Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Химические методы флюоресцентного мечения ДНК и РНК. Гибридизация флюоресцентных проб на микроматрице

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Химические методы флюоресцентного мечения ДНК и РНК. Гибридизация флюоресцентных проб на микроматрице"

сг,

«=Г ¿Г

О и

^ На правах рукописи

Г|э _,

I... ™ ПРУДНИКОВ ДМИТРИЙ ЮРЬЕВИЧ

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО МЕЧЕНИЯ ДНК И РНК. ГИБРИДИЗАЦИЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ ПРОБ НА МИКРОМАТРИЦЕ.

03.00.03 молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наух

Москва 1997

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологин им. В.А.Энгельгардта РАН и в Аргонской Национальной Лаборатории (США).

Научный руководитель:

доктор химических наук, проф., акад. РАН А. Д. Мирзабеков.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф., акад. РАН А. А. Краевский. доктор химических наук, проф. А. М. Юркевич.

Ведущая организация-

НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ

Защита состоится года в /^т..часов на заседании

диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

/

г

г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нерадиоактивные молекулярно-биалогические методы детекции быстро вытесняют радиоизотопные методы анализа. Эта тенденция берет начало с середины 70-х годов, когда нерадиоактнвный метод конъюгации фермент-антитело (ELISA) потеснил радиоиммунологию. Главная проблема в развитии нерадиоактивных систем дня ДНК и РНК детекции - возможность модификации нуклеиновой кислоты детектирующим компонентом таким образом, чтобы это не влияло на гибридизационкые свойства первой. К сожалению, методы, разработанные для кросс-сшивки или флюоресцентного мечения белков не всегда применимы для нуклеиновых кислот. Главными реахционноспособными группами в белках являются первичные амины, тиолы, карбоксигруппы - т.е. те, которые относительно легко подвергаются модификации.

Ни ДНК, ни РНК не содержат подобного рода функциональных групп. Обычным местом атаки флюоресцентной молекулы являются аминогруппы нуклеиновых оснований или фосфатные остатки.

Опубликованные химические методы флюоресцентного мечения ДНК/РНК предполагают первоначальное создание активных центров на молекуле нуклеиновой кислоты с последующей обработкой этих центров активированными красителями. Главным преимуществом подобного рода мечения составляет весьма низкая стоимость реагентов по сравнению со стоимостью флюоресцентно-меченых трифосфатов, используемых для ферментативных процедур. К сожалению, места создания активных центров в нуклеиновых кислотах весьма немногочисленны. Более того, большая часть подобного рода методов, как то аминирование фосфатных групп, либо переаминирование цитозина и проч. включает краситель по всей длине цепи ДНК (РНК), что не всегда благоприятно для дальнейшего использования флюоресцентно-меченных продуктов, например, в гибридизационных экспериментах. Помимо этого, для проведения количественного анализа образца эффективность мечения не должна зависеть от длины фрагментов. Последнее условие может быть выполнено предпочтительнее при химическом введении метки (исключающем ферментативные реакции).

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось создание и оптимизация метода флюоресцентною мечения ДНК, позволяющего проводить фрагментацию с последующим введением флюоресцентного красителя.

В работе были поставлены следующие задачи:

-определить оптимальные условия введения диаминов а также аминосодержащих флюоресцентных красителей в частично апуринизованную ДНК с полной или частичной фрагментацией последней;

-определить условия иммобилизации и гибридизационные свойства ДНК, содержащей образовавшиеся первичные аминогруппы, в полиакрнламидном геле;

-используя первичные аминогруппы апуринизованной ДНК, появляющиеся в нуклеиновой кислоте процессе восстановительного присоединения диаминов, провести флюоресцентное мечение образцов рибосомной кДНК ряда

микроорганизмов и выявить для них оптимальные условия дискриминации паттернов гибридизации.

Научная новизна работы. Впервые предложен вариант введения флюоресцентного красителя в ДНК по апуриновым участкам. Флюоресцентное мечение может сопровождаться либо полной, либо частичной фрагментацией ДНК по местам включения красителя, в зависимости от желания экспериментатора. Введение диамина в цепь ДНК как патента для последующего присоединения активированного красителя делает метод весьма универсальным, в то же время метод позволяет проводить флюоресцентное мечение нуклеиновой кислоты путем непосредственной обработки апуриновой ДНК аминосодержащим красителем.

Методы носят универсальный характер: незначительные модификации процедуры позволяют проводить мечение как ДНК, так и РНК.

Описанные методы введения флюоресцентных красителей в полинуклеотидную цепь были использованы для флюоресцентного мечения ДНК и РНК ряда микроорганизмов. Впервые была проведена идентификация различных видов бактерий путем гибридизации их тотальной и рибосомной РНК на микроматрице.

