Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных белков HU и p50 с однонитевой и двунитевой ДНК с помощью универсального олигонуклеотидного микрочипа

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных белков HU и p50 с однонитевой и двунитевой ДНК с помощью универсального олигонуклеотидного микрочипа"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ЗАСЕДАТЕЛЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

АНАЛИЗ СИКВЕНС-СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ НИ И Р50 С ОДНОНИТЕВОЙ И ДВУНИТЕВОЙ ДНК С ПОМОЩЬЮ УНИВЕРСАЛЬНОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО

МИКРОЧИПА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2003

I

(

Работа выполнена в Центре биологических микрочипов (лаборатории) Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор, академик РАН А.Д. Мирзабеков

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук А.К. Щелкина кандидат физико-математических наук, доцент А.А. Бутылин

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится "_"_2003 г. в часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан "_"_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. Крицын

Актуальность проблемы.

Связывание регуляторных белков с сайтами узнавания на ДНК является ключевым моментом в регуляторном механизме, контролирующем экспрессию генов. Определение полного набора нуклеотидных последовательностей, которые могут служить мишенями для связывания молекул исследуемого регуляторного белка, сравнение сродства в связывании белка с различными последовательностями ДНК представляют сложную экспериментальную задачу. Поэтому развиваемый в представленном исследовании подход к решению такого типа задач, основанный на применении технологии универсального generic микрочипа, позволяющего в одном эксперименте проанализировать 4096 однонитевых и/или 1024 двунитевых 6-мерных последовательностей на сиквенс-специфичность взаимодействия с исследуемым регуляторным белком, является актуальным. Такой множественный параллельный анализ позволяет в относительно простых экспериментах определить короткие нуклеотидные последовательности (мотивы), к которьм белок проявляет наибольшее сродство. Полученные в настоящей работе новые результаты по сиквенс-специфичности связывания регуляторных белков HU и р50 позволят идентифицировать новые сайты связывания этих белков на ДНК, что улучшит понимание потенциальных функций отдельных генов.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы является изучение сиквенс-специфичности взаимодействия гистоноподобного белка HU и белка р50 из семейства YB белков млекопитающих с однонитевой и двунитевой ДНК с помощью полного гексамерного generic микрочипа. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Развить методику применения гексамерного generic микрочипа для исследования сиквенс-специфичности ДНК-белковых взаимодействий.

2. Исследовать, к каким однонитевым и двунитевым последовательностям ДНК белок HU проявляет большее сродство связывания.

3. Изучить сиквенс-специфичность взаимодействия белка р50 с однонитевыми и двунитевыми последовательностями. Охарактеризовать ключевые мотивы ДНК, определяющие сиквенс-специфичность связывания белка р50. Определить участки последовательности Y-бокс, наиболее сильно дестабилизируемые белком р50.

4. Показать, что результаты, полученные с помощью generic микрочипа, согласуются с данными, полученными с помощью других методов анализа ДНК-белковых взаимодействий.

Научная новизна.

В этой работе впервые было показано, что с использованием полного гексамерного generic микрочипа можно исследовать сиквенс-специфичность ДНК-белкового взаимодействия. Впервые был проведен массовый параллельный анализ кривых диссоциации тысяч 6-мерных однонитевых и/или двунитевых последовательностей в комплексе с регуляторным белком. Generic микрочип позволил проанализировать связывание меченных белков HU-FITC и p50-TR с полным набором из 4096 внутренних 6-мерных последовательностей однонитевых олигонуклеотидных 8-меров и с набором из 1024 двунитевых олигонуклеотидных 8-меров, полученных в результате гибридизации на микрочипе комплементарной олигонуклеотидной смеси.

Если ранее считалось, что HU связывается как с однонитевой, так и с двунитевой ДНК, не проявляя специфичности к нуклеотидным последовательностям, то в данном исследовании с помощью generic микрочипа было показано, что этот белок проявляет предпочтение к GC-богатым однонитевым последовательностям. Из 1024 двунитевых 6-мерных последовательностей, которые в целом неспецифично стабилизировались

HU, были выделены мотивы AGA, AAG, AAGA, которые способствуют наиболее сильной стабилизации дуплексов белком.

Из анализа взаимодействия р50 с однонитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа, были найдены мотивы GGGG, а также САСС и CATC, которые являются наиболее специфичными для связывания белка р50 с однонитевой ДНК. Исследование взаимодействия р50 с двунитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа показало, что этот белок наиболее эффективно дестабилизирует GC-богатые дуплексы, и в особенности те из них, которые содержат мотивы GGTG/CACC, GATG/CATC и GTGG/CCAC.

В данной работе было также показано, что последовательности Y-бокса GGTC и TGGT имеют большее сродство к белку р50, чем мотив ATTG, который до этого считался кором связывания последовательности Y-бокс.

Апробация работы.

Результаты данной работы были представлены на V Международной конференции по молекулярной биологии им. Энгельгардта (21-26 июня, 2001, Москва) и на Симпозиуме, посвященном 50-летию открытия двойной спирали ДНК, Miami Nature Biotechnology Winter Symposia (1-5 февраля, 2003, Майами).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 92 страницах, включая 32 рисунка.

Содержание работы.

1. Взаимодействие белков HU и р50 с однонитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа.

Белки HU и р50 - регуляторные белки. Гистоноподобный гетеродимерный белок HUa(3 участвует в регуляции нескольких клеточных

процессов, таких как репликация, рекомбинация, транспозиция, транскрипция. Он относится к классу ДНК-связывающих белков, которые специфично узнают ДНК различной структуры: ДНК круциформы, суперспирализованную ДНК, ДНК, имеющую разрыв по одной из цепей, или ДНК, в одной из цепей которой отсутствует одно - два основания. При этом сродство HU к этим формам ДНК значительно выше, чем к линейной однонитевой и двунитевой ДНК. Предполагалось, что взаимодействие HU с однонитевой и двунитевой формами ДНК сиквенс-неспецифично.

Белок р50 относится к семейству Y-бокс связывающих белков, которые первоначально были классифицированы благодаря их способности специфично узнавать последовательность Y-бокс и регулировать активность генов, содержащих Y-бокс в своих промоторах. Белок р50 и другие белки семейства Y-бокс препятствуют транскрипции генов за счет дестабилизации двуспиральной ДНК или стабилизации однонитевой ДНК в участках промоторов и энхансеров.

В данной работе было исследовано взаимодействие белков HU и р50 с однонитевыми и двунитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа. Generic микрочип содержит 4096 иммобилизованных в геле октадезоксирибонуклеотидов следующей структуры: gel-5'-NH2-MNNNNNNM-3', где N - одно из четырех оснований, М - так называемый вырожденный нуклеотид (эквимолярная смесь четырех нуклеотидов). Таким образом, каждая ячейка микрочипа содержит олигонуклеотид с уникальной гексамерной последовательностью, а чип в целом - перебор всех возможных гексамерных последовательностей.

Было исследовано взаимодействие белков HU и р50 с полным перебором однонитевых гексамерных последовательностей generic микрочипа. HU-белок был помечен красителем FITC, а р50 — красителем TR. Белки гибридизовали с олигонуклеотидами микрочипа при температуре 0°С. После замены гибридизационной смеси на раствор буфера были сняты кривые диссоциации комплексов (зависимости интенсивности

флуоресцентного сигнала в ячейке от температуры). Пример полученных кривых диссоциации для белка р50 представлен на рис.1.

Температура, °С

Рис. 1. Кривые диссоциации четырех комплексов флуоресцентно меченного белка р50, p50-TR, с однонитевыми октадезоксирибонуклеотидами, иммобилизованными в гелевых ячейках generic микрояипа. Интенсивность флуоресценции в условных единицах на длине волны 630 им показывает долю непродиссоциировавших комплексов. Справа от кривых диссоциации указаны внутренпие 6-мерпые последовательности олигонуклеотидных 8-меров generic микрочипа. Соответствующие кривые диссоциации отмечены различными символами.

До 4000 кривых диссоциации комплексов белка HU-FITC с однонитевыми олигонуклеотидами и 3600 кривых диссоциации комплексов белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидами было проанализировано с помощью специальной компьютерной программы, разработанной в Центре биологических микрочипов. В результате были получены соответствующие наборы значений кажущихся температур диссоциации, TD (для упрощения терминологии будем в дальнейшем называть данную величину температурой диссоциации). TD в дальнейшем рассматривали как меру стабильности комплексов белок — олигонуклеотид.

Полный набор всех температур диссоциации, измеренных для различных олигонуклеотидов generic микрочипа в комплексе с белком р50, представлен на рис.2.

Рис. 2. Компьютерное представление температур диссоциации (То) комплексов флуоресцентно меченного белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидными 8-мерами, иммобилизованными на generic микрочипе. Каждая строка двумерной матрицы соответствует трем основаниям внутренней 6-мерной последовательности с 5'-копца, а каждый столбец соответствует трем основаниям внутренней 6-мерной последовательности с З'-конца. Интенсивность каждого квадратика матрицы указывает значение TD комплекса pSO-TR с соответствующим одноннтсвым олигонуклеотидом микрочипа. Шкала температур показана справа.

Для комплексов белка HU с однонитевыми олигонуклеотидами было обнаружено слабо выраженное увеличение температуры диссоциации (от 23 до 27 °С) с ростом G,C состава внутренних б-меров олигонуклеотидных 8-меров generic микрочипа.

1.1. Специфичность взаимодействия белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидами.

