ксенобиотики несмотря на низкое содержание фермента.

2.3. Исследование экспрессии генов цитохромов Р4501А и 2В в печени и легких крыс, индуцированных различными ксенобиотиками

Регуляция экспрессии генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков является одним из факторов, определяющих метаболическую активацию или детокенкацнго ксенобиотиков. Цитохромы Р450 подсемейства 1А осуществляют как детоксикацшо, так и конверсию определенных химических соединении в активные канцерогены. Так как транскрипция генов этих гемопротеидов активируется ароматическими углеводородами, понимание механизмов активации генов CYP1A канцерогенами представляется важным в изучении инициирующих этапов химического канцерогенеза. В печени экспериментальных животных под воздействием таких соединении индуцируется два цитохрома Р450 -CYP1A1 и CYP1A2, различных как по структуре, так и по субстратной специфичности (Denison et al., 1995). Ферментативная активность этих гемопротеидов регулируется как на транскрипционном, так и на по-сттраскрипционном уровнях (Silver, Krauter, 1988; Fujii-Kuriyama et al., 1990). Относительно меньше известно о механизмах индукции CYP1A в

других органах, особенно в легких, которые подвергаются постоянной экспозиции различными химическими соединениями из окружающей среды, в том числе потенциальными канцерогенами, особенно из сигаретного дыма.

Исследована нндуцибельность СУР1А1 и СУР1А2 в печени и легких крыс, обработанных различными ксенобиотиками. Результаты данных экспериментов представлены в таблице 6. Видно, что скорости окисления 7-этокспрезоруфина (ЭР) и 7-метоксирезоруфина (МР) в мнкросо-мах печени и легких контрольных крыс невелики. Введение животным различных ксенобиотиков сопровождалось существенным увеличением специфических активностей этих цитохромов Р450, причем индуцирующий эффект используемых ксенобиотиков был различен. Значительное увеличение скорости О-деэтнлирования 7-ЭР (в 80-100 раз по сравнению с контролем) наблюдалось в мпкросомах печени крыс, обработанных метилхолантреном (МХ), Арохлором 1254 (Ар) и бен-зо[а]пиреном (БП). При индукции (3-нафтофлавоном (БН) и гексахлор-бензолом (ГХБ) эта активность увеличивалась лишь в 13 и 30 раз соответственно. В легких также было зарегистрировано увеличение этой скорости во время индукции крыс различными соединениями. Однако, ее значения были ниже, чем в печени и также зависели от вида индуктора. Если эффект МХ, Ар и БП на активность СУР1А1 был практически одинаков: увеличение в 180, 210 и 200 раз соответственно, то эффект БН был заметно ниже - в 16 раз больше по сравнению с контролем. Обработка животных данными индукторами сопровождалась также усилением другой активности, специфичной для цитохрома Р450 1А2 - МР-О-деметилазы. Увеличение этой активности по сравненшо с контролем было в пределах 13-30 раз в зависимости от индуктора. Максимальная МРОД активность зарегистрирована в печени животных, обработанных Ар, - 1500 пкмоль резоруфина /мин на 1мг белка и минимальное значение этой величины - 380 пкмоль резоруфина /мин на 1мг белка - в печени крыс, индуцированных БН. В легких эта активность увеличивается в гораздо меньшей степени, чем в печени. Тем не менее, при индукции Арохлором 1254 регистрируется достаточно высокая МРОД активность в легких: 350 пкмоль резоруфина /мин на 1мг белка, эффект МХ и ГХБ существенно ниже: 15,5 и 20 пкмоль резоруфина /мин на 1мг белка соответственно. В легких крыс, обработанных БН и БП, эта активность не регистрируется.

Для количественного измерения уровня экспресснруемон мРНК был использован метод гибридизации в растворе с защитой от нуклеазы, описанный Равалем с соавторами (11а\'а1 е1 а1., 1991). Использование специфических олигонуклеотидов позволило определить уровни мРНК СУР1А1 и СУР1А2 в печени и легких крыс во время индукции различными соединениями (табл.6). Как в печени, так и в легких базальный уровень этих мРНК был невелик. Введение животным исследуемых ин-

Таблица 6.

Количественным уровень мРНК СУР 1Л (в фмоль мРНК/мкг суммарной РНК) п скорости деалкнлнровлннп 7-этокси-и 7-метокснрезоруфина (в пкмоль/мнн на 1 мг белка) в печени н легких крыс, пндуцнрованных различными ксенобиотиками

Орган ПЕЧЕНЬ ЛЕГКИЕ

СУР1А 1А1 1А2 1А1 1А2

Индуктор мРНК ЭР мРНК МР МРНК ЭР мРНК МР

Контроль 1,8 + 0,7 66,5± 47,05 2,7 ± 0,8 30,0 ± 12,0 < 0,1 2,5 ± 1,0 0,20 ±0,02 0,7 + 0,2

МХ 17,5 ± 3,7 7433 ±461 4,3 ± 0,3 943 ± 117 1,0 + 0,4 445 ± 130 3.0 ±2,1 15,5 ± 1,5

Ар 52,7 ± 13,6 5200 ±812 8,6 ± 1,7 1500 ± 215 4,3 ±0.6 533 ± 154 2.3 ± 0.6 350 + 25

БН 17.3 ±4,3 1937 ± 832 8,0 ± 2,9 380 ± 246 1,7 + 0,4 39 + 13 2,1 ± 0.7 <1.0

БП 7,5 + 3.0 5074+ 147 6,9 ± 2.2 659 ± 169 0.3 ± 0,1 506 ±131 2.1 ± 0,8 <1.0

ГХБ 11,2 ±3,3 900 ± 120 1,7 ± 0,6 710 ± 220 3,6 ± 1,8 100 ± 20 0,6 ± 0,1 20 + 5

В каждый эксперимент взято по 4 крысы

дукторов сопровождалось заметным увеличением уровня мРНК в печени, что особенно заметно во время индукции Ар. В печени таких, крыс регистрируется максимальное увеличение (30 раз) уровня мРНК. Эффект других индукторов был заметно ниже: уровень мРНК увеличивался в пределах 4-10 раз. Все используемые для индукции СУР1А соединения не вызывали заметного увеличения мРНК для СУР1А2. Так, в печени крыс, обработанных МХ, Ар, БП и БН, регистрировалось лишь 1,5-х-З-х кратное увеличение СУР1А2 мРНК. В печени ГХБ-нндуцированных животных такого увеличения не происходило. Во время индукции в легких крыс, также как и в печени, было зарегистрировано увеличение количества мРНК для СУР1А1 и СУР1А2. У необработанных животных уровень мРНК для СУР1А1 ниже уровня чувствительности используемого метода. Введение им индукторов приводит к появлению СУР1А1 мРНК, хотя ее уровень ниже, чем в печени. Незначительное количество мРНК для СУР1А2 регистрируется в легких интактных крыс. Под действием индукторов ее количество увеличивалось независимо от типа используемого индуктора.

Из представленных данных следует, что природа индукции микро-сомальных СУР представляет собой еще более сложную картину, т.е. является не только тканеспецифичной, но и зависит от типа индуктора. Исследование уровня экспрессии СУР1А1 также показало значительное увеличение количества мРНК как в печени, так и в легких. Особенно заметно это увеличение в случае индукции Ар. Исключение составляет тот факт, что не столь выраженному повышению уровня мРНК СУР1А1 при индукции БП соответствует значительное возрастание каталитической активности этого цнтохрома Р450. В данном случае можно предположить участие постгранскрппционных процессов в регуляции экспрессии этого гена, включая механизмы стабилизации мРНК. Таким образом, положительная корреляция между каталитической активностью и уровнем мРНК дает основание утверждать, что индукция цнтохрома Р450 этого подсемейства обусловлена усилением транскрипции гена этого белка.

В ответ на введение индукторов мнкросомальных монооксигеназ увеличивалась активность и СУР1А2. Однако выраженного увеличения уровня мРНК для этого фермента в печени не выявлено (табл. 6). Возможно, что индукция этого щггохрома Р450, в отличие от СУР1А1, происходит за счет посттранскрнпцнонных механизмов. В легких регистрируется некоторое количество мРНК для СУР1А2, но активность этого фермента крайне низкая, а при индукции БН и БП вовсе отсутствует. Этот факт позволяет сделать вывод о посттранскрипционной супрессии щггохрома Р450 1А2 в легких.

При исследовании экспрессии СУР2В в различных органах были применены методы определения его активности в метаболизме пенток-сирезоруфина (ПР, ПРОД активность), а также Вестерн-блот-анализ. В

табл. 7 представлены результаты активности СУР2В1 в метаболизме ПР при пндукцнн различными соединениями. Введение крысам индукторов смешанного типа Ар и ГХБ, также как п ФБ, не вызывает увеличения активности ПРОД в легких и почках, хотя в печени она увеличивается почти в 50 раз.

Таблица 7.

Активность СУР2 Н1 и разных органах крыс, получавших ФБ, Лрохлор 1254 или ГХБ

Индуктор Орган Содержание ПРОД

СУР (нмоль (пкмоль в мин

на мг белка) на мг белка)

Контроль Печень 0,68± 0,15 15,0± 2,5

Легкие 0,02± 0.01 <1

Почки 0,04± 0,01 2,4± 1.3

Арохлор 1254 Печень 2,84± 0,60 306± 109

Легкие 0,12+ 0,08 3,0± 1,2

Почки 0.75± 0,10 18.0± 5.7

ФБ Печень 2,49± 0,12 80б± 233

Легкие 0,08± 0,05 <1

Почки 0,21 + 0,13 2.0+ 0.8

ГХБ Печень 1,65± 0,20 235+ 115

Легкие 0.03± 0,01 3,0± 2,0

Почки 0.63± 0.11 3.0± 1.5

В каждый эксперимент взято по 5 крыс

Рис. 1. Вестерн-блот мнкросомальных препаратов печени (1), легких (2), почек (3) крыс, индуцированных фенобарбиталом (А), Арохлором 1254 (Б), гексахлорбензолом (В), с использованием моноклоиальпых антител против СУР2В (клон 12С10).

12 3 .12 3 1 2 3

Рис. 2. Вестерн-блот мнкросомальных препаратов печени (1), легких (2), почек (3) крыс, индуцированных метнлхолантреном (А), Арохлором 1254 (Б), гексахлорбензолом (В), с использованием моноклональных антител против СУР1А (клон 14Н5).

Индукция CYP1А и CYP2B была оценена также с помощью Вестерн-блот анализа мнкросомальиых препаратов разных органов крыс. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 1, 2. Видно, что мо-ноклональные антитела 12С10 выявляют в ФБ-микросомах печени CYP2B1 и CYP2B2, тогда как в легких регистрируется лишь первый. Совсем иная картина наблюдается при индукции Ар. И в печени, и в легких регистрируются CYP2B1 и CYP2B2, а также третий, иммуноло-гическн идентичный CYP2B, но неизвестный цитохром Р450. В почках по-прежнему индуцируется лишь CYP2B1. Моноклональные антитела 14Н5 в МХ-, АР- и ГХБ-микросомах печени выявляют CYP1A1 и 1А2. Однако при введении MX в микросомах легких и почек CYP1А2 не выявлялся, тогда как Ар и ГХБ иидуцируют его синтез в микросомах этих органов.Полученные результаты свидетельствуют о том, что под воздействием индукторов как в печени, так и в легких происходит увеличение уровня мРНК для щггохромов Р450 подсемейства CYP1A. Однако, эффект исследуемых соединений на экспрессию его генов неодинаков. К аналогичном}' выводу пришли Миллер с соавт., показавшие, что БН и MX по-разному активируют гены CYP1A в печени зародышей мышей, хотя механизм этого явления остается неизвестным (Miller et al., 1989). Известно, что активация генов как CYP1A1, так и CYP1A2 осуществляется через взаимодействие факторов транскрипции с различными участками гена, так называемыми XRE (Watson, Hankinson, 1992). Можно предположить, что исследуемые ксенобиотики могут взаимодействовать с различными факторами транскрипции, что, в конечном итоге, проявляется и в специфичной активации генов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при индукции ПАУ-соединениямн (БП, MX, р-НФ) или фенобарбиталом в печени крыс регистрируется координированный синтез CYP1A1, CYP1A2 и CYP2B1, CYP2B2 соответственно. В легких и почках синхронность синтеза данных гемопротеидов нарушается. Использование в качестве индукторов соединений смешанного типа (Ар, ГХБ) изменяет распределение исследуемых форм CYP как в печени, так и легких.

2.4. Межлинейные различия в активности цитохромов Р450 1А и 2В у экспериментальных животных

Генетический полиморфизм цнтохрома Р450, как было показано в последнее время, является важным фактором, определяющим способность организма к метаболизму лекарств, ядов, канцерогенов и других ксенобиотиков, что феиоптнческн проявляется в значительной разнице ферментативной активности CYP среди индивидуумов. Вариации в активности показаны для многих семейств этого гемопротеида. Известно, что для CYP2D6 и CYP1A1 такие различия связаны с существованием мутантных аллельных вариантов генов этих ферментов. С другой стороны, изменение в активности CYP1A1, выявленное для клеточных линий карциномы молочной железы человека, связано с различиями в регуляции транскрипции этого гена (Thomsen et al., 1991). Накапливается все больше данных о том, что чувствительность к возникновению рака связана с генетически обусловленными различиями в эффективности детоксификации потенциальных канцерогенов (Thomsen et al., 1989; Edwards et al., 1991).

Для экспериментальных животных также характерны межлинейные различия в активности цнтохрома Р450. Выбранные для исследования линии крыс и мышей показали заметную разниц}' в ответе на индукцию CYP1A и CYP2B. Этот факт представляет бесспорный интерес при исследовании метаболизма канцерогенных соединений, осуществляемого цитохромами Р450 подсемейства 1А.

2.4.1 Межлинейные различия в ферментативной активности CYP2B1

и экспрессии его гена в печени крыс при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном

Для исследования межлинейных различий в ферментативной активности CYP2B1 были выбраны три линии крыс: Спрэг-Доули (СД), Бра-телборо (БЛ) и Впстар (В). В качестве индукторов были выбраны фенобарбитал (ФБ) и трифеннлдиоксан (ТФД). Несмотря на разное химическое строение и отличающиеся дозо-зависнмые эффекты, оба индуктора вызывают существенное увеличение ферментативной активности CYP2B1, которая оценивалась по скорости окисления специфичных субстратов: 1 6ß-rn;ip оксидирования андростендиона и О-деал-кнлирования 7-пентокспрезоруфпна (ПРОД).

Таблица 8.

Содержание CYF и моноокемгеназные активности микросом в печени крыс СД, БЛ н В, получавших ФБ и ТФД

Индуктор Линия Содержание ПРОД1 16Р-АД2

крыс Р450 Пкмоль/мин на имоль/мин

нмоль .4 мг1 1 мг на 1 мг белка

белка белка

Контроль сд 0,6±0,2 <0,1 0,33±0,03

БЛ 0,6±0,2 9±0,6 0,18±0,05

В 0.6+0,1 11±1 0.26+0,04

Фенобарбитал сд 1,6±0,2 822±3 3,04±0,12

БЛ 2,7±0,4 744±10 7,22±0,18

В 2.5±0.4 348±7 5,58±0.3

Трнфеннлднок- сд 0,6±0,2 120±1 1,73±0,07

сан БЛ 1 ±0,2 525±4 6,36±0,12

В 1,5±0.3 205±41 6,60±0,08

В каждый эксперимент взято по 5-7 крыс для ПРОД Р < 0,05; для 16Р-АД Р< 0,01.

В таблице 8 представлены данные о содержании общего количества CYP, определенного спектрально , а также результаты определения активностей CYP2B1 в печени крыс линии СД, БЛ и В, получавших ФБ и ТФД. Введение животным исследуемых индукторов сопровождается увеличением как общего количества CYP, так и ПРОД и 16р-АД активностей, которые различались в исследуемых линиях. В печени крыс В, индуцированных ФБ, активность ПРОД в 2,5 раза ниже, чем у линий СД и БЛ, где она была практически одинакова. Различия в уровнях индуцируемой ПРОД активности также наблюдались при индукции крыс ТФД. Максимальное значение этой величины было зарегистрировано у крыс БЛ: 525 пкмоль резоруфина/мин/мг белка, а у В и СД крыс она составляла - 205 и 120 пкмоль резоруфина/мин/мг белка - соответственно. У крыс В и СД, обработанных ФБ или ТФД, уровень активности 16^-АД не различался, а у крыс СД она была почти в 2 раза ниже при индукции ФБ и в 3-4 раза ниже при воздействии ТФД. Таким образом, зарегистрированы количественные межлннейные различия в ферментативной активности CYP2B1 в печени крыс. Возможной причиной описываемого явления может быть неодинаковая экспрессия гена CYP2B1 под действием различных индукторов. Был оценен уровень содержания мРНК для CYP2B1 в печени крыс исследуемых линий в те же временные интервалы после введения индукторов, в которые измерялась соответствующая ферментативная активность. Для этого взяты специфические синтетические олигонуклеотиды, способные различать мРНК CYP2B1 (олигонуклеотнд "Ь") и CYP2B2 (олигонуклеотид "е"). В качестве кон-

троля экспериментов по гибридизации был взят ген (3-актина, экспрессия которого не зависела от типа используемого индуктора.

1234357 8

Ж" ■ я* Жь

в

Рис. 3. Гибридизация мРНК из печени крыс исследуемых линий с 32Р-меченным клопом "Ь" II "с": Л - контрольные животные: 1- зонд "Ь", 2 - препараты РНК нз печени крыс линии В + зонд "Ь", 3 - В + "е", 4- СД + "Ь", 5 - СД+ "е", 6 - БЛ + "Ь", 7 - БЛ + "с", 8 -зонд "с". Представлены данные одного нз трех экспериментов.

Б. Индукция ФБ: 1- зонд "Ь", 2 - препараты РНК из печени крыс линии БЛ + зонд "!)", 3 - БЛ + "с", 4- В + "Ь", 5 - В+ "е", б - СД + "Ь", 7 - СД + "е", 8 - зонд "е". Представлены данные одного из трех экспериментов.

В. Индукция ТФД: 1- зонд "Ь", 2 - препараты РНК ш печени крыс липни СД + зонд "Ь", 3 - СД + "е", 4- В + "Ь", 5 - В+ "е", 6 - БЛ + "Ь", 7 - БЛ + "с", 8 - зонд "с". Представлены данные одного нз трех экспериментов.