Впервые в полиакриламидном геле была проведена иммобилизация ДНК по апуриновым участкам.

Практическая ценность работы. Описанные методы введения аминогрупп в ДНК и РНК имеют универсальный характер и позволяют проводить не только реакции флюоресцентного мечения нуклеиновых кислот, во и использовать активированные подобным образом нуклеиновые кислоты в ряде других практических приложений. Одним из вариантов такого рода приложений является, например, иммобилизация ДНК в полиакриламидном геле. В перспективе это может быть использовано для анализа библиотек клонов кДНК.

Описание методы мечения могут быть легко автоматизированы и использованы на производстве.

Публикации. По Материалам диссертации опубликовано 3 статьи в международных журналах.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на D.OE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop V (Santa Fe, New Mexico, USA, 1996), а так же на конференцях "Microfabrication Technology for Research and • Diagnostics" (San Francisco, California, USA, 1996) и "Advances in Labels, Signaling & Detection (Improving Sensitivity, Accuracy and Speed)" (San Diego, California, USA, 1997).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из пяти разделов: Введение, Обзор литературы, Результаты и их обсуждение, Материалы и методы и Выводы. Работа изложена на 91 странице и содержит 13 рисунков, 16 схем и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 119 работ.

!

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В данной работе предлагается ряд новых эффективных методов введения флюоресцентной метки в ДНК через восстановительное присоединение реагентов, содержащих аминогруппы, к апуриновой ДНК. Процедура может сопровождаться полной или частичной фрагментацией ДНК по местам введения флюоресцентной метки.

Описанный метод флюоресцентного мечения без каких-либо существенных изменений использовался для иммобилизации ДНК в полиакриламидном геле. Проведена процедура гибридизации одноцепочечного фрагмента гена НЬА 0<3а, меченного по предложенным методикам, на микроматрице, содержащей комплементарные ему олигонуклеотидные зонды.

Проведена гибридизация фрагмектированного РНК-транскрипта (полученного с продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена НЬА 0(2а), меченного через присоединение аминосодержащих флюоресцентных красителей по окисленному З'-концевому рибозвену. Показана возможность использования описанных процедур для идентификации микроорганизмов путем гибридизации клеточной, рибосомной РНК, либо кДНК рибосомной РНК на микроматрице.

1. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО МЕЧЕНИЯ ДНК И РНК.

Предлагаемый нами метод флюоресцентного мечения ДНК по апуриновым и, возможно, по апиримидиновьм сайтам, основан на' реакции взаимодействия альдегидных групп сахарных остатков ДНК с реагентами, содержащими аминогруппы. Как известно, результатом такой реакции являются неустойчивые основания Шиффа, существующие в сахарах в виде гликозиламинов Гликозиламины могут далее восстанавливаться до алкиламинов с помощью цианоборогидрида натрия или борогидрида натрия. Амин, участвующий в образовании основания Шиффа, имеет флюоресцентную метку или активную группу, способную связываться с флюоресцентным красителем, за счет чего, после восстановления, образуется, соответственно, флюоресцентно меченный фрагмент ДНК или промежуточный продукт, способный к непосредственному взаимодействию с флюоресцентной меткой. Таким образом, метод может быть использован в двух вариантах:

Метод 1: вариант с полной фрагментацией (схема 1) - предполагает полное Р-элиминирование апуриновых сайтов ДНК обработкой раствором этилендиамина с последующим восстановительным присоединением последнего путем добавления натрия борогидрида. При обработке полученного продукта активированным флюоресцентным красителем получаем фрагменты ДНК, имеющие на З'-концевом сахарном остатке флюоресцентную метку 2-

Метод 2: вариант с частичной фрагментацией - предполагает непосредственную обработку частично апуринизованной ДНК флюоресцентным красителем, содержащим полиэфирный линкер с концевой алкилгидразиновой группой 2-

Стабилюация аддукта конденсации метки и апуриновой ДНК достигается восстановлением цианоборогидридом натрия. Результатом превращений является смесь продуктов, содержащих флюоресцентную метку как в середине цепи, так и на конце. Степнь фрагментации ДНК зависит от времени инкубации апуриновой ДНК с флюоресцентной меткой и может варьироваться от 30% (инкубация в

течении 1 чяга^ по ^ишгу^ятгнд в течеяни 7 ч-сси).

Предлагаемые методы флюоресцентного мечения РНК являются модификацией ранее описанных способов введения первичных аминов и тиосемикарбазидов по окисленному вицинальному цис-диолу РНК, Целью исследования в данном направлении являлась оптимизация собственно метода флюоресцентного мечения.