Гистограмма распределения количества комплексов белка р50 с однонитевыми 8-мерами по их температуре диссоциации показана на рис. ЗА. Распределение показывает, что способность белка связываться с различными последовательностями внутренних б-меров иммобилизованных 8-меров значительно варьирует. На рисунке можно выделить основной пик комплексов с температурой диссоциации около 20 °С, который соответствует неспецифичному связыванию р50 с олигонуклеотидами, а также небольшое подмножество комплексов, состоящее примерно из сорока в-богатых олигонуклеотидов, температура диссоциации которых лежит в интервале от 40 до 60 °С. Эти олигонуклеотиды проявляют наибольшее сродство к белку р50.

Рис. 3. Влияние олигонуклеотидного состава на стабильность комплексов р50 - однонитевая ДНК.

Л) Гистограмма распределения количества комплексов р50 -однонитевые олигонуклеотиды по температурам их диссоциации. Выделены участки гистограммы, характеризуемые различным содержанием в-оснований. Около 40 в-богатых олигонуклеотидов, черный участок гистограммы, образуют наиболее стабильные комплексы с р50 (эта часть гистограммы также показала в увеличенном масштабе). В) График зависимости средней температуры диссоциации, То, комплексов р50 с однонитевыми 8-мерами от количества Л, Т, в или С оснований во внутренних б-мерах олигонуклеотидных 8-меров микрочипа. Разброс показывает величину стандартного отклонения То внутри соответствующей группы

олигонуклеотидных 8-меров.

Температура диссоциации, °С

В)

0 12 9 4 5« Количество А, Т, С или в оснований, п

Специфичность связывания р50 можно также охарактеризовать графиком зависимости средней температуры диссоциации комплексов р50 -однонитевая ДНК от количества каждого из 4-х оснований во внутренних 6-мерах олигонуклеотидных 8-меров generic микрочипа, рис. ЗВ. Средняя температура диссоциации комплексов, олигонуклеотиды которых содержат до трех А, Т, С или G, равна примерно 20 °С для каждого из оснований. Температура диссоциации олигонуклеотидов, содержащих от 4 до 6 G внутри 6-нуклеотидного кора, увеличивается до 40°С, в то время как такое же содержание А, Т, или С практически не влияет на температуру диссоциации соответствующих комплексов. ч,

Влияние длины G-кластеров на величину сродства белка р50 можно оценить из анализа распределения, представленного на рис. 4А. Олигонуклеотиды, содержащие мотив GGG, имеют две области распределения: одна из них соответствует области неспецифичного связывания, а вторая — покрывает область высокотемпературной диссоциации. В то же время олигонуклеотиды, содержащие мотив GGGG, находятся в области наибольших температур диссоциации соответствующих комплексов. Поэтому можно сделать вывод о том, что именно мотив GGGG ответственен за образование наиболее стабильных комплексов белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидами.

Сравнение значений TD для олигонуклеотидов, содержащих пять G в различных положениях внутреннего 6-мерного кора (рис. 4В), подтверждает предыдущий вывод. Из рисунка видно, что наличие GGGG и GGGGG кластеров значительно увеличивает температуру диссоциации комплексов от 30°С до 45°С и 55°С, соответственно. Было обнаружено, что олигонуклеотиды, содержащие Т в сочетании с GGGG и GGGGG кластерами 6-мерного кора, образуют более стабильные комплексы с белком, чем олигонуклеотиды, которые в таких же сочетаниях содержат другие основания. Изменение положения любого основания в 6-мерном коре,

содержащем пять цитозинов или пять тиминов, слабо влияет на температуру диссоциации комплексов белка с олигонуклеотидами.

В)

О) 9 П О) Н

zouuoo Z. Z. Z. Z,

u Z *> о о о ~ Z ** **

в g 2 • 8 |j «. в ♦* J

а о о X ii Z ::

о и и о Z " Z

UUWUUZ ** м **

Рис. 4. Влияние структуры G-богатых олигонуклеотидов на стабильность комплексов р50 - однонитевая ДНК.

A) Гистограмма распределения количества комплексов р50 с олигонуклеотидами, содержащими мотивы GGG (слева) и GGGG (справа) (гистограммы закрашены черным цветом) по Тв в сравнении с распределением всех комплексов белка с олигонуклеотидами (белые гистограммы с черным контуром).

B) Зависимость температуры диссоциации комплексов р50 с однонитевыми олигонуклеотидами, которые содержат пять G, пять С или пять Т оснований, от положения шестого основания - тимина (крайняя левая гистограмма) или вырожденного нуклеотида N. Указаны внутренние 6-мерные последовательности олигонуклеотидных 8-меров generic микрочипа. Для каждой 6-мерной последовательности указана величина стандартного отклонения То усредненная по всем олигонуклеотидным 8-мерам, содержащим данную последовательность.

Для сравнения влияния последовательности каждого возможного 4-мерного мотива на специфиность связывания р50 был проделан статистический анализ полного набора значений TD с помощью соотношения Фишера, F. Полный набор температур диссоциации, TD, комплексов белка с

олигонуклеотидами можно охарактеризовать статистически количеством олигонуклеотидов, N, величиной среднего значения TD=T и стандартным отклонением от этого среднего значения ст. Для Ni олигонуклеотидов, содержащих рассматриваемый 4-мерный мотив, и характеризуемых средней температурой диссоциации Т|, отношение Фишера (учитывая, что N » Ni» 1) может быть приведено к следующему виду:

F = Ni(TI-T)2/o2

Из приведенной формулы следует, что вероятность того, что сродство белка к рассматриваемому мотиву является значимым (Ti достоверно отличается от Т), пропорциональна количеству Ni олигонуклеотидов, содержащих данный мотив, квадрату отклонения средней температуры диссоциации всех олигонуклеотидов, содержащих данный мотив, Tj, от средней температуры диссоциации всех олигонуклеотидов Т, и обратно пропорциональна квадрату стандартного отклонения ст полного набора температур диссоциации от среднего значения Т. Мотив имеет статистически значимое сродство к р50 и является специфичным, если F»l.

Отношение Фишера F было посчитано для всех возможных четырехмерных мотивов. На рис. 5 представлены мотивы, которые характеризуются наибольшими значениями величин F. Отношение Фишера F для мотива GGGG существенно превосходит значения этого параметра для остальных мотивов и превышает величину среднего значения этого параметра, F, более чем на три стандартных отклонения, Зст. Таким образом, олигонуклеотиды, содержащие мотив GGGG, образуют наиболее стабильные комплексы с р50. В порядке убывания значений F сразу за олигонуклеотидами, содержащими GGGG и GGG кластеры, наибольшее сродство к р50 по сравнению с остальными проявляют олигонуклеотиды, которые в своих последовательностях содержат мотивы САСС и CATC .

GGGG <3GQC CGGG GGGTTGOG CATC СЛСС GGCC GCGG AGGG

Рис. 5. Отношение Фишера, F, вычисленное для всех возможных олигонуклеотидных 4-мерных мотивов комплексов белок р50 - однонитевые 8-мсры. В порядке убывания значений F показаны десять мотивов, имеющих наибольшую величину отношения Фишера. Для каждого мотива указано стандартное отклонение отношения Фишера. Прерывистая линия соответствует величине стандартного среднего отношение Фишера, F, усредненного по всем 4-мерным мотивам. Отклонение от F, равное трем стандартным отклонениям, (Г+За), выделено сплошной линией.

3. Взаимодействие белков с двунитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа.

Для изучения связывания белков HU и р50 с дуплексами, однонитевые 8-меры generic микрочипа были конвертированы в двуспиральную форму путем гибридизации с флуоресцентно меченной смесью 8-меров 5'-MN(A/C)NN(A/C)NM-TR-3' в течение 24 часов при 0°С. Некомплементарные А/С нуклсотиды б двух позициях смеси из 1024 олигонуклеотидов предотвращают самогибридизацию этой смеси в растворе. Затем гибридизационная смесь была заменена на охлажденный буфер или на буфер, содержащий белок, и generic микрочип хранился при 0°С в течение 3 часов. После этого были сняты кривые диссоциации.

Из анализа кривых диссоциации полученных дуплексов и их комплексов с белком HU было получено, что HU стабилизировал большую часть дуплексов, увеличивая TD дуплексных комплексов. Часть дуплексов дестабилизировалась белком. Типичные кривые диссоциации дуплекса и дуплекса с HU представлены на рис. 6А.

А)

CGAATG

В)

5 1.0

X

-•-AGTCTQ -о-AGTCTG+HU

-о-AGTCTG+HU

X • -Л- CGAATG+p50

Э 1,5 GGCAGG

5 VS. -O-GGCASG+рбО

О

Ч * \\

о

X

о

0 10 20 30 40 50 Температура, °С

0 10 20 30 40 60 Температура, °С

Рис. 6. Кривые диссоциации для А) двунитевого олигонуклеотида в отсутствии (черпые кружки) и в присутствии (белые кружки) белка HTJ и для В) двух двунитевых олигоиуклеотидов в отсутствии (черные символы) и в присутствии (белые символы) белка р50. Последовательности внутренних 6-меров иммобилизованных в гелевых ячейках олигоиуклеотидов указаны справа от кривых диссоциации. Комплементарные октаиуклеотнды были флуоресцентно помечены красителем Texas Red, и их интенсивность флуоресценции в условных единицах использовали в качестве меры количества вепродиссоциировавших дуплексов. Стрелками указано направление сдвига кривых диссоциации комплексов.

Кривые диссоциации дуплексов и дуплексов в комплексе с белком р50 показали, что р50 сиквенс-специфично дестабилизирует большинство дуплексов. Значение TD уменьшалось вплоть до 20 °С. Типичные кривые диссоциации олигонуклеотидных дуплексов и их комплексов с р50 представлены на рис. 6В. Однако, в некоторых отдельных случаях р50 увеличивал температуру диссоциации дуплексов (см. ниже).