Известно, что в печены контрольных крыс ген СУР2В2 экспресснру-ется конститутивно, а СУР2В1 транскрипционно неактивен (\Уахтап, А/агоП", 1992). Как видно из рис. 3 (А), при инкубации РНК из печени контрольных животных с олигонуклеотидом "Ь "с последующей обработкой 81 нуклеазой отсутствует сигнал гибридизации, в то время как при использовании олигонуклеотпда "е" такой сигнал наблюдается. Это согласуется с литературными данными и свидетельствует о достаточной специфичности данного метода для оценки уровней мРНК СУР2В1.

На рис. 3 (Б, В) представлены результаты гибридизации суммарной РНК, выделенной из крыс трех линий, индуцированных ФБ и ТФД, с мечеными а-[32Р] олнгонуклеотидами "Ь" и "е". В ответ на введение индукторов происходит увеличение количества мРНК СУР2В1 и СУР2В2 у крыс всех исследуемых линий по сравнению с контролем. При индукции ФБ наибольшее количество мРНК СУР2В1 зарегистрировано для линии СД, наименьшее - для В.

Таблица 9.

Содержание мРНК СУР2В1 и СУР2В2 в печени крыс линии СД, БЛ, В, обработанных ФБ п ТФД (выражено в условных единицах). К - контрольные животные, получавшие 0,9% раствор №С1 пли растительное масло

Внстар Спрэг-Доули Брэтелборо

К ФБ ТФД К ФБ ТФД К ФБ ТФД

МРНК СУР2В1 Н.о." 250±10 400±Б Н.о 480±7 425110 Н.о 29516 450+4

МРНК СУР2В2 15+1 45±10 20+Ю 12±4 45±2 25±3 11 ±4 40110 23+4

*не определяется

У животных, обработанных ТФД, наибольшее значение мРНК СУР2В1 наблюдается в препаратах из печени крыс БЛ, а минимальное значение - у линий В. В таблице 9 приведены результаты определения содержания мРНК СУР2В1 и СУР2В2. Видно, что при индукции ТФД наиболее высокий уровень мРНК СУР2В1 наблюдается у крыс БЛ, что соответствует высоким как ПРОД, так и 160-АД активностям. При индукции ФБ положительная корреляция иабшодается только между уровнем мРНК СУР2В1 и ПРОД активностью. Так, у крыс лшши В наблюдается наименьшая активность ПРОД и наименьший уровень мРНК СУР2В1, н наоборот, у СД крыс зарегистрировано наибольшее содержание мРНК СУР2В1 и высокая активность фермента. В случае 16р-АД активности такой корреляции не наблюдается.

Таким образом, крысы линии Спрэг-Доули, Брэтелборо, Внстар, обработанные фенобарбиталом или трифеннлдиоксаном, с различной эффективностью окисляют специфичные для СУР2В1 субстраты - ПР и АД. Для данных шшш обнаружен неодинаковый уровень накопления соответствующей мРНК, что свидетельствует о различиях в экспрессии гена СУР2В1. При проведении сравнительного анализа ферментатнв-

ной активности и количества мРНК CYP2B1 выявлена положительная корреляция между этими параметрами (табл.8, 9). Тогда различная транскрипционная активность гена CYP2B1 при индукции фенобарбиталом н трифеннлдпоксаном может быть одной из причин межлинейных различий в ферментативной активности цитохрома Р450 2В1 в печени крыс. Так как ФБ и ТФД активируют транскрипцию обоих генов подсемейства CYP2B, то изменения, произошедшие в регуляции транскрипции гена CYP2B1, могу г не затрагивать ген CYP2B2, экспрессия которого не зависела от линии животного.

2.4.2. Активность и индуцибельность Сур1а в печени мышей инбредных линий

Инбредные линии мышей являются удобной моделью для изучения индуцнбельностн цитохрома Р4501А подсемейства, так как они генетически различаются по чувствительности к индукции ПАУ-соединениями (Nebert, 1989). Эти различия напрямую связаны с Ali-рецептором, который может быть дефектным, и индукции не происходит. Инбредные лиши мышей различаются также по чувствительности к канцерогенному действию многих химических соединений. Этот факт связывают с пндуцпбелыюстыо той формы цитохрома Р4501А, которая активирует исследуемый канцероген.

В описываемых экспериментах изучалась активность и индуцибельность цитохрома Р450 подсемейства la (Cypla) - осуществляющего первичное окисление аминоазокраснтелен в печени мышей-самцов четырех инбредных линий. Данные о базалыюм н индуцированном уровнях содержания цитохрома Р450 и активности 7-этоксирезоруфин О-деэтилазы (ЭРОД) и 7-метокснрезоруфин О-деметнлазы (МРОД) в печени изученных линий представлены в табл. 10. Видно, что мыши линий SWR и AKR имеют относительно низкие и не увеличивающиеся при воздействии индукторами уровни содержания цитохрома Р450 и активности ЭРОД и МРОД. При значительно более высоком базалыюм уровне цитохрома Р450 (на 30-70%) у СЗНА и CC57BR мышей его содержание после воздействия индукторов увеличивалось в 1,5-2 раза. В еще большей степени (в 5-10 раз) у них увеличивались ЭРОД и МРОД активности. Линии SWR и AKR, таким образом, непндуцпбельны, а СЗНА и CC57BR - нндуцнбельны по Ah-локусу.

Таблица 10.

Содержание н активность цитохрома F4S0 в печени ппбредных лшнш мышей, индуцированных бензоппреном (БП) и о-амипоазотолуолом (ОАТ)

Линия мышей Обработка Содержание Р450 (нмоль/мгбелка) * ЭРОД | МРОД

пкмоль резоруфнна/мин/нмоль Р450

СЗНА Контроль 0.8± 0.05 105130 82111

БП 1.2± 0.15(1.50)* 10601205 (10.09)* 6081151 (7.41)*

ОАТ 1.410.22(1.75)* 7161119 (6.81)* 515198 (6.28)*

SWR Контроль 0.4710.04 1261 25 1091 15

БП 0.4510.03 (0.96)* 173130(1.37)* 148122 (1.36)*

ОАТ 0.4210.08 (0.90)* 1781 19(1.41)* 165130 (1.51)*

AKR Контроль 0.610.04 89125 100119

БП 0.5810.10 (0.98)* 75128 (0.85)* 115114(1.15)*

ОАТ 0.5510.12 (0.92)* 69115 (0.66)* 125121 (1.25)*

CC57BR Контроль 0.7810.01 186182 261152

БП 1.5010.07 (1.93)* 1178154 (6.33)* 14191115 (5.43)*

ОАТ 1.3610.04(1.74)* 23901152 (12.84)* 26851205 (10.28)*

Результаты представлены как среднее значение ±80. В каждый эксперимент взято 8 мышей. * Индекс индуцнбелыюстп

Количественные различия в активности CYPla печени мышей были выявлены также в экспериментах, с длительным введением канцерогена. Была исследована активность этого цитохрома Р450 в печени СБА мышей при длительном и многократном введении ОАТ. Для сравнения была выбрана линия CC57BR, резистентная как к гепатотокенчному, так н гепатоканцерогенному действию этого соединения. Выбранные для исследования CC57BR и СВА линии мышей, как известно, характеризуются AlibAhb генотипом чувствительности к индукции полициклическими ароматическими углеводородами (Nebert, 1989), но различаются по чувствительности к гепатоканцерогенпому действию ОАТ (Каледин и др., 1990). Введение им канцерогенных соединений, способных связываться с All-рецептором и вызывать тем самым индукцию цитохрома Р450 1а, сопровождается значительным усилением ЭРОД и МРОД активности этого цитохрома Р450. Однократное введение гепа-токанцерогена ОАТ сопровождается индукцией Сур 1а в печени как CC57BR, так и СВА мышей (табл.11).

Следует заметить, что базальная активность CYPla для данных линий существенно не различается. Введение канцерогена CC57BR мышам, независимо от схемы, сопровождалось практически одинаковым увеличением активностей ЭРОД и МРОД Сур 1а: в 9,8 и 5,2 раз при однократном и 8 и 5,6 раз при многократном способах введения. В печени

СВА мышей, получавших канцероген один раз, регистрируется незначительное увеличение содержания общего цнтохрома Р450, определенного спектрально, н некоторое увеличение специфических активностей Сур 1а ЭРОД И МРОД в 3,7 и 1,8 раз соответственно. Однако, многократное длительное введение ОАТ существенно повлияло на эти активности: они увеличились в 22 и 8 раз для активностей ЭРОД и МРОД соответственно.

Таблица 11.

Содержание и активность цнтохрома Р450 в печени СВА п CC57BR мышей по время одноразовой и длительной индукции ОАТ

Линия Воздействие Содержание цнтохрома Р450 нмоль/мг белка О - деалкилазная активность (пкмоль резоруфина в мин. на мг белка) ЭРОД МРОД

СВА К обычно 0,60+0,12 183+40 406±145

ОАТ 1-кратно 1,11 ±0,08 677±136 720±65

К длительно 0,56±0,06 122+10 298±32

ОАТ многократно 1,30±0,08 2725±295 2466+412

CC57BR К обычно 0,50±0,02 222+41 448±32

ОАТ 1-кратно 1,1б±0,15 2177+153 2325±110

К длительно 0,45±0,13 252+55 434±49

ОАТ многократно 1,18±0,05 2019±197 2426±453

В каадый эксперимент взято по 5 мышей.

Таким образом, из приведенных результатов следует, что линии лабораторных животных различаются по активности и индуцибельности молекулярных форм цнтохрома Р450. В основе этих различий лежат генетические факторы, определяющие ответ животных на индукторы мшфосомальных монооксигеназ.

2.5. Регуляция экспрессии гена СУР2В индукторами ФБ-типа

2.5.1. Исследование взаимодействия позитивного и негативного цис-активных элементов гена СУР2В с ядерными белками печени крыс в разное время после введения им индукторов

При нсследовашш механизмов активации генов CYP2B достаточно большой прогресс был достигнут в исследовании цис-активных элементов, как в днстальных, так и в проксимальных районах 5'фланкируюгцей области генов СУР2В. В районе -199/-45, названном группой Падманабана минимальным промотором (РгаЫш е! а1., 1995), выявлены два участка, с которыми связываются факторы транскрипции. По своим функциям эти участки получили названия: негативный (-160/-127) и позитивный (-89Л56) регуляторные элементы, НЭ и ПЭ соответственно. В состав ПЭ входит последовательность -89/-73, названная Барби-бокс, встречающаяся у большинства прокариот и эукариот

(He, Fulco, 1991). Роль этих элементов в ФБ-зависимой активации транскрипции гена CYP2B считается доказанной (Ram et al., 1995; Hankokoski, Negishi, 1998). Однако данных о том, как они работают во времени, когда ген активно транскрибируется, не представлено. С другой стороны, не выяснен механизм индуктор-специфичной активации генов CYP2B. Для решения этих вопросов были проведены эксперименты по исследованию взаимодействия участков минимального промотора гена CYP2B с белками ядерных экстрактов изолированных из печени крыс в разное время после введения индукторов.

I 2 3 4 5 (I " Я 9 10 Н 12

Рис. 4. Радиоавтограф задержки в геле 32Р-меченного НЭ, инкубированного с белками ядерных экстрактов из печени контрольных н индуццроаанных ФБ животных

32Р-меченный НЭ присутствует во всех дорожках. К - белки ядерного экстракта, выделенные из печени ненндуцнрованных крыс. ИН - белки ядерного экстракта, выделенные из печени индуцированных крыс. Реакцию инкубации проводили 40 минут при комнатной температуре.

1 дорожка - 32Р-меченный НЭ; 2,11 дорожки - К; 3 - ИНб (цифрой обозначено время от начало введения индуктора); 4 - ИШ. 5 - ИН|з; 6 - ИНг* ; 7 - ИШз ; 8 дорожка -ИН56; 9 - ИНб4 ; 10 - ИН72 ; 12 - К + 100-кратный молярный избыток "холодной" ДНК, соответствующей НЭ гена СУР2В2.

При инкубации белков ядерного экстракта из печени контрольных животных с НЭ регистрируется один комплекс, который соответствует комплексу III, полученному другими исследователями в аналогичных экспериментальных условиях (РгаЫш е1 а1., 1995). На рис. 4 приведены данные анализа задержки ДНК в геле с использованием белковых ядерных экстрактов, полученных в разное время от начала введения крысам индуктора: 6, 9, 18, 24, 48, и 72 часа. Видно, что во всех случаях регистрируется один ДНК-белковый комплекс, причем его интенсивность зависит от того, в какой момент времени после введения индуктора были

получены белковые ядерные экстракты. Радиоавтографы этих экспериментов были денситометрнрованы, и полученные данные представлены в виде диаграмм зависимости интенсивности сигнала от времени. Так как речь идет об изучении индукции, представляется целесообразным сравнивать сигнал ретардации, полученный для ядерных белков нз печени индуцированных животных, с сигналом, полученным для контрольных ядерных белков, а интенсивность последнего принять за 100 %. Анализируя денситограммы, можно видеть, что в начальной точке исследуемой временной шкалы (6 часов после введения индуктора) регистрируется сигнал с низкой интенсивностью связывания, который, продолжая быть низким к 9 часам, постепенно усиливается и достигает максимального значения к 48 часам (рнс.5). Интенсивность радиоактивного сигнала с комплекса снижается после 48 часов и достигает к 72 часам уровня, сравнимого с контрольным. Аналогичные эксперименты были проведены с использованием белковых ядерных экстрактов из печени крыс, индуцированных ТФД (данные не приведены). В этом случае интенсивность сигнала в исследуемые промежутки времени совпадает с таковой для индукции ФБ. Таким образом, при формировании ДНК-белковых комплексов не выявлено зависимости от применяемых индукторов.

время после введения ФБ

Рис. 5. Зависимость iiiitciiciibhoctii сигнала связывания згР-меченного НЭ с белками ядерного экстракта, выделенными нз клеток печепп индуцированных ФБ крыс, от времени введения индуктора

По вертикали отражена интенсивность сигнала связывания 32Р-меченного НЭ с белками ядерного экстракта, выделенными нз печени индуцированных крыс (% от контроля). Денситометрическое значение интенсивности сигнала гибридизации 32Р-меченного НЭ с белками ядерного экстракта, выделенными из печени неиндуцнрованных крыс, соответствует 100%. Цифрами по горизонтали обозначено время от начала введения ФБ (в часах).

При исследовании взаимодействия Барби-бокса с белками ядерных экстрактов, полученных в разное время от введения индуктора, выявлено, что интенсивность радиоактивного сигнала комплексов II и III воз-

растает синхронно (рис.6,7). Максимальный сигнал для ядерных экстрактов регистрируется через 18 часов после введения ТФД или ФБ, после этого происходит постепенное снижение и к 72 часам он достигает контрольного уровня.

1 2 3 4 5 6 7 К 9 10

Рис. 6. Радиоавтограф задержки в геле 32Р-меченного Барбп-бокса, инкубированного с белками ядерных экстрактов из печени контрольных н индуцированных ФБ или ТФД животных

32Р-меченный Барби-бокс присутствует во всех дорожках. К - белкн ядерного экстракта, выделенные из печени неиндуцированных крыс. ИН - белки ядерного экстракта, выделенные из печени индуцированных крыс. Реакцию инкубации проводили 40 минут при комнатной температуре.

1 дорожка - 32Р-меченнын Барби-бокс, 2,9 - К, 3 дорожка - ИН|8фб (цифрой обозначено время от начало введения нндуктора, буквами - сокращенное название соответственного индуктора); 4 - ИШзфб; 5 - ИН72ФБ; 6 - ИН18ТФД; 7 - ИШзтфд ; 8 - ИН72ТФД;; 10 - К + 100-кратный молярный избыток "холодной" ДНК (Барби-бокс)..

Полученные результаты показали, что при инкубации НЕ с белками ядерных экстрактов, полученных из печени контрольных крыс, регистрируется один комплекс, тогда как с Барби-боксом - два комплекса (рис.4, 6). Данная ситуация соответствует, согласно результатам Прабху с соавт. (РгаЫш Ы а1, 1995), базальной транскрипции гена СУР2В. Инкубация исследуемых цис-активных элементов с ядерными белками из индуцированной печени принципиально не изменила картину ретардации: количество образовавшихся комплексов было таким же, как при инкубации с белками из контрольной печени. Однако интенсивность радиоактивного сигнала регистрируемых при индукции комплексов

заметно менялась. Так, инкубация НЭ с белками ядерных экстрактов, полученных из печени крыс через 6 и 9 часов после введения животным ТФД или ФБ, отчетливо свидетельствует о снижении интенсивности сигнала с ДНК-белковых комплексов, что, казалось бы, соответствует природе негативной регуляции - удалению белков-репрессоров с одного из участков регуляторной области гена. Достаточно неожиданным оказался факт выраженного усиления интенсивности связывания НЭ с ядерными белками, выделенными через 18 часов от начала индукции. Следует заметить, что такое усиление отмечено для длительного временного интервала: с 18 до 56 часов от введения индуктора. Объяснение этого факта требует дальнейших экспериментальных исследований, связанных с выяснением природы белковых факторов транскрипции. Тем не менее, можно утверждать, что мы имеем дело не с типичным элементом негативной регуляции, а скорее с составной частью единого позитивного элемента промоторной области гена СУР2В. Что касается взаимодействия ядерных белков с Барби-боксом, то в исследуемом интервале времени наблюдается постепенное усилите сигнала ретардации с 18 до 48 часов и последующее возвращение интенсивности сигнала до контрольного уровня к 72 часам (рис.6).

450 400 350 300 250 2 00 1 50 1 00 50

□ ф б

□ тф д

время после введения индуктора

время после введени

Рис. 7. Временная зависимость интенсивности сигнала связывания 32Р-мсчепного Барон-бокса с белками ядерного экстракта, выделенными из печени крыс, индуцированных ФБ пли ТФД.

По вертикали изображена интенсивность сигнала связывания 32Р-меченного Барби-бокса с белками ядерного экстракта, выделенными из печени индуцированных крыс (% от контроля). Денситомегрическое значение интенсивности сигнала для белков ядерного экстракта, выделенных из печени ненндуцнрованных крыс, соответствует 100%. Цифрами по горизонтали обозначено время от начала введения индуктора (в часах). А. Диаграмма для комплекса II; Б. Диаграмма для комплекса III.