Количественные характеристики методов приведены в таблице 1. Эксперименты проводились на модельных олигонуклеотидах 5'-ё(ТбСТ8) или 5'-(с!А)8ги. Измерение степени фрагментации апуринизованных одигонуклеотидов, а так же некоторые измерения выхода флюоресцентно-меченых продуктов проводились путем сканирования радиоавтотрафов рис. 1А, 2А, 2Б и 5. Как альтернативный вариант измерения выхода продуктов мечения использовалась УФ-спектроскопия.

Таблица 1. Выход флюоресцентно-меченых продухтов при использовынии предлагаемых методов флюоресцентного мечения.

Олигонуклеотид Процедура мечения Фрагментация (%) Выход флюоресцентно-меченого олигонуклеотида, %

1. 5'-d(T6GT8) ТМР-гидразин 52 20 59'

2. 5'-d(T6GT8) этилендиамин+ флюорофор 87 556, 46'

3. 5'-dAgUrib(, ТМР-гвдразин 52 65®, 59'

4. 5'- dAgUfibo этилендиамин+ флюорофор 48'

"Выход измерялся УФ-спектроскопией. 5Выход измерялся сканированием радиоавтографа.

1.1. Флюоресцентное мечение ДНК

Первая стадия процедуры (апуринизация) включает обработку ДНК либо 0.1 М соляной, либо 80% муравьиной кислотой. Выбор природы кислоты зависит от природы ДНК. Нами показано, что степень апуринизации муравьиной кислотой в течении 0,5 часа при комнатной температуре соответствует степени апуринизации соляной кислотой при +37°С в течении 1,5 часов

В качестве модельных соединений для процедуры флюоресцентного мечения нами были выбраны олигонуклеотвд dfTbGTg), радиоактивно меченный [■у-32Р] АТР с единственным пуриновым нуклеотндом в центре и полимер poly(dA-dT)»poly(dA-dT), причем первый подвергался полной апуринизации; частичная апуринизация полимера poly(dA-dT)»poly(dA-dT) проводилась либо соляной, либо муравьиной кислотой.

Дальнейшая обработка продукта апуринизации основаниями приводит к образованию продуктов p-элиминирования, а так же продукта р,5-элиминования. Проведение реакции элиминирования в мягких условиях приводит исключительно к p-элиминированию,- что позволяет сохранить на З'-конце фрагмента ДНК сахарный остаток.

Мы объединили стадии элиминирования, образования основания Шиффа и его последующее восстановление раствором боропщрида натрия в единый процесс. Это позволяет избежать дополнительных процедур очистки и выделения продуктов. Выбор этилендиамина как аминирующего агента был обусловлен его хорошей водорастворимостью, стабильностью по отношению к окислению кислородом воздуха (по сравнению с фенилендиамином), а также бифункциональностью - свободная аминогруппа может участвовать в реакции флюоресцентного мечения.

Схема 1. Флюоресцентное мечение РНК и апуринизованной ДНК. ФИТЦ-изотиоцианат флюоресцеина, БСЛ-ТМР- изотиоцианат тетраметилродамина) У-флюорофор.

е

1П IV

Рис. 1. Флюоресцентное меченне [32Р]с1(ТбОТ8) после фрагментации по апуринизованным сайтам и присоединения этилендиамина. А-Гель-электрофорез апуршшзованного олигонуклеотида [32Р]с1(ТбОТа) (дорожка 1) после обработки с пиперидином при 100°С в течении 1 часа (дорожка 2) или после реакции' с этилендиамином с последующим восстановлением натрия борогидридом (дорожка 3). Б- Гель-электрофорез соединений НУ (Рис. 1А, дорожка 3) обработанных сукцинимвдным эфиром тетраметилродамина.

Использование других восстановителей, как то пирндиний-боранового комплекса, а так же натрия цианоборогидрнда приводит к понижению выхода целевого продукта 2-

С целью определения выхода реакции нами было измерено процентное содержание продукта, связанного с этилендиамином, в реакционной смеси. Электрофорез в денатурирующем полиакриламвдном геле (рис. 1А, дорожка 3) позволяет с весьма высокой эффективностью провести разделение и измерение соотношения продуктов превращения. Дальнейший анализ показал, что единственным реакционноспособным соединением по отношению к сукцинимидному эфиру тетраметилродамина является II (рис. 1А).

Аналогично изложенной процедуре было проведено флюоресцентное мечение 1 нм ТбОТв; выход продукта реакции составил от 50 до 60 процентов.

Другая схема предполагает непосредственную обработку апуриновой ДНК флюоресцентным красителем без промежуточной реакции с бифункциональным аминолинкером 2.