Увеличение или уменьшение TD, ATD, зависело от последовательности олигоиуклеотидов, и поэтому было использовано в качестве меры специфичности белков HU и р50 к дуплексам. На рис. 7 представлен набор измеренных сдвигов температур диссоциации для белка р50.

дтш°с

Рис. 7. Компьютерное представление сдвигов температур диссоциаций (ДТв) двунитевых олигонуклеотидных 8-меров, вызванных взаимодействием с белком р50. Каждая строка двумерной матрицы соответствует трем основаниям внутренней 6-мерной последовательности с 5'-конца, а каждый столбец соответствует трем основаниям внутренней б-мерной последовательности с 3'-конца, аналогично рис. 2. Интенсивность каждого квадратика матрицы соответствует значению ДТВ для соответствующего комплекса р50 - двунитевой 8-мер. Шкала температур показана справа.

3.1. Специфичность взаимодействия белка Ни с двунитевымн олнгонуклеотидами.

Гистограмма распределения количества олигонуклеотидных дуплексов по сдвигам их температур диссоциации ДТВ в присутствии белка ни представлена на рис.8. Основной пик распределения соответствует неспецифичной к последовательности нуклеотидов стабилизации дуплексов белком Ни, при которой средний сдвиг температуры диссоциации равен 2°С.

160 Z_ 140 8

g 120 e

g 100 &

4 80

0

g 60

9 40 X

1 20

0

-10 -5 0 6 10 16 20

ДТо,°С

Рис. 8. Гистограмма распределения количества олигонуклеотидных дуплексов по сдвигам их температур диссоциации в результате взаимодействия с белком

ни.

Массив данных по сдвигам температуры диссоциации для 1010 различных гексамерных последовательностей был проанализирован следующим образом. Каждому 4-мерному мотиву была поставлена в соответствие группа из N] дуплексов, содержащих данный мотив. Для каждого 4-мерного мотива в соответствующей группе было определено значение ДТо и соответствующее стандартное отклонение. На рис. 9 представлены 4-мерные мотивы, наличие которых в иммобилизованных нитях дуплексных последовательностей способствовало наиболее эффективной стабилизации при взаимодействии с белком HU. Дуплвксь!, содержащие мотив AAGA, наиболее сильно стабилизируются белком HU. Значение ATD для этих мотивов превышает среднее значение ДТ0, посчитанное по всем четырехмерным мотивам, более чем на три стандартных отклонения, За. Аналогичный анализ для 3-мерных мотивов показал, что дуплексы, содержащие последовательности AGA, AAG, также имеют максимальный средний сдвиг температуры диссоциации и наиболее эффективно стабилизируются белком HU.

ATD+ЗО

-'í- ATd i*li

AAGA ТАМ TCTA CAGA ATTA AGAA ACTA AAGC ATAC GAGA

Рис. 9. Средний положительный сдвиг температуры диссоциации, вычисленный для всех возможных 4-мерных мотивов комплексов HU - двунитевые 8-меры. В порядке убывания значений ДТо показаны десять 4-мерных мотивов, имеющих наибольшую величину среднего сдвига температуры диссоциации. Для каждого мотива указано стандартное отклонение среднего сдвига температуры диссоциации внутри группы дуплексов, содержащих данный мотив. Прерывистая линия соответствует величине стандартного среднего сдвига температуры диссоциации, ДТо, усредненного по всем 4-мерным мотивам. Отклонение от ДТо на величину трех стандартных отклонений, (ЛТо+Зя), выделено сплошной линией.

oü

■Í

<

н

3.2. Специфичность взаимодействия белка р50 с двунитевыми олигонуклеотидами.

Гистограмма распределения количества олигонуклеотидных дуплексов по сдвигам их температур диссоциации в присутствии белка р50 представлена на рис. 10А. На гистограмме можно выделить основной пик дуплексов со сдвигом температуры диссоциации на -6°С. Дуплексы, относящиеся к этой части гистограммы проявляют неспецифичное связывание с р50. На гистограмме можно также выделить плечо сильно дестабилизируемых дуплексов, ДТ0 которых лежит в пределах от -10 до -20 °С.

Нужно отметить, что для четырех дуплексов, содержащих в участках последовательностей иммобилизованных олигонуклеотидов ОСКККЗ-кластеры, обнаруживается аномально высокий положительный сдвиг, ДТо, (14-20°С) при связывании с р50 (см. также рис. 7).

На рис. 10В представлен график зависимости среднего сдвига температуры диссоциации АТц комплексов р50 - <ЫЖА от количества ОС пар в различных участках внутреннего 6-мерного кора 8-мерных дуплексов. Присутствие четырех или пяти (исключая О-кластеры) ОС пар в дуплексных последовательностях коррелирует с наибольшим дестабилизирующим действием на них белка р50.

Среднее А)

Рис. 10. Влияние нуклеотидного состава дуплексов на

стабильность их комплексов с белком р50.

A) Гистограмма распределения количества дуплексов по сдвигам их температур диссоциации в результате взаимодействия с белком р50. Выделены участки гистограммы, характеризуемые дуплексами с различным средним содержанием вС пар. Черным цветом так же выделены четыре дуплекса, содержащих ССССС-кластеры в иммобилизованных нитях: ТОСССС, АСССвв, СССввС и ОССввА.

B) График зависимости среднего значения ДТц комплексов р50 -двунитевая ДНК от количества СС пар во внутренних дуплексных б-мерах. Разброс показывает величину стандартного отклонения ДТп внутри группы дуплексных 8-меров, содержащих определенное количество С1С пар.

На рис.11 А и 11В представлены результаты более детального статистического анализа данных с использованием отношения Фишера (см. стр. 9). Этот анализ позволил выделить 4-мерные и 5-мерные мотивы, наличие которых в иммобилизованных нитях дуплексных последовательностей способствовало наиболее сильному взаимодействию с белком р50. Как можно видеть из рисунка, дуплексы, содержащие мотивы

осте, СТОО и ОАТС (рис. 11 А) и мотивы СЮТСЮ, ООАТС, (рис. 11В) дестабилизировались белком р50 наиболее эффективно. Значение отношения Фишера Р для этих мотивов превышает среднее значение Р, посчитанное по всем четырехмерным или пятимерным мотивам, более чем на три стандартных отклонения, Зет.

А)

-j-i-i-i-*-.

вата отов што тоот воот оттв goat шов вате соот

U. "

a 40 & м

В)

il-i-i-i-8-Дт

оотоа ооатэ тввта вввта аятоа ватта аатат аттаа атввт otggc

Рис. 11. Применение отношения Фишера (К) для определения десяти наиболее специфичных 4-мерных (А) и 5-мерньгх (В) дуплексных мотивов для связывания с белком р50. Для каждого мотива указано стандартное отклонение отношения Фишера, подсчитанное в среднем по двадцати двум дуплексам, содержащим данный 4-мерный мотив, и в среднем по шести дуплексам, содержащим данный 5-мерный мотив. Прерывистая линия соответствует величине стандартного среднего отношение Фишера, Р, усредненного по всем 4-мерным (А) или 5-мерным (В) мотивам. Отклонение от Р, равное трем стандартным отклонениям, (Г+Зо), выделено сплошной линией.

Таким образом, представленный анализ показал, что ОС-богатые дуплексы (исключая дуплексы, содержащие ОСЮСЮ-кластерьт) и в особенности дуплексы, содержащие мотивы СОТО, ОТСЮ и вАТв, значительно дестабилизируются при взаимодействии с белком р50. Это наблюдение коррелирует с данными о том, что белок р50 проявляет наибольшее сродство к однонитевым мотивам, содержащим в-кластеры, а

также к однонитевым мотивам САСС и CATC (комплементарным к мотивам GGTG и GATG), что следует из экспериментальных данных о высоких температурах диссоциации комплексов белок — однонитевой олигонуклеотид и высоких значениях F для соответствующих олигонуклеотидных последовательностей. Таким образом, белок р50 проявляет высокое сродство к одним и тем же последовательностям (САСС и CATC) в однонитевой ДНК и в одной из нитей двунитевой ДНК. Из этого можно предположить, что специфичное связывания р50 с двунитевым олигонуклеотидом определяется взаимодействием этого белка с одной из нитей дуплекса.

4. Сопоставление результатов, полученных методом generic микрочипа, с данными экспериментов по gel-shift электрофорезу с использованием двух 24-мерных олигонуклеотидов, каждый из которых содержит 6-мерный участок связывания белка р50.

Количество красителя, присоединяемого при мечении белка p50-TR, было проанализировано с помощью MALDI mass спектрометрии. Анализ показал, что на каждую молекулу белка приходится 3-4 молекулы красителя. Для того, чтобы охарактеризовать влияние мечения белка на его свойства, был проведен SDS гель электрофорез (рис. 12А). Оказалось, что связывание 3-4 молекул красителя с р50 приводит к тому, что дорожка меченого белка получается более диффузной, чем у немеченого. Также при мечении наблюдается небольшая тенденция к олигомеризации. Однако, принципиальных изменений в картине электрофореза не наблюдается, из чего можно сделать вывод о том, что введение флуоресцентной метки в первом приближении не меняет свойств белка р50.