Динамика интенсивности связывания ПЕ и НЕ с ядерными белками в первые 18 часов действия индукторов совпадает с таковой, полученной в других исследованиях (Не and Fulko, 1991; Upadhya et al., 1992). Усиление интенсивности связывания ДНК с белками ядерных экстрак-

тов из печени индуцированных крыс с большой степенью вероятности может говорить об увеличении содержания активированных факторов транскрипции, причем этот процесс происходит при активно транскрибируемом гене в течение достаточно длительного времени: с 18 до 72 часов. Однако, сказать, имеется ли между этими двумя событиями причинно-следственная связь, пока не представляется возможным, как и остается неисследованным поведение дисгальных энхансерных элементов во времени. Увеличение интенсивности связывания Барби-бокса с факторами транскрипции в этот период коррелирует с увеличением количества мРНК. Этот факт дает основание предполагать, что регистрируемые комплексы могут являться составными элементами транскрипционных комплексов. Следует заметить, что как при ФБ-, так и при ТФД-индукции динамика взаимодействия ПЕ и НЕ с ядерными белками была одинаковой.

2.5.2. Исследование взаимодействия позитивного элемента транскрипции гена CYP2B2 с ядерными белками печени крыс при добавлении индукторов в системе in vitro

Для исследования индуктор-специфичной активации гена цнтохрома Р450 2В были проведены эксперименты, в которых регистрация ДНК-белковых комплексов осуществлялась в системе, содержащей Барби-бокс, ядерные белки из печени неиндуцированных крыс и индуктор. Результаты таких экспериментов приведены на рис. 8.

N3 N2

М

III II

! 2 3 4 5 й 7 9 18 II 1: П

Рис. 8. Радиоавтограф задержки в геле 32Р-меченного Барби-бокса и белков ядерных экстрактов, выделенных из печени контрольных н индуцированных животных.

з:Р-меченный Барби-бокс присутствует во всех дорожках. К - белки ядерного экстракта, выделенные из печени неиндуцированных крыс. ИН — белки ядерного экстракта, выделенные из печени индуцированных крыс. Реакцию инкубации проводили 120 минут при комнатной температуре.

1,13 дорожки - з:Р-меченный Барбн-бокс (32Р Барби-бокс); 2 дорожка - К + ТФД; 3 дорожка - ИНбТФД (цифрой обозначено время от начало пведення индуктора, буквами -сокращенное название соответственного индуктора) + ТФД; 4 дорожка - ПНитФД +ТФД; 5 дорожка - 11Н)зтфд+ТФД; 6 дорожка - ИН72ТФД+ТФД; 7 дорожка-К + ФБ; 8 дорожка -ИНбФБ +ФБ; 9 дорожка - ИН18ФБ +ФБ; 10 дорожка - ПШзфб +ФБ; 11 дорожка - пн72фб +ФБ; 12 дорожка-ИНбТФД+БП.

Под поз действием фенобарбитала взаимодействие белков ядерного экстракта с Барбн-боксом сопровождается образованием двух комплексов ретардации, соответствующих по своей электрофоретпческой подвижности комплексам II и III, а также приводит к появлешпо новой полосы ретардации, которая обладает более низкой электрофоретпческой подвижностью по сравнению с идентифицированными ранее комплексами II и III (Рис. 8, дорожка 7). Аналогичные эксперименты были проведены с ТФД. Следует заметить, что эксперименты, проводимые с 32Р Барбн-боксом, осуществляли при 30-мннутной инкубации. При увеличении времени инкубации 32Р-меченного Барби-бокса с ядерными белками до двух часов было зарегистрировано два новых комплекса, обозначенных как N11 и NIII (рис. 9, дорожка 2). Надо отметить, что при добавлении ФБ образования комплексов N11 п NIII не происходит (рис. 8, дорожка 7). Данные комплексы образуются лишь при добавлении ТФД к контрольным ядерным белкам, тогда как при инкубации ПЕ с ядерными белками из печени индуцированных крыс их образования не происходит (рис. 8, дорожки 4-6, 8-10). Комплекс N1 регистрируется как при ФБ-, так и при ТФД-индукщш, тогда как N11 и NIII специфичны лишь для ТФД. Все три новых комплекса являются короткоживущнми и исчезают после 9-ти часовой инкубации.

Таким образом, специфичность действия ТФД и ФБ на транскрипцию генов CYP2B осуществляется на уровне взаимодействия регуля-торных элементов гена с ДНК. Эксперименты по задержке ДНК в геле могут свидетельствовать в пользу этого утверждения. При увеличении времени шжубацип регуляторных элементов с ядерными белками с 30 мин до 2-х часов ТФД инициирует образование 5-ти ДНК-белковых комплексов, тогда как добавление ФБ сопровождается образованием лишь 3-х комплексов (рис. 9). Эти результаты могут указывать на различные механизмы действия этих соединений. В пользу этого предположения могут также говорить выявленные различия в активности CYP2B1 п экспрессии его гена.

2.6. Альтернативный сплайсинг мРНК цитохрома Р450 2В2 в печени крыс

Известно, что такие соединения, как фенобарбитал (ФБ), Арохлор 1254 (Ар), пиридин (ПИ) активируют транскрипцию двух генов семейства CYP2B - CYP2B1 и CYP2B2 (Nims et al., 1993; Kim et al., 1991).

N1

N2

N3

Экзон 5 ,Интрон5, Экзон6 128 п.н. ■ 142 п.н. |

' 0.6 т.п.н. '

Интрон 6, Экзон 7 3' ■ 144 п.н. ^ 1.6 т.п.н. '

Ориентация праймеров 1, 2 и 3 относительно нуклеотидной последовательности гена СУР2В2. Тонкие линии соответствует экзонам, толстые - интро-нам, стрелки - праймерам. Направление стрелок показывает ориентацию от 5' к 3'-концу.

Рис. 9

С помощью ПЦР продуктов обратной транскрипции мРНК СУР2В2 была исследована возможность появления альтернативных вариантов мРНК СУР2В2 в печени крыс Вистар, обработанных традиционным индуктором ФБ, а также ПИ и Ар. Альтернативный вариант мРНК, содержащий первые 24 нуклеотида 5-го нитрона выявляли с ипользова-ннем трех, олигонуклеотидов, позволяющих различать два варианта мРНК СУР2В2 (рис. 10).

с- !

-', .'. п.н.

' . " • . -620

-527

-217 -201

..................................'щи'!!" ............ЧИП 1>-г|ГI- 1ТПИ1М1П-.1 ■ 1-ггг-пт—ГГ|-И--? г--1-'Г'г-гГ —'

ПИ ФБ К М ПИ ФБ К | / II ' \

Рис. 10. Электрофоретическнн анализ в 2%-ом агарозном геле продуктов ПЦР с парами праймеров N2-N3 (I) н Nl-N3 (II), полученных на матрице кДНК печени ш ггактпых крыс (К), а также обработанных ПН, ФБ крыс. М - маркер длины фрагментов ДНК - \lspl-гидролизат ДНК рВ11322.

Из печени интактных и обработанных ФБ, ПИ и АР крыс была выделена суммарная РНК, которая служила матрицей для синтеза кДНК. Результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР, полученных на матрице кДНК печени контрольных н ФБ-, ПИ-обработанных крыс, представлены на рис. 10. При использовании пары праймеров N2-N3 должен амплифицироваться фрагмент кДНК альтернативного варианта мРНК. Этот фрагмент обнаружен как в контрольных препаратах печени, так и в печени обработанных ксенобиотиками животных (результаты, полученные при индукции Ар на рис. 10 не представлены). Пара праймеров ТЧЬЫЗ обеспечивает амплификацию кДНК обоих вариантов мРНК в случае всех исследованных препаратов печени. Таким образом, альтернативная форма мРНК СУР2В2 появляется независимо от наличия индукторов.

Таким образом, в печени крыс, наряду с индуцированными цито-хромамн Р4502В подсемейства регистрируется альтернативный вариант мРНК, который, возможно, вносит вклад в разнообразие форм ферментов этого подсемейства. Появление альтернативного варианта мРНК не зависит от применения индукторов. Пока трудно судить о том, транслируется ли с данной мРНК каталитически активная форма СУР2В. Результаты нммуноблотинга, представленные на рис. 1, показали, что появление нового варианта СУР2В2 коррелирует с воздействием определенных индукторов, тогда как альтернативный вариант мРНК обнаруживается в печени как интактных, так и индуцированных крыс. Тем не менее, нельзя исключить возможность того, что под действием индукторов происходит избирательная трансляция различных форм мРНК. Другие исследователи также обнаруживали альтернативные варианты мРНК СУР2В н цитохромов Р450 других подсемейств. Показано, что в печени крыс образуются два типа мРНК СУР2В1, одна из которых в результате альтернативного сплайсинга утрачивает гем-связывающую последовательность, и, следовательно, не может функционировать как моноокснгеназа (Кип и га й а1., 1989). Авторы предположили, что этот белок, связывая субстрат, может выполнять роль рецептора, регулируя концентрацию субстрата.

ВЫВОДЫ

1. Проведена идентификация и дана характеристика цитохромов Р450 подсемейств 1 А, 2В, 2С, 2А и ЗА для крыс линии Вистар.

2. Выявлены функциональные особенности цнтохрома Р450 печени новорожденных животных в сравнении с взрослыми особями.

- Ответ крыс раннего неонатального возраста на индукцию метилхо-лантреном сопровождается незначительным увеличением количества СУР1А1, но многократным увеличением его удельной активности в метаболизме бензпнрена и 7-этоксирезоруфина.

- При индукции неонатальных крыс фенобарбиталом количество CYP2B увеличивается незначительно, его удельная активность сравнима с таковой у взрослых.

3. Изучена псанеспецифичная экспрессия генов CYP1A и CYP2B, зависимая от типа применяемого индуктора.

- При введении крысам фенобарбитала или гексахлорбензола в печени индуцируются CYP2B1 и CYP2B2, тогда как в легких - лишь первый из них.

- Впервые описана индукция белка цитохрома Р450 подсемейства 2В (CYP2Bx) в легких и печени крыс, обработанных Арохлором 1254.

- Сопоставление уровней мРНК CYP1A в печени и легких индуцированных различными соединениями крыс с результатами ферментативной активности в отношении модельных субстратов позволяет сделать выбор между транскрипционным (CYP1A1) и посттранскрипционным (CYP1A2) механизмами его индукции.

4. Показаны межлинейные различия в активности CYP1A и CYP2B печени крыс и мышей, подвергавшихся действию индукторов.

5. Выявлена зависимая от времени введения индукторов фенобарбиталов ого типа экспрессия гена CYP2B в печени различных линий крыс.

6. В печени крыс, помимо мРНК для CYP2B1 и CYP2B2, впервые зарегистрирован альтернативно сплайсированный вариант мРНК, появление которого не зависит от типа применяемого индуктора.

7. Показано, что максимальный уровень экспрессии гена CYP2B при индукции крыс фенобарбиталом и трифенидцноксаном не совпадает по времени.

8. Установлено, что зависимая от индуктора экспрессия CYP2B регулируется на стадии образования комплекса позитивного элемента гена с ядерными белками.

- Трифенилдиоксан в системе in vitro инициирует образование пяти ДНК-белковых комплексов, тогда как фенобарбитал приводит к образованию лишь трех комплексов. Некоторые из этих комплексов описаны впервые.

- Интенсивность связывания позитивного элемента (Барби-бокса) с ядерными белками при индукции крыс трнфенилдиоксаном или фенобарбиталом имеет сходную динамику.

9. Предложена новая схема негативной регуляции экспрессии гена CYP2B2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Woldman Ya.Yu., Weiner L.M., Gulyaeva L.F. Lyakhovich V.V.H-NMR study of the interaction of aminopyrine with purified rat liver microsomal cytochrome P450 // FEBS Letters -1985, V. 181, P. 195 - 199.

2. Гуляева Л.Ф., Мшшш В.М., Ляхович В.В. Исследование индукции форм цитохрома Р-450 микросом печени крыс раннего неонаталъного возраста при введешш фенобарбитала и 3-метилхолантрена // Биохимия - 1985, Т. 50, С. 1817 - 1824.

3. Gulyaeva L.F., Mishin V.M., Lyakhovich V.V. Induction and catalytic activities of cytochromes Р450ь,е and P450cin the liver microsomes of neonatal rats // Int. J. Biochem. - 1986, V. 18, P. 4 - 15.

4. Woldman Ya.Yu., Weiner L.M., Gulyaeva L.F. Lyakhovich V.V. NMR-study of the interaction of P450 with 4-methoxypyridine // FEBS Letters - 1987, V. 212, P. 53 - 57.

5. Цырлов И.Б., Полякова H.E., Гуляева Л.Ф. Содержание и активность молекулярных форм монооксигеназы Р-450в и Р-450с при их раздельной и последовательной индукции в печени // Биохимия - 1987, Т. 52, С. 607-614.

6. Герасимов К.Е., Гуляева Л.Ф., Мишин В.М., Цырлов И.Б. Множественные формы цитохрома Р-450. Характеристика изолированной аминопирин-М-деметилазы // Биохимия - 1988, Т. 53, С. 3-10.

7. Вайнер Л.М., Вольдман Я.Ю., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В. Изучение взаимодействия субстратов с цитохромом Р-450 методом УФ и 'Н-ЯМР-спектроскопин // Биоорг. химия - 1989, Т. 15, С. 1044-1055

8. Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю., Мишин В.М., Ляхович В.В., Колева М., Стойчев Ц. Индукция форм цитохрома Р-450 при длительном введешш нифедипина // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1990, N 2, С. 148 - 150.

9. Вавилин В.А., Гришанова А.Ю., Гуляева Л.Ф., Мишин В.М., Ляхович В.В. Метаболизм теофиллина микросомнымн моноокснгеназамн печени крыс // Биохимия - 1990, Т. 55, С. 1786 -1793.

10. Фанбушевич А.А., Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю., Мишин В.М., Ляхович В.В. Метаболизм дназепама множественными формами цитохрома Р-450 микросом печени крыс // Биохимия - 1990, Т. 55, С. 1210-1215.

11. Хаценко О.Г., Мишин В.М., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В Оценка каталитической активности множественных форм цитохрома Р450 в микросомах печени крыс линии Вистар по метаболизму андростендиона // Биохимия - 1990, Т. 55, С. 308 -313.

12. Khatsenko O.G., Gulyaeva L.F., Mishin V.M., Lyakhovich V.V. Dynamics of androstenedione metabolite formation in rat liver microsomes during temporal phenobarbital induction // Сотр. Biochem. Physiol - 1991, V.99C, P. 257 - 261.

13. Koleva M., Stoytchev Ts., Gulyaeva L.F., Grishanova A., Mishin V. M..Lyakhovich V.V. Induction of cytochrome P-450 isozymes upon repeated administration of nifedipine // J. Drug Metab. Pharm. - 1991, V. 16, P. 103 -106

14. Золотарева Т. А., Горчакова Г. А., Коноваленко В.Л., Коноваленко Л.Н., Гришанова А.Ю., Гуляева Л.Ф., Мишин В.М., Ляхович В.В. Активность цитохромов Р-450Р и P-450h микросом печени и уровень кортикостероидов в крови экспериментальных животных в условиях воздействия физическими факторами // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1992, Т. 63, С. 498-500.

15. Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю., Громова O.A., Слынько Н.М., Вавнлин В.А., Ляхович В.В. Микросомная монооксигеназная система в биомониторинге окружающей среды // Аналитический обзор, типография ГПНТБ СО РАН, г. Новосибирск, 1994. - 104 С.

16. Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю., Ляхович В.В. Индукция цитохромов Р4501А и 2В в разных органах крыс, получавших гексахлорбензол и Арохлор 1254//Биохимия - 1994, Т. 59, С. 531-536.

17. Мезенцев А.Н., Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю., Коваленко С.П., Ляхович В.В. Альтернативный сплайсинг мРНК цитохрома Р450 2В2 в печени крыс // Мол. биол.- 1997, Т. 31, С. 801-804.

18. Захарова Л.Ю., Гуляева Л.Ф., Морозкова Т.С., Каледин В.И., Ляхович В.В. Активность и индуцибельность цитохрома Р-450 1А в печени мышей с различной чувствительностью к гепатоканцерогенному действию о-аминоазо- толуола // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1998, Т. 26, С. 201- 203.

19. Шарипова Г.А., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В. Активность цитохромов Р4501А и уровень мРНК в печени и легких крыс, индуцированных различными ксенобиотиками // Мол. биол. - 1998, Т. 32, С. 570-573.

20. Шварц Е.И., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В. Динамика накопления мРНК для генов CYP2B в печени крыс различных линий во время индукции ксенобиотиками //Вопр. мед. химии - 1998, Т. 44, С. 167 -171.

21. Каледин В.И., Гуляева Л.Ф., Вавнлин В.А.,Макарова С.И., Морозкова Т.И., Рихтер В.А. Активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени чувствительных к гепатоканцерогенному действию ОАТ мышей линий SWR и СЗНА и резистентных AKR и CC57BR // Эксперим. онкология - 1999, Т. 21, С. 18-23.

22. Гуляева Л.Ф., Вавилин В.А., Ляхович В.В. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков в химическом канцерогенезе // Аналитический обзор, типография ГПНТБ СО РАН, г. Новосибирск, 1999.- 85 С.

23. Шварц Е.И., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В. Межлинейные различия в ферментативной активности CYP2B1 и экспрессии его гена в печени крыс при индукции // Вопр. мед. химии - 1999, т. 45, С. 133-140.

24. Шварц Е.И., Дужак Т.Г., Гуляева Л.Ф., Ляхович В.В. Влияние индукторов на взаимодействие позитивного и негативного цис-активных элементов гена CYP2B2 с ядерными белками печени крыс // Мол. биол. - 2000, Т. 34, С. 1-8.

Тезисы докладов:

25. Gulyaeva L.F.,Grishanova A.Yu.,Mishin V.M.Lyakhovich V.V. Correlation between amount and catalytic activity of multiple forms of cytochrome P450 // Abst. of 6th Int.Conf. on Biochemistry, Biophysics of Cytochrome P450, Vienna, Austria. 1988. P. 50.