1 23456789 10

Рис. 2. Влияние различных восстановителей и рН на выход конденсации апуринового [32Р]с1(ТбСТ8) с красителем 1. А Гель-электрофорез восстановительного присоединения гидразинсодержащего ТМР 'к депуринизованному олигонуклеотиду [32Р]с1(ТбСТ8) в присутствии натрия борогидрида (дорожка 1), натрия цианоборогидрида (дорожка 2) и пиридиний-боранового комплекса (дорожка 3). Апуринизованный [32Р]<1(ТбОТа), обработанный пиперидином (дорожка 4) и апуринизованный (дорожка 5). Исходный олигонуклеотвд [32Р](1(ТбОТ8)- дорожка 6. Б - гель-электрофорез полностью апуринизовагаюго сшигонуклеотида [32Р]с1(Те,СТ8) (дорожка 1) после восстановительного присоединения 2 в 50 мМ ацетатном (фосфатном) буфере, рН 3.75-7.0, восстановленного натрия цианоборогидридом:

Необходимо отметить, что гвдразиновые группы флюоресцентного красителя 2 , играя роль основания, способствуют Р,6-элиминованию. В отличии от этилендиамина, получить преимущественное р-элиминирование с использованием соединения 2, нам не удалось. Понятно, что степень р,6-элиминования зависит от времени инкубации апуринового олигонуклеотида (ДНК) с флюоресцентным красителем.

Рисунок 2А демонстрирует зависимость выхода флюоресцентно-меченного продукта от выбора восстановителя, 2Б - зависимость выхода флюоресцентно-меченого продукта от рН реакционной среды. Полоса П (2Б) соответствует соединению 2 схемы 1, полоса I- апуриновый [32Р]с1(ТбСТ8) 1.

Флюоресцентное мечение ДНК может проводиться как в растворе, с последующим переосаждением, так и на колонке через серию промь!вок

реакционными растворами. Колоночная процедура более проста в техническом исполнении и может быть лепсо автоматизирована.

1 £ Л А

Рис.3. Флюоресцентное мечение ро1у(<1А-(1Т)-ро1у(<1А-с1Т) (дорожка 1) через восстановительное присоединение этилендиамина. Дорожки 2, 3 и 4-флюоресцеин, продукт конденсации флюоресцеина с этилендиамином и бромфеноловый синий, соответственно.

1.2. Флюоресцентное мечение РНК

Предлагаемые нами методы флюоресцентного мечения РНК основаны на опубликованных ранее способах включения аминосодержащих флюоресцентных красителей (в т.ч. первичных аминов и тиосемикарб азидов) по окисленному 3'-концевому рибозвену.

Нами было проведено флюоресцентное мечение модельных олигонуклеотидов, содержащих концевое рибозвено, посредством присоединения этилендиамина, с последующей обработкой полученного продукта изотиоцианатами тетраметилродамина, либо флюоресцеина а так же тетраметилродамина, содержащего алкилпщразиновый полиэфирный линкер. Последний подход технологически более прост на стадии собственно мечения РНК, хотя требует предварительной подготовки флюоресцентного красителя, включающей его синтез и выделение. Несмотря на это, первый является более универсальным, так как позволяет проводить флюоресцентное мечение РНК любыми флюоресцентными красителями, находящимися в форме изотиоцианатов, сукцинимидных эфиров, либо сульфохлоридов. Это тем более важно, так как не все флюоресцентные аминопроизводные выдерживают процедуру восстановления, стабилизирующую аддукт присоединения аминогруппы к РНК.

Процедура восстановительного присоединения этилендиамина была проведена на 800 пмоль модельного олигонуклеотида ((1А)8Ги. Олигонуклеотид 1 (схема 1) подвергался периодатному окислению, после чего в слабокислой среде в присутствии цианоборогндрида натрия проводилась конденсация полученного продукта с этилендиамином. После переосаждения олигонуклеотид растворяли в сухом диметилсульфоксиде и проводили его конденсацию с изотиоцианатом флюоресцеина. Избыток непрореагировавшего красителя удаляли насыщенным

водным бутанолом из подкисленного водного раствора, после чего образец переосаждали, регистрировали УФ-спектр в минимальном объеме водного раствора.

Другой метод предполагает непосредственное введение флюоресцентного красителя в окисленное концевое рибозвено. В качестве концевой активной группы линкера нами был выбран алкилгидразин исходя из его более высокой нуклеофильности по сравнению с имеющимися в продаже флюоресцентными аналогами, несущими концевой амин, семикарбазид, либо гидразид. Достаточно длинный линкер обеспечивает высокий выход реакции за счет уменьшения стерических препятствий. Полиэфирная природа линкера обеспечивает его гидрофильность (что весьма важно при проведении гибридизационного эксперимента).