Проверить достоверность выводов о сродстве р50 к найденным гексамерным последовательностям можно было бы с помощью gel-shift электрофореза, однако применение этого подхода в случае коротких олигонуклеотидов сталкивается с существенными экспериментальными трудностями. Поэтому мы поместили исследуемые последовательности в 24-

мер следующей общей структуры: 5 '-{с1А)9-гексамер-(с1 А)у-3'. Последовательности этих 24-меров, меченных 32Р по 5'-концам, были выбраны таким образом, чтобы предотвратить образование внутренних шпилек:

AAAAAAAAATGGGGGAAAAAAAAA (ON1) и ААААААААААААТАТААААААААА (ON2). Олигонуклеотид ON1 содержит G-богатый 6-мер TGGGGG. Комплекс между соответствующим октануклеотидом MTGGGGGM generic микрочипа и р50-TR имел Те, = 58 °С (см. наиболее стабильные комплексы на рис. ЗА, рис. 4). Олигонуклеотид ON2 содержит А,Т-богатый 6-мер АААТАТ. Комплекс между соответствующим октануклеотидом МАААТАТМ generic микрочипа и p50-TR имел существенно меньшее То = 23 °С. Этот комплекс

расположен внутри центральной части основного пика на рис.ЗА и соответствует неспецифичному связыванию.

На рис. 12В представлен результат эксперимента по gel-shift электрофорезу, выполненный для олигонуклеотида ON1 в присутствии нарастающего количества немеченого (дорожки 1-4) и меченого (дорожки 58) белка. Как видно из этого рисунка, мечение р50 тремя - четырьмя молекулами TR практически не влияет на сродство связывания этого белка.

На рис. 12С показан результат эксперимента по gel-shift электрофорезу, выполненный для олигонуклеотидов ON1 (дорожки 1-4) и ON2 (дорожки 5-8) в присутствии нарастающего количества меченого белка p50-TR. Из этого эксперимента очевидно следует, что белок проявляет намного более высокую специфичность связывания к 24-меру ON1, содержащему G-богатый 6-мер TGGGGG, по сравнению с ON2, содержащему А,Т-богатый 6-мер АААТАТ. Этот результат подтверждает данные по сиквенс-специфичности связывания белка, полученные с помощью generic микрочипа.

На рис. 12D показан результат эксперимента по gel-shift электрофорезу, выполненный для ON1 (дорожки 1-4) и ON2 (дорожки 5-8) в присутствии

AB С D

12345678 12345678 12345678 1 2 3 4 . ...» —«»pi —mm - .

Рис. 12. Электрофорез в геле белка р50 и его комплексов с олигонуклеотидамн.

A) Сравнение флуоресцентно меченого белка р50 (дорожки 1 и 2) и немеченого белка р50 (дорожки 3 и 4). Количество белка на дорожках 1 и 3 - 1 |ig; на дорожках 2 и 4 - 2 ng.

B) Gel-shift электрофорез у-^Р-меченого олигодеоксирибонуклеотида AAAAAAAAATGGGGGAAAAAAAAA (ON1) с добавлением немеченого (дорожки 1-4) и меченого (дорожки 5-8) белка pSO-TR в нарастающем количестве. Каждые 10 ц! наносимого образца содержали 8 ng олигонуклеотида. Количество белка составляло 0 ng на дорожках 1 и 5, 0.25 ng на дорожках 2 и 6, 0.5 ng на дорожках 3 и 7,1 ng на дорожках 4 и 8.

C) Gel-shift электрофорез олигонуклеотида ON1 (дорожки 1-4) и олигонуклеотида ON2 (дорожки 5-8). Оба олигонуклеотида были смешаны с нарастающим количеством меченого белка p50-TR. Каждые 10 образца содержали 8 ng олигонуклеотида. Количество белка составляло 0 (ig на дорожках 1 и 5, 0.25 ng на дорожках 2 и 6, 0.5 ng на дорожках 3 и 7,1 ng на дорожках 4 и 8. Электрофорезы по анализу сдвига электрофоретической подвижности были выполнены в 8% PAAG (19:1) в IxTBE буфере при 4-б°С.

D) Gel-shift электрофорез олигонуклеотида ON1 (дорожки 1-4) и олигонуклеотида ON2 (дорожки 5-8). Оба олигонуклеотида были смешаны с нарастающим количеством немеченого белка р50. Олигонуклеотиды и белок были взяты в том же количестве, что и для электрофореза на рис. С).

нарастающего количества немеченого белка р50. Сходство рис. 12С и рис. 12D с очевидностью демонстрирует, что мечение р50 тремя-четырьмя молекулами TR не влияет на сиквенс-специфичность белка.

Таким образом, результаты экспериментов по gel-shift электрофорезу оказались в полном соответствии с результатами, полученными на микрочипе, подтверждая результативность применения generic микрочипа для исследовательских задач. Прямой перебор всех последовательностей с помощью gel-shift электрофореза потребовал бы синтеза более четырех тысяч

олигонуклеотидов с различными гексамерными вставками и проведения такого же количества электрофорезов. По-видимому, оптимально сочетать комбинированный подход: нахождение предварительного набора специфичных последовательностей с помощью generic микрочипа, а затем -более детальное исследование сродства этих последовательностей другими методами.

5. Специфичность связывания белка р50 с 4-мерными участками Y-бокса.

Название "белки Y-бокса" дано из-за способности представителей этого семейства белков специфично узнавать на ДНК мотив Y-бокс (CTGATTGGc/tc/tAA). Мы проанализировали все 4-мерные мотивы Y-бокса для того, чтобы обнаружить мотивы, проявляющие наибольшее сродство к белку р50. Средние сдвиги температур диссоциации, ATD, для двунитевых олигонуклеотидов, содержащих 4-мерные мотивы Y-бокса, представлены на рис. 13. Оказалось, что средний сдвиг температур диссоциации, АТС, для двунитевых олигонуклеотидов, содержащих мотивы GGTC и TGGT характеризуется наибольшим значением отрицательного сдвига, превышающим стандартное отклонение, а, для полного массива 4-мерных мотивов. Следовательно, 4-меры GGTC и TGGT Y-бокса можно рассматривать, как участки этой последовательности, наиболее сильно дестабилизируемые белком р50. Совершенно неожиданно для нас оказалось, что значение АТд для наиболее общего мотива Y-бокса ATTG, обсуждаемого в литературе, близко к значению среднего сдвига температур диссоциации всех 4-мерных мотивов. Таким образом, этот 4-мерный участок не определяет способность белка р50 дестабилизировать последовательность Y-бокса. Результаты показывают, что последовательности Y-бокса GGTC и TGGT имеют большее сродство к белку р50, чем мотив ATTG, который до этого считался кором связывания последовательности Y-бокс.

Y-box

Рис. 13. Специфичность связывания белка р50 с различными 4-мерными последовательностями У-бокса. Статистический параметр - средний сдвиг температуры диссоциации АТ0, представлен для всех возможных 4-мерных последовательностей, обнаруженных в У-боксе. 4-мерные мотивы в У-боксе, содержащие точечные нуклеотидные вариации, отмечены различными символами. Средний сдвиг температуры диссоциации АТв = -6°С, подсчитанный для всего набора 4-нуклеотидных последовательностей, показан прерьгоистой линией, а соответствующая область, перекрываемая стандартным отклонением а, заштрихована.

выводы.

1. Для анализа сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных и ДНК-связывающих белков с ДНК на примере белков р50 и HU развит метод и продемонстрирована возможность применения generic микрочипа, содержащего полный набор всех гексамерных последовательностей.

2. С использованием олигонуклеотидного generic микрочипа показано

следующее:

- при взаимодействии с однонитевыми олигонуклеотидами белок HU проявляет большее сродство к GC-богатым последовательностям, чем к АТ-богатым;

- при взаимодействии белка HU с двунитевыми олигонуклеотидами большая часть последовательностей неспецифично стабилизируется белком, при этом гетерогенные мотивы AGA, AAG, AAGA способствуют наиболее сильной стабилизации дуплексов белком HU;

- наиболее специфичным для связывания белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидами является мотив GGGG, а так же мотивы САСС и CATC;

- при взаимодействии с р50 наиболее эффективно дестабилизируются GC-богатые двунитевые олигонуклеотиды, и в особенности те из них, которые содержат мотивы GGTG/CACC, GATG/CATC и GTGG/CCAC.

3. Показано, что результаты анализа ДНК-белкового взаимодействия, полученные с помощью generic микрочипа, согласуются с данными, полученными традиционным методом gel-shift электрофореза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Заседателева О.А., Крылов А.С., Шаронов А.Ю. и Мирзабеков А.Д. (2001). Двойной биологический микрочип и его применение для изучения биохимических реакций. Биосенсоры, том 15, с. 85-92.

2. Krylov A. S., Zasedateleva О. A., Prokopenko D. V., Rouviere-Yaniv J. & Mirzabekov A. D. (2001). Massive parallel analysis of the binding specificity of histonelike protein HU to single and double-stranded DNA with generic oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res., vol. 29, pp. 2654-2660.

3. Zasedateleva O.A., Krylov A.S., Prokopenko D.V., Skabkin M.A., Ovchinnikov L.P., Kolchinsky A. & Mirzabekov A.D. (2002). Specificity of mammalian Y-box binding protein p50 in interaction with ss and ds DNA analyzed with generic oligonucleotide microchip. J. Mol. Biol, vol. 324, pp. 73-87.

4. Zasedateleva O.A., Krylov A.S., Prokopenko D.V., Skabkin M.A., Ovchinnikov L.P., Kolchinsky A. & Mirzabekov A.D. 0- Sequence-specificity of mammalian Y-box binding protein p50 to ss and ds DNA analyzed with generic oligonucleotide microchip. Miami Nature Biotechnology Winter Symposia (Short Reports), 50 Years on: From The Double Helix to Molecular Medicine, February 1-5,2003, vol. 14, pp. 36,66.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 12.09.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,75. Тираж 110 экз. Заказ 733. Тел. 939-3890, 939-3891, 928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

1620a

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Заседателева, Ольга Александровна

Введение.