26. Gulyaeva L.F., Grishanova A., Khatzenko O. G., Lyakhovich V.V. Induction of the microsomal monooxygenase system by phenobarbital and 3-methylcholanthrene in the rats during the early neonatal period // Abst. of the 3d Eur. ISSX Symp.on Foreign Compound Metabolism, London, England. 1989. P. A. 7.

27. Koleva M., Stoytchev Ts., Gulyaeva L.F., Grishanova A. Yu., Mishin V.M., Lyakhovich V.V. Induction of cytochrome P-450 isozymes upon repeated application of nifedipine // Abst. of the 3d Eur. ISSX Symp.on Foreign Compound Metabolism, London, England. 1989. P. A. 7.

28. Faibushevitch A.A., Vavilin V.A., Grishanova A.Yu., Gulyaeva L.F., Mishin V.M Lyakhovich V.V. Metabolism of theophylline and diazepam by multiple forms of cytochrome P-450 // Proc. of the 8th Intern. Sympos. on Microsomes and Drug Oxidations, Stockholm, Sweden. 1990. P. 79.

29. Gulyaeva L.F., Grishanova A. Yu., Lyakhovich V.V Strain- and tissue-dependent induction of cytochrome P-450IA and IIB subfamilies during different type induction // Abstr. of the 7th Intern. Conf. "Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P-450; Structure and Function, Biotechnological and Ecological Aspects". Moscow, USSR. 1991. P. 83.

30. Gulyaeva L.F., Grishanova A.Yu., Lyakhovich V.V. Species differences in induction of hepatic and extrahepatic cytochromes P450IA and IIB by mixed-type inducers U Abst. of the 3d Intern. ISSX Meet."Drug metabo-lism:molecules, models and man", Amsterdam, Netherlands. 1991. P. 157.

31. Grishanova A.Yu., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Effects of mixed type inducers on the androstenedione metabolism in liver microsomes of Ah-responsive and Ah-nonresponsive mice // Abst. of the 3d Intern. ISSX Meet."Drug metabolism:molecules, models and man", Amsterdam, Netherlands. 1991. P. 161.

32. Grishanova A.Yu., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Distribution of activities of P-450 forms in rat extrahepatic tissues during different types of induction // Proc. Sympos. on Recent Progress in Extrahepatic Drug Metabolism. Ronneby, Sweden. 1991. Abstr. 12.

33. Vavilin V.A., Gromova O.A., Grishanova A.Yu, Gulyaeva L.F., Ma-karova S.I., Lyakhovich V.V. Intra- and inter-individual correlations between microsomal cytochromes P-450IA1 and IA2 contents, its specific activity and theophylline metabolites production in vitro and in vivo II J. Basic & Clin. Physiol. & Pharmacol. - 1992. V. 3 S. P. 191.

34. Gulyaeva L.F., Grishanova A.Yu., Lyakhovich V.V. Strain- and tissue dependent induction of cytochrome P-450IA and IIB subfamilies during different type induction // Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics /

Eds Archakov A., Bachmanova G., Russia, Moscow, INCO-TNC, Joint Stock Company. - 1992. P. 388-390.

35. Gulyaeva L.F., Grishanova A.Yu., Petchkovski E V., Lyakhovich V.V. Expression of rat cytochrome P450 IA in lung and liver during inductions by methylcholanthrene and Arochlor 1254 // Proc. of the 5th European ISSX Meeting, Tours, France, 1993. P. 190.

36. Gulyaeva L.F., Grishanova A.Yu., Petchkovski E V., Lyakhovich V.V. Regulation of the rat liver and lung CYP1A expression by different inducers P-450 // Abstr. of the 8th Int. Conf. on Cyt.P-450, Lisbon, Portugal, 1993. P. 303.

37. Gulyaeva L.F., Grishanova A.Yu., Petchkovski E V., Lyakhovich V.V. Strain- and tissue-specific expression of rat CYP2B // Abstr. of the 8th Int. Conf. on Cyt.P-450, Lisbon, Portugal, 1993. P. 305.

38. Mezentsev A.N., Gulyaeva L.F., Kovalenko S.P., Lyakhovich V.V. Role of alternative splicing in the fifth exon of CYP2B2 gene in formation of multiple forms of CYP2B proteins // Proc. of the Int. Conf. " Cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology". John Libbey, Eurotext Paris, France. 1994. P. 685 - 687.

40. Gulyaeva L.F., Grishanova A.Yu., Lyakhovich V.V. Regulation of the rat liver and lung CYP1A expression by different inducers // Abstr. of the North American ISSX Conference, North Carolina, Ralegh, USA. 1994. V. 6. P. 165.

41. Gulyaeva L.F., Schwartz E.I., Lyakhovich V.V. Interstrain differences in rat CYP2B gene activation // Abstr. of the North American ISSX Conference, South Carolina, Hilton Head, USA, 1996. V. 10, P.168.

42. Gulyaeva L.F., Sharipova G.A., Lyakhovich V.V. Regulation of CYP1A gene expression in rat liver and lung // Abstr. of the 11th Int. Symp. on Microsomes and Drug Oxidations, Los Angeles, USA. 1996. P. 235.

43. Schwartz E.I , Duzhak T.G., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Time-dependent activation of minimal CYP2B promoter element // Abstr. of 12th Intern. Symp. on Microsomes and Drug Oxidations Montpellier, France, 1998. Abstract 24.

44. Duzhak T.G., Schwartz E.I , Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. New aspects in inducer dependent activation of minimal CYP2B promoter element // Abstr. 5th Intern ISSX Meeting, Cairns, Australia. 1998. P. 284.

Заказ 56. Тираж 100. Печ. л. 2,0. Формат 60x84/16. Бумага офсетная №1.

Типография СО РАМН, 630117, Новосибирск, ул. Ак. Тимакова, 9, 2000 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гуляева, Людмила Федоровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современная классификация генов цитохрома Р450.

1.2. Типы индукторов цитохрома Р450.

1.3. Активность и индуцибельность цитохромов Р450 в онтогенезе.

1.3.1. Общие аспекты развития монооксигеназной системы печени животных и человека.

1.3.2. Развитие активностей цитохрома Р450 в эмбриональный период жизни.

1.3.3. Развитие микросомных монооксигеназ печени у животных раннего неонатального периода.

1.3.4. Регуляция активности СУР в эмбриональный и неонатальный периоды жизни.

1.3.5. Множественные формы цитохрома Р450 в разные периоды развития. Неонатальный импринтинг.

1.4.Тканеспецифичность индукции цитохромов Р450.

1.5. Характеристика цитохромов Р450 подсемейства 1А.

1.5.1. Индукция цитохрома Р450 1А1.

1.5.2. Индукция цитохрома Р450 1А2.

1.6. Активация генов подсемейства СУР2В барбитуратами и другими соединениями.

1.6.1.Характеристика цитохромов подсемейства Р450 2В.

1.6.2. Механизм индукции СУР2В барбитуратами.

1.7. Генетический полиморфизм цитохромов Р450 и химический канцерогенез.

1.7.1. Полиморфизм СУР человека.

1.7.2. Межлинейные различия в активности цитохрома Р450 у лабораторных животных.

1.8. Цитохром Р450 в метаболизме эндогенных соединений.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Материалы.

2.2. Плазмиды.

2.3. Животные.

2.4. Обработка животных индукторами.

2.5. Выделение микросом.

2.6. Определение белка.

2.7. Определение количества цитохромов Р450 «65.

2.8. Определение активности НАДФН-цитохром Р450редуктазы.

2.9. Определение каталитической активности форм СУР.

2.9.1 Гидроксилирование БП.

2.9.2. О-деалкилирование этоксирезоруфинов.

2.9.3. N-деметилирование бензфетамина.

2.9.4. Метаболизм алдрипа.

2.9.5. Метаболизм андростендиона.

2.10. Иммупохимические методы.

2.10.1.Получение антител.

2.10.2. Ракетный иммуноэлектрофорез.

2.10.3. Ингибирование метаболизма различных субстратов антителами.

2.11. Получение очищенных препаратов цитохрома Р450.

2.12. Очистка НАДФН-цитохром Р450редуктазы.

2.13. DcNa-гель электрофорез и иммуноблотинг белков микросом.

2.14. Приготовление радиоактивных зондов.

2.15. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.16. Получение двухцепочечных фрагментов ДНК из олигонуклеотидов.

2.17. Выделение суммарной РНК из клеток печени.

2.18. Электрофорез РНК и ДНК.

2.19. Гибридизация РНК.

2.20. Полимеразная цепная реакция.

2.21. Выделение белковых ядерных экстрактов.

2.22. Анализ ДНК-белковых комплексов методом задержки ДНК в геле.

2.22.1. Инкубация олигонуклеотидов с белками ядерных экстрактов из печени крыс, индуцированных ксенобиотиками.

2.24.2. Инкубация олигонуклеотидов с белками ядерных экстрактов из печени контрольных крыс при добавлении индукторов в условиях in vitro.

2.23. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Идентификация молекулярных форм цитохрома Р450, изолированных из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом и 3-метилхолантреном.

3.2. Оценка каталитической активности множественных форм цитохрома Р450 в микросомах печени крыс по метаболизму андростендиона.

3. 3. Активность цитохромов Р4501А и 2В в печени новорожденных крыс.

3.3.1. Характеристика форм CYP, индуцированных в печени неонатальных крыс.

3.3.2. Иммунохимическое определение индуцированных форм CYP.

3.3.3. Метаболизм специфических субстратов МОС печени крыс раннего неонатального периода.

3.3.4. Каталитическая активность индуцированных форм CYP у новорояеденных крыс.

3.4. Исследование экспрессии генов цитохромов Р4501А в печени и легких крыс, индуцированных различными ксенобиотиками.

3. 5. Характеристика CYPla печени мышей различных линий.

3.6. Межлинейные различия в ферментативной активности CYP2B1 и экспрессии его гена в печени крыс при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном.

3.7. Регуляция экспрессии гена CYP2B индукторами ФБ-типа.

3.7.1. Исследование активности цитохрома Р4502В1 и экспрессии его гена при индукции ФБ и ТФД.

3.7.2. Исследование взаимодействия позитивного и негативного цис-активных элементов гена CYP2B2 с ядерными белками печени крыс в разное время после введения им индукторов.

3.7.3. Исследование взаимодействия позитивного и негативного цис-активных элементов гена CYP2B2 с ядерными белками печени крыс при добавлении индукторов в системе in vitro.

3.8. Альтернативный сплайсинг мРНК цитохрома Р450 2В2 в печени крыс.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности цитохромов Р450 2В и 1А и экспрессии их генов"

Быстрый научно-технический прогресс цивилизации приводит к возникновению серьезных проблем, связанных с загрязнением окружающей человека внешней среды. С развитием химической промышленности с каждым годом увеличивается число вредных факторов, влияющих на организм человека. К таким факторам прежде всего относятся пестициды, пищевые добавки, канцерогены, отходы производства и другие соединения химического происхождения. В связи с этим трудно переоценить значение ферментативных систем, обеспечивающих защиту от перечисленных выше факторов.

Было сформулировано и экспериментально обосновано представление о том, что в клетке функционирует система ферментов, окисляющая чужеродные соединения, названная микросомной монооксигеназной системой со смешанными функциями (Omura, Sato, 1964; Арчаков, 1975; Estabrook, 1979; Ляхович, Цырлов, 1981). Монооксигеназы не только превращают чужеродные соединения (ксенобиотики) в более полярные, легко удаляемые из организма, но и активно участвуют в обмене различных эндогенных соединений, таких как холестерин, простагландины, витамины, стероидные гормоны и др. Данные ферменты локализованы в эндоплазматическом ретикулуме клетки и при центрифугировании гомогенатов тканей выделяются с микросомальной фракцией.

Ферменты микросомной монооксигеназной системы окисляют субстраты при определенных условиях. Для этого необходимо, прежде всего, достаточное количество кофермента НАДФН и растворимого в воде кислорода. Включение молекулярного кислорода в органические субстраты катализируют ферменты типа оксидаз. По структуре микросомальные оксидазы представляют собой цепь переноса электронов с НАДФН на кислород. Работы многих авторов, в том числе эксперименты по фракционированию и реконструкции этой ферментной системы, позволили выделить 3 основных ее компонента -НАДФН-цитохром Р450 редуктаза, цитохром Р450 и липиды. Ферменты этой системы обладают широкой субстратной специфичностью. Среди реакций, в которых они принимают участие, гидроксилирование ароматического кольца углеводородов, N-, О- гидроксилирование и N-, О- и S-деалкилирование разнообразных субстратов, расщепление азосвязи аминоазосоединений и целый ряд других биохимических превращений. Микросомные монооксигеназы участвуют также в метаболизме химических канцерогенов, что является инициирующим этапом в цепи превращений проканцерогена в активный канцероген (Pelkonen, Nebert, 1982).

Столь широкая субстратная специфичность ферментов микросомной монооксигеназной системы обеспечивается функционированием множественных форм цитохрома Р450 - терминального акцептора электронов этой системы (Porter, Coon, 1991). К настоящему времени известно более 400 различных форм этого гемопротеида, описанных для бактерий, растений и животных (Nelson et al., 1996). На основании генной структуры и аминокислотной последовательности цитохромы Р450 были разделены на семейства, которые обозначаются арабскими цифрами. В единое семейство попадают цитохромы Р450, гомология которых не менее 40%. При гомологии более, чем 70%, гемопротеиды входят в одно подсемейство, которое обозначается заглавными буквами латинского алфавита. И, наконец, внутри каждого подсемейства существуют отдельные члены, вновь обозначаемые арабскими цифрами. В качестве примера можно привести ферменты CYP1A1 и CYP1A2, индуцируемые ПАУ в печени многих млекопитающих (Океу, 1990). Таким образом, цитохромы Р450, представленные столь разнообразными ферментами, осуществляют в клетке огромное число метаболических превращений химических соединений как экзо-, так и эндогенного происхождения. Не будет преувеличением сказать, что регуляция их активности является важной составляющей в поддержании клеточного гомеостаза.

Активность внутриклеточного метаболизма химических соединений, а, следовательно, и судьба попавшего в клетку ксенобиотика, зависит от наличия или отсутствия той или иной формы цитохрома Р450. Эффективность метаболизма ксенобиотиков прежде всего определяется возможностью данных ферментов к индукции, т.е. увеличению количества фермента с усилением его каталитических способностей. Способность к индукции характерна для многих цитохромов Р450 (Denison, Whitlock, 1995). Химические соединения, обладающие свойством индуцировать различные формы цитохрома Р450, были разделены на несколько типов. Воздействие на экспериментальных животных фенобарбиталом характеризуется многократным увеличением содержания цитохромов Р450 подсемейства 2В - CYP2B1 и CYP2B2 (Fonne, Meyer, 1987; Ryan, Lewin, 1990), тогда как многие ПАУ вызывают индукцию цитохромов Р450 1А1 и 1А2 (Соппеу, 1982; Poland, Kmitson, 1982). И если первый окисляет ксенобиотики преимущественно по пути детоксификации, то второй в большинстве случаев осуществляет активацию многих канцерогенов в реактивные метаболиты, направляя тем самым метаболизм по пути токсификации (Phillips, 1983). В связи с этим очевидна важность проблемы изучения механизмов индукции ферментативных активностей этих цитохромов Р450, а также способов регуляции активностей. К настоящему времени внимание исследователей направлено на изучение механизмов индукции цитохромов Р4501А и Р4502В в печени экспериментальных животных. Доказано, что для активации гена CYP1A необходимо взаимодействие цитозольного белка - Ah-рецептора с ксенобиотиком, траслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и, наконец, взаимодействие вновь образованного комплекса Ah-рецептор- ARNT с цис-активными элементами гена (Whitlock, 1999). О механизмах активации ФБ-индуцированных генов CYP2B известно меньше. Лишь в последние 2-3 года удалось идентифицировать CAR белок, принадлежащий к семейству орфановых рецепторов, который участвует в активации транскрипции генов CYP2B фенобарбиталом (Honkakoski et al., 1998). В регуляторной области этих генов найдены функционально значимые районы, с которыми связываются факторы транскрипции (Trottier ET AL., 1995). Однако, последовательность событий, приводящая к активации транскрипции гена, пока остается неизвестной. Таким образом, изучение механизмов индукции цитохромов Р450 является важнейшей составляющей в понимании регуляции активности этих ферментов.

Активность молекулярных форм цитохрома Р450 зависит не только от наличия индуктора, но и от типа ткани, где экспрессируются его гены (de Waziers et al., 1990). Главным органом, где осуществляется метаболизм практически всех ксенобиотиков, является печень. Именно в печени наиболее ярко проявляется эффект индукции цитохромов Р450, в том числе и CYP2B и СУР1А. Цитохромы Р450 других органов, в литературе известных как "экстрагепатические" Р450, также способны к индукции, хотя для них этот эффект выражен не столь ярко. Более того, картина индуцибельности множественных форм в других, кроме печени, органах различается. Так, если в печени крыс регистрируется лишь конститутивная экспрессия CYP2B2, а при индукции ФБ появляются обе формы этого подсемейства - CYP2B1 и CYP2B2, то легких при индукции регистрируется только один фермент - CYP2B1 при полном отсутствии конститутивной экспрессии (Imaoka et al., 1989). Для цитохромов Р450 1А подсемейства также характерна тканеспецифичная экспрессия их генов: под воздействием ПАУ-индукторов в печени экспрессируются обе формы данного подсемейства, тогда как в легких активируется лишь CYP1A1 (Kiyohara et al., 1989).

Активность различных форм цитохрома Р450 зависит и от возраста. Для большинства млекопитающих характерна низкая активность цитохромов Р450 в эмбриональный период развития (Rich et al., 1997). Эта активность достигает уровня взрослых лишь через несколько недель постнатальной жизни. Индуцибельность микросомальных ферментов, в том числе цитохромов Р450, у эмбриональных и неонатальных экспериментальных животных резко снижена. И если эмбриональные цитохромы Р450, защищенные материнской плацентой, практически не индуцируются, то при воздействии на организм новорожденного различными ксенобиотиками наблюдается гетерогенность в индуцибельности многих монооксигеназ (Giachelli, Omiecinski, 1987). Выявленные качественные и количественные различия в их активности объясняются многими исследователями различной регуляцией множественных форм цитохрома Р450 на ранних этапах развития (Yang et al., 1988). Причины, вызывающие эти различия, во многом определяются формированием гормонального статуса организма и остаются до конца неисследованными.