Процедуру флюоресцентного мечения проводили на модельном олигонуклеотиде [32Р](<1А)8ги в различных рН 50 мМ натрийацетатного буфера. По оканчании флюоресцентного мечения образцы освобождали от примесей свободного красителя экстракцией бутанолом и наносили на полиакриламидный гель (рис. 5).

Рисунок демонстрирует влияние рН буфера, используемого для флюоресцентного мечения, на выход целевого продукта. Видим, что оптимальная рН для образования аддукта конденсации, как восстановленного (полоса II рисунка 5, соединение схемы 4), так и невосстановленного (полоса I рисунка 5) находится в пределах от 3.75 до 4.5. Увеличение алектрофоретической подвижности восстановленного продукта по отношению к невосстановленному обусловлено наличцем в невосстановленной форме положительно заряженного интермедиата.

С 6.5 4.0 4.9

О 3.75 4.5 5.2 Р

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 5. Влияние рН на выход продукта восстановительного аминировання олигонуклеотида [33Р]бА8ипьо флюоресцентным красителем 2 в присутствии цианоборогидрида натрия. Дорожка 1- [32Р](с1А)8ги; дорожка 2- [32P](dA)8гU после периодатного окисления. Дорожки 3-8- продукты восстановительного присоединения 2 к окисленному [32Р](йА)вги в присугствии цианоборогидрвда натрия в 35 мМ ацетатном или фосфатном буфере, рН 3.75-6.5. Полоса 1-невосстановленный продукт конденсации метки 1 с исходным олигонуклесгтидом; полоса II- восстановленный продукт; полоса III- немеченный исходный олигонуклеотид.

2. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ДНК НА ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ Ш1Е ЧЕРЕЗ АПУРИНОВЫЕ УЧАСТКИ

Высокая реакционная способность апуриновых участков ДНК может быть использована не только для ее флюоресцентного мечения, но так же и, например, для ее иммобилизации на полиакрил амидную микроматрицу. Процесс может проводиться как на полиакриламидном геле, обработанным гидразином, так и на геле, содержащем альдегидные группы.

А

5'-Техасс.Красн.-Ш-Т6ОТ8-ЗМеШ (1) 5' СвСССС-СО-ЗМсШ (4) 100 фмоль ДНК ЭОа, 10 мин. апур. 100 фмоль ДНК ОСЗа, 50 мин. апур.

б'-СОАССАСГГСТ АТОТСС-ЗМсШ (2) 5'-ААТПТ-АА-змПМ (5) 30 фмоль ДНК СКЗа, 10 мин. апур. 30 фмоль ДНК 0<2а, 50 мин. апур.

5' -СС АСЗСАСТТ-СТ-ЗМеШ (3) З'-вТСААС-ТС-змПМ (6) 10 фмоль ДНК йОа, Ю мин. апур. 10 фмоль ДНК ООа, 50 мин. апур.

® ®

е 0

: с

Рис. 6. А- схема расположения иммобилизованных олигонуклеотидов и ДНК на микроматрице. Б- картина гибридизации микрочипа с синтетическим олигонуклеотидом 5'- СТССАССТССАСАТАОААСТССТССТСТ- Ш-Техасский Красный. Матрица содержала 226 членный фрагмент ДНК ЕХ2а: б'-АССбТОТА ААСПТСТАССАСТСГГАСООТСССТСТССССАСТТСАСССАТСААТТГСАТОа АСАССАССАСТТСТАТаТСбАССТССАСАСОААСОАСАСТСТСТСОААСТ ТСССГСТСТТССАСАОАСТТАСАТГТОАСССаСААТТТССАСТОАСАААСАТС ОСТСТССТААААСАТААСТГСААСАТССТОАТТАААСССТССААСТСТАССО СТССТАССАА. Жирным шрифтом выделен участок комплементарности иммобилизованной ДНК гибридизуемому олигонуьпеотиду. Матрица содержит как контрольные олигонуклеотиды, способные к гибридизации с флюоресцентно-меченным олигонуклеотидом гибридизационного раствора (2-3), так и контроля, не комплементарные указанному олигонуклеотиду (4-6) (колличество олигонуклеотидов в ячейке геля составляет 10 фмоль).

Рис. 6 демонстрирует картину гибридизации апуриновой ДНК, иммобилизованной на квадратах полиакрияамидного геля, с синтетическим олигонуклеотидом, флюоресцентно меченным Техасским Красным. ДНК

наносилась на гель непосредственно после акта апуринизации, после чего гибридизация проводилась в стандартных условиях (рис. 6). Метод очень прост в препаративном исполнении. Очевидным недостатком такого подхода является нестабильность связи между ДНК и гелем, в силу чего нами была предпринята попытка провести иммобилизацию ДНК через присоединение этилевдиамина по апуриновым участкам с последующим восстановительным присоединением полученного продукта к гелю, содержащему альдегидные группы.