1. Литературный обзор.

Технологии ДНК матриц.

Применение ДНК микрочипов.

Анализ генной экспрессии.

Анализ точечного полиморфизма.

Анализ специфичности ДНК-белкового взаимодействия.

Белки HU и р50.

2. Материалы и методы.

Синтез олигонуклеотидов.

Производство микрочипов.

Белок HU.

Белок р50.

Условия гибридизации и снятие кривых диссоциации для белка HU.45 Условия гибридизации и снятие кривых диссоциации для белка р50.

Измерение кривых диссоциации.

Анализ экспериментальных данных по взаимодействию р50 с однонитевой и двунитевой ДНК с помощью отношения Фишера.

SDS гель-электрофорез.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA).

3. Результаты.

Взаимодействие белков с однонитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа.

Специфичность взаимодействия белка HU с однонитевыми олигонуклеотидами.

Специфичность взаимодействия белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидами.

Взаимодействие белков с двунитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа.

Специфичность взаимодействия белка HU с двунитевыми олигонуклеотидами.

Специфичность взаимодействия белка р50 с двунитевыми олигонуклеотидами.

Сопоставление результатов, полученных методом generic микрочипа, с данными экспериментов по gel-shift электрофорезу с использованием двух 24-мерных олигонуклеотидов, каждый из которых содержит 6-мерный участок связывания белка

Специфичность связывания белка р50 с 4-мерными участками Yбокса.

4. Обсуждение.

Выводы.80 •

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных белков HU и p50 с однонитевой и двунитевой ДНК с помощью универсального олигонуклеотидного микрочипа"