Для окислительного метаболизма лекарств и других ксенобиотиков характерны генетические вариации как в популяции людей, так и грызунов. В последнее время проводятся исследования молекулярных основ такого полиморфизма. Значительный вклад в полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков вносят аллельные вариации структурной области генов CYP (Nebert et al., 1996). Зависимые от линии мышей вариации ответа на ПАУ-соединения связаны с полиморфизмом Ah-рецептора (Gielen et al., 1972), причем этот ответ влияет также на индуцибельность ферментов как 1-ой (CYP1A1, 1А2 и 1В1), так и 2-ой фаз метаболизма ксенобиотиков (Denison, Whitlock, 1995).

Таким образом, можно выделить основные факторы, влияющие на активность цитохромов Р450, способных также изменять и экспрессию их генов.

1. Феномен индуцибельности Р450: ксенобиотик-индуктор способен усилить активность той или иной формы цитохрома Р450.

2. Тканеспецифичность индукции цитохромов Р450.

3. Влияние возраста на активность ферментов.

4. Генетический полиморфизм в активности и индуцибельности цитохромов Р450.

Целью данной работы является исследование механизмов, регулирующих активность молекулярных форм СУР подсемейств 1А и 2В у крыс и мышей.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать цитохромы Р450 1А и 2В по субстратной специфичности. В связи с эти представляется необходимым выделить эти ферменты из микросомальной мембраны, определить их активность в метаболизме специфичных субстратов с использованием реконструированной мембранной системы. Для определения активности фермента в микросомальной фракции печени необходимо определить его количество. Одним из перспективных подходов количественного определения ферментов в печени является иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител против исследуемых цитохромов Р450. С другой стороны, ингибируя их активность в микросомальной фракции антителами, можно достаточно уверенно судить о специфической активности изоформ цитохрома Р450.

2. Методами иммуноферментного анализа исследовать особенности функционирования МОС печени крыс в ранний неонатальный период развития, оценить активность и индуцибельность СУР1А и СУР2В

3. Исследовать специфичность действия ксенобиотиков на активацию СУР1А и 2В в различных органах крыс. Применение фенобарбитала и ПАУ-соединений (бенз[а]пирен, метилхолантрен, р-нафтофлавон, Арохлор 1254) в качестве индукторов монооксигеназ позволит оценить количественные аспекты индуцибельности генов СУР1А и 2В, играющей определяющую роль в развитии токсического ответа клетки на эти соединения. Для решения этой проблемы предполагается использовать как методы определения специфической активности, так и определение уровня мРНК.

4. Изучить влияние индукторов ФБ-типа (фенобарбитал, трифенилдиоксан) и смешанного типа (Арохлор 1254, пиридин) на активацию генов цитохрома Р450 2В подсемейства. Использование методов биохимии (специфические ферментативные реакции) и молекулярной биологии (методы гибридизации нуклеиновых кислот, ПЦР анализ, метод задержки ДНК в геле) позволит выявить некоторые аспекты механизма действия этих соединений на клетку.

5. Выявить межлинейные вариации в активности цитохромов Р450 подсемейств

2В и 1А у крыс и мышей.

Научная новизна работы. Исследование цитохром Р450-содержащей микросомной монооксигеназной системы печени экспериментальных животных позволило сделать ряд новых заключений о механизмах регуляции активности и экспрессии генов СУР1А и СУР2В.

Проведена идентификация и дана характеристика основных ФБ- и МХ-индуцированных молекулярных форм цитохрома Р450 в печени крыс Вистар. Показано, что в печени новорожденных крыс активность СУР1А1 в метаболизме специфических субстратов более, чем в 10 раз, превышает таковую для взрослых, что можно рассматривать как особый механизм защиты от чужеродных соединений.

Впервые показано, что под действием индукторов смешанного типа в легких индуцируется СУР1А2, обычно экспрессируемый в печени. Увеличение активности этого фермента в печени и легких не коррелирует с увеличением уровня мРНК, что позволяет сделать вывод о посттранскрипционных механизмах его регуляции.

Для СУР2В2 доказано существование альтернативного варианта мШК в печени, причем ее наличие не зависит от типа применяемых индукторов цитохрома Р450. Выявлены межлинейные различия в активности Сур 1а мышей, индуцированных канцерогенным о-аминоазотолуолом, что может быть важным фактором в развитии гепатоканцерогенного процесса, индуцированного этим соединением. Выявлены различия в способности к индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном у крыс различных линий, причиной которых могут быть изменения в экспрессии гена СУР2В.

Показана различающаяся динамика накопления мШК в печени крыс при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном. Исследованы механизмы действия этих индукторов на экспрессию гена СУР2В2. Впервые показано, что взаимодействие негативного регуляторного элемента гена СУР2В2 с ядерными белками сопровождается сначала уменьшением, а затем усилением интенсивности его связывания с белками, что дает основание пересмотреть природу негативной регуляции данного гена. Установлено, что фенобарбитал инициирует образование трех, а трифенилдиоксан - пяти ДНК-белковых комплексов, что говорит в пользу существования специфично зависимых от индуктора путей инициации транскрипции СУР2В2 гена.

Научно-практическое значение работы. В данной работе представлен обобщающий материал по регуляции активности СУР1А и СУР2В форм цитохрома Р450, участвующих в метаболизме различных ксенобиотиков, включая канцерогены и лекарства. Это дает возможность оценить действие таких соединений на живые организмы, установить факторы риска развития токсических процессов, включая канцерогенез.

Разработаны методы оценки метаболизирующей способности печени экспериментальных животных, индуцированных различными ксенобиотиками. Такая стратегия может быть использовано для решения задач, связанных как с биомониторингом окружающей среды, так и с изучением процессов биоактивации и метаболизма чужеродных соединений.

Результаты, полученные при изучении индуктор-специфической активации генов СУР2В, позволяют прояснить механизмы активации генов у эукариот.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Активность цитохрома Р450 зависит от возраста животных: у новорожденных его содержание невелико, однако, каталитическая активность некоторых его форм (СУР1А1) значительно выше, чем у взрослых.

2. Экспрессия генов цитохромов Р450 подсемейств 1А и 2В зависит от типа ткани. В печени крыс регистрируется их максимальная экспрессия, тогда как в почках и легких уровень мРНК и активность ферментов существенно ниже.

3. Экспрессия генов СУР1А и СУР2В в печени крыс и мышей, подвергавшихся действию индукторов, зависит от линии экспериментальных животных.

4. В печени крыс, помимо мРНК для СУР2В1 и СУР2В2, независимо от типа применяемого индуктора, регистрируется альтернативно сплайсированный вариант мРНК.

5. Экспрессия генов СУР 1а и СУР2В в печени крыс регулируется типом индуктора и временем его действия.

Принятые сокращения:

АД - андростендион-3,17

АР - Арохлор 1254

БР - 7-бензилрезоруфин

БФ - бензфетамин

ГХБ - гексахлобензол

МР - 7-метоксирезоруфин

МРОД - 7-метоксирезоруфин-О-деметилаза

МХ- 3-метилхолантрен

МОС - микросомная монооксигеназная система НЭ - негативный элемент транскрипции гена цитохрома Р4502В. ПАУ - полициклические ароматические углеводороды ПР -7-пентоксирезоруфин

ПЭ - позитивный элемент транскрипции гена цитохрома Р4502В СУР - цитохром Р450 ТФД - 1,3,5-трифенилдиоксан ФБ - фенобарбитал

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЭР - 7-этоксирезоруфин

ЭРОД - 7-этоксирезоруфин О-деэтилаза

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гуляева, Людмила Федоровна

ВЫВОДЫ

1. Проведена идентификация и дана характеристика цитохромов Р450 подсемейств 1 А, 2В, 2С, 2А и ЗА для крыс линии Вистар.

2. Выявлены функциональные особенности цитохрома Р450 печени новорожденных животных в сравнении с взрослыми особями.

- Ответ крыс раннего неонатального возраста на индукцию метилхолантреном сопровождается незначительным увеличением количества СУР1А1, но многократным увеличением его удельной активности в метаболизме бензпирена и 7-этоксирезоруфина.

- При индукции неонатальных крыс фенобарбиталом количество СУР2В увеличивается незначительно, его удельная активность сравнима с таковой у взрослых.

3. Изучена тканеспецифичная экспрессия генов СУР1А и СУР2В, зависимая от типа применяемого индуктора.

- При введении крысам фенобарбитала или гексахлорбензола в печени индуцируются СУР2В1 и СУР2В2, тогда как в легких - лишь первый из них.

- Впервые описана индукция белка цитохрома Р450 подсемейства 2В (СУР2Вх) в легких и печени крыс, обработанных Арохлором 1254.

- Сопоставление уровней мРНК СУР1А в печени и легких индуцированных различными соединениями крыс с результатами ферментативной активности в отношении модельных субстратов позволяет сделать выбор между транскрипционным (СУР1А1) и посттранскрипционным (СУР1А2) механизмами индукции.

4. Показаны межлинейные различия в активности СУР1А и СУР2В печени крыс и мышей, подвергавшихся действию индукторов.

5. Выявлена зависимая от времени введения индукторов фенобарбиталового типа экспрессия гена СУР2В в печени различных линий крыс.

6. В печени крыс, помимо мРНК для СУР2В1 и СУР2В2, впервые зарегистрирован альтернативно сплайсированный вариант мРНК, появление которого не зависит от типа применяемого индуктора.

7. Показано, что максимальный уровень экспрессии гена СУР2В при индукции крыс фенобарбиталом и трифенилдиоксаном не совпадает по времени.

8. Установлено, что зависимая от индуктора экспрессия СУР2В регулируется на стадии образования комплекса позитивного элемента гена с ядерными белками.

Трифенилдиоксан в системе in vitro инициирует образование пяти ДНК-белковых комплексов, тогда как фенобарбитал приводит к образованию лишь трех комплексов. Некоторые из этих комплексов описаны впервые.

- Интенсивность связывания позитивного элемента (Барби-бокса) с ядерными белками при индукции крыс трифенилдиоксаном или фенобарбиталом имеет сходную динамику.

9. Предложена новая схема негативной регуляции экспрессии гена СУР2В2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микросомная монооксигеназная система осуществляет метаболизм широкого спектра соединений как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Активность множественных форм цитохрома Р450 является ключевым фактором, определяющим пути метаболизма таких соединений. В связи с этим очевидно значение факторов, регулирующих активность цитохромов Р450, и, следовательно, процессы метаболизма ксенобиотиков и эндогенных субстратов. Среди множества молекулярных форм этого гемопротеида особое значение имеют цитохромы Р450 1А и 2В подсемейств. Это связано прежде всего с тем, что СУР1А1 и СУР1А2 окисляют большинство известных канцерогенов (полициклические ароматические углеводороды, ариламины, гетероциклические амины и др.). Образовавшиеся в результате этого процесса метаболиты канцерогенов, как правило, становятся электрофильными, что делает их способными взаимодействовать с различными клеточными мишенями, в том числе с ДНК и белками. Субстратами для цитохромы Р450 2В подсемейства являются самые разнообразные по своей химической структуре соединения, метаболизм которых, как правило, сопровождается окислением и выведением их из организма. Цитохромы Р450 исследуемых подсемейств способны к индукции. Представленные результаты подтверждают имеющиеся в литературе данные о различной субстратной специфичности этих ферментов, свидетельствуют и о различающихся механизмах активации генов. Активность исследуемых ферментов может меняться в зависимости от возраста, линии животного, вида ткани, где экспрессируется фермент, а также типа индуктора, попавшего в клетку. Таким образом, активность ферментов биотрансформации ксенобиотиков регулируется многими факторами, результатом чего является направление общего метаболизма ксенобиотиков в клетке.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гуляева, Людмила Федоровна, Новосибирск

1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление, М.: Наука, 1975. 327с.

2. Гришанова А.Ю., Мишин В.М., Ляхович В.В. Каталитическая активность цитохрома

3. Р-448 в нативных и реконструированных микросомных мембранах // Биохимия, 1984, Т.48, С. 1343-1349.

4. Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю., Ляхович В.В. Индукция цитохромов Р-4501А и 2В вразных органах крыс, получавших гексахлорбензол и Арохлор 1254 // Биохимия, 1994, Т. 59, С. 531-536.

5. Каледин В.И., Серова И.А., Семенова Л.А. Неодинаковая предрасположенность кразвитию спонтанных и индуцированных опухолей в печени мышей различных линий и их гибридов // Эксперим. Онкол, 1990, Т. 12, С. 28-30.

6. Курченко В.П., Усанов С.А., Метелица Д.И. Иммунохимическое изучение каталитической активности цитохрома P450LM2 из микросом печени кролика // Биохимия, 1982, Т. 47, С. 1431-1436.

7. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ,

8. Новосибирск: Наука, 1978. 236с.

9. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков,

10. Новосибирск: Наука, 1981,340с.

11. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, 1984, Мир, Москва.

12. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами Р450, М.: Наука,1982. 255с.

13. Мишин В.М., Гуткина Н.И., Ляхович В.В., Поспелова Л.Н., Чистяков В.В. Сравнение индуцирующего действия трифенилдиоксана, бис-(дихлорпиридилокси)бензола и фенобарбитала на монооксигеназу печени // Биохимия, 1990, Т. 55, С.29-36.

14. Мишин В.М., Ляхович В.В. Множественные формы цитохрома Р450, Новосибирск:1. Наука, 1984. 181с.

15. Цырлов И.Б. Хлорированные диоксины: биологические и медицинские аспекты // Аналит. Обзор, Новосибирск, 1990. 210 с.

16. Цырлов И.Б. и Ляхович В.В. Использование ингибирования в «системе со взаимнымистощении» для оценки активных центров различных арилгидрокарбонгидроксилаз // Биохимия, 1979, Т. 44, С. 1172-1183.

17. Adams N.H., Levi P.E., Hodgson E. Regulation of P450 isozymes by methylenedioxiphenyl compounds // Chem, Biol. Interact., 1993, V. 86, P. 255-274.

18. Adamson R.H. and Fouts J.R. The metabolism of drugs by hepatic tumors // Cancer Res,1961, V. 21, P. 667-672.

19. Agarwal В., Jugert F.K., Khan S/G., Bickers D.R., Merk H.F., Mukhtar H. Evidence formultiple inducible cytochrome P450 isozymes in sencar mouse skin by pyridine // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1994, V. 199, P. 1400-1406.

20. Aoyama T., Korzekwa K., Nagata K., Gillette J., Gelboin H.V., Gonzalez F.J. Estradiol metabolism by complementaru deoxyribonucleic-acid expressed human cytochrome P450 // Endocrinology, 1990, V. 126, P. 3101-3106.

21. Atchison M. and Adesnik M. A cytochrome P-450 multigene family. Characterization of agene activated by phénobarbital administration // J. Biol. Chem, 1983, V. 258, P. 1128511295.

22. Atlas S.A., Boobis A.R., Felton J.S., Thorgeirsson S.S., Nebert D.W. Ontogenetic expression of polycyclic aromatic compound-inducible monooxigenase activities and forms of cytochrome P-450 in rabbit.// J. Biol. Chem, 1977, V. 252, P. 4712-4721.

23. Autrup H., Vestergaard A.B., Okkels H. Transplacental transfer of environmental genotoxins: polycyclic hydrocarbon-albumin in non-smoking women, and the affect of maternal GSTM1 genotipe // Carcinogenesis, 1995, V. 16, P. 1305-1309

24. Bacsi S.G., Reisz-Porszasz S., Hankinson O. Orientation of the heterodimeric arylhydrocarbon (dioxin) receptor complex on its asymmetric DNA recognition sequence 11 Mol. Pharmacol, 1995, V. 47, P. 432-438.

25. Bandiera S., Safe S., Okey A.B. Binding of polychlorinated biphenyls classified as eitherphenobarbitone-, 3-methylcholanthrene or mixed-type inducers to cytosolic Ah receptor // Chem. Biol. Interact., 1982, v.39, P.259-277.

26. Basu T.K., Dickerson J.W.T., Parke D.V.W. Effect of development on the activity of microsomal drug-metabolizing enzymes in rat liver // Biochem. J, 1971, V.124, P. 19-24.

27. Beland F.A. and Kadlubar F.F. Metabolic activation and DNA adducts of aromatic aminesand nitroaromatic hydrocarbons // In Cooper C.S. and Glover P.L. (eds), Handbook of Experimental Pharmacology, Carcinogenesis and Mutagenesis, 1990, P. 267-325.

28. Bjorkhem I. Mechanism of bile acid biosynthesis in mammalian liver // Sterols and Bile

29. Acids (Ed. Danielson H. and Sjovall), 1985, Elsevier, Amsterdam, P. 231-278.

30. Boobis A.R., Edwards R.J., Foster J.R., Rich K.J. Ontogeny expression, distribution andinducibility of cytochromes P450 1A1 and 1A2 in hepatic and extrahepatic tissues of the rat//J. Pharmacol., 1990, V. 183, P.1502-1504.

31. Davies D.S. CYPlA2-catalyzed conversion of dietary heterocyclic amines to their proximal carcinogens is their major route of metabolism in humans // Cancer Res., 1994, V. 54, P. 89-94.

32. Burke M.D. and Mayer R.T. Ethoxyresorufin: Direct fluorometric assay of a microsomal

33. O-dealkylation which is preferentially inducible by 3-methylcholanthrene // Drug Metab. DisP., 1974, V. 2, P. 583-588.

34. Burke M.D., Thompson S., Weaver R.J., Wolf C.R., Mayer R.T. Cytochrome P450 specificities of alkoxyresorufin O-dealkylation in human and rat liver // Biochem. Pharmacol, 1994, V. 48, P. 923-936.

35. Carrier F., Owensh A., Nebert D.W., Puga A. Dioxin-dependent activation of murine Cyplal gene transcription requires protein kinase c-dependent phosphorylation receptor // Mol. Cell. Biol, 1992, V. 12, P. 1856-1862.

36. Carver L.A. and Bradfield C.A. Ligand-dependent interaction of the aryl hydrocarbon receptor with a novel immunophilin in vivo // J. Biol. Chem., 1997, V. 272, P. 1145211456.