ДНК подвергалась предварительной апуринизации муравьиной кислотой с последующим восстановительным присоединением этилевдиамина, как описано в экспериментальной части (раздел, посвященный флюоресцентному мечению ДНК). Продукты превращений либо подвергались очистке от этилендиамина на сорбенте С-18, либо использовались для дальнейшей иммобилизации на полиакриламидном геле без выделения. Бьио обнаружено, что эффективность иммобилизации и последующей гибридизации с флюоресцентно-меченным материалом в обоих случаях одинакова.

Рис. 7 А демонстрирует типичную картину гибридизации иммобилизованного через апуриновые участки 40-членного олигонуклеотида 5'-ТАССАСТТТТАСССТСССТСГСОССАСТАСАСССАТСААТ с флюоресцентно меченым олигонуклеотидом 5'-ААААСГООТА-Техасский красный. Анализ распределения интенсивностей флюоресценции на графиках 7Б-7В выявляет две . тенденции:

1) увеличение доли пуриновых нуклеотидов в гибридизуемом олигонуклеотиде соответствует увеличению доли пиримвдинов в комплиментарном ему участке 40-членника. Поскольку иммобилизация проводится по местам апуринизации, увеличение доли пуриновых нуклеотидов в гибридизуемом участке будет увеличивать вероятность нарушения олигонклеотидной последовательности в месте гибридизации, и, как следствие, приводить к ослаблению гибрвдизационного сигнала. Так, флюоресцентно-меченные сшигонуклеотиды 2 и 3, в которых отношение пиримидин - пурин одинаково (3/7) дают более интенсивные сигналы гибридизации, чем олигонуклеотды 1 и 4, соотношение пиримидинов к пуринам в которых составляет 4/6 и 5/4, соответственно.

2) Сравнение АЛМЗ/С состава 2 и 3 олигонуклеотидов показывает, что в комплементарной 2 олигонукпеотиду структуре все три пуриновых остатка являются гуанинами в отличии от, например, олигонуклеотида #3, где комплементарная последовательность содержит только один гуанозин из трех. Поскольку скорость гидролиза гуанозина слегка превышает скорость гидролиза аденозина, было бы логично ожидать уменьшение интенсивности гибридизуемых сигналов олигонуклеотида #2 по отношению к #3, что и наблюдается на рисунке 7Б.

3 нин

_ДНК _

Фрагментиров. /Нефрагментйр.

Итенсивность флюорссценцйнГ-нормир. на ф< ж

номера, опитому адеоткдов

3 Время

" апуринизации, мин.

Итенсивность флюоресцешш нормир. на фок

номера олиго-нуклеотилов

„„ 60 40

10 2ёреш

агтуршшзапин, мин.

Рис. 7. А- Гибридизация иммобилизованного олигонуклеотвда 5'-ТАССАОПТГАСССТСССТСТСО-ССАОТАСАСССАТСААТ с флюоресцентно меченым 5'-ААААСТСОТА-Тех. крас. (#3). Гибридизация проводилась 14 часов при +4°С. Количество ДНК, иммобилизованной в квадрате геля, составляет 100 фмоль. Распределение флюоресцентных сигналов при гибридизации -олигонуклеотидов~разногопурин-пиримидйнового состава с иммобилизованным фрагментированным (Б) и нефрагментированным 40-чпенным олигонуклеотидом (В). При гибридизации использовались одигонуклеотиды (в скобках указан номер олигонукдеотида на 1рафиках 7Б-7В и соотношение пиримидинов и пуринов в его составе): 5'-САТСОСТОТА-Тех. Кр. (#1, 6/4), 5'-САОАССОАСС-Тех. Кр. (#2, 3/7), 5'- ААААСгаетА-Тех. Кр. (#3, 3/7), б'-СТАСТСССС-Тех. Кр. (#4, 5/4).

3) Присоединение этилевдиамина по алуриновым участкам без предварительного акта {1-элимимфования и последующая иммобилизация полученного продукта на геле приводит к частичному удалению пуриновых оснований из полинуклеотидной цепи, сохраняя в целом ее структуру, что приводит к уменьшению различий в гибридизации олигонуклеотидов разного состава (рисунок 7В).

3. ГИБРИДИЗАЦИЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННЫХ ОБРАЗЦОВ ДНК И РНК НА МИКРОМАТРИЦЕ

Одноцепочечная ДНК (продукт асимметричной полимеразной цепной реакции) была подвергнута частичной апуринизации и помечена через присоединение ТМР-гиаразина 14, либо была фрагментирована этилендиамином и мечена через активированный флюоресцеин. РНК метилась либо энзиматически, либо через окисление З'-концевого рибозвена и присоединение TMP- гидразина. Гибридизационные картины образцов различным образом меченных ДНК и РНК приведены на рис. 8Б. Как и следовало ожидать, полностью фрагментированная ДНК (8А) гибридизуется более эффективно, давая более ярко выраженные сигналы, чем фрагментированная частично (рис. 8Б). Интенсивность сигналов так же растет с увеличением длины иммобилизованных олигонуклсотидов. Более длинные фрагменты ДНК (РНК) гибридизуются по периферии квадратов геля в силу затруднения диффузии, а так же за счет большой вероятности образования вторичной структуры, в отличии от полностью фрагментированных образцов, интенсивность флюоресценции которых практически равномерно распределяется по всей поверхности квадрата геля.

Апуринизация- сопровождалась удалением примерно 2% оснований ДНК. Случайное удаление нескольких оснований, например, из 200 членной последовательности, не должно кардинально сказываться на эффективности и : характере гибридизацинных синапов. Как видим, метод позволяет проводить одновременную детекцию, близкую к количественной, нескольких образцов ДНК (РНК), меченных разными красителями.

В работе так же демонстрируется применение микрочипов для анализа образцов нитробактерий. Нитробактерии весьма трудны в работе при использовании наиболее распространенного метода селективной среды в силу весьма длительного жизненного цикла. Микрочиповая технология анализа генетического материали бактерий позволяет избежать этих трудностей.

Анализ проводился на образцах ДНК (одно- и двухцепочечной), РНК (тотальной и рибосомной, выделенной непосредственно из микроорганизмов), а так же на образце РНК следующих бактерий: Nitrosovibrio tenius, Nitrosomonas europea, Nitrosospira briensis, E. coli I6S

А

10-мер 5'-ТСТ CCA ТСА Л-Гель

20-мер 5'-ТСА ТСТ ССА ТСА ААТ ТСА TG-Гель

30-мер S'-G TAG ААС ТСС ТСА ТСТ ССА ТСА ААТ ТСА TG-Гель

ДНК, РНК!

3'..д.л...С АТС TTG AGG AGT AGA GGT AGT TTA AGT AC47—5'

Б

30-мер 20-мер 10-мер 30-мер 20-мер 10-мер

I II

Рис. 8. Гибридизация флюоресцентно-меченных ДНК и РНК (фрагменты гена HLA DQa) на микроматрицах. А- схема фрагмента РНК (ДНК) длиной 230 нукеотндных оснований, и комплементарых ему 10-, 20-, и 30- меров, иммобилизованных на микроматрице. Б- Флюоресцентно меченые разными способами образцы ДНК (РНК) были гибридизованы с микрочипом; (а) частично апуринизованная ДНК фрагментировалась этнлешшамином и метилась активированным флюоресцином; (б) апуринизованная ДНК меченная ТМР-гвдразином 2; (в) РНК, меченная ТМР-гидразином 2; (г) РНК, меченная флюоресцентным урвдинтрифосфатом во время транкрипции используя Ambion MEGA shortscript kit в соответствии с процедурой. Образцы (а) и (б) гибридизовались в смеси и детектировались на флюоресцентном микроскопе одноврено на разных длинах волн. I- картины гибридизации, П-соотношение интегральных интенсивностей сигналов ячеек геля.

Хотя ожидаемая гибрвдизационная картина наблюдалась как при гибридизации ДНК, так и при гибридизации тотальной РНК, наиболее значительная дискриминация наблюдается при гибридизации рРНК-транскрюггов. Рис. 9 демонстрирует картину гибридизации Nittrosovibrio tenuis (A), Nitrosomonas europaea (Б) и E.Coli (В). Для гибридизации использовался один и тот же микрочип, отмываемый после каждого акта гибридизации. Поскольку иммобилизованные олигонуклеотиды имеют различную температуру плавления создаваемых ими дуплексов, то при нанесении одинаковой их концентрации и проведении гибрвдизационного эксперимента при одной и той же температуре для всех дуплексов, мы получаем гибридизационные сигналы различной интенсивности. Избежать этого можно варьируя либо концентрацию иммобилизованных олигонуклеотидов, либо их длину.

Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов, влияющих на термодинамику гибридизационного процесса, включая концентрацию иммобилизованных олигонуклеотидов на микроматрице, концентрацию ДНК в растворе, длину дуплексов и их G-C состав. Поскольку концентрация олигонуклеотидов в ячейках геля может меняться в широких пределах, это может служить основой для нормализации гибридизационных сигналов без изменения структуры образца.

Таблица 2. Состав оликонуклеотидных зондов для . анализа микробилогических образцов.