Биологические и биохимические исследования находятся в периоде г нарастающего информационного роста. Использование автоматизированного сиквенирования и вычислительных методов привело к тому, что на сегодняшний день полностью прочитан геном большого числа организмов, в том числе и Homo sapiens. И как результат, огромный перечень генов для каждого из организмов доступен для изучения. Однако простое чтение нуклеотидной последовательности генов не дает информации о том, как эти гены кооперируют в генетических путях, контролирующих физиологию организма. Основной задачей так называемой пост-геномной эры является максимальное использование огромного количества геномной информации для понимания комплексной природы жизни клетки. Успех проекта сиквенирования генома, который сам по себе явился результатом технологических усовершенствований и инноваций, делает необходимым дальнейшие технологические разработки по эффективному использованию огромного количества информации по сиквенированию. Функциональная геномика ответила развитием ряда новых технологий, и одной из наиболее эффективных стала технология биологических ДЬЖ микрочипов (микроматриц). ДНК микрочип это очень точная, с высокой степенью плотности матрица однонитевых олигонуклеотидых образцов, прикрепленных к твердой поверхности. Обычно, ДНК микрочипы изготовлены либо с использованием синтезированных олигонуклеотидов, либо на основе ПЦРамплифицированных последовательностей кДНК. Таким образом, каждая позиция в решетке микрочипа (ячейка) содержит много копий ДНК определенной последовательности. Использование однонитевой ДНК в таком формате является результатом способности однонитевых нуклеотидных последовательностей с высокой специфичностью гибридизоваться со вторыми нитями, содержащими комплементарные последовательности, и образовывать молекулы двуспиральной ЩШ.. Поэтому в основном ДЬЖ микрочипы используют для анализа комплексных смесей из тысяч нуклотидных последовательностей на присутствие и количество молекул определенной последовательности. Способность качественно и количественно проанализировать смесь нуклеотидных последовательностей делает Д1Ж микрочипы чрезвычайно необходимой технологией с широкой областью применения. На сегодняшний день наиболее часто эта технология используется для анализа генной экспрессии и ДНК полиморфизма. Идентификация изменений в генной экспрессии, вызванных определенными воздействиями на организм и/или связанных с изменениями в клетке в результате развития заболевания, долгое время была основной стратегией в исследовании физиологических путей. До недавнего времени анализ генной экспрессии в любом эксперименте был ограничен количественно несколькими десятками генов. Сейчас, с появлением ДНК микрочипов, стало возможным проводить анализ изменения экспрессии десятков тысяч различных генов в одном эксперименте. Технология ДЬЖмикрочипов позволила для определенных типов онкологических заболеваний выделить отдельные группы генов, которые имеют характерный уровень экспрессии, и, таким образом, расширить диагностику раковых заболеваний экспрессионным анализом. Вариации в геномной последовательности и структуре ответственны за большую часть вариаций среди индивидуумов. Знание генетической вариабельности между индивидуумами и корреляция этой информации с фенотипами болезней сыграло важную роль в понимании связи между генами и здоровьем человека. Помимо указанных основных областей применения, ДНК матрицы используются и для множества других целей. Одна из них основана на способности регуляторных белков взаимодействовать с однонитевыми и двунитевыми олигонуклеотидными последовательностями специфичным или неспецифичным образом. Таким образом, Д1Ж матрицы также используют для иззд1ения ДНК-белкового взаимодейсвия. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Технологии ДНК матриц. ДНК матрицы последнее достижение в эволюции био-аналитических технологий, начало развития которых приходится на 1960-ые и 1970-ые годы. Появление ДНК матриц связано с возникновением идеи иммобилизации однонитевых последовательностей Д1Ж на твердой (из пластика, стекла) поверхности, а также на нитроцеллюлозных и нейлоновых мембранах. Жесткая поверхность имеет ряд преимуществ перед эластичными мембранами, поскольку матрица нитей ДНК, иммобилизованных на твердой поверхности, получается более однородной, может достигать больших плотностей и может быть использована в исследованиях, которые занимают меньше времени и используют усовершенствованную технологию детекции, обычно с использованием флуоресцентньпс красителей. В основном используются три основных формата Д1Ж матриц, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки situ синтезированные олигонуклеотидные Одна из этих из технологий образцы, метод в цене, гибкости, последовательности фотолитографии, для синтеза на вариабельности и простоты использования.* Две технологии использзот in которых обьино берутся на основе последовательностей известных генов. использует адаптированный микроэлектронной индустрии, поверхности стекла олигонуклеотидов длинной до 30 оснований. Этот метод позволяет производить ДНК микрочипы очень высокой плотности сотни тысяч различных олигонуклеотидов на см. Поскольку в этой технологии используются относительно короткие олигонуклеотиды, то, например, для поиска точек полиморфизма одного гена необходимо порядка 1000 таких олигонуклеотидов. 4» Метод фотолитографии, используемый фирмой Affymetrix, позволяет производить микрочипы, на которых иммобилизовано 65 000 400 000 олигонуклеотидов. Поэтому один микрочип, содержащий 400 000 олигонуклеотидов, позволяет проанализировать в одном эксперименте примерно 400 генов (рис. 1). Размер одной ячейки микрочипа Affymetrix составляет 20x20 мкм. Размер самого микрочипа 1x1 см. Стоимость такого микрочипа составляет примерно 5000 High-Density Microarray Рис. 1. Микрочип фирмы Affymetrix. Основная стратегия этого метода заключается в следующем (рис. 2). Поверхность твердой подложки, маску, модифицированная (О-Х), производя фотолабильными через реактивные протекционными фотолитографическую заливается гидроксилами освещается свободные гидроксильные группы в освещенных участках. Затем поверхность подложки 3 -0-фосфорамидит-активированными концу фотолабильной дезоксинуклеозидами группой. Происходит Затем (например, тимидин дезоксинуклеозид фосфорамидитами), защищенными по 5-гидроксильному наращивание на один нуклеотид в местах, облученных светом.метятся P и гибридизуются на отдельные мембранные макрочипы. происходит герметичных в термостатируемых, вращающихся и или камерах. После гибридизации отмывки Гибридизация трясущихся макрочипы помещают на эмульсионную пластину, экспонируют, после чего получают локализованную картину радиоактивной интенсивности. Масгоаггау Control Sample Experimental Sample Create ndioactively-labeled targets and hybridize to separate membranes 1 2 cm (200-5,000 genes) Рис. 3. Схема анализа экспрессии генов с использованием макрочипов на нейлонной или нитроцеллюлозной основе."* 7/ 7 8 cm Detection with photphorimager в технологии микрочипов (микроэрреи) используют слайд из стекла или пластика (рис. 4). Микрочипы имеют гораздо большую плотность иммобилизованных олигонуклеотидов или наработанных с помощью ПЦР последовательностей кДЬЖ. Один такой микрочип, позволяет гибридизовать в одном эксперименте до 10 000 генов. Микрочипы по размеру миниатюрнее чем макрочипы. Гибридизуемые образцы метятся флуоресцентными красителями. Гибридизационная смесь заливается в гибридизационную камеру, и микрочип помещается на термостатируемый металлический с макрочипами, что позволяет использовать большие столик. Объем гибридизационных камер микрочипов гораздо меньше по сравнению концентрации гибридизуемых образцов. В экспериментах по генной экспрессии исследуемый и контрольный образцы метятся различными флуоресцентными красителями и заливают одновременно на один микрочип. 10 анализируя гибридизационные сигналы в разных длинах волн возбуждения и эмиссии. Microarray Control Sample Create redorareen ExperimentaJainple Рис. 4. Схема анализа экспрессии генов с использованием микрочипов на стеклянной или пластиковой основе. (s 10,000 genes) Detection with confocal microscope биологических микрочипах, разработанных Институте молекулярной биологии РАН, нуклеотидная проба иммобилизуется в гелевых (акриламидных или бис-акриламидных) ячейках на стекле."" По одной разработанной технологии, вначале на стекло наносятся гелевые ячейки, геометрия которых задается маской. Размер одной ячейки составляет SO ЮОмкм X ЮОмкм X 20мкм, расстояние между ячейками 200мкм. Через маску пропускают свет, инициирующий полимеризацию. После химической обработки матрицы, приводящей к образованию в геле альдегидных или гидразидных групп, на каждую ячейку наносят по 1 нл раствора модифицированных NH2 группой олигонуклеотидов,* которые ковалентно пришиваются к гелю.* По второй технологии готовят смесь мономеров и модифицированных олигонуклеотидов и наносят ее на стекло в виде капель. Сополимеризация мономеров происходит в результате облучения светом ультрафиолетовой области. Диаметр образующихся ячеек составляет 150 мкм, объем 0-1 нл, расстояние между ячейками ЗОмкм. Поскольку перед нанесением ячеек стекло обрабатывают раствором Repel-Silane, поверхность стекла между ячейками является гидрофобной, В таком виде микрочип может храниться месяцами. Рис. 5. Олигонуклеотидный generic микрочип. Изображение снято с помощью специализированного флуоресцентного микроскопа, оборудованного CCD камерой, соединенной с компьютером. Универсальный generic микрочип, разработанный по этим технологиям, содержит 4096 октадезоксирибонуклеотидов, следующей последовательности gel-5-NH2-MNNNNNNM-3, где N одно из четырех оснований, М вырожденное основание (равная смесь четырех нуклеотидов) (рис. 5). Таким образом, каждая ячейка микрочипа содержит уникальную гексамерную последовательность, а весь микрочип содержит полный перебор гексамерных последовательностей. Такой микрочип позволяет исследовать кинетические и термодинамические характеристики связывания лигандов,*" анализировать специфичность взаимодействия белков с короткими учасками ДЬЖ.* Для изучения связывания лигандов и белков с двунитевыми олигонуклеотидами, гибридизуемая смесь олигонуклеотидов флуоресцентно метится. Для анализа взаимодействия белков с однонитевыми красителями олигонуклеотидами generic микрочипа, флуоресцентными 12 (Texas Red, FITC) метят белки. Generic микрочипы имеют низкую плотность иммобилизованных олигонуклеотидов иммобилизация по сравнению двумерными в объеме микрочипами. Однако олигонуклеотидов трехмерного геля в несколько сот раз увеличивает емкость каждой ячейки по сравнению с иммобилизацией на поверхности стекла, что позволяет работать с более высокими сигналами и упростить регистрирующие приборы. Концентрация иммобилизованных олигонуклеотидов generic микрочипа, произведенного по второй технологии, составляет 200 50 мкМ. Размер такого микрочипа 16x17 мм. Несмотря на различия в производственных методах, результатом является ДНК микрочип, обладающий следующими свойствами: очень точная, высокой плотности решетка однонитевых нуклеотидных образцов, расположенная на твердой поверхности. При этом для исследователя в точности известна последовательность нуклеотидного образца в каждой позиции решетки (ячейке) микрочипа. Во всех широко используемых форматах микрочипов детектирование гибридизованных последовательностей обычно производится с помощью предварительного мечения флуоресцентными красителями гибридизуемых образцов, либо мечение осуществляется после гибридизации. В камере микрочипа флуоресцентно меченные олигонуклеотиды гибридизуются с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными на чипе. В результате сигналов количеству такой гибридизации образуется картина флуоресцентных результирующего в различной интенсивности. Интенсивность флуоресцентного сигнала в каждой ячейке микрочипа пропорциональна соответствующей нуклеотидной последовательности анализируемой смеси. Динамический диапазон интенсивностей измеряемых флуоресцентных сигналов, детектируемых CCD-камерой или сканером, перекрывает 3-4 порядка. Это означает, что возможно одновременно детектировать как слабые, так и сильные гибридизационные сигналы. 13 Применение ДНК микрочипов. В настоящее время внимание исследователей сконцентрировано на создании методов, позволяющих эффективно использовать обширное количество информации, полученной в результате сиквенирования генома человека и других организмов. В результате сиквенирования полного генетического материала человека возникло три вопроса (см. рис. 6): 1) как дифференциальная экспрессия этой информации связана со здоровьем и болезнями; 2) как мутации или небольшие вариации в последовательностях генов влияют на возникновение тех или иных генетических заболеваний или увеличивают риск этих заболеваний; 3) какие белки экспрессируются тем или иным геном, их классификация и функции, Первый вопрос, связанный с генной экспрессией, находится в центре внимания функциональной геномики. Функциональную геномику можно определить как изучение всех генов, экспрессируемых отдельными клетками или группой клеток, и тех изменений в их экспрессии, которые происходят во время развития, болезни И И под влиянием окружающей среды. Второй вопрос, связанный с ДЬЖ Л полиморфизмом, иногда рассматривают как часть геномики, либо относят к области функциональной геномики. И наконец, третий вопрос относится к области протеомики. Рис. 6. ДНК Транскрипция мРНК Поток генетической информации/ Геномика сиквенирование и создание библиотеки геномов. Функциональная геномика изучение генной экспрессии. Трансляция Белок Протеомика изучение экспрессируемых белков. 14 Анализ генной экспрессии. В прошлом, различные технологии (Северный блоттинг, точечный блот и другие) позволяли произвести анализ генной экспрессии одногонескольких генов в одном эксперименте. На сегодня, технология ДНК микроматриц позволяет определить уровень экспрессии десятков тысяч генов в одном эксперименте путем получения меченного обратного транскрипта полной мРНК, выделенной из клеток организма, и его последующей гибридизации с множеством различных ген-специфичных иммобилизованных кДНК молекул. Этот метод позволяет установить, что, например образец А содержит на 50% больше специфичной РНК, чем образец В, т.е. измерять уровень экспрессии генов в относительных единицах. Абсолютные величины транскриптов (образец А содержит 1000 копий Р1Ж, а образец В 500 копий этого транскрипта) по этой технологии измерить нельзя. Нужно отметить, что изменения в транскрипции мРЬЖ не всегда коррелируют с изменениями, происходящими с белками: до достижения полной активности транслируемые белки часто претерпевают добавочные модификации. Но пока технологии протеомики не станут универсально доступными для исследователей, гибризационные матрицы остаются наилучшим методом для исследования генной экспрессии в масштабах функциональной геномики. Mark Schena et al. (1995) использовали в качестве образца для анализа генной экспрессии растение Arabidopsis thaliana, поскольку этот экземпляр имеет очень маленький геном. иммобилизовано кДНК 14 полных На стекле с помощью робота было последовательностей генов и 31 экспрессируемых участков. Для контроля так же были иммобилизованы 3 из других организмов, кодирующие AChR человека (рис.7 al,2), глюкокортикоидный рецептор крысы (рис.7 с 11,12) и TRP4 (триптофановый биосинтез) дрожжей (рис.7 h 11,12). Длина иммобилизованных образцов составляла в среднем 1000 оснований. Для калибровки полная мРРЖ 15 растения была в массовом соотношении 1:10000 смешана с мРНК человеческого рецептора на ацетилхолин AChR. В ходе одного раунда реакции обратной транскрипции были получены флуоресцентно меченные образцы кДНК. В результате последующей гибридизации флуоресцентно меченной смеси и последующего сканирования флуоресцентных гибридизационных сигналов были получены флуоресцентные сигналы практически по всем иммобилизованным образцам кДНК (рис. 7А). Благодаря калибровке по соотношению масс тотальной мРНК и мРНК AchR, был установлен максимальный уровень чувствительности детектируемых флуоресцентных сигналов, который составил примерно 1:50000. Для кДЬЖ, кодирующих глюкокортикоидный рецептор крысы и TRP4 дрожжей (рис. 7А, с 11,12, h 11,12) не было обнаружено детектируемых гибридизационных сигналов. Анализ флуоресцентных сигналов показал, что минимальные и максимальные величины уровней экспрессии 45 генов различаются на три порядка (Рис. 7 А и В). Затем были выделены образцы мРНК растения дикого типа и растения с генетической модификацией в к/ЩК гена НАТ4. В ходе реакции обратной транскрипции с добавлением флуоресцеин- и лессаминмеченного нуклеотида были получены образцы кДНК растения дикого типа и растения с генетической модификацией, меченные красителями флуоресцеин и лессамин, соответственно. Затем оба образца были смешаны в одинаковых пропорциях, после чего смесь гибридизовалась на одном микрочипе, а результат гибридизации сканировался в двух длинах волн. Яркий гибридизационный сигнал наблюдался в позиции el,2, соответствующей кДНК гена НАТ4 лиссамин-меченного трансгенетического образца (рис. 7D), в то время как сигнал для флуоресцеин-меченного образца дикого типа в этой позиции отсутствовал (рис. 7С). Калибровка с помощью AchR мРНК, которая была добавлена в реакцию синтеза флуоресцеин- и лессаминмеченной кДНК в соотношении 1: 10000 и 1:100, соответственно, показала, что кДНК НАТ4 генетически модифицированного образца экспрессировала в 16 Heat Shock 10 100 F-xpressron Level (per 100.000) Рис. 8 Контроль генной экспрессии лимфоцитов крови человека, культивированных при 37С А), и лимфоцитов, вырощенных при повышенной температуре 43 С В), с помощью кДНК микроматрицы. Флуоресцентные сигналы представлены в псевдоцвете, в соответствии с уровнем экспрессии. Цветовая шкала была прокалибрована в отдельном эксперименте с использованием известного количественного соотношения контрольной мРНК растения Arahidopsis, добавленной в реакцию обратной транскрипции с включением меченого основания. Микроматрица содержит 10 контрольных кДНК Arabidopsis (верхний левый угол, ячейки 1-10) и 1046 кДНК лимфоцитов крови человека. 17 ячеек микроматрицы, интенсивность флуоресценции которых отличается более чем в два раза для двух типов клеток, выделены белыми рамками А). На рис. В) красными рамками отмечены ячейки, которые соотвествуют кДНК, увеличивающим свою экспрессию более чем в два раза в результате теплового воздействия, а зелеными рамками на рис. В) выделены ячейки, которые соотвествуют кДНК, уменьшающим свою экспрессию более чем в два раза в результате теплового воздействия. небольшое увеличение экспрессии 8 2 раза). Репрессировались гены, кодирующие цитохром с оксидазу III и |3 актин. Измерение уровней генной экспрессии 17-ти кДНК методом точечного блота показало примерно те же значения, что и в случае гибридизации на микроматрице (величины уровней экспрессии измеренные этими двумя методами различались менее чем в два раза). Следующий эксперимент по гибридизации в двух красках был выполнен для исследования влияния форболового эфира. Образцы мРЬЖ из клетки Jurkat, обработанные форболовым эфиром, и контрольные были 19 Heat Shock Phorbol Ester <0.5 0.5 2.0 >2.0 Expression Ratios Рис. 9 Схематическое изображение активируемых и репрессируемых генов при тепловом воздействии А) (также см. рис. 8) и в результате воздействия форбольным эфиром В). Цветовая шкала показывает во сколько раз изменился уровень экспрессии кДНК исследуемых клеток по сравнению с контрольными. помечены различными красителями, и их смесь была гибридизована на микроматрице, а результирующие сигналы отсканированы. Из 1046-ти кДНК шесть увеличивали генную экспрессию более чем в 2 раза (рис. 9В). Два гена, кодирующие РАС-1 тирозин фосфотазу и NF-kBl, значительно повышали уровень экспрессии, в 19 и 3.5 раза соответственно. Умеренную активацию испытывали гены, кодирующие фосфоглицерат киназу и р2микроглобулин (в 2.6 2.2 раза). Одна кДЬЖ, повышающая экспрессию в 2.1 раза, не была идентифицирована. Так же были проанализированы кДЬЖ из различных органов человека: костного мозга, головного мозга, простаты и сердца. Было получено, что экспрессия cytochrome С oxidase, hsp90a и еще одной новой неизвестной кДЬЖ значительно выше в клетках сердца, чем в клетках других органов. Анализ дифференциальной экспрессии генов с помощью микроматриц нашел широкое применение в медицине, особенно в злокачественных образований. Golub молекулярной et al. (1999) классификации использовали олигонуклеотидные микроматрицы высокой плотности фирмы 20 Affymetrix, содержащие пробы на 6817 генов человека. Образцы РНК бьши приготовлены из образцов костного мозга 38 пациентов с острой лейкемией (27 имели острую лимфобластную миелоидную лейкемию (ОМЛ). лейкемию (ОЛЛ), И острую Вначале для