37. Carver L.A., Hogenesch J.B., Bradfield C.A. Tissue specific expression of the rat Ah-receptor cDNA // Nucleic Acid Res., 1994, V. 22, P. 3038-3044.

38. Chapoupka K., santostefano M., Goldfarb A.S., Liu G., Myers M.J., Tsyrlov I.B., Gelboin

39. H.V., Krishnan V., Safe S. Aryl hydrocarbon (Ah) receptor-independent induction of Cypla2 gene expression by acenaphylene and related compounds in B6C3F1 mice // Carcinogenesis, 1994, V. 15, P. 2835-2840.

40. Cheung Y-L., Puddicombe S.M., Gray T.J.B., Ioannides C. Mutagenicity and CYP1A induction by azobenzenes correlates with their carcinogenicity // Carcinogenesis, 1994, V. 15, P.1257-1263.

41. Chiang J.V.L., DiLelle A.G., Steggles A.W. Effect of inducers and aging on rabbit livermicrosomal drug-metabolizing enzymes .// Mol. Pharmacol, 1982, V. 23, P. 244-251.

42. Christou M., Wilson N.M., Jefcoate C.R. Expression and function of three cytochrome P450 isozymes in rat extrahepatic tissues // Arch. Biochem. Biophys, 1987, V. 270, P. 162-172.

43. Christou M., Dodot L. Selective potent restriction of P450b- but not P450e- dependent 7,12- dimethylbenza.antracene metabolism by the microsomal environment. // Arch. Biochem. Biopys., 1989, V.270, P.162-172.

44. Chung L.W.K. Characteristics of neonatal androgen-induced imprinting of rat hepatic microsomal monooxygenases // Biochem. Pharmacol, 1979, V.26, P. 1979-1984.

45. Chung I. and Bresnick E. Identification of positive and negative regulatiry elements of thehuman cytochrome P4501A2 (CYP1A2) gene // Arch. Biochem. Biophys, 1997, V. 338, P. 220-226.

46. Ci H,S., Chung M., Tzameli I., Simha D„ Lee Y-K., Seol W., Moore D.D. Differential Transactivation by Two Isoforms of the Orphan Nuclear Hormone Receptor CAR // J. Biol. Chem,1997, V. 272, P. 23565-23571.

47. Conney A.H. Pharmacological implications of microsomal enzyme induction // Pharmacol. Rev, 1967, V. 19, P. 317-366.

48. Conney A.H. Induction of microsomal enzymes by foreign chemicals and carcinogenesis by polycyclic aromatic hydrocarbons // Cancer Res, 1982, V. 42, P. 4875-4917.

49. Conney A.H., Miller E.C., Miller J.A. The metabolism of metylated aminoazodyes . V. Evidence for induction of enzyme synthesis in the rat liver by 3-methylcholanthrene // Cancer Res, 1956, V. 16, P.450-459.

50. Crestani M., Galli G., Chiang J.Y.L. Genomic cloning, sequencibg and analysis of hamster cholesterol 7a-hydroxylase gene (CYP7) // Arch. Biochem. Biophys, 1993, V. 306, P. 451-460.

51. Cresteil T., Flinas J.P., Pfister A., Leroux J, P. Effect of microsomal prepaarations and induction of cytochrome P450-dependent monooxygenases in fetal and neonatal rat liver // Biochem. Pharmacol, 1979, V. 28, P. 2057-2063.

52. Cresteil T., Marie S., Sonnier M., Kersual J., Gonzalez F.J. Evidence for the transient expression of P-450 during the neonatal period in rat // Biochem. Biophys. Acta, 1994, V. 1208, P. 11-117.

53. Cuatrecasas P. Protein purification by affinity chromatogarphy. Derivatisations of agaroseand polyacrylamide beabs // J. Biol. Chem,1970, V. 245, P. 3057-3065.

54. Dalner G., Siekevitz P., Palade G.E. Synthesis of microsomal membranes and their enzymic constituents in developing rat liver // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1965, V. 20, P. 135-141.

55. Daly A.K., Cholerton M., Armstrong M., Idle J.R. Genotyping for polymorphisms in xenobiotic metabolism as a predictor of disease susceptibility // Environ. Health Perspect, 1994, V. 102, P. 55-61

56. Darnell J., Kerr I.M., Stark G.R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular proteins // Science, 1994, V. 264, P. 1415-1421.

57. Day A., Westphal H., Nebert D.W. Cell-specific induction of mouse Cypla mRNA duringdevelopment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, V. 21, P. 7446-7450.

58. Degawa ML, Kanazawa C., Hashimoto Y. In vitro metabolism of o-aminoazotoluene andmutagenesis of salmonella by the metabolites // Carcinogenesis ,1982, V. 3, P. 11131117.

59. DeLuca H.F. and Schnoes N.K. Vitamin D: Recent advantages // Ann. Rev. Biochem,1983, V. 52, P.411-439.

60. Denison M.S. and Heath-Pagliuso S. The Ah receptor: a regulator of the biochemical andtoxicological actions of structurally diverse chemicals // Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1998, V. 61, P. 557-568.

61. Denison M.S. and Whitlock J.P. Xenobiotic-inducible transcription of cytochrome P450genes expression by a geme- and phenobarbitone-modulated transcriptional factors // J. Biol. Chem,1995, V. 270, P. 18175-18178.

62. Desphande G.N., Turner A.K., Sommerville I.F. Plasma progesterone and pregnanediol inhuman pregnancy during labour and postpartum // Obsret. Gynaecol. Brit. Emp, 1960, V. 67, P.954-961.

63. De Waziers I., Cugnen P.H., Yang C.S., Leroux J-P., Beaune P.H. Cytochrome P450 isoenzymes, epoxide hydrolase and glutathione transferase in rat and human hepatic and extrahepatic tissues //J. Pharmacol. ExP. Ther, 1990, V. 253, P. 387-393.

64. Dignam J.D. and Strobel H.W. NADPH-cytochrome P-450 reductase, and epoxide hydrolase from a rat liver purification by affinity chromatography and characterization // Biochemistry, 1977, V. 16, P. 1116-1123.

65. Doostzaden J., Urban P., Pompon D., Morfin R. Pregnenolone-7p-hydroxilating activitiesof yeast-epressed mouse cytochrome H450-1A1 and mouse-tissue microsomes // Eur. J. Biochem, 1996, V. 242, P. 641-647.

66. Eaton D., Gallagher E.P., Bammler T.K., Kunze K.L. Role of cytochrome P4501F2 in chemical carcinogenesis: Implications for human variability in expression and enzyme activity // Pharmacogenetics, 1995, V. 5, P. 259-274.

67. Ecobichon D.J., Dykeman R.W., Hansell M.M. The development of hepatic drug-metabolizing enzymes in perinatal guinea pigs: A biochemical and morphological study // Can. J. Biochem, 1978, V. 56, P. 738-745.

68. Edwards R.J., Murray B.P., Schultx T. et al. Contribution of CYP1A1 and CYP1A2 to theactivation of heterocyclic amines in monkeys and human // Carcinogenesis, 1994, V. 15, P.829-836.

69. Enan E. and Matsumura F. Identification of the integral component of the cytosolic Ah receptor complex transducting the signal of 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin // Biochem. Pharmacol., 1996,V .52 , P. 1599-1612.

70. Estabrook R.W., Baron J., Peterson J., Ishimura P. Oxygenated cytochrome P450 as an intermediate in hydroxylation reactions,In: Biological Hydroxylation Mechanisms,L,N.Y.: Academic Press, 1978, P. 159-185.

71. Estabrook R.W., Werringloer J. The microsomal oxidative metabolism of many drugs,In:

72. The induction of Drug Metabolism, Stuttgart, N.Y. : Shattauer, 1979, P. 187-199.

73. Fonne R. and Meyer U.A. Mechanisms of phenobarbital-type induction of cytochrome P450 isozymes // Pharmacol. Ther., 1987, V. 33, P. 19-22.

74. Forman B.M., Tzameli I., Choi H.S., Chen J., Simba D„ Seol W„ Evans R.M., Moore D.D. Androstane metabolites bind to and deactivate the nuclear receptor CAR-p // Nature, 1998, V. 395, P. 612-615.

75. Fournier T., Mejdoubi N., lapoumerouli C., Hamelin J., Durand G., Porquet D. Transcriptional regulation of rat al-acid glycoprotein gene by phenobarbital // J. Biol. Chem, 1994, V. 269, P. 27175-27178.

76. Fraser D.R. Regulation of the metabolism of vitamin D // Physiol. Rev., 1980, V. 60, P.551.663.

77. Friedberg T., Grassow M.A., Oesch F. Studies of the expression of the cytochrome P4501., P450 IIB and IIC gene in extrahepatic tissues // Environ. Health Perspect, 1990, V. 88, P. 67-70.

78. Friedberg T., Siegetr P., Grassow M.A., Bartlomovoch B., Oesch F. Studies of the expression of the cytochrome P450 IA, P450IIB and P450IIC gene family in extrahepatic and hepatic tissues // Exp. Health. Persp., 1990, V. 88, P. 67-70.

79. Fujii-Kuriyaama Y., Sogawa K., Imataka H., Yasumoto K., Kikuchi Y., Fujisawa-Sehara

80. A. Transcription regulation of 3-methylcholanthreene-inducible P-450 gene responsible for metabolic activation of aromatic carcinogens // Int. SymP. Princess Takamatsu Cancer Res. Fund, 1990, V. 21, P. 165-175.

81. Garfinkel D. Studies on pig liver microsomes. I. Enzymic and pigment composition of different microsomal fractions // Arch. Biochem. Biophys, 1958, V. 77, P. 493-509

82. Gasser R., Negishi M., Philpot R. Primary structures of multiple forms of cytochrome P450 isozymes derived from rabbit pulmonary and hepatic cDNAs // Mol. Pharmacol, 1988, V. 32, P.22-27.

83. Giachelli C.M. and Omiecinski C.J. Developmental regulation of cytochrome P450 genesin rat // Mol. Pharmacol, 1987, V. 31, P. 477-484.

84. Gielen J.E., Goujon F.M., Nebert D.W. Genetic regulation of aryl hydrocarbon hydroxylase induction //J. Biol. Chem, 1972, V. 247, P. 1125-1137.

85. Gonzalez FJ. The molecular biology of cytochrome P450 // Pharmacol. Rev, 1988, V. 21,1. P. 244-288.

86. Gonzalez F.J. and Lee Y-H. Constitutive expression of hepatic cytochrome P450 genes // FASEB J, 1996, V. 10, P. 1112-1117.

87. Gonzalez F.J., Liu S,Y., Yano M. Regulation of cytochrome P450 genes: molecular mechanisms // Pharmacogenetics, 1993, V. 3, P. 51-57.

88. Gonzalez F.J. and Nebert D.W. Evolution of the P450 gene superfamily // Trends Genet,1990, V. 6, P. 182-186.

89. Gonzalez F.J., Tukey R.H., Nebert D.W. Structural gene products of the Ah locus. Transcriptional regulation of cytochrome Pi-450 and P3-450 mRNA levels by 3-methylcholanthrene // Mol. Pharmacol, 1984, V.26, P. 117-121.

90. Guengerich F.P. Roles of cytochrome P450 enzymes in chemical carcinogenesis and cancer chemotherapy // Cancer Res, 1988, V. 48, P. 2946-2954.

91. Guengerich F.P., Dannan G.A., Wright S.T. et al. Purification and characterization of microsomal cytochrome P-450 // Xenobiotica,1982, V. 12, P. 701-716.

92. Guengerich F.P. and Martin M.V. Purification of cytochrome P-450, NADPH-cytochrome

93. P-450 reductase, and epoxide hydrolase from a single preparation of rat liver microsomes // Arch. Biochem. Biophys. ,1980, V. 205, P. 3365-379.

94. Guenthner T.M. and Mannering G.J. Induction of hepatic monooxygenase systems in fetal and neonatal rats with phénobarbital, polycyclic hydrocarbons and other xenobiotics // Biochem. Pharmacol, 1977, V. 26, P.567-575.

95. Guenthner T.M. and Nebert D.W. Evidence in rat and mouse liver for temporal control of two forms of cytochrome P-450 inducible by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin rat // Eur. J. Biochem, 1978, V. 91, P. 449-456.

96. Guo J.F., Brown R., Rothwell C.E. Levels of cytochrome P450-mediated aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) are higher in differentiated than germinative cutaneous keratinocytes // J. Invest. Dermatol, 1990, V. 94, P. 86-93.

97. Hakkola J., Pasanen M., Purkunen R., Pelkonen O., Maenpaa J., Rane A., Raunlo H. Expression of xenobiotic-metabolizing cytochrome P450 forms in human adult and fetal liver // Biochem. Pharmacol, 1994, V. 48, P. 59-64.

98. Hahn M.E., Poland A., Glover E., Stegeman J.J. Photoaffinity labelling of the Ah receptor: phylogenetic survey of diverse vertebrate and invertebrate species // Arch. Biochem. Biophys. ,1994, V. 310,P. 218-228.

99. Hamm J.T., Ross D.G., Richardson V.M., Diliberto J.J., Birnbaum L.S. Methoxyresorufin: An inappropriate substrate for CYP1A2 in the mouse // Biochem. Pharmacol, 1998, V. 56, P. 1657-1660.

100. Hankinson O. The aryl hydrocarbon receptor complex // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol, 1995, V. 35, P. 307-340

101. Hannan R.R., Nebert D.W., Eisen H.J. Regulatory gene product of the Ah complex: comparizon of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and 3-methylcholanthrene to several moieties in mouse liver cytosol // J. Biol. Chem, 1981, V. 256, P. 4584-4590.

102. Hart L.G., Adamson R.H., Dixon R.L., Fouts J.R. Stimulation of hepatic microsomal drug metabolism in the newborn and fetal rabbit // J. Pharmacol. Exp. Ther, 1982, V. 137, P. 103-106.

103. Hashimoto T., Matsumoto T., Nishizawa M., Kawabata Morohashu K., Honda S., Omura T. A mutant rat strain deficient in induction of phenobarbital-inducible form of cytochrome P-450 in liver microsomes //J. Biochem, 1988,V.103, P.487-492.

104. Hayaishi O., Katagiri M., Rothberg S. Mechanism of the pyrocatechase reaction // J. Amer. Chem. Soc, 1955, V. 77, P. 5450-5451.

105. Hayashi S., Watanabe J., Nakachi K., Kawajiri K. Genetic linkage of lung cancer associated Mspl polymorphism with amino acid replacement in the heme binding region of the human cytochrome P4501A1 gene//J. Biochem, 1991, V. 110, P. 407-411.

106. He J,S. and Fulco A.J. A barbiturate-regulated protein binding to a common sequences in the cytochrome P450 of rodents and bacteria // J. Biol. Chem, 1991, V. 266, P. 78617869.

107. Henderson R.T. and Dewaide J.H. Metabolism of drug in isolated rat hepatocytes // Biochem. Pharmacol, 1969, V. 18, P. 2087-2094.

108. Hiang J.Y.L. Interaction of purified microsomal cytochrome P450 with cytochrome b5 // Arch. Biochem. Biophys, 1981, V. 211, P. 662-673.

109. Honkakoski P. and Negishi M. Characterization of phenobarbital-responsive module in mouse P450 Cyp2bl0 gene // J. Biol. Chem, 1997, V. 272, P. 14943-14949.

110. Honkakoski P. and Negishi M. Regulatory DNA elements of phenobarbital-responsive cytochrome P450 CYP2B genes / J. Biochem. Mol. Toxicol, 1998, V. 12, P. 3-9.

111. Honkakoski P., Moore R., Gynther J., Negishi M. Characterization of phenobarbital-inducible mouse Cyp 2bl0 gene transcription in primary hepatocytes // J. Biol. Chem, 1996, V. 271, P. 9746-9753.

112. Honkakoski P., Zelko I., Sueyoshi T., Negishi M. The Nuclear Orphan Receptor CAR-Retinoid X Receptor Heterodimer Activates the Phenobarbital-Responsive Enhancer Module of the CYP2B Gene //Mol. Cell. Biol, 1998, V.18, P. 5652-5658.

113. Ichikawa T., Hayashi S.I., Noshiro M., Takada K., Okuda K. Purification and characterization of cytochrome P-450 induced by benzanthracene in mouse skin microsomes // Cancer Res, 1989, V. 49, P. 806-809.

114. Imai Y. The use of 8-aminooctyl sepharose for the separation of some components of the hepatic microsomal electron transfer system //J. Biochem., 1976, V. 80, P. 267-276.

115. Imai Y. and Sato R. A gel-electrophoretically homogeneous preparation of cytochrome P450 from liver microsomes of phenobarbital pretreated rabbits // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1974, V. 60, P. 8-14.

116. Imaoka S. and Funae Y. Purification and characterization of rat pulmonary cytochrome P-450 // J. Biochem,1990, V. 108, P. 33-36.

117. Imaoka S., Terano Y., Funae Y. Expression of four phenobarbital-inducible cytochromes P450s in liver, kidney and lung of rats // J. Biochem, 1989, V. 105, P. 939-945.

118. Ingelman-Sundberg M., Haaparanta T., Rdstrom J. Membrane charge as affector of cytochrome P-450LM2 catalyzed reactions in reconstituted liposomes // Biochemistry, 1981, V. 20, P. 4100-4106.

119. Ioannides C. and Parke D.V. The cytochrome P450 I gene family of microsomal hemoproteins and their role in the metabolic activation of chemicals // Drug Metab. Rew, 1990, V. 22, P. 1-85.

120. Okey A.B. Enzyme induction in the cytochrome P450 system // Pharmacol. Ther, 1990, V. 45, P. 241-298.

121. Ioannides C. and Parke D.V. The cytochrome P450 I gene family of microsomal hemoproteins and their role in the metabolic activation of chemicals // Drug Metab. Rew, 1990, V. 22, P. 1-85.

122. Ishii Y., Mukoyaama H., Hata S. Metabolism of finasteride in rat hepatic microsomes: age and sex differences and effects of P450 inducers // Xenobiotica , 1994, V. 24, P. 863872.

123. Jean A., Reis A., Desrochers M., Dubois S., Trottier E. et al. Rat liver cytochrome P4502B3 and immunological identification of a constitutive P450 2B3-like protein in rat liver // DNA Cell Biol, 1994, V. 13, P. 784-792.