Название олигонуклеотида Последовательность Соответствие классу бактерии

NblOOO 5*-tgcgaccggtcatgg Nitrobacter

NIT3 5'-cctgtgctccatgctccg Nitrobacter

NEU23 5' -cccctctgctgcactcta Нитросомонас

Nsol90 5 '-cgatcccctgcttUct Ammonia oxidizers

Nsol225 5'-cgcgattgtattacgtgtga Ammonia oxidizers

Nsml56 S'-tattagcacatctttcgat Nitrosomonas

Nsv443 5' -ccgtgaccgtttcgttcc Nitrosospira

Bac338 5'-gctf>cctcccgtagggat Бактерия

NonBac338 5'-actcctacgggaggcagc Бактерия

Uni 1390 5'-gacgggcggtgtgtacaa Все жизненные формы

Таблица 3. Локализация олигонуклеотидов на полиакриламидной матрице:

I II III IV

А №1000 мтз МЕШЗ N50190

В N801225 №т156 N84443 -

С Вас338 №пВас338 иш!390 -

.. п к» (Ы;- *ттсчи #»гс1л«г».

о □ , -

■■■•'М ».Те Ь 4 С 1*1 • \ .. Л'

а-ят оп.13 ^ *

б>е*»гц Т

П О

Рисунок 9. Гибридизация образцов бактериальной РНК на микрочипе. А -163 РНК Шг^отопаI, Б - 16Б РНК ЫНго.ктЬго, В - 16Б РНК Е. СоП.

выводы

1. Предложен новый метод флюоресцентного мечения ДНК путем частичной апуринизации ДНК, восстановительного присоединения этилендиамина по алуриновым сайтам и включения флюоресцентной метки по аминогруппе. При этом непосредственное введение флюоресцентного красителя, содержащего аминогруппу, в молекулу ДНК, позволяет намного ускоритть и упростить процесс мечения вцелом. Процедуру мечения возможно проводить как в растворе, так и на колонке. Последняя позволяет автоматизировать процесс, что весьма существенно при анализе большого колличества проб.

2. Детально изучена и оптимизирована процедура мечения РНК через восстановительное присоединение аминогрупп к окисленному рибозвену.

3. По предложенным методам проведено флюоресцентное мечение ряда образцов РНК и ДНК. Результаты флюоресцентного мечения подтверждены методом электрофореза и гибридизацией на микроматрице.

4. Используя предложенные методы флюоресцентного мечения проведена идентификация клеточной, рибосомной РНК, РНК-транскрипта, а так же ДНК ряда микроорганизмов, и ПЦР транскрипта гена НЬА 0(}а человека с помощью гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами.

5. Используя активацию частично апуринизованной ДНК диаминами, проведена иммобилизация ДНК в полиакриламидном геле для получения ДНК-микрочипов; проведен подробный анализ гибридизационных свойств иммобилизованной ДНК.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. D. Proudnikov and A. Mirzabekov. Chemical Methods of DNA and RNA Fluorescent Labeling, Nucleic Acids Res., 1996, 24, 4535-4542.

2. D. Y. Guschin, В. K. Mobarry, D. Proudnikov, D.A. Stahl, В. E. Rittmann and A. D. Mirzabekov. Oligonucleotide Microchips as Genosensors for Determinative and Environmental Studies in Microbiology. Applied and Environmental Microbiology. 1997, 62, 6, 2397-2402.

3. D.Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. Shick, D. Proudnikov, P. Arenkov and A. Mirzabekov. Manual Manufacturing of Oligonucleotide, DNA, and Protein Microchips. Analytical Biochemistry, 1997, 250, 203-211.

4. D. Proudnikov, E. Timofeev and A. Mirzabekov. DNA Microchip: DNA Immobilization within Polyacrylamide Gel. Nucleic Acids Res., Принята к публикации.

5. A. Mirzabekov, G. Yershov, V. Barski, E. Timofeev, D. Guschin, V. Schick, S. Dubiley, D. Pobedimskaya and D. Prudnikov. Biological Microchips: Development and Applications. Abstracts of conference "Microfabrication Technology for Research and Diagnostics", San Francisco, California, J 996.

6. V. Shick, S. Dubiley, N. Kalganova, D. Pobedimskaya, D. Prudnikov, A. Perov, D. Guschin, S. Belikov and A. Mirzabekov. Detection of Beta-Thalassemia Mutations by Hybridization with Oligonucleotide Microchips, Abstracts of Contractor-Grantee Workshop V, Santa Fe, New Mexico, 1996.

7. D. Proudnikov, E. Timofeev and A. Mirzabekov. Chemical Methods of DNA and RNA Fluorescent Labeling and Attachment to Gel Support. Abstracts of conference "Advances in Labels, Signaling & Detection (Improving Sensitivity, Accuracy and Speed)", San Diego, California, 1997.