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Заседателева, Ольга Александровна

выводы.

1. Для анализа сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных и ДНК-связывающих белков с ДНК на примере белков р50 и HU развит метод и продемонстрирована возможность применения generic микрочипа, содержащего полный набор всех гексамерных последовательностей.

2. С использованием олигонуклеотидного generic микрочипа показано следующее:

- при взаимодействии с однонитевыми олигонуклеотидами белок HU проявляет большее сродство к GC-богатым последовательностям, чем к АТ-богатым; при взаимодействии белка HU с двунитевыми олигонуклеотидами большая часть последовательностей неспецифично стабилизируется белком, при этом гетерогенные мотивы AGA, AAG, AAGA способствуют наиболее сильной стабилизации дуплексов белком HU; наиболее специфичным для связывания белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидами является мотив GGGG, а так же мотивы САСС и CATC;

- при взаимодействии с р50 наиболее эффективно дестабилизируются GC-богатые двунитевые олигонуклеотиды, и в особенности те из них, которые содержат мотивы GGTG/CACC, GATG/CATC и GTGG/CCAC.

3. Показано, что результаты анализа ДНК-белкового взаимодействия, полученные с помощью generic микрочипа, согласуются с данными, полученными традиционным методом gel-shift электрофореза.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Приношу свою глубокую благодарность моему научному руководителю Андрею Дарьевичу Мирзабекову. Выражаю глубокую признательность Александру Сергеевичу Крылову, моему наставнику в освоении работы с белками, Льву Павловичу Овчинникову и Максиму Скабкину за предоставленный белок р50 и проведение gel-shift электрофореза, Дмитрию Прокопенко за создание программ по обработке экспериментальных данных и статистическому анализу результатов, Валентине Владимировне Чупеевой, Эдуарду Яковлевичу Крейндлину - за подготовку исследовательских микрочипов, Александру Колчинскому за помощь в работе и ценные замечания при обсуждении результатов. Отдельная благодарность Наталии Георгиевне Есиповой за помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Заседателева, Ольга Александровна, Москва

1. Gerhold D., Rushmore Т. & Caskey C.T. (May 1999). DNA chips: promising toys have become powerful tools. Trends in Biochemical Sciences, vol. 24, no. 5, pp. 168-173.

2. Harshman K. & Martinez-A C. (July 2002). DNA microarrays: a bridge between genome sequence information and biological understanding. European Review, vol. 10, no. 3, pp. 389-408.

3. Lennon G.G. & Lehrach H. (October 1991) Hybridization analyses of arrayed cDNA libraries. Trends in Genetics, vol.7, no. 10, pp. 314-317.

4. Rockett J.C. (Augest 2002). Macroresults through microarrays. Drug Discovery today, vol.7, no. 15, pp. 804-805.

5. Meldrum D. (2000). Automation for genomics, part two: sequencers, microarrays, and future trends. Genome Research, vol. 10, 1288-1303.

6. Pease A. C., Solas D., Sullivan E.J., Cronin M.T., Holmes C.P. & Fodor S.P.A. (May 1994). Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl Acad. Sci., vol. 91, no. 11, pp. 5022-5026.

7. Joos В., Kuster H. & Cone R. (1997). Covalent attachment of hybridizable oligonucleotides to glass supports. Analytical biochemistry, vol. 247, pp. 96101.

8. Freeman W.M., Robertson D.J. & Vrana K.E. (November 2000) Fundementals of DNA hybridization array for gene expression analysis. BioTechniques, vol. 29, no. 5, pp. 1042-1055.

9. Fotin А. V., Drobyshev A. L., Proudnikov D. Y., Perov A. N., & Mirzabekov A. D. (1998). Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res., vol. 26, 1515-1521.

10. Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., & Mirzabekov A. (2002). Fluorescence data analysis on gel-based biochips. J. Biomol. Screen. 7, 247-257.

11. Drobyshev A. L., Zasedatelev A. S., Yershov G. M. & Mirzabekov A. D. (1999). Massive parallel analysis of DNA-Hoechst 33258 binding specificity with a generic oligodeoxyribonucleotide microchip. Nucleic Acids Res. 27, 4100-4105.

12. Freeman W.M., Walker S.J. & Vrana K.E. (January 1999). Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. BioTechniques, vol. 25, no. 1, pp. 112-125.

13. Matz M.V. & Lukyanov S.A. (December 1998). Different strategies of differential display: areas of application. Nucleic Acids Research, vol. 26, no. 24, pp. 5537-5543.

14. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein В., Kinzler K.W., (1995). Serial analysis of gene expression. Science, vol.270, pp. 484-487.

15. Sutcliffe J.G., Foye P.E., Erlander M.G., Hilbush B.S., Bodzin L.J. & Durham J.T. (February 2000) TOGA: an automated parsing technology for analysing expression of nearly all genes. Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 5, pp. 19761981.

16. Lockhart D.J. & Winzeler E.A. (June 2000). Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature, vol. 405, no. 6688, pp. 827-836.

17. Pandey A. & Mann M. (June 2000). Proteomics to study genes and genomes. Nature, vol. 405, no. 6688, pp. 827-836.

18. Schena M., Shalon D., Davis R.W. & Brown P.O. (October 1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science, vol. 270, pp. 467-470.

19. Schena M., Shalon D., Heller R., Chai A., Brown P.O. & Davis R.W. (October 1996). Parallel human genome analysis: Microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 93, pp. 10614-10619.

20. Staudt L.M. (February 2003). Molecular diagnosis of cancer. Miami Nature Biotechnology Winter Symposium: 50 years on: from the double helix to molecular medicine. Vol. 14, pp. 48.

21. Roses A.D. (June 2000). Pharmacogenetics and the practice of medicine. Nature, vol. 405, no. 6688, pp. 827-836.

22. Chee M., Yang R., Hubbell E., Berno A., Huang X.C., Stern D., Winkler J., Lockhart D.J., Morris M.S. & Fodor S.P.A. (October 1996). Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays. Science, vol. 274, no. 5287, pp. 610-614.

23. Woodbury С .P. & Hippel P.H.V. (September 1983). On the determination of deoxyribonucleic acid-protein interaction parameters using the nitrocellulose filter-binding assay. Biochemistry, vol. 22, no. 20, pp. 4730-4737.

24. Bowen В., Steinberg J., Laemmli U.K. & Weintraub H. (January 1980). The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Res, vol. 8, no. l,pp. 1-20.

25. Jansen C., Gronenborn A.M. & Clore G.M. (August 1987). The binding of the cyclic AMP receptor protein to synthetic DNA sites containing permutations in the consensus sequence TGTGA. Biochem. J., vol. 246, no. 1, pp. 227-232.