124. Jones C.R. and Lubet R.A. Induction of a pleiotropic response by phénobarbital and related compounds //Biochem. Pharmacol, 1992, V. 44, P. 1651-1660.

125. Jones K.W. and Whitlock J.P.Jr. Functional analysis of the transcription promoter for the CYP1A1 gene//Mol. Cell. Biol., 1990, V. 10, P. 5098-5105.

126. Kalow W. and Bertillson L. Interehtic factors affering drug response // Adv. Drug Res, 1994, V. 25, P. 1-50

127. Kamataki T., Maeda K., Shimada M. et al. Neonatal testosterone imprinting of hepatic microsomal drug metabolism on a male specific form of cytochrome P-450 in the rat // J. Biochem., 1984, V. 96, P. 1939-1942.

128. Kardish R. and Feuer G. Relationship between maternal progesterone and delayed drug metabolism in neonate // Biol. Neonat, 1972, V. 20, P. 58-64.

129. Juchau M.R., Chao S.T., Omiecinski C.J. Drug metabolism by the human fetus // Clin. Pharmacokinet, 1980, V. 5, P. 320-340.

130. Kato R., Vasanelli P., Frontino G., Chiesara E. Variation of the activity of liver microsomal drug metabolizing enzymes in rat liver // Biochem. Pharmacol., 1964, V. 13, P. 1037-1051.

131. Kawajiri K., Nakachi K., Yoshii A. et al. Identification of genetically high risk individuals to lung cancer by DNA polymorphism of the cytochrome P450 1A1 gene // FEBS Lett, 1990, V. 263, P. 131-133.

132. Kawajiri K., Nakachi K., Imai K. et al. CYP1A1 and cancer susceptibility // Crit. Rev. Oncol. Hematol, 1993, V. 14, P. 77-87.

133. Kelley M., Hantelle P., Safe S., Levin W., Thomas P.E. Co-induction of cytochrome P-450 isozymes in rat liver by 2,4,5,2',4',5'-hexachlorobiphenyl or 3-methoxy-4-aminoazobenzene //Mol. Pharmacol., 1987, V. 32, P. 206-211.

134. Kellis J., Nesnow S., Vickery L.E. Inhibition of aromatase cytochrome P450 (estrogen synthetase) by derivatives of a-naphthoflavone // Biochem. Pharmacol, 1986, V. 35, P. 2887-2891.

135. Kim S.G., Philpot R.M., Novak R.F. Pyridine effects on P450IIE1, IIB and IYB expression in rabbit liver: characterization of high- and low-affinity pyridine N-oxygenases // J. Pharmaco. Exptl. Ther, 1991, V. 259, P. 470-477.

136. Kimura M., Baba T., Yamazaki H., Ohmori S., Inui Y., Gonzalea F.P., Guengerich F.P. Characterization of cytochrome P4502B6 in human liver microsomes // Drug Metab. Dispos, 1993, V. 21, P. 1048-1056.

137. Kimura S., Donovan J.C., Nebert D.W. Tissue-specific expression of the mouse dioxin-inducible PI-450 and P2-450 genes: different transcriptional activation and mRNA stability in liver and extrahepatic tissue // Mol. Cell Biol, 1986, V. 6, P.1471-1477.

138. Kimura H., Sogawa K., Sakai Y., Fujii-Kuriyama Y. Alternative splicing mechanism of a cytochrome P-450 (P-450PB-1) gene generates the two mRNAs coding for proteins of different functions // J. Biol. Chem., 1989, V. 264, P.2338-2342.

139. Kitada M., Kitagawa H., Kamataki T. Effect of incorporation into microsomes of purified NADPH-cytochrome c (P-450) reductase on drug oxidations // Biochem. Pharmacol., 1979, V. 28, P. 2670-2673.

140. Kiyohara C., Monn N., Nagayama J., Hirohata T. Strain- and organ-dependent differences in induction of aryl hydrocarbon hydroxylase activity by 3-methylcholanthrene. //Bull. Environ. Contam. Toxicol, 1989, V. 43, P. 185-191.

141. Klingenberg M. Pigments of rat liver microsomes // Arch. Biochem. Biophys, 1958, V. 75, P. 376-387

142. Klinger W. Biotransformation of drugs and other xenobiotics during postnatal development J I Pharmac. Ther, 1982, V. 16, P. 377-429.

143. Kocarek T.A., Schuetz E.G., Guzelian P.S. Regulation of phenobarbital-induciblecytochrome P450 2B1/2 mRNA by lovastatin and oxysterols in primary cultures of adult rat hepatocytes // Toxicol. Appl. Pharmacol, 1993, V. 120, P.298-307.

144. Kocarek T.A., Schuetz E.G., Guselian P.S. Differebtial induction of cytochrome P450 b/e and P450p mRNAs by doses of phenobarbital in primary cultures of adult rat hepatocytes //Mol. Pharmacol., 1990, V. 38, P. 440-444.

145. Kocarek T.A., Schuetz E.G., Guzelian P.S. Selective induction of cytochrome P450s by kepone (chlordecone) in primary cultures of adult rat hepatocytes // Mol. Pharmacol., 1991, v.40, P.203-210.

146. Kocarek I.A., Schuetz E.G., Guzelian P.S. Regulation of phenobarbital-induciblecytochrome P450 2B1/2 mRNA by lovastatin and oxysterols in primary cultures of adult rat hepatocytes // Toxicol. Appl. Pharmacol, 1993, V. 120, P.298-307.

147. Komori M., Nishio K., Kitada M., Shiramatsu K. et all. Fetus-specific expression of a form of cytochrome P450 in human livers // Biochemistry, 1990, V. 29, P. 4430-4433.

148. Kuenzig W., Kamm Y.J., Boublick M. Perinatal drug metabolism and morphological changes in the hepatocytes of normal and phenobarbital-treated guinea pigs // J. Pharmacol. Exp. Ther, 1974, V. 191, P. 32-44.

149. Kuwahara S., Harada N., Yoshioka H., Miyata T., Omura T. Purification and charaterization of four forms of cytochrome P-450 from liver microsomes of phenobarbital- and 3-methylcholanthrene-treated rats // J. Biochem, 1984, V. 95, P. 703714.

150. Lacroix D., Desrochers M., Lambert M., Anderson A. Alternative splicing mRNA encobing rat liver cytochrome P450e (P450II2B) // Gene, 1990, V.86, P. 201-207.

151. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature , 1970, V. 227, P. 680-685.

152. Lammers W.H., Mooren P.G., De Craeve A., Charles R. Perinatal development of the liver in rat and spiny mouse. Its relation to altricial and precocial timing of birth // Eur. J. Biochem, 1985, V. 146, P. 475-480

153. Landers J.P. and Bunce N.J. The Ah receptor and mechanism of dioxin toxicity // J. Biochem., 1991, V. 276, P. 273-287.

154. Lee Q.P., Fantel A.G., Juchau M.R. Human embryonic cytochrome P450s: phenoxazone ethers as probes for expression of functional isoforms during organogenesis // Biochem. Pharmacol., 1991, V. 42, P.2377-2385.

155. Li Y.C., Wang D.P., Chiang J.Y.L. Regulation of cholesterol 7a-hydroxylase in the liver specific // J. Biol. Chem, 1990, V. 265, P. 12012-12019.

156. Leaky J.E. and Fouts J.R. Precocious development of cytochrome P-450 in neonatal rat liver after glucocortical treatment//Biochem. J, 1979, V. 182, P. 233-236.

157. Levin W., Ryan D., Kuntzman R., Conney A. Neonatal imprinting and the turnover of microsomal cytochrome P-450 in rat liver // Mol. Pharmacol, 1979, V. 182, P. 233-236.

158. Li W., Harper P., Tang B,K., Okey A.B. Regulation of cytochrome P450 enzymes by aryl hydrocarbon receptor in human cells // Biochem. Pharmacol., 1998, V. 56, P. 599612.

159. Liang Q., He j,S., Fulco A.J. The role of barbi-box sequences as cis-acting elements involved in the barbiturate-mediated induction of cytochromesP450BMl and P450BM-3 in Bacillus megaterium // J. Biol. Chem, 1995, V. 270, P. 4438-4450.

160. Linko P. and Yeowell E. Enzyme induction in the cytochrome P450 system // Pharmacol. Ther, 1990, V. 45, P. 241-298

161. Linko P., Yeowell H.N., Gasiewicz T.A., Goldstein J.A. Induction of cytochrome P-450 isozymes by hexachlorobenzene in rats and aromatic hydrocarbon (Ah)-responsive mice II J. Biochem. Toxicol., 1986, V. 1, P. 95-107.

162. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randal R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. , 1951, V. 193, P. 265-275.

163. Lu A.Y.H., West S.B., Ryan D., Levin W. Characterization of partially purified cytochromes P-450 and P-448 from rat liver microsomes // Drug Metab. Disposit., 1973, V.1,P. 29-37.

164. Lubert R.A., Chauhan D.P., Nims R.W., Diwan B.A., Ward J.M., Jones C.R., Rice J.M., Miller M.S. A pleiotropic response to phenobarbital-type inducers in the F344/NCr rat:

165. Effects of chemicals of varied structure // Biochem. Pharmacol., 1992, V. 43, P. 10671078.

166. Luc P, V.T., Adesnik M., Ganduly S., Shaw P.M. Transcriptional regulation of the CYP2B and CYP2B2 genes by C/EBP-related proteins // Biochem. Pharmacol., 1996, V. 51, P. 345-356.

167. Mahendroo M.S., Means G.D., Mendelson C.R., Simpson E.R. Tissue-specific expression of human P-450 arom.//J. Biol. Chem, 1991, V. 266, P. 11276-11281.

168. Miles J.S., Spurr N.K., Gough A.C., Jowett T., McLare A.W., Brook A.W., Wolf C.R. A novel human P450 gene (P450IIB): chromosomal localization and evidence for alternative splicing // Nucl. Acids Res, 1988, V. 16, P. 5783-5795.

169. Makishima M., Okamoto A.Y., Repa J.J., Tu H„ Learned R.M., Luk A., Hull M.V., Mangelsdorf D.J., Shan B. Identification of a Nuclear Receptor for Bile Acids // Science, 1999, V. 284, P. 1362-1365.

170. Mangelsdorf D.J. and Evans R.M. The RXR heterodimers and orphan receptors // Cell, 1995, V. 83, P. 841-850.

171. Marcus C.B., Wilson N.M., Keith I.M., Jefcoate C.R., Omiecinski C.J. Selective expression of cytochrome P450 isozymes by 4-n-alkyl-methylenedioxybenzenes in rat lung cells // Arch. Biochem. Biophys,1990, V. 277, P. 17-25.

172. Marie S. and Cresteil T. Phenobarbital-inducible gene expression in developing rat: Relationship to hapatocyte function // Biochem. Biophys. Acta, 1989, V. 1009, P. 221228.

173. Mason M.S., Fowlks W.L., Peterson E. Oxigen transfer and electron transport by the phenolase complex // J. Amer. Chem. Soc, 1955, V. 77, P. 2914-2915.

174. Masters B.S.S., Williams C.H., Kamin H. The preparation and properties of microsomal TPNH-cytochrome c reductase from pig liver // Methods Enzymol, 1967, V. 10, P. 565573.

175. Masters B.S.S., Okita R.T. The history, properties and function of NADPH-cytochrome P450 reductase // Pharmac.Ther., 1979, V. 9, P. 227-244.

176. Matsubara T., Prough R.A., Burke M.D., Estabrook R.W. The preparation of microsomal fractions of rodent respiratory tract and their characterization // Cancer Res, 1974, V. 34, P. 2196-2203.

177. Miller M.S., Jones A.B., Chauhan D.P., Park S.S., Anderson L.M. Differential induction of fetal mouse liver and lung cytochromes P-450 by p-naphtoflavone and 3-methylcholanthrene // Carcinogenesis, 1989, V. 10, P. 875-883.

178. Mizuno K., Gonzalez F.J., Kimura S. Thiroid-specific enhancer-binding protein (T/EBP):cDNA cloning, functional characterization and structural identify with thiroid transcription factor TTF-1 //Moll. Cell Biol,1991, V. 11, P. 1927-1933.

179. Muller D., Forster D., Dietze H. et al. The influence of age and barbital treatment on the content of cytochrome P450 and b5 on the activity of glucoso-6-phosphate in microsomes of rat liver and kidney // Biochem. Pharmacol, 1973, V. 22, P. 905-910.

180. Nash T. The calorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsh reaction // Biochem. J., 1953, V. 55, P. 416-421.

181. Nebert D.W. The Ah locus: genetic differernces in toxicity, cancer, mutation, and birth defects // Toxicology, 1989, V. 20, P. 153-174.

182. Nebert D.W. Proposed role of drug-metabolizing enzymes: Regulation of steady state levels of the ligands that effect growth, homeostasis, differentiation, and neuroeendocrine functions // Mol. Endocrinol, 1991, V. 5, P.1203-1214.

183. Nebert D.W. and Gonzalez F.J. P450 genes: structure, evolution, and regulation // Annu. Rev. Pharmacol, 1987, V. 56, P. 943-993.

184. Nebert D.W. and Jensen N.W. The Ah locus: genetic regulation of the metabolism of carcinogens, drugs and other environmental chemicals by cytochrome P450 mediated monooxygenases // CRC Crit. Rev. Biochem,1 979, V. 6, P. 401-437.

185. Nebert D.W. and McKinnon R.A. Cytochrome P450: evolution and functional diversity // Prog. Liver Dis, 1994, V. 12, P. 63-97.

186. Nebert D.W., McKinnon R.A., Puga A. Human drug-metabolising enzyme polymorphism: Effects on risk of toxicity and cancer // DNA Cell Biol, 1996, V. 15, P. 273-280.

187. Nebert D.W. and Gelboin H.V. The in vivo and in vitro induction of aryl hydrocarbon hydroxylase in mammalian cells of different species, tissues, strains, and development and hormonal status // Arch. Biochem. Biophys, 1969, V. 134, P. 76-84.

188. Nebert D.W., Nelson D.R., Coon M.J., Estabrook R.W., Feyereisen R., Fujii-Kuriuama

189. Y., Gonzalez F.J., Guengerich F.P., Gunzalus I.C., Johnson E.F., Loper J.C., Sato R., Waterman M.R., Waxman D.J. The P450 superfamily: update of new sequences, gene mapping and recommended nomenclature // DNA Cell Biol, 1991, V. 10, P.1-14.

190. Nebert D.W., Nelson D.R., Feyereisen R. Evolution of the cytochrome P450 genes // Xenobiotica, 1989, V. 19, P. 1149-1160

191. Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegeman J.J. et al. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers, and nomenclature // Pharmacogenetics , 1996, V. 6, P. 1-43.

192. Nims R.W., Syi J,L., Nelson V.C., Thomas P.E et al. Hepatic cytochrome P450 2B-type induction by ethyl/phenyl-substituted congeners of phenobarbital in the rat // Chem. Res. Toxicol, 1993, V. 6, P. 180-187.

193. Nishimoto M., Noshiro M., Okuda K. Structure of the gene encoding human liver cholesterol 7a-hydroxylase // Biochem. Biophys. Acta, 1993, V. 1172, P. 147-150.

194. Norman R.L., Johnson E.F., Muller-Eberhard U. Identification of the major cytochrome P-450 form transplacental^ induced in neonatal rabbits by 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin // J. Biol. Chem, 1978, V. 253, P. 8640-8647.

195. Nuclear Receptors Nomenclature Committee // Cell, 1999, V. 97, P. 161-163

196. Okey A.B. Enzyme induction in the cytochrome P-450 superfamily // Pharmacol. Ther., 1990, V. 45, P.241-298.

197. Omiecinski C.J., Hassett C., Costa P. Developmental expression and in situ localization of the phenobarbital-inducible hepatic mRNAs for cytochromes CYP2B1, CYP2B2, CYP2C6, and CYP3A1 //Mol. Pharmacol, 1990, V. 38, P.462-470.

198. Omiecinski C.J., Redlich C.A., Costa C.A. Induction and developmental expression of cytochrome P450 1A1 messenger RNA in rat and human tissue: Detection by the polymerase chein reaction // Cancer Res, 1990, V. 50, P. 4315-4321.

199. Omiecinski C.J., Walz F.G., Vlasuk G.P. Phénobarbital induction of rat liver cytochrome P-450b and P-450e // J. Biol. Chem, 1985, V. 260, P. 3247-3250.

200. Omura T. and Sato R. The carbon monooxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature // J. Biol. Chem, 1964, V. 239, P. 2370-2378.

201. Orellana M., Valdes E., Capdevila J., Gil L. Nutritionally triggered alterations in the regiospecifity of arachidonic acid oxygenation by rat liver microsomal cytochrome P450 // Arch. Biochem. Biophys, 1989, V. 274, P.251-258.

202. Pacifici G.M., Franchi M., Bencin C., Repetti F., Lascio N.D. Tissue distribution of drug-metabolizing enzymes in humans // Xenobiotica, 1988, V. 18, P. 849-856.

203. Pantuck E., Conney A.H., Kuntman R. Effect of phénobarbital on the metabolism of phénobarbital and meperidine in fetal rabbits and rats // Biochem. Pharmacol, 1968, V. 17, P. 1441-1447.

204. Park Y., Li H., Kemper B. Phénobarbital induction mediated by a distal CYP2B2 sequence in rat liver transiently transfected in situ II J. Biol. Chem, 1996, V. 271, P. 23725-23728.

205. Parke D.V., Ioannides C., Lewis D.F.V. The role of cytochromes P450 in the detoxication and activtion of drugs and other chemicals // Can. J. Physiol. Pharmacol, 1991, V. 69, P. 537-549

206. Pelkonen O. Developmental drug metabolism, In: Concepts in Drug Metabolism, part A. Dekker: New York, 1980, P. 285-308.

207. Pelkonen O. Biotransformation of xenobiotics in the fetus // Eur. J. Biochem, 1981, V. 120, P. 213-220.

208. Pelkonen O., Couppila P., Karki N.T. Attempts to induce drug metabolism in human fetal liver and placenta by administration of phénobarbital to mothers // Arch. Inter. Pharmacodyn. Ther, 1973, V. 202, P. 228-297.

209. Pelkonen O., Katrala E.H., Larmi T.K.I., Karki N.T. Comparison of activities of drug metabolizing enzymes in human fetal liver and adult livers.// Clin. Pharmacol. Ther, 1973,V. 14, P. 1538-1540.

210. Pelkonen O., Nebert D.W. Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: etiologic role in carcinogenesis // Pharmacol. Rev, 1982, V. 34, P. 189-222.

211. Phelan D.M., Brackney W.R., Denison M.S. Ah receptor can bind ligand in the absence of receptor-associated heat-shock protein 90 // Arch. Biochem. Biophys, 1998, V. 353, P. 47-54.

212. Phillips D.H. Fifty years of benzo(a)pyrene // Nature, 1983, V. 303, P. 468-472.

213. Phillips D.H. and Langdon R.G. Hepatic triphosphopyridine nucleotide-cytochrome c reductase: isolation, characterization and kinetic studies // J. Biol. Chem.,1962, V. 237, P. 2652-2660.

214. Pickett C.B., Jeter R.L., Morin J., Lu A.Y.H. Electroimmunochemical quantitation of cytochrome P-450, cytochrome P-448 and epoxide hydrolase in rat liver microsomes // J. Biol. Chem, 1981, V. 256, P. 8815-8820.

215. Piechocki M.P. and Hines R.N. Functional characterization of the human CYP1A1 negative regulatory element: modulation of Ah receptor mediated transcriptional activity // Carcinogenesis , 1998, V. 19,P. 771-780.

216. Pineau D., Daujat M., Pichard L., Angevain J., Bonfils C., Maurel P. Developmental expression of rabbit cytochrome P450 CYP1A1, CYP1A2 and CYP3A6 genes // Eur. J. Biochem, 1991, V. 197, P. 145-153.

217. Poland A. and Knutson J.C. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related halogenated aromatic hydrocarbons: examination of the mechanism of toxicity // Ann. Rev. Toxicol. Pharmacol., 1982, V. 22, P. 517-554.

218. Pomental R.A., Liang B., Yee G.K., Wilhelmsson A., Poellinger L., Paulson K.E. Dioxin receptor and C/EBR regulate the function of the glutathione S-transferase Ya gene xenobiotic responsive element // Mol. Cell. Biol., 1993, V. 13, P. 4365-4373.

219. Porter T.D. and Coon M.J. Cytochrome P-450. Multiplicity of isoforms, substrates, and catalytic and regulatory mechanisms // J. Biol. Chem.,1 991, V. 266, P. 13469-13472.

220. Prabhu I., Upadhva P., Rani N., Nirodi S„ Sultana S., Vatsala P.G., Mani A., Rangarajani

221. P.N, Surolia A., Padmanaban G. Model for the transcriptional regulation of the CYP 2B1/2B2 gene in rat liver// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, V. 92, P. 9628-9632.

222. Pratt W.B. The role of the hsp90-based chaperone system in signal transduction by nuclear receptors and receptor signalling via MAP kinase // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1997, V. 37, P. 297-326.

223. Quattrochi L.C., Vu T„ Tukey R.H. The human CYP1A2 gene and induction by 3-methylcholanthrene: a region that supports AH-receptor binding and promoter-specific induction //J. Biol. Chem., 1994, V. 269, P. 6949-6954.

224. Ram N., Rao V., Prabhu I., Padmanaban G. Characterization of a negative cis-acting

225. DNA-element regulating the transcription of CYP2B1/2B2 gene in rat liver // Arch. Biochem. Biophys, 1995, V. 317, P.39-45.

226. Ramprsaud A. and Walz F.G. Polymorphism of four hepatic cytochromes P450 in 28 inbred strains of rats // Biochem. Genet, 1987, V. 25, P. 527-534.

227. Ramsden R., Sommer K.M., Omiecinski C.J. Phenobarbital induction and tissue-specific expression of the rat CYP2B2 gene in transgenic mice // J. Biol. Chem, 1993, V. 268, P. 21722-21726.

228. Raval P., Iversen P.L., Brsenick E. Induction of cytochromes P450 1A1 and P450 1A2 as determined by solution hybridization //Biochem. Pharmacol, 1991, V. 41, P. 1719-1723.

229. Ravishankar H. and Padmanaban G. Characterization of the CYP2B1/2B2 clones // J. Biol. Chem, 1985, V. 260, P. 1588-1593.

230. Reiners J.J., Jones C.L., Hong N., Myrand S.P. Differential induction of Cyplal, Cyplbl, Adh4, and Nmol in murine skin tumors and adjacent normal epidermis by ligands of the aryl hydrocarbon receptor // Mol. Carcinogenesis, 1998, V. 21, P. 135-146.

231. Remmer H. and Padmanaban G. Regulation of cytochrome P450b/e gene expression by a geme- and phenobarbitone-modulated transcriptional factors //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, V. 86, P. 3963-3967.

232. Rich K.J. and Boobis A.R. Expression and inducibility of P450 enzymes during liver ontogeny // Micr. Res. Tech, 1997, V. 39, P. 424-435

233. Riddick D.S., Huang Y., Harper P.A.,Okey A.B. 2,3,7,8-teterachlorodibenzo-p-dioxin versus 3-methylcholanthrene: comparative studies of Ah receptor binding, transformation, and induction of CYP1A1 // J. Biol. Chem.,1994, V. 269, P. 1211812128.

234. Roe A.L., Blouin R.A., Howard G. In vivo phenobarbital treatment increases protein binding to a putative AP-1 site in the CYP2B2 promoter // J. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1996, V. 228, P. 110-114.

235. Ryan D.E. and Lewin W. Purification and characterization of hepatic microsomal cytochrome P-450 // Pharmacol. Ther. ,1990, V. 45, P. 153-239.

236. Ryan D.E., Lida S., Wood A.W., Thomas P.E., Lieber C.S., Levin W. Characterization of three highly purified cytochromes P-450 from hepatic microsomes of adult male rats // J. Biol. Chem, 1984, V. 259, P. 1239-1250.

237. Safe S. Modulation of gene expression and endocrine response pathways to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related compounds // Pharm. Ther., 1998, V. 67,P. 247281.

238. Schlede E. Varying effect of phenobarbital on hepatic drug metabolism in rats of different ages // Arch. Pharmacol, 1974, V. 282, P. 311-315.

239. Shu L. and Hollenberg P. Role of cytochrome P450 in DNA damage induced by N-nitrosodialkylamines in cultured rat hepatocytes // Carcinogenesis, 1996, V. 17, P. 569576.

240. Schubert I. and Netter K.J. Evidence for endogenous triggering of perinatal inducibility of hepatic monooxygenase // Biochem. Pharmacol, 1981, V. 30, P. 2901-2906.

241. Schuetz E.G., Shuetz J.D., May B., Guzellan P.S. Regulation of cytochrome P-450b/e and P-450p by growth hormone in adult rat hepatocytes cultured on a reconstituted basement membrane // J. Biol. Chem, 1990, V. 265, P. 1188-1192.

242. Schwartzman M.L., Martasek P., Rios A.R., Levere R.D., Solangi K., Goodman A.I., Abraham N.G. Cytochrome P450-dependent arachidonic acid metabolism in human kidney // Kidney International, 1990, V. 37, P.94-99.

243. Schweikl H., Taylor J.A., Kitareewan S., Linko P., Nagorney D., Goldstein J.A. Expression of CYP1F1 and CYP1A2 genes in human liver // Pharmacogenetics, 1993, V. 3, P. 239-249.

244. Shimada T., Haues CL., Yaamazaki H., Amin S., Hecht S.S., Guengerich F.P., Sutter T.R. Activation of chemically diverse procarcinogens by human cytochrome P459 1B1 // Cancer Res, 1996, V. 56, P. 2979-2984.

245. Shaw G.C. and Fulco A J. Inhibition by barbiturates of the binding of Bm3Rl repressor to its operator site on the barbiturate-inducible cytochrome P450BM-3 gene of Bacillus megaterium // J. Biol. Chem,1993, V. 268, P. 2997-3004.

246. Shen E.S. and Whitlock J.PJr. Protein-DNA interactions as a dioxin-responsive enhancer: mutational analysis of the DNA-binding site for the liganded Ah receptor // J. Biol. Chem, 1992, V. 267, P. 6815-6819.

247. Short C.R., Kinder! D.A., Smith R.D. Fetal arid neonatal development of the microsomal monooxygenase system // Drug Metab. Rev, 1976, V. 5, P. 1-42.

248. Sigle R.O., Titus M.A., Harada N., Nelson S.D. Baculovirus mediated high level expression of human placental aromatase (CYP19A1) // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1994, V. 201, P. 694-700.

249. Silver G. and Krauter K.S. Expression of cytochromes P-450c and P-450d mRNAs in cultured rat hepatocytes. 3-methylcholanthrene induction is regulated primarily at the post-transcriptional level // J. Biol. Chem., 1988, V. 263, P. 11802-11807.

250. Sitar D.S. and Desai C.D. Effect of aging on response to induction and metabolizing activity of the hepatic mixed-function oxidase system of male Sprague-Dawley rats // Can. J. Physiol. Pharmacol, 1983, V. 61, P. 89-94.

251. Slaga T.J., Gleason G.L., Mills G., Ewald L., Fu P.P., Lee H.M., Harvey R. G. Comparison of the skin tumor-initiating activities of dihydrodiols and diol-epoxides of various polycyclic aromatic hydrocarbons // Cancer Res, 1980, V. 40, P. 1081-1084

252. Stoltz C.S and Anderson A. Positive regulation of the rat CYB2B2 a phenobarbital-responsive unit by the nuclear receptor hexamer half-site nuclear factor 1 complex // Biochem. Pharmacol, 1999, V. 57, P. 1073-1076.

253. Sueyoshi T., Kawamoto T., Zelko I., Honkakoski P., Negishi M. The Repressed Nuclear Receptor CAR Responds to Phenobarbital in Activating the Human CYP2B6 Gene // J. Biol. Chem, 1999, V. 274, P. 6043-6046.

254. Surolia A. and Padmanaban G. Model for the transcriptional regulation of the CYP 2B1/2B2 gene in rat liver // Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1 995, V. 92, P. 9628-9632.

255. Swanson H.I. and Bradfield C.A. The AH-receptor: genetics, structure and function // Pharmacogenetics, 1993, V. 3, P. 213-230.

256. Swinney D.C. and Mak A.Y. Androgen formation by cytochrome P450 CYP 17. Solvent isotope effect and pH studies suggest a role for protons in the regulation of oxene versus peroxide chemistry // Biochemistry, 1994, V. 33, P. 2185-2190.

257. Takahashi Y., Nakayama K., Itoh S., Fujii-Kuriyama Y., Kamataki T. Inhibition of the transcription of CYP1A1 gene by the upstream stimulatory factor 1 in rabbits // J. Biol. Chem., 1997, V. 272,P. 30025-30031.

258. Thompson G.H., Wu R.W., Felton J.S. Introduction of cytochrome P450 1A2 metabolic capability into cell lines genetically matched for DNA repair proficiency/deficiency // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, V. 88, P. 3827-3831.

259. Thuerl C., Otten U., Knoth R., Meyer R.P., Vk B. Possible role of cytochrome P450 in inactivation of testosterone in immortalized hippocampal neurons // Brain Res, 1997, V. 762, P. 47-55.

260. Toda K., Miyahara K., Kawamoto T., Ikeda H., Sagara Y., Chizuta Y. Characterization of a cis-acting regulatory element involved in human-aromatase gene expression // Eur. J. Biochem, 1992, V. 205, P.303-309.

261. Towbin H., Staehelin T., Gorgon G. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, V. 76, P. 4350-4354.

262. Trottier E., Belzil A., Stoltz C., Anderson A. Localization of a phénobarbital responsive element (PBRE) in 5'-flanking region of the rat CYP2B2 gene // Gene, 1995, V. 158, P. 263-268.

263. Van der Hoeven T.T., Haugen D.A., Coon M.I. Cytochrome P450 purified to apparent homogeneity from phenobarbital-involved rabbit liver microsomes: catalytic and other properties // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1974, V. 60, P. 569-575.

264. Vermilion J.L. and Coon M.J. Identification of the high and low potential flavins of liver microsomal NADH-cytochrome P450 reductase // J. Biol. Chem, 1978, V. 253, P. 88128819.

265. Vook B., Hettmannsperger U., Papp T., Amelizad Z., Oesch F., Knoth R. Mapping of phenytoin-inducible cytochrome P450 immunoreactivity in the mouse central nervous system // Neuroscience, 1991, V. 42, P. 215-235.

266. Voorman R. and Aust S. Inducers of cytochrome P-450d: Influence on microsomal catalytic activities and differential regulation by enzyme stabilization // Arch. Biochem. Biophys., 1988, V. 262, P. 76-84.

267. Wang D.P. and Chiang J.Y.L. Structure and nucleotide sequences of the human cholesterol 7a-hydroxylase gene (CYP7) // Genomics, 1994, V. 20, P. 320-323.

268. Darlington G.J. Impaired energy homeostasis in C/EBPa knockout mice // Science, 1995, V. 269, P. 1108-1112.

269. Waxman D.J. Interactions of hepatic cytochromes P-450 with steroid hormones. Regioselectivity and stereospecificity of steroid metabolism and hormonal regulated of rat cytochrome P-450 enzyme expression // Biochem. Pharmacol, 1988, V. 37, P. 71-84.

270. Waxman D.J. Rat hepatic cytochrome P450 isozyme 2c. Indication as a male-specific, developmentally induced steroid 16-alpha-hydroxylase and comparison to a female-specific cytochrome P-450 isozyme // J. Biol. Chem, 1984, V. 259, P. 5481-5490.

271. Waxman D.J. P450 gene induction by structurally diverse xenochemicals: central role of nuclear receptors CAR, PXR and PPAR // Arch. Biochem. Biophys, 1999, V. 369, P. 1123.

272. Waxman D.J., Attisano C., Gungerich F.P., Lapenson D.P. Human liver microsomal steroid metabolism: identification of the major microsomal steroid hormone 6 beta-hydroxylase cytochrome P-450 enzyme // Arch. Biochem. Biophys, 1988, V. 263, P. 424-436.

273. Waxman D.J. and Azaroff L. Phenobarbital induction of cytochrome P450 gene expression // Biochem J, 1992, V. 281, P. 577-592.

274. Weiss C., Kolluri S.K., Kiefir F., Gottlicher M. Complementation of Ah receptor deficiency in hepatoma cells: negative feedback regulation and cell cycle control by the Ah receptor// Exp. Cell Res, 1996, V. 226, P. 154-163.

275. Welch R.M., Gommi B.A., Alvares A.P., Conney A.H. Effect of enzyme induction on the metabolism of benzpyrene and 3-methyl-4-monomethyl-aminoazobenzene in the pregnant and fetal rat // Cancer Res, 1972, V. 32, P. 973-978.

276. Wenger R.H. and Gassmann M. Oxygen(es) and the hypoxia-inducible factor-1 // J. Biol. Chem, 1997, V. 378, P. 609616 609621.

277. Whitlock J.P. Induction of cytochrome P4501A1 // Ann. Rev. Pharmacol, 1999, V. 39, P. 103-125.

278. Whitlock J.P.Jr., Okino S.T., Dong L„ Ко H.P., Clarke-Katzenberg R., Ma Q„ Li H. Induction of cytochrome P4501A1: model for analyzing mammalian gene transcription // FASEB J., 1996, V. 10, P. 809-818.

279. Wilson J.T. Decreased hepatic microsomal drug metabolism after the injection of a mixture containing somatotropin, corticotropin and prolactin // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1968, V. 32, P. 903-907.

280. Wilson N.M., Christou M., Jefcoate C.R. Differential expression and function of three closely related phenobarbital-inducible cytochrome P-450 isozymes in untreated rat liver // Arch. Biochem. Biphys, 1987, V. 256, P. 407-420.

281. Wishart G.J. and Dutton G.J. Regulation of onset of development of UDP-glucuronosyltransferase activity towards o-aminophenol by glucocorticoids in late-fetal rat liver in utero // Biochem. J, 1977, V. 168, P. 507-511.

282. Wrighton S.A., Molowa D.T., Guzelian P.S. Identification of a cytochrome P-450 in human fetal liver related to glucocorticoid-inducible cytochrome P-450HLp in the adult // Biochem. Pharmacol, 1988, V. 37, P. 3053-3055.

283. Woldman Ya.Yu., Weiner L.M., Gulyaeva L.F. Lyakhovich V.V.H-NMR study of theinteraction of aminopyrine with purified rat liver microsomal cytochrome P450 // FEBS Letters -1985, V. 181, P. 195 199.

284. Woldman Ya.Yu., Weiner L.M., Gulyaeva L.F. Lyakhovich NMR-study of the interaction of P450 with 4-methoxypyridine // FEBS Letters 1987, V. 212, P. 53 - 57.

285. Wolff Т., Greim H., Huang M,T. Aldrin epoxydation catalyzed by purified rat liver ccytochromes P-450 and P-448. High selectivity for cytochrome P-450 // Eur. J. Biochem., 1980, V. 3, P. 545-551.

286. Wood A.W., Ryan D.E., Thomas P.E., Levin W. Regio- and stereo-selective metabolism of two C-19 steroids by five highly purified and reconstituted rat hepatic cytochrome P-450 isosymes // J. Biol. Chem, 1983, V. 158, P. 8839-8847.

287. Wu X., Shi H„ Jiang H., Kemp B., Hong W.K., Delclos G.L., Spotz M.R. Association between cytochrome P4502E1 genotype, mutagen sensitivity, cigarette smoking and susceptibility to lung cancer // Carcinogenesis, 1997, V. 18, P. 967-973.

288. Yang H,Y.L., Namkung M.J., Jachau M.R. Cytochrome P-450-dependent biotransformation of a series of phenoxazone ethers in the rat conceptus during early organogenesis: Evidence for multiple P-450 isoenzymes // Mol. Pharmacol., 1988, V. 34, P. 67-73.

289. Yanovski B.A., Willy P.J., Devi T.R., Falck J.R., Mangelsdorf D.J. An oxysterol signaling pathway mediated by the nuclear receptor LXPa // Nature, 1996, V. 383, P.728-731.

290. Yasukochi Y. and Masters B.S.S. Some properties of a detergent solubilized NADPHcytochrome c (P-450) reductase purified by biospecific chromatography // J. Biol.

291. Chem., 1976, V. 251, P. 5337-5344.w j t;ia ¿1533-9-OY