26. Bulyk M.L., Huang X., Choo Y. & Church G.M. (June 2001). Exploring the DNA-binding specificities of zinc fingers with DNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 98, no. 13, pp. 7158-7163.

27. Rouviere-Yaniv J., Yaniv M. & Germond J.E. (1979). Escherichia coli DNA-binding protein HU forms nucleosome-like structure with circular double-stranded DNA. Cell, vol. 17,no., pp. 265-274.

28. Rouviere-Yaniv J. & Kjeldgaard N.O. (1979) Native Escherichia coli HU protein is a heterotypic dimer. FEBS Lett., vol. 106, pp. 297-300.

29. Bramhill D. & Kornberg A. (1988). A model for initiation at origins of DNA replication. Cell, vol. 54, no., pp. 915-918.

30. Dri A.-M., Moreau P. & Rouviere-Yaniv J. (1992). Involvement of the histone-like proteins OsmZ and HU in homologous recombination. Gene, vol. 120, no., pp. 11-16.

31. Lavoie B.D. & Chaconas G. (1993). Site-specific HU binding in the MU transposome: conversion of a sequence-independent DNA-binding protein into chemical nuclease. Genes Dev., vol. 7,no., pp. 2510—2519.

32. Morisato D. & Kleckner N., (1997). TnlO transposition and circle formation in vitro. Cell, vol. 51., no., pp. 101-111.

33. Aki T. & Adhya S. (1997). Repressor induced site-specific binding of HU for transcriptional regulation. EMBOJ., vol. 16, no., pp. 3666-3674.

34. Boubrik F. & Rouviere-Yaniv J. (1995). Increased sensitivity to 7 irradiation inbacteria lacking protein HU. Proc. Natl Acad. Sci., vol. 92, no., pp. 3958-3962.

35. Bonnefoy E., & Rouviere-Yaniv J. (March 1991). HU and IHF, two homologous histone-like proteins of Escherichia coli, form different protein-DNA complexes with short DNA fragments. EMBO J., vol. 10, no. 3, pp. 687696.

36. Pinson V., Takahashi M., & Rouviere-Yaniv J. (April 1999). Differential binding of the Escherichia coli HU, homodimeric forms and heterodimeric form to linear, gapped and cruciform DNA. J. Mol. Biol., vol. 287, no. 3, pp. 485-497.

37. Holck A. & Kleppe K. (June 1985). Affinity of protein HU for different nucleic acids. FEBSLett., vol. 185, no. 1, pp. 121-124.

38. Matsumoto K. & Wolffe A.P. (1998). Gene regulation by Y-box proteins: coupling control of transcription and translation. Trends Cell Biol., vol. 8, pp. 318-323.

39. Thieringer H.A., Jones P.G. & Inouye M. (1998). Cold shock and adaptation.

40. BioEssays, vol. 20, pp. 49-57.

41. Wistow G. (1990). Cold shock and DNA binding. Nature, vol. 344, pp. 823824.

42. Wolffe A.P. (1994). Structural and functional properties of the evolutionary ancient Y-box family of nucleic acid binding proteins. BioEssays, vol. 16, pp. 245-251.

43. Sommerville J. & Ladomery M. (1996). Masking of mRNA by Y-box proteins.

44. Kloks C.P., Hoffmann A., Omichinski J.G., Vuister G.W., Hilbers C.W, & Grzesiek S. (1998). Resonance assignment and secondary structure of the cold shock domain of the human YB-1 protein. J. Biomol. NMR., vol. 12, pp. 463464.

45. Shnyreva M., Schullery D.S., Suzuki H., Higaki Y. & Bomsztyk, K. (2000). Interaction of two multifunctional proteins. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein К and Y-box-binding protein. J. Biol Chem., vol. 275, pp. 15498-15503.

46. Izumi H., Imamura Т., Nagatani G., Ise Т., Murakami Т., Uramoto H., Torigoe Т., Ishiguchi H., Yoshida Y., Nomoto M., Okamoto Т., Uchiumi Т., Kuwano

47. M., Funa К., & Kohno К. (2001). Y box-binding protein-1 binds preferentially to single-stranded nucleic acids and exhibits 3'—>5' exonuclease activity. Nucleic Acids Res., vol. 29, pp. 1200-1207.

48. Minich W.B., Maidebura I. P. & Ovchinnikov L.P. (1993). Purification and characterization of the major 50kDa repressor protein from cytoplasmic mRNP of rabbit reticulocytes. Eur. J. Biochem., vol. 212, pp. 633-638.

49. Jain S.K., Pluskal M.G. & Sarkar S. (1979). Thermal chromatography of eukaryotic messenger ribonucleoprotein particles on oligo (dT)-cellulose. Evidence for common mRNA-associated proteins in various cell types. FEBS Lett., vol. 97, pp. 84-90.

50. Sommerville J. (1999). Activities of cold-shock domain proteins in translation control. BioEssays, vol. 21, pp. 319-325.

51. Evdokimova V.M. & Ovchinnikov L.P. (1999). Translational regulation by Y-box transcription factor: involvement of the major mRNA-associated protein, p50. Int. J. Biochem. Cell Biol., vol. 31, pp. 139-149.

52. Stickeler E., Fraser S.D., Honig A., Chen A.L., Berget S.M. & Cooper T. A. (2001). The RNA binding protein YB-1 binds A/C-rich exon enhancers and stimulates splicing of the CD44 alternative exon v4. EMBO J., vol. 20, pp. 3821-3830.

53. Evdokimova V.M., Ruzanov P.V., Imataka H., Raught В., Svitkin Y.V., Ovchinnikov L.P. & Sonenberg N. (2001). The major mRNA-associated protein YB-1 is a potent 5' cap-dependent mRNA stabilizer. EMBO J., vol. 20, pp. 1-12.

54. Ladomery M. & Sommerville J. (1995). A role for Y-box proteins in cell proliferation. BioEssays, vol. 17, pp. 9-11.

55. Swamynathan S.K., Nambiar A. & Guntaka R.V. (1998). Role of single-stranded DNA regions and Y-box proteins in transcriptional regulation of viral and cellular genes. FASEB J., vol. 12, pp. 515-522.

56. MacDonald G.H., Itoh-Lindstorm Y. & Ting J.P.-Y. (1995). The transcriptional regulatory protein, YB-1, promotes single-stranded regions in the DRA promoter. J. Biol. Chem., vol. 270, pp. 3527-3533.

57. Lenz J., Okenguist S.A., LoSardo J.E., Hamilton K.K. & Doetsch P.W. (1990). Identification of a mammalian nuclear factor and human cDNA encoded proteins that recognize DNA containing apurinic sites, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 87, pp. 3396-3400.

58. Grant, С. E.& Deeley, R. G. (1993). Cloning and characterization of chicken YB-1: regulation of expression in the liver. Mol. Cell Biol., vol. 13, pp. 41864196.

59. Didier D.K., Schiffenbauer J., Woulfe S.L., Zacheis M. & Schwartz B.D. (1988). Characterization of the cDNA encoding a protein binding to the major histocompatibility complex class II Y-box. Proc. Natl Acad. Sci., USA, vol. 85, pp. 7322-7326.

60. Kollury R., Torrey A.T. & Kinniburgh A.J. (1992). A CT promoter element binding protein: definition of a double-strand and a novel single-strand DNA binding motif. Nucleic. Acids Res., vol. 20, pp. 111-116.

61. Horwitz E., Maloney K. & Ley T. (1994). A human protein containing a cold shock domain binds specifically to H-DNA upstream from the human y-globin genes. J. Biol. Chem., vol. 269, pp. 14130-14139.

62. Guschin D., Yershov G., Zaslavsky A., Gemmell A., Shick V., Proudnikov D., Arenkov P. & Mirzabekov A. (1997). Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and protein microchips. Anal. Biochem., vol. 250, pp. 203-211.

63. Timofeev E., Kochetkova S.V., Mirzabekov A.D. & Florentiev V.L. (1996). Regioselective immobilization of short oligonucleotides to acrylic copolymer gels. Nucleic Acids Res., vol. 24, pp. 3142-3148.

64. Hermanson G.T. (1996). Amine-reactive fluorescein derivatives. Texas Red sulfonyl chloride. In Bioconjugate Techniques, pp. 324-326, Academic Press, San Diego.

65. Fotin A.V., Drobyshev A.L., Proudnikov D.Y., Perov A.N., & Mirzabekov A.D. (1998). Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res., vol. 26, pp. 15151521.

66. Johnson N.L. & Leone F.C. (1977). Statistics and experimental design in engineering and the physical sciences (second edition), vol. 2, chapter 13, pp. 11-120, John Wiley & Sons, New York.

67. Tafuri S.R. & Wolffe A.P. (1990). Xenopus Y-box transcription factors: molecular cloning, functional analysis and developmental regulation. Proc. Natl Acad. Set USA, vol. 87, pp. 9028-9032.

68. Yan C. & Tamm I. (1991). Molecular cloning and characterization of interferon alpha/beta response element binding factors of the murine (2'-5')oligoadenylate synthetase ME-12 gene. Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol. 88, pp. 144-148.

69. Coles, L. S., Diamond, P., Occhiodoro, F., Vadas, M. A. & Shannon, M. F. (1996). Cold shock domain proteins repress transcription from the GM-CSF promoter. Nucleic Acids Res., vol. 24, pp. 2311-2317.

70. Kandala J.C. & Guntaka R.V. (1994). Cloning of Rous sarcoma virus enhancer factor genes. I. Evidence that RSV-EF-I is related to Y-box (inverted CCAAT) binding proteins and binds to multiple motifs in the RSV enhancer. Virology, vol. 198, pp. 514-523.